WO2011051906A1 - Procede de ligation native de polypeptides - Google Patents

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WO2011051906A1
WO2011051906A1 PCT/IB2010/054897 IB2010054897W WO2011051906A1 WO 2011051906 A1 WO2011051906 A1 WO 2011051906A1 IB 2010054897 W IB2010054897 W IB 2010054897W WO 2011051906 A1 WO2011051906 A1 WO 2011051906A1
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WO
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polypeptide
formula
amino acid
ligation reaction
trt
Prior art date
Application number
PCT/IB2010/054897
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English (en)
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Reda Mhidia
Julien Dheur
Nathalie Ollivier
Oleg Melnyk
Original Assignee
Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
Institut Pasteur De Lille
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/02—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length in solution
    • C07K1/026—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length in solution by fragment condensation in solution

Definitions

  • the present invention relates to a process for the native ligation of polypeptides.
  • the invention also relates to functionalized polypeptides useful for implementing this native ligation method, as well as to a method of manufacturing these functionalized polypeptides.
  • the invention also relates to an amino compound and a functionalized resin, which are useful for implementing the method for manufacturing the functionalized polypeptides.
  • the link between the polypeptides assembled by ligation is native, that is to say corresponds to the natural structure of the polypeptides.
  • the main native ligation method existing to date is that of Kent and Dawson, which is described for example in WO 96/34878 and WO 98/28434.
  • This method is based on a chemoselective reaction between a peptide thioester (C terminal) and a cysteinyl peptide.
  • the main disadvantage of this method is that the manufacture of the thioester peptides requires complex chemical processes.
  • An alternative method is the so-called Staudinger ligation described in WO 01/68565 and WO 01/87920. This includes reacting a phosphinothioester with an azide and hydrolyzing the combined reagents to form an amide bond. This method is difficult to apply on an industrial scale.
  • a third method, described in WO 2007/037812, is based on the reaction of an ⁇ -keto acid with an amine in a decarboxylative condensation reaction. However, ketoacids are molecules that are difficult to make and incorporate into peptides. Also, this third method is difficult to apply in peptide synthesis laboratories that do not have the means to perform complex organic syntheses.
  • the invention relates first of all to a process for producing a polypeptide of formula:
  • Xi and X 2 each represent a peptide fragment, and X "represents an amino acid residue having a thiol function, said method comprising at least one ligation reaction step between a polypeptide of the formula:
  • the ligation reaction is carried out by bringing into contact a polypeptide of formula:
  • X 2 represents a peptide fragment of formula
  • n being an integer greater than or equal to 3
  • each X, ', for i integer between 2 and n represents a peptide fragment
  • the method comprising, prior to ligation reaction step between the polypeptide of formula (I) and the polypeptide of formula (II), a succession of n-2 stages of ligation reaction, the j th step of a ligation reaction, for an integer between 1 and n-2, being a ligation reaction between a polypeptide of formula:
  • one or more of the n-2 ligation reaction steps between the polypeptide of formula (V) and the polypeptide of formula (VI) is carried out by bringing into contact a polypeptide of formula:
  • j being an integer between 1 and n-2, in the presence of at least one disulfide bond reducing compound.
  • the invention also relates to a method for producing a cyclic polypeptide of formula:
  • the ligation reaction is carried out by bringing into contact a pol peptide of formula:
  • the ligation reaction (s) are carried out in an aqueous medium, preferably at a pH of between 6.5 and 8.5, more preferably between 7 and 8, and most preferably about 7.5.
  • the ligation reaction (s) are carried out in the presence of at least one disulfide-reducing compound, of presence chosen from tris (2-carboxyethyl) phosphine, 4-mercaptophenylacetic acid, dithiothreitol, benzyl mercaptan and mixtures thereof.
  • the invention furthermore relates to a polypeptide of formula:
  • Xi comprises between 2 and 300 amino acid residues, preferably between 5 and 100 amino acid residues, more particularly preferably between 8 and 50 amino acid residues.
  • the invention also relates to a process for producing a polypeptide of formula:
  • Xi representing a peptide fragment, comprising at least one peptide synthesis step and a C-terminal functionalization step.
  • the peptide synthesis step precedes the functionalization step; the peptide synthesis step provides a polypeptide of formula:
  • the functionalization step comprises:
  • d represents a protecting group, said protecting group preferably forming a thioether, thioester or disulfide function, and more preferably being triphenylmethyl group, in the liquid phase, to form the polypeptide of formula (I); - optionally deprotection of the polypeptide of formula (I).
  • the invention also relates to a polymer resin support for the synthesis of solid phase polypeptides, comprising a main backbone and NH- (CH 2 CH 2 -S-Trt-) 2 functional groups or NH- (CH) functional groups.
  • Trt represents a triphenylmethyl group optionally substituted with one or more substituents, in particular chosen from the substituents chlorine, methoxy, methyl, fluorine and cyano; in which the functional groups NH- (CH 2 CH 2 -S-Trt-) 2 are linked to the main backbone by the two triphenylmethyl groups, or the functional groups NH- (CH 2 CH 2 -S-Trt-CO-NH- ) 2 are linked to the main skeleton by the two amino groups.
  • the invention also relates to a polymer resin support for the synthesis of solid phase polypeptides, comprising a main backbone and functional groups G 2 -AA-N- (CH 2 CH 2 -S-Trt-) 2 or functional groups G 2 -AA-N- (CH 2 CH 2 -S-Trt-CO-NH-) 2 , where Trt represents a triphenylmethyl group optionally substituted by one or more substituents, in particular chosen from the substituents chlorine, methoxy, methyl fluorine and cyano; AA represents an amino acid residue optionally comprising one or more protective groups; G 2 represents a hydrogen atom or an amino functional protective group; in which the functional groups G 2 -AA-N (CH 2 CH 2 -S-Trt-) 2 are linked to the main backbone by the two triphenylmethyl groups or the functional groups G 2 -AA-N- (CH 2 CH 2 - S-Trt-CO-NH-) 2 are linked to the main backbone by the two amino
  • the main skeleton is chosen from polystyrene, polyacrylamide, polyethylene glycol, cellulose, polyethylene, polyester, latex, polyamide, polydimethylacrylamide, polyethylene glycol-polystyrene copolymer, polyethylene glycol-polyacrylamide copolymer and their derivatives skeleton .
  • the invention also relates to a method of manufacturing a polymer resin support for the synthesis of solid phase polypeptides, comprising:
  • the method comprises, prior to the functionalization step of the polymer resin:
  • d is a protecting group, said protecting group preferably forming a thioether, thioester or disulfide function, and more preferably being triphenylmethyl;
  • the functionalization step precedes the peptide synthesis step
  • the functionalization step comprises:
  • a primer support which is a polymeric resin support comprising a main backbone and functional groups G 2 -AA-N- (CH 2 CH 2 -S-Trt-) 2 or functional groups G 2 -AA- N- (CH 2 CH 2 -S-Trt-CO-NH-) 2 , as described above;
  • the peptide synthesis step comprises a succession of amino acid couplings on the primer support.
  • the coupling of an amino acid to the polymer resin support comprises placing the polymer resin support in the presence of an amino acid halide or with an amino acid and an activating agent, preferably selected from PyBOP, BOP, PyBROP, more preferably PyBROP.
  • the subject of the invention is also a method of manufacturing a polypeptide of formula: ( ⁇ )
  • Xi represents a peptide fragment, comprising a step of oxidizing a polypeptide of formula:
  • this comprises a step of manufacturing the polypeptide of formula (I) and / or (V) or (XI) which is according to the process for producing the polypeptide of formula (I) described above, or a step of manufacturing the polypeptide of formula ( ⁇ ) and / or (V) or ( ⁇ ) according to the process for producing the polypeptide of formula ( ⁇ ) described above.
  • the invention also relates to a method of manufacturing a pharmaceutical composition comprising:
  • the invention also relates to a method of manufacturing a diagnostic device comprising:
  • this polypeptide in a form suitable for a diagnostic use.
  • the subject of the invention is also an amine compound of formula:
  • Trt represents the triphenylmethyl group.
  • the present invention overcomes the disadvantages of the state of the art.
  • it provides a process for the native ligation of polypeptides, which is both efficient and simpler to implement than previous methods, including on an industrial scale.
  • the invention also has one or preferably more of the advantageous features listed below.
  • the ligation method according to the invention optionally uses unprotected polypeptide reagents, in particular when a single ligation is carried out.
  • the use of protected polypeptides is delicate because of their low solubility, and because it also requires a deprotection step after ligation, resulting in additional cost and a possibility of degradation.
  • the invention thus makes it possible to avoid the disadvantages related to protected polypeptides, in particular when a single ligation is performed.
  • the method according to the invention leads directly to the formation of a native link at the point of ligation, without the need for deprotection after ligation.
  • the method of ligation according to the invention relies on the use of polypeptides modified with chemically stable functional groups, which are easy to introduce using conventional peptide synthesis techniques.
  • the invention makes it possible to use proteinogenic amino acids for the synthesis of peptide fragments. Thus, it is unnecessary to resort to the manufacture of amino acid derivatives (such as ketoacids for example), which considerably increases the synthesis.
  • the assembly of the polypeptide reagents can be carried out conventionally, for example using Fmoc / tert-butyl chemistry. Therefore, the method according to the invention is compatible with the industrial and automated synthesis processes currently available. Suitable amino acids and solid carriers are currently available in large quantities and at low cost.
  • the invention provides a ligation in an aqueous medium, which is compatible with the solubility of peptides and proteins.
  • the ligation reaction according to the invention can be carried out efficiently at a pH close to 7.5, that is to say under conditions compatible with the complex polypeptides or proteins.
  • the ligation reaction according to the invention offers a possibility of auto-ligation of a polypeptide, and thus of making cyclic polypeptides.
  • Fig. 1 represents the follow-up in RP-HPLC (reverse phase high performance liquid chromatography) of the native ligation between the polypeptide 1c and the polypeptide 2, to obtain the polypeptide 3c, according to Example 7.
  • Figs. 2a and 2b represent the RP-HPLC (reverse phase high performance liquid chromatography) monitoring of the native ligation between the 1 d polypeptide and the polypeptide 2, to obtain the 3d polypeptide, according to Example 7.
  • Figs. 3a to 3c represent the RP-HPLC (reverse phase high performance liquid chromatography) monitoring of the native ligation between the 1f polypeptide and the polypeptide 2, to obtain the polypeptide 3f, according to Example 7.
  • polypeptide is meant, in the context of the present application, a linear chain of amino acid residues (in number greater than or equal to two) connected by peptide bonds.
  • the "polypeptides” in the sense of the present application may therefore for example be oligopeptides, peptides or proteins according to the conventional meaning of these terms.
  • the amino acid residues present in the polypeptides according to the invention may be chosen from proteinogenic or non-proteinogenic amino acid residues. Preferably, they are chosen from the twenty proteinogenic amino acid residues.
  • Polypeptides are scored from the N-terminus to the C-terminus.
  • the amino acid residues present along the polypeptide chain are denoted according to the usual one-letter or three-letter code.
  • peptide fragment is meant, in the context of the present application, a portion of polypeptide comprising at least one amino acid residue.
  • a peptide fragment within the meaning of the present application, may therefore be, for example: an amino acid residue sequence (such as -AHG- or -Ala-His-Gly-) if the peptide fragment does not comprise the end N-terminally nor the C-terminus of the polypeptide; or a sequence of amino acid residues having a group at its N-terminus (such as H-AHG- or H-Ala-His-Gly-) if the peptide fragment comprises the N-terminus of the polypeptide; or a sequence of amino acid residues having a group at its C-terminus (such as -AHG-OH or -Ala-His-Gly-OH) if the peptide fragment comprises the C-terminus of the polypeptide.
  • Native binding of polypeptides such as -AHG- or -Ala-His-Gly
  • the invention provides a method for native ligation of polypeptides, wherein a polypeptide of formula:
  • the peptide fragment Xi is of the form Yi-AAiAA 2 ... AA n .
  • Yi is an N-terminal group, preferably a hydrogen atom, but also also any substituent group for primary or secondary amines known to those skilled in the art, for example an acyl group and in particular an acetyl group.
  • n is an integer greater than or equal to 2.
  • Each AA represents an amino acid residue.
  • An example of a polypeptide of formula (I) is the polypeptide 1a (see Example 3 below) of formula:
  • the peptide fragment Xi is H-GFGQGFGG.
  • the polypeptide of formula (I) preferably comprises between 2 and 300 amino acid residues, preferably between 5 and 100 amino acid residues, more preferably between 8 and 50 amino acid residues.
  • the polypeptide of formula (II) comprises a hydrogen atom and an X "residue at the N-terminus
  • the X" residue is an amino acid residue having a thiol function.
  • This thiol function may in particular be a beta-amino thiol function (in which case the residue X "preferably represents the cysteine residue) or a gamma-amino thiol function (in which case the residue X" preferably represents the homocysteine residue).
  • X can be read as representing a cysteine residue (Cys).
  • X 2 represents a peptide fragment, which comprises the C-terminal end of the polypeptide of formula (II) as well as the set of amino acid residues of this polypeptide, with the exception of N-terminal residue.
  • the peptide fragment X2 is of the form AA2'AA 3 '... AA n ' -Y2.
  • Y 2 is a terminal group, preferably a group -OH or -NH 2 or a group -OR or -NRR ', R and R' each representing an alkyl or aryl group.
  • n is an integer greater than or equal to 2.
  • Each AA ' represents an amino acid residue.
  • the polypeptide of formula (II) preferably comprises between 2 and 300 amino acid residues, preferably between 5 and 100 amino acid residues, more preferably between 8 and 50 amino acid residues.
  • the polypeptide of formula (II) can for example be obtained by a usual peptide synthesis method, in particular a solid phase synthesis method. It can also be obtained by means of a previous native ligation (see below).
  • Each of the polypeptides of formula (I) and (II) preferably comprises only amino acid residues selected from the twenty proteinogenic amino acid residues.
  • the polypeptides of formula (I) and (II) comprise one or more non-proteinogenic amino acid residues.
  • amino acid residues of the polypeptides of formula (I) and (II) may optionally be protected by protective groups of the side chains.
  • the presence of the two free thiol groups on the polypeptide of formula (I) is essential.
  • the ligation is said to be native because the peptide fragment Xi is linked to the peptide fragment X "-X 2 by an amide bond.
  • a disulfide bond reducing compound which may preferably be a thiol compound such as 4-mercaptophenylacetic acid (MPAA), dithiothreitol (DTT), thiophenol (and its derivatives), an alkylthiol (especially benzylmercaptan) or a phosphine such as tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP).
  • MPAA 4-mercaptophenylacetic acid
  • DTT dithiothreitol
  • TCEP thiophenol
  • TCEP phosphine
  • the joint use of several of these compounds is also appropriate, for example the use of MPAA and TCEP.
  • polypeptide of formula ( ⁇ ) is then reduced in situ and provides the polypeptide of formula (I) for the ligation reaction.
  • the ligation reaction from the polypeptide of formula ( ⁇ ) as a reagent may be more convenient to carry out than the ligation reaction directly with the polypeptide of formula (I).
  • the polypeptide of formula (I) has a natural tendency to oxidize to the polypeptide of formula ( ⁇ ), especially under the action of oxygen in the air.
  • a preparation of the polypeptide of formula (I) generally necessarily contains in part the polypeptide of formula ( ⁇ ). The presence of these two forms can complicate characterization and purification.
  • MPAA when present, is used at a concentration of between 1 and 500 mM, for example at a concentration of about 200 mM in the reaction.
  • TCEP when present is used at a concentration of between 1 and 200 mM, for example at a concentration of about 80 mM in the reaction.
  • the N-terminal amino acid residue of the polypeptide (I) has a thiol function, it must be protected during ligation, otherwise there is a concurrent cyclization reaction of the polypeptide of formula ( I).
  • the alpha amino function can be protected to avoid the cyclization reaction. It is possible, for example, to use a thiazolidine-type protection, which simultaneously protects the thiol and the alpha amine.
  • the ligation reaction is preferably carried out in the liquid phase, and in particular in an aqueous medium, for example in a phosphate buffer.
  • this reaction is carried out at a pH of between 6.5 and 8.5, more preferably at a pH of between 7 and 8 and ideally at a pH in the region of 7.5.
  • the ligation reaction is preferably carried out at 0 to 50 ° C, and most preferably at a temperature of about 37 ° C.
  • the duration of the reaction is adjusted according to the choice of reagents and other reaction conditions. The appropriate time may also be adjusted according to the results of a liquid chromatography-mass spectrometry analysis during the reaction. The appropriate duration will typically be from a few hours to a few days.
  • Each of the polypeptides of formula (I) and (II) is preferably present at a concentration of between 0.01 and 50 mM, during the reaction.
  • the molar concentration ratio between the polypeptides of formula (I) and (II) during the reaction is preferably between 2: 3 and 3: 2.
  • the ligation reaction described above may be followed by a purification step of the polypeptide of formula (III) obtained, for example by liquid chromatography or by any other usual technique. Production of a polypeptide with several successive native ligations
  • the invention also makes it possible to produce polypeptides by sequentially linking several ligation reactions as described above. This may be appropriate for obtaining large polypeptides, for example polypeptides comprising greater than about 100 amino acid residues. Indeed, in such cases the manufacture of polypeptides of formulas (I) and (II) by direct synthesis may have a low yield, and it is therefore advantageous to use two or more successive ligations, in order to have synthesize directly only polypeptides comprising for example less than about 50 amino acid residues.
  • the use of two successive ligations makes it possible to obtain a polypeptide comprising approximately 150 amino acid residues without having to directly synthesize polypeptide comprising more than approximately 50 amino acid residues; the use of three successive ligations makes it possible to obtain a polypeptide comprising approximately 200 amino acid residues without having to directly synthesize a polypeptide comprising more than approximately 50 amino acid residues.
  • the process according to the invention makes it possible to obtain a polypeptide of formula (III) in which the peptide fragment X2 is of the form X 2 '-X3 "-X3'- ...- X n " -X n ' (n being an integer greater than or equal to 3, each X, ', for i integer between 2 and n, being a peptide fragment, and each X', for i integer between 3 and n, being a residue X ', c' i.e., an amino acid residue having a thiol function, and especially a cysteine residue according to a particular embodiment) using n-1 successive ligations.
  • the polypeptide obtained in this case has the formula:
  • the first ligation reaction involves, on the one hand, a polypeptide of formula
  • the thiol function or the N-terminal amino function (or the thiol function and the amino function) of the amino acid residue X n- "must be protected in the polypeptide of formula (Va) during the ligation, otherwise results in a cyclizing reaction of the polypeptide of formula (Va), for example a thiazolidine-type protection.
  • the second ligation reaction involves on the one hand a polypeptide of formula:
  • the ligation reaction number j (for j integer between 1 and n-2) involves a polypeptide of formula
  • Each of the successive ligation reactions can be performed as described in the section "Native Ligation of Polypeptides".
  • the ligation reaction number j for an integer between 1 and n-2
  • the polypeptide of formula (VI) into contact with the polypeptide of formula:
  • polypeptide of formula (V) being then reduced in situ and providing the polypeptide of formula (V) for the ligation reaction.
  • the principles used for the native ligation described above can also be used to produce cyclic polypeptides, by native auto-ligation of a polypeptide (ligation of one end of the polypeptide with the other end of the same polypeptide).
  • the invention thus proposes a method for producing a cyclic polypeptide of formula:
  • the polypeptide of formula (XI) preferably comprises between 2 and 300 amino acid residues, preferably between 5 and 100 amino acid residues, more preferably between 8 and 50 amino acid residues.
  • the polypeptide of formula (XI) comprises a hydrogen atom and a residue X "at the N-terminus, X" having the meaning indicated above.
  • X 2 herein represents a peptide fragment of the form AAiAA 2 ... AA n where n is an integer greater than or equal to 1 and each AA represents an amino acid residue.
  • the polypeptide of formula (XI) preferably comprises only amino acid residues selected from the twenty proteinogenic amino acid residues. However, according to a particular embodiment, the polypeptide of formula (XI) comprises one or more non-proteinogenic amino acid residues.
  • amino acid residues of the polypeptide of formula (XI) may optionally be protected by protective groups of the side chains.
  • polypeptide of formula ( ⁇ ) is then reduced in situ and provides the polypeptide of formula (XI) for the ligation reaction.
  • the cyclization of the polypeptide of formula (XI) is not hindered by competing multimerizations, if the reaction is carried out under sufficiently diluted conditions.
  • a concentration of polypeptide of formula (XI) of between 0.01 and 50 mM, typically of approximately 1 mM (or possibly between 0.01 and 0.1 mM in case of serious risks of multimerizations).
  • the ligation reaction described above may be followed by a purification step of the cyclic polypeptide of formula (X) obtained, for example by liquid chromatography or by any other usual technique.
  • polypeptides of formula (I), (V) and (XI) are compounds that are useful for carrying out the ligation reaction described above.
  • the subject of the invention is therefore also those polypeptides of formula (I) (or of formula (V) or (XI)) as such, as well as a process making it possible to manufacture them.
  • the process for producing the polypeptides of formula (I) involves two main stages: a peptide synthesis step; and
  • the invention provides two main variants of this method.
  • the peptide synthesis precedes the functionalization.
  • the peptide synthesis follows the functionalization.
  • the second variant makes it possible to obtain a higher yield and is easier to implement on an industrial scale.
  • the first step (peptide synthesis step) makes it possible to obtain the polypeptide of formula:
  • This peptide synthesis step can be carried out according to any method known to those skilled in the art. It may in particular be carried out in the liquid phase or, preferably, in the solid phase.
  • peptide synthesis comprises a succession of amino acid couplings from a primer (initial amino acid or peptide fragment resulting from previous amino acid additions) and deprotections. More specifically, the peptide synthesis may successively comprise:
  • step (c) deprotecting the N-terminus of the bound amino acid, to provide the peptide fragment of the following step (a).
  • the peptide fragment (primer) is bound to a solid support at its C-terminus.
  • the solid support is preferably a polymer in the form of insoluble or soluble particles (beads). It is possible, for example, to use resins based on polystyrene, polyacrylamide, polyethylene glycol, cellulose, polyethylene, polyester, latex, polyamide, polydimethylacrylamide and resins derived therefrom. It is also possible to use a silica gel or glass beads as a solid support.
  • linker or "linker”
  • linker a suitable functional group
  • the amino acid corresponding to the C-terminal end of the polypeptide to be synthesized is fixed on the linker functional groups of the solid support (protecting the amine function of the amino acid during coupling and then deprotecting it to make it available for the next reaction), which is the first primer, then the following amino acids are added according to the sequence of reactions recalled above.
  • an activator compound especially a carbodiimide (for example dicyclohexylcarbodiimide or diisopropylcarbodiimide) in the presence of a triazole (for example 1-hydroxy-benzotriazole or 1-hydroxy-7-azabenzotriazole ), or a phosphonium or uronium salt of a non-nucleophilic anion (eg HBTU, HATU, TBTU or PyBOP); or alternatively to use activated amino acids in the form of acid halides, for example acid fluorides.
  • a carbodiimide for example dicyclohexylcarbodiimide or diisopropylcarbodiimide
  • a triazole for example 1-hydroxy-benzotriazole or 1-hydroxy-7-azabenzotriazole
  • a phosphonium or uronium salt of a non-nucleophilic anion eg HBTU, HATU, TBTU or PyBOP
  • the N-terminal ends of the amino acids are advantageously protected by a protective group, preferably a Fmoc (9H-fluoren-9-ylmethoxycarbonyl) group or a t-Boc (tert-butoxycarbonyl) group. or NSC (2- (4-nitrophenylsulfonyl) ethoxycarbonyl).
  • the side chains of the amino acid residues are preferably protected during the various coupling reactions by one or more suitable protecting groups, for example a tert-butyl group for the chains carrying a carboxylic function.
  • polypeptide of formula (IX) is functionalized.
  • the functionalization step comprises successively:
  • a protective group preferably chosen from the family of carbamates, amides or alkyl groups, and especially a tert-group; butoxycarbonyl (t-Boc), Fmoc (9H-fluoren-9-ylmethoxycarbonyl), trifluoroacetyl or triphenylmethyl.
  • polypeptide of formula (IX) can be provided directly in a form in which all the amine and carboxylic functions are protected, by providing a selective deprotection of the COOH function of the C-terminal end.
  • d is preferably chosen from groups providing a thioether, thioester (for example acetyl) or disulfide (for example tert-butylsulfenyl) function. More preferably, d is the triphenylmethyl group.
  • the amine compound is bis ( ⁇ 2- [triphenylmethyl) sulfanyl] ethyl ⁇ ) amine.
  • An activator is advantageously present during the coupling reaction, for example benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP) or bromotrispyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBROP) or the C-terminal amino acid itself activated. in the form of a halogenated derivative (in particular in the form of an amino acid fluoride or amino acid chloride), which can be preformed or formed in situ using suitable reagents known from the art. skilled in the art.
  • amino acid fluorides are preferred, preformed by reaction with 1,3,5-trifluorotriazine or formed in situ using TFFH (tetramethylfluoroformamidinium hexafluorophosphate).
  • TFFH tetramethylfluoroformamidinium hexafluorophosphate
  • any reagent for activating the carboxylic acid function of the amino acid known to those skilled in the art such as HBTU, TBTU, HATU, BOP ...
  • HBTU HBTU
  • TBTU TBTU
  • HATU hexafluorophosphate
  • BOP tetramethylfluoroformamidinium hexafluorophosphate
  • the polypeptide of formula (I) is obtained. It is advantageous to provide at this stage a purification step of the compound, for example by liquid chromatography.
  • the functionalization step precedes the peptide synthesis step.
  • This second variant is implemented in solid phase.
  • the functionalization step consists in this embodiment of creating a solid support primer from a previously functionalized solid support.
  • a soluble or insoluble polymer is used, the insoluble polymer preferably being in the form of particles (beads).
  • the insoluble polymer preferably being in the form of particles (beads).
  • the solid support has linking groups which are preferably chloro-triphenylmethyl (or chlorotrityl) groups, where the triphenylmethyl is optionally substituted by one or more substituents, in particular chosen from the substituents chlorine, methoxy, methyl, fluorine and cyano. .
  • solid support examples include polystyrene resins having trityl chloride linker groups, 2-chlorotrityl chloride, 4-methyltrityl chloride or 4-methoxytrityl chloride.
  • Such solid supports are commercially available, for example from Glycopep.
  • the solid support has linker groups which are trityl-alcohol type groups, that is to say OH-Trt-CO-NH- groups, where triphenylmethyl (Trt) is optionally substituted by one or more substituents, especially chosen from chlorine, methoxy, methyl, fluorine and cyano substituents.
  • linker groups which are trityl-alcohol type groups, that is to say OH-Trt-CO-NH- groups, where triphenylmethyl (Trt) is optionally substituted by one or more substituents, especially chosen from chlorine, methoxy, methyl, fluorine and cyano substituents.
  • the resin can be reacted directly with the amine NH (CH 2 -CH 2 -SH) 2 in the presence of BF 3 .Et 2 O, according to Singh, S. et al., J. Org. Chem. 2004, 69, 4551 -4554.
  • solid supports of this type can make it possible to use polyethylene glycol or polyethylene glycol-polystyrene type resin skeletons, more suited to the preparation of long polypeptides than polystyrene type resins.
  • the particles have a Dv50 of between 1 and 1000 ⁇ .
  • Dv50 is defined as the 50 th percentile of the particle size distribution, ie 50% of the particles are smaller than the Dv50 and 50% are larger than the Dv50.
  • the Dv50 is characteristic of the particle size distribution (volumetric distribution) of the particles, and it can be determined by laser granulometry (for a size less than 200 ⁇ ), or by sieving (for a size greater than 200 ⁇ ).
  • the preparation of the functionalized solid support is carried out by coupling the amine compound of formula:
  • the amine compound (VIN ') can itself be obtained by deprotection of the amine compound of formula (VIII) above, wherein d is a protecting group.
  • the coupling is carried out in acidic medium in order to limit the risks of unmasking of the secondary amine, which would induce side reactions.
  • the excess trityl chloride groups are preferably neutralized, for example with methanol. It is then important to add a base to neutralize the formed HCI.
  • the preparation of the functionalized solid support is an integral part of the second variant of the method of manufacturing the polypeptides of formula (I).
  • the functionalized solid support can be prepared in advance and distinctly, in order to be ready for use in the context of the second variant of the method of manufacturing the polypeptides of formula (I).
  • the functionalized solid support is a polymer resin support which comprises a main skeleton (polystyrene, polyethylene glycol-polystyrene, polyacrylamide, polyethylene glycol, cellulose, polyethylene, polyester, latex, polyamide, polydimethylacrylamide, polyethylene glycol-polystyrene copolymer, polyethylene glycol-polyacrylamide copolymer or derived from them, as the case may be) and NH- (CH 2 CH 2 -S-Trt-) 2 groups linked to the main backbone by the two Trt groups, or NH- (CH 2 CH 2 -S) groups. -Trt-CO-NH-) 2 , linked to the main backbone by the two NH functions, in the case where the solid starting support is of the trityl-alcohol type.
  • a main skeleton polystyrene, polyethylene glycol-polystyrene, polyacrylamide, polyethylene glycol, cellulose, polyethylene,
  • Trt represents a triphenylmethyl group optionally substituted with one or more substituents chosen in particular from the chlorine, methoxy, methyl, fluorine and cyano substituents.
  • this polymeric resin support is essentially free of free thiol functions, and has secondary amine functions (disulfanylethylamine functions).
  • an amino acid is coupled to the functionalized solid support.
  • amino acid is protected at its N-terminus by a protective group labile in the presence of base, preferably selected from the group 2- (4-nitrophenylsulfonyl) ethoxycarbonyl (NSC) or Fmoc.
  • a protective group labile in the presence of base preferably selected from the group 2- (4-nitrophenylsulfonyl) ethoxycarbonyl (NSC) or Fmoc.
  • the amino acid comprises protective groups on all or part (preferably all) of the functions present on its side chain, and in particular the carboxylic, amine, alcohol, phenol, guanidine (for arginine) functions. and imidazole (for histidine).
  • protective groups are known to those skilled in the art. For example, reference can be made to the reference work Protective groups in organic synthesis, 2nd edition, T. Greene and P. Wuts, John Wiley & Sons, Inc.
  • the amino acid is activated in the presence of PyBOP or BOP or more preferably in the presence of PyBROP, or in the form of a halide, especially fluoride (that is to say an atom fluorine is attached to the acyl group of the amino acid residue).
  • a halide especially fluoride (that is to say an atom fluorine is attached to the acyl group of the amino acid residue).
  • the amino acid reacts with the secondary amine function present on the functionalized solid support to form an amide bond. After coupling of the amino acid, it is possible to carry out the deprotection of the latter.
  • a polymer resin support comprising G2-NH-CHR-CO-N groups (CH 2 CH 2 -S-Trt-) 2 is obtained.
  • R representing an amino acid side chain
  • G2-AA-N CH 2 -S-Trt- 2 (AA representing an amino acid residue)
  • these groups being linked to the main skeleton by the two groups Trt; or else G2-AA-N- (CH 2 CH 2 -S-Trt-CO-NH-) 2 groups, linked to the main backbone by the two NH functions.
  • Trt denotes a triphenylmethyl group optionally substituted with one or more substituents, especially chosen from chlorine, methoxy, methyl, fluorine and cyano substituents.
  • G2 represents a hydrogen atom or an amine-protecting group, depending on whether the amino-amine group of the amino acid has been deprotected or not.
  • the primer support thus obtained (with or without the protective groups) is also an object of the invention as such.
  • the peptide synthesis step is carried out analogously to what has been described above in connection with the first embodiment, the initial primer being provided by the amino acid coupled to the activated support.
  • polypeptides of formula (I) obtained according to the invention can be used to produce a library of polypeptides, for example for screening purposes.
  • compositions can also be used for the manufacture of pharmaceutical compositions, in combination with one or more pharmaceutically acceptable adjuvants (including one or more pharmaceutically acceptable carriers).
  • pharmaceutically acceptable adjuvants including one or more pharmaceutically acceptable carriers.
  • Example 1 relates to the preparation of the compound bis (2-
  • Examples 2 and 3 lead to the manufacture of a polypeptide 1a of formula H-GFGQGFGG-N (CH 2 CH 2 SH) 2 (SEQ ID NO: 1, corresponding to the general formula (I) above) according to the first variant of the method of manufacturing a polypeptide of formula (I), described above (liquid phase synthesis).
  • Examples 4 and 5 lead to the manufacture of a functionalized resin having disulfanylethylamine functions.
  • Example 6 relates to the preparation of a so-called "primer" support from the preceding functionalized resin, to which a first amino acid is attached.
  • Example 7 relates to the preparation of the polypeptides 1c (H-ILKEPVHGG-N (CH 2 CH 2 SH) 2 ) (SEQ ID NO: 2), 1d (H-ILKEPVHGA- N (CH 2 CH 2 SH) 2 ) (SEQ ID NO: 3), 1 e (H-ILKEPVHGV-N (CH 2 CH 2 SH) 2 ) (SEQ ID NO: 4) and 1H (H-ILKEPVHGY-N) (CH 2 CH 2 SH) 2 ) (SEQ ID NO: 5), compounds corresponding to the general formula (I) above, according to the second variant of the process for producing a polypeptide of formula (I), described herein above (solid phase synthesis).
  • Example 8 relates to the ligation of the respective polypeptides 1c, 1d and 1f with a polypeptide 2 of formula H-CILKEPVHGV-NH 2 (SEQ ID NO: 6) corresponding to the general formula (II), to provide respective polypeptides 3c (SEQ ID NO: 9), 3d (SEQ ID NO: 10) and 3f (SEQ ID NO: 1 1).
  • Example 9 relates to the synthesis of the 1 g polypeptide (H-CHHLEPGG-
  • Example 10 relates to the oxidation of the polypeptides 1c, 1d, 1e and 1f to dithiazepanes (compounds of the general formula ( ⁇ ) above).
  • Example 11 relates to the ligation of the 1c polypeptide with a polypeptide 4 (SEQ ID NO: 17) comprising an N-terminal homocysteine, to provide a polypeptide (SEQ ID NO: 18).
  • Examples 12, 13 and 14 respectively relate to the synthesis of a polypeptide 6 (SEQ ID NO: 19), a polypeptide 7 (SEQ ID NO: 20) and a polypeptide 8 (SEQ ID NO: 21).
  • Example 15 relates to the ligation of polypeptide 7 and polypeptide 8 to form polypeptide 7-8 (SEQ ID NO: 22), and example 16 relates to ligation of polypeptide 6 with polypeptide 7-8 to form a polypeptide 6-7-8 (SEQ ID NO: 23) after deprotection of the thiazolidine present on the N-terminal cysteine of fragment 7-8. It is therefore a construction with two successive ligations.
  • the final 6-7-8 polypeptide is a linear polypeptide of sequence: H-IRNCIIGKGRSYKGTVSITKSGI KCQPWSSMIPHEHSFLPSSYRGKDLQENYCRNPRGEEGGWCFTSNPEV RYEVCDIPQCSEV-NH 2 , the cysteines indicated in bold being those involved in the ligations.
  • Example 1 Preparation of Bis ( ⁇ 2- [thphenylmethyl) sulfanyl] ethyl)) amine
  • the mixture is stirred at room temperature for 3 hours and the reaction is monitored by thin layer chromatography (TLC) (eluent: cyclohexane / ethyl acetate / triethylamine: 8/2 / 0.1). After this time, the solvent is evaporated on a rotary evaporator. The white solid obtained is then dissolved in 50 ml of dichloromethane (DCM) and the product is extracted three times with an aqueous solution of KH 2 PO 4 at 5%.
  • TLC thin layer chromatography
  • the product is then purified by silica gel column chromatography (eluent: cyclohexane / AcOEt / triethylamine (TEA): 8/2 / 0.1) to obtain 1.46 g of white amorphous solid (28% yield).
  • silica gel column chromatography eluent: cyclohexane / AcOEt / triethylamine (TEA): 8/2 / 0.1
  • the product analysis is as follows.
  • the reaction mixture is stirred at this temperature for 30 minutes. After this time, the solvent is evaporated and the white solid obtained is dissolved in 5 mL of DMF.
  • the solution is added to the resin with 0.1 equivalent of DMAP (12.2 mg, 0.1 mmol) in 1 mL of DMF, and the reaction mixture is stirred for 1 hour.
  • the resin is then filtered, washed with 5 ml of DMF, 5 ml of dichloromethane and then dried under vacuum.
  • the final charge of the resin (0.95 mmol / g, 86%) is determined by the UV quantification of the dibenzofulvene-piperidine adduct released upon deprotection of aliquots with a 20% solution of piperidine in DMF.
  • the synthesis of polypeptides is carried out in solid phase using the Fmoc / tert-butyl strategy on the Fmoc-Gly-Wang resin (scale of 0.5 mmol) prepared as above on a microwave peptide synthesizer (CEM ⁇ WAVES , Saclay, France).
  • the coupling is carried out using a 5-fold molar excess of each amino acid, the activator HBTU (O-benzotriazole-N, N, N ', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate) is used with a 4.5 fold excess molar and DiEA base (diisopropylethylamine) is used with a 10-fold molar excess.
  • the activator HBTU O-benzotriazole-N, N, N ', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate
  • DiEA base diisopropylethylamine
  • the final deprotection and the cleavage of the polypeptide of the resin are carried out with 30 ml of a TFA (trifluoroacetic acid) / TIS (triisopropylsilane) / H 2 O (95 / 2.5 / 2.5 by volume) mixture for 1 hour. .
  • the polypeptide is then obtained by precipitation in a diethyl ether / heptane mixture (1/1 by volume), dissolved in H 2 O and then lyophilized. Purity of the polypeptide (79%) is determined by HPLC (liquid chromatography) and capillary electrophoresis.
  • the LC-MS analysis of the predominant polypeptide consistent with the expected structure of the polypeptide (C33H 4 3N 9 Oio calculated 726.32 Da [M + H] +, observed 726.50 Da).
  • polypeptide H-GFGQGFGG-OH (SEQ ID NO: 8) (0.14 mmol) are dissolved in a minimum of anhydrous dimethylformamide (DMF) and 39 ⁇ l of triethylamine (TEA) (2 equivalents, 0.28 mmol) are added to the solution. While stirring, 42 ⁇ l of di-tert-butyldicarbonate (BOC0) (1.3 equivalents, 0.18 mmol) are added to the reaction medium and the solution is homogenized by the addition of anhydrous DMF. The reaction is monitored by HPLC.
  • DMF dimethylformamide
  • BOC0 di-tert-butyldicarbonate
  • the product analysis is as follows.
  • Example 6 Amino Acid Coupling on the Functionalized Resin of Example 5 to Provide Primer Supports (Functionalized Resin Carrying a First Amino Acid)
  • Fmoc-AA-F amino acid protected by an Fmoc group and activated in the form of an acid fluoride
  • 2 mmol of anhydrous DCM 0.5 mmol of Fmoc-AA-F (amino acid protected by an Fmoc group and activated in the form of an acid fluoride) are solubilized in 2 mL of anhydrous DCM and added to the resin of Example 5 (0.125 mmol). 82.4 ⁇ l of N-methylmorpholine (0.75 mmol) are then introduced. The reaction is stirred at room temperature for 2 hours. The resin is then washed with 5x2 minutes of anhydrous DCM and 3x2 minutes of DMF. The chloranil and Ellman colorimetric tests show the absence of secondary amine and free thiol on the resin.
  • the final charge of the resin is determined by a 290 nm UV-visible assay of the dibenzofulvene-piperidine adduct released upon deprotection with a 20% solution of piperidine in DMF.
  • This example is implemented with 4 different amino acids: glycine, alanine, valine and tyrosine.
  • a charge of 0.15 mmol / g is obtained for glycine; 0.124 mmol / g for alanine; 0.1 mmol / g for valine; and 0.107 mmol / g for tyrosine.
  • Example 7 (?? H-ILKEPVHGG-N (CH CH SH)) synthetic polypeptides 1 c, 1 d (H-ILKEPVHGA-N (CH CH SH)???), 1 e (H-ILKEPVHGV-N (CH ? CH ? SH) ? ) And 1f (H-ILKEPVHGY-N (CH ? CH ? SH) ? )
  • synthetic polypeptides 1 c, 1 d (H-ILKEPVHGA-N (CH CH SH)???)
  • 1 e H-ILKEPVHGV-N (CH ? CH ? SH) ?
  • 1f H-ILKEPVHGY-N (CH ? CH ? SH) ?
  • polypeptide 1c (SEQ ID NO: 2) is obtained from the primer support prepared in Example 6 with glycine.
  • polypeptide 1d (SEQ ID NO: 3) is obtained from the primer support prepared in Example 6 with alanine.
  • polypeptide 1 e (SEQ ID NO: 4) is obtained from the primer support prepared in Example 6 with valine.
  • polypeptide 1f (SEQ ID NO: 5) is obtained from the primer support prepared in Example 6 with tyrosine.
  • polypeptides obtained in Example 7 have the following generic formula:
  • the final deprotection and the cleavage of the polypeptide of the resin are carried out with 10 ml of a TFA / TIS / DMS / H 2 O mixture (92.5 / 2.5 / 2.5 / 2.5 by volume) during 1 hour.
  • the polypeptide is then obtained by precipitation in 100 ml of a diethyl ether / heptane mixture (1/1 by volume), dissolved in H 2 O and then lyophilized.
  • each polypeptide is determined by HPLC (91% for the polypeptide 1c with a glycine, 83% for the polypeptide 1d, 80% for 1e, and 88% for 1f).
  • the MALDI-Tof analysis of the polypeptides is consistent with the structure of the expected polypeptide (Peptide 1 c C 47 H 8 Ni 3 O 1 iS 2 [M + H] + calculated 1068.6 Da, observed 1068.5.)
  • the purification of the polypeptides is carried out on a C18 nucleosil column in acetonithel-H 2 O (80-20) in TFA, with a gradient of 0 to 30% in 30 minutes for the polypeptide 1 c, and a gradient of 0 to 10% in 5 min then 10 to 25% in 25 min for the polypeptides 1 d and 1 e.
  • the purity determined by HPLC is 96% for the polypeptide 1 c with an overall yield of 35%, 97% for the polypeptide 1 d with a yield of 31%, and 99% for the polypeptide 1 e with a yield of 27%.
  • Example 8 ligation of the polypeptides 1c, 1d and 1f with the polypeptide 2 (H-CILKEPVHGV-NH 2)
  • reaction medium is transferred into a 15 mL polypropylene tube.
  • the reaction flask is rinsed with 3.4 ml of buffer A (water containing 0.05% by volume of TFA) which is transferred into the 15 ml tube.
  • 4 extractions (4 x 4 mL) are performed with ether.
  • the aqueous phase is further acidified by the addition of 150 ⁇ l of 10% TFA in water. 4 new extractions (4 x 4 mL) with ether are renewed.
  • the aqueous phase is then injected into preparative HPLC (room temperature, 230 nm, C18 nucleosil 120 A-5 ⁇ column, buffer A (water containing 0.05% by volume of TFA), buffer B acetonitrile / water 4/1 by volume containing 0.05% by volume of TFA, flow rate 3 mL / min, gradient 0 to 15% B in 15 min, then 15 to 100% B in 283 min, volume injected 4 mL).
  • preparative HPLC room temperature, 230 nm, C18 nucleosil 120 A-5 ⁇ column, buffer A (water containing 0.05% by volume of TFA), buffer B acetonitrile / water 4/1 by volume containing 0.05% by volume of TFA, flow rate 3 mL / min, gradient 0 to 15% B in 15 min, then 15 to 100% B in 283 min, volume injected 4 mL).
  • reaction medium is transferred to a 15 mL polypropylene tube.
  • the reaction flask is rinsed with 3.5 ml of buffer A and acidified with 150 ⁇ l of 10% TFA in water which is also transferred to the tube. 3 extractions (3 x 5.5 mL) are performed with ether.
  • the aqueous phase is then injected into preparative HPLC (RT, 230 nm, C18 nucleosil 120 A-5 ⁇ column, 100% water buffer containing 0.05% TFA, 4/1 acetonitrile / water buffer containing 0.05% TFA, 3 ml flow rate. / min, gradient 0 to 15% B in 15 min, then 15 to 100% B in 283 min, flight injected 4 mL).
  • Figs. 1 to 3d illustrate the tracking of the ligation reaction for ligation of the 1c, 1d and 1f polypeptides.
  • Example 9 Synthesis of q 1 polypeptide in the solid phase and cyclizing the polypeptide (H-CHHLEPGG-N (CH CH SH)???)
  • the 1 g polypeptide (SEQ ID NO: 7) was synthesized as the 1 c polypeptide.
  • the synthesis of the 1 g polypeptide is carried out in solid phase using the Fmoc / tertButyl strategy (50 ⁇ scale) on a microwave peptide synthesizer.
  • the coupling is carried out in the presence of HTBU as activating agent (4.5 eq) and DIEA as base (10 eq).
  • the resin is washed with dichloromethane (2 ⁇ 5 mL), with ethyl ether (2 ⁇ 5 mL) and then dried.
  • Final deprotection and cleavage of the polypeptide were performed with 5 mL TFA / H2O / DMS TFA, 9.25 / 0.25 / 0.25 / 0.25 by volume for one hour.
  • the polypeptide is precipitated in 50 ml of an ether / heptane mixture (1/1), dissolved in water and then lyophilized.
  • Polypeptide 1g C39H61 N13O10S3, MALDI-TOF analysis [M + H] + calculated 968.19, observed 968.2.
  • the 1 g polypeptide is then cyclized to provide the 3 g polypeptide, according to the following scheme:
  • the conditions used for the cyclization are identical to the conditions used to ligate the 1c polypeptide to the polypeptide 2.
  • polypeptides 1c, 1d, 1e and 1f are as obtained in Example 7. These polypeptides are oxidized according to the following general scheme:
  • Each polypeptide is cleaved from the solid support by the action of a TFA / DMS / TiS / H 2 O solution (92.5 / 2.5 / 2.5 / 2.5, v / v).
  • the polypeptide is then precipitated in a large volume of a diethyl ether / heptane mixture (1/1, v / v) and washed twice with this solution.
  • the lyophilized crude polypeptide after the cleavage step is then dissolved in a 0.1 M ammonium bicarbonate solution degassed beforehand for 10 min by bubbling with nitrogen (1 mg / ml).
  • the mixture is then left at room temperature with vigorous stirring.
  • the evolution of the reaction is monitored by MALDI-TOF mass spectrometry until complete disappearance of the reduced form of the polypeptide under consideration.
  • the polypeptide is finally purified by RP-HPLC (eluent gradient A (H 2 O / 0.05% TFA) / eluent B (80% acetonitrile / 20% H 2 O / 0.05% TFA): 0 to 10% by weight. 10 min then 10% to 25% in 25 min) then frozen and lyophilized.
  • the 1 c polypeptide (SEQ ID NO: 2) is ligated with polypeptide 4 (SEQ ID NO: 17) which is identical to polypeptide 2 except that the N-terminal cysteine is replaced by homocysteine.
  • This reaction provides the polypeptide (SEQ ID NO: 18).
  • the scheme of the reaction is as follows:
  • the polypeptide 6 has the following sequence
  • the polypeptide 6 is assembled on a part of the previous resin
  • polypeptide 6 Part of the polypeptide 6 is then oxidized before purification.
  • the polypeptide 6 49.8 mg is dissolved in AcOH / water 4/1 (2 mL). It is added dropwise in a solution of iodine in AcOH / water 4/1 (25 mL, "10 eq"). After stirring for 10 minutes, the reaction medium is transferred to a separating funnel containing water (60 ml). 3 extractions with ether were carried out (3 x 60 mL). The aqueous phase is frozen and lyophilized to give 44.1 mg of crude peptide.
  • the polypeptide 7 has the following sequence:
  • the resin described in Example 5 (0.5 mmol, 0.175 mmol / g) is conditioned in dichloromethane.
  • Fmoc-Tyr-OH (2.288 g, 5 mmol) is dissolved in dichloromethane ( ⁇ 5 mL) and a few drops of DMF to aid solubilization and then added to the resin.
  • PyBrop (2.31 g, 5 mmol) is dissolved in the minimum of DCM and then added to the resin.
  • DIEA (2.614 mL, 15 mmol) is then added to the resin and the coupling lasts 2 h.
  • the resin is then washed for 4 x 2 minutes with dichloromethane.
  • the resin is then treated with 10% Ac 2 O 5% DiEA / DCM (10 mL, 2 min) and then (10 mL, 20 min).
  • the resin is then washed for 5 x 2 minutes with dichloromethane.
  • the polypeptide 7 is assembled on the preceding resin (0.5 mmol,
  • the coupling is carried out with the amino acids (0.2 M, 4 eq), the activator HBTU (0.5 M, 3.6 eq) and the base DIEA (2 M, 8 eq).
  • the washing solvent (DMF) and the Fmoc-Met-OH solvent contain 1% thioanisole in order to avoid the oxidation of the methionine of the sequence.
  • the resin is separated at 2 after glutamine at position 2 (0.25 mmol) in order to couple the Boc-L-Thz-OH manually. To do this, the resin is washed 4 x 2 minutes with DMF, weighed in DMF and divided into 2.
  • HBTU (379.3 mg, 1 mmol) is dissolved in DMF (1100 ⁇ ).
  • HOBt (135 mg, 1 mmol) is dissolved in DMF (500 ⁇ l) and added to HBTU.
  • Boc-L-Thz-OH (233.29 mg, 1 mmol) is dissolved in DMF (500 ⁇ l) and added to the HBTU / HOBt mixture.
  • DIEA 522.7 ⁇ M, 3 mmol
  • the final deprotection and peptide cleavage of the resin is performed with TFA / TIS / DMS / thioanisole / H 2 O (90 / 2.5 / 2.5 / 2.5 / 2.5 by volume, 25 mL) during 2:30.
  • Part of the polypeptide 7 is then oxidized before purification.
  • the polypeptide 8 has the following sequence:
  • the polypeptide 8 is assembled on the Novasyn TGR resin (0.5 mmol, 0.25 mmol / g) with a peptide synthesizer (CEM Waves, Saclay, France), using the Fmoc / tert-butyl strategy.
  • the coupling is carried out with the amino acids (0.2 M, 4 eq), the activator HBTU (0.5 M, 3.6 eq) and the base DIEA (2 M, 8 eq).
  • the final deprotection and cleavage of the peptide of the resin are carried out with TFA / EDT / H 2 O / TIS (94 / 2.5 / 2.5 / 1 by volume, 30 mL) for 2.5 hours.
  • the peptide is precipitated in a cold diethyl ether / heptane mixture (1/1 by volume), dissolved in a minimum of water and freeze-dried.
  • Example 15 Ligation of polypeptide 7 and polypeptide 8 (glove box) to obtain polypeptide 7-8 (SEQ ID NO: 22)

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Abstract

L'invention concerne principalement un procédé de fabrication d'un polypeptide de formule : (III) X1-X"-X2 X1 et X2 représentant chacun un fragment peptidique, et X" représentant un résidu d'acide aminé comportant une fonction thiol, ledit procédé comprenant au moins une étape de réaction de ligation entre un polypeptide de formule : (I) X1-N(CH2CH2SH)2 et un polypeptide de formule : (II) H-X"-X2. L'invention concerne également les polypeptides de formule (I) eux- mêmes et leur procédé d'obtention, ainsi que des supports de résine adaptés à leur obtention.

Description

PROCEDE DE LIGATION NATIVE DE POLYPEPTIDES
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne un procédé de ligation native de polypeptides. L'invention concerne également des polypeptides fonctionnalisés utiles pour mettre en œuvre ce procédé de ligation native, ainsi qu'un procédé de fabrication de ces polypeptides fonctionnalisés. L'invention concerne également un composé aminé ainsi qu'une résine fonctionnalisée, utiles pour la mise en œuvre du procédé de fabrication des polypeptides fonctionnalisés.
ARRIERE-PLAN TECHNIQUE
La synthèse de polypeptides par des méthodes conventionnelles en phase solide, acide aminé par acide aminé, est limitée par des rendements faibles lorsque les polypeptides synthétisés sont de grande taille. Afin de surmonter cette limitation, il est connu d'assembler deux polypeptides par ligation chimique afin de produire un polypeptide plus long.
De manière générale, on souhaite que le lien entre les polypeptides assemblés par ligation soit natif, c'est-à-dire corresponde à la structure naturelle des polypeptides.
La principale méthode de ligation native existant à ce jour est celle de Kent et Dawson, qui est décrite par exemple dans les documents WO 96/34878 et WO 98/28434. Cette méthode est fondée sur une réaction chimiosélective entre un peptide thioester (en C terminal) et un cystéinyl- peptide. Le principal inconvénient de cette méthode est que la fabrication des peptides thioester nécessite des procédés chimiques complexes.
Une méthode alternative est la ligation dite de Staudinger, décrite dans les documents WO 01/68565 et WO 01/87920. Celle-ci comprend la réaction d'un phosphinothioester avec un azide et l'hydrolyse des réactifs combinés pour former une liaison amide. Cette méthode est difficilement applicable à l'échelle industrielle. Une troisième méthode, décrite dans le document WO 2007/037812, repose sur la réaction d'un α-cétoacide avec une aminé dans une réaction de condensation décarboxylative. Toutefois, les cétoacides sont des molécules qui sont difficiles à fabriquer et à incorporer dans des peptides. Aussi, cette troisième méthode est difficilement applicable dans les laboratoires de synthèse peptidique ne disposant pas des moyens de réaliser des synthèses organiques complexes.
Il existe donc un réel besoin de mettre au point un nouveau procédé de ligation native de polypeptides, qui soit à la fois efficace et plus simple à mettre en œuvre, y compris à l'échelle industrielle.
RESUME DE L'INVENTION
L'invention concerne en premier lieu un procédé de fabrication d'un polypeptide de formule :
(III) Xi-X"-X2
Xi et X2 représentant chacun un fragment peptidique, et X" représentant un résidu d'acide aminé comportant une fonction thiol, ledit procédé comprenant au moins une étape de réaction de ligation entre un polypeptide de formule :
(I) Xi-N(CH2CH2SH)2
et un polypeptide de formule :
(II) H-X"-X2.
Selon un mode de réalisation, la réaction de ligation est effectuée en mettant en contact un polypeptide de formule :
Figure imgf000004_0001
avec le polypeptide de formule (II), en présence d'au moins un composé réducteur des liaisons disulfure.
Selon un mode de réalisation, X2 représente un fragment peptidique de formule
(IV) X2'-(Xi"-Xi')i=3...n
n étant un entier supérieur ou égal à 3, chaque X ", pour i entier compris entre 3 et n, représentant un résidu d'acide aminé comportant une fonction thiol, et chaque X,', pour i entier compris entre 2 et n, représentant un fragment peptidique ; le procédé comprenant, avant l'étape de réaction de ligation entre le polypeptide de formule (I) et le polypeptide de formule (II), une succession de n-2 étapes de réaction de ligation, la jeme étape de réaction de ligation, pour j entier compris entre 1 et n-2, étant une réaction de ligation entre un polypeptide de formule :
(V) H-Xn-j"-Xn-j'- N(CH2CH2SH)2
dans lequel la fonction amine et / ou la fonction thiol du résidu Xn-j" est protégée, et un polypeptide de formule :
(VI) H-(Xj"-Xj')i=(n-j+1)...n
pour former un polypeptide de formule :
(VII) H-(Xi"-Xi')i=(n_j)...n
le polypeptide de formule (VII) subissant une déprotection de la fonction thiol du résidu Xn-j" à l'issue de la réaction de ligation.
Selon un mode de réalisation, une ou plusieurs des n-2 étapes de réaction de ligation entre le polypeptide de formule (V) et le polypeptide de formule (VI) est effectuée en mettant en contact un polypeptide de formule :
Figure imgf000005_0001
avec le polypeptide de formule :
(VI) H-(Xj"-Xj')i=(n-j+1)...n
j étant un entier compris entre 1 et n-2, en présence d'au moins un composé réducteur des liaisons disulfure.
L'invention concerne également un procédé de fabrication d'un polypeptide cyclique de formule :
(X) j- Χ"-Χ2 X2 représentant un fragment peptidique, et X" représentant un résidu d'acide aminé comportant une fonction thiol, ledit procédé comprenant au moins une étape de réaction de ligation d'un polypeptide de formule :
(XI) H-X"-X2-N(CH2CH2SH)2
avec lui-même.
Selon un mode de réalisation, la réaction de ligation est effectuée en mettant en contact un pol peptide de formule :
Figure imgf000005_0002
avec au moins un composé réducteur des liaisons disulfure.
Selon un mode de réalisation de l'un quelconque des procédés précédents, la ou les réactions de ligation sont effectuées en milieu aqueux, de préférence à un pH compris entre 6,5 et 8,5, de manière plus particulièrement préférée entre 7 et 8, et idéalement d'environ 7,5.
Selon un mode de réalisation de l'un quelconque des procédés précédents, la ou les réactions de ligation sont effectuées en présence d'au moins un composé réducteur des liaisons disulfure, de présence choisi parmi la tris(2-carboxyéthyl)phosphine, l'acide 4-mercaptophénylacétique, le dithiothréitol, le benzylmercaptan et les mélanges de ceux-ci.
L'invention concerne par ailleurs un polypeptide de formule :
(I) Xi-N(CH2CH2SH)2
ou de formule :
Figure imgf000006_0001
dans lesquelles Xi représente un fragment peptidique.
Selon un mode de réalisation, Xi comprend entre 2 et 300 résidus d'acides aminés, de préférence entre 5 et 100 résidus d'acides aminés, de manière plus particulièrement préférée entre 8 et 50 résidus d'acides aminés.
L'invention concerne également un procédé de fabrication d'un polypeptide de formule :
(I) Xi-N(CH2CH2SH)2
Xi représentant un fragment peptidique, comprenant au moins une étape de synthèse peptidique et une étape de fonctionnalisation C-terminale.
Selon un mode de réalisation, l'étape de synthèse peptidique précède l'étape de fonctionnalisation ; l'étape de synthèse peptidique fournit un polypeptide de formule :
(IX) X1-OH
comportant de préférence des groupements protecteurs sur ses fonctions aminés et carboxyliques, à l'exception de sa fonction carboxylique C-terminale ; et l'étape de fonctionnalisation comprend :
- la réaction du polypeptide de formule (IX) avec le composé aminé de formule :
(VIII) NH(CH2-CH2-S-Gi)2
dans laquelle d représente un groupement protecteur, ledit groupement protecteur formant de préférence une fonction thioéther, thioester ou disulfure, et étant de manière plus particulièrement préférée le groupement triphénylméthyle, en phase liquide, pour former le polypeptide de formule (I) ; - éventuellement la déprotection du polypeptide de formule (I). L'invention a également pour objet un support de résine polymère pour la synthèse de polypeptides en phase solide, comprenant un squelette principal et des groupements fonctionnels NH-(CH2CH2-S-Trt-)2 ou des groupements fonctionnels NH-(CH2CH2-S-Trt-CO-NH-)2, où Trt représente un groupement triphénylméthyle éventuellement substitué par un ou plusieurs substituants, notamment choisis parmi les substituants chlore, méthoxy, méthyle, fluor et cyano ; dans lequel les groupements fonctionnels NH-(CH2CH2-S-Trt-)2 sont liés au squelette principal par les deux groupements triphénylméthyle, ou les groupements fonctionnels NH- (CH2CH2-S-Trt-CO-NH-)2 sont liés au squelette principal par les deux groupements aminés.
L'invention a également pour objet un support de résine polymère pour la synthèse de polypeptides en phase solide, comprenant un squelette principal et des groupements fonctionnels G2-AA-N-(CH2CH2-S-Trt-)2 ou des groupements fonctionnels G2-AA-N-(CH2CH2-S-Trt-CO-NH-)2, où Trt représente un groupement triphénylméthyle éventuellement substitué par un ou plusieurs substituants, notamment choisis parmi les substituants chlore, méthoxy, méthyle, fluor et cyano ; AA représente un résidu d'acide aminé comportant éventuellement un ou plusieurs groupements protecteurs ; G2 représente un atome d'hydrogène ou un groupement protecteur de fonction aminé ; dans lequel les groupements fonctionnels G2-AA-N(CH2CH2-S-Trt-)2 sont liés au squelette principal par les deux groupements triphénylméthyle ou les groupements fonctionnels G2-AA-N-(CH2CH2-S-Trt-CO-NH-)2 sont liés au squelette principal par les deux groupements aminés.
Selon un mode de réalisation des supports de résine polymère précédents, le squelette principal est choisi parmi les squelettes polystyrène, polyacrylamide, polyéthylèneglycol, cellulose, polyéthylène, polyester, latex, polyamide, polydiméthylacrylamide, copolymère polyéthylèneglycol- polystyrène, copolymère polyéthylèneglycol-polyacrylamide et leurs dérivés.
L'invention concerne également un procédé de fabrication d'un support de résine polymère pour la synthèse de polypeptides en phase solide, comprenant :
- la fourniture d'une résine polymère ;
- la fonctionnalisation de la résine polymère par réaction avec le composé aminé de formule :
(VIII') NH(CH2-CH2-S-H)2 Selon un mode de réalisation du procédé de fabrication de support de résine polymère, le procédé comprend, préalablement à l'étape de fonctionnalisation de la résine polymère :
- la fourniture d'un composé amine de formule :
(VIII) NH(CH2-CH2-S-Gi)2
dans laquelle d représente un groupement protecteur, ledit groupement protecteur formant de préférence une fonction thioéther, thioester ou disulfure, et étant de manière plus particulièrement préférée le groupement triphénylméthyle ;
- la déprotection de ce composé amine pour obtenir le composé amine de formule (VIII').
Selon un mode de réalisation du procédé de fabrication du polypeptide de formule (I) :
- l'étape de fonctionnalisation précède l'étape de synthèse peptidique ;
- l'étape de fonctionnalisation comprend :
le couplage d'un acide aminé à un support de résine polymère comprenant un squelette principal et des groupements fonctionnels NH-(CH2CH2-S-Trt-)2 ou des groupements fonctionnels NH-(CH2CH2-S-Trt-CO-NH-)2, tel que décrit ci- dessus, pour fournir un support amorce ; ou
la fourniture d'un support amorce qui est un support de résine polymère comprenant un squelette principal et des groupements fonctionnels G2-AA-N-(CH2CH2-S-Trt-)2 ou des groupements fonctionnels G2-AA-N-(CH2CH2-S-Trt-CO-NH-)2, tel que décrit ci-dessus;
- l'étape de synthèse peptidique comprend une succession de couplages d'acides aminés sur le support amorce.
Selon un mode de réalisation de ce procédé, le couplage d'un acide aminé au support de résine polymère comprend la mise en présence du support de résine polymère avec un halogénure d'acide aminé ou avec un acide aminé et un agent d'activation, choisi de préférence parmi le PyBOP, le BOP, le PyBROP, de manière plus particulièrement préférée le PyBROP.
L'invention a aussi pour objet un procédé de fabrication d'un polypeptide de formule : (Γ)
Figure imgf000008_0001
dans laquelle Xi représente un fragment peptidique, comprenant une étape d'oxydation d'un polypeptide de formule :
(I) Xi-N(CH2CH2SH)2
de préférence au contact de l'air, ou en présence de l2 ou de diamide, et dans un tampon, ladite étape d'oxydation étant de préférence précédée d'une étape de fabrication du polypeptide de formule (I) selon le procédé décrit ci-dessus.
Selon un mode de réalisation du procédé de fabrication d'un polypeptide de formule (III) ou (X), celui-ci comprend une étape de fabrication du polypeptide de formule (I) et / ou (V) ou (XI) qui est selon le procédé de fabrication du polypeptide de formule (I) décrit ci-dessus, ou une étape de fabrication du polypeptide de formule (Γ) et / ou (V) ou (ΧΓ) selon le procédé de fabrication du polypeptide de formule (Γ) décrit ci-dessus.
L'invention concerne également un procédé de fabrication d'une composition pharmaceutique comprenant :
- la fabrication d'un polypeptide selon le procédé de fabrication d'un polypeptide de formule (III) ou (X) décrit ci-dessus, et
- la formulation de ce polypeptide avec un ou plusieurs adjuvants pharmaceutiquement acceptables.
L'invention concerne également un procédé de fabrication d'un dispositif de diagnostic comprenant :
- la fabrication d'un polypeptide selon le procédé de fabrication d'un polypeptide de formule (III) ou (X) décrit ci-dessus, et
- la formulation de ce polypeptide sous une forme adaptée à une utilisation diagnostique.
L'invention a encore pour objet un composé aminé de formule :
(VIII") NH(CH2-CH2-S-Trt)2
où Trt représente le groupement triphénylméthyle.
La présente invention permet de surmonter les inconvénients de l'état de la technique. Elle fournit plus particulièrement un procédé de ligation native de polypeptides, qui est à la fois efficace et plus simple à mettre en œuvre que les procédés antérieurs, y compris à l'échelle industrielle.
Cela est accompli grâce à la mise au point d'un schéma réactionnel dans lequel un polypeptide modifié à l'extrémité C-terminale par un groupement bis(mercaptoéthyl)amino réagit avec un polypeptide présentant une cystéine à l'extrémité N-terminale (ou un autre acide aminé comportant une fonction thiol) pour former une liaison amide native. Selon certains modes de réalisation particuliers, l'invention présente également une ou de préférence plusieurs des caractéristiques avantageuses énumérées ci-dessous.
- La méthode de ligation selon l'invention utilise éventuellement des réactifs polypeptidiques non protégés, en particulier lorsque l'on effectue une seule ligation. L'utilisation de polypeptides protégés est délicate du fait de leur faible solubilité, et parce qu'elle exige en outre une étape de déprotection après la ligation, entraînant un coût supplémentaire et une possibilité de dégradation. A l'inverse, l'invention permet donc d'éviter les inconvénients liés aux polypeptides protégés, en particulier lorsque l'on effectue une seule ligation. Le procédé selon l'invention conduit directement à la formation d'un lien natif au point de ligation, sans qu'il soit nécessaire d'effectuer une déprotection après la ligation.
- La méthode de ligation selon l'invention repose sur l'utilisation de polypeptides modifiés par des groupements fonctionnels stables chimiquement, et qui sont faciles à introduire en utilisant les techniques de synthèse peptidique conventionnelles.
- L'invention permet d'utiliser des acides aminés protéinogéniques pour la synthèse des fragments peptidiques. Ainsi, il est inutile de recourir à la fabrication de dérivés d'acides aminés (tels que des cétoacides par exemple), qui alourdit considérablement la synthèse.
- L'assemblage des réactifs polypeptidiques peut être réalisé de façon classique, par exemple en utilisant la chimie de Fmoc/tert- butyle. Par conséquent, le procédé selon l'invention est compatible avec les processus de synthèse industriels et automatisés actuellement disponibles. Les acides aminés et les supports solides appropriés sont actuellement disponibles en grande quantité et à bas coût.
- L'invention prévoit une ligation en milieu aqueux, qui est donc compatible avec la solubilité des peptides et des protéines.
- La réaction de ligation selon l'invention peut être effectuée efficacement à un pH proche de 7,5, c'est-à-dire en conditions compatibles avec les polypeptides complexes ou protéines.
- La réaction de ligation selon l'invention offre une possibilité d'auto- ligation d'un polypeptide, et donc de fabrication de polypeptides cycliques. BREVE DESCRIPTION DES FIGURES
La Fig. 1 représente le suivi en RP-HPLC (chromatographie liquide haute performance en phase inverse) de la ligation native entre le polypeptide 1 c et le polypeptide 2, pour obtenir le polypeptide 3c, selon l'exemple 7. Le tracé inférieur correspond à l'instant t=10 min ; le tracé du milieu correspond à l'instant t=18 h ; et le tracé supérieur correspond à l'instant t=43 h.
Les Fig. 2a et 2b représentent le suivi en RP-HPLC (chromatographie liquide haute performance en phase inverse) de la ligation native entre le polypeptide 1 d et le polypeptide 2, pour obtenir le polypeptide 3d, selon l'exemple 7. Le tracé A correspond à l'instant t=0 ; le tracé B correspond à l'instant t=1 h ; le tracé C correspond à l'instant t=3 h ; le tracé D correspond à l'instant t=5 h ; et le tracé E correspond à l'instant t=22 h.
La Fig. 2c représente le spectre de spectrométrie de masse déconvolué pour le pic du polypeptide 3d obtenu à l'instant t=22h (Fig. 2b).
Les Fig. 3a à 3c représentent le suivi en RP-HPLC (chromatographie liquide haute performance en phase inverse) de la ligation native entre le polypeptide 1f et le polypeptide 2, pour obtenir le polypeptide 3f, selon l'exemple 7. Le tracé A correspond à l'instant t=0 ; le tracé B correspond à l'instant t=1 h ; le tracé C correspond à l'instant t=3 h ; le tracé D correspond à l'instant t=6 h ; et le tracé E correspond à l'instant t=27 h.
La Fig. 3d représente le spectre de spectrométrie de masse déconvolué pour le pic du polypeptide 3f obtenu à l'instant t=27h (Fig. 3c).
DESCRIPTION DE MODES DE REALISATION DE L'INVENTION
L'invention est maintenant décrite plus en détail et de façon non limitative dans la description qui suit.
Par « polypeptide » on entend, dans le cadre de la présente demande, une chaîne linéaire de résidus d'acides aminés (en nombre supérieur ou égal à deux) reliés par des liaisons peptidiques. Les « polypeptides » au sens de la présente demande peuvent donc par exemple être des oligopeptides, peptides ou protéines selon l'acception conventionnelle de ces termes. Les résidus d'acides aminés présents dans les polypeptides selon l'invention peuvent être choisis parmi les résidus d'acides aminés protéinogéniques ou non. De préférence, ils sont choisis parmi les vingt résidus d'acides aminés protéinogéniques. La notation des polypeptides s'effectue de l'extrémité N-terminale vers l'extrémité C-terminale. Les résidus d'acides aminés présents le long de la chaîne polypeptidique sont notés selon le code usuel à une lettre ou à trois lettres. Un résidu d'acide aminé est un fragment de polypeptide de formule -NH-(CH-R)-(C=O)-, dans laquelle R représente une chaîne latérale, différente d'un acide aminé à l'autre.
Par « fragment peptidique » on entend, dans le cadre de la présente demande, une portion de polypeptide comprenant au moins un résidu d'acide aminé. Un fragment peptidique, au sens de la présente demande, peut donc être par exemple : une séquence de résidus d'acides aminés (telle que -AHG- ou -Ala-His-Gly-) si le fragment peptidique ne comprend ni l'extrémité N-terminale ni l'extrémité C-terminale du polypeptide ; ou bien une séquence de résidus d'acides aminés présentant un groupement à son extrémité N- terminale (telle que H-AHG- ou H-Ala-His-Gly-) si le fragment peptidique comprend l'extrémité N-terminale du polypeptide ; ou bien une séquence de résidus d'acides aminés présentant un groupement à son extrémité C- terminale (telle que -AHG-OH ou -Ala-His-Gly-OH) si le fragment peptidique comprend l'extrémité C-terminale du polypeptide. Liqation native de polypeptides
L'invention fournit une méthode de ligation native de polypeptides, selon laquelle un polypeptide de formule :
(I) Xi-N(CH2CH2SH)2
réagit avec un polypeptide de formule :
(II) H-X"-X2
pour fournir un polypeptide de formule :
(III) Xi-X"-X2.
Le polypeptide de formule (I) comprend un fragment peptidique Xi (ledit fragment peptidique comprenant l'extrémité N-terminale du polypeptide) et un groupement fonctionnel -N(CH2CH2SH)2 à l'extrémité C-terminale (lié à la terminaison (C=O) du résidu d'acide aminé en position C-terminale).
Le fragment peptidique Xi est de la forme Yi-AAiAA2...AAn. Yi est un groupement N-terminal, de préférence un atome d'hydrogène, mais éventuellement aussi tout groupement substituant pour les aminés primaires ou secondaires connu de l'homme du métier, par exemple un groupement acyle et notamment un groupement acétyle. n est un nombre entier supérieur ou égal à 2. Chaque AA, représente un résidu d'acide aminé. Un exemple de polypeptide de formule (I) est le polypeptide 1 a (voir exemple 3 ci-dessous) de formule :
Figure imgf000013_0001
Dans cet exemple, le fragment peptidique Xi est H-GFGQGFGG. Le polypeptide de formule (I) comprend de préférence entre 2 et 300 résidus d'acides aminés, de préférence entre 5 et 100 résidus d'acides aminés, de manière plus particulièrement préférée entre 8 et 50 résidus d'acides aminés.
Le polypeptide de formule (II) comprend un atome d'hydrogène et un résidu X" à l'extrémité N-terminale. Le résidu X" est un résidu d'acide aminé comportant une fonction thiol. Cette fonction thiol peut être en particulier une fonction beta-amino thiol (auquel cas le résidu X" représente de préférence le résidu cystéine) ou une fonction gamma-amino thiol (auquel cas le résidu X" représente de préférence le résidu homocystéine).
Dans toute la description qui suit, selon un mode de réalisation particulier, X" peut se lire comme représentant un résidu cystéine (Cys).
Selon la notation utilisée ci-dessus, X2 représente un fragment peptidique, qui comprend l'extrémité C-terminale du polypeptide de formule (II) ainsi que l'ensemble des résidus d'acides aminés de ce polypeptide, à l'exception du résidu N-terminal.
Le fragment peptidique X2 est de la forme AA2'AA3'...AAn'-Y2. Y2 est un groupement terminal, de préférence un groupement -OH ou -NH2 ou encore un groupement -OR ou -NRR', R et R' représentant chacun un groupement alkyle ou aryle. n est un nombre entier supérieur ou égal à 2. Chaque AA,' représente un résidu d'acide aminé.
Le polypeptide de formule (II) comprend de préférence entre 2 et 300 résidus d'acides aminés, de préférence entre 5 et 100 résidus d'acides aminés, de manière plus particulièrement préférée entre 8 et 50 résidus d'acides aminés.
Le polypeptide de formule (II) peut être par exemple obtenu par une méthode de synthèse peptidique usuelle, notamment une méthode de synthèse en phase solide. Il peut également être obtenu au moyen d'une ligation native précédente (voir ci-dessous). Chacun des polypeptides de formule (I) et (II) comprend de préférence uniquement des résidus d'acides aminés choisis parmi les vingt résidus d'acides aminés protéinogéniques. Toutefois, selon un mode de réalisation particulier, les polypeptides de formule (I) et (II) comprennent un ou plusieurs résidus d'acides aminés non-protéinogéniques.
Les résidus d'acides aminés des polypeptides de formule (I) et (II) peuvent éventuellement être protégés par des groupements protecteurs des chaînes latérales.
Pour que la réaction de ligation s'effectue correctement, la présence des deux groupes thiol libres sur le polypeptide de formule (I) est essentielle. La ligation est dite native car le fragment peptidique Xi est relié au fragment peptidique X"-X2 par une liaison amide.
Il est possible d'effectuer la réaction de ligation ci-dessus en mettant en présence le polypeptide de formule (II) avec un polypeptide de formule :
Figure imgf000014_0001
à condition d'utiliser lors de la réaction un composé réducteur des liaisons disulfure, qui peut être de préférence un composé thiol tel que l'acide 4-mercaptophénylacétique (MPAA), le dithiothréitol (DTT), le thiophénol (et ses dérivés), un alkylthiol (notamment le benzylmercaptan) ou encore une phosphine telle que la tris(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP). L'utilisation conjointe de plusieurs de ces composés est également appropriée, par exemple l'utilisation de MPAA et de TCEP.
En effet, le polypeptide de formule (Γ) est alors réduit in situ et fournit le polypeptide de formule (I) pour la réaction de ligation.
De manière générale, la réaction de ligation à partir du polypeptide de formule (Γ) en tant que réactif peut être plus pratique à mettre en œuvre que la réaction de ligation directement avec le polypeptide de formule (I). En effet, le polypeptide de formule (I) a naturellement tendance à s'oxyder en le polypeptide de formule (Γ), notamment sous l'action de l'oxygène de l'air. Par exemple, il est possible que le polypeptide de forme ouverte (I) s'oxyde dans le temps lorsqu'il est stocké sous forme lyophilisée. En d'autres termes, une préparation du polypeptide de formule (I) contient généralement nécessairement en partie le polypeptide de formule (Γ). La présence de ces deux formes peut compliquer la caractérisation et la purification. C'est pourquoi il peut être plus simple de mettre en œuvre la réaction de ligation par mise en contact du polypeptide de formule (Γ) avec le polypeptide de formule (II), le polypeptide à terminaison cyclique de formule (Γ) étant réduit in situ en le polypeptide ouvert de formule (I).
Pour les mêmes raisons, même lorsque la réaction de ligation est effectuée directement par mise en contact du polypeptide de formule (I) avec le polypeptide de formule (II), il est préférable d'utiliser lors de la réaction un ou plusieurs des composés réducteurs des liaisons disulfure mentionnés ci- dessus.
De préférence, le MPAA, lorsqu'il est présent, est utilisé à une concentration comprise entre 1 et 500 mM, par exemple à une concentration d'environ 200 mM lors de la réaction.
De préférence, la TCEP lorsqu'elle est présente, est utilisée à une concentration comprise entre 1 et 200 mM, par exemple à une concentration d'environ 80 mM lors de la réaction.
Dans l'hypothèse où le résidu d'acide aminé N-terminal du polypeptide (I) comporte une fonction thiol, celle-ci doit être protégée lors de la ligation, sans quoi on aboutit à une réaction concurrente de cyclisation du polypeptide de formule (I). Alternativement, on peut protéger la fonction aminé alpha afin d'éviter la réaction de cyclisation. On peut utiliser par exemple une protection de type thiazolidine, qui protège simultanément le thiol et l'aminé alpha.
La réaction de ligation intervient de préférence en phase liquide, et notamment en milieu aqueux, par exemple dans un tampon phosphate. De préférence, cette réaction est effectuée à un pH compris entre 6,5 et 8,5, de manière plus particulièrement préférée à un pH compris entre 7 et 8 et idéalement à un pH voisin de 7,5.
La réaction de ligation est effectuée de préférence à une température comprise entre 0 et 50°C, et idéalement à une température d'environ 37°C. La durée de la réaction est ajustée en fonction du choix des réactifs et des autres conditions de la réaction. La durée appropriée peut également être ajustée selon les résultats d'une analyse de chromatographie liquide - spectrométrie de masse au cours de la réaction. La durée appropriée sera typiquement de quelques heures à quelques jours.
Chacun des polypeptides de formule (I) et (II) est de préférence présent à une concentration comprise entre 0,01 et 50 mM, lors de la réaction. Le rapport de concentration molaire entre les polypeptides de formule (I) et (II) lors de la réaction est de préférence compris entre 2:3 et 3:2. La réaction de ligation décrite ci-dessus peut être suivie d'une étape de purification du polypeptide de formule (III) obtenu, par exemple par chromatographie en phase liquide ou par toute autre technique usuelle. Production d'un polypeptide avec plusieurs liqations natives successives
L'invention permet également de produire des polypeptides en enchaînant successivement plusieurs réactions de ligation telles que décrites ci-dessus. Ceci peut s'avérer approprié pour obtenir des polypeptides de grande taille, par exemple des polypeptides comprenant plus d'environ 100 résidus d'acides aminés. En effet, dans de tels cas la fabrication de polypeptides de formules (I) et (II) par synthèse directe peut avoir un faible rendement, et il est donc avantageux d'utiliser deux ou plus de deux ligations successives, afin d'avoir à synthétiser directement uniquement des polypeptides comprenant par exemple moins d'environ 50 résidus d'acides aminés.
A titre d'exemple, l'utilisation de deux ligations successives permet d'obtenir un polypeptide comprenant environ 150 résidus d'acides aminés sans avoir à synthétiser directement de polypeptide comprenant plus d'environ 50 résidus d'acides aminés ; l'utilisation de trois ligations successives permet d'obtenir un polypeptide comprenant environ 200 résidus d'acides aminés sans avoir à synthétiser directement de polypeptide comprenant plus d'environ 50 résidus d'acides aminés.
Ainsi, le procédé selon l'invention permet d'obtenir un polypeptide de formule (III) dans lequel le fragment peptidique X2 est de la forme X2'-X3"-X3'- ...-Xn"-Xn' (n étant un entier supérieur ou égal à 3 ; chaque X,', pour i entier entre 2 et n, étant un fragment peptidique ; et chaque X ", pour i entier entre 3 et n, étant un résidu X", c'est-à-dire un résidu d'acide aminé comportant une fonction thiol, et notamment un résidu cystéine selon un mode de réalisation particulier) en utilisant n-1 ligations successives. En d'autres termes le polypeptide obtenu présente dans ce cas la formule :
(ΙΙΙ') Χι-Χ"-Χ2'-Χ3"-Χ3'-...-Χη"-Χη'
La première réaction de ligation fait intervenir d'une part un polypeptide de formule
(Va) H-Xn-i"-Xn-i'-N(CH2CH2SH)2
et d'autre part un polypeptide de formule
(Via) H-Xn"-Xn'.
Cette réaction de ligation est exactement similaire à celle décrite dans la section précédente. Elle conduit à l'obtention du polypeptide de formule (Vlb) Η-Χη-1 "-Χη-1 ,-Χη"-Χη'.
La fonction thiol ou la fonction aminé N-terminale (ou la fonction thiol et la fonction aminé) du résidu d'acide aminé Xn-i " doit être protégée dans le polypeptide de formule (Va) lors de la ligation, sans quoi on aboutit à une réaction concurrente de cyclisation du polypeptide de formule (Va). On peut utiliser pour ce faire par exemple une protection de type thiazolidine.
A l'issue de la réaction de ligation, la fonction thiol du résidu d'acide aminé Xn-i " doit être déprotégée dans le polypeptide de formule (Vlb) afin de permettre la réaction de ligation suivante.
La deuxième réaction de ligation fait intervenir d'une part un polypeptide de formule :
(Vb) H-Xn-2"-Xn-2'-N(CH2CH2SH)2
et d'autre part le polypeptide de formule (Vlb) précédemment obtenu. La fonction thiol du résidu d'acide aminé Xn-2" doit être protégée dans le polypeptide de formule (Vb), sans quoi on aboutit à une réaction concurrente de cyclisation du polypeptide de formule (Vb). On peut utiliser pour ce faire par exemple une protection de type thiazolidine. La réaction de ligation du polypeptide de formule (Vb) avec le polypeptide de formule (Vlb) est alors suivie d'une déprotection de la fonction thiol du résidu d'acide aminé Xn-2" préalablement à la réaction de ligation suivante.
Les réactions de ligation suivantes sont du même type. De manière générique, la réaction de ligation numéro j (pour j entier compris entre 1 et n- 2) fait intervenir un polypeptide de formule
(V) H-Xn-j"-Xn-j'- N(CH2CH2SH)2
et un polypeptide de formule :
(VI) H-(Xj"-Xj')i=(n-j+1)...n
pour former un polypeptide de formule :
(VII) H-(Xi"-Xi')i=(n_j)...n
Enfin, la dernière (c'est-à-dire la n-1 eme) réaction de ligation fait intervenir le polypeptide de formule :
(I) Xi-N(CH2CH2SH)2
et le polypeptide de formule :
(II) H-X"-X2, qui représente ici H-X"-X2'-X3"-X3'-...-Xn"-Xn', pour former le polypeptide de formule :
(III) Xi-X"-X2, c'est-à-dire
(Ι Ι Ι') Χι-Χ"-Χ2'-Χ3"-Χ3'-...-Χη"-Χη'
Chacune des réactions de ligation successives peut être effectuée comme décrit dans la section « ligation native de polypeptides ». En particulier, il peut être avantageux d'effectuer la réaction de ligation numéro j (pour j entier compris entre 1 et n-2) par mise en contact du polypeptide de formule (VI) avec le polypeptide de formule :
Figure imgf000018_0001
en présence d'un ou plusieurs composés réducteurs de liaisons disulfure mentionnés ci-dessus, le polypeptide de formule (V) étant alors réduit in situ et fournissant le polypeptide de formule (V) pour la réaction de ligation.
Production d'un polypeptide cyclique par auto-ligation native
Les principes utilisés pour la ligation native décrits ci-dessus peuvent également être utilisés pour produire des polypeptides cycliques, par auto- ligation native d'un polypeptide (ligation d'une extrémité du polypeptide avec l'autre extrémité du même polypeptide). De manière générale, l'invention propose ainsi un procédé de fabrication d'un polypeptide cyclique de formule :
(X) j- X"-X2 où X2 représente un fragment peptidique, et X" représente un résidu d'acide aminé comportant une fonction thiol, par une réaction de ligation d'un polypeptide de formule :
(XI) H-X"-X2-N(CH2CH2SH)2
avec lui-même.
Le polypeptide de formule (XI) comprend de préférence entre 2 et 300 résidus d'acides aminés, de préférence entre 5 et 100 résidus d'acides aminés, de manière plus particulièrement préférée entre 8 et 50 résidus d'acides aminés.
Le polypeptide de formule (XI) comprend un atome d'hydrogène et un résidu X" à l'extrémité N-terminale, X" ayant la signification indiquée ci- dessus. X2 représente ici un fragment peptidique de la forme AAiAA2...AAn où n est un nombre entier supérieur ou égal à 1 et chaque AA, représente un résidu d'acide aminé.
Le polypeptide de formule (XI) comprend de préférence uniquement des résidus d'acides aminés choisis parmi les vingt résidus d'acides aminés protéinogéniques. Toutefois, selon un mode de réalisation particulier, le polypeptide de formule (XI) comprend un ou plusieurs résidus d'acides aminés non- protéinogéniques.
Les résidus d'acides aminés du polypeptide de formule (XI) peuvent éventuellement être protégés par des groupements protecteurs des chaînes latérales.
Il est possible d'effectuer la réaction de ligation ci-dessus en mettant en présence le polypeptide de formule (ΧΓ) :
Figure imgf000019_0001
avec au moins un composé réducteur des liaisons disulfure, qui est de préférence tel que décrit ci-dessus. En effet, le polypeptide de formule (ΧΓ) est alors réduit in situ et fournit le polypeptide de formule (XI) pour la réaction de ligation.
De manière générale, même lorsque la réaction de ligation est effectuée directement à partir du polypeptide de formule (XI), il est préférable d'utiliser lors de la réaction un ou plusieurs des composés réducteurs des liaisons disulfure mentionnés ci-dessus.
En général, la cyclisation du polypeptide de formule (XI) n'est pas gênée par des multimérisations concurrentes, si la réaction est effectuée en conditions suffisamment diluées. On peut par exemple utiliser une concentration de polypeptide de formule (XI) comprise entre 0,01 et 50 mM, typiquement d'environ 1 mM (ou éventuellement entre 0,01 et 0,1 mM en cas de risques sérieux de multimérisations).
Par ailleurs, les conditions préférées de mise en œuvre de la réaction de ligation sont les mêmes que celles décrites ci-dessus pour la réaction à partir des polypeptides de formule (I) et (II).
La réaction de ligation décrite ci-dessus peut être suivie d'une étape de purification du polypeptide cyclique de formule (X) obtenu, par exemple par chromatographie en phase liquide ou par toute autre technique usuelle.
Procédé de fabrication des polypeptides de formule (I), (V) et (XI)
Les polypeptides de formule (I), (V) et (XI) sont des composés utiles à la mise en œuvre de la réaction de ligation décrite ci-dessus. L'invention a donc également pour objet ces polypeptides de formule (I) (ou de formule (V) ou (XI)) en tant que tels, ainsi qu'un procédé permettant de les fabriquer.
Le procédé de fabrication des polypeptides de formule (I) (ou de formule (V) ou (XI)) fait intervenir deux étapes principales : - une étape de synthèse peptidique ; et
- une étape de fonctionnalisation C-terminale.
L'invention fournit deux variantes principales de ce procédé. Selon la première variante, la synthèse peptidique précède la fonctionnalisation. Selon la deuxième variante, la synthèse peptidique suit la fonctionnalisation. La deuxième variante permet d'obtenir un rendement plus important et est plus simple à mettre en œuvre à l'échelle industrielle.
Selon la première variante, la première étape (étape de synthèse peptidique) permet d'obtenir le polypeptide de formule :
(IX) X1-OH
Cette étape de synthèse peptidique peut être effectuée selon toute méthode connue de l'homme du métier. Elle peut en particulier être effectuée en phase liquide ou, de préférence, en phase solide.
De manière schématique, la synthèse peptidique comprend une succession de couplages d'acides aminés à partir d'une amorce (acide aminé initial ou fragment peptidique résultant des additions d'acides aminés précédentes) et de déprotections. Plus précisément, la synthèse peptidique peut successivement comprendre :
(a) la fourniture d'un fragment peptidique présentant une extrémité N-terminale non protégée, et d'un acide aminé protégé à son extrémité N-terminale ;
(b) l'établissement d'une liaison peptidique entre l'acide aminé et le fragment peptidique, à l'extrémité N-terminale dudit fragment peptidique ;
(c) la déprotection de l'extrémité N-terminale de l'acide aminé lié, pour fournir le fragment peptidique de l'étape (a) suivante.
Dans le cas de la synthèse peptidique en phase solide, le fragment peptidique (amorce) est lié à un support solide à son extrémité C-terminale. Le support solide est de préférence un polymère sous forme de particules (billes) insolubles ou solubles. On peut par exemple utiliser des résines à base de polystyrène, polyacrylamide, polyéthylèneglycol, cellulose, polyéthylène, polyester, latex, polyamide, polydiméthylacrylamide et des résines dérivées de celles-ci. Il est également possible d'utiliser un gel de silice ou des billes de verre à titre de support solide.
La liaison entre le fragment peptidique et le support solide est effectuée par l'intermédiaire d'un groupement fonctionnel approprié, dit lieur (ou « linker »). Ainsi, dans un premier temps l'acide aminé correspondant à l'extrémité C-terminale du polypeptide à synthétiser est fixé sur les groupements fonctionnels lieurs du support solide (en protégeant la fonction aminé de l'acide aminé lors du couplage puis en la déprotégeant pour la rendre disponible pour la réaction suivante), ce qui constitue la première amorce, puis les acides aminés suivants sont ajoutés selon la succession de réactions rappelée ci-dessus.
Au cours des différentes réactions de couplage, il est avantageux d'utiliser un composé activateur, notamment un carbodiimide (par exemple dicyclohexylcarbodiimide ou diisopropylcarbodiimide) en présence d'un triazole (par exemple 1 -hydroxy-benzotriazole ou 1 -hydroxy-7- azabenzotriazole), ou un sel phosphonium ou uronium d'un anion non- nucléophile (par exemple HBTU, HATU, TBTU ou PyBOP) ; ou encore d'utiliser des acides aminés activés sous forme d'halogénures d'acide, par exemple de fluorures d'acide.
Dans le cas d'une synthèse en phase solide, et une fois la dernière réaction de couplage d'acide aminé effectuée, on prévoit une réaction de séparation (ou clivage) du polypeptide de son support solide.
Au cours des différentes réactions de couplage, les extrémités N- terminales des acides aminés sont avantageusement protégées par un groupement protecteur, de préférence un groupement Fmoc (9H-fluorèn-9- ylméthoxycarbonyle) ou encore un groupement t-Boc (tert-butoxycarbonyle) ou NSC (2-(4-nitrophénylsulfonyl)éthoxycarbonyle).
De même, les chaînes latérales des résidus d'acides aminés sont de préférence protégées au cours des différentes réactions de couplage par un ou plusieurs groupements protecteurs appropriés, par exemple un groupement tert-butyle pour les chaînes portant une fonction carboxylique.
Dans ce cas, une fois la dernière réaction de couplage d'acide aminé effectuée, on peut prévoir une réaction de déprotection des chaînes latérales. Il faut toutefois noter qu'il peut être préférable de conserver l'ensemble des protections (à l'exception d'une éventuelle protection de la fonction COOH à l'extrémité C) en vue de l'étape de fonctionnalisation.
A l'issue de l'étape de synthèse peptidique, le polypeptide de formule (IX) est fonctionnalisé.
L'étape de fonctionnalisation comprend successivement :
- Eventuellement la protection de l'extrémité N-terminale du polypeptide de formule (IX) avec un groupement protecteur, de préférence choisi parmi la famille des carbamates, des amides ou des groupements alkyles, et notamment un groupement tert- butoxycarbonyle (t-Boc), Fmoc (9H-fluorèn-9- ylméthoxycarbonyle), trifluoroacétyle ou triphénylméthyle.
- Eventuellement également, la protection des fonctions des chaînes latérales des résidus d'acides aminés du polypeptide de formule (IX), et tout particulièrement des fonctions aminés (de préférence au moyen des groupements protecteurs ci-dessus) et des fonctions carboxyliques (au moyen par exemple de groupements tert-butyles).
- Alternativement, et selon un mode de réalisation plus simple, on peut fournir le polypeptide de formule (IX) directement sous une forme dans laquelle l'ensemble des fonctions aminés et carboxyliques sont protégées, en prévoyant une déprotection sélective de la fonction COOH de l'extrémité C-terminale.
- Le couplage du polypeptide de formule (IX) avec un composé amine de formule :
(VIII) NH(CH2-CH2-S-Gi)2
d étant un groupement protecteur.
- Eventuellement la déprotection du polypeptide.
En ce qui concerne le composé amine de formule (VIII), d est choisi de préférence parmi les groupements fournissant une fonction thioéther, thioester (par exemple acétyle) ou disulfure (par exemple tert-butylsulfényle). De manière plus particulièrement préférée, d est le groupement triphénylméthyle. Dans ce cas, le composé amine est la bis({2- [triphénylméthyl)sulfanyl]éthyl})amine. En ce qui concerne une méthode de préparation du composé amine de formule (VIII), on pourra se référer à l'exemple 1 ci-dessous.
Un activateur est avantageusement présent lors de la réaction de couplage, par exemple l'hexafluorophosphate de benzotriazol-1 -yl- oxytripyrrolidinophosphonium (PyBOP) ou Γ hexafluorophosphate de bromo- trispyrrolidinophosphonium (PyBROP) ou l'acide aminé C-terminal lui-même activé sous la forme d'un dérivé halogéné (en particulier sous la forme d'un fluorure d'acide aminé ou chlorure d'acide aminé), celui-ci pouvant être préformé ou formé in situ à l'aide de réactifs appropriés connus de l'homme de l'art. Parmi les halogénures d'acides aminés, les fluorures d'acides aminé sont préférés, préformés par réaction avec la 1 ,3,5-trifluorotriazine ou formés in situ à l'aide de TFFH (tétraméthylfluoroformamidinium hexafluorophosphate). De manière générale, on peut également envisager tout réactif permettant l'activation de la fonction acide carboxylique de l'acide aminé connu de l'homme de l'art comme l'HBTU, le TBTU, l'HATU, le BOP... (on pourra se rapporter par exemple à Chemical approaches to the synthesis of peptides and proteins par Lloyd-Williams, P., Albericio, F., Giralt, E., 1997, CRC Press). Le PyBOP, le PyBROP, le BOP ou de façon plus générale les phosphoniums sont préférés.
A l'issue de l'étape de fonctionnalisation, le polypeptide de formule (I) est obtenu. Il est avantageux de prévoir à ce stade une étape de purification du composé, par exemple par chromatographie en phase liquide.
Selon la deuxième variante du procédé de production d'un polypeptide de formule (I), l'étape de fonctionnalisation précède l'étape de synthèse peptidique. Cette deuxième variante est mise en œuvre en phase solide. Ainsi, l'étape de fonctionnalisation consiste dans ce mode de réalisation à créer un support solide amorce à partir d'un support solide préalablement fonctionnalisé.
A titre de support solide, on utilise un polymère soluble ou insoluble, le polymère insoluble étant de préférence sous forme de particules (billes). On peut par exemple utiliser une résine à base de polystyrène (de préférence) ou encore à base de polyacrylamide, polyéthylèneglycol, cellulose, polyéthylène, polyester, latex, polyamide, polydiméthylacrylamide, copolymère polyéthylèneglycol-polystyrène, copolymère polyéthylèneglycol- polyacrylamide ou encore une résine dérivée de celles-ci.
En outre, le support solide présente des groupements lieurs qui sont de préférence des groupements chloro-triphénylméthyle (ou chlorotrityle), où le triphénylméthyle est éventuellement substitué par un ou plusieurs substituants, notamment choisis parmi les substituants chlore, méthoxy, méthyle, fluor et cyano.
A titre d'exemples de support solide, on peut citer les résines polystyrènes présentant des groupements lieurs chlorure de trityle, chlorure de 2-chlorotrityle, chlorure de 4-méthyltrityle ou chlorure de 4-méthoxytrityle. De tels supports solides sont disponibles commercialement, par exemple auprès de Glycopep.
Selon un autre mode de réalisation, le support solide présente des groupements lieurs qui sont des groupements de type trityl-alcool, c'est à dire des groupements OH-Trt-CO-NH-, où le triphénylméthyle (Trt) est éventuellement substitué par un ou plusieurs substituants, notamment choisis parmi les substituants chlore, méthoxy, méthyle, fluor et cyano. Des supports solides présentant de tels groupements lieurs ont été décrits par exemple dans Quibell, JACS 1995, 1 17, 1 1656-1 1668, et sont disponibles commercialement, par exemple dans la gamme ChemMatrix® de supports solides polyéthylèneglycol.
L'utilisation de supports solides de ce type nécessite une étape préliminaire d'activation du support solide :
- soit avec un agent bromé (notamment bromure d'acétyle) pour modifier les groupements lieurs sous la forme Br-Trt-CO-NH- ;
- soit avec un agent chloré (notamment chlorure d'oxalyle) pour modifier les groupements lieurs sous la forme CI-Trt-CO-NH-.
Une étape d'activation de ce type est décrite par exemple dans Harre et al., Reactive & functional polymers 1999, 41 , 1 1 1 -1 14.
Alternativement, on peut faire réagir directement la résine avec l'aminé NH(CH2-CH2-SH)2 en présence de BF3.Et2O, selon Singh, S. et al., J. Org. Chem. 2004, 69, 4551 -4554.
L'utilisation de supports solides de ce type peut permettre d'utiliser des squelettes de résine de type polyéthylèneglycol ou polyéthylèneglycol- polystyrène, plus adaptés à la préparation de longs polypeptides que les résines de type polystyrène.
De préférence, les particules présentent un Dv50 compris entre 1 et 1000 μιτι. Le Dv50 est défini comme étant le 50eme centile de la distribution de taille des particules, c'est-à-dire que 50 % des particules ont une taille inférieure au Dv50 et 50 % ont une taille supérieure au Dv50. De manière générale, le Dv50 est caractéristique du profil granulométrique (distribution volumétrique) des particules, et il peut être déterminé par granulométrie laser (pour une taille inférieure à 200 μιτι), ou par tamisage (pour une taille supérieure à 200 μιτι).
La préparation du support solide fonctionnalisé s'effectue en couplant le composé amine de formule :
(VIII') NH(CH2-CH2-SH)2
au support solide ci-dessus. Le composé amine (VIN') peut lui-même être obtenu par déprotection du composé amine de formule (VIII) ci-dessus, dans lequel d est un groupement protecteur.
Le couplage s'effectue en milieu acide afin de limiter les risques de démasquage de l'aminé secondaire, ce qui induirait des réactions secondaires. Les groupements chlorure de trityle en excès sont de préférence neutralisés, par exemple avec du méthanol. Il est alors important d'ajouter une base pour neutraliser le HCI formé.
On peut prévoir que la préparation du support solide fonctionnalisé fasse partie intégrante de la deuxième variante du procédé de fabrication des polypeptides de formule (I). Alternativement, le support solide fonctionnalisé peut être préparé à l'avance et de manière distincte, afin d'être prêt à l'emploi dans le cadre de la deuxième variante du procédé de fabrication des polypeptides de formule (I).
Le support solide fonctionnalisé est un support de résine polymère qui comprend un squelette principal (de type polystyrène, polyéthylèneglycol- polystyrène, polyacrylamide, polyéthylèneglycol, cellulose, polyéthylène, polyester, latex, polyamide, polydiméthylacrylamide, copolymère polyéthylèneglycol-polystyrène, copolymère polyéthylèneglycol- polyacrylamide ou dérivé de ceux-ci, selon le cas) et des groupements NH- (CH2CH2-S-Trt-)2 liés au squelette principal par les deux groupements Trt, ou bien des groupements NH-(CH2CH2-S-Trt-CO-NH-)2, liés au squelette principal par les deux fonctions NH, dans le cas où le support solide de départ est de type trityl-alcool.
Dans ce qui précède, Trt représente un groupement triphénylméthyle éventuellement substitué par un ou plusieurs substituants notamment choisis parmi les substituants chlore, méthoxy, méthyle, fluor et cyano .
Ainsi, ce support de résine polymère est essentiellement dépourvu de fonctions thiols libres, et présente des fonctions aminés secondaires (fonctions disulfanylethylamines).
Par la suite, un acide aminé est couplé au support solide fonctionnalisé.
De préférence l'acide aminé est protégé à son extrémité N-terminale par un groupement protecteur labile en présence de base, de préférence choisi parmi le groupement 2-(4-nitrophénylsulfonyl)éthoxycarbonyl (NSC) ou Fmoc.
De préférence, l'acide aminé comporte des groupements protecteurs sur la totalité ou une partie (de préférence la totalité) des fonctions présentes sur sa chaîne latérale, et notamment les fonctions carboxylique, aminé, alcool, phénol, guanidine (pour l'arginine) et imidazole (pour l'histidine). De tels groupements protecteurs sont connus de l'homme du métier. On pourra se reporter par exemple à l'ouvrage de référence Protective groups in organic synthesis, 2ème édition, T. Greene et P. Wuts, John Wiley & Sons, Inc.
De préférence, l'acide aminé est activé en présence de PyBOP ou de BOP ou de manière plus particulièrement préférée en présence de PyBROP, ou encore sous forme d'un halogénure, notamment fluorure (c'est-à-dire qu'un atome de fluor est lié au groupement acyle du résidu d'acide aminé).
L'acide aminé réagit avec la fonction amine secondaire présente sur le support solide fonctionnalisé pour former une liaison amide. Après couplage de l'acide aminé, on peut éventuellement procéder à la déprotection de celui- ci.
Par conséquent, à l'issue de l'étape de fonctionnalisation, on obtient un support de résine polymère, dit support amorce, comprenant des groupements G2-NH-CHR-CO-N(CH2CH2-S-Trt-)2 (R représentant une chaîne latérale d'acide aminé), que l'on peut également noter G2-AA-N(CH2CH2-S-Trt-)2 (AA représentant un résidu d'acide aminé), ces groupements étant liés au squelette principal par les deux groupements Trt ; ou bien des groupements G2-AA-N-(CH2CH2-S-Trt-CO-NH-)2, liés au squelette principal par les deux fonctions NH.
On rappelle que Trt désigne un groupement triphénylméthyle éventuellement substitué par un ou plusieurs substituants notamment choisis parmi les substituants chlore, méthoxy, méthyle, fluor et cyano. Par ailleurs, G2 représente un atome d'hydrogène ou un groupement protecteur de fonction amine, selon que le groupement amine alpha de l'acide aminé a été déprotégé ou non. Enfin, les fonctions de la chaîne latérale R du résidu d'acide aminé AA peuvent être avantageusement protégées, comme mentionné ci-dessus.
Le support amorce ainsi obtenu (avec ou sans les groupements protecteurs) est également un objet de l'invention en tant que tel.
Puis l'étape de synthèse peptidique est effectuée, de manière analogue à ce qui a été décrit ci-dessus en relation avec le premier mode de réalisation, l'amorce initiale étant fournie par l'acide aminé couplé au support activé.
Une fois la dernière réaction de couplage d'acide aminé effectuée, on prévoit une réaction de séparation (ou clivage) du polypeptide de son support solide et si nécessaire les déprotections adéquates, après quoi on obtient le polypeptide de formule (I). Tout comme pour la première variante, il est avantageux de prévoir à ce stade une étape de purification du composé, par exemple par chromatographie en phase liquide. Procédé de fabncation des polypeptides de formule (Γ), (V) et (ΧΓ)
Les polypeptides de formule (Γ), (V) et (ΧΓ) mentionnés ci-dessus peuvent être obtenus très facilement à partir respectivement des polypeptides de formule (I), (V) et (XI) par oxydation à l'air, par exemple dans un tampon bicarbonate d'ammonium à environ pH 8. Une autre possibilité avantageuse consiste à utiliser de l'iode I2 ou le diamide H2NCO-N=N- CONH2. Applications
Les polypeptides de formule (I) obtenus selon l'invention peuvent être utilisés pour produire une banque de polypeptides, par exemple à des fins de criblage.
Ils peuvent également être utilisés pour la fabrication de compositions pharmaceutiques, en combinaison avec un ou plusieurs adjuvants pharmaceutiquement acceptables (y compris un ou plusieurs véhicules pharmaceutiquement acceptables). A titre d'exemple de compositions pharmaceutiques pouvant être obtenues selon l'invention, on peut citer les médicaments et les préparations vaccinales.
Ils peuvent également être utilisés pour la réalisation de kits de diagnostic.
EXEMPLES
Les exemples suivants illustrent l'invention sans la limiter.
L'exemple 1 concerne la préparation du composé bis({2-
[triphénylméthyl)sulfanyl]éthyl})amine (composé de formule (VIII)).
Les exemples 2 et 3 conduisent à la fabrication d'un polypeptide 1 a de formule H-GFGQGFGG-N(CH2CH2SH)2 (SEQ ID NO : 1 , répondant à la formule générale (I) ci-dessus) selon la première variante du procédé de fabrication d'un polypeptide de formule (I), décrite ci-dessus (synthèse en phase liquide).
Les exemples 4 et 5 conduisent à la fabrication d'une résine fonctionnalisée, présentant des fonctions disulfanyléthylamine.
L'exemple 6 concerne la préparation d'un support dit « amorce » à partir de la résine fonctionnalisée précédente, sur laquelle est fixé un premier acide aminé.
L'exemple 7 concerne la préparation des polypeptides 1 c (H- ILKEPVHGG-N(CH2CH2SH)2) (SEQ ID No : 2), 1d (H-ILKEPVHGA- N(CH2CH2SH)2) (SEQ ID NO : 3), 1 e (H-ILKEPVHGV-N(CH2CH2SH)2) (SEQ ID NO : 4) et 1f (H-ILKEPVHGY-N(CH2CH2SH)2) (SEQ ID NO : 5), composés répondant à la formule générale (I) ci-dessus, selon la deuxième variante du procédé de fabrication d'un polypeptide de formule (I), décrite ci-dessus (synthèse en phase solide).
L'exemple 8 concerne la ligation des polypeptides respectifs 1 c, 1 d et 1f avec un polypeptide 2 de formule H-CILKEPVHGV-NH2 (SEQ ID NO : 6) répondant à la formule générale (II), pour fournir des polypeptides respectifs 3c (SEQ ID NO : 9), 3d (SEQ ID NO : 10) et 3f (SEQ ID NO : 1 1 ).
L'exemple 9 concerne la synthèse du polypeptide 1 g (H-CHHLEPGG-
N(CH2CH2SH)2) (SEQ ID NO : 7), composé répondant à la formule générale (XI) ci-dessus, selon la deuxième variante du procédé de fabrication d'un polypeptide de formule générale (XI), décrite ci-dessus (synthèse en phase solide) ; ainsi que la cyclisation de ce polypeptide pour fournir un polypeptide cyclique répondant à la formule générale (X) ci-dessus.
L'exemple 10 concerne l'oxydation des polypeptides 1 c, 1 d, 1 e et 1f en dithiazépanes (composés répondant à la formule générale (Γ) ci-dessus).
L'exemple 1 1 concerne la ligation du polypeptide 1 c avec un polypeptide 4 (SEQ ID NO : 17) comportant une homocystéine N-terminale, pour fournir un polypeptide 5 (SEQ ID NO : 18).
Les exemples 12, 13 et 14 concernent respectivement la synthèse d'un polypeptide 6 (SEQ ID NO : 19), d'un polypeptide 7 (SEQ ID NO : 20) et d'un polypeptide 8 (SEQ ID NO : 21 ).
L'exemple 15 concerne la ligation du polypeptide 7 et du polypeptide 8 pour former un polypeptide 7-8 (SEQ ID NO : 22), et l'exemple 16 concerne la ligation du polypeptide 6 avec le polypeptide 7-8 pour former un polypeptide 6-7-8 (SEQ ID NO : 23) après déprotection de la thiazolidine présente sur la cystéine N-terminale du fragment 7-8. Il s'agit donc d'une construction avec deux ligations successives. Le polypeptide 6-7-8 final est un polypeptide linéaire de séquence : H-IRNCIIGKGRSYKGTVSITKSGI KCQPWSSMIPHEHSFLPSSYRGKDLQENYCRNPRGEEGGPWCFTSNPEV RYEVCDIPQCSEV-NH2, les cystéines indiquées en gras étant celles impliquées dans les ligations. Exemple 1 : préparation de la bis({2-[thphénylméthyl)sulfanyl1éthyl))amine
1 ,50 g de bis(2-chloroéthyl)amine (8,4 mmol) et 4,65 g de triphénylméthanethiol (2 équivalents, 16,80 mmoles) sont introduits dans un ballon et placés sous atmosphère inerte. Sous agitation magnétique, 25 mL de diméthylformamide (DMF) anhydre sont ajoutés et le mélange réactionnel est refroidi dans un bain de glace. 4 équivalents de 1 ,8- diazabicyclo[5,4,0]undec-7-ène (DBU) sont additionnés goutte à goutte au mélange. Le mélange est laissé sous agitation à température ambiante durant 3 heures et la réaction est suivie par chromatographie sur couche mince (CCM) (éluant: cyclohexane / acétate d'éthyle / triéthylamine: 8 / 2 / 0,1 ). Passé ce délai, le solvant est évaporé à l'évaporateur rotatif. Le solide blanc obtenu est alors dissous dans 50 mL de dichlorométhane (DCM) et le produit est extrait trois fois avec une solution aqueuse de KH2PO4 à 5 %. Le produit est alors purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice (éluant : cyclohexane / AcOEt / triéthylamine (TEA) : 8 / 2 / 0,1 ) pour obtenir 1 ,46 g de solide amorphe blanc (rendement de 28 %)
L'analyse du produit est la suivante.
Rf = 0,37 (silica gel, cyclohexane / AcOEt / TEA : 8 / 2 / 0,1 ); 1H RMN (300 MHz, CDCIs) δ 7,41 -7,37 (m, 12H, Trt), 7,15 - 7,29 (m, 18H, Trt), 2,23 - 2,36 (m, 8H, CH2), 1 ,26 (s, 1 H, NH) ; 13C (75 MHz, CDCI3) 154,1 ; 129,8 ; 128,1 ; 126,9 ; 47,9 ; 32,6 ; MALDI-TOF: 243,1 [Trt+], 622,3 [M+H+]+, 644,3 [M++Na+]. Exemple 2 : synthèse du polypeptide H-GFGQGFGG-OH (SEQ ID NO : 8)
1 g de résine Wang (charge : 1 ,1 mmoles/g) est placé dans un réacteur et solvaté 30 min dans le DMF. Parallèlement, dans un ballon placé sous atmosphère inerte, 3,27 g de Fmoc-Gly-OH (10 équivalents, 1 1 mmoles) sont dissous dans 100 mL d'un mélange dichlorométhane anhydre / DMF (99/1 , v/v). Une solution de 857 μί de diisopropylcarbodiimide (5 équivalents, 5,50 mmoles) dans 5 mL de dichlorométhane anhydre est ajoutée, sous atmosphère inerte, sur la solution d'acide aminé à 0°C. Le mélange réactionnel est laissé sous agitation à cette température pendant 30 min. Passé ce délai, le solvant est évaporé et le solide blanc obtenu est dissous dans 5 mL de DMF. La solution est ajoutée à la résine avec 0,1 équivalent de DMAP (12,2 mg, 0,1 mmol) dans 1 mL de DMF, puis le mélange réactionnel est mis sous agitation 1 heure. La résine est alors filtrée, lavée avec 5 mL de DMF, 5 mL de dichlorométhane puis séchée sous vide. La charge finale de la résine (0,95 mmole/g ; 86%) est déterminée par la quantification UV de l'adduit dibenzofulvène-pipéridine libéré lors de la déprotection d'aliquots avec une solution à 20% de pipéridine dans le DMF. La synthèse de polypeptides est effectuée en phase solide en utilisant la stratégie Fmoc/tert-butyl sur la résine Fmoc-Gly-Wang (échelle de 0,5 mmoles) préparée comme précédemment sur un synthétiseur de peptide à micro-ondes (CEM μ WAVES, Saclay, France). Le couplage est effectué en utilisant un excès 5 fois molaire de chaque acide aminé, l'activateur HBTU (O-benzotriazole-N,N,N',N'-tétraméthyluronium hexafluorophosphate) est utilisé avec un excès de 4,5 fois molaire et la base DiEA (diisopropyléthylamine) est utilisée avec un excès 10 fois molaire. La déprotection finale et le clivage du polypeptide de la résine sont réalisés avec 30 mL d'un mélange TFA (acide trifluoroacétique) / TIS (triisopropylsilane) / H2O (95 / 2,5 / 2,5 en volume) pendant 1 heure. Le polypeptide est ensuite obtenu par précipitation dans un mélange éther diéthylique / heptane (1 / 1 en volume), dissout dans H2O puis lyophilisé. La pureté du polypeptide (79%) est déterminée par HPLC (chromatographie en phase liquide) et électrophorèse capillaire. L'analyse LC-MS du polypeptide majoritaire concorde avec la structure du polypeptide attendu (C33H43N9Oio calculé 726,32 Da [M+H]+, observé 726,50 Da).
Exemple 3 : synthèse du polypeptide 1 a (H-GFGQGFGG-N(CH?CH?SH)?) (SEQ ID NO : 1 ) en phase liquide
102 mg de polypeptide H-GFGQGFGG-OH (SEQ ID NO : 8) (0,14 mmoles) sont dissous dans un minimum de diméthylformamide (DMF) anhydre et 39 μί de triéthylamine (TEA) (2 équivalents, 0,28 mmoles) sont additionnés à la solution. Sous agitation, 42 μί de di-tert-butyldicarbonate (B0C2O) (1 ,3 équivalents, 0,18 mmoles) sont ajoutés au milieu réactionnel et la solution est homogénéisée par l'ajout de DMF anhydre. Le suivi de la réaction est effectué par HPLC.
174,2 mg de bis({2-[triphénylméthyl)sulfanyl]éthyl})amine (2 équivalents, 0,28 mmoles) sont ajoutés au milieu réactionnel précédent. 32 μί de DiEA (1 ,3 équivalents, 0,18 mmoles) ainsi que 94,7 mg d'hexafluorophosphate de benzotriazol-1 -yl-oxytripyrrolidinophosphonium (PyBOP) (1 ,3 équivalents, 0,18 mmoles) sont ajoutés au mélange réactionnel. Le suivi du couplage est effectué par HPLC. Le polypeptide issu de cette étape de couplage est alors précipité et lavé dans un large volume d'éther diéthylique froid. Le polypeptide est alors dissous dans un minimum de DMF puis précipité et lavé une deuxième fois dans l'éther diéthylique.
12,2 mL d'un mélange TFA / TIS / eau (95 / 2,5 / 2,5) sont ajoutés sur le polypeptide protégé. La solution prend immédiatement une couleur jaune et se décolore rapidement. Après 30 min, le polypeptide est précipité dans 300 mL d'un mélange éther diéthylique / heptane (1 / 1 ) froid. La solution est centrifugée puis le polypeptide est lavé deux fois avec le mélange ci-dessus. Le polypeptide est solubilisé dans l'eau, congelé puis lyophilisé. Le produit est alors purifié par HPLC préparative (gradient : 0 à 40% de tampon B en 40 min, débit : 6 mL/min). 60 mg de polypeptide purifié sont alors obtenus après lyophilisation (rendement total = 50%).
L'analyse du produit est la suivante.
RMN 1H (500 MHz, DMF-d7).
Phe2 (2,98, dd, IH, Ηβ ; 3,23, dd, 1 H, Ηβ ; 4,63, m, 1 H, Ha ; 7,19 -
7,33, m, 5H, Harom. ; ) ; Gln4 (1 ,98-2,15, m, 2H, Ηβ ; 2,31 , m, 2H, Ηγ; 4,37, dt, 1 H, Ha ; 6,97, s, 1 H, NH2 ; 7,57, s, 1 H, NH2 ; 8,09, d, 1 H, NH) ; Phe6 (2,98, dd, 1 H, Ηβ ; 3,23, dd, 1 H, Ηβ ; 4,63, m, 1 H, Ha); Glyi, 3, s, i, s (3,72 - 4,21 , m, 10H, Ha ; 8,6, large s, 3H, NH3 + term.).
Groupement bis(tritylmercaptoéthyl)amino : 2,22 (t, 1 H, SH) ; 2,42 (t,
1 H, SH) ; 2,68 (q, 2H, CH2) ; 2,81 (q, 2H, CH2) ; 3,5 (t, 2H, CH2) ; 3,58 (t, 2H, CH2).
RMN 13C (125 MHz, DMF-d7) : Phe2 (39,7, Οβ ; 57,5, Ca ; Carom. ; CO); Gln4 (30,2, Οβ ; 34,1 , Cy ; 55,9, Ca; CO) ; Phe6 (39,7, Οβ ; 58,2, Ca ; Carom. ; CO) ; Glyi,3, s, 7, 8 (Ca; CO).
Groupement bis(tritylmercaptoéthyl)amino : 24,0 ; 25,0 ; 52,0 ; 53,0.
Spectrométrie de masse: LC-MS C37H52N ioO9S2 [M+H]+ calculé 845,34 Da ; observé 845,42 Da. Exemple 4 : déprotection de l'aminé secondaire bis({2- [thphénylméthyl)sulfanyl1éthyl))amine
12,5 mL d'un mélange TFA / TIS (97,5 / 2,5) sont versés sur 77,75 mg de bis({2-[triphénylméthyl)sulfanyl]éthyl})amine (0,125 mmoles). Le mélange réactionnel est laissé sous agitation pendant 30 minutes. La solution est alors évaporée à sec à l'aide d'un évaporateur rotatif pour obtenir un solide blanc. Le solide obtenu (composé de formule (VIN')) est solubilisé dans le cyclohexane et évaporé à sec, l'opération est renouvelée deux fois.
Exemple 5 : couplage de l'aminé déprotéqée sur la résine chlorotrityle
893 mg de résine (résine chlorure de trityle sur squelette copolymère styrène avec 1 % de divinylbenzène, 200-400 mesh, 1 ,4 mmol/g, commercialisée par Merck sous la référence 01 -64-0074) sont introduits dans un réacteur (1 ,25 mmoles). Sous argon, l'aminé de l'exemple 4 est solubilisée dans 5 ml_ de DMF anhydre et déposée sur la résine à l'aide d'une seringue étanche au gaz. Le réacteur est mis en agitation une nuit sous papier d'aluminium. 40,5 μί de méthanol (1 mmol) et 1 16,5 μί de lutidine (1 mmol) sont ajoutés sur la résine. Après 30 minutes de solvolyse, la résine est lavée avec 2x2 minutes de DMF, 2x2 minutes MeOH, 2x2 minutes DMF, 2x2minut.es DIEA à 5 % dans le DMF et finalement 2x2 minutes DMF. Les tests colorimétriques chloranil et d'Ellman révèlent la présence d'une amine secondaire et l'absence de thiol libre sur la résine.
Le procédé d'obtention de la résine fonctionnalisée de l'exemple 5 correspond au schéma général suivant:
Figure imgf000032_0001
Rési
Figure imgf000032_0002
Support solide prêt pour la
synthèse des peptides en
ohase solide
Exemple 6 : couplage d'acides aminés sur la résine fonctionnalisée de l'exemple 5 pour fournir des supports amorce (résine fonctionnalisée portant un premier acide aminé)
0,5 mmol de Fmoc-AA-F (acide aminé protégé par un groupe Fmoc et activé sous forme d'un fluorure d'acide) sont solubilisés dans 2 mL de DCM anhydre et ajoutés sur la résine de l'exemple 5 (0,125 mmol). On introduit ensuite 82,4 μί de N-méthylmorpholine (0,75 mmol). La réaction est agitée à température ambiante durant 2 heures. La résine est lavée ensuite avec 5x2 minutes de DCM anhydre et 3x2 minutes DMF. Les tests colorimétriques chloranil et d'Ellman montrent l'absence d'amine secondaire et de thiol libre sur la résine.
La charge finale de la résine est déterminée par un dosage UV-visible à 290 nm de l'adduit dibenzofulvène-pipéridine libéré lors de la déprotection avec une solution à 20% de pipéridine dans le DMF. Cet exemple est mis en œuvre avec 4 acides aminés différents : glycine, alanine, valine et tyrosine.
On obtient une charge de 0,15 mmol/g pour la glycine ; 0,124 mmol/g pour l'alanine ; 0,1 15 mmol/g pour la valine ; et 0,107 mmol/g pour la tyrosine.
Il faut noter que pour le couplage du premier acide aminé au support solide, d'autres agents de couplage peuvent être utilisés comme le PyBOP, le PyBrop, l'HBTU... Il a été constaté que le PyBrop donne les meilleurs résultats et permet l'utilisation directe des acides aminés sans nécessité de préactiver à l'aide d'un fluorure d'acide (ce qui est moins pratique expérimentalement).
Exemple 7 : synthèse des polypeptides 1 c (H-ILKEPVHGG-N(CH?CH?SH)?), 1 d (H-ILKEPVHGA-N(CH?CH?SH)?), 1 e (H-ILKEPVHGV-N(CH?CH?SH)?) et 1f (H-ILKEPVHGY-N(CH?CH?SH)?) en phase solide
Le polypeptide 1 c (SEQ ID NO : 2) est obtenu à partir du support amorce préparé dans l'exemple 6 avec la glycine.
Le polypeptide 1 d (SEQ ID NO : 3) est obtenu à partir du support amorce préparé dans l'exemple 6 avec l'alanine.
Le polypeptide 1 e (SEQ ID NO : 4) est obtenu à partir du support amorce préparé dans l'exemple 6 avec la valine.
Le polypeptide 1f (SEQ ID NO : 5) est obtenu à partir du support amorce préparé dans l'exemple 6 avec la tyrosine.
La synthèse des polypeptides peut être résumée comme suit:
Figure imgf000033_0001
Support solide prêt pour la
synthèse des peptides en
ohase solide
Figure imgf000033_0002
Les polypeptides obtenus dans l'exemple 7 ont la formule générique suivante :
Figure imgf000034_0001
R= H 1 c
R= CH3 1 d
R= CH(CH3)2 1 e
R= p-OHPhCH2 1f La synthèse des différents polypeptides est effectuée en phase solide en utilisant la stratégie Fmoc/terf-butyle sur les résines respectives de l'exemple 6 (échelle de 0,1 mmol) sur un synthétiseur de peptide à microondes (CEM μ WAVES, Saclay, France). Le couplage est effectué en utilisant un excès 5 fois molaire de chaque acide aminé, l'activateur HBTU est utilisé avec un excès de 4,5 fois molaire et la base DiEA est utilisée avec un excès 10 fois molaire.
La déprotection finale et le clivage du polypeptide de la résine sont réalisés avec 10 mL d'un mélange TFA/TIS/DMS/H2O (92,5/2,5/2,5/2,5 en volume) pendant 1 heure. Le polypeptide est ensuite obtenu par précipitation dans 100 mL d'un mélange éther diéthylique/heptane (1/1 en volume), dissout dans H2O puis lyophilisé.
La pureté de chaque polypeptide est déterminée par HPLC (91 % pour le polypeptide 1 c avec une glycine, 83% pour le polypeptide 1 d, 80% pour 1 e, et 88% pour 1f). L'analyse MALDI-Tof des polypeptides concorde avec la structure du polypeptide attendu (Peptide 1 c C47H8i Ni3Oi iS2 [M+H]+ calculé 1068,6 Da, observé 1068,5. Polypeptide 1 d C48H83Ni3Oi iS2 [M+H]+ calculé 1082,6 Da, observé 1082,4. Polypeptide 1 e C50H87N13O11S2 [M+H]+ calculé 1 1 10,6 Da, observé 1 1 10,5). Polypeptide 1f C54H87Ni3Oi2S2 [M+H]+ calculé 1 174,6 Da, observé 1 174,6).
La purification des polypeptides est réalisée sur colonne C18 nucléosil en acetonithle-H2O (80-20) en TFA, avec un gradient de 0 à 30 % en 30 mn pour le polypeptide 1 c, et un gradient de 0 à 10 % en 5 mn puis 10 à 25% en 25 mn pour les polypeptides 1 d et 1 e.
La pureté déterminée par HPLC est de 96% pour le polypeptide 1 c avec un rendement global de 35%, 97% pour le polypeptide 1 d avec un rendement de 31 %, et de 99% pour le polypeptide 1 e avec un rendement de 27%.
Exemple 8 : ligation des polypeptides 1 c, 1 d et 1f avec le polypeptide 2 (H- CILKEPVHGV-NH?)
Les ligations respectives des polypeptides 1 c, 1 d et 1f obtenus à l'exemple 7 avec le polypeptide 2 (SEQ ID NO : 6) sont effectuées selon le schéma suivant :
Figure imgf000035_0001
R= H 1c
R= CH3 1d
R= p-OHPhCH2 1f
TCEP MPAA
Figure imgf000035_0002
R= H 3c
R= CH3 3d
R= p-OHPhCH2 3f
Ces ligations permettent d'obtenir les polypeptides respectifs 3c (de formule H-ILKEPVHGGCILKEPVHGV-NH2, SEQ ID NO : 9), 3d (de formule H-ILKEPVHGACILKEPVHGV-NH2, SEQ ID NO : 10) et 3f (de formule H- ILKEPVHGYCILKEPVHGV-NH2, SEQ ID NO : 1 1 ).
Ligation du polypeptide 1 c.
336 mg de MPAA (2 mmol, 200mM) et 234 mg de TCEP (800 μηηοΙ, 80 mM) sont dissous dans 10 mL de tampon phosphate 0,1 M (pH ajusté à 7,5). 10,2 mg de polypeptide 1 c est dissous dans le mélange (7,2 μιτιοΙ, 0,72 mM), cette solution est additionnée sur 15,3 mg de polypeptide 2 H- CILKEPVHGV-NH2 (10,6 mmol, 1 ,06 mM). Le mélange est placé sous argon puis mis sous agitation à 37°C. Le produit est ensuite purifié par RP-HPLC pour donner 5,9 mg de polypeptide 3c (32%).
Ligation du polypeptide 1 d.
Dans un premier temps, on prépare une solution MPAA/TCEP HCI. 33,52 mg de MPAA et 57,54 mg de TCEP HCI sont pesés dans un tube en polypropylène de 1 ,5 ml_. 1 ml_ de tampon phosphate 0,1 M à pH=7,3 puis 140 μΙ_ de NaOH à 6M sont ajoutés et entraînent la solubilisation complète des poudres. 20 μΙ_ NaOH à 6M supplémentaires sont ajoutés pour ajuster le pH de la solution à 7,05.
Pour la réaction de ligation proprement dite, 5,99 mg de polypeptide
1 d et 9.05 mg polypeptide 2 sont pesés dans le même ballon de 5 ml_ en verre. 600 μΙ_ de la solution ci-dessus sont ajoutés. Le milieu réactionnel est mis sous argon par 3 cycles vide/argon, puis placé dans un bain d'huile thermostaté à 37°C et agité à l'aide d'un barreau magnétique.
Au bout de 26h30, le milieu réactionnel est transféré dans un tube en polypropylène de 15 mL. Le ballon réactionnel est rincé par 3,4 mL de tampon A (eau contenant 0.05% en volume de TFA) que l'on transfère dans le tube de 15 mL. 4 extractions (4 x 4 mL) sont réalisées avec de l'éther. On acidifie d'avantage la phase aqueuse par addition de 150 μί de TFA à 10% dans l'eau. 4 nouvelles extractions (4 x 4 mL) à l'éther sont renouvelées.
La phase aqueuse est alors injectée en HPLC préparative (température ambiante, 230 nm, colonne C18 nucleosil 120 A-5 μιτι, tampon A (eau contenant 0,05 % en volume de TFA), tampon B acétonitrile/eau 4/1 en volume contenant 0,05 % en volume de TFA, débit 3 mL/min, gradient 0 à 15% B en 15 min, puis 15 à 100 % B en 283 min, volume injecté 4 mL).
Après lyophilisation, on recueille 8,5 mg de produit de ligation (rendement=77%).
C93H 156N26O23S [M+H]+ calculé 2038,16, trouvé 2038,07.
Détermination de la pureté énantiomérique pour l'alanine : 1 ,76% D- énantiomère.
Ligation du polypeptide 1f.
Dans un premier temps, on prépare une solution MPAA/TCEP HCI.
33,63 mg MPAA et 57,37 mg de TCEP HCI sont pesés dans un tube en polypropylène de 1 ,5 mL. 1 mL de tampon phosphate 0,1 M pH=7,3 puis 140 μί de NaOH à 6M sont ajoutés et entraînent la solubilisation complète des poudres. Le pH de la solution est ajusté à 7,05 avec NaOH à 6M.
Pour la réaction de ligation proprement dite, 3,97 mg polypeptide 1 e et
5,75 mg de polypeptide 2 sont pesés dans le même ballon de 5 mL en verre.
374 μί de la solution ci-dessus sont ajoutés. Le milieu réactionnel est mis sous argon par 3 cycles vide/argon, puis placé dans un bain d'huile thermostaté à 37°C et agité à l'aide d'un barreau aimanté. Au bout de 44h30, on rajoute 78,6 μΙ_ (30 eq) d'une solution de TCEP-HCI à 1 M dans le tampon phosphate réajusté à pH=7.0 à l'aide de soude 6N.
Au bout de 4 jours et demi, le milieu réactionnel est transféré dans un tube en polypropylène de 15 mL. Le ballon réactionnel est rincé par 3,5 mL de tampon A et acidifié avec 150 μί de TFA à 10% dans l'eau que l'on transfère également dans le tube. 3 extractions (3 x 5,5 mL) sont réalisées avec de l'éther.
La phase aqueuse est alors injectée en HPLC préparative (RT, 230 nm, colonne C18 nucleosil 120 A-5 μιτι, tampon A 100% eau contenant 0.05% TFA, tampon B acétonitrile/eau 4/1 contenant 0.05% TFA, débit 3 ml/min, gradient 0 à 15% B en 15 min, puis 15 à 100% B en 283 min, vol injecté 4 mL).
Après lyophilisation, on recueille 3,80 mg de produit de ligation (rendement=54%).
C99Hi6oN26O24S [M+H]+ calculé 2130,18, trouvé 2130,2.
Détermination de la pureté énantiomérique de Tyr : 1 ,25% D- énantiomère.
Les Fig. 1 à 3d illustrent le suivi de la réaction de ligation pour la ligation des polypeptides 1 c, 1 d et 1f.
Exemple 9 : synthèse du polypeptide 1 q (H-CHHLEPGG-N(CH?CH?SH)?) en phase solide et cyclisation de ce polypeptide
Le polypeptide 1 g (SEQ ID NO : 7) a été synthétisé comme le polypeptide 1 c.
La synthèse du polypeptide 1 g est effectuée en phase solide en utilisant la stratégie Fmoc/tertButyle (échelle 50 μιτιοΙ) sur un synthétiseur de peptides à micro-ondes. Le couplage est effectué en présence d'HTBU comme agent activant (4,5 éq) et de DIEA comme base (10 éq). A la fin de la synthèse la résine est lavée au dichlorométhane (2 x 5 mL), à l'éther éthylique (2 x 5 mL) puis séchée. La déprotection finale et le clivage du polypeptide sont réalisés avec 5 mL du mélange TFA TIS/H2O/DMS, 9,25/0,25/0,25/0,25 en volume pendant une heure. Le polypeptide est précipité dans 50 mL d'un mélange éther/heptane (1/1 ), dissout dans l'eau puis lyophilisé.
Polypeptide 1g : C39H61 N13O10S3, analyse MALDI-TOF [M+H]+ calculée 968,19, observée 968,2. Le polypeptide 1 g est ensuite cyclisé pour fournir le polypeptide 3g, selon le schéma suivant : o
i H .SH
∞2— C H H L E P G-N
N
SH
MPAA/TCEP
Phosphate pH 7.5
37°C
Figure imgf000038_0001
3g
Les conditions utilisées pour la cyclisation sont identiques aux conditions utilisées pour liguer le polypeptide 1 c au polypeptide 2.
33,64 mg de MPAA (200 mM) et 22,9 mg de TCEP (80 mM) sont dissous dans 1 mL de tampon phosphate 0.1 M à pH 7.5 ajusté à l'aide d'une solution de NaOH 6N.
1 ,0 mg (0,76 μιτιοΙ) de polypeptide 1 g est dissous dans le mélange (764 [il, 1 mM), placé sous argon puis mis sous agitation à 37°C. La réaction conduit exclusivement à la formation du polypeptide cyclique 3g (SEQ ID NO : 12).
Polypeptide 3g : cyclo(CHHLEPGG) ; CssH^N^OioS analyse MALDI- TOF [M+H]+ calculé 831 ,1 observé 831 ,1 .
Exemple 10 : oxydation des polypeptides 1 c, 1d, 1 e et 1f en dithiazépanes (SEQ ID NO : 13. 14, 15 et 16)
Les polypeptides 1 c, 1 d, 1 e et 1f sont tels qu'obtenus à l'exemple 7. Ces polypeptides sont oxydés selon le schéma général suivant :
Figure imgf000039_0001
= peptide-dithiazépane
Chaque polypeptide est clivé du support solide par l'action d'une solution TFA/DMS/TiS/H2O (92,5/2,5/2,5/2,5 ; v/v). Le polypeptide est alors précipité dans un large volume d'un mélange éther diéthylique/heptane (1/1 ; v/v) et lavé deux fois à l'aide de cette solution. Le polypeptide brut lyophilisé après l'étape de coupure est ensuite dissous dans une solution de bicarbonate d'ammonium à 0,1 M préalablement dégazée pendant 10 min par bullage d'azote (1 mg/mL).
Le mélange est alors laissé à température ambiante sous agitation forte. L'évolution de la réaction est suivie par spectrométrie de masse MALDI-TOF jusqu'à disparition totale de la forme réduite du polypeptide considéré. Le polypeptide est enfin purifié par RP-HPLC (gradient éluant A (H2O/0,05% TFA)/éluant B (80% Acétonitrile/20% H2O/0,05% TFA) : 0 à 10% en 10 min puis 10% à 25 % en 25 min) puis congelé et lyophilisé.
Le tableau ci-dessous résume les résultats obtenus (analyse MALDI- TOF^
Polypeptide m/z [M+H]+ caic. M/z [M+H]+ obs. Rendement final(%) 1 c 1066,6 1066,6 17
1 d 1080,6 1080,6 13
1 e 1 108,6 1 108,6 23
1f 1 172,6 1 172,6 20
Exemple 1 1 : liqation entre le polypeptide 1 c et le polypeptide 4
On effectue une ligation du polypeptide 1 c (SEQ ID NO : 2) avec le polypeptide 4 (SEQ ID NO : 17) qui est identique au polypeptide 2 à ceci près que la cystéine N-terminale est remplacée par une homocystéine. Cette réaction permet d'obtenir le polypeptide 5 (SEQ ID NO : 18). Le schéma de la réaction est le suivant :
Figure imgf000040_0001
TCEP MPAA
Figure imgf000040_0002
33,6 mg de MPAA (0,2 mmol, 200 mM) et 57,4 mg de TCEP (0,2 mmol, 200 mM) sont dissous dans 1 ml_ de tampon phosphate 0,1 M (pH ajusté à 7,35). 6,15 mg de polypeptide 1 c (4,4 μιτιοΙ, 7 mM) et 9,35 mg de polypeptide 4 (H-homoCyslLKEPVHGV-NH2) (6.55 μηηοΙ, 10.5 mM) sont dissous avec le mélange (624 μΙ_). Le mélange est placé sous argon puis mis sous agitation à 37°C. Le produit est ensuite purifié par RP-HPLC pour donner 3,3 mg de polypeptide 5 (29%). C91 Hi52 N_26 O23 S. Analyse MS MALDI-TOF (monoisotopique) [M+H]+ 2010,12 calculé, 2009,5 trouvé.
Exemple 12 : synthèse du polypeptide 6 (SEQ ID NO : 19)
Le polypeptide 6 présente la séquence suivante
-I R N-
Figure imgf000040_0003
La résine décrite dans l'exemple 5 (0,5 mmol, 0,175 mmol/g) est conditionnée dans le dichlorométhane. Fmoc-Lys(Boc)-OH (2.342 g, 5 mmol) est dissous dans le dichlorométhane et quelques gouttes de DMF pour aider à la solubilisation puis ajouté sur la résine. PyBrop (2.331 g, 5 mmol) est dissous dans le minimum de dichlorométhane puis ajouté sur la résine. La DIEA (2.613 mL, 15 mmol) est ensuite additionnée sur la résine et le couplage dure 2h. La résine est ensuite lavée 3 x 2 minutes au dichlorométhane. La résine est ensuite traitée par 10% Ac2O 5% DiEA dichlorométhane (10 mL, 2 min) puis (10 mL, 20 min). La résine est ensuite lavée 5 x 2 minutes au dichlorométhane.
Le polypeptide 6 est assemblé sur une partie de la résine précédente
(0,25 mmol, 0.175 mmol/g) avec un synthétiseur de peptides (CEM Waves, Saclay, France), en utilisant la stratégie Fmoc/terf-butyle. Le couplage est effectué avec les acides aminés (0,2 M, 4 eq), l'activateur HBTU (0,5 M, 3,6 eq) et la base DIEA (2 M, 8 eq). La déprotection finale et le clivage du peptide de la résine sont réalisés avec TFA/TIS/DMS/thioanisole/H2O (90/2,5/2,5/2,5/2,5 en volume, 25 mL) pendant 2h30. Le peptide est précipité dans un mélange froid éther diéthylique/heptane (1/1 en volume), dissout dans un minimum d'eau et lyophilisé. 288 mg de peptide brut sont obtenus (R=32%). Ci2oH2i6N36O3iS4 LC-MS [M+H]+ calculé (masse moyenne) 2788.5; observé 2788.1 .
Une partie du polypeptide 6 est ensuite oxydée avant purification. Pour cela, le polypeptide 6 (49,8 mg) est dissous dans AcOH/eau 4/1 (2 mL). Il est additionné goutte à goutte dans une solution d'iode dans AcOH/eau 4/1 (25 mL, « 10 eq »). Après 10 minutes d'agitation, le milieu réactionnel est transféré dans une ampoule à décanter contenant de l'eau (60 mL). 3 extractions à l'éther sont réalisées (3 x 60 mL). La phase aqueuse est congelée et lyophilisée pour donner 44.1 mg de peptide brut.
Après purification RP-HPLC (colonne Atlantis dC18 OBD 5 μηη,19 x 100 mm, 210-300 nm, tampon A 100% eau contenant 0.05% TFA, tampon B CH3CN/eau 4/1 contenant 0.05% TFA, gradient : 20 à 40% de tampon B en 40 min, débit 25 mL/min) on obtient 7.2 mg de peptide pur (R=14.5%) Ci2oH2i4N36O3iS4 LC-MS [M+H]+ calculé (masse moyenne) 2786.52; observé 2786.33. Exemple 13 : synthèse du polypeptide 7 (SEQ ID NO : 20)
Le polypeptide 7 présente la séquence suivante :
Figure imgf000041_0001
La résine décrite dans l'exemple 5 (0,5 mmol, 0,175 mmol/g) est conditionnée dans le dichlorométhane. Fmoc-Tyr-OH (2,298 g, 5 mmol) est dissous dans le dichlorométhane (<5 mL) et quelques gouttes de DMF pour aider à la solubilisation puis ajouté sur la résine. PyBrop (2,331 g, 5 mmol) est dissous dans le minimum de DCM puis ajouté sur la résine. DIEA (2,614 mL, 15 mmol) est ensuite additionné sur la résine et le couplage dure 2 h. La résine est ensuite lavée 4 x 2 minutes au dichlorométhane. La résine est ensuite traitée par 10% Ac2O/5% DiEA/DCM (10 mL, 2 min) puis (10 mL, 20 min). La résine est ensuite lavée 5 x 2 minutes au dichlorométhane.
Le polypeptide 7 est assemblé sur la résine précédente (0,5 mmol,
0,175 mmol/g) avec un synthétiseur de peptides (CEM Waves, Saclay, France), en utilisant la stratégie Fmoc/terf-butyle. Le couplage est effectué avec les acides aminés (0.2 M, 4 eq), l'activateur HBTU (0.5 M, 3.6 eq) et la base DIEA (2 M, 8 eq). Le solvant de lavage (DMF) ainsi que le solvant de Fmoc-Met-OH contiennent 1 % de thioanisole afin d'éviter au maximum l'oxydation de la méthionine de la séquence.
La résine est séparée en 2 après la glutamine en position 2 (0,25 mmol) afin de coupler la Boc-L-Thz-OH manuellement. Pour ce faire, la résine est lavée 4 x 2 minutes au DMF, pesée en DMF et divisée en 2. HBTU (379,3 mg, 1 mmol) est dissous dans le DMF (1 100 μΙ_). HOBt (135 mg, 1 mmol) est dissous dans le DMF (500 μί) et additionné sur l'HBTU. Boc-L- Thz-OH (233,29 mg, 1 mmol) est dissous dans DMF (500 μΙ_) et additionné au mélange HBTU/HOBt. DIEA (522,7 μί, 3 mmol) est ensuite ajouté sur le mélange. On agite pendant 1 minute puis le mélange est additionné sur la résine et le couplage dure 45 minutes. La résine est ensuite lavée 4 x 2 minutes au DMF, 4 x 2 minutes au dichlorométhane puis 3 x 2 minutes à Et2O et séchée.
La déprotection finale et le clivage du peptide de la résine sont réalisés avec TFA/TIS/DMS/thioanisole/H2O (90/2,5/2,5/2,5/2,5 en volume, 25 mL) pendant 2h30. Le peptide est précipité dans un mélange froid éther diéthylique/heptane (1/1 en volume), dissout dans un minimum d'eau et lyophilisé. 369 mg de peptide brut sont obtenus (R=37.6%). Ci53H223N4iO44S4 MALDI-TOF [M+H]+ calculé (résolution monoisotopique) 3467.54; observé 3466.0.
Une partie du polypeptide 7 est ensuite oxydée avant purification.
Pour cela, le fragment 2 (51 ,8 mg) est dissous dans CH3CN (2.38 mL) puis 0,2 M tampon phosphate pH=7.3 (9, .50 mL) sont ajoutés. Il est additionné goutte à goutte sur une solution de 10 mM diamide dans l'eau (1 ,32 mL, 1 eq). Après 15 minutes d'agitation, le milieu réactionnel est dilué avec du tampon A (1 ,8 ml_) et injecté en RP-HPLC (colonne Atlantis dC18 OBD 5 μηη,19 x 100 mm, 210-300 nm, tampon A 100% eau contenant 0.05% TFA, tampon B CH3CN/eau 4/1 contenant 0,05% TFA, gradient : 25 à 45 % de tampon B en 40 min, débit 25 mL/min) on obtient 1 1 ,2 mg de peptide pur (R=21 .6%) Ci53H22i N4iO44S4 LC-MS [M+H]+ calculé (masse moyenne) 3467,97; 3467,38 .
Exemple 14 : synthèse du polypeptide 8 (SEQ ID NO : 21 )
Le polypeptide 8 présente la séquence suivante :
Figure imgf000043_0001
Le polypeptide 8 est assemblé sur la résine Novasyn TGR (0,5 mmol, 0,25 mmol/g) avec un synthétiseur de peptides (CEM Waves, Saclay, France), en utilisant la stratégie Fmoc/terf-butyle. Le couplage est effectué avec les acides aminés (0,2 M, 4 eq), l'activateur HBTU (0,5 M, 3,6 eq) et la base DIEA (2 M, 8 eq). La déprotection finale et le clivage du peptide de la résine sont réalisés avec TFA/EDT/H2O/TIS (94/2,5/2,5/1 en volume, 30 mL) pendant 2h30. Le peptide est précipité dans un mélange froid éther diéthylique/heptane (1/1 en volume), dissout dans un minimum d'eau et lyophilisé. Après purification RP-HPLC (colonne C18 vydac 50 cm χ 2 cm, 280 nm, tampon A 100% eau contenant 0.05% TFA, tampon B CH3CN/eau 4/1 contenant 0.05% TFA, gradient : 0 à 20 % de tampon B en 10 min puis 20 à 50 % de tampon B en 60 min, débit 30 mL/min) on obtient 272 mg de peptide pur (R=13%) Ci58H239N47O52S4 MALDI-TOF [M+H]+ calculé (résolution monoisotopique) 3755,6 ; observé 3755,7.
Exemple 15 : liqation du polypeptide 7 et du polypeptide 8 (en boîte à gants) pour obtenir le polypeptide 7-8 (SEQ ID NO : 22)
MPAA (33,70 mg) et TCEP.HCI (57,30 mg) sont dissous dans 0,1 M tampon phosphate pH=7,3 contenant 4 M guanidine HCI (1 mL). Le pH de la solution est réajusté à 7.2 avec de la soude 5N (200 μί). Les polypeptides 7 (8,5 mg) et 8 (18,25 mg, 2 eq) sont pesés dans le même tube et dissous avec la solution précédente (309 μί). Le milieu réactionnel est placé dans un bain à 37°C. Après 24 h, le milieu réactionnel est dilué par la même solution (300 μΙ_).
25 h plus tard, 56 mM O-méthylhydroxylamine dans 0,1 M tampon acétate à pH=3,93 (1 ,52 mL) est ajouté. Le pH du milieu réactionnel est réajusté à pH=4,15 avec de l'acide acétique (35 μί). Après 20 h à 37°C, le milieu réactionnel est sorti de la boîte à gants. MPAA est extrait avec Et2O (3 x 6 mL). Le milieu réactionnel est traité 20 minutes à TCEP.HCI (28 mg) avant purification par RP-HPLC (colonne uptisphère 5C4 27.5 cm χ 1 cm, 215 nm, tampon A 100% eau contenant 0.05% TFA, tampon B CH3CN/eau 4/1 contenant 0.05% TFA, gradient : 0 à 20 % de tampon B en 3 min puis 20 à 50 % de tampon B en 57 min, débit 6 mL/min). On obtient 4,4 mg de polypeptide 7-8 pur (R=25,4%) CsoeH^i Ns/OgeSe MALDI-TOF [M+H]+ calculé (masse moyenne) 7077,8; observé 7078,5. Exemple 16 : ligation du polypeptide 6 et du polypeptide 7-8 (en boîte à gants) pour obtenir le polypeptide 6-7-8 (SEQ ID NO : 23)
MPAA (33,74 mg) et TCEP.HCI (57,54 mg) sont dissous dans 0,1 M de tampon phosphate à pH=7,3 contenant 4 M de guanidine HCI (1 mL). Le pH de la solution est réajusté à 7,2 avec de la soude 5 N (220 μί). Les polypeptides 7-8 (3,85 mg) et 6 (2,89 mg, 1 ,7 eq) sont pesés dans le même tube et dissous avec la solution précédente (1 15 μί). Le milieu réactionnel est placé dans un bain à 37°C.
Après 24 h, on voit la formation du produit de ligation, à savoir le polypeptide 6-7-8 de séquence : H-IRNCIIGKGRSYKGTVSITKSG IKCQPWSSMIPHEHSFLPSSYRGKDLQENYCRNPRGEEGGPWCFTSNPEV RYEVCDIPQCSEV-NH2
C4i8H648Ni22Oi27S7 MALDI-TOF [M+H]+ calculé (masse moyenne) 9640,01 ; observé 9640,1 .

Claims

REVENDICATIONS
Procédé de fabrication d'un polypeptide de formule :
(III) Xi-X"-X2
Xi et X2 représentant chacun un fragment peptidique, et X" représentant un résidu d'acide aminé comportant une fonction thiol,
ledit procédé comprenant au moins une étape de réaction de ligation entre un polypeptide de formule :
(I) Xi-N(CH2CH2SH)2
et un polypeptide de formule :
(II) H-X"-X2.
Procédé selon la revendication 1 , dans lequel la réaction de ligation est effectuée en mettant en contact un polypeptide de formule :
Figure imgf000045_0001
avec le polypeptide de formule (II), en présence d'au moins un composé réducteur des liaisons disulfure, le polypeptide de formule ( ) étant réduit in situ en le polypeptide de formule (I) pour la réaction de ligation.
Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel X2 représente un fragment peptidique de formule
(IV) X2'-(Xi"-Xi')i=3...n
n étant un entier supérieur ou égal à 3, chaque X", pour i entier compris entre 3 et n, représentant un résidu d'acide aminé comportant une fonction thiol, et chaque X,', pour i entier compris entre 2 et n, représentant un fragment peptidique ; ledit procédé comprenant, avant l'étape de réaction de ligation entre le polypeptide de formule (I) et le polypeptide de formule (II), une succession de n-2 étapes de réaction de ligation, la jeme ^tape réaction de ligation, pour j entier compris entre 1 et n-2, étant une réaction de ligation entre un polypeptide de formule : (V) H-Xn-j"-Xn-j'- N(CH2CH2SH)2
dans lequel la fonction aminé et / ou la fonction thiol du résidu
Xn-j" est protégée
et un polypeptide de formule :
(VI) H-(Xj"-Xj')i=(n-j+1)...n
pour former un polypeptide de formule :
(VII) H-(Xi"-Xi')i=(n_j)...n
le polypeptide de formule (VII) subissant une déprotection de la fonction thiol du résidu Xn-j" à l'issue de la réaction de ligation.
Procédé selon la revendication 3, dans lequel une ou plusieurs des n-2 étapes de réaction de ligation entre le polypeptide de formule (V) et le polypeptide de formule (VI) est effectuée en mettant en contact un polypeptide de formule :
Figure imgf000046_0001
le polypeptide de formule
(VI) H-(Xj"-Xj')i=(n-j+1)...n
j étant un entier compris entre 1 et n-2, en présence d'au moins un composé réducteur des liaisons disulfure.
Procédé de fabrication d'un polypeptide cyclique de formule :
Figure imgf000046_0002
X2 représentant un fragment peptidique, et X" représentant un résidu d'acide aminé comportant une fonction thiol,
ledit procédé comprenant au moins une étape de réaction de ligation d'un polypeptide de formule :
(XI) H-X"-X2-N(CH2CH2SH)2
avec lui-même.
Procédé selon la revendication 5, dans lequel la réaction de ligation est effectuée en mettant en contact un polypeptide de formule :
(ΧΙ') H-X"-X2-
Figure imgf000046_0003
avec au moins un composé réducteur des liaisons disulfure, le polypeptide de formule (ΧΓ) étant réduit in situ en le polypeptide de formule (XI) pour la réaction de ligation.
Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, dans lequel la ou les réactions de ligation sont effectuées en milieu aqueux, de préférence à un pH compris entre 6,5 et 8,5, de manière plus particulièrement préférée entre 7 et 8, et idéalement d'environ 7,5.
Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, dans lequel la ou les réactions de ligation sont effectuées en présence d'au moins un composé réducteur des liaisons disulfure, de présence choisi parmi la tris(2-carboxyéthyl)phosphine, l'acide 4-mercaptophénylacétique, le dithiothréitol, le benzylmercaptan et les mélanges de ceux-ci.
Polypeptide de formule :
(I) Xi-N(CH2CH2SH)2
ou de formule :
Figure imgf000047_0001
dans lesquelles Xi représente un fragment peptidique et le groupement -N(CH2CH2SH)2 ou N | est lié à la terminaison C=O du résidu d'acide aminé du fragment peptidique Xi qui est en position C-terminale.
10. Polypeptide selon la revendication 9, dans laquelle Xi comprend entre 2 et 300 résidus d'acides aminés, de préférence entre 5 et 100 résidus d'acides aminés, de manière plus particulièrement préférée entre 8 et 50 résidus d'acides aminés. 11. Procédé de fabrication d'un polypeptide de formule :
(I) Xi-N(CH2CH2SH)2
Xi représentant un fragment peptidique et le groupement -N(CH2CH2SH)2 étant lié à la terminaison C=O du résidu d'acide aminé du fragment peptidique Xi qui est en position C- terminale,
comprenant au moins une étape de synthèse peptidique et une étape de fonctionnalisation C-terminale.
Procédé selon la revendication 1 1 , dans lequel l'étape de synthèse peptidique précède l'étape de fonctionnalisation ; l'étape de synthèse peptidique fournit un polypeptide de formule :
(IX) X1-OH
comportant de préférence des groupements protecteurs sur ses fonctions aminés et carboxyliques, à l'exception de sa fonction carboxylique C-terminale ; et l'étape de fonctionnalisation comprend :
- la réaction du polypeptide de formule (IX) avec le composé aminé de formule :
(VIII) NH(CH2-CH2-S-Gi)2
dans laquelle d représente un groupement protecteur, ledit groupement protecteur formant de préférence une fonction thioéther, thioester ou disulfure, et étant de manière plus particulièrement préférée le groupement triphénylméthyle, en phase liquide, pour former le polypeptide de formule (I) ;
- éventuellement la déprotection du polypeptide de formule
(!)■
Support de résine polymère pour la synthèse de polypeptides en phase solide, comprenant un squelette principal et des groupements fonctionnels NH-(CH2CH2-S-Trt-)2 ou des groupements fonctionnels NH-(CH2CH2-S-Trt-CO-NH-)2, où Trt représente un groupement triphénylméthyle éventuellement substitué par un ou plusieurs substituants, notamment choisis parmi les substituants chlore, méthoxy, méthyle, fluor et cyano ; dans lequel les groupements fonctionnels NH-(CH2CH2-S-Trt-)2 sont liés au squelette principal par les deux groupements triphénylméthyle, ou les groupements fonctionnels NH- (CH2CH2-S-Trt-CO-NH-)2 sont liés au squelette principal par les deux groupements aminés. Support de résine polymère pour la synthèse de polypeptides en phase solide, comprenant un squelette principal et des groupements fonctionnels G2-AA-N-(CH2CH2-S-Trt-)2 ou des groupements fonctionnels G2-AA-N-(CH2CH2-S-Trt-CO-NH-)2, où Trt représente un groupement triphénylméthyle éventuellement substitué par un ou plusieurs substituants, notamment choisis parmi les substituants chlore, méthoxy, méthyle, fluor et cyano ; AA représente un résidu d'acide aminé comportant éventuellement un ou plusieurs groupements protecteurs ; G2 représente un atome d'hydrogène ou un groupement protecteur de fonction aminé ; dans lequel les groupements fonctionnels G2-AA-N(CH2CH2-S-Trt-)2 sont liés au squelette principal par les deux groupements triphénylméthyle ou les groupements fonctionnels G2-AA-IM- (CH2CH2-S-Trt-CO-NH-)2 sont liés au squelette principal par les deux groupements aminés.
15. Support de résine polymère selon la revendication 13 ou 14, dans lequel le squelette principal est choisi parmi les squelettes polystyrène, polyacrylamide, polyéthylèneglycol, cellulose, polyéthylène, polyester, latex, polyamide, polydiméthylacrylamide, copolymère polyéthylèneglycol- polystyrène, copolymère polyéthylèneglycol-polyacrylamide et leurs dérivés.
16. Procédé de fabrication d'un support de résine polymère pour la synthèse de polypeptides en phase solide, comprenant :
- la fourniture d'une résine polymère ;
- la fonctionnalisation de la résine polymère par réaction avec le composé aminé de formule :
(VIII') NH(CH2-CH2-S-H)2
17. Procédé selon la revendication 16, comprenant, préalablement à l'étape de fonctionnalisation de la résine polymère :
- la fourniture d'un composé aminé de formule :
(VIII) NH(CH2-CH2-S-Gi)2
dans laquelle G1 représente un groupement protecteur, ledit groupement protecteur formant de préférence une fonction thioéther, thioester ou disulfure, et étant de manière plus particulièrement préférée le groupement triphénylméthyle ;
- la déprotection de ce composé aminé pour obtenir le composé aminé de formule (VIII').
18. Procédé selon la revendication 1 1 , dans lequel :
- l'étape de fonctionnalisation précède l'étape de synthèse peptidique ;
- l'étape de fonctionnalisation comprend :
■ le couplage d'un acide aminé à un support de résine polymère selon la revendication 13 ou 15, pour fournir un support amorce ; ou
la fourniture d'un support amorce qui est un support de résine polymère selon la revendication 14;
- l'étape de synthèse peptidique comprend une succession de couplages d'acides aminés sur le support amorce.
19. Procédé selon la revendication 18, dans lequel le couplage d'un acide aminé au support de résine polymère, comprend la mise en présence du support de résine polymère avec un halogénure d'acide aminé ou avec un acide aminé et un agent d'activation, choisi de préférence parmi le PyBOP, le BOP, le PyBROP, de manière plus particulièrement préférée le PyBROP. 20. Procédé de fabrication d'un polypeptide de formule :
Figure imgf000050_0001
dans laquelle Xi représente un fragment peptidique et le groupement N | est lié à la terminaison C=O du résidu d'acide aminé dulragment peptidique Xi qui est en position C- terminale, comprenant une étape d'oxydation d'un polypeptide de formule :
(I) Xi-N(CH2CH2SH)2
de préférence au contact de l'air, ou en présence de l2 ou de diamide, et dans un tampon, ladite étape d'oxydation étant de préférence précédée d'une étape de fabrication du polypeptide de formule (I) selon le procédé des revendications 1 1 , 12, 18 ou 19.
Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, comprenant une étape de fabrication du polypeptide de formule (I) et / ou (V) ou (XI) selon le procédé des revendications 1 1 , 12, 18 ou 19 ou une étape de fabrication du polypeptide de formule (Γ) et / ou (V) ou (ΧΓ) selon le procédé de la revendication 20. 22. Procédé de fabrication d'une composition pharmaceutique comprenant :
- la fabrication d'un polypeptide selon le procédé de l'une des revendications 1 à 8 ou 21 , et
- la formulation de ce polypeptide avec un ou plusieurs adjuvants pharmaceutiquement acceptables.
23. Procédé de fabrication d'un dispositif de diagnostic comprenant :
- la fabrication d'un polypeptide selon le procédé de l'une des revendications 1 à 8 ou 21 , et
- la formulation de ce polypeptide sous une forme adaptée à une utilisation diagnostique.
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