WO2011016436A1 - ポリ乳酸微粒子含有凍結乾燥組成物の製造方法 - Google Patents

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WO2011016436A1
WO2011016436A1 PCT/JP2010/063056 JP2010063056W WO2011016436A1 WO 2011016436 A1 WO2011016436 A1 WO 2011016436A1 JP 2010063056 W JP2010063056 W JP 2010063056W WO 2011016436 A1 WO2011016436 A1 WO 2011016436A1
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polylactic acid
solution
aqueous
dispersant
excipient
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PCT/JP2010/063056
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Inventor
敬一 松久
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千寿製薬株式会社
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    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
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    • C08J3/12—Powdering or granulating
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    • C08J3/02—Making solutions, dispersions, lattices or gels by other methods than by solution, emulsion or suspension polymerisation techniques
    • C08J3/03—Making solutions, dispersions, lattices or gels by other methods than by solution, emulsion or suspension polymerisation techniques in aqueous media
    • C08J3/07—Making solutions, dispersions, lattices or gels by other methods than by solution, emulsion or suspension polymerisation techniques in aqueous media from polymer solutions
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    • C08J3/12—Powdering or granulating
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J2367/00—Characterised by the use of polyesters obtained by reactions forming a carboxylic ester link in the main chain; Derivatives of such polymers
    • C08J2367/08—Polyesters modified with higher fatty oils or their acids, or with resins or resin acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for suppressing the generation of aggregates of polylactic acid particles obtained by freeze-drying an aqueous suspension of polylactic acid fine particles.
  • Transparent tissues such as the vitreous body, lens and cornea are gathered in the eye. Cataract surgery removes the nucleus and cortex in the capsular bag, but the lens cortex remaining near the posterior capsule becomes cloudy and is known to cause secondary cataract.
  • vitreous body removal surgery it is required to remove as much as possible the vitreous tissue that has adhered to the retina and the vitreous body that will serve as a scaffold for growth.
  • the vitreous body is a transparent tissue, and complete removal of the vitreous body is not easy.
  • a transparent vitreous body is visualized by injecting a steroid suspension such as a triamcinolone preparation (Kenacort-A: registered trademark) into the vitreous cavity using a syringe during a vitreous removal operation. (See Non-Patent Document 1).
  • a steroid suspension such as a triamcinolone preparation (Kenacort-A: registered trademark)
  • Non-Patent Documents 2 and 3 a method of improving the visibility of the vitreous body by injecting a suspension of particles made of polylactic acid or other high molecular compound having no pharmacological action into the vitreous cavity, and a transparent tissue visualization agent (eye) used therefor A drug for improving the visibility of the transparent tissue of the eye at the time of surgery has been proposed (Patent Document 1).
  • the suspension of fine particles is extremely supplied in the form of a freeze-dried suspension for reasons such as avoiding stability problems such as precipitation separation due to long-term storage in liquid form.
  • some polymer compounds such as polylactic acid, form agglomerates and form coarse particles when the suspension is lyophilized. Since the polymer compound particles are used in the form of being injected into the eye by a syringe, the particles must be of a particle size that can be passed without clogging the injection needle.
  • the particle diameter is disclosed as an average value, the maximum particle diameter is not mentioned, and there is no clear description regarding the preparation conditions for controlling the particle diameter.
  • Patent Document 2 discloses a method for improving the visibility of ocular tissue by adding a divalent or trivalent metal salt to a polylactic acid dispersion. There is no description regarding prevention of the formation of coarse particles.
  • Patent Document 3 discloses a method for producing an injectable implant by forming 20-120 ⁇ m polylactic acid microparticles and freeze-drying in an aqueous carrier containing glycolic acid. In the preparation of pharmaceuticals, taking into account the possibility of chlorinated organic solvent remaining in the formulation, including the steps of dissolving and precipitating in the chlorinated organic solvent, manufacturing pharmaceutical formulations, especially formulations that are injected into the eye It is not preferable as a method.
  • Patent Documents 4 and 5 discuss technical conditions for freeze-drying emulsions and suspensions, but prevent the formation of coarse particles due to particle aggregation during freeze-drying of polylactic acid suspensions. There is no description about what to do.
  • an object of the present invention is to provide a method for producing polylactic acid particles by freeze-drying from an aqueous suspension of polylactic acid microparticles, which can prevent generation of coarse particles in the freeze-drying process. That is.
  • Another object of the present invention is to provide polylactic acid particles for a transparent tissue visualization agent, which is a preparation for improving the visibility of transparent tissues of the eyes by applying to the transparent tissues of the eyes, particularly vitreous body and lens. It is to provide a manufacturing method.
  • the present inventor has found that polylactic acid dissolved in a water-miscible organic solvent in an aqueous solution containing a dispersant dissolved therein or an aqueous solution containing a dispersant and an excipient dissolved therein.
  • an aqueous suspension of polylactic acid microparticles having an average particle size of 500 to 1000 nm (maximum particle size of 5 ⁇ m or less) as primary particles (referring to individual particles in a non-aggregated state) is obtained.
  • the freeze-drying process it was found that the formation of coarse particles can be suppressed by freezing at a slow cooling rate rather than rapidly freezing.
  • the present invention has been completed based on the findings and further studies. That is, the present invention provides the following.
  • a method for suppressing the formation of coarse particles of polylactic acid during freeze-drying of a polylactic acid microparticle aqueous suspension (a) preparing a polylactic acid microparticle aqueous suspension containing a dispersant and an excipient, (i) A polylactic acid solution prepared by dissolving polylactic acid in a water-miscible organic solvent is added to a dispersant aqueous solution containing a dispersant under stirring, and then an excipient is added, or (ii) Adding a polylactic acid solution prepared by dissolving lactic acid in a water-miscible organic solvent to a dispersing agent / excipient aqueous solution containing the dispersing agent and an excipient under stirring; and (b) subjecting the polylactic acid microparticle aqueous suspension to lyophilization in a glass container; Comprising In step (b), the glass container containing the aqueous polylactic acid fine particle suspension is placed in
  • a method of producing polylactic acid particles for visualizing a transparent tissue of the eye (a) preparing a polylactic acid microparticle aqueous suspension containing a dispersant and an excipient, (i) A polylactic acid solution prepared by dissolving polylactic acid in a water-miscible organic solvent is added to a dispersant aqueous solution containing a dispersant under stirring, and then an excipient is added, or (ii) Adding a polylactic acid solution prepared by dissolving lactic acid in a water-miscible organic solvent to a dispersing agent / excipient aqueous solution containing the dispersing agent and an excipient under stirring; and (b) subjecting the polylactic acid microparticle aqueous suspension to lyophilization in a glass container; Comprising In step (b), the glass container containing the aqueous polylactic acid fine particle suspension is placed in a chamber of a freeze dryer, and the cooling rate in the chamber when the aqueous polylactic acid
  • the production method of 16, wherein the polyhydric alcohol is mannitol. 18. 18. The production method according to any one of 12 to 17 above, wherein the concentration of the polylactic acid in the polylactic acid solution is 1 to 50 W / V%. 19. 19. The production method according to any one of 12 to 18 above, wherein the water-miscible organic solvent is an acetone / ethanol mixed solution. 20. 19. The production method as described in 19 above, wherein the mixing ratio of acetone and ethanol in the acetone / ethanol mixed solution is acetone: ethanol 3: 7 to 5: 5 by volume. 21.
  • the present invention having the above structure suppresses the aggregation of the polylactic acid particles during freeze-drying of the polylactic acid fine particle aqueous suspension, and is a coarse aggregate (particularly, the minor axis of the particles is 0.3 mm or more, especially 0.2 mm or more). Generation) can be prevented.
  • the polylactic acid particles when injecting an aqueous suspension of polylactic acid particles into the eye for visualizing a transparent tissue, the polylactic acid particles have a minor axis of 0.3 mm or more, particularly 0.2 mm or more.
  • the polylactic acid particles produced according to the present invention are not spherical, but individually take various irregular shapes, but such irregularly shaped polylactic acid particles are more vitreous and crystalline than the spherical particles. When it comes into contact with a transparent tissue such as the eye, it adheres well to the tissue and does not easily fall out of the tissue due to the flow of intraocular perfusate during surgery. For this reason, irregular-shaped polylactic acid particles are excellent as a transparent tissue visualization agent.
  • polylactic acid used in the study is DL-polylactic acid, D-polylactic acid, L-polylactic acid, and DL-polylactic acid are not distinguished, and appropriate mixtures thereof are also used in the present invention. can do.
  • transparent tissue of the eye refers to a transparent tissue in the ocular tissue such as the vitreous body, the vitreous membrane, the lens and the cornea.
  • transparent tissue visualization agent refers to a preparation in which polylactic acid particles obtained by freeze-drying are dispersed in a dispersion.
  • polylactic acid fine particles means polylactic acid particles having a particle diameter of 5 ⁇ m or less.
  • polylactic acid microparticle aqueous suspension is a liquid containing polylactic acid microparticles in a suspended state
  • the dispersion medium is an aqueous medium, that is, organic in a mixed state. What is water which contains a solvent in part.
  • the term “dispersant aqueous solution” refers to an aqueous solution obtained by adding a dispersant to water and dissolving
  • the term “dispersant / excipient aqueous solution” refers to a dispersant and an excipient.
  • the suspension is poured into a container and placed in a chamber of a freeze dryer to be cooled and frozen.
  • the present inventors have found that it greatly affects the formation of coarse particles. That is, contrary to what is expected from the conventional technical common sense, surprisingly, if the cooling rate at the time when the aqueous suspension of polylactic acid fine particles starts freezing is high, coarse particles are likely to be formed. When the cooling rate is slow, the generation of coarse particles is suppressed. The reason for this is not clear, but it is assumed that the high uniformity of temperature distribution in the suspension plays an important role when freezing starts.
  • the cooling rate in the chamber in which the container is installed is 0.1 to 1 ° C./min at the moment when the suspension starts to freeze. It is preferably 0.1 to 0.8 ° C./min, more preferably 0.1 to 0.6 ° C./min.
  • the temperature at the instant of starting freezing varies depending on the type and concentration of the additive, but is in the range of ⁇ 10 to ⁇ 20 ° C.
  • the dispersant contained in the dispersant aqueous solution or the dispersant / excipient aqueous solution is prepared by adding a polylactic acid solution dissolved in a water-miscible organic solvent to the aqueous solution containing the dispersant to precipitate polylactic acid fine particles. It is useful for the suppression of particle growth in the process of maintaining the homogenous suspension of polylactic acid before lyophilization and when preparing a transparent tissue visualization agent by mixing the lyophilized composition with a dispersion medium. Is also useful for rapidly suspending polylactic acid particles and maintaining a stable suspended state.
  • a surfactant or a water-soluble polymer having surface activity can be used as the dispersant.
  • a water-soluble polymer that is solid at room temperature and immediately soluble in water is preferably used, and vinyl polymers such as polyvinylpyrrolidone and polyvinyl alcohol are particularly preferably used.
  • the content of the compound in the aqueous dispersant solution or dispersant / excipient aqueous solution is preferably 0.11 to 2.2 W / V%, preferably 0.22 to 1. 1 W / V% is more preferable, and 0.44 to 0.66 W / V% is more preferable.
  • the content of the compound in the aqueous dispersant solution or dispersant / excipient aqueous solution is preferably 0.55 to 2.2 W / V%, and 0 when polyvinyl alcohol is used. .22 to 0.55 W / V% is preferable.
  • the concentration of the excipient in the dispersant / excipient aqueous solution is preferably 1.1 to 11 W / V%, more preferably 3.85 to 11 W / V%, and 4. It is more preferably 5 to 10 W / V%, and particularly preferably 5.5 to 8 W / V%.
  • Preferred examples of the excipient include polyhydric alcohols, and among them, mannitol is particularly preferable.
  • the concentration of polylactic acid dissolved in the water-miscible organic solvent is usually in the range of 1 to 50 W / V%, preferably 2 to 30 W / V%, and 5 to 20 W / V%. Is more preferable.
  • the water-miscible organic solvent is preferably an acetone / ethanol mixture.
  • the volume ratio of acetone and ethanol used to prepare this may be appropriate, but it is usually preferably in the range of 3: 7 to 5: 5. Both of these solvents are safer for body tissues than chlorinated organic solvents, and, unlike chlorinated organic solvents, are miscible with water. It is easy to shift from the water phase to the water phase, it is quickly removed by lyophilization, and does not substantially remain in the final lyophilized composition.
  • the volume ratio of the dispersant aqueous solution or the dispersant / excipient aqueous solution to the polylactic acid solution added thereto is usually preferably 95: 5 to 85:15, particularly preferably about 90:10. is there.
  • a polylactic acid solution is added to the aqueous solution at such a ratio and stirred, an aqueous suspension of polylactic acid fine particles having an average primary particle size of 500 to 1000 nm and a maximum particle size of 5 ⁇ m or less can be easily obtained. .
  • the primary particles may be partially agglomerated during the preparation of the aqueous suspension, but there is no problem if the particles applied to the primary suspension are removed by passing the aqueous suspension through a sieve having a diameter of 106 ⁇ m after the preparation.
  • the content of polylactic acid in the aqueous polylactic acid microparticle suspension subjected to freeze-drying is usually 0.05 to 7.5 W / V%, preferably 0.1 to 5.0 W / V%, more preferably 0.5 to 2.5 W / V%.
  • the polylactic acid content in the polylactic acid microparticle aqueous suspension may be adjusted by adjusting the concentration of polylactic acid contained in a water-miscible organic solvent (acetone / ethanol mixture, etc.) in advance. You may carry out by adjusting the addition ratio of the polylactic acid solution with respect to the aqueous solution at the time of liquid preparation.
  • the polylactic acid particles are aggregated in combination with the presence of excipients when the aqueous polylactic acid microparticle suspension is lyophilized. Can be prevented. This method can be applied even when the polylactic acid content is less than these ranges.
  • the term “average molecular weight” for polylactic acid refers to the weight average molecular weight.
  • the average molecular weight of the polylactic acid used in the present invention is usually 500 or more, preferably 1000 or more, more preferably 3000 or more, particularly preferably 4000 or more, and usually 20000 or less, preferably 15000 or less, more preferably 10,000 or less, more preferably 6000 or less.
  • lyophilized polylactic acid fine particle aqueous suspension contains pharmaceutically acceptable additives such as isotonic agents (salts such as sodium chloride and potassium chloride: glycerin, sorbitol, glucose, mannitol and the like).
  • pharmaceutically acceptable additives such as isotonic agents (salts such as sodium chloride and potassium chloride: glycerin, sorbitol, glucose, mannitol and the like).
  • Sugar Polyhydric alcohols such as glycerin and propylene glycol: boric acid, borax, etc.), buffer (phosphate buffer, acetate buffer, borate buffer, carbonate buffer, citrate buffer, Tris buffer) ), Thickeners (hydroxyethylcellulose, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, polyvinyl alcohol, polyethylene glycol, sodium alginate, etc.), stabilizers (sodium bisulfite, sodium thiosulfate, sodium edetate, que Sodium acid, ascorbic acid, dibutylhydroxytoluene, magnesium chloride, calcium chloride and the like), pH adjusting agents (hydrochloric acid, sodium hydroxide, can be added phosphoric acid, such as acetic acid) and the like as appropriate.
  • buffer phosphate buffer, acetate buffer, borate buffer, carbonate buffer, citrate buffer, Tris buffer
  • Thickeners hydroxyethylcellulose, hydroxypropylcellulose,
  • these additives may be added in advance to the aqueous dispersion or dispersion / excipient aqueous solution before the polylactic acid solution is added, and an aqueous suspension containing polylactic acid microparticles is prepared. It may be added to this later, or a part of it is added in advance to the aqueous dispersion or dispersion / excipient aqueous solution before the polylactic acid solution is added, and the rest is added to the aqueous suspension containing polylactic acid fine particles. You may add to this after preparing.
  • the pH of the aqueous polylactic acid microparticle suspension subjected to freeze-drying is usually adjusted to 4.0 to 8.0, preferably about 5.0 to 7.5.
  • a glass container is usually used as a container for subjecting the polylactic acid fine particle aqueous suspension to freeze-drying, and a glass vial is particularly preferable.
  • the amount of liquid injected into each container may be appropriate, but is usually 0.5 to 5 mL, more preferably 1 to 2 mL.
  • the polylactic acid particles produced according to the present invention have an irregular shape.
  • the lyophilized composition containing polylactic acid fine particles produced according to the present invention is prepared in the form of an aqueous suspension of polylactic acid fine particles by mixing with an aqueous dispersion medium when used.
  • an aqueous dispersion medium for that purpose, an aqueous solution having a composition that can be injected into the eye as a medicine can be appropriately used.
  • Various compositions are well known to those skilled in the art as intraocular perfusion / cleaning solutions, and they may be appropriately selected and used as a dispersion medium.
  • a medicine already sold as an intraocular perfusion / cleaning solution may be used as a dispersion medium.
  • Opegard MA registered trademark, manufactured by Senju Pharmaceutical Co., Ltd.
  • Opegard Neo Kit registered trademark, manufactured by Senju Pharmaceutical Co., Ltd.
  • Liquid A and liquid B were mixed at a volume ratio of 9: 1 as follows.
  • the micropipette tip (Eppendolf ep TIPS standard 2-200 ⁇ L) was stirred with a stirrer (medium speed 700-800 rpm) using a stirrer (diameter 6 mm, length 20 mm) with the A solution in a 200 mL beaker.
  • a tube pump (PERISTALTIC PUMP PST-100 IWAKI) with a silicone tube (outer diameter 6mm, inner diameter 4mm) attached to the discharge side, liquid B is fed into liquid A at a rate of about 1mL / min.
  • fine particles of PLA0005 were deposited.
  • Suspension D is filled in 1.5 mL glass vials (18 ⁇ , height 33 mm), the filled vials are equally divided into groups 1 to 4, and suspension D is lyophilized under the following conditions: To obtain a freeze-dried composition.
  • Test equipment Triomaster-A04 type (Nissei Co., Ltd.)
  • B Tray: Pull-out tray Frame 290W x 445L, 1 sheet used
  • Vial 18 ⁇ x 33H (glass)
  • D Dispensing amount: 1.5 mL / vial
  • e Vial installation: Suspension D or dummy liquid (1.5 mL of 2.5% D-mannitol aqueous solution) so that one tray in the chamber of the apparatus is filled Of vials.
  • Pre-freezing In order to investigate the effect of the cooling rate in the chamber during freezing on the aggregation of particles, the following method, which differs depending on the group, was performed.
  • Group 1 (Slow-Cooling Freezing 1): The above vials are arranged in a normal temperature tray in the chamber, and the suspension D is frozen by gradually cooling the tray temperature from + 20 ° C. to ⁇ 40 ° C. over 2 hours.
  • Second group (slow cooling freezing 2): The above vials are arranged in a room temperature tray in the chamber, and the tray temperature is gradually cooled from + 20 ° C. to ⁇ 45 ° C. over 40 minutes to freeze the suspension D.
  • Group 3 The tray was cooled to ⁇ 45 ° C. in advance, and the vial was placed on the ⁇ 45 ° C. tray to freeze the drug solution.
  • Group 4 liquid nitrogen freezing: The vials were immersed in liquid nitrogen to rapidly freeze the chemicals, and then placed on a ⁇ 45 ° C. tray.
  • G Primary drying and secondary drying: For each group, primary drying and secondary drying were performed according to the following freeze-drying program. Primary drying: Tray temperature was increased from ⁇ 45 ° C. or ⁇ 40 ° C. to ⁇ 10 ° C. over 1 hour, and then held at ⁇ 10 ° C. for 19 hours. The vacuum control value at this time was set to 0.1 Torr. Secondary drying: Tray temperature was raised from ⁇ 10 ° C. to + 20 ° C. in 1 hour, and then held at + 20 ° C. for 12 hours. The degree of vacuum at this time was assumed to be a success.
  • H Vials of the vial: After the secondary drying, the vial was sealed with a rubber stopper.
  • the solutions A-5 to A-9 and the solution B were mixed at a ratio of 9: 1 as follows. While stirring each solution of A-5 to A-9 in a 200 mL beaker with a stirrer (diameter 6 mm, length 20 mm) with a stirrer (medium speed 700 to 800 rpm), a micropipette tip (Eppendolf ep TIPS Using a tube pump (PERISTALTIC PUMP PST-100 IWAKI) equipped with a silicon tube (outer diameter 6 mm, inner diameter 4 mm) with a standard 2 to 200 ⁇ L attached to the discharge side, the B solution was A-5 at a rate of about 1 mL / min.
  • a tube pump PERISTALTIC PUMP PST-100 IWAKI
  • the suspensions D-5 to D-9 obtained above were passed through a sieve (caliber 106 ⁇ m) to remove agglomerates.
  • the suspensions D-5 to D-9 after sieving are filled in 1.5 mL glass vials (18 ⁇ , height 33 mm) and freeze-dried under the following conditions. -5 to E-9 were obtained.
  • Suspensions were prepared by dispersing lyophilized compositions E-5 to E-9 in dispersion medium C having the composition shown in Table 4 so that the polylactic acid content was 1 W / V%.
  • Evaluation method The total amount of the suspension prepared above was transferred to a 12-well plate (12.5 cm ⁇ 8 cm, inner diameter 22 mm, IWAKI), and the particle size was measured with a digital microscope (model number: VHX-500, Keyence). Was observed. At that time, the magnification was set so that an almost whole image of one hole could be captured. Photographs were taken, and the number of aggregates having a minor axis of 0.3 and 0.2 mm or more was measured. The results are shown in Table 5 below.
  • a freeze-dried composition containing polylactic acid microparticles is produced by the following procedure.
  • Polyvinylpyrrolidone (Povidone K-30) and D-mannitol were added to purified water so as to have concentrations of 1.1 W / V% and 1.1 W / V%, respectively, and the solution was dissolved in a 0.22 ⁇ m aqueous filter. Filter to make liquid A.
  • polylactic acid for example, PLA0005, DL-polylactic acid, weight average molecular weight 5000, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • solution B is filtered through a 0.22 ⁇ m non-aqueous filter to obtain solution B.
  • Solution A and solution B are mixed at a volume ratio of 9: 1 as follows: 200 mL
  • the micropipette tip (Eppendolf ep TIPS standard 2-200 ⁇ L) was discharged on the discharge side while stirring the solution A in the beaker of No. 1 with a stirrer (medium speed 700-800 rpm) using a stirrer (diameter 6 mm, length 20 mm).
  • liquid B is fed into liquid A at a rate of about 1 mL / min.
  • the micro-pipette tip which is the discharge port, is completely immersed in the liquid, and this liquid is stirred for about 30 minutes to obtain a suspension.
  • the resulting suspension D (in 100 mL) contains polylactic acid, polyvinylpyrrolidone and D-mannitol (in 100 mL) as follows.
  • the suspension D is dispensed into a glass vial and freeze-dried under the following conditions.
  • Test equipment Triomaster-A04 type (Nissei Co., Ltd.)
  • B Tray: Pull-out tray Frame 290W x 445L, 1 sheet used
  • Vial 18 ⁇ x 33H (glass)
  • D Dispensing amount: 1.5 mL / vial
  • e Vial installation: The vial is laid so that one tray in the chamber of the apparatus is filled.
  • Pre-freezing In order to confirm the effect of freezing rate on particle aggregation, pre-freezing is performed by the following method.
  • Production Example 1 Vials were charged into a normal temperature shelf, the shelf was cooled, and the chemical solution was frozen.
  • a freeze-dried composition containing polylactic acid microparticles is produced by the following procedure.
  • Polyvinylpyrrolidone (Povidone K-30) is added to purified water to 1.1 times the final concentration of PVP content in Table 6 and dissolved, and the solution is filtered through a 0.22 ⁇ m aqueous filter to make solution A.
  • acetone: ethanol (volume ratio) an acetone-ethanol mixed solution was prepared, and polylactic acid [Table 6 (PLA molecular weight), DL-polylactic acid, weight average molecular weight 5000-20000, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • solution B Is dissolved in an acetone / ethanol mixed solution so that the final concentration is as shown in Table 6 (polylactic acid content), and the resulting solution is filtered with a 0.22 ⁇ m non-aqueous filter to obtain solution B.
  • a liquid and B liquid are mixed by volume ratio as follows according to Table 6 (aqueous solution: PLA solution).
  • a freeze-dried composition containing polylactic acid microparticles is produced by the following procedure.
  • Polyvinylpyrrolidone (Povidone K-30) and D-mannitol were added to purified water and dissolved so as to be 1.1 times the final concentration of Table 6 (PVP content, mannitol content), and the solution was 0.22 ⁇ m. Filter with an aqueous filter to make Liquid A.
  • Solution A and Liquid B was mixed by volume ratio as follows according to Table 6 (aqueous solution: PLA solution):
  • aqueous solution PLA solution
  • liquid A in a 200 mL beaker was mixed with a stirrer (diameter 6 mm, length 20 mm) with a stirrer (medium speed Attach a silicon tube (outer diameter 6 mm, inner diameter 4 mm) with a micropipette tip (Eppendolf ep TIPS standard 2-200 ⁇ L) attached to the discharge side while stirring at 700-800 rpm)
  • a tube pump PERISTALTIC PUMP PST-100 manufactured by IWAKI
  • liquid B is fed into liquid A at a rate of about 1 mL / min to precipitate polylactic acid microparticles.
  • the tip of the pipette tip is completely immersed in the liquid, and this liquid is stirred for about 30 minutes to obtain a suspension, which is passed through a sieve (caliber 106 ⁇ m), agglomerates are removed, and the suspension D is removed. obtain.
  • Suspension D obtained in Formulation Examples 5 to 9 is dispensed into glass vials and lyophilized under the following conditions.
  • Test equipment Triomaster-A04 type (Nissei Co., Ltd.)
  • B Tray: Pull-out tray Frame 290W x 445L, 1 sheet used
  • Vial 18 ⁇ x 33H (glass)
  • D Dispensing amount: 1.5 mL / vial
  • e Vial installation: The vial is laid so that one tray in the chamber of the apparatus is filled.
  • Pre-freezing In order to confirm the influence of freezing rate on particle aggregation, pre-freezing is performed by the following method.
  • Primary drying and secondary drying are performed with the following freeze-drying program. Primary drying is ramped from ⁇ 45 ° C. or ⁇ 40 ° C. to ⁇ 10 ° C. over 1 hour and then set at ⁇ 10 ° C. for 19 hours. The vacuum control value at this time is 0.1 Torr. Secondary drying is ramped from ⁇ 10 ° C. to + 20 ° C. in 1 hour and then set at + 20 ° C. for 12 hours. The degree of vacuum at this time is assumed to be good. After secondary drying, seal with a rubber stopper.
  • a freeze-dried composition containing polylactic acid microparticles is produced by the following procedure. Polyvinyl alcohol and D-mannitol are added to purified water to a concentration of 0.22% and 5.5% and dissolved, and the solution is filtered through a 0.22 ⁇ m aqueous filter to give solution A.
  • polylactic acid for example, PLA0005, DL-polylactic acid, weight average molecular weight 5000, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • the resulting solution is filtered through a 0.22 ⁇ m non-aqueous filter to give solution B.
  • Solution A and solution B are mixed at a volume ratio of 90:10 as follows: 200 mL
  • the micropipette tip (Eppendolf ep TIPS standard 2-200 ⁇ L) was discharged on the discharge side while stirring the solution A in the beaker of No. 1 with a stirrer (medium speed 700-800 rpm) using a stirrer (diameter 6 mm, length 20 mm).
  • a tube pump PERISTALTIC PUMP PST-100 IWAKI
  • silicon tube outer diameter 6 mm, inner diameter 4 mm
  • the micropipette tip which is the discharge port, is completely immersed in the liquid, and the liquid is stirred for about 30 minutes to obtain a suspension. This is passed through a sieve (diameter 106 ⁇ m) to remove agglomerates and obtain a suspension D.
  • Suspension D is dispensed into glass vials and lyophilized under the following conditions.
  • Test equipment Triomaster-A04 type (Nissei Co., Ltd.)
  • B Tray: Pull-out tray Frame 290W x 445L, 1 sheet used
  • Vial 18 ⁇ x 33H (glass)
  • D Dispensing amount: 1.5 mL / vial
  • e Vial installation: The vial is laid so that one tray in the chamber of the apparatus is filled.
  • Pre-freezing In order to confirm the influence of freezing rate on particle aggregation, pre-freezing is performed by the following method.
  • the suspension D is subjected to primary drying and secondary drying by the following freeze-drying program.
  • Primary drying is ramped from ⁇ 45 ° C. or ⁇ 40 ° C. to ⁇ 10 ° C. over 1 hour and then set at ⁇ 10 ° C. for 19 hours.
  • the vacuum control value at this time is 0.1 Torr.
  • Secondary drying is ramped from ⁇ 10 ° C. to + 20 ° C. in 1 hour and then set at + 20 ° C. for 12 hours. The degree of vacuum at this time is assumed to be good. After secondary drying, seal with a rubber stopper.
  • the solutions A-10 to A-13 and the solution B were mixed at a ratio of 9: 1 as follows. While stirring each solution of A-10 to A-13 in a 200 mL beaker with a stirrer (medium speed 700 to 800 rpm) using a stirrer (diameter 6 mm, length 20 mm), a micropipette tip (Eppendolf ep TIPS Using a tube pump (PERISTALTIC PUMP PST-100 IWAKI) with a silicon tube (outer diameter 6 mm, inner diameter 4 mm) with a standard 2-200 ⁇ L) attached to the discharge side, the B solution was A- at a rate of about 1 mL / min.
  • the suspensions D-10 to D-13 obtained above were passed through a sieve (caliber 106 ⁇ m) to remove aggregates.
  • the suspensions D-10 to D-13 after sieving were filled in 1.5 mL glass vials (18 ⁇ , height 33 mm) and freeze-dried under the following conditions. To E-13.
  • Suspensions were prepared by dispersing lyophilized compositions E-10 to E-13 in purified water so that the content of polylactic acid was 1 W / V%.
  • Evaluation method The particle size distribution of the suspension prepared above was measured using a laser diffraction particle size distribution analyzer (SALD-2100, Shimadzu Corporation).
  • the 10th, 11th and 13th groups had a maximum particle size of 0.287 mm, the 12th group had a maximum particle size of 0.233 mm, and all of the 10th to 13th groups were 0.3 mm or more. The coarse particles of were not detected.
  • the production method of the present invention provides a redispersible lyophilized composition containing polylactic acid fine particles that can suppress aggregation of polylactic acid fine particles during lyophilization and does not contain coarse particles that clog the injection needle. It can be used to produce a transparent tissue visualization agent suitable for use in ophthalmic surgery such as removal surgery.

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Abstract

【課題】ポリ乳酸微粒子水性懸濁液の凍結乾燥工程で粗大粒子が生成するのを防止する方法，及び眼の透明組織可視化剤用ポリ乳酸粒子の製造方法の提供。 【解決手段】ポリ乳酸微粒子水性懸濁液の凍結乾燥時における粗大粒子生成を抑制する方法であって，(a)分散剤と賦形剤を含有するポリ乳酸微粒子水性懸濁液を調製するステップであって，(i)ポリ乳酸を水混和性有機溶媒に溶解させてなる溶液を，分散剤水溶液に撹拌下で添加した後，賦形剤を添加するか，又は(ii)ポリ乳酸を該溶媒に溶解させてなる溶液を，分散剤及び賦形剤を含有する水溶液に撹拌下で添加することによるものであるステップと，(b)該懸濁液をガラス容器中で凍結乾燥に付すステップと，を含み，ステップ(b)において，ガラス容器が凍結乾燥機のチャンバー内に置かれ，該懸濁液が凍結する時のチャンバー内の冷却速度が０．１～１℃／分に調節されるものである，方法。

Description

ポリ乳酸微粒子含有凍結乾燥組成物の製造方法
　本発明は，ポリ乳酸微粒子水性懸濁液を凍結乾燥して得られるポリ乳酸粒子の凝集塊の発生を抑制する方法に関する。
　眼には硝子体，水晶体および角膜などの透明組織が集まっている。白内障手術では水晶体嚢内の核および皮質の除去を行うが，後嚢近くに残った水晶体の皮質が混濁し，後発白内障を引き起こすことが知られている。
　また硝子体除去手術では，網膜に癒着した増殖組織と増殖の足場となる硝子体を可能な限り完全に除去することが求められる。しかしながら，硝子体は透明な組織であり，硝子体の完全な除去は容易ではない。この解決策として，硝子体除去手術中にトリアムシノロン製剤（ケナコルト－Ａ：登録商標）などのステロイド懸濁液を硝子体腔に注射器を用いて注入することによって透明な硝子体を可視化することが行われている（非特許文献１参照）。この方法を採用することで，手術手技を容易にし，確実に硝子体の除去を行うことができる。しかしながら，治療を目的としたトリアムシノロン製剤の硝子体への使用においては，副作用として眼圧上昇と白内障の進行が報告されている（非特許文献２および３参照）。そこで，ポリ乳酸その他の薬理作用を示さない高分子化合物からなる粒子の懸濁液を硝子体腔に注入することにより，硝子体の視認性を向上させる方法及びそのために使用する透明組織可視化剤（眼の透明組織に注入又は散布することによって，手術時における眼の透明組織の視認性を向上させるための薬剤）が提案されている（特許文献１）。
　上記の方法において，微粒子の懸濁液は，液状での長期保存による沈殿分離等の安定性の問題を回避する等の理由から，懸濁液の凍結乾燥物の形で供給されることが極めて好ましい。しなしながら，ポリ乳酸等，高分子化合物によっては懸濁液の凍結乾燥時に凝集塊を形成して粗大粒子を生ずるものがある。高分子化合物の粒子は，注射器により眼内に注入される形で使用されるから，粒子は，注射針を詰らせることなしに通過できる粒子径のものでなければならない。上記特許文献１には，平均値として粒子径が開示されているものの，最大粒子径には言及されておらず，また粒子径をコントロールするための調製条件に関する明確な記載はない。また，ポリ乳酸の分散液に２価あるいは３価の金属塩を添加することで眼組織の視認性を向上させる方法が特許文献２に開示されているが，同文献には，凍結乾燥時の粗大粒子の生成の防止に関しては記載がない。更に，２０～１２０μｍのポリ乳酸微粒子を形成してグリコール酸含有の水性担体中で凍結乾燥することによる注射可能インプラントの製造方法が特許文献３に開示されているが，同方法は，ポリ乳酸微粒子の生成に際し塩素系有機溶媒への溶解及び析出の工程を含んでおり，製剤中の塩素系有機溶媒の残留の可能性を考慮すると，医薬用途の製剤，特に眼内に注入される製剤の製造方法としては好ましくない。その他，特許文献４，５に乳液および懸濁液を凍結乾燥させるための技術的な条件検討が行われているが，ポリ乳酸の懸濁液の凍結乾燥に際した粒子凝集による粗大粒子形成を防止することに関しては，記載がない。
　懸濁液を凍結乾燥するときは，分散した懸濁粒子が沈降するより前，すなわち懸濁粒子が均一に分散した状態にあるうちに速やかに凍結させてしまえば，粒子同士が凝集する時間は殆どなくなる筈である。このことから，ポリ乳酸微粒子懸濁液を凍結乾燥するに際して粒子の凝集を防止して微小粒子の状態を維持するには，均一な懸濁液の状態から急速に冷却して凍結するのが望ましいと考えられる（特許文献６）。
国際公開第２００５／１１５４１１号 国際公開第２００８／１２６７２０号 国際公開第２００３／００７７８２号 国際公開第２００１／０５１０３２号 国際公開第２００４／１１２７５４号 国際公開第２００３／０２６６４２号
Sakamoto,T. et al., Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology, 240: p.423(2002). Challa,J.K. et al., Australian and New Zealand Journal of Ophthalmology, 26: p.277(1998). Wingate,R.J. et al., Australian and New Zealand Journal of Ophthalmology, 27: p.431(1999).
　上記背景において，本発明の一目的は，ポリ乳酸微粒子水性懸濁液から凍結乾燥によりポリ乳酸粒子を製造する方法であって，凍結乾燥工程で粗大粒子が生成するのを防止できる方法を提供することである。 
　また本発明の更なる一目的は，眼の透明組織，特に硝子体および水晶体に適用することによってそれら眼の透明組織の視認性を向上させるための製剤である透明組織可視化剤用ポリ乳酸粒子の製造方法を提供することである。
　本発明者は，上記目的のため検討の結果，分散剤を溶解して含有する水溶液又は分散剤と賦形剤とを溶解して含有する水溶液に，水混和性有機溶媒に溶解させたポリ乳酸を添加，撹拌することにより一次粒子（凝集していない状態での個々の粒子をいう）としての平均粒子径５００～１０００ｎｍ（最大粒子径５μｍ以下）であるポリ乳酸微粒子の水性懸濁液が得られ，その凍結乾燥工程において凍結乾燥工程において，急速に凍結するのではなく緩徐な冷却速度で凍結する方が，粗大粒子の生成が抑制できることを見出した。本発明は，当該発見に基づき，更に検討を重ねて完成させたものである。すなわち，本発明は以下を提供する。
　すなわち，本発明は以下を提供する。
　１．ポリ乳酸微粒子水性懸濁液の凍結乾燥時におけるポリ乳酸の粗大粒子の生成を抑制する方法であって，
　(a) 分散剤と賦形剤とを含有するポリ乳酸微粒子水性懸濁液を調製するステップであって，
　　(i) ポリ乳酸を水混和性有機溶媒に溶解させてなるポリ乳酸溶液を，分散剤を含有する分散剤水溶液に撹拌下で添加した後，賦形剤を添加するか，又は
　　(ii) ポリ乳酸を水混和性有機溶媒に溶解させてなるポリ乳酸溶液を，分散剤及び賦形剤を含有する分散剤／賦形剤水溶液に撹拌下で添加することによるものであるステップと，
　(b) 該ポリ乳酸微粒子水性懸濁液をガラス容器中で凍結乾燥に付すステップと，
を含んでなり，
　ステップ(b)において，該ポリ乳酸微粒子水性懸濁液を入れた該ガラス容器が凍結乾燥機のチャンバー内に置かれ，該ポリ乳酸微粒子水性懸濁液が凍結する時の該チャンバー内の冷却速度が０．１～１℃／分に調節されるものである，方法。
　２．該分散剤水溶液又は該分散剤／賦形剤水溶液中の該分散剤の濃度が０．１１～２．２Ｗ／Ｖ％である，上記１の方法。
　３．該分散剤がポリビニルピロリドン又はポリビニルアルコールである，上記１又は２の方法。
　４．該分散剤／賦形剤水溶液中の該賦形剤の濃度が１．１～１１Ｗ／Ｖ％である，上記１ないし３の何れかの方法。
　５．該賦形剤が多価アルコールである，上記１ないし４の何れかの方法。
　６．該多価アルコールがマンニトールである，上記５の方法。
　７．該ポリ乳酸溶液中の該ポリ乳酸の濃度が１～５０Ｗ／Ｖ％である，上記１ないし６の何れかの方法。
　８．該水混和性有機溶媒がアセトン・エタノール混液である，上記１ないし７の何れかの方法。
　９．該アセトン・エタノール混液におけるアセトンとエタノールの混合比が，体積で，アセトン：エタノール＝３：７～５：５である，上記８の方法。
　１０．該分散剤水溶液又は該分散剤／賦形剤水溶液と該ポリ乳酸溶液の混合比が，体積で，該水溶液：ポリ乳酸溶液＝８５：１５～９５：５である，上記１ないし９の何れかの方法。
　１１．該ガラス容器がガラスバイアルである，上記１ないし１０の何れかの方法。
　１２．眼の透明組織可視化剤用ポリ乳酸粒子の製造方法であって，
　(a) 分散剤と賦形剤とを含有するポリ乳酸微粒子水性懸濁液を調製するステップであって，
　　(i) ポリ乳酸を水混和性有機溶媒に溶解させてなるポリ乳酸溶液を，分散剤を含有する分散剤水溶液に撹拌下で添加した後，賦形剤を添加するか，又は
　　(ii) ポリ乳酸を水混和性有機溶媒に溶解させてなるポリ乳酸溶液を，分散剤及び賦形剤を含有する分散剤／賦形剤水溶液に撹拌下で添加することによるものであるステップと，
　(b) 該ポリ乳酸微粒子水性懸濁液をガラス容器中で凍結乾燥に付すステップと，
を含んでなり，
　ステップ(b)において，該ポリ乳酸微粒子水性懸濁液を入れた該ガラス容器が凍結乾燥機のチャンバー内に置かれ，該ポリ乳酸微粒子水性懸濁液が凍結する時の該チャンバー内の冷却速度が０．１～１℃／分に調節されるものである，製造方法。
　１３．該分散剤水溶液又は該分散剤／賦形剤水溶液中の該分散剤の濃度が０．１１～２．２Ｗ／Ｖ％である，上記１２の製造方法。
　１４．該分散剤がポリビニルピロリドン又はポリビニルアルコールである，上記１２又は１３の製造方法。
　１５．該分散剤／賦形剤水溶液中の該賦形剤の濃度が１．１～１１Ｗ／Ｖ％である，上記１２ないし１４の何れかの製造方法。
　１６．該賦形剤が多価アルコールである，上記１２ないし１５の何れかの製造方法。
　１７．該多価アルコールがマンニトールである，上記１６の製造方法。
　１８．該ポリ乳酸溶液中の該ポリ乳酸の濃度が１～５０Ｗ／Ｖ％である，上記１２ないし１７の何れかの製造方法。
　１９．該水混和性有機溶媒がアセトン・エタノール混液である，上記１２ないし１８の何れかの製造方法。
　２０．該アセトン・エタノール混液におけるアセトンとエタノールの混合比が，体積で，アセトン：エタノール＝３：７～５：５である，上記１９の製造方法。
　２１．該分散剤水溶液又は該分散剤／賦形剤水溶液と該ポリ乳酸溶液の混合比が，体積で，該水溶液：ポリ乳酸溶液＝８５：１５～９５：５である，上記１２ないし２０の何れかの製造方法。
　２２．該ガラス容器がガラスバイアルである，上記１２ないし２１の何れかの製造方法。
　上記構成になる本発明は，ポリ乳酸微粒子水性懸濁液の凍結乾燥時におけるポリ乳酸粒子の凝集を抑制し粗大な凝集塊（特に，粒子の短径が０．３ｍｍ以上，取り分け０．２ｍｍ以上のもの）の発生を防止できる。このため本発明によれば，透明組織を可視化するための眼内へのポリ乳酸粒子水性懸濁液の注入に際し，ポリ乳酸粒子の短径が０．３ｍｍ以上，取り分け０．２ｍｍ以上の粗大な凝集塊を実質的になくすることで，眼科手術において一般に使用される注射針に粒子が詰まることがなくなり，懸濁粒子を眼内に円滑に注入することを可能にする。
　本発明により製造されるポリ乳酸粒子は，球状でなく，個々に種々の不規則な形状をとっているが，そのような不規則形状のポリ乳酸粒子は，球状粒子に比べて硝子体及び水晶体等の眼の透明組織と接触したとき，組織によく付着し，手術中の眼内灌流液の流れによっても組織から脱落しにくい。このため，不規則形状のポリ乳酸粒子は，透明組織可視化剤として優れている。
　検討に用いたポリ乳酸はＤＬ－ポリ乳酸であることから，Ｄ－ポリ乳酸，Ｌ－ポリ乳酸，ＤＬ－ポリ乳酸を区別することなく，またそれらの適宜の混合物も，本発明において同様に使用することができる。
　本明細書中で，「眼の透明組織」の語は，硝子体，硝子体膜，水晶体及び角膜等の眼組織中の透明な組織をいう。
　本明細書中で，「透明組織可視化剤」の語は，凍結乾燥して得られるポリ乳酸粒子を分散液に分散させた製剤をいう。
　本明細書において，「ポリ乳酸微粒子」の語は，ポリ乳酸の粒子であって粒子径が５μｍ以下のものを意味する。
　本明細書において，「ポリ乳酸微粒子水性懸濁液」の語は，ポリ乳酸微粒子を懸濁状態で含有する液体であって，その分散媒が水性媒質，すなわち，水，又は混和した状態で有機溶媒を一部に含有する水であるものをいう。
　本明細書中で，「分散剤水溶液」の語は，分散剤を水に添加し溶解させることにより得られる水溶液をいい，「分散剤／賦形剤水溶液」の語は，分散剤及び賦形剤を水に添加し溶解させることにより得られる水溶液をいう。
　ポリ乳酸微粒子水性懸濁液の凍結乾燥にあたり，本発明においては当該懸濁液を容器に注入してこれを凍結乾燥機のチャンバー内に設置して冷却し凍結させるが，このときチャンバーの冷却速度が，粗大粒子の生成に大きく影響することを本発明者は見出した。すなわち，従来の技術的常識から予想されたところとは逆に，驚くべきことにポリ乳酸微粒子水性懸濁液が凍結を開始する時での冷却速度が速いと粗大粒子が生成し易く，同時点での冷却速度が遅いと粗大粒子の生成が抑制される。この理由は明らかでないが，凍結が開始する時点において懸濁液内の温度分布の均一性が高いことが重要な役割を果たしているものと推測される。懸濁液内の温度分布の均一性は，冷却速度と密接に関係し，冷却速度が遅い程，温度分布の均一性は保たれ易い。これらのことから，ポリ乳酸微粒子水性懸濁液の凍結乾燥にあたっては，当該懸濁液が凍結を開始する瞬間において，該容器の設置されたチャンバー内の冷却速度が０．１～１℃／分であることが好ましく，０．１～０．８℃／分であることがより好ましく，０．１～０．６℃／分であることが更に好ましい。なお，凍結を開始する瞬間の温度は添加物の種および濃度により変動するが，－１０～－２０℃の範囲である。
　上記分散剤水溶液又は上記分散剤／賦形剤水溶液に含有される分散剤は，水混和性有機溶媒に溶解させたポリ乳酸溶液を，分散剤を含有する水溶液に添加してポリ乳酸微粒子を析出させる工程において粒子成長の抑制に有用であり，また，凍結乾燥前におけるポリ乳酸微粒子の均一な懸濁状態の維持及び凍結乾燥組成物を分散媒と混合して透明組織可視化剤を調製する際にも，ポリ乳酸粒子を迅速に懸濁させ且つ安定な懸濁状態を維持する上で有用である。分散剤としては，界面活性剤や界面活性を有する水溶性高分子を用いることができる。常温で固体であり，水に対して即溶性の水溶性高分子が好適に用いられ，ポリビニルピロリドン，ポリビニルアルコール等のビニル系ポリマーが特に好適に用いられる。ポリビニルピロリドン又はポリビニルアルコールを用いる場合，分散剤水溶液又は分散剤／賦形剤水溶液中における当該化合物の含有量は０．１１～２．２Ｗ／Ｖ％とするのが好ましく，０．２２～１．１Ｗ／Ｖ％とするのがより好ましく，０．４４～０．６６Ｗ／Ｖ％とするのがより好ましい。また、ポリビニルピロリドンを用いる場合は分散剤水溶液又は分散剤／賦形剤水溶液中における当該化合物の含有量は０．５５～２．２Ｗ／Ｖ％とするのが好ましく，ポリビニルアルコールを用いる場合は０．２２～０．５５Ｗ／Ｖ％とするのが好ましい。
　上記該分散剤／賦形剤水溶液中の該賦形剤の濃度は，１．１～１１Ｗ／Ｖ％であることが好ましく，３．８５～１１Ｗ／Ｖ％とすることがより好ましく，４．５～１０Ｗ／Ｖ％とすることが更に好ましく，５．５～８Ｗ／Ｖ％とすることが特に好ましい。賦形剤として好ましいものとして多価アルコールが挙げられ，それらのうち特にマンニトールが好ましい。
　本発明において水混和性有機溶媒に溶解させるポリ乳酸の濃度は，通常１～５０Ｗ／Ｖ％の範囲であり，２～３０Ｗ／Ｖ％とするのが好ましく，５～２０Ｗ／Ｖ％とするのが更に好ましい。
　上記水混和性有機溶媒しては，アセトン・エタノール混液が好ましい。これを調製するのに用いるアセトンとエタノールとの体積比は，適宜でよいが，通常は３：７～５：５の範囲とするのが好ましい。これらの溶媒は共に，塩素系有機溶媒に比して身体組織に対する安全性が高く，しかも塩素系有機溶媒と異なり水混和性であるため，ポリ乳酸微粒子水性懸濁液を調製したときポリ乳酸微粒子から水相へと移行し易く，凍結乾燥により速やかに除去され，最終的に得られる凍結乾燥組成物中には，実質的に残存しない。
　上記において分散剤水溶液，又は分散剤／賦形剤水溶液とこれに添加するポリ乳酸溶液との体積比率は，通常９５：５～８５：１５とすることが好ましく，特に好ましくは約９０：１０である。このような比率で当該水溶液にポリ乳酸溶液を添加し撹拌したとき，一次粒子としての平均粒子径が５００～１０００ｎｍで最大粒子径５μｍ以下であるポリ乳酸微粒子の水性懸濁液が容易に得られる。一次粒子は，水性懸濁液の調製中に一部凝集する場合があり得るが，調製後に例えば口径１０６μｍの篩に水性懸濁液を通してこれに掛かる粒子を除去しておけば，問題はない。
　本発明において凍結乾燥に付すポリ乳酸微粒子水性懸濁液中のポリ乳酸の含量は，通常０．０５～７．５Ｗ／Ｖ％，好ましくは０．１～５．０Ｗ／Ｖ％，より好ましくは，０．５～２．５Ｗ／Ｖ％とすればよい。ポリ乳酸微粒子水性懸濁液中のポリ乳酸含量の調整は，水混和性有機溶媒（アセトン・エタノール混液等）に含有させるポリ乳酸の濃度を予め調節しておくことによって行ってもよく，懸濁液調製時における水溶液に対するポリ乳酸溶液の添加割合を調整することによって行ってもよい。ポリ乳酸微粒子水性懸濁液中のポリ乳酸の含量がこれらの含量範囲にある場合，ポリ乳酸微粒子水性懸濁液の凍結乾燥時に，賦形剤の存在と相俟って，ポリ乳酸粒子の凝集が防止できる。なお，本法はこれらの範囲よりポリ乳酸含量を少なくした場合でも適用し得る。 
　本明細書において，ポリ乳酸について「平均分子量」というときは，重量平均分子量をいう。本発明において使用されるポリ乳酸の平均分子量は，通常５００以上，好ましくは１０００以上であり，より好ましくは３０００以上，特に好ましくは４０００以上であり，通常２００００以下，好ましくは１５０００以下，より好ましくは１００００以下，更に好ましくは６０００以下である。
　本発明において，凍結乾燥されるポリ乳酸微粒子水性懸濁液には，医薬上許容される添加物，例えば等張化剤（塩化ナトリウム，塩化カリウムなどの塩：グリセリン，ソルビトール，グルコース，マンニトールなどの糖類：グリセリン，プロピレングリコールなどの多価アルコール類：ホウ酸，ホウ砂など），緩衝剤（リン酸緩衝液，酢酸緩衝液，ホウ酸緩衝液，炭酸緩衝液，クエン酸緩衝液，トリス緩衝液など），増粘剤（ヒドロキシエチルセルロース，ヒドロキシプロピルセルロース，ヒドロキシプロピルメチルセルロース，カルボキシメチルセルロースナトリウム，ポリビニルアルコール，ポリエチレングリコール，アルギン酸ナトリウムなど），安定化剤（亜硫酸水素ナトリウム，チオ硫酸ナトリウム，エデト酸ナトリウム，クエン酸ナトリウム，アスコルビン酸，ジブチルヒドロキシトルエン，塩化マグネシウム，塩化カルシウムなど），ｐＨ調整剤（塩酸，水酸化ナトリウム，リン酸，酢酸など）などを適宜添加することができる。その場合，それらの添加物は，ポリ乳酸溶液が添加される前の分散剤水溶液又は分散剤／賦形剤水溶液に予め添加しておいてもよく，ポリ乳酸微粒子含有水性懸濁液を調製した後でこれに添加してもよく，また一部をポリ乳酸溶液が添加される前の分散剤水溶液又は分散剤／賦形剤水溶液に予め添加し，残りをポリ乳酸微粒子含有水性懸濁液を調製した後でこれに添加してもよい。
　本発明において，凍結乾燥に付されるポリ乳酸微粒子水性懸濁液のｐＨは，通常４．０～８．０，好ましくは約５．０～７．５に調整される。
　本発明において，ポリ乳酸微粒子水性懸濁液を凍結乾燥に付す際の容器は，通常はガラス容器が用いられ，中でもガラスバイアルが好ましい。
　本発明において，ポリ乳酸微粒子水性懸濁液をガラス容器中で凍結乾燥に付すに際し，各容器に注入される液量は適宜でよいが，通常は，０．５～５ｍＬ，より好ましくは１～２ｍＬである。
　本発明により製造されるポリ乳酸粒子は不規則形状である。
　なお，本発明により製造されるポリ乳酸微粒子含有の凍結乾燥組成物は，使用に際し水性の分散媒と混合されてポリ乳酸微粒子の水性懸濁液の形に調製される。そのための水性の分散媒としては，医薬として眼内に注入することが許容される組成の水溶液を，適宜用いることができる。眼内灌流・洗浄液としては種々の組成物が当業者によく知られており，それらを適宜選択して分散媒として用いてよい。また，眼内灌流・洗浄液として既に販売されている医薬品を分散媒として使用してもよく，そのような医薬品として特に適しているものの例としては，オペガードＭＡ（登録商標，千寿製薬株式会社製）及びオペガードネオキット（登録商標，千寿製薬株式会社製）が挙げられる。
　以下実施例を参照して本発明を更に具体的に説明するが，本発明が実施例に限定されることは意図しない。
〔試験例１〕
　精製水にポリビニルピロリドン（ポビドンＫ－３０，ＢＡＳＦジャパン製，日本薬局方）及びＤ－マンニトールを，それぞれ０．５５Ｗ／Ｖ％及び１．１Ｗ／Ｖ％の濃度となるように添加して溶解させ，溶液を０．２２μｍ水性フィルターでろ過しＡ液とした。
　ＰＬＡ０００５〔ＤＬ－ポリ乳酸，重量平均分子量５０００，和光純薬（株）製〕をアセトン・エタノール混液（体積比でアセトン：エタノール＝４：６）に１０Ｗ／Ｖ％の濃度となるように溶解させ，得られた溶液を０．２２μｍ非水性フィルターでろ過してＢ液とした。
　Ａ液とＢ液を９：１の体積比で次のように混合した。すなわち，２００ｍＬのビーカーに入れたＡ液を，撹拌子（直径６ｍｍ長さ２０ｍｍ）を用いてスターラー（中速度７００～８００ｒｐｍ）で攪拌しながら，マイクロピペットチップ（Eppendolf ep T.I.P.S standard 2-200 μL）を吐出側に装着したシリコンチューブ（外径６ｍｍ内径４ｍｍ）を取り付けたチューブポンプ（PERISTALTIC PUMP PST-100 IWAKI社製）を用い，Ｂ液を約１ｍＬ／分の速度でＡ液中に送液することにより，ＰＬＡ０００５の微粒子を析出させた。この間，吐出口であるマイクロピペットチップの先端は完全に液中に浸漬させておいた。この液を約３０分間攪拌して懸濁液を得，これを篩（口径１０６μｍ）にかけ，凝集塊を除去した。得られた懸濁液Ｄ（１００ｍＬ中）のポリ乳酸，ポリビニルピロリドン及びＤ－マンニトールの含量（１００ｍＬ中）は次のとおりである。
ポリ乳酸（ＰＬＡ０００５）・・・・・・・１ｇ
ポリビニルピロリドン・・・・・・・・・・０．５ｇ
Ｄ－マンニトール・・・・・・・・・・・・１ｇ
　懸濁液Ｄを１．５ｍＬずつガラス製バイアル（１８Φ，高さ３３ｍｍ）に充填し，充填済みバイアルを第１群～第４群に等分し，下記の条件で懸濁液Ｄを凍結乾燥に付し，凍結乾燥組成物を得た。
　（ａ）試験装置：Triomaster-A04型（日精株式会社製）
　（ｂ）トレイ：引き抜きトレイ　　枠２９０Ｗ×４４５Ｌ，１枚使用
　（ｃ）バイアル：１８φ×３３Ｈ（ガラス）
　（ｄ）分注量：１．５ｍＬ／バイアル
　（ｅ）バイアル設置：装置のチャンバー内のトレイ１枚分が埋まるよう懸濁液Ｄ又はダミー液（２．５％Ｄ－マンニトール水溶液１．５ｍＬ）のバイアルを敷き詰めた。
　（ｆ）予備凍結：凍結におけるチャンバー内の冷却速度が粒子の凝集に与える影響を調べるため，群により異なる以下の方法で実施。
　(i) 第１群（徐冷凍結１）：　チャンバー内の常温のトレイに上記バイアルを並べ，トレイ温度を＋２０℃から－４０℃まで２時間かけて徐々に冷却して懸濁液Ｄを凍結させた。
　(ii) 第２群（徐冷凍結２）：　チャンバー内の常温のトレイに上記バイアルを並べ，トレイ温度を＋２０℃からー４５℃まで４０分かけて徐々に冷却して懸濁液Ｄを凍結させた。
　(iii)
第３群：トレイを予め－４５℃まで冷却した上で，上記バイアルを－４５℃トレイの上に並べて薬液を凍結させた。
　(iv) 第４群（液体窒素凍結）：上記バイアルを液体窒素に浸して薬液を急速に凍結させた後，－４５℃のトレイ上に並べた。
　（ｇ）一次乾燥及び二次乾燥：何れの群についても以下の凍結乾燥プログラムに従い一次乾燥および二次乾燥を実施した。
　・一次乾燥：トレイ温度－４５℃又は－４０℃から－１０℃まで１時間で上昇させ，その後－１０℃で１９時間保持した。このときの真空制御値を０.１ Torrとした。
　・二次乾燥：トレイ温度－１０℃から＋２０℃まで１時間で上昇させ，その後＋２０℃で１２時間保持した。このときの真空度は成り行きとした。
　（ｈ）バイアルの密栓： 二次乾燥終了後はゴム栓で密封した。
〔凍結乾燥組成物の評価〕
　上記第１～４群の凍結乾燥組成物を，表１に示した組成の分散媒Ｃに，ポリ乳酸の含量が１Ｗ／Ｖ％となるように分散させることにより懸濁液を再調製した（バイアルあたり液量１．５ｍＬ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  
＜評価方法＞
　各群の凍結乾燥組成物から上記で再調製した懸濁液につき，各バイアル内の全量をそれぞれ，１２穴プレート（１２．５ｃｍＸ８ｃｍ，内径２２ｍｍ，ＩＷＡＫＩ社）の各穴に移し，デジタルマイクロスコープ（型番：ＶＨＸ－５００　キーエンス社）にて懸濁液中の粒子の大きさを観察した。観察は，１穴のほぼ全体像が捉えられるよう倍率を設定して懸濁液の写真撮影を行い，写真上において粗大粒子として，短径が０．２ｍｍを超える凝集体の個数及びそれらのうち短径が０．３ｍｍを超える凝集体の個数を測定した。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  
　表２に見られるように，冷却がゆっくりと行われるほど，粗大粒子の生成は抑制されることが判明した。特に第１群における冷却速度０．５℃／分では，第２群に比して粗大粒子は顕著に少なかった。
〔試験例２〕　第５群～第９群
　精製水にポリビニルピロリドン（ポビドンＫ－３０）を０．５５Ｗ／Ｖ％の濃度となるように，及びＤ－マンニトールを表３の第５群～第９群にそれぞれ規定した量の１．１倍となるように溶解させ，溶液を０．２２μｍ水性フィルターでろ過し，それぞれＡ－５～Ａ－９液とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
  
　ＰＬＡ０００５〔ＤＬ－ポリ乳酸，重量平均分子量５０００，和光純薬（株）製〕をアセトン・エタノール混液（体積比でアセトン：エタノール＝４：６）に１０Ｗ／Ｖ％の濃度となるように溶解させ，得られた溶液を０．２２μｍ非水性フィルターでろ過してＢ液とした。
　Ａ－５～Ａ－９の各液とＢ液を９：１の割合で次のように混合した。２００ｍＬのビーカーに入れたＡ－５～Ａ－９の各液を，撹拌子（直径６ｍｍ長さ２０ｍｍ）を用いてスターラー（中速度７００～８００ｒｐｍ）で攪拌しながら，マイクロピペットチップ（Eppendolf ep T.I.P.S standard 2～200μＬ）を吐出側に装着したシリコンチューブ（外径６ｍｍ内径４ｍｍ）を取り付けたチューブポンプ（PERISTALTIC PUMP PST-100 IWAKI社製）用いてＢ液を約１ｍＬ／分の速度でＡ－５～Ａ－９の各液中に送液し，ＰＬＡ０００５の微粒子を析出させた。このとき吐出口であるマイクロピペットチップの先端は完全に液中に浸漬させておいた。これを約３０分間攪拌して懸濁液それぞれＤ－５～Ｄ－９を得た。懸濁液Ｄ－５～Ｄ－９に含有されるポリ乳酸，ポリビニルピロリドン及びＤ－マンニトールの量は表３に示したとおりである。
　上記で得られた懸濁液Ｄ－５～Ｄ－９を，篩（口径１０６μｍ）にかけ，凝集塊を除去した。篩にかけた後の懸濁液Ｄ－５～Ｄ－９を１．５ｍＬずつガラス製バイアル瓶（１８Φ，高さ３３ｍｍ）に充填し，下記の条件で凍結乾燥を行い，凍結乾燥組成物それぞれＥ－５～Ｅ－９を得た。
（凍結乾燥条件）
ａ）試験装置：Triomaster-A04型（日精株式会社）
ｂ）トレイ：引き抜きトレイ　　枠２９０Ｗ×４４５Ｌ，1枚使用
ｃ）バイアル：１８φ×３３Ｈ（ガラス）
ｄ）分注量：１．５ｍＬ／バイアル
ｅ）凍結乾燥本数：トレイ１枚分が埋まるよう実液またはダミー液（Ｄ－マンニトール水溶液２．５％）のバイアルを敷き詰めた。
ｆ）凍結乾燥プログラムの設定
＜予備凍結＞
　常温棚にバイアルを仕込み，棚を冷却して薬液を凍結させた。棚温を＋２０℃から－４０℃まで２時間かけて冷却した。
＜一次乾燥及び二次乾燥＞
　懸濁液Ｄ－５～Ｄ－９につき，以下の凍結乾燥プログラムにて一次乾燥および二次乾燥を行った。
　一次乾燥は，棚温－４５℃または－４０℃から－１０℃に１時間で上昇させ，その後－１０℃で１９時間に設定した。このときの真空制御値を０.１Torrとした。二次乾燥は棚温－１０℃から＋２０℃に１時間で上昇させ，その後＋２０℃で１２時間に設定した。このときの真空度は成り行きとした。二次乾燥終了後はゴム栓で密封した。
〔凍結乾燥組成物の評価〕
　凍結乾燥組成物Ｅ－５～Ｅ－９を，表４に示した組成の分散媒Ｃに，ポリ乳酸の含量が１Ｗ／Ｖ％となるように分散させることにより懸濁液を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
  
評価方法：上記で調製した懸濁液の全量を１２穴プレート（１２．５ｃｍ×８ｃｍ，内径２２ｍｍ，ＩＷＡＫＩ社）に移し，デジタルマイクロスコープ（型番：ＶＨＸ－５００　キーエンス社）にて粒子の大きさを観察した。その際，１穴のほぼ全体像が捉えられるよう倍率を設定した。写真撮影を行い，短径が０．３および０．２ｍｍ以上の凝集体の個数を測定した。結果を次の表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
  
　表５に見られるように，予備凍結を徐冷とし、Ｄ－マンニトールを５％以上含有させた第８群及び第９群の懸濁液中に，粗大粒子が全く見られないことが確認された。
〔製剤実施例１～４〕
　下記の手順で，ポリ乳酸微粒子含有凍結乾燥組成物を製造する。
　精製水にポリビニルピロリドン（ポビドンＫ－３０）及びＤ－マンニトールを，それぞれ１．１Ｗ／Ｖ％及び１．１Ｗ／Ｖ％の濃度となるように添加して溶解させ，溶液を０．２２μｍ水性フィルターでろ過しＡ液とする。別に，ポリ乳酸（例えばＰＬＡ０００５，ＤＬ－ポリ乳酸，重量平均分子量５０００，和光純薬（株）製〕をアセトン・エタノール混液（体積比でアセトン：エタノール＝４：６）に１Ｗ／Ｖ％の濃度となるように溶解させ，得られた溶液を０．２２μｍ非水性フィルターでろ過してＢ液とする。Ａ液とＢ液を９：１の体積比で次のように混合する。すなわち，２００ｍＬのビーカーに入れたＡ液を，撹拌子（直径６ｍｍ長さ２０ｍｍ）を用いてスターラー（中速度７００～８００ｒｐｍ）で攪拌しながら，マイクロピペットチップ（Eppendolf ep T.I.P.S standard 2-200 μL）を吐出側に装着したシリコンチューブ（外径６ｍｍ内径４ｍｍ）を取り付けたチューブポンプ（PERISTALTIC PUMP PST-100 IWAKI社製）を用い，Ｂ液を約１ｍＬ／分の速度でＡ液中に送液することにより，ＰＬＡ０００５の微粒子を析出させる。この間，吐出口であるマイクロピペットチップの先端は完全に液中に浸漬させておく。この液を約３０分間攪拌して懸濁液を得，これを篩（口径１０６μｍ）にかけ，凝集塊を除去する。得られる懸濁液Ｄ（１００ｍＬ中）のポリ乳酸，ポリビニルピロリドン及びＤ－マンニトールの含量（１００ｍＬ中）は次のとおりである。
ポリ乳酸（ＰＬＡ０００５）・・・・・・・　０．１ｇ
ポリビニルピロリドン・・・・・・・・・・　１ｇ
Ｄ－マンニトール・・・・・・・・・・・・　１ｇ
　上記懸濁液Ｄをガラスバイアルに分注し，以下の条件で凍結乾燥に付す。
　（ａ）試験装置：Triomaster-A04型（日精株式会社製）
　（ｂ）トレイ：引き抜きトレイ　　枠２９０Ｗ×４４５Ｌ，１枚使用
　（ｃ）バイアル：１８φ×３３Ｈ（ガラス）
　（ｄ）分注量：１．５ｍＬ／バイアル
　（ｅ）バイアル設置：装置のチャンバー内のトレイ１枚分が埋まるようバイアルを敷き詰める。
　（ｆ）予備凍結：　試験は，凍結速度の粒子凝集への影響を確認するため，予備凍結は以下の方法で行う。
　(i) 製造実施例１：　常温棚にバイアルを仕込み，棚を冷却して薬液を凍結させた。棚温を＋１０℃から－１０℃まで１５分かけて冷却し，その後－１０℃から－４０℃まで６０分かけて冷却する。
　(ii) 製造実施例２：　常温棚にバイアルを仕込み，棚を冷却して薬液を凍結させた。棚温を＋１５℃から－５℃まで１０分かけて冷却し，その後－５℃から－４０℃まで１００分かけて冷却する。
　(iii) 製造実施例３：　常温棚にバイアルを仕込み，棚を冷却して薬液を凍結させた。棚温を＋２０℃から－１０℃まで２０分かけて冷却し，その後－５℃から－３０℃まで６０分かけて冷却し，更に３０℃からー４０℃まで４０分かけて冷却する。
　(iv) 製造実施例４：　常温棚にバイアルを仕込み，棚を冷却して薬液を凍結させた。棚温を＋１０℃から－１０℃まで１５分かけて冷却し，その後－１０℃から－３０℃まで６０分かけて冷却し，更に３０℃からー４０℃に５分かけて冷却してー４０℃の状態を３０分間維持する。
　（ｇ）一次乾燥と二次乾燥：
　・一次乾燥：トレイ温度－４５℃又は－４０℃から－１０℃まで１時間で上昇させ，その後－１０℃で１９時間保持する。真空制御値は０.１
Torrとする。
　・二次乾燥：トレイ温度－１０℃から＋２０℃まで１時間で上昇させ，その後＋２０℃で１２時間保持する。
　（ｈ）バイアルの密栓： 二次乾燥終了後はゴム栓で密封し，ポリ乳酸微粒子含有凍結乾燥組成物とする。
〔製剤実施例５〕
下記の手順で，ポリ乳酸微粒子含有凍結乾燥組成物を製造する。
　精製水にポリビニルピロリドン（ポビドンＫ－３０）を，表６のＰＶＰ含量の最終濃度の１．１倍となるように添加して溶解させ，溶液を０．２２μｍ水性フィルターでろ過しＡ液とする。別に，表６（アセトン：エタノール（体積比））に従い，アセトン・エタノール混液を調製し，ポリ乳酸〔表６（ＰＬＡ分子量），ＤＬ－ポリ乳酸，重量平均分子量５０００～２００００，和光純薬（株）製〕を最終濃度が表６（ポリ乳酸含量）のとおりになるようにアセトン・エタノール混液に溶解させ，得られた溶液を０．２２μｍ非水性フィルターでろ過してＢ液とする。Ａ液とＢ液を表６（水溶液：PLA溶液）に従い体積比で次のように混合する。すなわち，２００ｍＬのビーカーに入れたＡ液を，撹拌子（直径６ｍｍ長さ２０ｍｍ）を用いてスターラー（中速度７００～８００ｒｐｍ）で攪拌しながら，マイクロピペットチップ（Eppendolf ep T.I.P.S standard 2-200 μL）を吐出側に装着したシリコンチューブ（外径６ｍｍ内径４ｍｍ）を取り付けたチューブポンプ（PERISTALTIC PUMP PST-100 IWAKI社製）を用い，Ｂ液を約１ｍＬ／分の速度でＡ液中に送液することにより，ポリ乳酸の微粒子を析出させる。この間，吐出口であるマイクロピペットチップの先端は完全に液中に浸漬させておく。ポリ乳酸の微粒子を析出させた後，Ｄ－マンニトールを表６のＤ－マンニトール含量になるように添加して溶解させ，この液を約３０分間攪拌して懸濁液を得，これを篩（口径１０６μｍ）にかけ，凝集塊を除去し，懸濁液Ｄを得る。
〔製剤実施例６～９〕
下記の手順で，ポリ乳酸微粒子含有凍結乾燥組成物を製造する。
　精製水にポリビニルピロリドン（ポビドンＫ－３０）及びＤ－マンニトールを，表６（ＰＶＰ含量，マンニトール含量）のそれぞれ最終濃度の１．１倍となるように添加して溶解させ，溶液を０．２２μｍ水性フィルターでろ過しＡ液とする。別に，表６（アセトン：エタノール（体積比））に従い，アセトン・エタノール混液を調製し，ポリ乳酸（表６（ＰＬＡ分子量）ＤＬ－ポリ乳酸，重量平均分子量５０００～２００００，和光純薬（株）製〕を最終濃度が表６（ポリ乳酸含量）のとおりになるようにアセトン・エタノール混液に溶解させ，得られた溶液を０．２２μｍ非水性フィルターでろ過してＢ液とする。Ａ液とＢ液を表６（水溶液：PLA溶液）に従い体積比で次のように混合する。すなわち，２００ｍＬのビーカーに入れたＡ液を，撹拌子（直径６ｍｍ長さ２０ｍｍ）を用いてスターラー（中速度７００～８００ｒｐｍ）で攪拌しながら，マイクロピペットチップ（Eppendolf ep T.I.P.S standard 2-200 μL）を吐出側に装着したシリコンチューブ（外径６ｍｍ内径４ｍｍ）を取り付けたチューブポンプ（PERISTALTIC PUMP PST-100 IWAKI社製）を用い，Ｂ液を約１ｍＬ／分の速度でＡ液中に送液することにより，ポリ乳酸の微粒子を析出させる。この間，吐出口であるマイクロピペットチップの先端は完全に液中に浸漬させておく。この液を約３０分間攪拌して懸濁液を得，これを篩（口径１０６μｍ）にかけ，凝集塊を除去し，懸濁液Ｄを得る。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
  
　製剤実施例５～９で得られる懸濁液Ｄをガラスバイアルに分注し，以下の条件で凍結乾燥に付す。
　（ａ）試験装置：Triomaster-A04型（日精株式会社製）
　（ｂ）トレイ：引き抜きトレイ　　枠２９０Ｗ×４４５Ｌ，１枚使用
　（ｃ）バイアル：１８φ×３３Ｈ（ガラス）
　（ｄ）分注量：１．５ｍＬ／バイアル
　（ｅ）バイアル設置：装置のチャンバー内のトレイ１枚分が埋まるようバイアルを敷き詰める。
　（ｆ）予備凍結：試験は，凍結速度の粒子凝集への影響を確認するため，予備凍結は以下の方法で行う。
（凍結乾燥条件）
ａ）試験装置：Triomaster-A04型（日精株式会社）
ｂ）トレイ：引き抜きトレイ　　枠２９０Ｗ×４４５Ｌ，1枚使用
ｃ）バイアル：１８φ×３３Ｈ（ガラス）
ｄ）分注量：１．５ｍＬ／バイアル
ｅ）凍結乾燥本数：トレイ１枚分が埋まるよう実液またはダミー液（Ｄ－マンニトール水溶液２．５％）のバイアルを敷き詰める。
ｆ）凍結乾燥プログラムの設定
＜予備凍結＞
　常温棚にバイアルを仕込み，棚を冷却して薬液を凍結させる。棚温を＋２０℃から－４０℃まで２時間かけて冷却する。
＜一次乾燥及び二次乾燥＞
　製剤実施例５～９につき，以下の凍結乾燥プログラムにて一次乾燥および二次乾燥を行う。
　一次乾燥は，棚温－４５℃または－４０℃から－１０℃に１時間で上昇させ，その後－１０℃で１９時間に設定する。このときの真空制御値を０.１Torrとする。二次乾燥は棚温－１０℃から＋２０℃に１時間で上昇させ，その後＋２０℃で１２時間に設定する。このときの真空度は成り行きとする。二次乾燥終了後はゴム栓で密封する。
〔製剤実施例１０〕
下記の手順で，ポリ乳酸微粒子含有凍結乾燥組成物を製造する。
　精製水にポリビニルアルコール及びＤ－マンニトールを，０．２２％及び５.５％となるように添加して溶解させ，溶液を０．２２μｍ水性フィルターでろ過しＡ液とする。別に，ポリ乳酸（例えばＰＬＡ０００５，ＤＬ－ポリ乳酸，重量平均分子量５０００，和光純薬（株）製〕をアセトン・エタノール混液（体積比でアセトン：エタノール＝４：６）に１０Ｗ／Ｖ％の濃度となるように溶解させ，得られた溶液を０．２２μｍ非水性フィルターでろ過してＢ液とする。Ａ液とＢ液を９０：１０の体積比で次のように混合する。すなわち，２００ｍＬのビーカーに入れたＡ液を，撹拌子（直径６ｍｍ長さ２０ｍｍ）を用いてスターラー（中速度７００～８００ｒｐｍ）で攪拌しながら，マイクロピペットチップ（Eppendolf ep T.I.P.S standard 2-200 μL）を吐出側に装着したシリコンチューブ（外径６ｍｍ内径４ｍｍ）を取り付けたチューブポンプ（PERISTALTIC PUMP PST-100 IWAKI社製）を用い，Ｂ液を約１ｍＬ／分の速度でＡ液中に送液することにより，ポリ乳酸の微粒子を析出させる。この間，吐出口であるマイクロピペットチップの先端は完全に液中に浸漬させておく。この液を約３０分間攪拌して懸濁液を得，これを篩（口径１０６μｍ）にかけ，凝集塊を除去し，懸濁液Ｄを得る。
懸濁液Ｄをガラスバイアルに分注し，以下の条件で凍結乾燥に付す。
　（ａ）試験装置：Triomaster-A04型（日精株式会社製）
　（ｂ）トレイ：引き抜きトレイ　　枠２９０Ｗ×４４５Ｌ，１枚使用
　（ｃ）バイアル：１８φ×３３Ｈ（ガラス）
　（ｄ）分注量：１．５ｍＬ／バイアル
　（ｅ）バイアル設置：装置のチャンバー内のトレイ１枚分が埋まるようバイアルを敷き詰める。
　（ｆ）予備凍結：試験は，凍結速度の粒子凝集への影響を確認するため，予備凍結は以下の方法で行う。
（凍結乾燥条件）
ａ）試験装置：Triomaster-A04型（日精株式会社）
ｂ）トレイ：引き抜きトレイ　　枠２９０Ｗ×４４５Ｌ，1枚使用
ｃ）バイアル：１８φ×３３Ｈ（ガラス）
ｄ）分注量：１．５ｍＬ／バイアル
ｅ）凍結乾燥本数：トレイ１枚分が埋まるよう実液またはダミー液（Ｄ－マンニトール水溶液２．５％）のバイアルを敷き詰める。
ｆ）凍結乾燥プログラムの設定
＜予備凍結＞
　常温棚にバイアルを仕込み，棚を冷却して薬液を凍結させる。棚温を＋２０℃から－４０℃まで２時間かけて冷却する。
＜一次乾燥及び二次乾燥＞
　懸濁液Ｄにつき，以下の凍結乾燥プログラムにて一次乾燥および二次乾燥を行う。
　一次乾燥は，棚温－４５℃または－４０℃から－１０℃に１時間で上昇させ，その後－１０℃で１９時間に設定する。このときの真空制御値を０.１Torrとする。二次乾燥は棚温－１０℃から＋２０℃に１時間で上昇させ，その後＋２０℃で１２時間に設定する。このときの真空度は成り行きとする。二次乾燥終了後はゴム栓で密封する。
〔試験例３〕　第１０群～第１３群
　表７に基づき，精製水にポリビニルピロリドン（ポビドンＫ－３０）又はポリビニルアルコールとＤ－マンニトールとを，第１０群～第１３群についてそれぞれ規定した量の１．１倍となるように溶解させ，溶液を０．２２μｍ水性フィルターでろ過し，それぞれＡ-１０～Ａ-１３液とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
 　
　ＰＬＡ０００５〔ＤＬ－ポリ乳酸，重量平均分子量５０００，和光純薬（株）製〕をアセトン・エタノール混液（体積比でアセトン：エタノール＝４：６）に１０Ｗ／Ｖ％の濃度となるように溶解させ，得られた溶液を０．２２μｍ非水性フィルターでろ過してＢ液とした。
　Ａ－１０～Ａ－１３の各液とＢ液を９：１の割合で次のように混合した。２００ｍＬのビーカーに入れたＡ－１０～Ａ－１３の各液を，撹拌子（直径６ｍｍ長さ２０ｍｍ）を用いてスターラー（中速度７００～８００ｒｐｍ）で攪拌しながら，マイクロピペットチップ（Eppendolf ep T.I.P.S standard 2-200 μL）を吐出側に装着したシリコンチューブ（外径６ｍｍ内径４ｍｍ）を取り付けたチューブポンプ（PERISTALTIC PUMP PST-100 IWAKI社製）用いてＢ液を約１ｍＬ／分の速度でＡ－１０～Ａ－１３の各液中に送液し，ＰＬＡ０００５の微粒子を析出させた。このとき吐出口であるマイクロピペットチップの先端は完全に液中に浸漬させておいた。これらＡ－１０～Ａ－１３を約３０分間攪拌して懸濁液それぞれＤ－１０～Ｄ－１３を得た。懸濁液Ｄ－１０～Ｄ－１３に含有されるポリ乳酸，ポリビニルピロリドン及びＤ－マンニトールの量は表７に示したとおりである。
　上記で得られた懸濁液Ｄ－１０～Ｄ－１３を，篩（口径１０６μｍ）にかけ，凝集塊を除去した。篩にかけた後の懸濁液Ｄ－１０～Ｄ－１３を１．５ｍＬずつガラスバイアル（１８Φ，高さ３３ｍｍ）に充填し，下記の条件で凍結乾燥を行い，凍結乾燥組成物それぞれＥ－１０～Ｅ－１３を得た。
（凍結乾燥条件）
ａ）試験装置：Triomaster-A04型（日精株式会社）
ｂ）トレイ：引き抜きトレイ　　枠２９０Ｗ＊４４５Ｌ，1枚使用
ｃ）バイアル：１８φ＊３３Ｈ（ガラス）
ｄ）分注量：１．５ｍＬ／バイアル
ｅ）凍結乾燥本数：トレイ１枚分が埋まるよう実液又はダミー液（Ｄ－マンニトール水溶液２．５％）のバイアルを敷き詰めた。
ｆ）凍結乾燥プログラムの設定
＜予備凍結＞
　常温棚にバイアルを仕込み，棚を冷却して薬液を凍結させた。棚温を＋２０℃から－４０℃まで２時間かけて冷却した（平均冷却速度０．５℃／分）。
＜一次乾燥及び二次乾燥＞
　Ｄ－１０～Ｄ－１３につき，以下の凍結乾燥プログラムにて一次乾燥および二次乾燥を行った。
　一次乾燥では，棚温－４５℃又は４０℃から－１０℃に１時間で上昇させ，その後－１０℃で１９時間とした。このときの真空制御値を０.１Torrとした。二次乾燥では棚温－１０℃から＋２０℃に１時間で上昇させ，その後＋２０℃で１２時間とした。このときの真空度は成り行きとした。二次乾燥終了後はゴム栓で密封した。
〔凍結乾燥組成物の評価〕
　凍結乾燥組成物Ｅ－１０～Ｅ－１３を，精製水に，ポリ乳酸の含量が１Ｗ／Ｖ％となるように分散させることにより懸濁液を調製した。
評価方法：上記で調製した懸濁液の粒度分布を、レーザ回折式粒度分布測定装置（ＳＡＬＤ－２１００、島津製作所）を用いて測定した。
結果：第１０群、第１１群および第１３群の最大粒子径は０．２８７ｍｍ、第１２群の最大粒子径は０．２３３ｍｍであり、第１０群～第１３群のいずれも０．３ｍｍ以上の粗大粒子は検出されなかった。
　本発明の製造方法は，凍結乾燥時におけるポリ乳酸微粒子の凝集を抑制でき，注射針を詰まらせる粗大粒子を含まないポリ乳酸微粒子含有の再分散性のある凍結乾燥組成物を与えるため，硝子体除去手術等の眼科手術における使用に適した透明組織可視化剤の製造に利用することができる。

Claims (22)

  1. 　ポリ乳酸微粒子水性懸濁液の凍結乾燥時におけるポリ乳酸の粗大粒子の生成を抑制する方法であって，
    　(a) 分散剤と賦形剤とを含有するポリ乳酸微粒子水性懸濁液を調製するステップであって，
    　　(i) ポリ乳酸を水混和性有機溶媒に溶解させてなるポリ乳酸溶液を，分散剤を含有する分散剤水溶液に撹拌下で添加した後，賦形剤を添加するか，又は
    　　(ii) ポリ乳酸を水混和性有機溶媒に溶解させてなるポリ乳酸溶液を，分散剤及び賦形剤を含有する分散剤／賦形剤水溶液に撹拌下で添加することによるものであるステップと，
    　(b) 該ポリ乳酸微粒子水性懸濁液をガラス容器中で凍結乾燥に付すステップと，
    を含んでなり，
    　ステップ(b)において，該ポリ乳酸微粒子水性懸濁液を入れた該ガラス容器が凍結乾燥機のチャンバー内に置かれ，該ポリ乳酸微粒子水性懸濁液が凍結する時の該チャンバー内の冷却速度が０．１～１℃／分に調節されるものである，方法。
  2. 　該分散剤水溶液又は該分散剤／賦形剤水溶液中の該分散剤の濃度が０．１１～２．２Ｗ／Ｖ％である，請求項１の方法。
  3. 　該分散剤がポリビニルピロリドン又はポリビニルアルコールである，請求項１又は２の方法。
  4. 　該分散剤／賦形剤水溶液中の該賦形剤の濃度が１．１～１１Ｗ／Ｖ％である，請求項１ないし３の何れかの方法。
  5. 　該賦形剤が多価アルコールである，請求項１ないし４の何れかの方法。
  6. 　該多価アルコールがマンニトールである，請求項５の方法。
  7. 　該ポリ乳酸溶液中の該ポリ乳酸の濃度が１～５０Ｗ／Ｖ％である，請求項１ないし６の何れかの方法。
  8. 　該水混和性有機溶媒がアセトン・エタノール混液である，請求項１ないし７の何れかの方法。
  9. 　該アセトン・エタノール混液におけるアセトンとエタノールの混合比が，体積で，アセトン：エタノール＝３：７～５：５である，請求項８の方法。
  10. 　該分散剤水溶液又は該分散剤／賦形剤水溶液と該ポリ乳酸溶液の混合比が，体積で，該水溶液：ポリ乳酸溶液＝８５：１５～９５：５である，請求項１ないし９の何れかの方法。
  11. 　該ガラス容器がガラスバイアルである，請求項１ないし１０の何れかの方法。
  12. 　眼の透明組織可視化剤用ポリ乳酸粒子の製造方法であって，
    　(a) 分散剤と賦形剤とを含有するポリ乳酸微粒子水性懸濁液を調製するステップであって，
    　　(i) ポリ乳酸を水混和性有機溶媒に溶解させてなるポリ乳酸溶液を，分散剤を含有する分散剤水溶液に撹拌下で添加した後，賦形剤を添加するか，又は
    　　(ii) ポリ乳酸を水混和性有機溶媒に溶解させてなるポリ乳酸溶液を，分散剤及び賦形剤を含有する分散剤／賦形剤水溶液に撹拌下で添加することによるものであるステップと，
    　(b) 該ポリ乳酸微粒子水性懸濁液をガラス容器中で凍結乾燥に付すステップと，
    を含んでなり，
    　ステップ(b)において，該ポリ乳酸微粒子水性懸濁液を入れた該ガラス容器が凍結乾燥機のチャンバー内に置かれ，該ポリ乳酸微粒子水性懸濁液が凍結する時の該チャンバー内の冷却速度が０．１～１℃／分に調節されるものである，製造方法。
  13. 　該分散剤水溶液又は該分散剤／賦形剤水溶液中の該分散剤の濃度が０．１１～２．２Ｗ／Ｖ％である，請求項１２の製造方法。
  14. 　該分散剤がポリビニルピロリドン又はポリビニルアルコールである，請求項１２又は１３の製造方法。
  15. 　該分散剤／賦形剤水溶液中の該賦形剤の濃度が１．１～１１Ｗ／Ｖ％である，請求項１２ないし１４の何れかの製造方法。
  16. 　該賦形剤が多価アルコールである，請求項１２ないし１５の何れかの製造方法。
  17. 　該多価アルコールがマンニトールである，請求項１６の製造方法。
  18. 　該ポリ乳酸溶液中の該ポリ乳酸の濃度が１～５０Ｗ／Ｖ％である，請求項１２ないし１７の何れかの製造方法。
  19. 　該水混和性有機溶媒がアセトン・エタノール混液である，請求項１２ないし１８の何れかの製造方法。
  20. 　該アセトン・エタノール混液におけるアセトンとエタノールの混合比が，体積で，アセトン：エタノール＝３：７～５：５である，請求項１９の製造方法。
  21. 　該分散剤水溶液又は該分散剤／賦形剤水溶液と該ポリ乳酸溶液の混合比が，体積で，該水溶液：ポリ乳酸溶液＝８５：１５～９５：５である，請求項１２ないし２０の何れかの製造方法。
  22. 　該ガラス容器がガラスバイアルである，請求項１２ないし２１の何れかの製造方法。
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