WO2011024748A1 - インフルエンザm2由来の改変ペプチドワクチン - Google Patents

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WO2011024748A1
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modified peptide
influenza
virus
amino acid
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一義 上仲
周英 野崎
松田　純一
清人 西山
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一般財団法人化学及血清療法研究所
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    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • the present invention relates to a modified peptide in which a cysteine residue is inserted into a peptide consisting of a part of matrix protein 2 of influenza virus and a method for using the same.
  • Influenza virus is a negative-strand single-stranded RNA virus belonging to the Orthomyxoviridae family. Viral particles are 80 to 120 nm in size, and the surface lipid bilayer contains hemagglutinin (hemagglutinin, HA), neuraminidase (NA), matrix protein 2 (M2), and matrix protein 1 (M1). Is backed by. Inside, segmented negative-strand RNA forms a complex (RNP) with nucleoprotein (NP) and RNA polymerase (PA, PB1, PB2). Furthermore, influenza viruses are broadly classified into types A, B, and C depending on the antigenicity of their internal proteins. Among these, it is type A and type B that infect humans and cause epidemics. Type A is particularly pathogenic and causes an explosive epidemic. The type A has 16 types of HA and 9 types of NA, and it is known that there are many subtypes in combination.
  • hemagglutinin, HA neuraminidase
  • M2 matrix protein 2
  • RNA viruses are known to be susceptible to mutation, and this is not an exception in influenza viruses, and the antigenicity of these viruses changes little by little due to point mutations in the genes encoding HA and NA. Yes (antigen drift / drift).
  • influenza A viruses it is known that new virus strains with different antigenicity are generated at intervals of several decades due to discontinuous mutation in which either HA or NA or both are replaced with another type ( antigen shift).
  • antigen shift are continually damaging to civilization.
  • several antigenic shifts have occurred worldwide, causing a pandemic that causes many victims. Specifically, the Spanish cold in 1918, the Asian cold in 1957, the Hong Kong cold in 1968, and the Soviet cold in 1977.
  • Influenza caused by influenza virus infection is one of the most serious infectious diseases on a global scale, and there are many cases that cause death or encephalitis in the elderly, children or patients with weak immunity. It has been. In addition, if the influenza virus infection causes physical symptoms such as fever, headache, and malaise even before death, the patient is forced to suspend social activity for a period of time, leading to significant economic losses. In addition to the existing importance of protection against influenza virus infection, it is necessary to establish an effective prevention method for new virus strains due to the increased possibility of new virus strains due to antigenic shifts. It is said that.
  • the preventive measure against influenza is to vaccinate every year.
  • a vaccine currently in practical use is a split vaccine mainly composed of HA purified from a vaccine production strain cultured in growing chicken eggs.
  • the virus that is expected to be prevalent in that year is used as a vaccine production strain.
  • current influenza vaccines must be vaccinated every year compared to vaccines that can immunize for at least several years with a single vaccination schedule, such as DPT (diphtheria, pertussis, tetanus) vaccines and Japanese encephalitis vaccines.
  • Influenza virus that causes such a large epidemic is type A, so if a vaccine that imparts immunogenicity common to type A is developed, it will be a promising influenza vaccine not only for annual epidemics but also for pandemics It is considered to be. From such a point of view, research has been conducted on vaccines targeting the M2 protein common to influenza virus type A (see, for example, Non-Patent Document 1).
  • M2 is a viral surface protein whose amino acid sequence is relatively well conserved among influenza virus types A. M2 is a relatively small component in influenza virus particles (see, for example, non-patent document 2), but is expressed in a relatively large amount in virus-infected cells (see, for example, non-patent document 3).
  • Neirynck et al. Have reported the use of a fusion antigen obtained by fusing the extracellular domain of M2 to the N-terminus of hepatitis B virus core antigen (see Non-Patent Document 6). According to them, particles in which M2 is exposed to hepatitis B virus core particles are expressed in Escherichia coli, and the particles are purified from the E. coli and administered with an adjuvant to induce antibodies to M2.
  • Non-Patent Document 7 uses an oligomer peptide called an MAP and an oligomer peptide. It has been reported that a peptide corresponding to a region consisting of 23 amino acids (M2e) obtained by removing the hydrophobic transmembrane domain from M2 can also prevent lethal infection by heterologous influenza A virus. It has also been clarified that at least one epitope for the protective antibody produced by immunization with M2e exists in the amino acid region at positions 6 to 13 (see, for example, Non-Patent Document 9).
  • An object of the present invention is to provide a modified peptide having a strong immunogenicity derived from matrix protein 2 (hereinafter also referred to as “M2”), which is one of the surface proteins of influenza virus, and a method for using the same. It is in.
  • M2 matrix protein 2
  • M2e a peptide consisting of 23 amino acids from the 2nd to 24th amino acids of the influenza A virus M2 amino acid sequence
  • M2eC peptides Peptides with cysteine residues inserted
  • a cysteine residue is added to a peptide (M2e) consisting of 23 amino acids at positions 2 to 24 of M2 (see Patent Document 2) consisting of 97 amino acids, which is one of the surface proteins of influenza virus.
  • Nucleic acid fragment consisting of inserted M2eC peptide, fusion protein of M2eC peptide and other polypeptide, M2eC peptide or influenza vaccine containing the fusion protein as an active ingredient, M2eC peptide or a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the fusion protein
  • An expression vector (including a viral vector) in which the nucleic acid fragment is incorporated, a host having the expression vector, and an antibody that recognizes M2 are provided.
  • Nucleic acid fragments consisting of M2eC peptide and a base sequence encoding the amino acid sequence of M2eC peptide can be effectively used for the prevention and treatment of influenza infection. Therefore, the present invention is as follows. [1] A modified peptide in which a cysteine residue is inserted into a peptide (M2e) consisting of amino acid sequences 2 to 24 of matrix protein 2 of influenza virus. [2] The modified peptide according to [1], wherein the influenza virus is type A. [3] The modified peptide according to [1] or [2], wherein the insertion position of the cysteine residue is on the C-terminal side between the amino acids at positions 15 and 16 of M2e.
  • M2e peptide
  • the insertion position of the cysteine residue is any of amino acids at positions 15 and 16 of M2e, positions 20 and 21, positions 21 and 22, positions 22 and 23, positions 23 and 24
  • a fusion protein comprising the modified peptide according to any one of [1] to [6] and a polypeptide.
  • a nucleic acid fragment comprising the modified peptide according to any one of [1] to [6] or the base sequence encoding the amino acid sequence of the fusion protein according to [7] or [8].
  • the M2eC peptide of the present invention has an antibody-producing ability effective in preventing infection of influenza virus 2 to 20 times that of M2e in which no cysteine residue is inserted.
  • one of the M2eC peptides of the present invention Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-Cys-Arg-Cys-Asn-
  • the M2eC peptide consisting of the amino acid sequence of Cys-Asp-Cys-Ser-Cys-Ser-Asp (SEQ ID NO: 10) has an immunogenicity about 20 times higher than that of M2e reported so far.
  • the N-terminal 9 amino acids of the M2eC peptide of the present invention have an amino acid sequence that is well conserved among influenza viruses, and thus are not affected by epidemic strains. Moreover, peptides of this size can be uniformly synthesized in large quantities at low cost by chemical synthesis. This has the tremendous advantage of being able to supply vaccines immediately in the event of a pandemic.
  • the M2eC peptide of the present invention can also be expressed in a form fused with other polypeptides.
  • FIG. 1 is a drawing showing the average anti-M2e antibody titer of each peptide immunization group in Table 2.
  • FIG. 2 is a drawing showing the average anti-M2e antibody titer of each peptide immunization group in Table 3.
  • FIG. 3 is a drawing showing the average anti-M2e antibody titer of each peptide immunization group in Table 4.
  • FIG. 4 is a graph showing the average anti-M2e antibody titer immediately before the attack in the homo virus attack system.
  • FIG. 5 is a drawing showing the average anti-M2e antibody titer immediately before the attack in the heterologous virus attack system.
  • the present invention is characterized by a peptide (M2eC peptide) in which a cysteine residue is inserted into a peptide consisting of 23 amino acids at positions 2 to 24 (M2e) of matrix protein 2 of influenza virus.
  • M2eC peptide a peptide in which a cysteine residue is inserted into a peptide consisting of 23 amino acids at positions 2 to 24 (M2e) of matrix protein 2 of influenza virus.
  • M2e used for the M2eC peptide of the present invention may be derived from M2 of any strain of influenza A virus as long as it has the ability to produce protective antibodies against influenza virus.
  • Influenza virus type A has 15 types of HA and 9 types of NA, and many subtypes of these combinations have been isolated.
  • M2e derived from any strain of M2 can be used.
  • Ser-X1aa-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-X2aa-Arg-X3aa-X4aa-Trp-X5aa-Cys-X6aa-Cys-X7aa-X8aa-Ser-X9aa-Asp (X1aa Is Pro or Leu, X2aa is Ile or Thr, X3aa is Asn or Ser, X4aa is Gly or Glu, X5aa is Gly or Glu, X6aa is Lys or Arg, X7aa is Asn or Ser, X8aa is Gly or Asp, and X9aa is Asn
  • M2e represented by the formula Ser) (SEQ ID NO: 20) is used.
  • Said X1aa, X2aa, X3aa, X4aa, X5aa, X6aa, X7aa, X8aa and X9aa are due to substitution of amino acids derived from the above subtypes.
  • Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-Cys-Arg-Cys-Asn-Asp-Ser-Ser-Asp M2e consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is used.
  • the insertion position and number of cysteine residues to be inserted into M2e are not particularly limited as long as the influence on an important epitope region related to production of protective antibodies is avoided.
  • any of M2e 15th and 16th, 20th and 21st, 21st and 22nd, 22nd and 23rd, or 23rd and 24th 1-5 cysteine residues are inserted at these positions.
  • a total of four cysteine residues are inserted, one each between positions 20 and 21, M21, positions 21 and 22, positions 22 and 23, positions 23 and 24.
  • a maximum of 3 cysteine residues may be inserted into at least one of the above insertion positions.
  • three cysteine residues are inserted between positions 20 and 21 of M2e.
  • the M2eC peptide of the present invention includes amino acid sequences deduced from the amino acid sequences and base sequences of various influenza virus-derived M2 proteins reported so far (see, for example, Non-Patent Document 5), and the above-mentioned cysteine residues. Can be obtained by chemically synthesizing with a peptide synthesizer (for example, 430A peptide synthesizer: manufactured by PerkinElmer Japan Applied Biosystems) based on the design for insertion. At present, there are a large number of peptide synthesis contract institutions such as Bex Corporation, Toray Research Center Co., Ltd., Takara Bio Inc., Invitrogen Corporation, etc., and production can be outsourced to them.
  • a peptide synthesizer for example, 430A peptide synthesizer: manufactured by PerkinElmer Japan Applied Biosystems
  • the M2eC peptide of the present invention can be used as a fusion protein conjugated with various polypeptides such as albumin, annexin V, virus protein (HBV core protein, etc.) and the like.
  • the polypeptide is not particularly limited, but preferably has a high expression level in the selected host.
  • a nucleic acid fragment encoding the polypeptide can be obtained by using a general gene recombination technique described by Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual Second Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989) .
  • the nucleic acid fragment encoding the fusion protein is prepared by combining a nucleic acid fragment encoding the M2eC peptide of the present invention and a nucleic acid fragment encoding another polypeptide by a method using a PCR method or a DNA synthase.
  • a primer comprising a base sequence encoding the M2eC peptide of the present invention and a base sequence encoding a part of the fusion partner polypeptide (21 bases)
  • the other primer of the fusion partner is used (the primer direction is determined depending on which primer is on the N-terminal side).
  • a base sequence of an appropriate restriction enzyme cleavage site may be inserted or added to the end of the primer.
  • nucleic acid fragment encoding the M2eC peptide or fusion protein of the present invention is incorporated into an appropriate expression vector and introduced into a host, whereby the nucleic acid fragment is expressed.
  • an expression vector a plasmid, a viral vector or the like can be used.
  • the promoter contained in the expression vector can be selected from promoters such as Lac, tac, pho5, adh, early SV40, late SV40, and ⁇ -actin depending on the combination with the microorganism or animal cell used as the host.
  • bacteria, yeast, animal cells, plant cells, insect cells and the like are commonly used, and may be selected according to the purpose of use. A known method may be used when transforming a host cell.
  • a calcium phosphate method for example, a calcium phosphate method, a DEAE dextran method, a method using lipofectin-based liposomes, a protoplast polyethylene glycol fusion method, an electroporation method, and the like can be used, and an appropriate method may be selected depending on the host cell to be used.
  • Purification of the M2eC peptide and fusion protein of the present invention is a method commonly used in protein chemistry, such as centrifugation, salting out, ultrafiltration, isoelectric precipitation, electrophoresis, ion exchange chromatography, This can be achieved by appropriately combining gel filtration chromatography, affinity chromatography, hydrophobic chromatography, hydroxyapatite chromatography and the like.
  • the M2eC peptide of the present invention may be expressed in a form fused with another polypeptide or peptide.
  • a His-tag expression system Novagen
  • a system Sigma
  • GST fusion protein purification system GE Healthcare Bioscience Co., Ltd.
  • MagneHis Protein Protein Purification System Promega Inc
  • GST transferase
  • the M2eC peptide of the present invention can be specifically and easily purified by using a nickel affinity column (GE Healthcare Bioscience Co., Ltd.) after being expressed as a fusion peptide with oligohistidine.
  • the amount of the obtained M2eC peptide was determined by weight measurement using a balance or the like or ultraviolet absorption method (absorbance measurement at a wavelength of 214 nm), and the amount of fusion protein bound with M2eC peptide was determined by BCA Protein Assay Reagent Kit (Pierce Biotechnology, Inc), protein assay kit (Nippon Bio-Rad Co., Ltd.) and the like.
  • the evaluation of the M2eC peptide of the present invention and a fusion protein in which the M2eC peptide and another polypeptide are combined is carried out by using the antigen as a small animal such as a chicken or a mouse.
  • the antigen as a small animal such as a chicken or a mouse.
  • blood is collected from the immunized animal, and then the serum is separated and the antibody titer against the M2eC peptide of the present invention in the serum and the medium against the influenza virus are isolated.
  • the M2eC peptide of the present invention thus obtained has an antibody-producing ability effective in preventing infection of influenza virus 2 to 20 times that of M2e, and can be used as an immunizing antigen for influenza vaccine.
  • one M2eC peptide may be used alone, or two or more M2eC peptides or other influenza virus antigens such as HA, NA, and NP antigens may be used in combination.
  • the immunization method (for example, subcutaneous, intradermal, intramuscular, intraperitoneal, nasal, oral, sublingual administration site, immunization period, etc.) is a common immunity commonly used when examining immunogenicity of vaccines, etc.
  • Any method that can induce immunity such as a technique or an immunization method using a device that can be delivered into a living body across a biological barrier, may be used.
  • Such devices include various types of microneedles and hydrophilic gel patches for inducing immunity from the skin, and various enteric capsules, liposomes, and non-enveloped viruses for inducing immunity from the intestinal tract. And particles.
  • Antigens used for immunization are those that can be used against humans, such as adjuvants such as aluminum hydroxide gel, aluminum phosphate gel, CpG oligonucleotide, MDP, QS21, MPL + TDM emulsion, in order to enhance their immunity. Any adjuvant may be added, if any. Furthermore, in order to maintain the stability and shape of the antigen, various additives that are acceptable for pharmaceutical use may be added. Examples of such additives include stabilizers (arginine, polysorbate 80, macrogol 4000, etc.) and excipients (mannitol, sorbitol, sucrose, lactose).
  • composition containing the M2eC peptide or fusion protein of the present invention thus prepared as an active ingredient is treated with aseptic filtration, dispensing, lyophilization, etc., and formulated to protect against infection and development of influenza virus. Used as a vaccine.
  • the M2eC peptide of the present invention is capable of producing a protective antibody against influenza virus, and the obtained antibody is used as a material for treating influenza patients or a detection system for influenza virus (for example, ELISA method, It can be used as a material for constructing a detection system by an antibody measurement method such as Western blotting or dot blotting.
  • a protective antibody polyclonal antibody
  • Such a protective antibody can be obtained from the serum of an animal immunized by the immunization method described above.
  • the above-described protein purification method is used for antibody purification.
  • antibody-producing cells such as spleen cells or lymphocytes are collected from the immunized animal and fused with a myeloma cell line or the like according to the method of Milstein et al. (Method Enzymol., 73, 3-46, 1981). Is made.
  • NSI-Ag4 / 1 As mouse myeloma cells, NSI-Ag4 / 1 (Eur. J. Immunol., 6: 511, 1976), P3X63-Ag8.U1 (Curr. Topics Microbiol. Immunol., 81: 1, 1978), X63-Ag8 .653 (J.
  • the hybridoma can be obtained by culturing in HAT medium for a time sufficient for the unfused cells to die, usually several days to several weeks.
  • the target antibody-producing strain is selected and cloned using the culture solution according to the usual limiting dilution method.
  • Selection of a clone producing an antibody that specifically binds to the peptide of the present invention may be performed by a commonly used analytical method such as ELISA, RIA, or Western blot.
  • Antibody production technology using phage display technology Page Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual Edited by Brian K.
  • M2eC peptide The amino acid sequence of M2e used as a template for M2eC peptide production is the A / New Caledonia / 20/1999 (H1N1) strain (GeneBank Accession) having a more universal sequence (1999 Nature Med. 5: 1157-1163). number ACF41880) was synthesized (Becks Corporation). Table 1 shows the synthesized M2e and each M2eC peptide. Each synthesized peptide was prepared to 5 mg / mL with distilled water substituted for injection containing 1 mM EDTA and stored at -80 ° C. or lower until use.
  • mice Female BALB / c (7 weeks old, SPF, Charles River Japan, Inc.) was preliminarily raised in an SPF environment. An immunization experiment was conducted after about 1 week of preliminary breeding.
  • the labeled antibody diluent is discarded, washed twice with 300 ⁇ L / well of PBST and twice with the same amount of distilled water, added with 100 ⁇ L / well of chromogenic substrate solution TMB + (Dako), and protected from light at room temperature for 30 minutes. Reacted for 1 minute. Thereafter, 1N sulfuric acid was added at 100 ⁇ L / well to stop color development, and the absorbance at 450 nm (OD450 value) was measured.
  • FIG. 1 shows the anti-M2e antibody titers of the M2e and various M2eC peptide immunized groups into which one cysteine residue was inserted after 2 weeks of immunization at 2 weeks.
  • the M2eC peptide immunized group has an anti-M2e antibody titer that is 2 to 4 times higher than that of the M2e immunized group, except for the M2eC22 peptide in which a cysteine residue is inserted between positions 21 and 22 of M2e. Rose to.
  • the immunogenicity of the M2eC peptide having 2 to 3 cysteine residues inserted was evaluated by anti-M2e antibody titer. As shown in Figure 2, one more cysteine residue was inserted into M2eC21 with one cysteine residue inserted between positions 20 and 21 of M2e, and two cysteine residues were inserted into M2e. In the inserted M2eC1621, M2eC2122 and M2eC2123, it was confirmed that the anti-M2e antibody titer was higher than that of M2eC21.
  • M2eC212223 immunization group in which 3 cysteine residues were inserted, one cysteine residue at 20th and 21st positions, 21st and 22nd positions, and 22nd and 23rd positions of M2e, is the M2e immunity group.
  • the anti-M2e antibody titer was 20 times higher, and it was revealed that the antibody had very high immunogenicity.
  • M2eC162122 into which three cysteine residues were inserted was able to induce higher antibody titers than M2e, similar to M2eC212223.
  • M2eC151621, in which three cysteine residues were also inserted was able to induce only the same antibody titer as M2e. This is presumed that the M2e epitope was affected by the insertion of cysteine residues at positions 14 and 15.
  • the anti-M2e antibody increased more in the M2eC16212223 and M2eC1621222324 immunization groups relative to M2eC162122, and the anti-M2e antibody titer in the M2eC21222324 immunization group increased higher than M2eC212223. From this, it was considered that the immunogenicity can be enhanced by increasing the number of cysteine residues to be inserted. In addition, a high anti-M2e antibody titer was also induced in the immunized group of M2eC212121, in which a total of three cysteine residues were inserted at positions 20 and 21 of M2e. It is also possible to enhance immunogenicity by inserting a plurality of cysteine residues at positions 15 and 16, 20 and 21, 22 and 23, or 23 and 24.
  • the M2eC peptide can be made a more powerful influenza vaccine by increasing the number of cysteine residues to be inserted into M2e.
  • mice were divided into 3 groups of 10 animals, 8 animals and 12 animals, and as shown in Table 5, 1 group and 2 groups were immunized with 2 ⁇ g and 20 ⁇ g of M2eC212223, respectively.
  • Non-administration group 2 ⁇ g and 20 ⁇ g of M2eC212223, respectively.
  • influenza virus A / PR8 strain
  • sevofurene Maruishi Pharmaceutical
  • mice were observed from the time of virus attack until the 21st day, and their survival was recorded.
  • mice after influenza virus attack as shown in Table 6, M2e 20 and 21 positions, 21 and 22 positions and one cysteine residue at 22 and 23 positions, a total of 3
  • the M2eC212223 immunized group into which a cysteine residue was inserted showed a higher survival rate than the peptide non-administered group. From these results, it was revealed that the M2eC212223 peptide has an effective onset suppression effect against influenza virus even with immunization of 2 ⁇ g per mouse.
  • Table 7 shows the peptides used for immunization and the M2e sequence of the attack virus.
  • the M2e sequence of the attack virus and the sequence of the immunopeptide differ only by one amino acid at position 21.
  • the five amino acids at positions 11, 13, 16, 20, and 21 are different.
  • mice were divided into 6 groups of 10 mice, and swM2e was divided into 1 group and 2 groups as shown in Table 9, and 3 groups and 4 groups.
  • the swM2eC212223 peptide was immunized, and groups 5 and 6 were non-peptide-administered groups.
  • Group 5 received Alum adjuvant and group 6 received PBS alone.
  • Example 1- (6) The day before the virus attack (6 days after the second immunization), partial blood collection was performed from the tail vein of the mouse, and the serum was separated in the same manner as in Example 1- (6) until the measurement of anti-M2e antibody titer. Stored below 20 ° C.
  • mice Observation of mice The test mice were observed from the time of virus attack until the 21st day, and their survival was recorded.
  • the M2eC212223 peptide has a high protective effect against the attack of influenza viruses having the same M2e sequence as that of the Alum adjuvant, which is approved for human use. It was also revealed that the M2eC212223 peptide has higher onset protection ability than the M2e peptide.
  • M2eC peptide inserted with cysteine residue in M2e peptide has higher immunogenicity than M2e peptide and has higher protective effect against influenza virus infection, and as a vaccine material It was considered more preferable.
  • the anti-M2e antibody titer immediately before the attack is the highest in the 20 ⁇ g immunization group of swM2eC212223.
  • the swM2eC212223 2 ⁇ g immunization group and the swM2e 20 ⁇ g immunization group showed little increase in antibody titer in the swM2e 2 ⁇ g immunization group.
  • mice after virus challenge was consistent with the above-mentioned increase in anti-M2e antibody titer, and the anti-M2e antibody titer was high, swM2e 20 ⁇ g immunization group, swM2eC212223 2 ⁇ g and 20 ⁇ g immunization group
  • the onset-protective effect was confirmed.
  • the swM2eC212223 peptide which can induce a high anti-M2e antibody by inserting a cysteine residue, can confer the onset protection against influenza virus infection even with a smaller immunity than the swM2e peptide without the cysteine residue inserted. It became clear.
  • the M2eC peptide in which a cysteine residue is inserted into the M2e peptide has a higher protective effect than the M2e peptide against influenza virus infection with mutations in the sequence, and is considered preferable as a vaccine material. It was.
  • the modified peptide of the present invention can be used as a material for a universal influenza vaccine against influenza A virus.

Abstract

　インフルエンザウイルスの表層タンパク質の一つであるマトリックスタンパク2（以下、「M2」と称することもある）由来の改変ペプチド及びその利用方法が提供される。インフルエンザウイルスA型のM2のアミノ酸配列のうち、2～24番目の23アミノ酸から成るペプチド（以下、「M2e」と称することもある）にシステイン残基を挿入した改変ペプチド、該改変ペプチドとポリペプチドからなる融合タンパク質、該改変ペプチド又は該融合タンパク質を有効成分として含有するインフルエンザワクチン、該インフルエンザワクチンを含有する生体内に送達可能なデバイス、該改変ペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸断片、該核酸断片が組み込まれた発現ベクター、該発現ベクターが導入された宿主、及び該改変ペプチドを認識し、インフルエンザウイルスに対する防御効果を有する抗体。

Description

インフルエンザM2由来の改変ペプチドワクチン
　本発明は、インフルエンザウイルスのマトリックスタンパク2の一部から成るペプチドにシステイン残基が挿入された改変ペプチド及びその利用方法に関する。
　インフルエンザウイルスは、オルソミクソウイルス科に属するマイナス鎖の一本鎖RNAウイルスである。ウイルス粒子は80～120nmの大きさで、表層の脂質二重膜には赤血球凝集素（ヘマグルチニン、HA）、ノイラミニダーゼ（NA）、マトリックスタンパク2（M2）が存在し、さらにマトリックスタンパク1（M1）に裏打ちされている。その内側には分節したマイナス鎖のRNAが、核タンパク（NP）及びRNAポリメラーゼ（PA, PB1, PB2）と複合体（RNP）を形成している。さらに、インフルエンザウイルスは、その内部タンパクの抗原性の違いによって、A型、B型、C型に大別される。そのなかでヒトに感染して流行を引き起こすのはA型とB型である。特に病原性が強く爆発的な流行を起こすのはA型である。そのA型ではHAは16種類、NAは9種類あり、その組み合わせで多くの亜型が存在することが知られている。
　一般的にRNAウイルスは変異を起こしやすいことが知られており、インフルエンザウイルスにおいても例外ではなく、HA及びNAをコードする遺伝子が点突然変異することにより、その抗原性が年々少しずつ変異している（antigen drift／ドリフト）。さらに、A型インフルエンザウイルスにおいては、HAとNAのいずれか、もしくは両方が別の型に置き換わる不連続変異により抗原性の異なる新型ウイルス株が数十年の間隔で生じることが知られている（antigen shift／シフト）。これらインフルエンザウイルスのドリフトやシフトによる変異は絶え間なく人類に被害をもたらしている。これまで世界的には数回の抗原性のシフトが起こり、多くの犠牲者を出す大流行（パンデミック）の原因となっている。具体的には、1918年のスペインかぜ、1957年のアジアかぜ、1968年の香港かぜ、1977年のソ連かぜである。
　このようにインフルエンザウイルスの感染によって起こるインフルエンザは世界的な規模で流行する重大な感染症の一つであり、老人、小児あるいは免疫力が低下した患者においては死亡、あるいは脳炎を引き起こす症例が多数認められている。さらに、インフルエンザウイルス感染により、死には至らないまでも発熱、頭痛、倦怠感などの身体症状がもたらされれば、その患者は一定期間社会活動の停止を余儀なくされ、重大な経済的損失につながる。このような従来から存在するインフルエンザウイルス感染防御の重要性に加えて、抗原性のシフトによる新型ウイルス株出現の可能性の増大により、新型ウイルス株に対しても効果的な予防法の確立が必要とされている。
　インフルエンザに対する予防策は、ワクチン接種を毎年行うことである。現在実用化されているワクチンは、発育鶏卵で培養したワクチン用製造株より精製したHAを主成分とするスプリットワクチンである。つまり、その年に流行すると予想されるウイルスをワクチン用製造株として用いることになる。このため、毎年、流行株を予想してワクチン用製造株を決めなければならず、ワクチン用製造株と流行株がミスマッチの場合にはそのインフルエンザワクチンは効きにくいことになる。また、DPT（ジフテリア・百日咳・破傷風）ワクチンや日本脳炎ワクチンのように、一回のワクチン接種スケジュールで少なくとも数年以上にわたって免疫を付与できるワクチンに比べ、現行のインフルエンザワクチンは毎年ワクチン接種を行わなければならず、ワクチンを受ける国民や接種する医師にとっても、不便で費用の負担も大きい。さらに、流行予測が外れてワクチン株と異なるウイルス株が発生した場合には、ワクチン接種にも拘らずインフルエンザウイルスに感染してしまうこととなる。特に、抗原性が大きく変わるシフトによる新型インフルエンザが発生した場合には、従来のインフルエンザワクチンではまったく防御効果が期待できないため、その流行は爆発的になり、所謂、パンデミックに至る可能性が大きい。
　以上述べてきたように、現行インフルエンザワクチンではウイルスの変異に対して十分には対応できないため、それを克服するような抗原変異に影響を受けることが少ない普遍的なインフルエンザワクチンが渇望されている。
　このように大きな流行を起こすインフルエンザウイルスはA型であることから、A型に共通した免疫原性を付与するワクチンを開発すれば、毎年の流行のみならずパンデミックに対しても有望なインフルエンザワクチンになると考えられる。そのような観点に立って、インフルエンザウイルスのA型に共通なM2タンパクを標的としたワクチンの研究がなされている（例えば、非特許文献１参照）。M2は、インフルエンザウイルスA型間ではそのアミノ酸配列が比較的よく保存されたウイルス表面タンパクである。M2はインフルエンザウイルス粒子の中では比較的少ない成分であるが（例えば、非特許文献２参照）、ウイルス感染細胞においては比較的多量に発現している（例えば、非特許文献３参照）。
　そのM2に対する抗体がインビボ及びインビトロモデルの両方でA型インフルエンザの複製を阻害することが報告されている（例えば、非特許文献４及び５参照）。さらに、SlepushkinらはM2をワクチン接種したマウスにおいて、異種のA型インフルエンザウイルスによる致死性の感染が防御され、感染した肺組織からのウイルス除去が促進されたことを報告している（例えば、非特許文献１参照）。また、疎水性膜貫通ドメインが除去された改変型M2タンパクがワクチン調製に有用であることも報告されている（例えば、特許文献１参照）。
　一方、Neirynckらは、M2の細胞外ドメインをB型肝炎ウイルスコア抗原のN末端に融合させたものをワクチン抗原として用いることについて報告している（非特許文献６参照）。彼らによれば、M2をB型肝炎ウイルスコア粒子に露出させた粒子を大腸菌で発現させ、その大腸菌から粒子を精製しアジュバントと共に投与することでM2に対する抗体を誘導させている。
　さらに、マウスを用いた実験から、Wuら（例えば、非特許文献７参照）やMozdzanowskaら（例えば、非特許文献８参照）は、アジュバントの利用やMAPと呼ばれるオリゴマーのペプチドを利用することで、M2から疎水性膜貫通ドメインを除去した23アミノ酸からなる領域（M2e）に相当するペプチドでも異種のA型インフルエンザウイルスによる致死性の感染を防御できると報告している。また、M2eの免疫により産生される防御抗体に対するエピトープの少なくとも1箇所は、6～13位のアミノ酸領域に存在することが明らかにされている（例えば、非特許文献９参照）。
　従来のインフルエンザワクチンの製造は、先ずその年の流行株を予測し、そのウイルスを卵で増殖できるように適応させ、それを大量の卵で培養して、そこからウイルスを分離し不活化し、さらに抗原タンパクを精製するという時間と手間のかかる工程を経なければならなかった。このように毎年流行株を予測してワクチン株を製造することもなく、しかもパンデミックにも対応できる新規なワクチンを開発できれば、国民の福祉と医療経済に対し非常に大きな貢献がもたらされることになる。
米国特許第6169175号 特表2001-512748号 Slepushkinら、1995, Vaccine 13: p1399-1402 Zebedee及びLamb，1988 J. Virol．62: p2762-2772 Lambら、1985 Cell 40: p627-633 Hugheyら、1995 Virology 212: p411-421 Treanorら、1990 J. Virol. 64: p1375-1377 1999 Nature Med. 5: p1157-1163 2007 Vaccine 25: p8868-8873 2007 Virology J. 4: 118 doi: 10.1186/1743-422X-4-118 Wanliら、2004 Immunol. Lett 93: p131-136
　本発明の目的は、インフルエンザウイルスの表層タンパク質の一つであるマトリックスタンパク2（以下、「M2」と称することもある）由来の強力な免疫原性を有する改変ペプチド及びその利用方法を提供することにある。
　本発明者らは、上記の目的を達成するために鋭意努力した結果、インフルエンザウイルスA型のM2のアミノ酸配列のうち、2～24番目の23アミノ酸から成るペプチド（以下、「M2e」と称することもある）にシステイン残基を挿入したペプチド（以下、「M2eCペプチド」と称することもある）が、これまでに報告されているM2eよりも非常に高い免疫原性（2倍から20倍）を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
　本発明に従えば、インフルエンザウイルスの表層タンパク質の一つである97個のアミノ酸から成るM2（特許文献２参照）の内、2～24位の23アミノ酸から成るペプチド（M2e）にシステイン残基を挿入したM2eCペプチド、M2eCペプチドと他のポリペプチドとの融合タンパク質、M2eCペプチド又は該融合タンパク質を有効成分として含有するインフルエンザワクチン、M2eCペプチド又は該融合タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸断片、該核酸断片が組み込まれた発現ベクター（ウイルスベクターも含む）及び該発現ベクターを有する宿主、並びにM2を認識する抗体が提供される。
　M2eCペプチド及びM2eCペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸断片は、インフルエンザ感染症の予防や治療に有効に利用され得るものである。したがって、本発明は、以下の通りである。
〔1〕インフルエンザウイルスのマトリックスタンパク2の2～24位のアミノ酸配列から成るペプチド（M2e）にシステイン残基が挿入された改変ペプチド。
〔2〕インフルエンザウイルスが、A型であることを特徴とする、〔1〕に記載の改変ペプチド。
〔3〕前記システイン残基の挿入位置が、M2eの15位と16位のアミノ酸間よりC末側であることを特徴とする、〔1〕又は〔2〕に記載の改変ペプチド。
〔4〕前記システイン残基の挿入位置が、M2eの15位と16位、20位と21位、21位と22位、22位と23位、又は23位と24位のアミノ酸間の何れか一つ、またはこれらの二つ以上の組み合わせからなることを特徴とする、〔3〕に記載の改変ペプチド。
〔5〕前記システイン残基の挿入総数が、1～5個であることを特徴とする、〔1〕ないし〔４〕の何れかに記載の改変ペプチド。
〔6〕前記の各挿入位置に対するシステイン残基の挿入数が、最大3個であることを特徴とする、〔5〕に記載の改変ペプチド。
〔7〕〔1〕ないし〔6〕の何れかに記載の改変ペプチドとポリペプチドからなる融合タンパク質。
〔8〕ポリペプチドがアネキシンV又はアルブミンであることを特徴とする、〔7〕に記載の融合タンパク質。
〔9〕〔1〕ないし〔6〕の何れかに記載の改変ペプチド又は〔7〕又は〔8〕に記載の融合タンパク質を有効成分として含有するインフルエンザワクチン。
〔10〕〔9〕に記載のインフルエンザワクチンを含んでなる、生物学的障壁を横切って生体内に送達可能なデバイス。
〔11〕〔1〕ないし〔6〕の何れかに記載の改変ペプチド又は〔7〕若しくは〔8〕に記載の融合タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸断片。
〔12〕〔11〕に記載の核酸断片が組み込まれた発現ベクター。
〔13〕〔12〕に記載の発現ベクターが導入された宿主。
〔14〕〔1〕ないし〔6〕の何れかに記載の改変ペプチドを認識し、インフルエンザウイルスに対する防御効果を有する抗体。
　本発明のM2eCペプチドは、システイン残基の挿入されていないM2eの2～20倍のインフルエンザウイルスの感染阻止に有効な抗体産生能を有する。例えば、本発明のM2eCペプチドの一つであるSer-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-Cys-Arg-Cys-Asn-Cys-Asp-Cys-Ser-Cys-Ser-Aspのアミノ酸配列（配列番号10）からなるM2eCペプチドは、これまでに報告されているM2eよりも約20倍も高い免疫原性を有し、インフルエンザワクチンの好適な材料となり得る。また、本発明のM2eCペプチドのN末側9個のアミノ酸は、インフルエンザウイルス間でよく保存されたアミノ酸配列を有するために流行株に左右されない。しかも、このサイズのペプチドは化学合成により大量に安価に均一に合成することができる。このことはパンデミックという緊急事態に早急にワクチンを供給できるという非常に大きなメリットを有することになる。また、本発明のM2eCペプチドは、他のポリペプチドと融合させた形で発現させることも可能である。
図1は、表2の各ペプチド免疫群の平均抗M2e抗体価を示す図面である。 図2は、表3の各ペプチド免疫群の平均抗M2e抗体価を示す図面である。 図3は、表4の各ペプチド免疫群の平均抗M2e抗体価を示す図面である。 図4は、ホモのウイルス攻撃系での攻撃直前の平均抗M2e抗体価を示す図面である。 図5は、へテロのウイルス攻撃系での攻撃直前の平均抗M2e抗体価を示す図面である。
　本発明は、インフルエンザウイルスのマトリックスタンパク2の2～24位の23アミノ酸から成るペプチド（M2e）にシステイン残基が挿入されたペプチド（M2eCペプチド）によって特徴付けられる。
　本発明のM2eCペプチドに使用されるM2eは、インフルエンザウイルスに対する防御抗体産生能を有するものであるならば、A型インフルエンザウイルスのうちいずれの株のM2由来であってもよい。インフルエンザウイルスのA型には、15種類のHA及び9種類のNAが存在し、その組み合わせから成る多くの亜型が分離されている。このような亜型としてA/PR/8株、IOWA株、WISC株、TAIW株、LENT株、VIET株、INDO株、HK156株、A/北京/262/95株、A/シドニー/5/97株、A/パナマ/2007/99株、A/ワイオミング/3/2003株、A/ニューカレドニア/20/99株、A/ニューヨーク/55/2004株、A/広島/52/2005株、A/ソロモン諸島/3/2006株、A/ブリスベン/59/2007株、A/ウルグアイ/716/2007株、及びA/カリフォルニア/05/2009及びA/カリフォルニア/06/2009が報告されているが、これらのいずれの株のM2由来のM2eも用いることができる。
　好ましくは、Ser-X1aa-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-X2aa-Arg-X3aa-X4aa-Trp-X5aa-Cys-X6aa-Cys-X7aa-X8aa-Ser-X9aa-Asp（X1aaはPro又はLeu、X2aaはIle又はThr、X3aaはAsn又はSer、X4aaはGly又はGlu、X5aaはGly又はGlu、X6aaはLys又はArg、X7aaはAsn又はSer、X8aaはGly又はAsp及びX9aaはAsn又はSer）（配列番号20）なる式で表現されるM2eが使用される。前記のX1aa、X2aa、X3aa、X4aa、X5aa、X6aa、X7aa、X8aa及びX9aaは、上記の亜型に由来するアミノ酸の置換によるものである。最も好ましくは、Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-Cys-Arg-Cys-Asn-Asp-Ser-Ser-Asp（配列番号1）なるアミノ酸配列から成るM2eが使用される。
　M2eに挿入されるシステイン残基の挿入位置及び個数は、防御抗体産生に係る重要なエピトープ領域への影響が回避されるのであれば特に制限されない。インフルエンザウイルス感染症に対する強力な免疫を付与するには、M2eの15位と16位、20位と21位、21位と22位、22位と23位、又は23位と24位の間の何れかの位置に1～5個のシステイン残基が挿入される。好ましくは、M2eの20位と21位、21位と22位、22位と23位及び23位と24位の間にそれぞれ1個ずつ、計4個のシステイン残基が挿入される。また、上記の各挿入位置の少なくとも1箇所に最大3個のシステイン残基が挿入してもよい。好ましくは、M2eの20位と21位の間に3個のシステイン残基が挿入される。
　本発明のM2eCペプチドは、これまでに報告されている種々のインフルエンザウイルス由来のM2タンパク質のアミノ酸配列や塩基配列から推測されるアミノ酸配列（例えば、非特許文献５参照）、及び上記のシステイン残基の挿入に関する設計に基づいてペプチド合成機（例えば、430Aペプチドシンセサイザー：パーキンエルマージャパン・アプライドバイドバイオシステムズ社製）で化学合成することにより取得できる。現在では、多数のペプチド合成受託機関、例えば、株式会社ベックス、株式会社東レリサーチセンター、タカラバイオ株式会社、インビトロジェン株式会社等が存在するので、これらに製造を委託することもできる。
　本発明のM2eCペプチドは、種々のポリペプチド、例えば、アルブミン、アネキシンV、ウイルスタンパク質（HBVコア蛋白質など）等と結合させた融合タンパク質として使用することができる。該ポリペプチドは特に限定されるものではないが、選択した宿主において発現量の多いものが好ましい。該ポリペプチドをコードする核酸断片は、Sambrookらが述べている一般的な遺伝子組換え技術（Molecular Cloning, A Laboratory Manual Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 1989）を利用することにより取得できる。融合タンパク質をコードする核酸断片は、本発明のM2eCペプチドをコードする核酸断片と他のポリペプチドをコードする核酸断片をPCR法やDNA合成酵素を用いた方法で結合させることにより調製される。例えば、PCR法により融合タンパクをコードする核酸断片を取得するときは、本発明のM2eCペプチドをコードする塩基配列及び融合相手のポリペプチドの一部をコードする塩基配列（21塩基）からなるプライマーと融合相手のもう一方のプライマー（どちらがN末側にくるかで、プライマーの方向が決定される）が用いられる。このとき、プライマーの末端に適当な制限酵素切断部位の塩基配列を挿入又は付加することがある。
　こうして得られた本発明のM2eCペプチドや融合タンパク質をコードする核酸断片を適当な発現ベクターに組み込み、これを宿主に導入することによって、核酸断片の発現が行なわれる。発現ベクターとしては、プラスミド、ウイルスベクター等を用いることができる。該発現ベクターに含まれるプロモーターは、宿主として用いる微生物又は動物細胞との組み合わせにより、Lac、tac、pho5、adh、SV40初期、SV40後期、βアクチンなどのプロモーターから選択することができる。宿主としては、細菌、酵母、動物細胞、植物細胞及び昆虫細胞などが常用されるが、使用目的にあわせて選択すればよい。宿主細胞を形質転換するときには公知の方法を利用すればよい。例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、リポフェクチン系のリポソームを用いる方法、プロトプラストポリエチレングリコール融合法、エレクトロポレーション法などが利用でき、使用する宿主細胞により適当な方法を選択すればよい。
　本発明のM2eCペプチド及び融合タンパク質の精製は、蛋白質化学において通常使用される方法、例えば、遠心分離、塩析法、限外ろ過法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換クロマト法、ゲルろ過クロマト法、アフィニティークロマト法、疎水クロマト法、ハイドロキシアパタイトクロマト法などを適宜組み合わせることにより達成される。
　また、本発明のM2eCペプチドの精製を容易にする目的で他のポリペプチドやペプチドと融合させた形で発現させてもよい。このような融合蛋白を発現させるベクターとして、オリゴヒスチジンを付加することができるHis-tag発現システム（Novagen社）、FLAGタグを付加した融合蛋白を発現させることができるシステム（シグマ社）、グルタチオンSトランスフェラーゼ（GST）との融合蛋白を作製することができるGST融合タンパク質精製システム（GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社）、MagneHis Protein Purification System（Promega Inc）などが挙げられる。例えば、本発明のM2eCペプチドは、オリゴヒスチジンとの融合ペプチドとして発現させた後、ニッケルアフィニティーカラム（GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社）を用いることにより特異的、且つ容易に精製することができる。
　得られたM2eCペプチドの量は、天秤等による重量測定や紫外部吸収法（波長214nmの吸光度測定）により、また、M2eCペプチドを結合した融合タンパク質の量は、BCA Protein Assay Reagent Kit（Pierce Biotechnology, Inc）、プロテインアッセイキット（日本バイオ・ラッド株式会社）などを用いて測定される。
　本発明のM2eCペプチド及びM2eCペプチドと他のポリペプチドを結合させた融合タンパク質（以下、これらを単に「抗原」と称することもある）のワクチンとしての評価は、抗原を小動物、例えば、ニワトリ、マウス、ラット、モルモット、イヌ、サルなどに免疫した後、in vitroの系においては、免疫動物から採血後、血清を分離し、当該血清中の本発明のM2eC ペプチドに対する抗体力価やインフルエンザウイルスに対する中和抗体価を測定することにより、また、in vivoの系においては、前記免疫動物に致死量のインフルエンザウイルスを投与し、その後免疫動物の生死、病状等を観察することにより行われる。in vitroの系における抗体の測定には、ELISA法、PHA法、プラークアッセイ法などが常用される。こうして得られる本発明のM2eCペプチドは、M2eの2～20倍のインフルエンザウイルスの感染阻止に有効な抗体産生能を有するものであり、インフルエンザワクチンの免疫抗原として利用することができる。インフルエンザワクチンの免疫抗原として用いる場合、一つのM2eCペプチドを単独で用いても良く、2つ以上のM2eCペプチド或いはHA、NA、NP抗原等の他のインフルエンザウイルス抗原を組み合わせて用いてもよい。
　免疫方法（例えば、皮下、皮内、筋肉内、腹腔内、経鼻、経口、舌下等の投与部位、免疫期間等）は、ワクチン等の免疫原性を調べる時に常用される一般的な免疫手法、或いは生物学的障壁を横切って生体内に送達可能なデバイスを用いての免疫法等、免疫を誘導できる方法であればよい。このようなデバイスとして、皮膚からの免疫を惹起するためには各種形状のマイクロニードルや親水性ゲルパッチ等が、また腸管からの免疫を惹起するためには各種の腸溶カプセルやリポソーム、ノンエンベロープウイルス粒子などが挙げられる。免疫に用いる抗原には、その免疫能を高めるためにアジュバント、例えば、水酸化アルミニウムゲル、リン酸アルミニウムゲル、CpGオリゴヌクレオチド、MDP、QS21、MPL+TDMエマルジョン等、ヒトに対して使用できるものであればいずれのアジュバントを添加してもよい。更に抗原の安定性や形状維持のために医薬品の用途として許容できる種々の添加剤を加えることもある。このような添加剤として、安定化剤（アルギニン、ポリソルベート80、マクロゴール4000など）や賦型剤（マンニトール、ソルビトール、ショ糖、乳糖）が挙げられる。こうして調整された本発明のM2eCペプチド又は融合タンパク質を有効成分として含有する組成物は、無菌濾過、分注、凍結乾燥等の処理を行い、製剤化され、インフルエンザウイルスの感染・発症を防御するためのワクチンとして使用される。
　上述したように、本発明のM2eCペプチドはインフルエンザウイルスに対する防御抗体を産生し得るものであり、得られた抗体はインフルエンザの患者を治療するための材料やインフルエンザウイルスの検出系（例えば、ELISA法、ウェスタンブロット法、ドットブロット法等の抗体測定法による検出系）を構築するための材料として利用することができる。このような防御抗体（ポリクローナル抗体）は、上記の免疫方法により免疫した動物の血清から取得できる。抗体の精製には、上記のタンパク質の精製方法が用いられる。
　また、モノクローナル抗体を取得する場合は、以下の方法が取られる。すなわち、免疫した動物から脾細胞もしくはリンパ球等の抗体産生細胞を採取し、例えば、Milsteinらの方法（Method Enzymol., 73, 3－46, 1981）に従って、ミエローマ細胞株等と融合し、ハイブリドーマを作製する。マウスミエローマ細胞としては、NSI-Aｇ4/1（Eur. J. Immunol., 6:511, 1976）、P3X63-Ag8.U1（Curr. Topics Microbiol. Immunol., 81:1, 1978）、X63-Ag8.653（J. Immunol., 123:1548, 1979）等を使用することができる。ハイブリドーマは、未融合細胞が死滅するのに十分な時間、通常数日～数週間HAT培地中で培養することにより得られる。かくして得られるハイブリドーマに対し、その培養液を用いて、通常の限界希釈法に従い、目的とする抗体産生株の選択及びクローン化が行われる。本発明のペプチドに特異的に結合する抗体を産生しているクローンの選択は、一般的に使用されるELISA法、RIA法、ウエスタンブロット法等の分析方法を用いればよい。また、ファージディスプレイ技術を利用した抗体作製技術（PHage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual Edited by Brian K. Kay et al.、Antibody Engineering: A PRACTICAL APPROACH Edited by J. McCAFFERTY et al.、ANTIBODY ENGINEERING second edition edited by Carl A. K. BORREBAECK）により本発明のM2eCペプチドと結合する抗体を作製することもできる。
　以下、実施例に従って更に詳述するが、本発明は、何らこれらの実施例に限定されるものではない。
＜M2eにシステイン残基を挿入したM2eCペプチドの免疫原性評価＞
１．材料と方法
(1)M2eCペプチド
　M2eCペプチド作製の鋳型としたM2eのアミノ酸配列は、よりユニバーサルな配列（1999 Nature Med．5：1157-1163）を持つA/New Caledonia/20/1999(H1N1)株（GeneBank Accession number ACF41880）の配列をもとに合成した（株式会社ベックス）。表1に合成したM2e及び各M2eCペプチドを示した。合成した各ペプチドは1mM EDTAを含有する窒素ガス置換した注射用蒸留水にて5mg/mLに調製し、これを原液として使用時まで-80℃以下で保存した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
(2)投与マウス
　雌のBALB/c（7週齢、SPF、日本チャールズリバー社）をSPF環境下で予備飼育した。約1週間の予備飼育の後、免疫実験を実施した。
(3)免疫群構成
(3)-1　M2eにシステイン残基1個を挿入したM2eCペプチドの免疫原性評価
　24匹のマウスを一群4匹の6群に分け、表2に示すように各群にM2e及び5種のM2eCペプチドを免疫した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
(3)-2　 M2eに3個までのシステイン残基を挿入したM2eCペプチドの免疫原性評価
　24匹のマウスを4匹ずつの6群に分け、表3に示すように各群にM2e及び5種のM2eCペプチドを免疫した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
(3)-3　 M2eに3個以上のシステイン残基を挿入したM2eCペプチドの免疫原性評価
　32匹のマウスを4匹ずつの8群に分け、表4に示すように各群にM2e及び7種のM2eCペプチドを免疫した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 (4)免疫物の調製
　免疫の前日に-80℃以下で保存中の各ペプチド原液をPBS（INVITROGEN社）で1mg/mLに希釈し、等量のAlumアジュバント（ALHYDROGEL, BRENNTAG BIOSECTOR社）と混合して一夜静置した。
(5)免疫方法及びスケジュール
　前日に調製した各免疫物をPBSで0.2mg/mLに希釈し、マウス1匹あたり100μLずつ1mLツベルクリン用注射器（テルモ、SS-01T2613S）を用いて背部皮下内に投与した（一個体あたりの投与量：各ペプチド20μg）。免疫は2週間隔で2回行った。
(6)採血
　2回目の免疫から2週間後にすべてのマウスをペントバルビタールナトリウム（共立製薬、ソムノペンチル）麻酔下腹部大静脈より採血して殺処分した。採取した血液はマイクロティナ（BECTON DICKINSON社）に移し、室温にて十分に凝固させた後、5,000回転、10分間遠心により血清を分離した。分離した血清は測定まで-20℃にて保存した。
(7)マウス標準血清の調製
　各免疫群の抗M2e抗体上昇を比較するために、抗M2e抗体を有するマウス標準血清として、上記表1のM2e（10μg/body/shot）とAlumアジュバントを背部皮下に3週間間隔で3回免疫したマウス15匹分の血清をプールし、標準血清とした。
(8)抗M2e抗体（IgG）の測定
　M2eを0.1M Carbonate buffer, pH9.6で2μg/mLに希釈し、96-well plate（Nunc社、Immobilizer Amino）に100μL/well加え、4℃で一夜静置して固相化した。翌日、各wellを300μLの0.05%Tween20含有リン酸緩衝液（PBST）で3回洗浄し、0.1M Carbonate buffer, pH9.6で10mMに希釈したモノエタノールアミン（和光純薬）を300μL/wellずつ添加して、室温で1時間静置した。
　1時間後、10mMモノエタノールアミンを十分に除き、PBSTで検体を希釈して100μL/wellにて添加した（各検体ともduplicate）。室温、1時間の反応の後、添加した各希釈血清を捨て300μL/wellのPBSTで3回洗浄した。洗浄後、well内の洗浄液を十分に除き、PBSTで2,000倍希釈したHRP標識抗マウスIgGヤギ抗体（American Qualax社、A131PS）を100μL/wellを添加し、室温、1時間反応した。反応後、標識抗体希釈液を捨て300μL/wellのPBSTで2回、同量の蒸留水で2回洗浄し、発色基質液TMB+（Dako社）を100μL/well添加して遮光下、室温で30分間反応した。その後、1N硫酸を100μL/well添加して発色を停止し、450nmの吸光度（OD450値）を測定した。
(9)標準血清の抗M2e抗体価算出
　32匹の未免疫マウス（C57BL/6、雄）血清を検体希釈液にて200倍希釈し、各希釈検体をduplicateにてそれらのOD450値を測定した。測定したOD450値の平均値にその標準偏差値の2倍を加えた値をカットオフ値と設定した。次に、標準血清を15,000倍から960,000倍まで2倍段階希釈してそのOD450値を測定し、カットオフ値を超える最大希釈倍率を標準血清の抗体価とした。なお、本試験系では約400,000倍希釈までカットオフ値を超えたことから、標準血清原液の抗M2e抗体価を400,000単位とした。
(10)血中抗M2e抗体価
　各種ペプチドを免疫した各群のマウス血清の抗体価は以下のようにして算出した。先ず、標準血清を検体希釈液にて1, 2, 4, 8, 16, 32単位となるように希釈し、抗体価測定時のスタンダードを調製した。次に各免疫群のマウス血清を調製したスタンダードの範囲に入るように検体希釈液にて希釈した。以上のように調製した被検試料を実施例1-(8)に示す系にて測定し、得られたスタンダードの単位とOD450値の標準直線より各被検マウス血清の抗M2e抗体価を算出した。
２．結果
　2週間間隔で2回免疫後2週間目に採血したM2e及び1個のシステイン残基を挿入した各種M2eCペプチド免疫群の抗M2e抗体価を図1に示した。図1に示すように、M2eの21位と22位間にシステイン残基を挿入したM2eC22ペプチドを除き、M2eCペプチド免疫群ではM2e免疫群に比較して、抗M2e抗体価が2倍から4倍に上昇した。
　以上の結果から、M2eの15位と16位、20位と21位、22位と23位、又は23位と24位の間の何れか1箇所にシステイン残基を1個挿入することで従来のM2eペプチドに比較して高い免疫原性を有することが明らかとなった。
　次に、システイン残基を2～3個挿入したM2eCペプチドの免疫原性を抗M2e抗体価により評価した。図2に示すように、M2eの20位と21位の間にシステイン残基を1個挿入したM2eC21にさらに1個のシステイン残基を挿入し、M2eに対しては2個のシステイン残基を挿入したM2eC1621、M2eC2122及びM2eC2123では、M2eC21以上の抗M2e抗体価の上昇が確認できた。さらに、M2eの20位と21位、21位と22位及び22位と23位にシステイン残基を1個ずつ、計3個のシステイン残基を挿入したM2eC212223の免疫群は、M2e免疫群の実に20倍の抗M2e抗体価を示し、非常に高い免疫原性を有することが明らかとなった。
　さらにシステイン残基の挿入個数を増やしたM2eCペプチドの免疫原性を、同じく抗M2e抗体価により評価した。図3に示すように、3個のシステイン残基を挿入したM2eC162122ではM2eC212223と同じく、M2eよりも高い抗体価を誘導することができた。しかし、同じく3個のシステイン残基を挿入したM2eC151621ではM2eと同程度の抗体価しか誘導できなかった。このことは、14位と15位にシステイン残基を挿入することでM2eのエピトープが影響を受けたものと推定される。
　また、M2eC162122に対してM2eC16212223及びM2eC1621222324免疫群では抗M2e抗体はより高く上昇し、M2eC212223に対してM2eC21222324免疫群の抗M2e抗体価はより高く上昇した。このことから、挿入するシステイン残基の個数を増やすことでより免疫原性を増強することができると考えられた。さらに、M2eの20位と21位に計3個のシステイン残基を挿入したM2eC212121の免疫群でも高い抗M2e抗体価が誘導されたことから、システイン残基の挿入により抗M2e抗体の上昇が認められる、15位と16位、20位と21位、22位と23位又は23位と24位にシステイン残基を複数個挿入することでも免疫原性を増強することが可能と考えられる。
　以上の結果から、M2eに挿入するシステイン残基を増やすことで、M2eCペプチドはより強力なインフルエンザワクチンとすることができると考えられた。
＜M2eCペプチドの発症防御能評価＞
１．材料と方法
(1)ペプチド
　実施例１で使用したM2eCペプチドのうちM2eC212223を使用した。
(2)攻撃ウイルス
　凍結保存中のインフルエンザウイルス（A/PR8/8/34株、H1N1）を使用した。
(3)投与マウス
　実施例１-(2)と同様の方法により行なった。
(4)免疫群構成
　30匹のマウスを10匹、8匹、12匹の3群に分け、表5に示すように1群と2群にM2eC212223を各々2μg及び20μg免疫し、3群はペプチド非投与群とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
(5)免疫物の調製、免疫方法及びスケジュール
　初回免疫は、免疫日当日に、-60℃以下で保存中のM2eC212223原液をPBS（INVITROGEN社）で0.04mg/mL及び0.4mg/mLに希釈し、等量のフロインドのコンプリートアジュバントと混合し、マウス1匹あたり100μLずつ1ｍLツベルクリン用注射器（テルモ、SS-01T2613S）を用いて背部皮下内に投与した（一個体あたりの投与量：2μg又は20μg）。コントロールとなる第三群ではペプチド溶液の代わりにPBSを使用した。二回目の免疫も、初回免疫と同様に調製した。ただし、アジュバントにはフロインドのインコンプリートアジュバントを使用した。免疫は2週間隔で2回行った。
(6)攻撃用ウイルス液の調製及び攻撃方法
　2回目の免疫から1週間後、凍結保存中のインフルエンザウイルス（A/PR8株）液をPBSで希釈し、セボフレン（丸石製薬）麻酔下、マウス一匹あたり20μL（5LD50相当）ずつ経鼻投与した。
(7)マウスの観察
　被検マウスについて、ウイルス攻撃時より21日目まで観察し、その生死を記録した。
２．結果
　インフルエンザウイルス攻撃後のマウス観察の結果、表6に示すように、M2eの20位と21位、21位と22位及び22位と23位にシステイン残基を1個ずつ、計3個のシステイン残基を挿入したM2eC212223免疫群は、ペプチド非投与群に比べ、高い生存率を示した。この結果から、M2eC212223ペプチドは、マウス一匹あたり2μgの免疫でもインフルエンザウイルスに対して効果的な発症抑制効果を有することが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
＜ホモ及びヘテロのウイルス攻撃系でのM2eとM2eC212223ペプチドの発症防御能比較＞
１．材料と方法
(1)免疫に使用したペプチドと攻撃ウイルス
　ホモのウイルス攻撃系では実施例１で使用したM2e及びM2eC212223を免疫に使用し、ヘテロのウイルス攻撃系では2009年に流行した新型インフルエンザウイルス（A/H1N1型）のM2配列を基に、合成したswM2e及びswM2eC212223を使用した（株式会社ベックス）。合成したペプチドは実施例１に示す方法で原液を調製し、使用時まで-60℃以下で保存した。また、攻撃ウイルスは実施例２と同じインフルエンザウイルスを使用した。
　表7には免疫に使用したペプチドと攻撃ウイルスのM2e配列を示した。ホモのウイルス攻撃系では、攻撃ウイルスのM2e配列と免疫ペプチドの配列は21位のアミノ酸1箇所のみ異なるだけである。しかし、ヘテロのウイルス攻撃系では、11位、13位、16位、20位及び21位の5箇所のアミノ酸が異なる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
 ＊下線は免疫に使用したペプチドと異なるアミノ酸を示す。
(2)投与マウス
　実施例１-(2)と同様の方法により行なった。
(3)免疫群構成
(3)-1　ホモのウイルス攻撃系での発症防御能評価
　24匹のマウスを8匹ずつの3群に分け、表8に示すように1群にM2e、2群にM2eC212223ペプチドを免疫し、3群はペプチド非投与群（Alum単独群）としてペプチドの代わりにPBSを投与した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
(3)-2　ヘテロのウイルス攻撃系での発症防御能評価
　60匹のマウスを10匹ずつの6群に分け、表9に示すように1群及び2群にswM2e、3群及び4群にswM2eC212223ペプチドを免疫し、5群及び6群はペプチド非投与群とした。5群にはAlumアジュバント、6群にはPBSのみを投与した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
(4)免疫物の調製、免疫方法及びスケジュール
(4)-1　ホモのウイルス攻撃系での発症防御能評価
　免疫の前日に、実施例１-(4)と同様の方法により調製した。翌日、調製した各免疫物をPBSで0.02mg/mLに希釈し、マウス1匹あたり100μLずつ1ｍLツベルクリン用注射器（テルモ、SS-01T2613S）を用いて背部皮下内に投与した（一個体あたりの投与量：各ペプチド2 μg）。免疫は2週間隔で2回行った。なお、ウイルス攻撃の前日（2回目の免疫から6日目）にマウスの尾静脈より部分採血を行い、実施例１-(6)と同様に血清を分離し、抗M2e抗体価の測定まで-20℃以下に保存した。
(4)-2　ヘテロのウイルス攻撃系での発症防御能評価
　免疫の前日に、実施例１-(4)と同様の方法により調製した。翌日、調製した各免疫物をPBSで0.02mg/mL又は0.2mg/mLに希釈し、マウス1匹あたり100μLずつ1ｍLツベルクリン用注射器（テルモ、SS-01T2613S）を用いて背部皮下内に投与した（一個体あたりの投与量：各ペプチド2又は20μg）。免疫は2週間隔で2回行い、本実施例の(4)-1と同様にウイルス攻撃前日の血清を採取・保存した。
(5)血中抗M2e抗体価
　各被検マウス血清の抗M2e抗体価の測定は実施例１と同様に行った。
(5)攻撃用ウイルス液の調製及び攻撃方法
　実施例２と同様に行った。
(6)マウスの観察
　被検マウスについて、ウイルス攻撃時より21日目まで観察し、その生死を記録した。
２．結果
　ホモのウイルス攻撃系において、図4に示すように、ヒトでの使用が認められているAlumアジュバントでもM2eC212223の2μg免疫群では高い抗M2e抗体価（攻撃ウイルスのM2e配列とほぼ同じ配列のペプチドに対する抗体）を誘導することができた。しかし、システイン残基を挿入していないM2e免疫群では、2μgでは抗M2e抗体価を誘導することはできなかった。さらにウイルス攻撃後の結果をみると、表10に示すように、M2eC212223免疫群は、M2e免疫群及びペプチド非投与群に比べ、明らかに高い生存率を示した。この結果から、M2eC212223ペプチドは、その配列とほぼ同じM2e配列を持つインフルエンザウイルスの攻撃に対して、ヒトでの使用が認められているAlumアジュバントでも高い発症防御効果を有することが明らかとなった。また、M2eペプチドに比べてM2eC212223ペプチドの方が発症防御能が高いことも明らかとなった。
　以上の結果から、M2eペプチドにシステイン残基を挿入したM2eCペプチドは、M2eペプチドに比較して高い免疫原性を有するとともに、インフルエンザウイルス感染に対してより高い防御効果を有し、ワクチンの材料としてより好ましいと考えられた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　次にヘテロのウイルス攻撃系において、図5に示すように、攻撃直前の抗M2e抗体価（攻撃ウイルスのM2e配列とほぼ同じ配列のペプチドに対する抗体）はswM2eC212223の20μg免疫群で最も高く、以下、swM2eC212223の2μg免疫群、swM2eの20μg免疫群となり、swM2eの2μg免疫群ではほとんど抗体価は上昇しなかった。さらにウイルス攻撃後のマウス生存率は、表11に示すように、前述の抗M2e抗体価の上昇結果と一致し、抗M2e抗体価が高かったswM2eの20μg免疫群、swM2eC212223の2μg及び20μg免疫群において発症防御効果が確認された。すなわち、システイン残基を挿入して高い抗M2e抗体を誘導できるswM2eC212223ペプチドの方が、システイン残基を挿入していないswM2eペプチドに比べて少ない免疫量でもインフルエンザウイルス感染に対する発症防御能を付与できることが明らかとなった。
　以上の結果から、M2eペプチドにシステイン残基を挿入したM2eCペプチドは、その配列上に変異のあるインフルエンザウイルス感染に対しても、M2eペプチドより高い防御効果を有し、ワクチンの材料として好ましいと考えられた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　本発明の改変ペプチドは、A型インフルエンザウイルスに対するユニバーサルなインフルエンザワクチンの材料として利用できる。

Claims (14)

  1. 　インフルエンザウイルスのマトリックスタンパク2の2～24位のアミノ酸配列から成るペプチド（M2e）にシステイン残基が挿入された改変ペプチド。
  2. 　インフルエンザウイルスが、A型であることを特徴とする、請求項１に記載の改変ペプチド。
  3. 　前記システイン残基の挿入位置が、M2eの15位と16位のアミノ酸間よりC末側であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の改変ペプチド。
  4. 　前記システイン残基の挿入位置が、M2eの15位と16位、20位と21位、21位と22位、22位と23位、又は23位と24位のアミノ酸間の何れか一つ、またはこれらの二つ以上の組み合わせからなることを特徴とする、請求項３に記載の改変ペプチド。
  5. 　前記システイン残基の挿入総数が、1～5個であることを特徴とする、請求項１ないし４の何れか一項に記載の改変ペプチド。
  6. 　前記の各挿入位置に対するシステイン残基の挿入数が、最大3個であることを特徴とする、請求項５に記載の改変ペプチド。
  7. 　請求項１ないし６の何れか一項に記載の改変ペプチドとポリペプチドからなる融合タンパク質。
  8. 　ポリペプチドがアネキシンV又はアルブミンであることを特徴とする、請求項７に記載の融合タンパク質。
  9. 　請求項１ないし６の何れか一項に記載の改変ペプチド又は請求項７又は８に記載の融合タンパク質を有効成分として含有するインフルエンザワクチン。
  10. 　請求項９に記載のインフルエンザワクチンを含んでなる、生物学的障壁を横切って生体内に送達可能なデバイス。
  11. 　請求項１ないし６の何れか一項に記載の改変ペプチド又は７若しくは８に記載の融合タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸断片。
  12. 　請求項１１に記載の核酸断片が組み込まれた発現ベクター。
  13. 　請求項１２に記載の発現ベクターが導入された宿主。
  14. 　請求項１ないし６の何れか一項に記載の改変ペプチドを認識し、インフルエンザウイルスに対する防御効果を有する抗体。
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