WO2011009296A1 - 一种在微藻大规模培养中有效治理敌害生物的方法 - Google Patents

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microalgae
enemy
organism
culture
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王慧岭
马卫敬
马欣欣
刘敏胜
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新奥科技发展有限公司
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/38—Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound

Definitions

  • the present invention relates to the field of controlling hostile organisms, and in particular to a method for effectively controlling enemy organisms in large-scale cultivation of microalgae.
  • BACKGROUND OF THE INVENTION Microalgae has become a new type of energy and nutrient product attracting attention in the world.
  • the main challenge of the present invention is to propose a simple and effective method for killing enemy organisms.
  • Predation Invasive organisms such as Rotifera, Oxyrr/i/s sp, Amoeba sp, etc., directly inoculate algae cells. Because algae cells grow and multiply fast, if the number of predators is small, the amount of swallowing is small, and the effect is not significant. However, when the number of breeding organisms increases and the amount of ingestion increases, the damage to algae cultivation is serious. Especially the rotifer, its swallowing amount is astonishing to a large extent, and the algae cells can be eaten in two or three days to clear the algae liquid.
  • Invasive organisms such as Rotifera, Oxyrr/i/s sp, Amoeba sp, etc.
  • each production link is strictly disinfected, and the aseptic environment is maintained as much as possible to prevent pollution from the source.
  • the first inoculated algae must Taken from the exponential growth phase, and secondly meet the requirements of algae growth in terms of environmental conditions, so that algae grow vigorously.
  • the inoculation amount of the algae species is large, and from the beginning of the cultivation, the algae has an absolute advantage in the amount of the culture medium.
  • filtration methods to remove large-scale enemy biological bait algae is very small, and large-scale contaminated organisms (such as rotifers) can be removed by filtration.
  • large-scale contaminated organisms such as rotifers
  • rotifers can be filtered with a sieve having a mesh size of less than 60um. After one filtration, the adult of the rotifer can be removed, and the rotifer eggs and the developing young individual cannot be completely removed, so it is necessary to continuously filter for 3 days, once a day. After the first filtration and the remaining eggs develop into adult bodies, the second and third filtration Can be cleared.
  • the treatment of microalgae pollution is now concentrated in the prevention process.
  • Sterile processing of the culture system which is difficult to achieve on a large scale, and costly.
  • Purification and cultivation of algae species and maintaining a relatively large inoculum to maintain population advantage which invisibly increases costs on large scale cultures.
  • the sterility requirements are high, the quantity requirements are high, the requirements on the process and equipment are high, and the sterility is maintained at all times during the entire operation process, and the operating cost is increased, which becomes a bottleneck for mass production.
  • large-scale organisms are mainly used for filtration.
  • Small-scale organisms use drugs. Filtration increases operating costs in large-scale production.
  • the drugs also kill algae while killing protozoa, and it is difficult to recover in the short term. Growing, even a large number of algae die. In addition, some people adopt the method of timely harvesting after pollution.
  • the invention is characterized by effectively controlling the pollution of enemy organisms by adjusting the pH value. Most organisms are difficult to survive in a saturated carbon dioxide environment and in a higher pH environment, but for many algae, they are more tolerant and recover more quickly in the right environment.
  • the pH tolerance of the contaminant species is judged by experience or preliminary experiment, and then treated in a pH environment that cannot be tolerated.
  • different pH environment treatment can be adopted according to the severity of the pollutant species.
  • the microscopic algae is controlled by microscopic observation, it is adjusted to be suitable for microalgae. The pH environment of growth. For most algae, growth can be resumed in 24 hours.
  • the treatment method is simple and convenient, low in cost, has no effect on the later products, and is easy to adjust after adjustment. It can use the method of full aeration and proper temperature rise to quickly restore the pH to the pH range required for optimal growth. If necessary, it can also be adjusted with an alkaline substance such as NaOH or ammonia.
  • an alkaline substance such as NaOH or ammonia.
  • Enemy organism Other organisms that compete or prey on the algae culture in the culture of the microalgae.
  • Optimal pH for microalgae growth The pH environment most suitable for microalgae growth, often between 7.0 and 9.0, depending on the species.
  • Alkali-resistant or acid-resistant enemy organisms Different pH gradient experiments are carried out on contaminated algae liquids. It is determined by microscopic examination that it has tolerance to acid and alkali. Generally, alkaline-resistant predators refer to high pH environments. Strong tolerance, organisms that can survive in high pH environments; Acid resistance refers to organisms that can survive in lower pH environments.
  • Algae tolerance limit PH The minimum and maximum algae can withstand pH. Referring to Figure 1, a specific embodiment of the present invention is described in detail below:
  • the present invention provides a method for effectively controlling a hostile organism in large-scale cultivation of microalgae, the method comprising the steps of:
  • the type of contamination of the contaminated algae is first determined.
  • the pollution types of general polluted algae liquids fall into three categories, namely, alkali-resistant, acid-resistant and mixed.
  • the hostile organisms that are resistant to alkaline pollution mainly include pollutant species that are highly resistant to high pH, such as: amoeba.
  • Acid-contaminated hostile organisms mainly include pollutant species that are highly resistant to low pH, such as: nose-tip worms.
  • Mixed-contaminated enemy organisms mainly include pollutants that are not single, such as: At the same time, there are amoeba and ciliates.
  • the method for determining the type of contaminated hostile organisms can be carried out by the following steps: Microscopic examination of the form of the pollutant species contaminated by the algae liquid, preliminary determination of the type of pollution by conventional pattern comparison, if it is very common, taking the contaminated algae liquid with acid Or adjust the pH value with alkali, set different pH gradients, observe the pollutant species and microalgae morphology by timing microscopy to determine the best treatment plan.
  • the type of contaminated algae liquid is alkaline-resistant, pass C0 2 in the culture system of microalgae, and lower the pH value.
  • the pH value is brought to a saturated state.
  • the pH can also be adjusted back to the optimum pH for growth of the microalgae by using ammonia (one of the nitrogen sources used by the microalgae).
  • the pH can also be adjusted back to the optimum pH for growth of the microalgae by using NaOH.
  • the NaOH used is 1 M NaOH.
  • the pH of the algal liquid culture system in which the concentration of C0 2 is saturated is 5.6-5.7.
  • the introduced co 2 can control the pH between 6.0 and 6.5, and then if it is determined that the enemy organism has been obtained Control (if most amoeba has become spherical), then dilute with water to reduce salinity (saltitude refers to the ratio of dissolved matter mass to seawater mass in seawater), then air, full aeration, pH and salt The degree is adjusted to the conditions suitable for algae growth.
  • C0 2 can be introduced in a batch manner. In one embodiment, C0 2 is intermittently introduced at intervals of two hours.
  • the culture system is maintained between pH 6.0 and 6.5 for 2 days, after which water is added to reduce the salinity by one percentage point. In one embodiment, the culture system is maintained at saturation (0 2 for about 28 hours. In an 'embodiment, The CO 2 in the culture system was brought to a saturated state for about 27 hours. In one embodiment, the saturated state of C0 2 is continuously passed through the culture system for 36 hours. In one embodiment, C0 2 (pH between 5.0 and 8.5) is intermittently introduced over a period of 2 hours for 2 days.
  • the base can be aqueous ammonia.
  • the base can be NaOH.
  • the base may be 1 M NaOH. According to different pH requirements and different culture systems, different concentrations of alkali may be used depending on the stirring condition, so that the microalgae may not be damaged if the pH is too high.
  • the base may be other types of bases that do not pose a hazard due to accumulation in the microalgae, such as ammonia, water, NaOH, KOH, and the like.
  • the pH of the culture system is adjusted to 11.5-12.0 using 1 M NaOH or 1 M ammonia water.
  • the pH of the culture system is adjusted to 11.0-11.8 or 8.0-11.0 using 1 M NaOH or 1 M ammonia water.
  • the pH of the culture system is adjusted to between 8.0-11.0, 11.5-12.0 or 11.0-11.8 for 3 hours.
  • the degree of alkali is treated as follows:
  • the pH is adjusted back to a pH suitable for the normal growth of the algae to take air into, or take full aeration at high pH from pH callback into C0 2, real-time detection The pH is achieved.
  • the pH of the culture system is first adjusted with a base, and then saturated with C0 2 , and the microscopic organisms are already controlled (eg, these enemies, such as the nose tipworm, are no longer present in the microscopic examination.
  • the denatured and ciliate or the activity of the predatory organism has been reduced), air is introduced, and aeration is sufficiently aerated to adjust the pH to the pH at which the algae is optimally grown.
  • the pH of the culture system is adjusted using a base and passed to CO 2 such that the time interval between saturations is 1 hour.
  • the base can be aqueous ammonia.
  • the base can be 1 M NaOH.
  • the base may be other types of bases that do not pose a hazard due to accumulation in the microalgae, such as ammonia, soluble bases such as NaOH, KOH, and the like.
  • the pH of the culture system is adjusted to 11.5-12.0, 11.0-11.8 or 8.0-11.0 using 1 M NaOH or aqueous ammonia.
  • the pH of the culture system is adjusted to 11.5-12.0, 11.0-11.8 or 8.0-11.0 for 1 hour and then continuously passed to C0 2 for a period of about 24 hours.
  • the pH is first adjusted to 11.5-12.0, 11.0-11.8 or 8.0-11.0, and after 1 hour, C0 2 is passed to saturation for 24 hours.
  • the pH of the culture system is first adjusted to 11.5-12.0, 11.0-11.8 or 8.0-11.0 for 1 hour, and then passed to C0 2 for saturation for 23 hours.
  • the algae-contaminated predators are controlled, and the cultured algae begin to grow normally after the pH returns to the normal pH.
  • the microscope used is generally a Nikon fluorescent inverted microscope Ti series.
  • the common harmful protozoa can be effectively treated, and it is also effective for some algae pollution.
  • the method of the present invention is economical, convenient, and highly feasible, and greatly reduces the impact of pollution on production and the cost of pollution treatment, and is currently the first choice for treating pollution in a large-scale cultivation process.
  • this method is easy to adjust to the pH environment suitable for algae growth, the growth rate of algae The rate is less affected and does not affect the culture cycle and yield.
  • the present invention is directed to the species of hostile organisms contaminated by the microalgae being cultured; and the degree of acid and alkali tolerance of the species of the predatory organisms is appropriately deal with;
  • pH control of the present invention does not affect the biological activity of the microalgae (pH below 4, most of the microalgae activity is rapidly lost, and below 1 is less active);
  • the pH adjustment of the present invention is not regulated by the addition of a chemical substance, but is adjusted by adding C0 2 , a nitrogen source or the like which does not impair the activity of the microalgae, is beneficial to the growth of the microalgae;
  • the present invention not only adjusts the pH value, but also temporarily kills the pests and diseases by temporarily adjusting the salt concentration and the pH. After killing the pests and diseases, the salt concentration is restored, and the growth of the microalgae is not affected;
  • the technology of the present invention is to treat both pests and diseases and to control pests and diseases.
  • the method of the present invention can adjust pH and salinity regularly without adding harmful high-cost chemicals which are unfavorable growth, even if the pests and diseases have not spread. Pests and diseases are stifled in the early stage.
  • BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS Figure 1 is a flow chart of a method for effectively controlling hostile organisms in large-scale cultivation of microalgae.
  • Figure 2 (Example 1) is a diagram of the contamination treatment of Dunaliella salina by a 120 L bubbling reactor.
  • Figure 2 shows the contamination of the amoeba in Dunaliella salina by low pH. After about 144 hours of culture, the oil was microscopically examined for amoeba contamination, followed by intermittent access (0 2 to maintain the pH between 6.0 and 6.5 for 2 days, and additional water to reduce the salinity by one percentage point. The growth of Dunaliella salina is basically unaffected.
  • Figure 3 is a graph of the chlorella contamination treatment of a 320 L bubbling reactor.
  • Figure 3 shows the contamination of the nose mites at about 196 hours of chlorella culture, adjusting the pH to 11.0-11.8 by 1M NaOH, adjusting the pH to 7.0-8.0 with C0 2 after 3 hours, and fully aerating, Chlorella begins to grow after about 18 hours.
  • Figure 4 is a graph of the chlorella contamination treatment of a 320 L bubbling reactor.
  • Figure 4 shows that amoeba contamination occurs after about 72 hours of chlorella culture, and C0 2 is introduced to make the culture system. In the saturated C0 2 state, the amoeba was barely visible on the microscopic examination after about 28 hours, and the chlorella began to grow after about 28 hours.
  • Figure 5 is a graph of the chlorella contamination treatment of a 320 L bubbling reactor.
  • Figure 5 shows that chlorella was found to have amoeba, nose, and ciliate contamination in the culture for about 72 hours.
  • the pH was adjusted to 11.0-11.8 with 1M NaOH for 1 hour and continued to pass C0 2 to a saturated state of about 24 After an hour, the air is introduced and fully aerated, and the chlorella can resume growth after about 24 hours.
  • Figure 6 is a diagram of the pollution treatment of Chlorella in a 60 L glass plate reactor.
  • Fig. 6 shows that the chlorella culture was contaminated with amoeba for about 5 days, and C0 2 was introduced to be in a state of C0 2 saturation for about 27 hours, and then air was sufficiently aerated, and after 8 hours, Chlorella began to grow.
  • Figure 7 is a diagram of the pollution treatment of Chlorella in a 60 L glass plate reactor.
  • Figure 7 shows that Chlorella sp. is contaminated by nose mites after 3 days of culture.
  • the pH is adjusted to 11.5-12.0 by 1M NaOH.
  • the pH is adjusted to 7.0-8.0 by passing C0 2 , and the green ball is about 18 hours later.
  • the algae began to grow.
  • Figure 8 is a diagram of the pollution treatment of Chlorella in a 60 L glass plate reactor.
  • Figure 8 shows that after 4 days of culture of Chlorella, mixed contamination occurs. The pH is adjusted to 11.5-12.0 with 1M NaOH. After 1 hour, it is passed to C0 2 to make it saturated. After 24 hours, it is aired and fully exposed. Gas, Chlorella began to grow after about 18 hours.
  • Figure 9 is a diagram of the pollution treatment of Chlorella in a 60 L glass plate reactor.
  • Figure 9 shows that during the cultivation of Chlorella, the diatom contamination was observed in the microscopic examination at about 6 days, and C0 2 was continuously introduced for 36 hours, and then air was introduced. Full aeration, diatoms grow slowly, while Chlorella can grow normally
  • Figure 10 is a graph of the contamination treatment of the microspheres of a 1.5 m 3 glass plate reactor.
  • Figure 10 shows that during the whole process of culture of Nannochloropsis, amoeba contamination was found after 4 days, and C0 2 was intermittently introduced in a 2-hour cycle for 2 days, and the amoeba was basically controlled, Nannochloropsis Growth is basically unaffected.
  • Figure 11 is a diagram of a 500 L runway pool spirulina contamination treatment.
  • Figure 11 shows that in S. spirulina culture for 7 days, mixed contamination occurs. The pH is adjusted to 11.5-12.0 by 1M NaOH for 1 hour. After that, it is saturated with C0 2 for 23 hours. The air is fully aerated. After 24 hours. Spirulina can resume growth. detailed description
  • the conventional type comparison is used to judge the type of the pollutant, such as the unknown type of pollution, and the algae solution is subjected to a pH gradient test to judge its tolerance to acid and alkali.
  • the normally cultured microalgae were adjusted to different pH ranges, their growth rates were examined, and their morphology was examined by microscopy.
  • Example 1 Treatment of amoeba contamination in Dunaliella salina by low pH
  • Amoeba (Nikon fluorescence inverted microscope Ti series) Continuously enters C0 2 (pH between about 5.6-5.7 at C0 2 saturation), microscopic examination after 1 hour, most amoeba become spherical, inactive (The microscopic examination can not be deformed and swim, become spherical), continue to pass C0 2 , after 27 hours, the complete amoeba is basically not visible. After that, the air is introduced, fully aerated, and the pH rises after 4 hours. Between 7.0 and 7.5, there is basically no effect on algae growth, and chlorella begins to grow after pH is restored to above 7.0 for 24 hours. See Figure 4.
  • Example 4 Treatment of contaminated small balls under different pH conditions Algae
  • Example 7 Treatment of Chlorella vulgaris contaminated by different species under different pH conditions
  • the medium of Chlorococcum sp. (algae from Qingdao Ocean Institute) was modified BG11 (see Table 3), cultured for 4 days, and microscopic examination (Nikon fluorescence inverted microscope Ti series) found that there was deformation at the same time.
  • Chlorella can resume growth. See Figure 11.
  • Example 11 High pH to control the nose worms in Chlorella
  • Example 12 Treatment of Chlorella vulgaris contaminated by different species under different pH conditions
  • a greenhouse temperature about 25 °C, humidity 60%-80%, light 8000-200001ux
  • 320L bubbling reactor produced by Langfang Jiangchuan Plexiglass Co., Ltd., (p300mmx2m) cultured Chlorella sp.
  • the culture medium (algae from Jinan University) was modified SM medium (see Table 2), and the amoeba, the nose tipworm and the ciliate were observed in the oil microscope microscopic examination (Nikon fluorescence inverted microscope Ti series). Ammonia water was adjusted to pH 9.0. After 1 hour, the microscopic examination of the nose tipworm was basically inactive, and then it was rectified into C0 2 to make it saturated (pH 5.6), and it was continuously passed for 24 hours.
  • Chlorella After 18 hours, Chlorella began to grow. Since ammonia can act as a nitrogen source for the growth of microalgae, Chlorella significantly grows better than when pH is adjusted with NaOH.
  • Example 14 Treatment of Chlorella vulgaris contaminated by different species under different pH conditions
  • the medium of Chlorococcum sp. (algae from Qingdao Ocean Institute) was modified BG11 (see Table 3), cultured for 4 days, and microscopic examination (Nikon fluorescence inverted microscope Ti series) found that there was deformation at the same time. Insects, nose-nosed worms and ciliates, first adjust the pH to 9.0 by 1M ammonia water. Microscopic examination of the nose-tip worms is basically inactive.
  • Chlorella can restore growth. Because ammonia can act as a nitrogen source for microalgae growth, Chlorella significantly grows better than pH with NaOH.

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Description

一种在微藻大规模培养中有效治理敌害生物的方法
技术领域
本发明涉及治理敌害生物领域， 具体地涉及一种在微藻大规模培养中 有效治理敌害生物方法。 背景技术 微藻已成为世人瞩目的一种能源和营养品的新型产业， 在微藻大规 模培养过程中， 由于无法系统灭菌， 因此极易被敌害生物污染， 敌害生物 的污染往往会使整个培养全部失败， 本发明关键在于提出一种简单、 有效 的杀灭敌害生物的方法。
1.藻培养过程中，常会发生敌害生物如原生动物及其它藻类等的污染。 敌害生物对微藻培养的危害十分严重， 常常会导致培养功亏一篑。 敌害生 物的污染和危害是造成当前微藻培养质量不稳定的主要原因之一， 而且防 治问题至今还没有彻底解决。
2.生物对微藻培养的危害作用
1 )捕食： 逸害生物如轮虫 （Rotifera) 、 尖鼻虫 （ Oxyrr/i/s sp ) 、 变形 虫 (Amoeba sp ) 等， 直接吞食藻细胞。 因为藻细胞生长繁殖速度快， 如 果敌害生物的数量不多， 吞食量不大， 影响并不显著。 但当敌害生物繁殖 数量增多且吞食量也增大时，则对藻类培养的危害就严重了。尤其是轮虫， 它的吞食量大到惊人的程度，在二三天内可以把藻细胞吃光，使藻液变清。
2)通过分泌有害物质对微藻起抑制和毒害作用： 敌害生物通过分泌某 些有害的胞外产物对藻细胞产生抑制和毒害作用， 是敌害生物对培养藻类 危害的又一方面， 它往往比直接吞食的危害程度更加严重。 当敌害生物分 泌的有害物质较少时培养的藻类表现为生长缓慢。 当敌害生物繁殖数量较 大， 且分泌的有害物质多时， 即造成藻细胞大量下沉死亡。 敌害生物分泌 的有害物质对藻类毒性大小， 依不同种类而异。 一种敌害生物对藻类的危 害作用， 可能是上述某一方面的， 也可能同时具有两个方面的危害。
3.防治敌害生物的措施 对待敌害生物的污染和危害应遵守以防为主、 防治结合的原则， 尽可 能减小其危害程度。
1 ) 预防措施
( 1 ) 在培养过程中， 各个生产环节严格消毒， 尽可能保持无菌环境， 从源头上预防污染。
(2)做好藻种的分离、 培养和供应工作 在培养工作中严格防止污染是 重要的， 但从目前微藻培养的水平来看， 在长期的培养过程中， 绝对防止 敌害生物的污染是不可能的。 因此， 污染必然会或迟早地发生， 并在适宜 的条件下， 敌害生物大量繁殖， 最后导致培养的失败。 要从根本上解决这 个问题， 就必须不断地补充新的纯藻种来取代在长期培养过程中已经受污 染的藻种， 这才有可能使培养较顺利进行。 所以， 进行藻种的分离、 培养 和供应工作十分重要。
(3 )保持培养藻类的生长优势和数量优势 培养的藻类长势良好及在 藻液中数量的绝对优势， 对防止和减轻敌害生物的危害有着重要的作用。 长期的培养经验告诉我们， 当培养的藻类生长良好、 繁殖迅速时， 敌害生 物的严重危害情况就较少出现。 有时尽管藻类已经受到污染， 但经过一段 时间的培养， 敌害生物的数量并没有增加， 甚至减少乃至消失。 所以保持 培养藻类良好的生长及其数量上的绝对优势， 通过分泌较多的胞外产物对 敌害生物起抑制作用是培养成功的原因之二， 保持藻类的良好长势， 首先 接种的藻种必须取自指数生长期， 其次在环境条件方面尽可能地满足藻类 生长的要求， 使藻类生长旺盛。 藻种的接种量大， 从培养一开始， 藻类在 培养液中即占有数量上的绝对优势。
2 ) 清除、 抑制或杀灭敌害生物的方法
通常采取下列三个方法来清除、 抑制或杀灭敌害生物。
( 1 ) 使用过滤方法清除大型敌害生物 饵料藻类都很小， 对污染的 大型敌害生物 (如轮虫等)， 可以用过滤方法清除。 通常轮虫可用网孔小于 60um的筛絹过滤，经一次过滤可以清除轮虫的成体，而轮虫卵和正在发育 的幼小个体不能完全清除， 所以必须连续过滤 3d， 每天 1次。 待第一次过 滤后存留下来的卵和幼小个体发育成成体后， 在第二次和第三次过滤时即 可清除。
(2)使用药物抑制或杀灭敌害生物 用于抑制或杀灭敌害生物的药物。
(3 ) 改变环境条件杀灭敌害生物 使用改变环境条件杀灭敌害生物的 方法， 必须了解培养藻类和敌害生物对环境因子如温度、 盐度、 pH等的适 应范围， 然后根据具体情况， 改变某一环境因子达到杀灭敌害生物而又保 存藻类的目的。 发明内容
(1)要解决的技术问题 - 微藻在培养过程中敌害生物的污染是不可避免的， 有时候由于污染无 法控制会导致整个培养失败。
现在对于微藻污染的治理， 主要集中在预防过程中。 培养系统的无菌 处理， 这在大规模养殖上很难实现， 并且耗费成本较高。 藻种的纯化培养 和保持相对较大的接种量， 以保持种群优势， 这在大规模培养上会无形中 增加成本。 无菌程度要求高， 数量要求多， 对工艺和设备的要求就高， 并 且在整个运行过程中需要各个环节时时刻刻要保持无菌， 增加运行成本， 成为大规模生产的瓶颈。
对于污染的处理针对大型生物主要采取过滤， 小型的生物采取使用药 物， 过滤在大规模生产上会增加运行成本， 药物在杀害原生动物的同时对 藻类也有很大的杀伤性， 短期内很难恢复生长， 甚至有大量的藻类死亡。 另外也有人采取在污染后及时采收的方法。
(2)技术方案
整个发明如图 1所示， 根据所污染生物的耐受性选择不同的 pH处理 方案， 根据污染物的种类和污染程度可以采取二者相结合的方法， 最后通 过曝气或通入 C02, 调节到适合藻类生长的 pH环境继续培养。
本发明的特点是通过调节 pH值来有效治理敌害生物的污染。 在饱和 二氧化碳的环境和较高的 pH较高的环境下， 大多数生物很难存活， 但是 对于许多藻类， 具有较强的耐受性， 并且在合适的环境下恢复活性较快。
1在污染的培养体系通过经验或初步实验判断污染物种的 pH耐受性， 然后采取其不能耐受的 pH环境进行处理。 2 在敌害生物污染种类较多， 且污染较为严重的情况下， 可根据所污 染物种的严重程度， 采取不同的 pH环境处理， 当镜检观察到污染物种得 到控制时， 调节到适合微藻生长的 pH环境。对大多数藻来说在 24小时候 即可恢复生长。
3所采用处理方法简单方便， 成本低廉， 对后期产品没有任何影响， 调节后处理简单， 可以利用充分曝气， 适当升温等方法使 pH值很快恢复 到最佳生长状态所需 pH范围， 如有必要， 也可以用 NaOH， 氨水等碱性 物质进行调节。 在本文中对下列术语进行具体定义：
敌害生物: 在微藻培养中与所养藻类存在竞争或捕食关系的其它生 物。
有效杀死或抑制敌害生物: 显微镜下镜检观察其数目明显减少， 细胞 形态不完整或者失去活性。
微藻生长的最适 pH值: 最适合微藻生长的 pH环境， 不同物种不同， 常在 7.0-9.0之间。
耐碱性或耐酸性敌害生物: 对污染藻液先做不同 pH梯度实验， 通过 镜检确定其有对酸碱的耐受性， 一般耐碱性敌害生物是指对高的 pH环境 有强的耐受性， 在高 pH环境下可以存活的生物； 耐酸性是指在较低的 pH 环境下可以存活的生物。
混合敌害生物: 污染物种不是单一污染， 不同的污染物有不同的耐受 性。
藻类耐受极限 PH: 藻类对 pH值所能承受的最低和最高限度。 参照图 1， 下面详细描述本发明具体的实施方案：
本发明提供一种在微藻大规模培养中有效治理敌害生物的方法， 所述 方法包括下列步骤：
a、 确定藻类污染的敌害生物种类； 以及所述敌害生物种类的耐受酸 碱程度；
b、根据敌害生物的不同耐受酸碱程度对微藻培养体系的 pH值进行调 节， 在有效杀死和抑制敌害生物之后， 再将所述 pH值调回到所述微藻生 长的最适 pH值。 、 - 如图 1所显示， 首先确定污染藻液的污染类型。 一般污染藻液的污染 类型分为三类， 即耐碱性污染， 耐酸性污染以及混合污染。 其中耐碱性污 染的敌害生物主要包括对高 pH值有较强的耐受性的污染物种， 如： 变形 虫。 耐酸性污染的敌害生物主要包括对低 pH值有较强的耐受性的污染物 种， 如： 鼻尖虫。 混合污染的敌害生物主要包括污染物种不单一， 如： 同 时污染有变形虫及纤毛虫。 确定污染的敌害生物的类型的方法， 可以通过 下列步骤进行： 显微镜检污染藻液所污染物种的形态， 通过常规形态比对 初步判断污染种类， 如果为非常见污染， 取污染藻液用酸或碱调节 pH值， 设置不同 pH梯度， 定时镜检观察污染物种及微藻形态， 以确定最佳处理 方案。
如果确定污染藻液的类型为耐碱性污染时， 在微藻的培养体系中通入 C02， 调低 pH值， 此时镜检观察藻细胞及敌害生物的形态， 如果敌害生 物已经得到抑制或失去活性时， 之后通入空气， 充分曝气， 使 pH值回到 所述微藻生长的最适 pH。 在一个实施方案中， 使所述 C02浓度达到饱和 状态。 在一个备选实施方案中， 也可以通过使用氨水 （微藻使用的氮源之 一 )的方法来将 pH值调回到所述微藻生长的最适 pH。在一个实施方案中， 也可以通过使用 NaOH的方法来将 pH值调回到所述微藻生长的最适 pH。 在一个实施方案中， 所使用的 NaOH为 1M NaOH。 在一个实施方案中， C02的浓度达到饱和状态的藻液培养体系的 pH 为 5.6-5.7。 在一个备选实 施方案中， 在所述藻为海洋藻类 (如杜氏盐藻的情形中)时， 通入的 co2可 以将 pH控制在 6.0-6.5之间， 之后如果确定敌害生物已经得到控制 (如大 多数变形虫已经变成球形)， 则加水稀释将盐度降低 (盐度是指海水中溶解 物质质量与海水质量的比值)， 之后通入空气， 充分曝气， 将 pH和盐度调 节到适合藻类生长的条件。 在一个实施方案中 （如藻种是拟微绿球藻或杜 氏盐藻的情形）， C02可以以间歇的方式通入。 在一个实施方案中， 间歇 通入 C02以两小时为间隔。在一个实施方案中，将培养体系在 pH6.0和 6.5 之间维持 2天， 之后补加水使盐度降低一个百分点。 在一个实施方案中， 使培养体系在饱和 ( 02状态下维持大约 28个小时。 在一个'实施方案中， 使培养体系中的 C02达饱和状态约 27个小时。 在一个实施方案中， 在培 养体系内持续通入饱和状态的 C02 36小时。 在一个实施方案中， 以 2小 时为周期间断性通入 C02 (pH在 5.0-8.5之间)， 持续 2天。
如果确定污染藻液的类型为耐酸性污染时， 在微藻的培养体系中使用 碱来将 pH值调高， 以藻的最高耐受性为限， 维持一段时间， 镜检到敌害 生物失去活性或溶解 (如镜检不到完整而且可以快速游动的鼻尖虫)， 之后 再将 pH值调到适合微藻生长的环境。 在一个实施方案中， 所述碱可以是 氨水。 在一个实施方案中， 所述碱可以是 NaOH。 在一个实施方案中， 所 述碱可以是 1M的 NaOH， 根据不同的 pH需求和不同的培养体系可以视 搅拌情况使用不同浓度的碱来调节， 以不会瞬间 pH值太高对微藻造成伤 害为依据， 尽量不要因为添加太多碱溶液而造成培养体系细胞浓度的稀 释。 在一个实施方案中， 所述碱可以是不会因在微藻体内蓄积而造成危害 的其它类型的碱， 如氨水、 NaOH、 KOH等可溶性碱。在一个实施方案中， 使用 1M的 NaOH或 1M氨水将培养体系的 pH调节到 11.5-12.0。 在一个 实施方案中， 使用 1M 的 NaOH或 1M 氨水将培养体系的 pH 调节到 11.0-11.8 或 8.0-11.0。 在一个实施方案中， 将培养体系的 pH 值调节到 8.0-11.0， 11.5-12.0或 11.0-11.8之间维持 3小时。
如果确定污染藻液的类型为混合污染时， 如污染的敌害生物同时包括 耐酸性污染和耐碱性污染时， 根据敌害生物的种类、 危害速度及程度以及 敌害生物的不同耐受酸碱程度采取如下处理：
(1)在耐碱性污染较为严重的情况下， 先用低 pH处理一段时间， 确定该处理对目标敌害生物有相对较大的抑制和致死， 后改用高 pH环境 处理相反耐受性敌害生物，当确定有效杀死或抑制所述敌害生物后，将 pH 调节回所述藻类正常生长的 pH值； 或
(2)在耐酸性污染较为严重的情况下， 先用高 pH处理一段时间， 确 定该处理对目标敌害生物有相对较大的抑制和致死， 后改用低 pH环境处 理相反耐受性敌害生物， 当确定有效杀死或抑制所述敌害生物后， 将 pH 调节回所述藻类正常生长的 pH值。
在一个实施方案中， 将 pH调节回适合所述藻类正常生长的 pH值采 取通入空气、 充分曝气或从高 pH值回调 pH时采取通入 C02， 实时检测 pH值来实现。
在一个实施方案中， 先使用碱将培养体系的 pH调高， 之后通入 C02 使饱和， 当镜检敌害生物已经得到控制 (如镜检不再存在这些敌害生物，如 鼻尖虫、变性虫和纤毛虫或所述敌害生物的活性己经降低)， 通入空气， 充 分曝气， 将 pH调节到所述藻类最适生长的 pH值。 在一个实施方案中， 使用碱将培养体系的 pH调高和通入 C02使饱和之间的时间间隔是 1小时。 在一个实施方案中， 所述碱可以是氨水。 在一个实施方案中， 所述碱可以 是 1M的 NaOH。 在一个实施方案中， 所述碱可以是不会因在微藻体内蓄 积而造成危害的其它类型的碱， 如氨水， NaOH、 KOH等可溶性碱。 在一 个实施方案中， 使用 1M 的 NaOH 或氨水将培养体系的 pH 调节到 11.5-12.0, 11.0-11.8 或 8.0-11.0。 在一个实施方案中， 将培养体系的调节 pH到 11.5-12.0, 11.0-11.8或 8.0-11.0持续 1个小时后持续通入 C02，达饱 和状态约 24 个小时。 在一个实施方案中， 先将 pH 调节到 11.5-12.0， 11.0-11.8或 8.0-11.0, 1小时后， 通入 C02达饱和状态， 维持 24小时。 在 一个实施方案中，先将培养体系的 pH调节到 11.5-12.0， 11.0-11.8或 8.0-11.0 维持 1小时， 之后通入 C02达饱和状态， 持续 23小时。
通过上述方法， 藻类污染的敌害生物受到控制， 在 pH恢复到正常 pH 后一段时间， 培养的藻类开始正常生长。
在上述实施方案中， 所用的显微镜一般为 Nikon 荧光倒置显微镜 Ti 系列。
(3) 发明效果
对于绝大多数微藻（绿藻、 蓝藻、 杂色藻） 培养过程中常见危害性原 生动物都可以有效治理， 对于部分杂藻污染也有效果。
(4) 本发明的创新性
1、 本发明所述的方法经济、 方便， 可行性较高， 大大减少污染对生 产的影响和污染处理的成本问题， 是目前大规模培养过程中处理污染的首 选方案。
2、此方法处理后很容易调到适合藻类生长的 pH环境，对藻类生长速 率影响较小， 不会对培养周期及产量造成影响。
3、 可以结合多种环境因素， 如盐度、 温度等同时使用， 提高治理速 度和效果。
具体而言， 本发明与现有技术的主要区别在于： （1)本发明针对正在 培养的微藻污染的敌害生物种类； 以及所述敌害生物种类的耐受酸碱程度 来进行恰当的处理；
(2)本发明的调节 pH防治病虫害技术， 是不影响微藻的生物活性的 (pH到 4以下， 绝大部分微藻活性快速丧失， 到了 1以下， 活性更差）；
(3)本发明的 pH调节不是通过采用加入化学物质调节的， 而是通过 加入不损害微藻活性， 有益于微藻生长的 C02， 氮源等进行调节的；
(4)本发明不仅仅调节 pH值，还通过暂时性调节盐浓度和 pH共同作 用杀死病虫害， 杀死完病虫害后，通过恢复盐浓度，对微藻的生长无影响；
(5)本发明的技术是治理病虫害和防治病虫害兼顾的，本发明的方法， 可以在病虫害尚未蔓延的情况下， 通过定期调节 pH值和盐度， 不添加不 利生长的高成本化学物质， 将病虫害扼杀在前期。 附图说明 图 1 是在微藻大规模培养中有效治理敌害生物方法的流程图。
图 2 (实施例 1 ) 是 120L鼓泡式反应器杜氏盐藻污染处理的图。 .图 2 显示低 pH值处理杜氏盐藻中变形虫的污染。 在培养大约 144个小时的时 候油镜下镜检发现有变形虫污染， 之后间断性通入 ( 02使 pH维持在 6.0 和 6.5之间， 维持 2天， 补加水使盐度降低一个百分点。 杜氏盐藻生长基 本不受影响。
图 3 (实施例 2)是 320L鼓泡式反应器小球藻污染处理的图。 图 3显 示在小球藻培养大约 196小时时出现鼻尖虫的污染， 通过 1M NaOH调节 pH值到 11.0-11.8之间， 3小时后用 C02调节 pH到 7.0-8.0之间， 充分曝 气， 小球藻大约 18个小时后开始生长。
图 4(实施例 3 ) 是 320L鼓泡式反应器小球藻污染处理的图。 图 4显 示在小球藻培养大约 72小时后出现变形虫污染， 通入 C02， 使培养体系 处于饱和 C02状态， 大约 28个小时后镜检基本上看不到变形虫， 小球藻 约 28小时后开始生长。
图 5(实施例 4 ) 是 320L鼓泡式反应器小球藻污染处理的图。 图 5显 示小球藻在培养大约 72小时镜检发现有变形虫， 鼻尖虫， 纤毛虫污染， 用 1M NaOH调节 pH到 11.0-11.8持续 1个小时后持续通入 C02， 达饱和 状态约 24个小时， 之后通入空气， 充分曝气， 约 24小时后小球藻可以恢 复生长。
图 6(实施例 5 ) 是 60L玻璃板式反应器绿球藻污染处理的图。 图 6显 示绿球藻培养约 5天出现变形虫的污染， 通入 C02， 使其处于 C02饱和状 态约 27个小时， 之后通入空气充分曝气， 8小时后绿球藻开始生长。
图 7(实施例 6 ) 是 60L玻璃板式反应器绿球藻污染处理的图。 图 7显 示绿球藻在培养 3天后出现鼻尖虫的污染， 通过 1M NaOH调节 pH到 11.5-12.0, 3小时后， 通入 C02调节 pH到 7.0-8.0之间， 大约在 18小时后 绿球藻开始生长。
图 8(实施例 7 ) 是 60L玻璃板式反应器绿球藻污染处理的图。 图 8显 示绿球藻培养 4天后， 出现混合污染现象， 先用 1M NaOH调节 pH到 11.5-12.0, 1小时后通入 C02，使其处于饱和状态，维持 24小时后通入空气， 充分曝气， 大约在 18小时后绿球藻开始生长。
图 9(实施例 8 ) 是 60L玻璃板式反应器绿球藻污染处理的图。 图 9显 示在绿球藻培养过程中， 大约在 6天镜检发现有硅藻污染， 持续通入 C02 36个小时， 后通入空气。 充分曝气， 硅藻生长缓慢， 而绿球藻则可以正常 生长
图 10(实施例 9 ) 是 1.5m3玻璃板式反应器拟微球藻污染处理的图。图 10显示在微拟球藻培养的整个过程中， 在 4天后发现有变形虫污染， 以 2 小时为周期间断性通入 C02, 持续 2天， 变形虫基本上得到控制， 微拟球 藻生长基本不受影响。
图 11(实施例 10 ) 是 500L跑道池螺旋藻污染处理的图。 图 11显示在 螺旋藻培养 7天， 出现混合污染， 先通过 1M NaOH调节 pH到 11.5-12.0 维持 1个小时， 之后通入 C02饱和状态持续 23小时， 通入空气充分曝气， 24小时后螺旋藻可以恢复生长。 具体实施方式
下面本文将结合实施例进行详细描述， 但要注意的是， 实施例仅是举 例说明的目的， 本发明并不局限于所述实施例。 实施例
在微藻大规模培养中有效治理敌害生物方法中的一般方法：
1.确定微藻培养受到污染- 在微藻培养的过程中始终要通过显微镜检来作为判断其生长的状况 的依据之一， 因此早期污染都是在镜检时发现的， 如未做镜检的藻液在污 染时一般会发生颜色变化， 如变成棕褐色， 或在反应器闭上可以观察到棕 褐色斑等现象， 但是一旦在直观可以看到颜色变化的都已经是污染较为严 重， 建议在培养周期中连续镜检， 在早期治理效果较佳。
2. 确定受到污染的种类：
镜检发现污染后， 通过常规形态比对， 判断污染物的种类， 如未知种 类污染， 取藻液进行 pH梯度实验， 以判断其对酸碱的耐受性。
3.判断所达到的 PH是藻类的耐受极限：
取正常培养的微藻， 调节不同的 pH范围， 检测其生长速率和显微镜 检其形态。 在实施例中所用的培养基配方：
表 1 Erdschreiber's Medium培养基培方
# 成分
1 补充海水 3 L
2 P-IV 金属元素 36 mL/3 L
3 NaN03 10 mL/3 L
4 Na2HPO 7H20 10 mL/3 L
5 土壤水 150 mL/3 L
6 维生素 B12 3 mL/3 L
Figure imgf000013_0001
表 2 SM培养基
# 成分 量
1 Spir 1 500 mL/L
2 Spir 2 500 mL/L
Spir 1
# 成分 量
1 NaHC03 6.81 g 500 mL dH20
2 Na2C03 4.03 g/500 mL dH20
3 K2HP04 0.5 g/500 mL dH20
Spir 2
# 成分 量
1 NaN03 2.5 g/500 mL
2 2S04 1 g/500 mL
3 NaCl 1 g/500 mL
4 MgS04-7H20 0.2 g/500 mL
5 CaCl2-2H20 0.04 g/500 mL
6 P-IV金属元素 6 mL/0.5 L
7 Chu微量元素 1 mL/0.5 L
8 维生素 B12 1 mL/0.5 L
P-IV金属元素
# 成分 量
1 Na2EDTA-2H20 0.75 g/L
2 FeCl3-6H20 0.097 g/L
3 MnCl2-4H20 0.041 g/L
4 ZnCl2 0.005 g/L
5 CoCl2.6H20 0.002 g/L
6 Na2Mo04-2H20 0.004 g/L
chu微量元素
# 成分 量
1 CuS04-5H20 0.02 g/L
2 ZnS04-7H20 0.044 g/L
3 CoCl2-6H20 0.02 g/L
4 MnCl2-4H20 0.012 g L
5 Na2Mo04-2H20 0.012 g/L 6 H3B03 0.62 g/L
7 Na2EDTA-2H20 0.05 g/L
维生素 B 12
成分 量
1 HEPES buffer pH 7.8 2.4 g/200 mL dH20
Vitamin B 12
2 0.027 g/200 mL dH20
(cyanocobalamin, Sigma V2876)
表 3 改良 BG-11培养基配方
Figure imgf000015_0001
Figure imgf000015_0002
表 4 改良 BG-11培养基配方 名称 浓度 （g/L) 硝酸钠 NaN03 0.75
磷酸氢二钾 K2HPO4 0.039
七水合硫酸镁 MgS04 7H20 0.075
氯化钙 CaCl2 0.027
柠檬酸 Citric acid 0.006
柠檬酸铁 Fe citrate 0.006
乙二胺四乙酸 EDTA 0.001
碳酸钠 NaC03 0.02 九水合硅酸钠 Na2Si03-9H20 0.058
微量元素 Microelements 1M1
海水精 30g/L
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实施例一： 低 pH值处理杜氏盐藻中变形虫的污染
阳光大棚户外培养杜氏盐藻 Dunaliella tertiolecta) (购自 UTEX) , 在 120L 鼓泡式反应器 （廊坊市江川有机玻璃有限公司生产， (p300mmx2m)，改良 EM培养基 (见表一)，平均温度约 25 °C，湿度 60%-80%， 平均光照 15000-200001ux (正常培养 pH值在 8.0-9.0之间）。当油镜（Nikon 荧光倒置显微镜 Ti系列， 1000倍） 下观察到有变形虫污染， 间断性通入 C02使 pH维持在 6.0和 6.5之间， 维持 2天后镜检， 发现大多数变形虫变 为球形， 加水稀释使盐度（例如， 从 9%的盐度稀释到 8% ) 降低一个百分 点。 之后通入空气， 充分曝气， 24小时后镜检已基本上看不到变形虫。 对 藻类生长影响较小。 具体见图 2。 实施例二： 高 pH值治理小球藻中的鼻尖虫
阳光大棚户外培养，温度约 25 °C，湿度 60%-80%，光照 8000-200001ux) 在 320L鼓泡式反应器（廊坊市江川有机玻璃有限公司生产， (p300mmx2m) 培养小球藻 (Chlorella sp.) (购自中国科学院武汉水生研究所中国淡水藻种 库） 培养基为改良 SM (见表二） （正常培养 pH在 7.0-9.0之间）， 当油镜 (Nikon荧光倒置显微镜 Ti系列， ) 下观察到污染有鼻尖虫时， 通过 1M NaOH调节 PH到 11.0-11.8之间， 3小时后镜检， 基本上看不到鼻尖虫的 存在，之后通入 C02， 调节 PH到 7.0-8.0之间，所述小球藻 18小时后开始 生长。 具体见图 3。 实施例三： 饱和 co2治理小球藻中的变形虫污染
在 320L 鼓泡式反应器 （廊坊市江川有机玻璃有限公司生产， (p300mmx2m)培养小球藻 (Chlorella sp.) (购自中国科学院武汉水生研究所 中国淡水藻种库）培养基为改良的 SM培养基 （见表 2) (正常培养 pH在 7.0-9.0之间）， 阳光大棚户外培养， 温度约 25 。C， 湿度 60%-80%， 光照 8000-200001ux。 在油镜下镜检发现污染有变形虫 （Nikon荧光倒置显微镜 Ti系列） 持续通入 C02 (在 C02饱和状态下 pH值大约在 5.6-5.7之间）， 1小时后镜检， 大多数变形虫变为球形， 无活性 （镜检不能变形游动， 变 成球形）， 继续通入 C02， 在 27小时后， 已基本上看不到完整的变形虫。 之后通入空气， 充分曝气， 在 4小时后 pH上升到 7.0-7.5之间， 基本上对 藻类生长没有影响， 在 pH恢复到 7.0以上 24小时后小球藻开始生长。 具 体见图 4。 实施例四： 不同 pH条件下治理不同物种污染的小球藻
在阳光大棚 （温度约 25 。C， 湿度 60%-80%， 光照 8000-200001ux ) 320L鼓泡式反应器 （廊坊市江川有机玻璃有限公司生产， （p300mmx2m) 培养小球藻 （Chlorella sp. ) (藻种来自暨南大学） 培养基为改良 SM培养 基 （见表 2)， 在油镜下镜检 （Nikon荧光倒置显微镜 Ti系列） 中观察到 污染有变形虫， 鼻尖虫和纤毛虫， 通过 1M NaOH调节 PH到 11.0-11.8之 间， 1小时后显微镜检鼻尖虫基本失去活性，之后改通入 C02使其饱和 (pH 5.6), 持续通入 24小时， 藻液由处理前的褐色变为绿色， 镜检未发现变形 虫和鼻尖虫， 有少量失去活性， 不能游动的纤毛虫。通入空气， 充分曝气， 24小时后小球藻可以恢复生长。 具体见图 5。 实施例五： 饱和 C02治理绿球藻中的变形虫污染
阳光大棚在 60L 玻璃板式反应器 （廊坊市江川有机玻璃有限公司生 产， OP=10cm) (培养温度约 25 °C， 湿度 60%-80%， 光照 8000-200001ux) 培养 （正常培养 pH在 8.0-9.0之间）的绿球藻（Chlorococcum sp. ). (藻种来 自青岛海洋所） 培养基为改良 BG11(见表 3)， 约 5天显微镜 （Nikon荧光 倒置显微镜 Ti系列） 镜检发现污染变形虫， 持续通入 co2使培养体系达 饱和 C02， pH值大约在 5.6-5.7之间， 1小时后镜检， 大多数变形虫变为 球形，无活性镜检不能变形游动，变成球形，继续通入 C02, 在 27小时后， 已基本上看不到完整的变形虫。之后通入空气， 充分曝气，在 4小时后 pH 上升到 7.0-8.0之间， 基本上对藻类生长没有影响， 在 pH恢复到 7.0以上 8小时后小球藻开始生长。 具体见图 6。 实施例六： 高 pH值治理绿球藻中的鼻尖虫
阳光大棚在 60L玻璃板式反应器（廊坊市江川有机玻璃有限公司生产， OP=10cm) (培养温度约 25 °C， 湿度 60%-80%， 光照 8000-200001ux) 培 养（正常培养 pH在 8.0-9.0之间)的绿球藻（Chlorococcum.sp.) (藻种来自 青岛海洋所） 培养基为改良 BG11 (见表 3)， 培养 3天后， 镜检 （Nikon荧 光倒置显微镜 Ti 系列） 发现污染鼻尖虫， 通过 1M NaOH 调节 pH 到 11.5-12.0之间， 3小时后镜检，基本上看不到鼻尖虫的存在，之后通入 C02， 调节 PH到 7.0-8.0之间， 18小时后绿球藻开始生长。 具体见图 7。 实施例七： 不同 pH条件下治理不同物种污染的绿球藻
阳光大棚在 60L玻璃板式反应器（廊坊市江川有机玻璃有限公司生产， OP=10cm) (培养温度约 25 V， 湿度 60%-80%， 光照 8000-200001ux) 培 养 （正常培养 pH在 8.0-9.0之间）的绿球藻（Chlorococcum sp.) (藻种来自 青岛海洋所）培养基为改良 BG11 (见表 3)， 培养 4天， 显微镜检 (Nikon荧 光倒置显微镜 Ti系列)发现同时污染有变形虫， 鼻尖虫和纤毛虫， 先通过 1M NaOH调节 PH到 11.5-12.0之间， 显微镜检鼻尖虫基本失去活性， 之 后改 1小时后通入 C02使饱和 （约 5.6左右）， 持续通入 24小时， 藻液由 处理前的褐色变为绿色， 镜检未发现变形虫和鼻尖虫， 有少量失去活性， 不能游动的纤毛虫。通入空气，充分曝气， 18小时后绿球藻可以恢复生长。 具体见图 8 实施例八： 绿球藻污染硅藻的控制
阳光大棚在 60L玻璃板式反应器（廊坊市江川有机玻璃有限公司生产， OP=10cm) (培养温度约 25°C， 湿度 60%-80%， 光照 8000-200001ux) 培 养 （正常培养 pH在 8.0-9.0之间)的绿球藻（Chlorococcum sp.) (藻种来自 青岛海洋所）培养基为改良 BG11 (见表 3)， 油镜 Nikon荧光倒置显微镜 Ti 系列下镜检发现污染有硅藻， 持续通入 C02使其处于饱和状态 (此时 pH 大约 5.6)， 36小时后镜检发现， 部分硅藻， 细胞内色素流失， 出现空壳， 通入空气充分曝气， 剩余污染硅藻活性降低， 生长缓慢， 不会成为优势藻 种， 可以有效控制污染程度， 不会对绿球藻整个培养造成影响。 具体见图 9 实施例九： 低 pH环境治理拟微球藻污染变形虫
阳光大棚 （温度约 25 °C， 湿度 60%-80%， 光照 8000-200001ux) 1.5m3 玻璃板式反应器（廊坊市江川有机玻璃有限公司生产， OP=10cm)培养培 养基为改良 BG11 (见表 4) (正常培养 pH 在 7.0-9.0 之间）拟微绿球藻 (Nannochloris sp.) (藻种来自青岛海洋所）， 经镜检 （Nikon荧光倒置显 微镜 Ti系列） 发现污染变形虫， 以 2小时为周期间断性通入 C02(pH在 5.0-8.5之间波动)， 2天后镜检， 未发现变形虫， 藻种生长速率基本不受影 响。 具体见图 10。 实施例十： 调节 pH值治理螺旋藻污染
在 500L跑道池培养（阳光大棚户外培养，温度约 25 °C，湿度 60%-80%， 光照 8000-200001ux) (廊坊市江川有机玻璃有限公司生产， （p300mmx2m) 培养螺旋藻（培养基为改良 SM (见表 2) (Spirulina maxima) (购自 UTEX) , 镜检（Nikon荧光倒置显微镜 Ti系列）发现同时污染有变形虫， 鼻尖虫和 纤毛虫， 先通过 1M NaOH调节 PH到 11.5-12.0之间， 1小时后通入 C02 使饱和持续 23小时 (pH大约为 5.8)， 镜检未发现变形虫和鼻尖虫， 有少量 失去活性， 不能游动的纤毛虫。 通入空气， 充分曝气， 24小时后绿球藻可 以恢复生长。 具体见图 11。 实施例十一： 高 pH值治理小球藻中的鼻尖虫
阳光大棚户外培养，温度约 25 °C，湿度 60%-80%，光照 8000-200001ux) 在 320L鼓泡式反应器（廊坊市江 j 11有机玻璃有限公司生产， (p300mmx2m) 培养小球藻 (Chlorella sp.) (购自中国科学院武汉水生研究所中国淡水藻种 库） 培养基为改良 SM (见表二） （正常培养 pH在 7.0-9.0之间）， 当油镜 (Nikon荧光倒置显微镜 Ti系列，） 下观察到污染有鼻尖虫时， 通过 1M 氨水调节 pH到 8.0， 3小时后镜检， 基本上看不到鼻尖虫的存在， 之后通 入 C02， 调节 pH到 7.0-8.0之间，所述小球藻 18小时后开始生长。因为氨 水可以作为微藻生长的氮源， 因此小球藻明显地比用 NaOH调节 pH的情 形生长得更好。 实施例十二： 不同 pH条件下治理不同物种污染的小球藻
在阳光大棚（温度约 25 °C，湿度 60%-80%，光照 8000-200001ux ) 320L 鼓泡式反应器 （廊坊市江川有机玻璃有限公司生产， （p300mmx2m) 培养 小球藻（ Chlorella sp.) (藻种来自暨南大学）培养基为改良 SM培养基（见 表 2)， 在油镜下镜检 （Nikon荧光倒置显微镜 Ti系列） 中观察到污染有 变形虫， 鼻尖虫和纤毛虫， 通过 1M氨水调节 pH到 9.0， 1小时后显微镜 检鼻尖虫基本失去活性， 之后改通入 C02使其饱和 (pH 5.6)， 持续通入 24 小时， 藻液由处理前的褐色变为绿色， 镜检未发现变形虫和鼻尖虫， 有少 量失去活性， 不能游动的纤毛虫。 通入空气， 充分曝气， 24小时后小球藻 可以恢复生长。 因为氨水可以作为微藻生长的氮源， 因此小球藻明显地比 用 NaOH调节 pH的情形生长得更好。 实施例十三： 高 pH值治理绿球藻中的鼻尖虫
阳光大棚在 60L玻璃板式反应器（廊坊市江川有机玻璃有限公司生产， OP=10cm) (培养温度约 25 湿度 60%-80%， 光照 8000-200001ux) 培 养（正常培养 pH在 8.0-9.0之间)的绿球藻（Chlorococcum sp. ) (藻种来自 青岛海洋所） 培养基为改良 BG1 U见表 3)， 培养 3天后， 镜检 （Nikon荧 光倒置显微镜 Ti系列） 发现污染鼻尖虫， 通过 1M氨水调节 pH到 10.0， 3小时后镜检， 基本上看不到鼻尖虫的存在， 之后通入 C02， 调节 PH到 7.0-8.0之间， 18小时后绿球藻开始生长。因为氨水可以作为微藻生长的氮 源， 因此绿球藻明显地比用 NaOH调节 pH的情形生长得更好。 实施例十四： 不同 pH条件下治理不同物种污染的绿球藻
阳光大棚在 60L玻璃板式反应器（廊坊市江川有机玻璃有限公司生产， OP=10cm) (培养温度约 25 V， 湿度 60%-80%， 光照 8000-200001ux) 培 养 （正常培养 pH在 8.0-9.0之间)的绿球藻（Chlorococcum sp.) (藻种来自 青岛海洋所）培养基为改良 BG11 (见表 3)， 培养 4天， 显微镜检 (Nikon荧 光倒置显微镜 Ti系列)发现同时污染有变形虫， 鼻尖虫和纤毛虫， 先通过 1M氨水调节 PH到 9.0， 显微镜检鼻尖虫基本失去活性， 之后改 1小时后 通入 C02使饱和 （约 5.6左右）， 持续通入 24小时， 藻液由处理前的褐色 变为绿色， 镜检未发现变形虫和鼻尖虫， 有少量失去活性， 不能游动的纤 毛虫。 通入空气， 充分曝气， 18小时后绿球藻可以恢复生长。 因为氨水可 以作为微藻生长的氮源， 因此绿球藻明显地比用 NaOH调节 pH的情形生 长得更好。 实施例十五： 调节 pH值治理螺旋藻污染
在 500L跑道池培养（阳光大棚户外培养，温度约 25 °C，湿度 60%-80%， 光照 8000-200001ux) (廊坊市江川有机玻璃有限公司生产， （p300mmx2m) 培养螺旋藻（培养基为改良 SM (见表 2) (Spirulina maxima) (购自 UTEX) , 镜检（Nikon荧光倒置显微镜 Ti系列）发现同时污染有变形虫， 鼻尖虫和 纤毛虫， 先通过 1M氨水调节 pH到 10.0， 1小时后通入 C02使饱和持续 23小时 (pH大约为 5.8)， 镜检未发现变形虫和鼻尖虫， 有少量失去活性， 不能游动的纤毛虫。通入空气，充分曝气， 24小时后绿球藻可以恢复生长。 因为氨水可以作为微藻生长的氮源， 因此绿球藻明显地比用 NaOH 调节 pH的情形生长得更好。
应该理解， 尽管参考其示例性的实施方案， 已经对本发明进行具体地 显示和描述， 但是本领域的普通技术人员应该理解， 可以在其中进行各种 形式和细节的变化， 而不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和 范围。

Claims

1、 一种在微藻大规模培养中有效治理敌害生物的方法， 所述方法包 括下列步骤- a 确定正在培养的微藻污染的敌害生物种类； 以及所述敌害生物种 类的耐受酸碱程度；
b、根据敌害生物的不同耐受酸碱程度对微藻培养体系的 pH值进行调 节， 当确定有效杀死或抑制敌害生物后， 再将 pH值调回适合所述藻类正 常生长的 ρΡΠ
其中当所述敌害生物种类为耐碱性时， 向所述微藻的培养体系中通入 C02， 当确定有效杀死或抑制敌害生物后， 通入空气、 充分曝气或使用碱 调节， 将 pH值调节回适合所述藻类正常生长的 pin ;
当所述敌害生物种类为耐酸性时， 首先用碱调节所述微藻的培养体系 的 pH， 使培养体系处于较高的 pH环境下， 当确定有效杀死或抑制敌害生 物后， 将 pH调节回适合所述藻类生长的 pH值；
当所述敌害生物种类为混合污染时， 根据敌害生物的种类、 危害速度 及程度以及敌害生物的不同耐受酸碱程度：
(1)在耐碱性污染较为严重的情况下， 先用低 pH处理一段时间， 确定该处理对目标敌害生物有相对较大的抑制和致死， 后改用高 pH环境 处理相反耐受性敌害生物，当确定有效杀死或抑制所述敌害生物后，将 pH 调节回所述藻类正常生长的 pH值； 或
(2) 在耐酸性污染较为严重的情况下， 先用高 pH处理一段时间， 确定该处理对目标敌害生物有相对较大的抑制和致死， 后改用低 pH环境 处理相反耐受性敌害生物，当确定有效杀死或抑制所述敌害生物后，将 pH 调节回所述藻类正常生长的 pH值。
2、 根据权利要求 1 所述的方法， 其中所述微藻培养中常见耐碱性敌 害生物为变形虫。
3、 根据权利要求 1 所述的方法， 其中所述微藻培养中常见耐酸性敌 害生物为鼻尖虫。
4、 根据权利要求 1 所述的方法， 其中所述敌害生物为选自以下各项 的混合污染： 变形虫、 鼻尖虫、 纤毛虫、 及其它杂藻污染。
5、 根据权利要求 1所述的方法， 其中所述的通入 02将 pH控制在 6.0-6.5之间， 在确定污染的生物被有效杀死或被抑制后， 加水稀释使所述 培养体系的盐度降低， 之后通入空气， 充分曝气。
6、 根据权利要求 1所述的方法， 其中所述的通入 C02达到 C02饱和 状态， 根据污染情况和藻种特性， 确定饱和状态的具体时间。
7、 根据权利要求 6所述的方法， 其中饱和状态的时间为 1小时。
8、 根据权利要求 6所述的方法， 其中饱和状态时的 pH值为 5.6-5.7。
9、 根据权利要求 1所述的方法， 其中通入 C02以 2小时为周期间歇 通入。
10、根据权利要求 1所述的方法，其中用碱将所述微藻培养体系的 pH 调高到 8.0-11.0， 11.0-11.8或 l l.5-12.0o
11、 根据权利要求 1所述的方法， 其中将 pH调节回适合所述藻类正 常生长的 pH值采取通入空气、充分曝气或从高 pH值回调 pH时采取通入 C02， 实时检测 pH值来实现。
12、 根据权利要求 1所述的方法， 其中先使用碱将培养体系的 pH调 高， 之后通入 co2使其处于饱和状态， 当镜检敌害生物已经得到控制， 通 入空气， 充分曝气， 将 pH调节到所述藻类正常生长的 pH值。
13、根据权利要求 1-12中任一项所述的方法，其中所述碱为非重金属 常见可溶性碱。
14、根据权利要求 1-12中任一项所述的方法，其中所述碱性物质为氨 水或 NaOH。
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