WO2011052716A1 - 動物細胞をアレイ状に配置するための基板の調製方法及び動物細胞をアレイ状に配置した基板の調製方法 - Google Patents

動物細胞をアレイ状に配置するための基板の調製方法及び動物細胞をアレイ状に配置した基板の調製方法 Download PDF

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electrode
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extracellular matrix
array
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純弘 小山
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独立行政法人海洋研究開発機構
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2529/00—Culture process characterised by the use of electromagnetic stimulation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue

Definitions

  • the present invention relates to a method for preparing a substrate for arranging animal cells in an array, and a method for preparing a substrate in which animal cells used in this method are arranged in an array.
  • ⁇ Attempts have been made to identify and select cells one by one and use the selected cells.
  • the antigen specificity of each lymphocyte is individually detected, and further, the detected antigen-specific lymphocyte is recovered, and the recovered antigen-specific lymphocyte is used, for example, an antibody (Patent Document 1) has been studied.
  • a microwell array chip is used to detect antigen-specific lymphocytes.
  • the shape and size of each microwell have a shape and size in which only one lymphocyte is stored in one microwell.
  • Patent Documents 2 to 4 It is known that when animal cells are cultured on a substrate surface, an adhesion protein called an extracellular matrix is formed outside the cell, and the cells adhere to the substrate surface. It is also known to peel off and use cells attached to the substrate surface in this way. It is also known to use electrical stimulation as a peeling method (Patent Documents 2 to 4).
  • Patent Documents 1 to 4 are specifically incorporated herein by reference.
  • An object of the present invention is to provide a new means capable of individually arranging animal cells on a substrate surface one by one without using a microwell.
  • the present inventors have developed a culture substrate capable of individually attaching animal cells by adsorption of the extracellular matrix and separation of the extracellular matrix by partial electrical stimulation.
  • the present invention was completed by finding that it can be formed.
  • the present invention is as follows. [1] (1) preparing a substrate having an adsorption surface in an array on the electrode substrate surface; (2) adsorbing an extracellular matrix on the electrode surface and adsorption surface of the substrate; and (3) applying a weak potential to the electrode, peeling the extracellular matrix on the electrode surface, and obtaining a substrate having the extracellular matrix adsorbed on the adsorption surface; A method for preparing a substrate for arranging animal cells in an array.
  • [2] (1) preparing a substrate having an adsorption surface in an array on the electrode substrate surface; (2) a step of adsorbing an extracellular matrix on the electrode surface and adsorption surface of the substrate; (3) applying a weak potential to the electrode, peeling the extracellular matrix on the electrode surface, and obtaining a substrate having the extracellular matrix adsorbed on the adsorption surface; and (4) culturing animal cells on the surface of the substrate obtained in step (3) to obtain a substrate having animal cells attached to the adsorption surface; A method for preparing a substrate on which animal cells are arranged in an array.
  • [3] The preparation method according to [1] or [2], wherein the dimension of each adsorption surface in the form of an array is such that one animal cell can adhere to one adsorption surface.
  • [Four] The preparation method according to any one of [1] to [3], wherein the substrate is selected from the group consisting of a non-conductive organic material and an inorganic material.
  • [Five] The preparation method according to any one of [1] to [3], wherein the substrate is glass, plastic, or ceramics.
  • the weak potential in the step (3) is in the range of -0.4V to -0.2V or + 0.2V to + 0.5V (vs. Ag / AgCl), according to any one of [1] to [4] Preparation method.
  • the culture of the animal cell in the step (4) is performed while applying an electric potential in the range of ⁇ 0.4 V to ⁇ 0.2 V (vs. Ag / AgCl) to the electrode and suppressing the adhesion of the animal cell to the electrode [ [2] The preparation method according to any one of [6]. [8] The culture of the animal cell in the step (4) is performed by applying a positive potential to the electrode so that the animal cell adheres to the electrode, thereby obtaining a substrate on which the animal cell adheres to the adsorption surface and the electrode. [2] The preparation method according to any one of [6].
  • a culture substrate on which animal cells can be individually attached.
  • animal cells can be individually arranged on the substrate surface one by one.
  • An explanatory view of an electrode preparation procedure in Example 1 is shown. Explanatory drawing of process (2)-(4) is shown. The image of the surface of a patterned electrode when FITC-labeled collagen I is used as an extracellular matrix protein is shown. The image of the surface of a patterned electrode when FITC-labeled collagen I is used as an extracellular matrix protein is shown. The image of the pattern electrode surface at the time of using FITC labeled poly-L-lysin as an extracellular matrix protein is shown. The image of the electrode surface after 24 hours culture
  • the present invention relates to a method for preparing a substrate for arranging animal cells in an array, and a method for preparing a substrate on which animal cells are arranged in an array using the substrate.
  • a substrate preparation method for arranging animal cells in an array includes the following steps (1) to (3), and a substrate preparation method in which animal cells are arranged in an array includes the following steps (1) to ( 4) is included.
  • Step (1) is a step of preparing a substrate having an adsorption surface in an array on the electrode substrate surface.
  • the electrode substrate has an electrode on a part or all of the surface of the insulating substrate, and can be, for example, a glass slide coated with indium oxide (ITO).
  • ITO indium oxide
  • the insulating substrate is not intended to be limited to a glass slide, and the electrode is not intended to be limited to indium oxide (ITO).
  • the electrode substrate has an adsorption surface in an array on the surface.
  • the adsorption surface is a surface other than the electrode for adsorbing the extracellular matrix, and is made of a material that can adsorb the extracellular matrix.
  • the material that can be adsorbed by the extracellular matrix can be, for example, glass, but is not particularly limited as long as it is a nonconductive solid, and can be a nonconductive organic material or an inorganic material.
  • examples of non-conductive organic materials and inorganic materials include plastics and ceramics. Therefore, although the glass surface can be exemplified as the adsorption surface, it is not intended to be limited to the glass surface, and can be appropriately selected from non-conductive organic materials and inorganic materials.
  • substrate is transparent.
  • the array shape means that the adsorption surface is arranged as a plurality of minute regions in each column and row.
  • the number can be appropriately determined according to the type (size) of animal cells and the purpose of use of the substrate on which the animal cells are arranged in an array. It can be in the range of 5 x lateral 10 to 10 5 . However, it is not intended to be limited to this range.
  • the shape of the adsorption surface can be appropriately determined as a rectangle (triangle, square, rectangle, polygon, etc.), a circle, an ellipse, or the like.
  • each adsorption surface in the array can be such that one animal cell can adhere to one adsorption surface. Since the size of the animal cell varies depending on the cell, the size of the surface for adsorption can be appropriately determined according to the size of the animal cell to be attached. However, for example, when the animal cell is a HeLa cell, the size of the adsorption surface can be in the range of 25 to 100 ⁇ m, for example. Further, the size of each adsorption surface in the form of an array can be a size that allows two or more animal cells to adhere to one adsorption surface.
  • the surface for array-like adsorption to the electrode substrate surface is, for example, coating the electrode layer on the substrate surface, forming a mask for the surface for array-like adsorption on the electrode layer surface, and then etching the electrode layer surface through the mask Then, it can be formed by removing the mask.
  • the array-like adsorption surface can be formed on the electrode substrate surface by coating the substrate surface with an electrode layer through a mask for the array-like adsorption surface, and then removing the mask. Formation of the electrode layer, etching of the electrode layer surface, and the like can be appropriately performed using a conventional method.
  • Step (2) is a step of adsorbing the extracellular matrix on the electrode surface and adsorption surface of the substrate prepared in step (1).
  • the extracellular matrix is adsorbed on the electrode surface and the adsorption surface (array electrode surface) of the substrate.
  • the extracellular matrix is a cell adhesion protein, and can include, for example, collagen, proteoglycan, hyaluronic acid, fibronectin, laminin, tenascin, entactin and the like.
  • a commercially available extracellular matrix can be obtained.
  • Adsorption of the extracellular matrix to the substrate surface is performed by applying an aqueous solution containing the extracellular matrix to the substrate surface, or immersing it in an aqueous solution containing the extracellular matrix with the substrate surface facing upward, and allowing to stand. it can.
  • Step (3) is a step of peeling the extracellular matrix on the electrode surface by applying a weak potential to the electrode of the substrate on which the extracellular matrix is adsorbed to obtain a substrate on which the extracellular matrix is adsorbed on the adsorption surface. is there.
  • the extracellular matrix on the electrode surface to which the weak potential is applied is peeled off while maintaining the adsorption of the extracellular matrix on the surface for adsorption (center portion).
  • the weak potential is, for example, in the range of -0.4 V to -0.2 V or +0.2 V to +0.5 V (vs.
  • the weak potential is preferably, for example, in the range of ⁇ 0.4 V to ⁇ 0.2 V (vs. Ag / AgCl).
  • the application of the weak potential may be caused by the amount of extracellular matrix adsorbed on the electrode surface or the extracellular matrix. It can be determined appropriately according to the type, and can be carried out, for example, in the range of 2 hours to 24 hours. After peeling by applying a weak potential, the substrate surface can be washed as necessary to remove the released extracellular matrix.
  • a substrate for arranging animal cells in an array can be prepared by steps (1) to (3).
  • the substrate on which the animal cells obtained so far are arranged in an array can be further used in the following step (4) to prepare a substrate on which animal cells are arranged in an array.
  • Step (4) is a step of culturing animal cells on the surface of the substrate obtained in step (3) to obtain a substrate having animal cells attached to the adsorption surface.
  • animal cells adhere to the adsorption surface.
  • animal cells cultured on the substrate surface There are no particular limitations on animal cells cultured on the substrate surface, and examples include human normal cells, ES cells, iPS cells, HeLa cells, and CHO cells.
  • culture conditions for animal cells on the surface of the substrate known culture conditions can be appropriately employed depending on the type of animal cells.
  • a culture solution containing animal cells is supplied to the substrate surface and cultured under culture conditions according to the type of animal cells, the extracellular matrix is adsorbed on the adsorption surface, so that the animal cells adhere to the extracellular matrix.
  • animal cells adhere to the adsorption surface.
  • a substrate on which animal cells are arranged in an array is prepared.
  • the culture of the animal cell in the step (4) applies an electric potential in the range of ⁇ 0.4 V to ⁇ 0.2 V (vs. Ag / AgCl) to the electrode while suppressing the adhesion of the animal cell to the electrode.
  • an electric potential in the range of ⁇ 0.4 V to ⁇ 0.2 V (vs. Ag / AgCl) can be applied.
  • step (4) B of Fig. 2 by applying a potential in the range of -0.4V to -0.2V (vs. Ag / AgCl) to the electrode, the adhesion of animal cells to the electrode is suppressed, and Animal cells adhere to the surface.
  • a negative potential of -0.2V to -0.4V vs. Ag / AgCl
  • Adsorption of extracellular matrix proteins to the electrode can be suppressed, and as a result, adhesion of animal cells to the electrode can be suppressed.
  • animal cells may adhere to the electrode due to the extracellular matrix secreted by the animal cells.
  • -0.2V to -0.4V By applying a negative potential of (vs. Ag / AgCl), adsorption of extracellular matrix protein to the electrode can be suppressed, and adhesion of animal cells to the electrode can be suppressed.
  • animal cells have a negative charge, adhesion of animal cells can be suppressed on the surface of the electrode substrate to which the negative potential is applied. Thereby, animal cells do not adhere on the electrode surface to which a negative potential is applied, and the cells can be attached only to the array pattern portion to which the animal cells are to be attached.
  • the animal cell culture in the step (4) is performed by applying a positive potential to the electrode so that the animal cell adheres to the electrode, thereby obtaining the adsorption surface and the substrate having the animal cell attached to the electrode.
  • the positive potential is, for example, from +0.2 V to +1.0 V (vs. Ag / AgCl), preferably +0.2 V from the viewpoint of inducing attachment of animal cells by electrostatic attraction and not damaging the animal cells. A range of V to +0.6 V (vs. Ag / AgCl) is appropriate.
  • a substrate on which animal cells prepared by the method of the present invention are arranged in an array can be used, for example, to examine the properties of animal cells or to examine substances discharged from animal cells.
  • the mechanism activated by physicochemical stimulation can be analyzed at the single cell level.
  • the cells attached to the electrode substrate surface and the adsorption surface in the vicinity of the electrode substrate surface have, for example, a frequency in the range of 1 KHz to 10 MHz and a potential width of ⁇ 1.0 V (vs Ag / AgCl) or smaller.
  • Separation can be achieved by applying a certain high-frequency fluctuation potential (waveform is, for example, a rectangular wave, a sine wave, or a triangular wave) to the electrodes.
  • a certain high-frequency fluctuation potential waveform is, for example, a rectangular wave, a sine wave, or a triangular wave
  • Example 1 Electrode preparation An electrode and a three-electrode culture system were prepared according to the following procedure.
  • FIG. 1 shows an explanatory diagram of the procedure for producing an electrode.
  • a conductive resin Dotite, D-550, Fujikura Kasei Co., Ltd.
  • the ITO pattern electrode chamber was ultrasonically cleaned in distilled water for 5 minutes. 2) 1M NaOH was added to the ITO pattern electrode chamber and allowed to stand for 5 minutes. 3) The ITO pattern electrode chamber was lightly washed with PBS (-) and then UV-sterilized for 5 minutes in a clean bench. 4) Add 0.1 mg / ml FITC-labeled poly-L-lysin (Sigma) in PBS (-) or 0.1 mg / ml FITC-labeled collagen I (Sigma) in 0.01M HCl aqueous solution into the chamber, Allowed to stand for 10 minutes. 5) After lightly rinsing the chamber twice with PBS ( ⁇ ), the ITO pattern electrode chamber was stored at 4 ° C. or used immediately in the experiment.
  • FIGS. 3 and 4 show the results when FITC-labeled collagen I is used as the extracellular matrix protein.
  • Figure 3 was obtained when -0.4V, -0.3V, -0.2V, + 0.3V, or + 0.4V constant potential (vs. Ag / AgCl) was applied in PBS (-) for 24 hours. It is the fluorescence image of FITC of the electrode surface. Fluorescence is observed on the patterned glass surface (square), indicating that FITC-labeled collagen I is adsorbed, and no fluorescence is observed on the surrounding ITO electrode, and FITC-labeled collagen I is peeled off. Indicates that
  • Fig. 4 is a FITC fluorescence image of the electrode surface obtained when the applied constant potential (vs. Ag / AgCl) is +0.4 V and the application time is changed from 0 to 16 hours. From 0 to 8 hours, fluorescence is also observed on the ITO electrode area around the patterned glass surface (square), but from 8 to 16 hours, fluorescence is observed only on the patterned glass surface (square). This indicates that the FITC-labeled collagen IV is adsorbed, and no fluorescence is observed on the surrounding ITO electrode portion, indicating that the FITC-labeled collagen IV is peeled off.
  • the applied constant potential vs. Ag / AgCl
  • FIG. 5 shows the results when FITC-labeled poly-L-lysin (Sigma) is used as the extracellular matrix protein.
  • FIG. 5 shows that -0.4V, -0.3V, -0.2V, + 0.2V, + 0.3V, + 0.4V, or + 0.5V constant potential (vs. Ag / AgCl) in PBS (-) It is the fluorescence image of FITC of the electrode surface obtained when it applied for a time.
  • -0.4V, -0.3V, + 0.3V, + 0.4V, and + 0.5V constant potential (vs. Ag / AgCl) is applied for 24 hours, fluorescence is observed on the patterned glass surface (square).
  • Example 2 In Example 1, FITC-labeled collagen I was used as an extracellular matrix protein, and -0.3 V constant potential (vs. Ag / AgCl) was applied in PBS (-) for 42 hours in the chamber of the pattern electrode. Then, 1 ⁇ 10 5 cells / well of animal cells (HeLa cells) suspended in a serum-containing medium were seeded and cultured for 24 hours. A constant potential of -0.3 V was further applied during the culture (24 hours). 24 hours after applying the potential, the distribution of cells and extracellular matrix proteins was observed with a confocal laser microscope (FV500, Olympus) and a phase contrast microscope (CKX-41, Olympus). An image of the electrode surface after 24-hour culture is shown in FIG.
  • FV500 confocal laser microscope
  • CKX-41 phase contrast microscope
  • HeLa cells animal cells
  • FITC-labeled collagen I is adsorbed.
  • 100 ⁇ 100 ⁇ m 2 and 50 ⁇ 50 ⁇ m 2 have succeeded in placing the cells only on the glass substrate. It shows that the arrangement of cells can be controlled up to 25 ⁇ 25 ⁇ m 2 .
  • Example 3 In Example 1, FITC-labeled collagen I was used as an extracellular matrix protein, and a constant potential (vs. Ag / AgCl) of +0.4 V was applied in PBS ( ⁇ ) for 66 hours in the chamber of the pattern electrode. Then, animal cells (PC12 cells) suspended in a serum-containing medium were seeded and cultured for 24 hours. A constant potential of + 0.4V was further applied during the culture (24 hours). 24 hours after applying the potential, the distribution of cells and extracellular matrix proteins was observed with a confocal laser microscope (FV500, Olympus) and a phase contrast microscope (CKX-41, Olympus). An image of the electrode surface after 24 hours of culture is shown in FIG. It can be seen that animal cells (PC12 cells) are attached on the surface of the ITO electrode substrate on which FITC-labeled collagen I is not adsorbed.
  • a constant potential vs. Ag / AgCl
  • Reference example 1 The contact angle of water on the surface of the ITO electrode when a constant potential was applied to the ITO electrode was measured.
  • the measurement was performed by placing water droplets on the surface of the ITO electrode in the electrolytic cell filled with cyclooctane and measuring the contact angle before and after constant potential application (24 hours).
  • the results are shown in FIG. It can be seen that application of constant potentials of -0.4 V and +0.4 V (vs. Ag / AgCl) decreases the contact angle with water by about 20 to 40% and increases hydrophilicity. From this result, it is surmised that the exfoliation of the extracellular matrix protein in the present invention by applying a constant potential is due to an increase in the hydrophilicity of the electrode surface.
  • the present invention is useful in fields related to animal cell culture.

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Abstract

マイクロウェルを用いることなく、動物細胞を一つずつ個別に基板表面上に配置できる新たな手段を提供する。 下記工程(1)～(3)を含む動物細胞をアレイ状に配置するための基板の調製方法及び、下記工程(1)～(4)を含む動物細胞をアレイ状に配置した基板の調製方法。(1)電極基板表面にアレイ状に吸着用表面を有する基板を用意する工程、(2)前記基板の電極表面及び吸着用表面に細胞外マトリクスを吸着させる工程、(3)前記電極に微弱電位を印加して、電極表面の細胞外マトリクスを剥離して、吸着用表面に細胞外マトリクスが吸着した基板を得る工程、(4)工程(3)で得た基板表面で動物細胞を培養して、吸着用表面に動物細胞が付着した基板を得る工程。

Description

動物細胞をアレイ状に配置するための基板の調製方法及び動物細胞をアレイ状に配置した基板の調製方法 関連出願の相互参照
　本出願は、２００９年１０月３０日出願の日本特願２００９－２５０５１６号の優先権を主張し、その全記載は、ここに特に開示として援用される。
　本発明は、動物細胞をアレイ状に配置するための基板の調製方法、及びこの方法に用いる動物細胞をアレイ状に配置した基板の調製方法に関する。
　細胞を1つ1つのレベルで特定し、選別し、選別された細胞を用いる試みがなされている。例えば、１つ１つのリンパ球の抗原特異性を個別に検出し、さらに検出された1つの抗原特異的リンパ球を回収し、回収された1つの抗原特異的リンパ球を用いて、例えば、抗体を製造することが検討されている（特許文献1）。
　特許文献1では、抗原特異的リンパ球を検出するためにマイクロウェルアレイチップを用いている。このマイクロウェルアレイチップは、各マイクロウェルの形状及び寸法が、１つのマイクロウェルに１つのリンパ球のみが格納される形状及び寸法を有するものである。
　動物細胞を基板表面で培養すると細胞外マトリクスと呼ばれる接着タンパク質を細胞外に形成し、細胞を基板表面に付着することが知られている。このように基板表面に付着した細胞を剥離して利用することも知られている。剥離方法として電気的刺激を利用することも知られている(特許文献2～4)。
特開2004－173681号公報 特開2008－295382号公報 特開2005－312343号公報 特開平10－42857号公報
特許文献１～４の全記載は、ここに特に開示として援用される。
　しかし、細胞外マトリクスによる細胞の基板表面への付着や電気的刺激による細胞の剥離が、動物細胞を一つずつ個別に基板表面上に配置する手段として利用されたことはない。
　本発明は、マイクロウェルを用いることなく、動物細胞を一つずつ個別に基板表面上に配置できる新たな手段を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記目的を達成すべく種々検討した結果、細胞外マトリクスの吸着と細胞外マトリクスの部分的な電気的刺激による剥離により、動物細胞を個別に付着させることができる培養基板を形成できることを見出して本発明を完成させた。
　本発明は、以下のとおりである。
[1]
(1)電極基板表面にアレイ状に吸着用表面を有する基板を用意する工程、
(2)前記基板の電極表面及び吸着用表面に細胞外マトリクスを吸着させる工程、及び
(3)前記電極に微弱電位を印加して、電極表面の細胞外マトリクスを剥離して、吸着用表面に細胞外マトリクスが吸着した基板を得る工程、
を含む、動物細胞をアレイ状に配置するための基板の調製方法。
[2]
(1)電極基板表面にアレイ状に吸着用表面を有する基板を用意する工程、
(2)前記基板の電極表面及び吸着用表面に細胞外マトリクスを吸着させる工程、
(3)前記電極に微弱電位を印加して、電極表面の細胞外マトリクスを剥離して、吸着用表面に細胞外マトリクスが吸着した基板を得る工程、及び
(4)工程(3)で得た基板表面で動物細胞を培養して、吸着用表面に動物細胞が付着した基板を得る工程、
を含む、動物細胞をアレイ状に配置した基板の調製方法。
[3]
アレイ状の各吸着用表面の寸法が、1つの吸着用表面に1つの動物細胞が付着できる寸法である、[1]または[2]に記載の調製方法。
[4]
前記基板は、非導電性の有機材料及び無機材料から成る群から選ばれる[1]～[3]のいずれかに記載の調製方法。
[5]
前記基板は、ガラス、プラスチックまたはセラミックスである、[1]～[3]のいずれかに記載の調製方法。
[6]
工程(3)における前記微弱電位が、-0.4Vから-0.2Vまたは+0.2Vから+0.5V(vs. Ag/AgCl)の範囲である、[1]～[4]のいずれかに記載の調製方法。
[7]
工程(4)における動物細胞の培養は、前記電極に-0.4Vから-0.2V(vs. Ag/AgCl)の範囲の電位を印加して、前記電極に対する動物細胞の付着を抑制しながら行う[2]～[6]のいずれかに記載の調製方法。
[8]
工程(4)における動物細胞の培養は、前記電極にプラスの電位を印加して、前記電極に動物細胞を付着させるように行い、吸着用表面及び電極に動物細胞が付着した基板を得る、[2]～[6]のいずれかに記載の調製方法。
　本発明によれば、動物細胞を個別に付着させることができる培養基板を形成でき、この培養基板を用いれば、動物細胞を一つずつ個別に基板表面上に配置することもできる。
実施例１における電極作製手順の説明図を示す。 工程(2)～(4)の説明図を示す。 細胞外マトリクスタンパク質として、FITC標識collagen Iを用いた場合のパターン電極表面の画像を示す。 細胞外マトリクスタンパク質として、FITC標識collagen Iを用いた場合のパターン電極表面の画像を示す。 細胞外マトリクスタンパク質として、FITC標識poly-L-lysinを用いた場合のパターン電極表面の画像を示す。 実施例２において得た、動物細胞(HeLa細胞)を24時間培養後の電極表面の画像を示す。 実施例３において得た、動物細胞(PC12細胞)を24時間培養後の電極表面の画像を示す。 参考例１におけるITO電極の表面の水に対する接触角の測定結果を示す。
　本発明は、動物細胞をアレイ状に配置するための基板の調製方法、及びこの基板を用いた、動物細胞をアレイ状に配置した基板の調製方法に関する。動物細胞をアレイ状に配置するための基板の調製方法は以下の工程(1)～(3)を含み、動物細胞をアレイ状に配置した基板の調製方法は、以下の工程(1)～(4)を含むものである。
工程(1)
　工程(1)は、電極基板表面にアレイ状に吸着用表面を有する基板を用意する工程である。電極基板は、絶縁性の基板の表面の一部または全部に電極を有するものであり、例えば、スライドガラスに酸化インジウム(ITO)をコーティングしたものであることができる。但し、絶縁性の基板は、スライドガラスに限定される意図ではなく、電極は、酸化インジウム(ITO) に限定される意図ではない。
　上記電極基板は、表面にアレイ状に吸着用表面を有するものである。吸着用表面は、細胞外マトリクスが吸着するための電極以外の表面であり、細胞外マトリクスが吸着し得る材料で構成される。細胞外マトリクスが吸着し得る材料は、例えば、ガラスであることができるが、非導電性の固体であれば特に制限はなく、非導電性の有機材料や無機材料であることができる。非導電性の有機材料や無機材料としては、ガラス以外に、例えば、プラスチックやセラミックス等を挙げることもできる。従って、吸着用表面としては、ガラス表面を例示できるが、ガラス表面に限定される意図ではなく、非導電性の有機材料や無機材料から適宜選択できる。尚、顕微鏡等で細胞外マトリクスの吸着や細胞の付着状態を観察する場合には、基板は透明なものであることが好ましい。
　アレイ状とは、例えば、縦列及び横列それぞれに複数の微小領域として、吸着用表面が配置されることを意味する。縦列及び横列それぞれの微小領域の数は特に制限はなく、動物細胞の種類(サイズ)や動物細胞をアレイ状に配置した基板の利用目的等に応じて適宜決定できるが、例えば、縦10～105×横10～105の範囲であることができる。但し、この範囲に限定される意図ではない。吸着用表面の形状は、矩形(三角形、正方形、長方形、多角形等)や円形、楕円形等、適宜決定できる。アレイ状の各吸着用表面の寸法は、1つの吸着用表面に1つの動物細胞が付着できる寸法であることができる。動物細胞の寸法は、細胞により様々であるので、付着させる動物細胞の寸法に応じて、吸着用表面の寸法は適宜決定できる。但し、例えば、動物細胞がHeLa細胞である場合、吸着用表面の寸法は、例えば、25～100μmの範囲であることができる。また、アレイ状の各吸着用表面の寸法は、1つの吸着用表面に2つ以上の動物細胞が付着できる寸法であることもできる。
　電極基板表面へのアレイ状吸着用表面は、例えば、基板表面に電極層をコーティングし、アレイ状吸着用表面用のマスクを電極層表面に形成し、次いで、マスクを介して電極層表面をエッチングし、マスクを除去することで形成することができる。あるいは、電極基板表面へのアレイ状吸着用表面の形成は、基板表面に電極層をアレイ状吸着用表面用のマスクを介してコーティングし、次いでマスクを除去することで形成することができる。電極層の形成や電極層表面のエッチング等は、常法を用いて適宜実施できる。
工程(2)
　工程(2)は、工程(1)で用意した基板の電極表面及び吸着用表面に細胞外マトリクスを吸着させる工程である。図2の工程(2)に示すように、基板の電極表面及び吸着用表面(アレイ電極表面)に細胞外マトリクスを吸着させる。
　細胞外マトリクスとは、細胞接着性のタンパク質であり、例えば、コラーゲン、プロテオグリカン、ヒアルロン酸、フィブロネクチン、ラミニン、テネイシン、エンタクチン等を含むものであることができる。細胞外マトリクスは、市販品を入手することができる。細胞外マトリクスの基板表面への吸着は、細胞外マトリクスを含む水溶液を基板表面に塗布するか、あるいは基板表面を上向きにした状態で細胞外マトリクスを含む水溶液に浸漬し、静置することで実施できる。
工程(3)
　工程(3)は、細胞外マトリクスを吸着させた基板の電極に微弱電位を印加することで電極表面の細胞外マトリクスを剥離して、吸着用表面に細胞外マトリクスが吸着した基板を得る工程である。図2の工程(3)に示すように、吸着用表面(中央部)の細胞外マトリクスの吸着と維持したままで、微弱電位を印加した電極表面の細胞外マトリクスは剥離する。微弱電位は、例えば、-0.4Vから-0.2Vまたは+0.2Vから+0.5V(vs. Ag/AgCl)の範囲であることが、吸着用表面に吸着した細胞外マトリクスは吸着を維持し、電極表面の細胞外マトリクスを剥離できるという観点から好ましい。微弱電位は、好ましくは、例えば、-0.4Vから-0.2V(vs. Ag/AgCl)の範囲である微弱電位の印加は、電極表面に吸着している細胞外マトリクスの量や細胞外マトリクスの種類に応じて適宜決定でき、例えば、2時間～24時間の範囲で実施することができる。微弱電位の印加による剥離後、基板表面を必要により洗浄して、遊離した細胞外マトリクスを除去することもできる。
　工程(1)～(3)により、動物細胞をアレイ状に配置するための基板を調製することかできる。ここまでで得られた動物細胞をアレイ状に配置するための基板は、さらに、以下の工程(4)に供して、動物細胞をアレイ状に配置した基板の調製に用いることができる。
工程(4)
　工程(4)は、工程(3)で得た基板表面で動物細胞を培養して、吸着用表面に動物細胞が付着した基板を得る工程である。図2の工程(4)Aに示すように、吸着用表面に動物細胞が付着する。基板表面で培養する動物細胞には特に制限はなく、例えば、ヒト正常細胞、ES細胞、iPS細胞、HeLa細胞、CHO細胞等であることができる。基板表面での動物細胞の培養条件は、動物細胞の種類に応じて公知の培養条件を適宜採用することができる。基板表面に、動物細胞を含む培養液を供給し、動物細胞の種類に応じた培養条件で培養すると、吸着用表面に細胞外マトリクスが吸着していることから、細胞外マトリクスに動物細胞が付着して、吸着用表面に動物細胞が付着する。これにより、動物細胞をアレイ状に配置した基板が調製される。
　尚、工程(4)における動物細胞の培養は、前記電極に-0.4Vから-0.2V(vs. Ag/AgCl)の範囲の電位を印加して、前記電極に対する動物細胞の付着を抑制しながら行うことかできる。図2の工程(4)Bに示すように、電極に-0.4Vから-0.2V (vs. Ag/AgCl)の範囲の電位を印加することで電極に対する動物細胞の付着を抑制し、吸着用表面に動物細胞が付着する。例えば、培養を血清中で行う場合、血清の中に細胞外マトリクスタンパク質が含まれることから、培養の間も-0.2Vから-0.4V（vs. Ag/AgCl）のマイナス電位印加をすることで、電極への細胞外マトリクスタンパク質の吸着を抑制することができ、その結果、動物細胞の電極への付着を抑制できる。また、無血清で培養を行う場合であっても、動物細胞が分泌する細胞外マトリクスにより、動物細胞が電極へ付着することもあり、この場合も、培養の間も-0.2Vから-0.4V（vs. Ag/AgCl）のマイナス電位印加をすることで、電極への細胞外マトリクスタンパク質の吸着を抑制し、動物細胞の電極への付着を抑制できる。さらに、動物細胞がマイナスチャージを持つことから、上記マイナス電位を印加した電極基板表面上に対しては、動物細胞の付着も抑制できる。これにより、マイナス電位を印加した電極表面上に動物細胞が付着せず、動物細胞を付着させたいアレイ状パターン部分のみに細胞を付着させることができる。
　さらに、工程(4)における動物細胞の培養は、前記電極にプラスの電位を印加して、前記電極に動物細胞を付着させるように行い、吸着用表面及び電極に動物細胞が付着した基板を得ることもできる。上記のように動物細胞はマイナスチャージを持つので、プラスの電位を印加した電極基板表面上に静電的な引力により、動物細胞を誘導付着させることができる。そのため、前記電極にプラスの電位を印加すると、コラーゲン等の細胞外マトリクスタンパク質がコートされていない場所にも細胞を良好に付着させることができる。プラスの電位は、静電的な引力による動物細胞の誘導付着と動物細胞に対してダメージを与えないという観点から例えば、+0.2Vから+1.0V（vs. Ag/AgCl）、好ましくは+0.2Vから+0.6V（vs. Ag/AgCl）の範囲であることが適当である。
　本発明の方法で調製された動物細胞をアレイ状に配置した基板は、例えば、動物細胞の性質を調べたり、動物細胞から排出される物質を調べたりするために用いることができる。特に、アレイ状に動物細胞を培養基板表面上に一つずつ配置することで、物理化学的な刺激によって活性化されるメカニズムを単一細胞レベルで解析することもできる。さらに、電極基板表面及び電極基板表面近傍の吸着用表面に付着した細胞は、例えば、周波数が1KHz～10MHzの範囲であり、かつ±1.0V(vs Ag/AgCl) またはそれより小さい電位の幅である高周波変動電位(波形は、例えば、矩形波、正弦波、または三角波)を電極に印加することで、剥離することができる。但し、剥離時の培養液はリン酸緩衝液(Ca2+、Mg2+不含)とすることが、剥離を容易にするという観点から好ましい。
　以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
実施例1
(1)電極作製
　以下の手順に従って、電極及び３電極培養系を作製した。図1に電極作製の手順の説明図を示す。
１）スライドグラス(図1左上)上の中央部に酸化インジウム（ITO）を6.3～7.5Ω/cm2でコーティングしたパターン電極(1cm×1cm)を作製した（図1左下）。パターン電極は、左下に示すように、4つの領域に分けて作製され、各領域のパターンA～Dは図1の中央に示す。黒い部分がガラス表面で、白い部分がITO電極表面である。
２）このスライドグラスの端の部分をダイヤモンドドリルで穴をあけ、導電性樹脂（Dotite, D-550, 藤倉化成（株））で導線とITO電極をつなげた。
３）ラブテックチェンバースライド(Lab-tek chamber slike, 177410, NalgeNunc)のチェンバー部分を取り外し、水槽修復用のシリコンボンド(東芝シリコーン, TSE382-C クリア)でITOパターン電極上に接着した。
４）ラブテックチェンバースライドのフタ部分を２か所、ダイヤモンドドリルで穴をあけ、白金電極と銀/塩化銀電極を接続した。
５）フタとチェンバーを組み合わせて、３電極培養系（右上写真）を完成させた。
(2)細胞外マトリックスタンパク質の吸着
　(1)で作製された３電極培養系の電極表面に、以下の手順で細胞外マトリックスタンパク質を吸着させた。
１）ITOパターン電極チェンバーを５分間、蒸留水中で超音波洗浄した。
２）ITOパターン電極チェンバー内に、1M NaOHを加え、５分間静置した。
３）ITOパターン電極チェンバーをPBS(-)で軽く洗浄後、クリーンベンチ内で５分間UV殺菌処理した。
４）0.1mg/mlのFITC標識poly-L-lysin(Sigma)in PBS(-)、または0.1mg/mlのFITC標識collagen I(Sigma)in 0.01M HCl水溶液をチェンバー内に加え、３７℃、１０分間静置した。
５）PBS(-)でチェンバー内を２回軽くすすいだ後、ITOパターン電極チェンバーを４℃で保存するか、実験にすぐに使用した。
(3)電位印加
　(2)で電極表面に細胞外マトリックスタンパク質を吸着させた後に以下の手順で電位印加を行って、電極表面から細胞外マトリクスタンパク質を剥離した。
１）ITOパターン電極チェンバー内にPBS(-)を5ml加えた。
２）電極をつなげたフタをセットし、３電極培養系とした。
３）ポテンシオスタット（PS-14, Toho technical research）で、定電位を印加することで、細胞外マトリクスタンパク質を剥離した。
４）定電位印加後PBS(-)で軽くすすぐ。その後、共焦点レーザー顕微鏡（FV500, Olympus）で細胞外マトリクスタンパク質の分布を観察した。
(4)結果
　細胞外マトリクスタンパク質として、FITC標識collagen Iを用いた場合の結果を図3及び4に示す。図3は、-0.4V、-0.3V、-0.2V、+0.3V、または+0.4Vの定電位(vs. Ag/AgCl)をPBS(-)中で24時間印加した場合に得られた電極表面のFITCの蛍光画像である。パターン化されたガラス表面(四角)に蛍光が観察され、FITC標識collagen Iが吸着していることを示し、その周囲のITO電極部分には蛍光が観察されず、FITC標識collagen Iが剥離されていることを示す。
　図4は、印加した定電位(vs. Ag/AgCl)を+0.4Vにし、印加時間を0～16時間変化させた場合に得られた電極表面のFITCの蛍光画像である。0～8時間では、パターン化されたガラス表面(四角)の周囲のITO電極部分にも蛍光が観察されるが、8～16時間では、パターン化されたガラス表面(四角)にのみ蛍光が観察され、FITC標識collagen Iが吸着していることを示し、その周囲のITO電極部分には蛍光が観察されず、FITC標識collagen Iが剥離されていることを示す。
　細胞外マトリクスタンパク質として、FITC標識poly-L-lysin(Sigma)を用いた場合の結果を図5に示す。図5は、-0.4V、-0.3V、-0.2V、+0.2V、+0.3V、+0.4V、または+0.5Vの定電位(vs. Ag/AgCl)をPBS(-)中で24時間印加した場合に得られた電極表面のFITCの蛍光画像である。-0.4V、-0.3V、+0.3V、+0.4V及び+0.5Vの定電位(vs. Ag/AgCl)を24時間印加した場合には、パターン化されたガラス表面(四角)に蛍光が観察され、FITC標識poly-L-lysinが吸着していることを示し、その周囲のITO電極部分には蛍光が観察されず、FITC標識poly-L-lysinが剥離されていることを示す。-0.2V及び+0.2Vの定電位(vs. Ag/AgCl)を24時間印加した場合には、パターン化されたガラス表面(四角)の周囲のITO電極部分にも蛍光が観察された。
実施例2
　実施例1で、細胞外マトリクスタンパク質としてFITC標識collagen Iを用い、-0.3Vの定電位(vs. Ag/AgCl)をPBS(-)中で42時間印加して得られたパターン電極のチェンバー内に、血清含有培地に懸濁させた動物細胞(HeLa細胞)１×105 cells/wellを播種し、24時間培養した。培養の間(24時間)、-0.3Vの定電位をさらに印加した。電位印加２４時間後、細胞や細胞外マトリクスタンパク質の分布を共焦点レーザー顕微鏡（FV500, Olympus）や位相差顕微鏡(CKX-41, Olympus)で観察した。24時間培養後の電極表面の画像を図6に示す。FITC標識collagen Iが吸着したガラス表面(四角)上に動物細胞(HeLa細胞)が付着しているのが分かる。100Ｘ100μｍ2および50Ｘ50μｍ2は、細胞をガラス基板上のみに配置することに成功している。25Ｘ25μｍ2まで細胞の配置制御が可能であることを示す。
実施例3
　実施例1で、細胞外マトリクスタンパク質としてFITC標識collagen Iを用い、+0.4Vの定電位(vs. Ag/AgCl)をPBS(-)中で66時間印加して得られたパターン電極のチェンバー内に、血清含有培地に懸濁させた動物細胞(PC12細胞)を播種し、24時間培養した。培養の間(24時間)、+0.4Vの定電位をさらに印加した。電位印加２４時間後、細胞や細胞外マトリクスタンパク質の分布を共焦点レーザー顕微鏡（FV500, Olympus）や位相差顕微鏡(CKX-41, Olympus)で観察した。24時間培養後の電極表面の画像を図7に示す。FITC標識collagen Iが吸着していないITO電極基板表面上に動物細胞(PC12細胞)が付着しているのが分かる。
参考例1
　ITO電極に定電位を印加したときのITO電極の表面の水に対する接触角を測定した。測定は、シクロオクタンを満たした電解槽中のITO電極の表面に水滴を載せ、定電位印加(24時間)前後の接触角を測定することで行った。結果を図8に示す。-0.4V及び+0.4Vの定電位(vs. Ag/AgCl)の印加により、水に対する接触角が約20～40%低下し、親水性が増加することが分かる。この結果から、本発明における細胞外マトリクスタンパク質の定電位印加による剥離は、電極表面の親水性の増加が一因であると推察される。
　本発明は動物細胞の培養関連分野に有用である。

Claims (8)

  1. (1)電極基板表面にアレイ状に吸着用表面を有する基板を用意する工程、
    (2)前記基板の電極表面及び吸着用表面に細胞外マトリクスを吸着させる工程、及び
    (3)前記電極に微弱電位を印加して、電極表面の細胞外マトリクスを剥離して、吸着用表面に細胞外マトリクスが吸着した基板を得る工程、
    を含む、動物細胞をアレイ状に配置するための基板の調製方法。
  2. (1)電極基板表面にアレイ状に吸着用表面を有する基板を用意する工程、
    (2)前記基板の電極表面及び吸着用表面に細胞外マトリクスを吸着させる工程、
    (3)前記電極に微弱電位を印加して、電極表面の細胞外マトリクスを剥離して、吸着用表面に細胞外マトリクスが吸着した基板を得る工程、及び
    (4)工程(3)で得た基板表面で動物細胞を培養して、吸着用表面に動物細胞が付着した基板を得る工程、
    を含む、動物細胞をアレイ状に配置した基板の調製方法。
  3. アレイ状の各吸着用表面の寸法が、1つの吸着用表面に1つの動物細胞が付着できる寸法である、請求項1または2に記載の調製方法。
  4. 前記基板は、非導電性の有機材料及び無機材料から成る群から選ばれる請求項1～3のいずれかに記載の調製方法。
  5. 前記基板は、ガラス、プラスチックまたはセラミックスである、請求項1～3のいずれかに記載の調製方法。
  6. 工程(3)における前記微弱電位が、-0.4Vから-0.2Vまたは+0.2Vから+0.5V(vs. Ag/AgCl)の範囲である、請求項1～4のいずれかに記載の調製方法。
  7. 工程(4)における動物細胞の培養は、前記電極に-0.4Vから-0.2V(vs. Ag/AgCl)の範囲の電位を印加して、前記電極に対する動物細胞の付着を抑制しながら行う請求項2～6のいずれかに記載の調製方法。
  8. 工程(4)における動物細胞の培養は、前記電極にプラスの電位を印加して、前記電極に動物細胞を付着させるように行い、吸着用表面及び電極に動物細胞が付着した基板を得る、請求項2～6のいずれかに記載の調製方法。
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