WO2010150375A1 - 改変型ビオチン結合タンパク質 - Google Patents

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WO2010150375A1
WO2010150375A1 PCT/JP2009/061530 JP2009061530W WO2010150375A1 WO 2010150375 A1 WO2010150375 A1 WO 2010150375A1 JP 2009061530 W JP2009061530 W JP 2009061530W WO 2010150375 A1 WO2010150375 A1 WO 2010150375A1
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residue
seq
biotin
amino acid
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高倉　由光
雅子 綱島
梢 惣福
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日本たばこ産業株式会社
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/375—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from Basidiomycetes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
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    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/22—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a Strep-tag
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/36—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Actinomyces; from Streptomyces (G)

Definitions

  • the present invention relates to a modified biotin-binding protein.
  • Avidin is a basic glycoprotein derived from egg white and binds strongly to biotin (vitamin H).
  • streptavidin is an avidin-like protein derived from Streptomyces avidinii, and its isoelectric point is neutral and does not contain a sugar chain. Both proteins form a tetramer and bind to one molecule of biotin per subunit. The molecular weight is about 60 kDa.
  • Avidin has an isoelectric point exceeding 10, and due to its high basicity or the presence of sugar chains, nonspecific binding to biomolecules such as DNA and proteins may be problematic.
  • Biotin has a small molecular weight of 244 and is stable to pH change and heat, so it is often used for labeling substances.
  • As a biotinylation method there is a method in which chemically modified biotin is bound to various functional groups such as amino group, carboxyl group, and aldehyde group of protein.
  • Such biotinylation reagents are commercially available, and proteins and nucleic acids can be biotinylated using these reagents.
  • a fusion protein of a target protein and a sequence that is biotinylated by biotin ligase in vivo is expressed as a recombinant protein and fused by the same enzyme in the host cell.
  • biotinylating proteins An example of such a biotinylated sequence is BioEase Tag (registered trademark), which is commercially available as a system for expressing proteins in E. coli, Drosophila cells, or mammalian cells in a biotinylated state in vivo.
  • avidin and streptavidin with reduced biotin binding properties have been reported so far.
  • nitrated avidin and nitrated streptavidin in which a tyrosine residue contributing to the binding to biotin is nitrated have been developed. They bind strongly to biotin when acidic to neutral (pH 4 to 7.5) and dissociate when alkaline (pH 10).
  • Nitrated avidin-agarose is commercially available as CaptAvidin-agarose. However, nitration takes time and the efficiency is not constant. Moreover, extreme pH changes may adversely affect biotinylated proteins and the like.
  • each subunit is named A, B, C, D
  • the 55th in subunit A Is present at a position close to the 59th arginine of subunit B.
  • the 76th threonine in subunit A is located very close to the 76th threonine and 59th alanine on subunit B.
  • the 109th leucine in subunit B interacts with the 125th valine on subunit A.
  • 125th valine in subunit A is 109th leucine on subunit D, 120th tryptophan, 123th threonine, 125th valine, 109th leucine on subunit B, on subunit C It interacts extensively with the 107th glutamine. Therefore, by substituting these amino acids with highly polar amino acids such as arginine, lysine, histidine, aspartic acid, glutamic acid, asparagine, glutamine, threonine, etc., charge repulsion between subunits and steric hindrance are caused. It can be expected to generate. Among polar amino acids, arginine with the lowest Hydrophathy index is considered to have a great effect.
  • the dissociation constant KD
  • M 10 ⁇ 7
  • the biotin binding ability is too strong to efficiently dissociate the desired biotinylated substance. This is because the desired biotinylated substance cannot be sufficiently bound due to its weak ability (Wu and Wong (2006) Protein Expr. Purif. 46: 268-27).
  • Mutants with dissociation constants of 10 ⁇ 8 to 10 ⁇ 7 (M) have moderate biotin binding capacity for applications such as affinity chromatography (Queshi and Wong (2002) Protein Expr. Purif. 25: 409-415; Wu and Wong (2006) Protein Expr. Purif. 46: 268-273).
  • affinity chromatography Queshi and Wong (2002) Protein Expr. Purif. 25: 409-415; Wu and Wong (2006) Protein Expr. Purif. 46: 268-273.
  • Affinity chromatography often uses a crude cell extract mixed with various substances, but the crude cell extract often contains proteases, and monomers are not suitable for use in such applications. There was a problem.
  • the hydrophobic region hidden by the bond between the subunits is exposed, so that the solubility of the whole protein may be lowered, and it may cause reaggregation.
  • monomers designed so far with avidin as a model for example, Promega SoftLink Soft Release Avidin Resin
  • avidin for example, Promega SoftLink Soft Release Avidin Resin
  • the monomers associate to form a tetramer.
  • the affinity with biotin is increased.
  • biotin capable of sufficiently binding a desired biotinylated substance and having a biotin-binding ability that can be dissociated, highly soluble in Escherichia coli, and further resistant to protease.
  • No binding protein has been known so far.
  • tamavidin 1 and tamavidin 2 which are novel avidin-like biotin-binding proteins from edible mushrooms (Pueurotus koncopiae) (WO02 / 072817). Tamavidin 1 and tamavidin 2 can be expressed in large quantities in E. coli, and tamavidin 2 was particularly easily prepared by purification using an iminobiotin column (WO02 / 072817). Tamavidin 1 and tamavidin 2 bound very strongly to biotin. In particular, tamavidin 2 showed a biotin binding activity at almost the same level as avidin and streptavidin. Tamavidin 2 is a biotin-binding protein that is superior in heat resistance as compared to avidin and streptavidin, and that has less non-specific binding than avidin.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a biotin-binding protein that can be highly expressed in Escherichia coli and that can be easily purified with a biotin-immobilized carrier.
  • the present inventors have the ability to bind to a desired biotinylated substance sufficiently and have a biotin-binding ability that can be dissociated. Furthermore, the present inventors have succeeded in obtaining a stable modified biotin-binding protein having protease resistance, and arrived at the present invention.
  • the present invention relates to modified biotin having the above properties by modifying the amino acid sequence (SEQ ID NO :) of natural tamavidin 2 (hereinafter sometimes referred to as “TM2” in the present specification). A binding protein was obtained.
  • SEQ ID NO : amino acid sequence of natural tamavidin 2
  • the present invention preferably includes the following embodiments.
  • Aspect 1 In a protein showing biotin-binding activity, comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, or an amino acid sequence having one to a plurality of amino acid mutations in this sequence, or an amino acid sequence having 80% or more identity with this sequence , The following groups: 1) Substitution of the 36th serine residue of SEQ ID NO: 2 with an amino acid residue that does not form a hydrogen bond; 2) substitution of the 80th tryptophan residue of SEQ ID NO: 2 with a hydrophilic amino acid residue; 3) Substitution of the 116th aspartic acid residue of SEQ ID NO: 2 to an amino acid residue that does not form a hydrogen bond; 4) Substitution of the 46th proline residue of SEQ ID NO: 2 with a threonine, serine or tyrosine residue, and substitution of the 78th threonine residue with an amino acid residue that does not form a hydrogen bond; 5) Sub
  • a protein showing biotin-binding activity comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, or an amino acid sequence having one to a plurality of amino acid mutations in this sequence, or an amino acid sequence having 80% or more identity with this sequence .
  • A) -l) below a) the 14th asparagine residue of SEQ ID NO: 2 is unaltered or substituted with glutamine or aspartic acid; b) the 18th serine residue of SEQ ID NO: 2 is not modified or substituted with threonine or tyrosine; c) the 34th tyrosine residue of SEQ ID NO: 2 is not modified or substituted with serine or threonine; d) the 36th serine residue of SEQ ID NO: 2 is not modified or substituted with threonine or tyrosine; e) The 40th aspartic acid residue of SEQ ID NO: 2 is not modified or substituted with a residue other than asparagine; f) The 69th tryptophan residue of SEQ ID NO: 2 is not modified; g) the 76th serine residue of SEQ ID NO: 2 is not modified or substituted with threonine or tyrosine; h) the 78th thre
  • a modified TM2 having a biotin-binding activity with an appropriate strength that enables high-soluble expression in Escherichia coli and enables binding and dissociation with biotin is provided.
  • the modified TM2 of the present invention can be immobilized on a carrier, for example, and subjected to affinity chromatography for purifying a biotinylated substance.
  • FIG. 1A is a photograph showing the purification of wild type tamavidin 2 (WT-TM2: left side) and TM2 S36A (right side), FIG. 1B is TM2 T78A, and FIG. 1C is TM2 D116A purified by biotin-agarose. After each protein was bound to biotin-agarose, elution was performed by adding PBS (pH 7.4) containing 10 mM biotin. An equal amount of 2 ⁇ SDS Sample Buffer was added to each fraction solution, treated at 95 ° C. for 10 minutes, and applied to SDS-PAGE, followed by Coomassie Brilliant Blue (CBB) staining.
  • WT-TM2 wild type tamavidin 2
  • TM2 S36A right side
  • FIG. 1B is TM2 T78A
  • FIG. 1C is TM2 D116A purified by biotin-agarose. After each protein was bound to biotin-agarose, elution was performed by adding PBS (pH
  • FIG. 2A is a photograph showing the purification of TM2 P46TD116A
  • FIG. 2B is the purification of TM2 P46TT78AD116A
  • FIG. 2C is the purification of T78AD116A with biotin-agarose. Elution was performed by adding PBS (pH 7.4) containing 10 mM biotin.
  • FIG. 2D is a photograph showing the purification of TM2 P46TT78A with iminobiotin-agarose and biotin-agarose.
  • FIG. 3A is a photograph showing the purification of TM2 S36A-D116A
  • FIG. 3B is the purification of TM2 S36A-T78A-D116A using biotin-agarose.
  • TM2 S36A-D116A is bound to biotin-agarose at pH 5, or pH 6, or pH 7, and when bound at pH 5 and pH 6, when bound at pH 7 with a pH 4 potassium phosphate buffer containing 500 mM NaCl. Were washed with a pH 7 potassium phosphate buffer containing 500 mM NaCl. Thereafter, 1 mL of pH 7 potassium phosphate buffer was added when bound at pH 5 or pH 6, and 1 mL of pH 7.4 PBS containing 10 mM biotin was added when bound at pH 7.
  • TM2 S36A-T78A-D116A was combined with biotin-agarose in a pH 4 or pH 7 potassium phosphate buffer or a pH 12 50 mM CAPS buffer, and then washed, and a pH 7 100 mM potassium phosphate buffer was added. 1 mL was added and eluted. An equal amount of 2 ⁇ SDS Sample Buffer was added to each fraction solution, followed by treatment at 95 ° C. for 10 minutes, and after donating to SDS-PAGE, CBB staining was performed.
  • FIG. 4 shows various modified tamavidins 2 (TM2 S36A (FIG. 4A), TM2 T78A, TM2 D116A, TM2 T78A-D116A (above FIG.
  • FIG. 4C shows various modified tamavidins 2 (TM2 S36A-D116A (FIG. 5A, C), TM2 T78A, TM2 P46T-T78A (above FIG.
  • FIG. 5A is a photograph showing the Protease resistance of TM2, W80K, TM2, P46T-T78A-D116A (FIG. 5D).
  • FIG. 6 is a photograph showing the thermal stability of TM2 T78A.
  • TM2 T78A was heat-treated for 20 minutes in 1 ⁇ SDS Sample Buffer at a predetermined temperature in the presence and absence of biotin, and then donated to SDS-PAGE for CBB staining.
  • FIG. 7 is a photograph showing the purification of biotinylated BSA by TM2 S36A-Sepharose.
  • FIG. 8A is a photograph showing purification of biotinylated BSA by TM2 D116A-Sepharose, FIG. 8B by TM2 P46TT78A-Sepharose, and FIG. 8C by TM2 P46TD116A-Sepharose.
  • Biotinylated BSA or Escherichia coli extract and biotinylated BSA are purified with each carrier before purification (total), through column (flow-through) fraction (FT), washed fraction (W), elution fraction An equal amount of 2 ⁇ SDS Sample Buffer was added to each minute (Elu) solution, treated at 95 ° C. for 10 minutes, and supplied to SDS-PAGE.
  • FIG. 9 is a photograph showing the pH dependence of the binding of biotinylated BSA to TM2 S36A-D116A-sepharose.
  • Tamavidin Tamavidin are novel biotin-binding proteins that were discovered from Basidiomycetes Pleurotus cornucopiae (Pleurotus conucopiae) an edible mushroom (WO02 / 072817).
  • the literature includes: -Amino acid homology between tamavidin 1 and tamavidin 2 is 65.5% and binds strongly to biotin; -Tamavidin 2 is highly expressed in the soluble fraction in E. coli; and -When tamavidin 2 is expressed in E. coli, about 4.5 mg of purified purified recombinant protein per 50 ml of culture is obtained in 4.5 hours of culture. Obtained. This is very high compared to avidin and streptavidin known as biotin-binding proteins; It is described.
  • “Tamavidin 2” in the present specification means tamavidin 2 (TM2) or a variant thereof.
  • the present invention provides a modified TM2 that enables a reversible reaction with biotin by modifying a specific amino acid residue of TM2 or a variant thereof.
  • the terms “tamavidin 2” and “TM2” mean wild-type TM2 and variants thereof unless otherwise specified. However, depending on the meaning of the sentence, it may be used as a general term for the wild type, mutant type, and modified type of the present invention, including the modified TM2 of the present invention.
  • TM2 is sometimes referred to as “biotin-binding protein” in the present specification because TM2 exhibits biotin-binding properties.
  • TM2 wild type is typically a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or a protein encoded by a nucleic acid comprising the base sequence of SEQ ID NO: 1, Good.
  • TM2 is a variant of a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or a protein encoded by a nucleic acid comprising the base sequence of SEQ ID NO: 1, and has the same biotin binding as tamavidin 2 It may be a protein having activity.
  • the variant of TM2 may be a protein comprising an amino acid sequence containing one or more amino acid deletions, substitutions, insertions and / or additions in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the substitution may be a conservative substitution, which is the replacement of a particular amino acid residue with a residue having similar physicochemical characteristics.
  • conservative substitutions include substitutions between aliphatic group-containing amino acid residues such as substitutions between Ile, Val, Leu or Ala, Lys and Arg, Glu and Asp, Gln and Asn Substitution between polar residues such as substitution is included.
  • Mutants resulting from amino acid deletion, substitution, insertion and / or addition may be performed on, for example, site-directed mutagenesis (for example, Nucleic Acid Research, Vol. 10, No. 20), which is a well-known technique, to DNA encoding a wild-type protein. , P. 6487-6500, 1982, the entire contents of which are incorporated herein by reference).
  • site-directed mutagenesis for example, Nucleic Acid Research, Vol. 10, No. 20
  • one or more amino acids means amino acids that can be deleted, substituted, inserted and / or added by site-directed mutagenesis.
  • “one or more amino acids” may mean one or several amino acids depending on the case.
  • Site-directed mutagenesis can be performed, for example, using a synthetic oligonucleotide primer complementary to the single-stranded phage DNA to be mutated, in addition to the specific mismatch that is the desired mutation, as follows: . That is, the synthetic oligonucleotide is used as a primer to synthesize a strand complementary to the phage, and a host cell is transformed with the obtained double-stranded DNA. Transformed bacterial cultures are plated on agar and plaques are formed from single cells containing phage. Then, theoretically 50% of the new colonies contain phages with mutations as single strands and the remaining 50% have the original sequence.
  • the obtained plaque is hybridized with a synthetic probe labeled by kinase treatment at a temperature that hybridizes with the DNA having the desired mutation and that does not hybridize with DNA having the original strand. .
  • plaques that hybridize with the probe are picked up and cultured to recover DNA.
  • TM2 in the present invention is a protein having an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted or added in SEQ ID NO: 2 and having biotin-binding activity.
  • the variant of TM2 is further at least 80% or more, preferably 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. More preferably, it may be a protein comprising an amino acid sequence having 99.3% or more amino acid identity and having a biotin-binding activity similar to that of TM2.
  • The% identity between two amino acid sequences may be determined by visual inspection and mathematical calculation. Alternatively, the percent identity of two protein sequences can be determined by Needleman, S .; B. And Wunsch, C.I. D. (J. Mol. Biol., 48: 443-453, 1970) and determined by comparing sequence information using the GAP computer program available from the University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). May be.
  • Preferred default parameters for the GAP program include: (1) Henikoff, S .; And Henikoff, J.H. G. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10915-10919, 1992), scoring matrix, blossum 62; (2) gap weight of 12, (3) gap length weight of 4; And (4) no penalty for end gaps.
  • the percent identity can be determined by comparison with sequence information using, for example, the BLAST program described in Altschul et al. (Nucl. Acids. Res., 25, p. 3389-3402, 1997).
  • the program can be used on the Internet from the National Center for Biotechnology Information (NCBI) or the DNA Data Bank of Japan (DDBJ) website.
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • DDBJ DNA Data Bank of Japan
  • Various conditions (parameters) for identity search by the BLAST program are described in detail on the same site, and some settings can be changed as appropriate, but the search is usually performed using default values.
  • the percent identity between two amino acid sequences can be determined by genetic information processing software GENETYX Ver. It may be determined using a program such as 7 (manufactured by Genetics) or the FASTA algorithm. At that time, the default value may be used for the search.
  • the percent identity between two nucleic acid sequences can be determined by visual inspection and mathematical calculation, or more preferably, this comparison is made by comparing the sequence information using a computer program.
  • a typical preferred computer program is the Wisconsin package, version 10.0 program “GAP” from the Genetics Computer Group (GCG; Madison, Wis.) (Devereux, et al., 1984, Nucl. Acids Res. , 12: 387).
  • GAP Genetics Computer Group
  • two amino acid sequences can be compared, and a nucleic acid sequence and an amino acid sequence can be compared.
  • GAP GCG run of an unary comparison matrix for nucleotides (including values of 1 for identical and 0 for non-identical), and Schwartz and Dayhoff supervised “Atlas of Polypeptide Sequence and Structure” National Biomedical Research Foundation, pages 353-358, 1979, Gribskov and Burgess, Nucl. Acids Res. 14: 6745, 1986 weighted amino acid comparison matrix; or other comparable comparison matrix; (2) 30 penalties for each gap of amino acids and one additional penalty for each symbol in each gap; or nucleotide sequence Includes 50 penalties for each gap and an additional 3 penalties for each symbol in each gap; (3) no penalty to end gaps; and (4) no maximum penalty for long gaps.
  • sequence comparison programs used by those skilled in the art are available, for example, at the National Library of Medicine website: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.html
  • a BLASTN program, version 2.2.7, or UW-BLAST 2.0 algorithm can be used. Standard default parameter settings for UW-BLAST 2.0 are described at the following Internet site: http://blast.wustl.edu.
  • the BLAST algorithm uses a BLOSUM62 amino acid scoring matrix and the selection parameters that can be used are: (A) Segments of query sequences with low compositional complexity (Woughton and Federhen SEG program (Computers and Chemistry, 1993); Woton and Federhen, 1996 “Analysis of compositional weight region in sequence database (Analysis of compositionally-biased in sequence data bases): 71-66”.
  • E-score Karlin and Altschul, 1990
  • the preferred E-score threshold value is 0.5 or, in order of increasing preference, 0.25, 0.1, 0.05, 0.01, 0.001, 0 .0001, 1e-5, 1e-10, 1e-15, 1e-2 A 1e-25,1e-30,1e-40,1e-50,1e-75 or 1e-100,.
  • a variant of TM2 is also a protein encoded by a nucleic acid comprising a base sequence that hybridizes to a complementary strand of the base sequence of SEQ ID NO: 1 under stringent conditions and has the same binding activity as TM2. It may be.
  • under stringent conditions means to hybridize under moderately or highly stringent conditions.
  • moderately stringent conditions can be easily determined by those skilled in the art having general techniques based on, for example, the length of the DNA.
  • Basic conditions are shown in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Chapter 6, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001, for example, 5 ⁇ SSC, 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA (PH 8.0) pre-wash solution, about 50% formamide at about 42 ° C., 2 ⁇ to 6 ⁇ SSC, preferably 5 ⁇ to 6 ⁇ SSC, 0.5% SDS (or about 42 ° C.
  • hybridization solutions such as Stark solution in 50% formamide
  • moderately stringent conditions include hybridization conditions (and washing conditions) of about 50 ° C., 6 ⁇ SSC, 0.5% SDS.
  • High stringency conditions can also be readily determined by one skilled in the art based on, for example, the length of the DNA.
  • these conditions include hybridization at higher temperatures and / or lower salt concentrations than moderately stringent conditions (eg, containing about 0.5% SDS, about 65 ° C., 6 ⁇ SSC to 0. 2 ⁇ SSC, preferably 6 ⁇ SSC, more preferably 2 ⁇ SSC, more preferably 0.2 ⁇ SSC, or even 0.1 ⁇ SSC) and / or washing, for example hybridization as described above Defined with conditions and washing at approximately 65 ° C. to 68 ° C., 0.2 ⁇ to 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS.
  • moderately stringent conditions eg, containing about 0.5% SDS, about 65 ° C., 6 ⁇ SSC to 0. 2 ⁇ SSC, preferably 6 ⁇ SSC, more preferably 2 ⁇ SSC, more preferably 0.2 ⁇ SSC, or even 0.1 ⁇ SSC
  • moderately stringent conditions eg, containing about 0.5% SDS, about 65 ° C., 6 ⁇ SSC to 0. 2 ⁇ SSC
  • SSC 1 ⁇ SSC is 0.15 M NaCl and 15 mM sodium citrate
  • SSPE 1 ⁇ SSPE is 0.15 M NaCl, 10 mM NaH 2 PO 4 , and 1. 25 mM EDTA, pH 7.4
  • washing is performed for 15 minutes to 1 hour after hybridization is completed.
  • hybridization kit that does not use a radioactive substance for the probe can be used.
  • hybridization using an ECL direct labeling & detection system can be mentioned.
  • ECL direct labeling & detection system manufactured by Amersham
  • For stringent hybridization for example, 5% (w / v) Blocking reagent and 0.5M NaCl are added to the hybridization buffer in the kit, and the reaction is performed at 42 ° C. for 4 hours.
  • a condition is that 20% is performed twice at 55 ° C. for 20 minutes in 4% SDS, 0.5 ⁇ SSC, and once at room temperature for 5 minutes in 2 ⁇ SSC.
  • the biotin-binding activity of the TM2 mutant can be measured by any known method. For example, it may be measured by a method using fluorescent biotin as described in Kada et al. (Biochim. Biophys. Acta., 1427: 33-43 (1999)). This method is an assay system utilizing the property that the fluorescence intensity of fluorescent biotin disappears when fluorescent biotin binds to the biotin binding site of the biotin binding protein. Alternatively, the biotin-binding activity of the mutant protein can be evaluated using a sensor capable of measuring the binding between the protein and biotin, such as a biosensor based on surface plasmon resonance.
  • Modified tamavidin (type I) of the present invention has as one aspect, A protein having biotin-binding activity, comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, or an amino acid sequence having one to a plurality of amino acid mutations in this sequence, or an amino acid sequence having 80% or more identity with this sequence ( TM2 or TM2 (mutant))
  • the following groups 1) Substitution of the 36th serine residue of SEQ ID NO: 2 with an amino acid residue that does not form a hydrogen bond; 2) substitution of the 80th tryptophan residue of SEQ ID NO: 2 with a hydrophilic amino acid residue; 3) Substitution of the 116th aspartic acid residue of SEQ ID NO: 2 to an amino acid residue that does not form a hydrogen bond; 4) Replacement of the 46th proline residue of SEQ ID NO: 2 with a threonine, serine or tyrosine residue, and replacement of the 78th threonine residue with an amino acid residue that does
  • tamavidin 2 (TM2) is as defined above.
  • substitution with an amino acid residue that does not form a hydrogen bond means substitution with an amino acid residue that is considered not to form a hydrogen bond with biotin.
  • Specific examples include, but are not limited to, amino acids with nonpolar or hydrophobic R groups such as alanine (A), valine (V), leucine (L), isoleucine (I), methionine ( M), tryptophan (W), phenylalanine (F), proline (P), and the like may be substituted from amino acid residues other than these.
  • a modified form in which serine, threonine or aspartic acid is substituted with alanine (A) in the following modified TM2 is described.
  • substitution with a hydrophilic amino acid residue means substitution with an amino acid residue that is generally considered to be hydrophilic in this technical field. Specific examples include, but are not limited to, polar amino acids, among which lysine (K), arginine (R), and histidine (R) having a positively charged R group at physiological pH. H), substitution with aspartic acid (D) or glutamic acid (E) having an R group having a negative charge at physiological pH, and tryptophan is converted to lysine (K) in the following modified TM2. State the replacement.
  • Such a modified TM2 is preferably 1-a) Modified biotin-binding protein (TM2 S36A) in which the serine residue at position 36 in SEQ ID NO: 2 is substituted with alanine, 2-a) Modified biotin-binding protein (TM2 W80K) in which the 80th tryptophan residue of SEQ ID NO: 2 is substituted with lysine, 3-a) a modified biotin-binding protein (TM2 D116A) in which the 116th aspartic acid residue of SEQ ID NO: 2 is substituted with alanine, 4-a) a modified biotin-binding protein (TM2 P46T-T78A) in which the 46th proline residue of SEQ ID NO: 2 is substituted with threonine and the 78th threonine residue is substituted with alanine, 5-a) a modified biotin-binding protein (TM2 P46T-D116A) in which the 46th proline residue of SEQ ID NO: 2 is
  • Such modified TM2 preferably has the following properties: i) Purification using biotin is possible. ii) maintaining the tetrameric structure of the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; iii) resistant to proteases, iv) high expression in the soluble fraction of E. coli, 1 to all of
  • purification using biotin means that the target protein has an appropriate biotin-binding ability and can bind and dissociate with biotin.
  • biotinylated substance such as biotinylated protein
  • the modified TM2 is a low-affinity tamavidin having a smaller biotin binding ability than the wild-type TM2.
  • “maintaining a tetrameric structure” means substantially maintaining the tetrameric subunit structure of natural TM2. Specifically, it means a state having the same molecular weight as wild type TM2.
  • the molecular weight of the modified TM2 can be measured by high-speed protein liquid chromatography (Fast protein liquid chromatography (FPLC)) and compared with the molecular weight of TM2.
  • FPLC protein liquid chromatography
  • “having resistance to protease” means that the protein is not enzymatically degraded or substantially not degraded by the protease treatment.
  • treatment with protease K is performed at 30 ° C. for 15 minutes.
  • “Non-enzymatic degradation” means that the tetramer, dimer and / or monomer bands of the protein can be clearly detected even after SDS-PAGE after enzyme treatment, as in wild-type TM2. means.
  • proteins that are not resistant to proteases are degraded to small molecules by protease treatment, and tetramer, dimer, and monomer bands cannot be detected in SDS-PAGE after protease treatment.
  • the tetramer structure is maintained without being completely decomposed by protease treatment. And in SDS-PAGE, it is detected as a tetramer and / or a dimer or monomer band from which the tetramer is dissociated.
  • “high expression in the soluble fraction of E. coli” means that a desired gene is incorporated into an expression vector, introduced into E. coli, and then expressed in an appropriate medium at an appropriate temperature and under conditions for inducing expression.
  • the recombinant protein is produced in Escherichia coli in a soluble fraction after disruption of the cells sufficiently to be identifiable, preferably about the same as or more than wild type TM2.
  • Means. it means that 1 mg or more, preferably 5 mg or more, 10 mg or more, 15 mg or more, particularly preferably 20 mg or more is expressed per liter of culture solution.
  • TM2 S36A and TM2 D116A are modified in TM2 that are considered to be hydrogen-bonded to biotin and highly expressed in the soluble fraction of E. coli.
  • these variants TM2 maintain a tetrameric structure and have high resistance to proteases.
  • biotin-binding ability of these modified TM2s is a single amino acid variant, the ability to bind biotin to it is reduced to a degree sufficient to cause a reversible reaction with biotin, Biotinylated proteins can be purified very efficiently.
  • TM2 S36A and “TM2 D116A” are very excellent biotin reversible binding proteins that can solve the problems of conventional low binding ability biotin binding proteins.
  • TM2 W80K is a modified part of TM2 that is considered to be hydrophobically bound to biotin, and is obtained by modifying the 80th tryptophan of wild type TM2 (SEQ ID NO: 2) to lysine.
  • TM2 W80K is highly expressed in the soluble fraction of E. coli. In addition, it maintains the tetramer structure and has high resistance to proteases. Furthermore, the biotin-binding ability of these mutants has been reduced to a degree sufficient to cause a reversible reaction with biotin, even though it is a single amino acid variant. It can be purified very efficiently. Moreover, even if an iminobiotin column is used, it can be purified very efficiently. Therefore, W80K is a very excellent protein having the property of reversibly binding biotin, which has solved the problems of conventional low-binding ability biotin-binding proteins.
  • TM2 P46T-T78A and TM2 P46T-D116A are modified sites that are considered to be involved in binding between tamavidin subunits and that are considered to be hydrogen-bonded to biotin.
  • the amino acid homology of both is 48% as a whole
  • the 55th valine (Val) and 76th threonine (Thr) in streptavidin were examined.
  • 109th leucine (Leu) and 125th valine (Val) are 46th proline (Pro), 66th alanine (Ala), 97th leucine (Leu), 113th respectively in TM2. It was thought to be valine (Val).
  • TM2 P46T in which the 46th proline considered to be involved in the intersubunit binding of TM2 is changed to threonine is a mutant intended to weaken the intersubunit binding, but maintains the tetramer. ing. And the biotin binding ability is very high unexpectedly, and even if an excessive amount of biotin is added, the biotinylated substance cannot be eluted.
  • the mutant in which the 78th threonine or 116th aspartic acid is modified to alanine in this TM2 P46T, which is considered to be a hydrogen bond with biotin has a biotin binding ability changed to an appropriate level and biotinylation The material can be fully purified.
  • TM2 P46T-T78A-D116A combining all these mutations can also sufficiently purify the biotinylated substance.
  • Modified tamavidin (type II) of the present invention has one aspect, A protein having biotin-binding activity, comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, or an amino acid sequence having one to a plurality of amino acid mutations in this sequence, or an amino acid sequence having 80% or more identity with this sequence ( TM2 or TM2 (mutant)) 6) It has the substitution to the amino acid residue which does not form the hydrogen bond of the 78th threonine residue of sequence number 2.
  • Such a modified TM2 is preferably 6-a) A modified biotin-binding protein (TM2 T78A) in which the 78th threonine residue of SEQ ID NO: 2 is substituted with an alanine residue.
  • TM2 T78A modified biotin-binding protein
  • tamavidin 2 (TM2) is as defined above.
  • substitution with an amino acid residue that does not form a hydrogen bond is as defined above.
  • Such modified TM2 preferably has the following properties: i) Purification using biotin is possible. ii) maintaining the tetrameric structure of the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; iii) resistant to proteases, v) It has higher heat resistance than the protein consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2. 1 to all of
  • “having high heat resistance” means having heat resistance equivalent to or higher than that of the wild type.
  • the Tr value temperature at which the quantity ratio of monomer to tetramer is 1: 1 when heat-treated for 20 minutes in the presence of SDS is compared to natural TM2, In the absence of biotin, it means preferably about the same, more preferably 5 ° C. or higher, more preferably 10 ° C. or higher.
  • TM2 T78A has a low recovery rate by iminobiotin-agarose from E. coli soluble fraction, but a high recovery rate by biotin-agarose (about 95%), maintains a tetramer and has protease resistance.
  • TM2 T78A is a single amino acid variant like TM2 S36A and TM2 D116A, biotin-binding ability is moderately reduced, and biotinylated protein can be purified (recovery rate is 40 % To 50%).
  • TM2 T78A has a Tr value of 88 ° C in the absence of biotin, which is 10 ° C higher than that of TM2 (78 ° C), and has a Tm value of 100 ° C or higher when biotin is bound. Is a very high protein.
  • the modified TM2 of the present invention has one aspect, A protein having biotin-binding activity, comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, or an amino acid sequence having one to a plurality of amino acid mutations in this sequence, or an amino acid sequence having 80% or more identity with this sequence ( TM2 or TM2 (mutant))
  • the following groups 7) Substitution of the 36th serine residue of SEQ ID NO: 2 to an amino acid residue that does not form a hydrogen bond, and substitution of the 116th aspartic acid residue to an amino acid residue that does not form a hydrogen bond; and 8) Substitution of the 36th serine residue of SEQ ID NO: 2 to an amino acid residue that does not form a hydrogen bond, substitution of the 78th threonine residue to an amino acid residue that does not form a hydrogen bond, and the 116th aspartic acid residue It is characterized by having a substitution selected from substitutions with amino acid residues that do not form
  • tamavidin 2 (TM2) is as defined above.
  • substitution with an amino acid residue that does not form a hydrogen bond is as defined above.
  • Such a modified TM2 is preferably 7-a) Modified biotin-binding protein (TM2 S36A-D116A) in which the 36th serine residue of SEQ ID NO: 2 is substituted with alanine and the 116th aspartic acid residue is substituted with alanine And 8-a) the 36th serine residue of SEQ ID NO: 2 is substituted with alanine, the 78th threonine residue is substituted with alanine, and the 116th aspartic acid residue is replaced with alanine Replaced modified biotin binding protein (TM2 S36A-T78A-D116A) Selected from the group consisting of
  • Such modified TM2 has the following properties: i) purification with biotin is possible; iii) resistant to proteases, vi) binds to biotin under mildly acidic conditions and does not bind to biotin under neutral conditions; 1 to all of
  • the modified tamavidin of this embodiment shows a special pH dependency.
  • weakly acidic means a hydrogen ion index in the range of pH 4 to pH 6.
  • Negtral means a hydrogen ion index in the range of pH 7 to pH 8.
  • TM2 S36A-D116A has a recovery rate from the E. coli soluble fraction of 95%, a purity of 95% (when bound at pH 4 and dissociated at pH 7), maintains a tetramer, and has protease resistance. It has a very specific pH dependency with respect to biotin binding. To date, no biotin-binding protein that does not bind to biotin near neutrality (around pH 7) has been known. This “TM2 S36A-D116A” binds biotin very efficiently under mildly acidic conditions (about pH 4-6), whereas it does not bind biotin at all under neutral and alkaline conditions (pH 7, pH 12). It has completely different characteristics from conventional biotin-binding proteins. Therefore, if this modified substance is used, the target substance can be purified under mild conditions without being denatured by exposure to strong alkaline conditions.
  • alkaline condition means a hydrogen ion index within a range of pH 9 to pH 13.
  • TM2 S36A-T78A-D116A is highly expressed in the soluble fraction of E. coli. In addition, it maintains the dimer structure and has high resistance to proteases.
  • TM2 S36A-T78A-D116A like “TM2 S36A-D116A”, binds efficiently to biotin under mildly acidic conditions (about pH 4-6), whereas it does not bind to biotin under neutral conditions (pH 7). It has a completely different characteristic from conventional biotin-binding proteins that it does not bind. However, under alkaline conditions, unlike “TM2 S36A-D116A”, it was efficiently bound to biotin in the same manner as under weakly acidic conditions.
  • TM2 S36A-T78A-D116A also has a feature that it does not bind to iminobiotin at all and cannot be purified with iminobiotin. This is in common with the later-described IV type and property vii). The significance of “cannot be purified with iminobiotin” will be described in detail in the description of type IV.
  • Modified tamavidin (type IV) of the present invention has one aspect, A protein having biotin-binding activity, comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, or an amino acid sequence having one to a plurality of amino acid mutations in this sequence, or an amino acid sequence having 80% or more identity with this sequence ( TM2 or TM2 (mutant)) 9)
  • tamavidin 2 (TM2) is as defined above.
  • substitution with an amino acid residue that does not form a hydrogen bond is as defined above.
  • Such a modified TM2 is preferably 9-a) Modified biotin-binding protein (TM2 T78A-D116A) in which the 78th threonine residue of SEQ ID NO: 2 is substituted with alanine and the 116th aspartic acid residue is substituted with alanine It is.
  • TM2 T78A-D116A Modified biotin-binding protein
  • Such modified TM2 has the following properties: i) Purification using biotin is possible. ii) maintaining the tetrameric structure of the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; iii) resistant to proteases, iv) high expression in the soluble fraction of E. coli, vii) 1 to all that cannot be purified with iminobiotin.
  • Iminobiotin cannot be purified means that the target protein does not bind to iminobiotin or the target protein bound to iminobiotin cannot be eluted, so that purification using iminobiotin is impossible. It means that.
  • TM2 T78A-D116A is highly expressed in the soluble fraction of E. coli. It also maintains the tetramer structure and has high resistance to proteases. This variant has a unique property that has never been known that it cannot be purified with iminobiotin but can be purified with biotin very well.
  • the modified body can be used for the following uses, for example.
  • these variants are first injected into the specimen and bound to endogenous biotin in the blood of the specimen. Subsequently, a specific antibody against the antigen is iminobiotinylated, introduced into a specimen, and the cells are labeled with iminobiotin. Finally, a cell can be specifically labeled by injecting into the specimen a protein that binds strongly to biotin, such as radioisotope-labeled or fluorescently-labeled avidin, streptavidin, or tamavidin.
  • biotin such as radioisotope-labeled or fluorescently-labeled avidin, streptavidin, or tamavidin.
  • the endogenous biotin levels are reduced with these variants in advance, so the background is low, and these variants bind to biotin but not iminobiotin. Do not combine.
  • the biotin-binding protein binds to both iminobiotin and biotin, the above-described system cannot be established unless these variants are used.
  • Amino acid modification method The method for modifying the amino acid of TM2 to obtain the modified TM2 of the present invention is not particularly limited, and a known method for mutating an amino acid sequence can be used.
  • the base sequence of the nucleic acid encoding the altered protein of the present invention is modified and altered.
  • the target variant can be obtained by performing PCR using a primer containing a mismatch codon of the target mutation, producing a DNA encoding the target variant and expressing it.
  • a variant by amino acid deletion, substitution, insertion and / or addition can be prepared by a method such as performing site-directed mutagenesis, which is a well-known technique as described above, to a DNA encoding a wild-type protein. .
  • Modification of amino acid residues in the modified TM2 of the modified TM2 modified not be desirable amino acid residues present invention in the present invention, such as purification by modified TM2 has suitable biotin affinity allows modification It is.
  • biotin pocket of streptavidin which is one of the biotin-binding proteins, has already been elucidated.
  • the homology between the amino acid sequences of streptavidin and TM2 is only about 50%, but the inventors compared the amino acid sequences of TM2 and streptavidin in parallel to obtain knowledge about the biotin pocket of TM2.
  • residues N23, S27, Y43, S45, N49, W79, S88, T90, W92, W108, W120, D128 corresponds to N14, S18, Y34, S36, D40, W69, S76, T78, W80, W96, W108, and D116, respectively, in TM2, and is very well preserved. It was found that The biotin binding pockets of TM2 and streptavidin have very similar structures, and these amino acid residues are thought to be greatly involved in biotin binding.
  • streptavidin 49th N was the 40th D (aspartic acid) in TM2, which was an exception.
  • the present inventors have found that the biotin-binding ability is increased in TM2 D40N TM2, which is modified to asparagine in the same manner as streptavidin. Therefore, the modified product in which the 40th aspartic acid is substituted with asparagine has too strong biotin-binding ability, and therefore it is not preferable to use TM2 D40N TM2 in the present invention.
  • the four tryptophan residues (W69, W80, W96, W108) are thought to play an important role in the structure of the biotin pocket. It is desirable not to be modified. Alternatively, when these are modified, it is desirable to modify them to amino acids having similar properties or structures so that the binding to biotin can be maintained, for example, to phenylalanine (F).
  • amino acids considered to be involved in the binding to biotin that is, the amino acid residues (N14, S18, Y34, S36, S76, T78, D116) that are considered to directly interact with biotin in TM2 It is desirable not to modify except for the substitution specified in the above description. Alternatively, when these are modified, it is desirable to modify them to amino acids having similar properties or structures so that the binding to biotin can be maintained.
  • glutamine (Q) or aspartic acid (D ) Preferably to glutamine, in the case of aspartic acid (D40), to other than asparagine (N), in the case of serine (S18, S36, S76), to threonine (T) or tyrosine (Y), preferably threonine In the case of tyrosine (Y34), to serine (S) or threonine (T), preferably to threonine, and in the case of threonine (T78), to serine (S) or tyrosine (Y), preferably to serine, In the case of aspartic acid (D116), glutamic acid (E) or asparagine (N) is preferably used. To Min acid, it is desirable to modify, respectively.
  • Nucleic acid encoding modified TM2 protein The present invention provides a nucleic acid encoding the modified TM2 protein of the present invention.
  • the base sequence of such a nucleic acid is obtained by modifying the base sequence of TM2 (SEQ ID NO: 1) into a base sequence encoding a modified amino acid of the modified TM2 protein.
  • the base sequence to be modified is not limited as long as it is a base sequence encoding the modified amino acid.
  • TM2 gene a nucleic acid comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 (hereinafter referred to as “TM2 gene”) or a complementary strand thereof, hybridizes under stringent conditions, and enables binding and dissociation with biotin.
  • Nucleic acid encoding a protein having a specific biotin-binding activity which includes a nucleic acid whose base sequence is modified in order to carry out the modification of the present invention.
  • the nucleic acid of the present invention preferably encodes any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, and 20. More preferably, the nucleic acid of the present invention consists of the nucleic acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 and 19.
  • the vector containing the nucleic acid of this invention provides the vector containing the nucleic acid which codes modified
  • it is an expression vector for expressing the modified TM2 protein.
  • nucleic acid encoding the modified TM2 protein of the present invention is as described above in “Nucleic acid encoding modified TM2 protein”, and is not particularly limited. It is desirable that a promoter that functions in a desired host is disposed upstream of the nucleic acid encoding the modified TM2 protein, and a terminator is disposed downstream thereof.
  • the vector of the present invention is preferably an expression vector.
  • the expression vector has a unit for allowing replication in a desired host, such as a replication origin, and selects a desired host cell.
  • a desired host such as a replication origin
  • the host is not particularly limited, but is preferably E. coli.
  • an appropriate expression control system such as a lactose repressor system in E. coli may be incorporated into the present expression vector.
  • Carrier on which modified TM2 is immobilized The present invention provides a carrier on which the modified TM2 protein of the present invention is immobilized.
  • a known material can be used for the material constituting the carrier.
  • Examples include, but are not limited to, platinum, silver, copper, iron, stainless steel, ferrite, silicon wafer, polyethylene, polyethyleneimine, polylactic acid, resin, polysaccharide, protein (such as albumin), carbon or combinations thereof. Further, those having a certain strength, a stable composition, and little nonspecific binding are preferable.
  • the shape of the solid support includes, but is not limited to, beads, magnetic beads, thin films, microtubes, filters, plates, microplates, carbon nanotubes, sensor chips, and the like.
  • Flat solid carriers such as thin films and plates may be provided with pits, grooves, filter bottoms, etc., as is known in the art.
  • the beads can have a sphere diameter ranging from about 25 nm to about 1 mm. In preferred embodiments, the beads have a diameter in the range of about 50 nm to about 10 ⁇ m. The size of the beads can be selected depending on the particular application.
  • the binding of the protein to the carrier is not particularly limited, and a known method for binding the protein to the carrier can be used. A specific binding method can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the type of carrier.
  • LATM2 Low Affinity Tamavidin 2
  • LATM2 Low-affinity tamavidin 2
  • the present inventors conducted a comparative study between streptavidin and the amino acid sequence of TM2 based on the knowledge of the crystal structure of streptavidin, and the amino acid residues that interact with biotin in TM2. The group was deduced and the knowledge that their amino acid configuration was similar to that of the amino acid that streptavidin interacts with biotin was obtained.
  • the tryptophan at the 69th, 80th, 96th, and 108th positions of the amino acid sequence of TM2 is an amino acid that is hydrophobically bound to biotin, and the 14th asparagine and 18th serine of the amino acid sequence of TM2.
  • 34th tyrosine, 36th serine, 76th serine, 78th threonine, and 116th aspartic acid were estimated to be amino acids that hydrogen bond with biotin.
  • 46th proline, 66th alanine, 97th leucine and 113th valine are important for binding between subunits in TM2.
  • amino acid mutations were introduced into TM2 for the purpose of reducing the affinity between TM2 and biotin.
  • tryptophan (69th, 80th, 96th, 108th tryptophan) thought to play an important role in the hydrophobic bond with biotin
  • amino acid 14th asparagine, 18th
  • mutagenesis was also performed on amino acid residues considered to be important for binding between subunits (46th proline, 66th alanine, 97th leucine, 113th valine).
  • TM2 W108K TM2 in which 108th tryptophan is replaced with lysine
  • TM2 W69K TM2 in which the 69th tryptophan is replaced with lysine
  • TM2 W80K TM2 in which the 80th tryptophan is replaced with lysine
  • TM2 S36A the base sequence is described in SEQ ID NO: 5 and the amino acid sequence is described in SEQ ID NO: 6
  • TM2 S36A-T78A-D TM2 S36A-T78A-D
  • TM2 P46T-T78A having 46th proline to threonine substitution and 78th threonine to alanine substitution
  • the base sequence is shown in SEQ ID NO: 13
  • the amino acid sequence is SEQ ID NO: 14
  • TM2 having 46th proline to threonine substitution and 116th aspartic acid to alanine substitution (hereinafter referred to as “TM2 P46T-D116A”, the nucleotide sequence is set forth in SEQ ID NO: 15, the amino acid sequence is set to SEQ ID NO: 16).
  • TM2 having 46th proline to threonine substitution, 78th threonine to alanine substitution and 116th aspartic acid to alanine mutation (hereinafter referred to as “TM2 P46T-T78A-D116A”, nucleotide sequence) Is described in SEQ ID NO: 17, and the amino acid sequence is described in SEQ ID NO: 18.)
  • TM2 having 46th proline to threonine substitution, 66th alanine to arginine substitution and 97th leucine to threonine mutation (hereinafter referred to as “TM2 P46T-A66R-L97T”).
  • TM2 W108E TM2 having a mutation from 108th tryptophan to glutamic acid
  • TM2 W108R TM2 having a mutation from the 108th tryptophan to arginine
  • TM2 W96K TM2 having a 96th tryptophan to lysine mutation
  • TM2 S36A-D116A having 36th serine to alanine substitution and 116th aspartic acid to alanine substitution
  • the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 19
  • the amino acid sequence is SEQ ID NO: 20.
  • TM2 S18A TM2 having a mutation from the 18th serine to alanine
  • TM2 T78A-D116A having a substitution of the 78th threonine to alanine and a substitution of the 116th aspartic acid to alanine
  • TM2 Y34A TM2 having a mutation from the 34th tyrosine to alanine
  • TM2 P46T TM2 having a 46th proline to threonine mutation
  • TM2 P46T-L97T TM2 having 46th proline to threonine substitution and 97th leucine to threonine substitution
  • TM2 having 46th proline to threonine substitution, 66th alanine to arginine substitution, 97th leucine to threonine mutation and 113th valine to arginine substitution (hereinafter referred to as “TM2”). P46T-A66R-L97T-V113R ").
  • TM2 A66R-V113R TM2 having 66th alanine to arginine substitution and 113th valine to arginine substitution
  • TM2 having 66th alanine to arginine substitution, 97th leucine to threonine substitution and 113th valine to arginine substitution hereinafter referred to as “TM2 A66R-L97T-V113R”.
  • TM2 L97T TM2 having a 97th leucine to threonine mutation
  • TM2 L97T-V113R having a 97th leucine to threonine mutation and a 113th valine to arginine substitution
  • Primer Tm2 5 ′ Pci, consisting of a sequence of the 5 ′ part region of the TM2 gene and a sequence in which a restriction enzyme PciI cleavage site (ACATGT) is arranged upstream thereof, and a restriction enzyme downstream thereof
  • ACATGT restriction enzyme PciI cleavage site
  • Primer Tm2 3′Bam composed of a sequence in which a BamHI cleavage site (GGATCC) was arranged was designed.
  • a series of sense primers and antisense primers containing mismatch codons for each modified tamavidin 2 are shown in Table 1, respectively. In Table 1, the restriction enzyme recognition site is indicated by an underline, and the mutation introduction site is indicated by a dotted line.
  • RNA amplification by PCR In order to construct the LATM2 gene, two-step PCR was performed.
  • a plasmid in which the TM2 gene is incorporated into the vector pTrc99A is used as a template, and a primer Tm2NtermPci and an antisense primer (TM2-S36A-Rv, TM2-N14A-Rv, TM2 -T78A-Rv, TM2-D116A-Rv, TM2-W108K-Rv, TM2-W108E-Rv, TM2-W108R-Rv, TM2-W96K-Rv, TM2-S18A-Rv, TM2-Y34A-Rv, TM2-W69K -Rv, TM2-W80K-Rv, TM2-P46T-Rv, TM2-V113R-Rv, TM2-L97T-Rv) were used to amplify the 5 ′ portion of the mutant gene.
  • sense primers containing mismatch codons (TM2-S36A-Fw, TM2-N14A-Fw, TM2-T78A-Fw, TM2-D116A-Fw, TM2-W108K-Fw, TM2-W108E-Fw, TM2-W108R-Fw, TM2-W96K-Fw, TM2-S18A-Fw, TM2-Y34A-Fw, TM2-W69K-Fw, TM2-W80K-Fw, TM2-P46T-Fw, TM2-V113R-Fw, TM2-L97T-Fw) And Tm2CtermBam were used to amplify the 3 ′ portion of the mutated gene.
  • PCR reaction conditions are as follows. In a 50 ⁇ L reaction solution, 500 ng of template DNA, 5 ⁇ L of 10 ⁇ Pyrobest buffer (Takara), 4 ⁇ L of 2.5 mM dNTP, 25 pmoles of each primer, 0.5 ⁇ L of Pyrobest DNA polymerase (manufactured by Takara) are added. Then, using Program Temp Control System PC-700 (ASTEK), 96 ° C for 3 minutes once, 96 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute, 72 ° C for 2 minutes 10 times, 72 ° C for 6 minutes once Heating was performed in cycles. As a result, a PCR product having a size as designed was obtained in both the 5 'portion and the 3' portion of the gene.
  • ASTEK Program Temp Control System PC-700
  • PCR products were subjected to agarose electrophoresis in TAE buffer solution using low melting point agarose (SeaPlaqueGTG, CAMBREX). Each DNA fragment was cut out together with the gel, an equal amount of 200 mM NaCl was added to the gel, and treated at 70 ° C. for 10 minutes to melt the gel. This sample was subjected to phenol extraction, phenol / chloroform extraction, and chloroform extraction once, and the DNA fragments of the 5 'portion and 3' portion of the gene were recovered by ethanol precipitation. Second-stage PCR was performed using both the 5 'and 3' DNA fragments of each mutant gene as templates and using primers Tm2NtermPci and Tm2CtermBam. The reaction conditions were the same as in the first stage. As a result, a PCR product of about 430 bp was obtained in any clone.
  • LATM2 gene fragment obtained by PCR was cloned into the vector pCR4 Blunt TOPO (manufactured by Invitrogen). The ligation reaction followed the instructions attached to the vector kit.
  • An electroporation method to introduce DNA into E. coli TB1, and plasmid DNA was extracted according to a conventional method (Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning, A laboratory manual, 2 nd edition).
  • the base sequence of the PCR product was determined from both ends with the ABI PRISM fluorescence sequencer (Model 310 Genetic Analyzer, Perkin Elmer) using the M13 primer (Takara), and the target base It was confirmed that the mutation was introduced.
  • the above plasmid was double-digested with restriction enzymes PciI and BamHI, and gel purification was performed by the method described above to recover the DNA fragment.
  • This fragment was ligated to Escherichia coli expression vector pTrc99A that had been digested with NcoI and BamHI in advance using a ligation kit (manufactured by Takara).
  • the ligation product was transformed into E. coli TB1, plasmid DNA was extracted according to a conventional method, and restriction enzyme analysis was performed to confirm the presence or absence of the inserted gene.
  • LATM2 having two amino acid mutations and LATM2 having three amino acid mutations
  • an expression vector incorporating a gene encoding LATM2 having a point mutation is used as a template, and a mismatch codon for each variant is included. It was constructed by the method described above using primers.
  • E. coli expression of LATM2 E. coli BL21 transformed with each LATM2 / pTrc99A is inoculated into 6 mL of LB medium containing antibiotic ampicillin (final concentration 100 ⁇ g / mL) until the absorbance at OD 600 reaches 0.5. Cultured with shaking at 25 ° C. Thereafter, 1 mM IPTG was added and further cultured with shaking at 25 ° C. overnight. E. coli was collected from 1 mL of the culture solution by centrifugation, suspended in 1500 ⁇ L of 100 mM phosphate buffer (pH 7), and the cells were disrupted by ultrasonic waves. The disrupted solution was centrifuged (15000 rpm), and the supernatant was used as a soluble fraction.
  • the amount of soluble LATM2 protein expressed per liter of the culture broth was about 20 mg, which was the same as that of WT-TM2.
  • TM2 W108R, TM2 W96K, TM2 S18A, and TM2 Y34A were hardly expressed, and thus were not examined further.
  • LATM2 Purification of LATM2 can be performed according to Hofmann et al. (1980) was performed using a column packed with 2-iminobiotin-agarose (manufactured by Sigma). For E. coli transformed with each LATM2, expression was induced by adding IPTG to 25 mL of E. coli culture solution to a final concentration of 1 mM. The cells are collected by centrifugation, suspended in 1.5 mL of 50 mM CAPS (pH 12) containing 50 mM NaCl, 500 ⁇ L of 2-iminobiotin-agarose is added to the centrifuged supernatant after ultrasonic disruption, and the column is added to the column. Filled. The column was thoroughly washed with 50 mM CAPS (pH 12) containing 500 mM NaCl, and then eluted with 50 mM NH 4 OAC (pH 4).
  • biotin-agarose manufactured by Sigma was performed by the following method. Expression was induced in 25 mL of each E. coli culture solution of LATM2, cells were suspended in 1.5 mL of 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0), and 400 ⁇ L of biotin-agarose was added to the supernatant after ultrasonic disruption. After that, it was mixed by inversion for 1 hour. Thereafter, the column was filled with agarose, and the column was thoroughly washed with PBS (pH 7.4) containing 500 mM NaCl, followed by elution with 1 mL of PBS containing 10 mM biotin.
  • PBS pH 7.4
  • TM2 S36A-T78A-D116A was suspended in 1.5 mL of 50 mM CAPS (pH 12) containing 50 mM NaCl, and 400 ⁇ L of biotin-agarose was added to the supernatant after ultrasonic disruption. After mixing by inverting for 1 hour, the column was thoroughly washed with 50 mM CAPS (pH 12) containing 500 mM NaCl, and eluted with 1 mL of PBS (pH 7.4) containing 10 mM biotin.
  • 50 mM CAPS pH 12
  • PBS pH 7.4
  • TM2 S36A-D116A was suspended in 1.5 mL of 100 mM potassium phosphate buffer (pH 4.0), and 400 ⁇ L of biotin-agarose was added to the supernatant after ultrasonic disruption.
  • 100 mM potassium phosphate buffer (pH 4) containing 500 mM NaCl was used and eluted with 1 ml of PBS (pH 7) containing 10 mM biotin. Biotin bound to LATM2 eluted with an excess amount of biotin was removed by dialysis overnight against 20 mM potassium phosphate buffer.
  • Table 2 shows the recovery and purification results for 2-iminobiotin-agarose and biotin-agarose.
  • the recovery rate was expressed as% by multiplying 100 by the amount of LATM2 protein after purification divided by the amount of LATM2 protein before purification.
  • the degree of purification was expressed as% by multiplying the ratio of the amount of LATM2 protein in the total amount of protein in the purified fraction by 100.
  • the recovery and the degree of purification in the biotin-agarose purification are shown as the results when bound at pH 7 and eluted with excess biotin.
  • TM2 P46T, TM2 S36A, TM2 D116A, TM2 P46T-T78A, TM2 P46T-D116A, TM2 P46T-T78A-D116A, TM2 W80K, and TM2 P46T- L97T could be purified to the same extent as wild type TM2 (WT-TM2: recovery rate 95%, purity 95%) in terms of recovery rate and purity.
  • TM2 W108K, TM2 N14A, TM2 T78A, TM2 W108E, and TM2 W69K were purified by 2-iminobiotin-agarose, although the recovery rate was inferior to that of WT.
  • TM2 S36A-T78A-D116A, TM2 S36A-D116A, TM2 A66R, TM2 P46T-A66R, TM2 T78A-D116A, TM2 P46T-A66R-L97T, TM2 A66R-L97T, TM2 A66R-L97T-V97R-T97T-V97R-113 TM2 V113R and TM2 P46T-V113R did not bind to 2-iminobiotin-agarose (manufactured by Sigma) and could not be purified using it. However, all of these LATM2s could bind to biotin-agarose (Sigma) and be purified.
  • TM2 P46T-A66R-L97T-V113R and TM2 A66R-V113R did not bind to 2-iminobiotin-agarose or biotin-agarose.
  • TM2 P46T and TM2 L97T were bound to biotin-agarose, but as with WT-TM2, elution with excess biotin was not possible. This was thought to be due to the extremely strong binding to biotin.
  • FIG. 1A shows the results of purifying WT-TM2 and TM2 S36A with biotin-agarose and analyzing with SDS-PAGE.
  • WT-TM2 is efficiently adsorbed to biotin-agarose as can be seen from the absence of that band in the flow-through (FT) in FIG. 1A.
  • FT flow-through
  • TM2 S36A is also adsorbed to biotin-agarose in the same way, but it is eluted by adding excess biotin and TM2 S36A is added to Elu. Are detected. This reversibility of biotin binding was thought to be caused by the decrease in affinity with biotin by incorporating a mutation into TM2.
  • TM2 S36A-D116A Escherichia coli culture solution 25mL was induced with 1mM IPTG and suspended in 1.5mL of 100mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) or 1.5mL of 50mM CAPS (pH 12.0). It became cloudy and sonicated. Thereafter, centrifugation was performed, and when 400 ⁇ L of biotin-agarose was added to the supernatant after centrifugation, it did not bind to biotin-agarose at all. However, protein extraction with 100 mM potassium phosphate buffer at pH 4.0, pH 5.0, or pH 6.0 efficiently bound to biotin-agarose.
  • TM2 S36A-D116A was dissociated from the carrier and recovered with an efficiency of 95%. That is, in FIG. 3A, the band of TM2 S36A-D116A was recognized as a single band in the elution fraction in the experimental system bound with pH 5 and pH 6 potassium phosphate buffer and eluted with pH 7 potassium phosphate buffer. It was. On the other hand, in the pH 7 potassium phosphate buffer, TM2 S36A-D116A did not bind to biotin-agarose and was found in the flow-through fraction.
  • TM2 S36A-T78A-D116A was also tested for pH dependence. Suspension using a pH 4.0 or pH 12.0 buffer solution, sonication, and addition of biotin-agarose to the supernatant after centrifugation showed binding to biotin-agarose. On the other hand, as with TM2 S36A-D116A, it did not bind to biotin-agarose at pH 7.0. Utilizing this property, high-purity TM2 S36A-T78A-D116A could be obtained by binding to biotin-agarose at pH 4.0 and eluting at pH 7.0 (FIG. 3B).
  • Subunit association state of LATM2 In order to analyze the subunit association state of LATM2, the molecular weight of each LATM2 was measured by FPLC. Sephacryl S-100HR (manufactured by GE Healthcare) was used as the column. Gel Filtration Calibration Kit LMW (manufactured by GE Healthcare) was used as a molecular weight measurement marker. As the buffer, 50 mM potassium phosphate containing 500 mM NaCl was used.
  • the peak position where the tetramer elutes was defined to be 44 to 47 ml. Further, from the result of loading the molecular weight measurement marker, the peak position where the monomer elutes was defined to be around 63 to 66 ml, and the peak position where the dimer was eluted was defined to be around 51 to 54 ml.
  • Table 3 shows the results of analyzing various types of LATM2.
  • TM2 A66R is partially monomeric (about 30% of the total is monomer), and TM2 P46T-A66R, in which a 46th proline to threonine mutation is added, is almost all Was monomerized (about 75% of the total).
  • TM2 P46T-A66R-L97T and TM2 A66R-L97T were 72.8% and 90% monomerized, respectively.
  • TM2 S36A, TM2 T78A, TM2 D116A maintained the tetramer, while TM2 S36A-T78A-D116A existed as a dimer.
  • TM2 W108K exists as a 100% tetramer, whereas TM2 W108E contains a mixture of tetramer and dimer, and the abundance ratios were 33% and 67%, respectively.
  • LATM2 purified with protease resistant biotin-agarose of LATM2 (TM2 S36A, TM2 D116A, TM2 T78A, TM2 W80K, TM2 T78A-D116A, TM2 P46T-T78A, TM2 P46T-D116A, TM2 S36A-D116A, TM2 S36A-T78A-D116A and TM2 P46T-T78A-D116A) were reacted in 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) containing 5 ⁇ M Proteinase K and 5 mM CaCl 2 at 30 ° C. for 15 minutes.
  • Tris-HCl pH 8.0
  • TM2 S36A-D116A was reduced in molecular weight by about half in the presence of Proteinase K, the monomer band was clearly seen and it was shown to be resistant to the enzyme. It was. (FIGS. 5A, C).
  • Heat resistance of LATM2 The heat resistance of LA-TM2 was investigated by SDS-PAGE. Each protein was heat-treated in SDS sample buffer in the presence and absence of biotin at a predetermined temperature for 20 minutes, and then subjected to SDS-PAGE to perform CBB staining.
  • the heating temperatures employed were 80 ° C., 82 ° C., 84 ° C., 86 ° C., 88 ° C., 90 ° C., 92 ° C., and 94 ° C. in the experimental system without biotin, and 86 ° C. and 88 ° C. in the experimental system with biotin added. , 90 ° C, 92 ° C, 94 ° C, 96 ° C, 98 ° C, and 100 ° C.
  • the left side is an experimental system without biotin
  • the right side is an experimental system with biotin.
  • the Tr value in the absence of biotin (the temperature at which the quantity ratio of monomer to tetramer is 1: 1) is 88 ° C.
  • the Tr value of wild type TM2 ( 78 ° C.) was more than 10 ° C.
  • the subunit associating force is increased, so that the tetrameric structure of WT-TM2 and TM2 T78A is stabilized and the heat resistance is considered to be improved.
  • the Tr value of TM2 T78A in the presence of biotin was 100 ° C. or higher. From the above, it was found that the thermal stability was clearly improved in TM2 T78A.
  • Example 2 Purification of biotinylated protein by LATM2 Whether or not biotinylated protein can be efficiently purified using LATM2 prepared as described above was confirmed by preparing a carrier on which LATM2 was immobilized.
  • TM2-S36A-Sepharose was prepared by immobilizing TM2 S36A to Sheparose.
  • TM2 S36A bound to the carrier was calculated by measuring the amount of TM2 S36A remaining in the supernatant and subtracting the value from the amount of protein before addition to the carrier. As a result, 1.01 mg of TM2 S36A corresponding to 86% of the added protein was bound to the carrier.
  • TM2 P46T-T78A When other LATM2 (TM2 P46T-T78A, TM2 P46T-D116A, TM2 D116A) exhibiting similar biotin reversible binding properties were examined, the amount of TM2 P46T-T78A added was 0.853 mg and 25% 0.21 mg of TM2 P46T-D116A was added by 0.761 mg and 93% 0.709 mg was added, TM2 D116A was added by 1.16 mg and 87% of 1.01 mg was bound.
  • biotinylated BSA bovine serum albumin
  • EZ-Link registered trademark
  • NHS-biotin linker length: 13.5 ⁇ , manufactured by PIERCE
  • a purification experiment of biotinylated BSA using the modified low affinity tamavidin of the present invention was performed.
  • the bacterial cell extract used was a suspension of Escherichia coli TB1 cells in 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7.0), which was crushed by ultrasound and the supernatant was collected by centrifugation.
  • the left side is an experimental system in which biotinylated BSA and bacterial cell extract are added to TM2-S36A-Sepharose
  • the right side is an experimental system in which only biotinylated BSA is added to TM2-S36A-Sepharose.
  • biotinylated BSA present in the sample before purification was hardly detected in the flow-through (FT) fraction and the washing solution (W), but in the eluate (Elu).
  • FT flow-through
  • W washing solution
  • Elu eluate
  • biotinylated BSA can be specifically bound and purified from various proteins in the bacterial cell extract using TM2-S36A-Sepharose.
  • the recovery rate of biotinylated BSA was 80%, and the degree of purification was 95%.
  • the band considered to be TM2-S36A was hardly detected in the eluted fraction.
  • FIG. 8A and 8B show an example in which biotinylated BSA is bound to TM2-D116A-Sepaharose or TM2-P46T-T78A-Sepaharose, and biotinylated BSA is recovered at a recovery rate of 60% and a purity of 95%.
  • FIG. 8C shows biotinylated BSA or biotinylated BSA mixed with E. coli cell extract using biotinylated TM2-P46T-D116A-Sepaharose with 80% recovery and 95% purification. An example of purifying BSA was described.
  • LATM2 (TM2 W80K, TM2 T78A-D116A, TM2 P46T-T78A-D116A), which is thought to have a lower biotin affinity than TM2 S36A, was immobilized on Sepharose from the crude E. coli extract. Purification of biotinylated protein (BSA) was examined. As a result, although the purification efficiency was slightly reduced as compared with TM2-S36A-Sepharose, the biotinylated protein could be purified.
  • BSA biotinylated protein
  • TM2-W80K-Sepharose has a recovery rate of 25%, a purification rate of 80%, TM2-T78A-D116A-Sepharose has a recovery rate of 60%, a purification rate of 85%, and TM2 P46T-T78A-D116A-Sepharose.
  • S36A-D116A-Sepharose was prepared in the same manner as in 2-1) above. Biotinylated BSA was bound to the prepared S36A-D116A-sepharose in 100 mM potassium phosphate buffer at pH 5, pH 6, or pH 7. After thoroughly washing with a pH 4 or pH 7 potassium phosphate buffer containing 500 mM NaCl, a pH 7 potassium phosphate buffer was added to elute biotinylated BSA. An equal amount of 2 ⁇ SDS Sample Buffer was added to each fraction solution, treated at 95 ° C. for 10 minutes, then donated to SDS-PAGE, and the protein was silver stained using a Silver Staining II kit (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). .
  • a Silver Staining II kit manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • FIG. 9 shows the results of SDS-PAGE in each sample before purification (total), flow-through fraction (FT), washing solution (W), and eluate (Elu) when bound at pH 5, pH 6, or pH 7. Shown in As shown in FIG. 9, at pH 5 and pH 6, biotinylated BSA bands were observed in the eluate. Therefore, S36A-D116A-sepharose showed a characteristic pH dependence of binding biotinylated protein at pH 5 or pH 6 and dissociating it at pH 7. On the other hand, at pH 7, biotinylated BSA did not bind to S36A-D116A-sepharose.
  • biotinylated protein could be purified under extremely mild pH conditions (for example, binding at pH 5 and elution at pH 7).

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Abstract

　本発明は、配列番号２に記載のアミノ酸配列、あるいはその変異配列を含み、ビオチン結合活性を示すタンパク質において、以下のグループ；　１）配列番号２の３６番目のセリン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換；　２）配列番号２の８０番目のトリプトファン残基の親水性アミノ酸残基への置換；　３）配列番号２の１１６番目のアスパラギン酸残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換；　４）配列番号２の４６番目のプロリン残基のスレオニン、セリン若しくはチロシン残基への置換、及び、７８番目のスレオニン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換；　５）配列番号２の４６番目のプロリン残基のスレオニン、セリン若しくはチロシン残基への置換、及び、１１６番目のアスパラギン酸残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換：並びに　６）配列番号２の４６番目のプロリン残基のスレオニン、セリン若しくはチロシン残基への置換、７８番目のスレオニン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換、及び、１１６番目のアスパラギン酸残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換、 から選択される置換を有することを特徴とする、改変型ビオチン結合タンパク質を提供する。

Description

改変型ビオチン結合タンパク質
　本発明は改変型ビオチン結合タンパク質に関する。
　アビジンは卵白由来の塩基性糖タンパク質で、ビオチン（ビタミンＨ）と強く結合する。一方、ストレプトアビジンは放線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｖｉｄｉｎｉｉ）由来のアビジン様タンパク質で、等電点は中性付近で糖鎖を含まない。両タンパク質とも、四量体を形成し、１つのサブユニット当たり１分子のビオチンと結合する。分子量は６０ｋＤａ程度である。アビジンとビオチン、あるいはストレプトアビジンとビオチンの親和性は非常に高く（Ｋｄ＝１０－１５～－１４Ｍ）、生体二分子間の相互作用としては最も強い。そのため、アビジン／ストレプトアビジン－ビオチン相互作用は、生化学、分子生物学、あるいは医学の分野で広く応用されている。アビジンは、等電点が１０を越え、その高い塩基性、あるいは糖鎖の存在により、ＤＮＡやタンパク質等の生体分子に対する非特異的な結合が問題となる場合がある。
　ビオチンの分子量は２４４と小さく、ｐＨ変化や熱にも安定であるため、物質の標識によく用いられている。ビオチン化の方法としては、化学的な修飾を施したビオチンを、タンパク質のアミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基等の各種の官能基に結合させる方法がある。このようなビオチン化試薬は市販されており、これらを利用してタンパク質や核酸等をビオチン化することができる。またタンパク質のビオチン化の方法の一つとして、生体内のビオチンリガーゼによってビオチン化される配列と、目的のタンパク質との融合タンパク質を、組換えタンパク質として発現させ、宿主細胞内の同酵素によって、融合タンパク質をビオチン化させる方法がある。このようなビオチン化配列として、例えばＢｉｏＥａｓｅ　Ｔａｇ（登録商標）があり、大腸菌やショウジョウバエ細胞、あるいは哺乳類細胞において、タンパク質をｉｎ ｖｉｖｏでビオチン化させた状態で発現させるシステムとして、市販されている。
　アビジンまたはストレプトアビジンと、ビオチンとの結合は極めて強いため、その結合は不可逆的であり、一度結合すると殆ど解離させることが出来ない。この強い結合のため、従来のアビジン、ストレプトアビジンは、そのままでは、ビオチン化生体分子の精製のために必要な、例えばアフィニティクロマトグラフィー等の可逆的な結合を必要とする技術分野へ応用することが出来ない。
　この問題への対策として、これまでにビオチン結合性を低下させたアビジンやストレプトアビジンが報告されている。例えば、ビオチンとの結合に寄与するチロシン残基をニトロ化したニトロ化アビジンやニトロ化ストレプトアビジンが開発された。これらは酸性～中性（ｐＨが４～７．５）の時にビオチンと強く結合し、アルカリ性（ｐＨが１０）の時に解離する。ニトロ化アビジン－アガロースはＣａｐｔＡｖｉｄｉｎ－アガロースとして市販されている。しかしニトロ化には手間がかかり、またその効率も一定ではない。しかも極端なｐＨ変化がビオチン化タンパク質等に悪影響を及ぼす可能性がある。
　一方これまでに、遺伝子工学的にアビジンやストレプトアビジンに、部位特異的アミノ酸変異を導入することによって、ビオチンに対する親和性を下げた例が報告されている。ビオチンとの親和性を低下させる方法として、ビオチン結合ポケットを形成するアミノ酸のうち、ビオチンと直接相互作用するアミノ酸に変異導入する方法と、タンパク質のサブユニット同士の接点に関与するアミノ酸に変異導入する方法の２つがある。
　アビジンの場合、ビオチンと水素結合するアミノ酸に変異を入れることで（Ｍａｒｔｔｉｌａ　ｅｔ　ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ.　３６９：２４９－２５４；　Ｌａｉｔｉｎｅｎ　ｅｔ　ａｌ．（２００３）Ｊ. Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７８：４０１０－４０１４　；　Ｌａｉｔｉｎｅｎ　ｅｔ　ａｌ．（２００１）Ｊ. Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７６：８２１９－８２２４）、あるいはビオチンと疎水結合するアミノ酸に変異を入れることで（Ｌａｉｔｉｎｅｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９９９）ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ.　４６１：５２－５８；　Ｌａｉｔｉｎｅｎ　ｅｔ　ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７８：４０１０－４０１４）、ビオチンへの親和性を下げた組換えタンパク質が報告されている。
　同様にストレプトアビジンの場合も、ビオチンと水素結合するアミノ酸に変異を入れた例（Ｑｕｒｅｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ　２７６：４６４２２－４６４２８；　Ｇａｂｒｉｅｌ　ｅｔ　ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　９５：１３５２５－１３５３０；　Ｑｕｒｅｓｈｉ　ａｎｄ　　Ｗｏｎｇ （２００２）Ｐｒoｔｅｉｎ　Ｅｘｐｒ．　Ｐｕｒｉｆ．２５：４０９－４１５；　Ｗｕ　ａｎｄ　　Ｗｏｎｇ（２００６）Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．４６：２６８－２７３；　Ｗｕ　ａｎｄ　Ｗｏｎｇ（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２８０：２３２２５－２３２３１）や、ビオチンと疎水結合するアミノ酸に変異を入れた例（Ｃｈｉｌｋｏｔｉ　ｅｔ　ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９２：１７５４－１７５８　；　Ｌａｉｔｉｎｅｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９９９）ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ.　４６１，５２－５８；　Ｓａｎｏ　ｅｔ　ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　９２：３１８０－３１８４，；　Ｓａｎｏ　ｅｔ　ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　９４：６１５３－６１５８）が知られている。
　さらに、アビジンとストレプトアビジンにおいて、それらのタンパク質のサブユニット同士の接点に関与するアミノ酸に変異導入する方法で、単量体の変異タンパク質を作成し、ビオチンへの親和性を下げた例が報告されている（Ｌａｉｔｉｎｅｎ　ｅｔ　ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２７６：８２１９－８２２４、Ｗｕ　ａｎｄ　Ｗｏｎｇ（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２８０：　２３２２５－２３２３１）。アビジンやストレプトアビジンは、四量体を形成し、各サブユニットそれぞれに１つずつビオチン結合サイトを持つ。完全なビオチン結合ポケットを形成するには、隣接するサブユニットのアミノ酸残基（例えばタマビジン２の場合、１０８番目のトリプトファン（Ｗ１０８））の存在が重要である。従って、サブユニット間の結合は、ビオチンとの親和性にも大きな影響を与えるものと考えられている。
　Ｗｕら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００５），２８０：２３２２５－２３２３１）によれば、ストレプトアビジンの場合、各サブユニットをＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄと名付けると、サブユニットＡにある５５番目のバリンは、サブユニットＢの５９番目のアルギニンに近い位置に存在する。サブユニットＡにある７６番目のスレオニンは、サブユニットＢ上の７６番目のスレオニンと５９番目のアラニンと非常に近い位置に配置している。サブユニットＢにある１０９番目のロイシンは、サブユニットＡ上の１２５番目のバリンと相互作用している。サブユニットＡにある１２５番目のバリンは、サブユニットＤ上の１０９番目のロイシン、１２０番目のトリプトファン、１２３番目のスレオニン、１２５番目のバリン、サブユニットＢ上の１０９番目のロイシン、サブユニットＣ上の１０７番目のグルタミンと広範囲に渡って相互作用をしている。従って、これらのアミノ酸を極性の高いアミノ酸、例えばアルギニン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、スレオニン等に置換することによって、サブユニット間に電荷的反発を発生させることや立体障害を生じさせることが期待できる。極性アミノ酸の中でもＨｙｄｒｏｐｈａｔｙ ｉｎｄｅｘが最も低いアルギニンはその効果が大きいと考えられる。
　アビジンやストレプトアビジンなどのビオチン結合性タンパク質を、アフィニティクロマトグラフィー等の可逆的な結合を必要とする技術分野へ応用するためには、解離定数（ＫＤ）を１０－７ （Ｍ） 程度まで上昇させることが一つの目安となると考えられている。場合にもよるが一般に解離定数がこれ以上小さい場合、ビオチン結合能が強すぎて、所望のビオチン化物質を効率よく解離させることができず、また、解離定数がこれより大きい場合は、ビオチン結合能が弱すぎて所望のビオチン化物質を十分に結合させることができないからである（Ｗｕ　ａｎｄ　Ｗｏｎｇ（２００６）Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｐｒ.　Ｐｕｒｉｆ.　４６：２６８－２７）。
　この点を考慮すると、上記のストレプトアビジン変異体において、水素結合部位一アミノ酸変異体は、いずれも解離定数が１０－１１　（Ｍ）程度と小さく、ビオチン結合能が強すぎるものであった。但し、このような変異体には、アミノ酸改変の結果、サブユニット相互作用にまで影響を及ぼすものが多くあり、これらはしばしば単量体となるが、単量体になった場合には１０－９　（Ｍ）程度の解離定数であった。また、上記のストレプトアビジン変異体において、水素結合部位を２箇所以上追加して改変させた場合、そのほとんどは単量体となり、その中にはビオチン結合能（解離定数）が１０－８　ないし１０－６　（Ｍ）程度になるものがあった（Ｑｕｒｅｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：４６４２２－４６４２８）。
　解離定数が、１０－８　ないし１０－７　（Ｍ）の変異体は、アフィニティクロマトグラフィーなどの用途に適度なビオチン結合能を有している（Ｑｕｒｅｓｈｉ　ａｎｄ　　Ｗｏｎｇ （２００２）Ｐｒoｔｅｉｎ　Ｅｘｐｒ．　Ｐｕｒｉｆ．２５：４０９－４１５；　Ｗｕ　ａｎｄ　　Ｗｏｎｇ（２００６）Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．４６：２６８－２７３）。しかし反面、このような単量体はプロテアーゼに非常に分解されやすいことが知られている（Ｌａｉｔｉｎｅｎ　ｅｔ　ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２７６：８２１９－８２２４、Ｗｕ　ａｎｄ　Ｗｏｎｇ（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２８０：　２３２２５－２３２３１）。アフィニティクロマトグラフィーでは様々な物質が混合した細胞粗抽出液を利用する場合が多いが、細胞粗抽出液中にはしばしばプロテアーゼが含まれており、単量体はこのような用途で使用するには問題があった。
　また、単量体にすることによって、サブユニット間の結合で隠されていた疎水性領域が露出するため、タンパク質全体の可溶性が低下する可能性があり、また再凝集の原因にもなりうる。これまでアビジンをモデルに設計された単量体では（例えばプロメガ社のＳｏｆｔＬｉｎｋ　Ｓｏｆｔ　Ｒｅｌｅａｓｅ　Ａｖｉｄｉｎ　Ｒｅｓｉｎ）、これを担体に固定化させた際、単量体同士が会合して四量体を形成するため、結果としてビオチンとの親和性が高くなってしまう。このためビオチン標識物質を添加する前に、四量体がビオチンと強く結合する領域をビオチンで埋める処理が必要となる。この処理は手間がかかる上、前処理の程度によってビオチン標識物質の収量が大きく変わってくる虞がある。
　上記のストレプトアビジン変異体において、水素結合部位のアミノ酸を２箇所以上改変しても四量体が維持されたものがまれにあった。しかし、例えこのような四量体であっても、改変によりサブユニット相互作用が弱まっており、担体に結合させた後に、ビオチン化物質と結合させ、その後、過剰ビオチンを加えてビオチン化物質を溶出させる場合、四量体を構成する単量体の多くが溶出してしまうという現象が見られた。
　さらに、アビジンやストレプトアビジンのアミノ酸改変タンパク質はその多くが、大腸菌で可溶性発現させることができず、昆虫細胞や枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）で発現させなければならないため（Ｌａｉｔｉｎｅｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９９９）ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ.，　４６１，　５２－５８、Ｑｕｒｅｓｈｉ　ａｎｄ　　Ｗｏｎｇ （２００２）Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｐｒ．　Ｐｕｒｉｆ．２５：４０９－４１５）、手間とコストが非常に問題となっていた。大腸菌で可溶性発現ができるのは一部の単量体ストレプトアビジンのみである（Ｗｕ　ａｎｄ　Ｗｏｎｇ（２００６）Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｐｒ.　Ｐｕｒｉｆ.　４６：２６８－２７３）。
　以上述べたように、所望のビオチン化物質を十分に結合することができ、かつ、解離することができる程度のビオチン結合能を有し、大腸菌で可溶性高発現し、さらにプロテアーゼ耐性を有する、ビオチン結合性タンパク質はこれまで知られていなかった。
　なお本発明者らは、食用キノコタモギタケ（Ｐｕｅｕｒｏｔｕｓ　ｃｏｎｕｃｏｐｉａｅ）から、新規なアビジン様ビオチン結合性タンパク質である、タマビジン１とタマビジン２を発見している（ＷＯ０２／０７２８１７）。タマビジン１及びタマビジン２は、大腸菌で大量に発現させることができ、特にタマビジン２はイミノビオチンカラムを用いた精製により容易に調製できた（ＷＯ０２／０７２８１７）。タマビジン１及びタマビジン２はビオチンと極めて強く結合し、特にタマビジン２に関しては、アビジンやストレプトアビジンとほぼ同レベルのビオチン結合活性を示した。またタマビジン２はアビジンやストレプトアビジンと比べて高い耐熱性を有し、さらにアビジンよりも非特異的な結合が少ないといった点で優れたビオチン結合性タンパク質であった。
ＷＯ０２／０７２８１７
Ｍａｒｔｔｉｌａ ｅｔ　ａｌ． （２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ.　３６９：２４９－２５４ Ｌａｉｔｉｎｅｎ ｅｔ　ａｌ．（２００３）Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７８：４０１０－４０１４ Ｌａｉｔｉｎｅｎ　ｅｔ　ａｌ．（２００１）Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７６：８２１９－８２２４） Ｌａｉｔｉｎｅｎ ｅｔ　ａｌ．（１９９９）ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ.　４６１：５２－５８ Ｑｕｒｅｓｈｉ ｅｔ　ａｌ．（２００１）Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７６：４６４２２－４６４２８ Ｇａｂｒｉｅｌ　ｅｔ　ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ． Ｓｃｉ.　９５：１３５２５－１３５３０ Ｑｕｒｅｓｈｉ　ａｎｄ　　Ｗｏｎｇ （２００２）Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｐｒ．　Ｐｕｒｉｆ．　２５：４０９－４１５ Ｗｕ　ａｎｄ　　Ｗｏｎｇ（２００６）Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｐｒ．　Ｐｕｒｉｆ.　４６：２６８－２７３ Ｗｕ　ａｎｄ　Ｗｏｎｇ（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２８０：　２３２２５－２３２３１ Ｃｈｉｌｋｏｔｉ ｅｔ　ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ.　９２：１７５４－１７５８ Ｓａｎｏ ｅｔ　ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　９２：３１８０－３１８４ Ｓａｎｏ　ｅｔ　ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．　９４：６１５３－６１５８
　本発明の解決すべき課題は、大腸菌で可溶性高発現が可能で、かつ、ビオチン固定化担体による精製が容易である、ビオチン結合性タンパク質を提供することである。
　本発明者らは上記課題の解決のために、鋭意研究に努めた結果、所望のビオチン化物質と十分に結合することができ、かつ、解離することができる程度のビオチン結合能を有し、さらにプロテアーゼ耐性を有する、安定な改変型のビオチン結合性タンパク質を得ることに成功し、本発明を想到した。
　具体的には、本発明は天然のタマビジン２（以下、本明細書において「ＴＭ２」と記載する場合がある）のアミノ酸配列（配列番号）を改変することにより、上記性質を有する改変型のビオチン結合性タンパク質を得たものである。
　本発明の好ましい態様
　本発明は好ましくは以下の態様を含む。
［態様１］
　配列番号２に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中に１から複数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列、又はこの配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ビオチン結合活性を示すタンパク質において、
以下のグループ：
　１）配列番号２の３６番目のセリン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換；
　２）配列番号２の８０番目のトリプトファン残基の親水性アミノ酸残基への置換；
　３）配列番号２の１１６番目のアスパラギン酸残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換；
　４）配列番号２の４６番目のプロリン残基のスレオニン、セリン若しくはチロシン残基への置換、及び、７８番目のスレオニン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換；
　５）配列番号２の４６番目のプロリン残基のスレオニン、セリン若しくはチロシン残基への置換、及び、１１６番目のアスパラギン酸残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換：並びに
　６）配列番号２の４６番目のプロリン残基のスレオニン、セリン若しくはチロシン残基への置換、７８番目のスレオニン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換、及び、１１６番目のアスパラギン酸残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換
から選択される置換を有することを特徴とする、改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様２］
　１－ａ）配列番号２の３６番目のセリン残基がアラニンに置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２　Ｓ３６Ａ）；
　２－ａ）配列番号２の８０番目のトリプトファン残基がリジンに置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２　Ｗ８０Ｋ）；
　３－ａ）配列番号２の１１６番目のアスパラギン酸残基がアラニンに置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２　Ｄ１１６Ａ）；
　４－ａ）配列番号２の４６番目のプロリン残基がスレオニンに置換されており、そして、７８番目のスレオニン残基がアラニンに置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２　Ｐ４６Ｔ－Ｔ７８Ａ）；
　５－ａ）配列番号２の４６番目のプロリン残基がスレオニンに置換されており、そして、１１６番目のアスパラギン酸残基がアラニンに置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２　Ｐ４６Ｔ－Ｄ１１６Ａ）；並びに
　６－ａ）配列番号２の４６番目のプロリン残基がスレオニンに置換されており、７８番目のスレオニン残基がアラニンに置換されており、そして、１１６番目のアスパラギン酸残基がアラニンに置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２　Ｐ４６Ｔ－Ｔ７８Ａ―Ｄ１１６Ａ）
からなるグループから選択される、態様１に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様３］
　以下の性質：
　ｉ）ビオチンを用いた精製が可能である；
　ｉｉ）配列番号２の記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の四量体構造を維持している；
　ｉｉｉ）プロテアーゼに対し耐性を有する；及び
　ｉｖ）大腸菌の可溶性画分において高い発現を示す
の１ないし全部を満たす、態様１又は２に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様４］
　配列番号２に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中に１から複数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列、又はこの配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ビオチン結合活性を示すタンパク質において、
　６）配列番号２の７８番目のスレオニン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換を有することを特徴とする改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様５］
　６－ａ）配列番号２の７８番目のスレオニン残基がアラニン残基へ置換されている、態様４に記載の改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２　Ｔ７８Ａ）。
［態様６］
　以下の性質：
　ｉ）ビオチンを用いた精製が可能である；
　ｉｉ）配列番号２の記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の四量体構造を維持している；
　ｉｉｉ）プロテアーゼに対し耐性を有する；及び
　ｖ）配列番号２の記載のアミノ酸配列からなるタンパク質よりも、高い耐熱性を有する
の１ないし全部を満たす、態様４又は５に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様７］
　配列番号２に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中に１から複数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列、又はこの配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ビオチン結合活性を示すタンパク質において、
以下のグループ：
　７）配列番号２の３６番目のセリン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換、及び、１１６番目のアスパラギン酸残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換；並びに
　８）配列番号２の３６番目のセリン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換、７８番目のスレオニン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換、及び、１１６番目のアスパラギン酸残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換
から選択される置換を有することを特徴とする、改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様８］
　７－ａ）配列番号２の３６番目のセリン残基がアラニンに置換されており、そして、１１６番目のアスパラギン酸残基がアラニンに置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２　Ｓ３６Ａ―Ｄ１１６Ａ）；並びに
　８－ａ）配列番号２の３６番目のセリン残基がアラニンに置換されており、７８番目のスレオニン残基がアラニンに置換されており、そして、１１６番目のアスパラギン酸残基がアラニンに置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２　Ｓ３６Ａ－Ｔ７８Ａ―Ｄ１１６Ａ）
からなるグループから選択される、態様７に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様９］
　以下の性質：
　ｉ）ビオチンを用いた精製が可能である；
　ｉｉｉ）プロテアーゼに対し耐性を有する；及び
　ｖｉ）弱酸性条件下でビオチンと結合し、そして、中性条件下でビオチンと結合しない
の１ないし全部を満たす、態様７又は８に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様１０］
　配列番号２に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中に１から複数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列、又はこの配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ビオチン結合活性を示すタンパク質において、
　９）配列番号２の７８番目のスレオニン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換、及び、１１６番目のアスパラギン酸残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換
を有することを特徴とする、改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様１１］
　９－ａ）配列番号２の７８番目のスレオニン残基がアラニンに置換されていおり、そして、１１６番目のアスパラギン酸残基がアラニンに置換されている、態様１０に記載の改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２　Ｔ７８Ａ―Ｄ１１６Ａ）。
［態様１２］
　以下の性質：
　ｉ）ビオチンを用いた精製が可能である；
　ｉｉ）配列番号２の記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の四量体構造を維持している；
　ｉｉｉ）プロテアーゼに対し耐性を有する；
　ｉｖ）大腸菌の可溶性画分において高い発現を示す；及び
　ｖｉｉ）イミノビオチンで精製できない
の１ないし全部を満たす、態様１０又は１１のいずれか１項に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様１３］
　配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質よりも、低いビオチン結合性を示す、態様１ないし１２のいずれか１項に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様１４］
　以下のａ）－ｌ）
　ａ）配列番号２の１４番目のアスパラギン残基は改変されていない、あるいはグルタミン又はアスパラギン酸に置換されている；
　ｂ）配列番号２の１８番目のセリン残基は改変されていない、あるいはスレオニン又はチロシンに置換されている；
　ｃ）配列番号２の３４番目のチロシン残基は改変されていない、あるいはセリン又はスレオニンに置換されている；
　ｄ）配列番号２の３６番目のセリン残基は改変されていない、あるいはスレオニン又はチロシンに置換されている；
　ｅ）配列番号２の４０番目のアスパラギン酸残基は改変されていない、あるいはアスパラギン以外の残基に置換されている；
　ｆ）配列番号２の６９番目のトリプトファン残基は改変されていない；
　ｇ）配列番号２の７６番目のセリン残基は改変されていない、あるいはスレオニン又はチロシンに置換されている；
　ｈ）配列番号２の７８番目のスレオニン残基は改変されていない、あるいはセリン又はチロシンに置換されている；
　ｉ）配列番号２の８０番目のトリプトファン残基は改変されていない；
　ｊ）配列番号２の９６番目のトリプトファン残基は改変されていない；
　ｋ）配列番号２の１０８番目のトリプトファン残基は改変されていない；
　ｌ）配列番号２の１１６番目のアスパラギン酸残基は改変されていない、あるいはグルタミン酸又はアスパラギンに置換されている
　ｍ）配列番号２の４６番目のプロリン残基は改変されていない；
　ｎ）配列番号２の６６番目のアラニン残基は改変されていない；
　ｏ）配列番号２の９７番目のロイシン残基は改変されていないか、イソロイシンに改変されている；及び
　ｐ）配列番号２の１１３番目のバリン残基は改変されていない
の１ないし全ての条件を満たす、ただし、このうち、１）ないし９）で特定したアミノ酸残基は、１）ないし９）の各々で特定したように置換されている、
態様１ないし１３のいずれか１項に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
　本発明によって、大腸菌で可溶性高発現が可能であり、かつ、ビオチンとの結合及び解離を可能とする、適切な強度のビオチン結合活性を有する、改変型ＴＭ２が提供された。本発明の改変型ＴＭ２を例えば担体に固定化し、ビオチン化物質を精製するためのアフィニティクロマトグラフィー等に供することができる。
図１Ａは、野生型タマビジン２（ＷＴ－ＴＭ２：左側）とＴＭ２　Ｓ３６Ａ（右側）の、図１ＢはＴＭ２　Ｔ７８Ａの、ならびに図１ＣはＴＭ２　Ｄ１１６Ａの、ビオチン－アガロースによる精製を示す写真である。各タンパク質をビオチン－アガロースに結合後、１０ｍＭのビオチンを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）を添加することにより、溶出を行った。各画分溶液に等量の２ｘＳＤＳ　Ｓａｍｐｌｅ　Ｂｕｆｆｅｒを添加後、９５℃で１０分処理しＳＤＳ－ＰＡＧＥに供与したのちクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色を行った。Ｓｕｐはカラムにかける前の可溶性画分であり、ＦＴはカラム通過（フロースルー）画分であり、Ｗは洗浄画分であり、Ｅｌｕは溶出画分である。 図２ＡはＴＭ２　Ｐ４６ＴＤ１１６Ａの、図２ＢはＴＭ２　Ｐ４６ＴＴ７８ＡＤ１１６Ａの、ならびに図２ＣはＴ７８ＡＤ１１６Ａの、ビオチン－アガロースによる精製を示す写真である。１０ｍＭのビオチンを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）を添加することにより、溶出を行った。さらに図２ＤはＴＭ２　Ｐ４６ＴＴ７８Ａの、イミノビオチン－アガロース、ならびにビオチン－アガロースによる精製を示す写真である。各画分溶液に等量の２ｘＳＤＳ　Ｓａｍｐｌｅ　Ｂｕｆｆｅｒを添加後、９５℃で１０分処理しＳＤＳ－ＰＡＧＥに供与したのちＣＢＢ染色を行った。Ｓｕｐはカラムにかける前の可溶性画分であり、ＦＴはカラム通過（フロースルー）画分であり、Ｗは洗浄画分であり、Ｅｌｕは溶出画分である。Ｍは分子量マーカーである。 図３Aは、ＴＭ２　Ｓ３６Ａ－Ｄ１１６Ａの、図３Bは、ＴＭ２　Ｓ３６Ａ－Ｔ７８Ａ－Ｄ１１６Ａの、ビオチン－アガロースによる精製を示す写真である。ｐＨ５、またはｐＨ６、あるいはｐＨ７で、ＴＭ２　Ｓ３６Ａ－Ｄ１１６Ａをビオチン－アガロースとを結合させ、ｐＨ５およびｐＨ６で結合させた時には５００ｍＭのＮａＣｌを含むｐＨ４のリン酸カリウム緩衝液で、ｐＨ７で結合させた時は５００ｍＭのＮａＣｌを含むｐＨ７のリン酸カリウム緩衝液で、それぞれ洗浄した。その後、ｐＨ５またはｐＨ６で結合させた時にはｐＨ７のリン酸カリウム緩衝液を１ｍＬ添加して、ｐＨ７で結合させた時には１０ｍＭのビオチンを含むｐＨ７．４のＰＢＳを１ｍＬ添加して、それぞれ溶出した。また、ｐＨ４またはｐＨ７のリン酸カリウム緩衝液、あるいはｐＨ１２の５０ｍＭ　ＣＡＰＳ緩衝液中で、ＴＭ２　Ｓ３６Ａ－Ｔ７８Ａ－Ｄ１１６Ａをビオチン－アガロースと結合させた後、洗浄し、ｐＨ７の１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液を１ｍＬ添加して溶出した。各画分溶液に等量の２ｘＳＤＳ　Ｓａｍｐｌｅ　Ｂｕｆｆｅｒを添加した後、９５℃で１０分処理し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供与したのちＣＢＢ染色を行った。 図４は、種々の改変型タマビジン２（ＴＭ２　Ｓ３６Ａ（図４Ａ）、ＴＭ２　Ｔ７８Ａ、ＴＭ２　Ｄ１１６Ａ、ＴＭ２　Ｔ７８Ａ－Ｄ１１６Ａ（以上図４Ｃ））、野生型のタマビジン２（ＷＴ－ＴＭ２、図４Ａ）、並びに対照としてＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ　Ａｌｂｕｍｉｎ、図４Ｂ）のＰｒｏｔｅａｓｅ耐性を示す写真である。これらの改変型タマビジン２をＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫと３０℃、１５分間反応させた後、各反応溶液に５ｘＳＤＳ　Ｓａｍｐｌｅ　Ｂｕｆｆｅｒを添加した後、９５℃で１０分処理して反応を停止させた。サンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥに供与し、ＣＢＢ染色を行った。 図５は、種々の改変型タマビジン２（ＴＭ２　Ｓ３６Ａ－Ｄ１１６Ａ（図５Ａ、Ｃ）、ＴＭ２　Ｔ７８Ａ、ＴＭ２　Ｐ４６Ｔ－Ｔ７８Ａ（以上図５Ａ）、ＴＭ２　Ｐ４６Ｔ－Ｄ１１６Ａ（図５Ｂ）、ＴＭ２　Ｓ３６Ａ－Ｔ７８Ａ－Ｄ１１６Ａ（図５Ｃ）、ＴＭ２　Ｗ８０Ｋ、ＴＭ２　Ｐ４６Ｔ－Ｔ７８Ａ－Ｄ１１６Ａ（以上図５Ｄ））のＰｒｏｔｅａｓｅ耐性を示す写真である。これらの改変型タマビジン２をＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫと３０℃、１５分間反応させた後、各反応溶液に５ｘＳＤＳ　Ｓａｍｐｌｅ　Ｂｕｆｆｅｒを添加した後、９５℃で１０分処理して反応を停止させた。なお、星印を付したＴＭ２　Ｔ７８Ａについては、１００℃で１０分処理して反応を停止させた。サンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥに供与し、ＣＢＢ染色を行った。 図６は、ＴＭ２　Ｔ７８Ａの熱安定性を示す写真である。ＴＭ２　Ｔ７８Ａを、ビオチンの存在下、非存在下において所定の温度で、１ｘＳＤＳ　Ｓａｍｐｌｅ　Ｂｕｆｆｅｒ中で２０分間熱処理をした後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供与し、ＣＢＢ染色を行った。 図７は、ＴＭ２　Ｓ３６Ａ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅによる、ビオチン化ＢＳＡの精製を示す写真である。大腸菌（ＴＢ１）の菌体抽出液とビオチン化ＢＳＡ、あるいはビオチン化ＢＳＡのみのサンプルを、ＴＭ２　Ｓ３６Ａ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅで精製した際の、精製前（ｔｏｔａｌ）、カラム通過（フロースルー）画分（ＦＴ）、洗浄画分（Ｗ）、溶出画分（Ｅｌｕ）の各溶液に、等量の２ｘＳＤＳ　Ｓａｍｐｌｅ　Ｂｕｆｆｅｒを添加した後、９５℃で１０分処理しＳＤＳ－ＰＡＧＥに供与した。ビオチン化ＢＳＡの存在は銀染色ＩＩキット（和光純薬社製）によって確認した。なお、溶出液には５ｍＭのビオチンを添加した。 図８ＡはＴＭ２　Ｄ１１６Ａ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅによる、図８ＢはＴＭ２　Ｐ４６ＴＴ７８Ａ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅによる、図８Ｃは、ＴＭ２　Ｐ４６ＴＤ１１６Ａ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅによる、ビオチン化ＢＳＡの精製を示す写真である。ビオチン化ＢＳＡ、あるいは大腸菌抽出液とビオチン化ＢＳＡを、各担体でそれぞれ精製した際の、精製前（ｔｏｔａｌ）、カラム通過（フロースルー）画分（ＦＴ）、洗浄画分（Ｗ）、溶出画分（Ｅｌｕ）の各溶液に、等量の２ｘＳＤＳ　Ｓａｍｐｌｅ　Ｂｕｆｆｅｒを添加した後、９５℃で１０分処理しＳＤＳ－ＰＡＧＥに供与した。ビオチン化ＢＳＡの存在は銀染色ＩＩキット（和光純薬社製）によって確認した。なお、溶出液には５ｍＭのビオチンを添加した。 図９は、ビオチン化ＢＳＡのＴＭ２　Ｓ３６Ａ－Ｄ１１６Ａ－ｓｅｐｈａｒｏｓｅへの結合の、ｐＨ依存性を示す写真である。ｐＨ５、ｐＨ６あるいはｐＨ７の１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液中でビオチン化ＢＳＡと結合させ、５００ｍＭのＮａＣｌを含むｐＨ４（上記ｐＨ５またはｐＨ６で結合させた場合）またはｐＨ７（上記ｐＨ７で結合させた場合）のリン酸カリウム緩衝液で洗浄した後、ｐＨ７のリン酸カリウム緩衝液を加えてビオチン化ＢＳＡを溶出した。精製前（ｔｏｔａｌ）、カラム通過（フロースルー）画分（ＦＴ）、洗浄画分（Ｗ）、溶出画分（Ｅｌｕ）の各溶液に、等量の２ｘＳＤＳ　Ｓａｍｐｌｅ　Ｂｕｆｆｅｒを添加し、９５℃で１０分処理した後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供与した。さらに銀染色ＩＩキット（和光純薬社製）を用いてタンパク質を銀で染色した。
　以下、本発明を実施するための好ましい形態について説明する。
　タマビジン
　タマビジンは、食用キノコである担子菌タモギタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ　ｃｏｎｕｃｏｐｉａｅ）から発見された新規ビオチン結合タンパク質である（ＷＯ０２／０７２８１７）。当該文献には、
　－タマビジン１とタマビジン２の相互のアミノ酸相同性は６５．５％で、ビオチンと強く結合する；
　－タマビジン２は、大腸菌で可溶性画分に高発現する；そして
　－タマビジン２を大腸菌で発現させた場合、４．５時間の培養で、５０ｍｌの培養当たり約１ｍｇの純度の高い精製組換えタンパク質が得られた。これはビオチン結合性タンパク質として知られているアビジンやストレプトアビジンと比較しても、非常に高い値である；
ことが記載されている。
　本明細書における「タマビジン２」は、タマビジン２（ＴＭ２）又はそれらの変異体を意味する。本発明は、ＴＭ２又はその変異体の特定のアミノ酸残基を改変させることにより、ビオチンとの可逆的な反応を可能とする、改変型ＴＭ２を提供するものである。本明細書において「タマビジン２」、「ＴＭ２」と記載した場合には、特に言及しない限り野生型のＴＭ２及びその変異体を意味する。ただし、文意により、本発明の改変型ＴＭ２も含めてＴＭ２の野生型、変異型、本発明の改変型の総称として使用する場合もある。また、ＴＭ２はビオチン結合性を示すことから、本明細書においてＴＭ２を「ビオチン結合タンパク質」と呼称することがある。
　具体的には、ＴＭ２（野生型）は典型的には、配列番号２のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、又は、配列番号１の塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質、であってよい。あるいは、ＴＭ２は、配列番号２のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、又は、配列番号１の塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質、の変異体であって、タマビジン２と同様のビオチン結合活性を有するタンパク質であってよい。ＴＭ２の変異体は、配列番号２のアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加を含むアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であってもよい。置換は、保存的置換であってもよく、これは、特定のアミノ酸残基を類似の物理化学的特徴を有する残基で置き換えることである。保存的置換の非限定的な例には、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＡｌａ相互の置換のような脂肪族基含有アミノ酸残基の間の置換、Ｌｙｓ及びＡｒｇ、Ｇｌｕ及びＡｓｐ、Ｇｌｎ及びＡｓｎ相互の置換のような極性残基の間での置換などが含まれる。
　アミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加による変異体は、野生型タンパク質をコードするＤＮＡに、例えば周知技術である部位特異的変異誘発（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　Ｖｏｌ．１０，　Ｎｏ．　２０，　ｐ．６４８７－６５００，　１９８２参照、引用によりその全体を本明細書に援用する）を施すことにより作成することができる。本明細書において、「１又は複数のアミノ酸」とは、部位特異的変異誘発法により欠失、置換、挿入及び／又は付加できる程度のアミノ酸を意味する。また、本明細書において「１又は複数のアミノ酸」とは、場合により、１又は数個のアミノ酸を意味してもよい。
　部位特異的変異誘発法は、例えば、所望の変異である特定の不一致の他は、変異を受けるべき一本鎖ファージＤＮＡに相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて次のように行うことができる。即ち、プライマーとして上記合成オリゴヌクレオチドを用いてファージに相補的な鎖を合成させ、得られた二重鎖ＤＮＡで宿主細胞を形質転換する。形質転換された細菌の培養物を寒天にプレーティングし、ファージを含有する単一細胞からプラークを形成させる。そうすると、理論的には５０％の新コロニーが一本鎖として変異を有するファージを含有し、残りの５０％が元の配列を有する。上記所望の変異を有するＤＮＡと完全に一致するものとはハイブリダイズするが、元の鎖を有するものとはハイブリダイズしない温度において、得られたプラークをキナーゼ処理により標識した合成プローブとハイブリダイズさせる。次に該プローブとハイブリダイズするプラークを拾い、培養してＤＮＡを回収する。
　なお、生物活性ペプチドのアミノ酸配列にその活性を保持しつつ１または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入及び／又は付加を施す方法としては、上記の部位特異的変異誘発の他にも、遺伝子を変異源で処理する方法、及び遺伝子を選択的に開裂し、次に選択されたヌクレオチドを除去、置換、挿入又は付加し、次いで連結する方法もある。より好ましくは、本発明におけるＴＭ２は、配列番号２において１ないしは１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ビオチン結合活性を有するタンパク質である。
　ＴＭ２の変異体はさらに、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上、より好ましくは９９．３％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、ＴＭ２と同様のビオチン結合活性を有するタンパク質であってもよい。
　２つのアミノ酸配列の同一性％は、視覚的検査および数学的計算によって決定してもよい。あるいは、２つのタンパク質配列の同一性パーセントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，　Ｓ．　Ｂ．　及びＷｕｎｓｃｈ，　Ｃ．　Ｄ．　（Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　４８：　４４３－４５３，　１９７０）のアルゴリズムに基づき、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラムを用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，　Ｓ．　及びＨｅｎｉｋｏｆｆ，　Ｊ．　Ｇ．　（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　８９：　１０９１５－１０９１９，　１９９２）に記載されるような、スコアリング・マトリックス、ｂｌｏｓｕｍ６２；（２）１２のギャップ加重；（３）４のギャップ長加重；及び（４）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。
　当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、用いてもよい。同一性のパーセントは、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ．　Ｒｅｓ．，　２５，　ｐ．３３８９－３４０２，　１９９７）に記載されているＢＬＡＳＴプログラムを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。当該プログラムは、インターネット上でＮａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、あるいはＤＮＡ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ　ｏｆ　Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから利用することが可能である。ＢＬＡＳＴプログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。又は、２つのアミノ酸配列の同一性％は、遺伝情報処理ソフトウエアＧＥＮＥＴＹＸ　Ｖｅｒ．７（ゼネティックス製）などのプログラム、又は、ＦＡＳＴＡアルゴリズムなどを用いて決定してもよい。その際、検索はデフォルト値を用いてよい。
　２つの核酸配列の同一性％は、視覚的検査と数学的計算により決定可能であるか、またはより好ましくは、この比較はコンピュータ・プログラムを使用して配列情報を比較することによってなされる。代表的な、好ましいコンピュータ・プログラムは、遺伝学コンピュータ・グループ（ＧＣＧ；ウィスコンシン州マディソン）のウィスコンシン・パッケージ、バージョン１０．０プログラム「ＧＡＰ」である（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，　ｅｔ　ａｌ．，　１９８４，　Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　１２：　３８７）。この「ＧＡＰ」プログラムの使用により、２つの核酸配列の比較の他に、２つのアミノ酸配列の比較、核酸配列とアミノ酸配列との比較を行うことができる。ここで、「ＧＡＰ」プログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドについての（同一物について１、及び非同一物について０の値を含む）一元（ｕｎａｒｙ）比較マトリックスのＧＣＧ実行と、Ｓｃｈｗａｒｔｚ及びＤａｙｈｏｆｆ監修「ポリペプチドの配列および構造のアトラス（Ａｔｌａｓ　ｏｆ　Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）」国立バイオ医学研究財団、３５３－３５８頁、１９７９により記載されるような、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ，　Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　１４：　６７４５，　１９８６の加重アミノ酸比較マトリックス；又は他の比較可能な比較マトリックス；（２）アミノ酸の各ギャップについて３０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の１のペナルティ；又はヌクレオチド配列の各ギャップについて５０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の３のペナルティ；（３）エンドギャップへのノーペナルティ：及び（４）長いギャップへは最大ペナルティなし、が含まれる。当業者により使用される他の配列比較プログラムでは、例えば、米国国立医学ライブラリーのウェブサイト：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.htmlにより使用が利用可能なＢＬＡＳＴＮプログラム、バージョン２．２．７、またはＵＷ－ＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムが使用可能である。ＵＷ－ＢＬＡＳＴ２．０についての標準的なデフォルトパラメーターの設定は、以下のインターネットサイト：http://blast.wustl.eduに記載されている。さらに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸スコア付けマトリックスを使用し、使用可能である選択パラメーターは以下の通りである：（Ａ）低い組成複雑性を有するクエリー配列のセグメント（ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎのＳＥＧプログラム（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　１９９３）により決定される；ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎ，　１９９６「配列データベースにおける組成編重領域の解析（Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌｌｙ　ｂｉａｓｅｄ　ｒｅｇｉｏｎｓ　ｉｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｄａｔａｂａｓｅｓ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，　２６６：　５４４－７１も参照されたい）、又は、短周期性の内部リピートからなるセグメント（ＣｌａｖｅｒｉｅおよびＳｔａｔｅｓ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　１９９３）のＸＮＵプログラムにより決定される）をマスクするためのフィルターを含むこと、及び（Ｂ）データベース配列に対する適合を報告するための統計学的有意性の閾値、またはＥ－スコア（ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，　１９９０）の統計学的モデルにしたがって、単に偶然により見出される適合の期待確率；ある適合に起因する統計学的有意差がＥ－スコア閾値より大きい場合、この適合は報告されない）；好ましいＥ－スコア閾値の数値は０．５であるか、または好ましさが増える順に、０．２５、０．１、０．０５、０．０１、０．００１、０．０００１、１ｅ－５、１ｅ－１０、１ｅ－１５、１ｅ－２０、１ｅ－２５、１ｅ－３０、１ｅ－４０、１ｅ－５０、１ｅ－７５、または１ｅ－１００である。
　ＴＭ２の変異体はまた、配列番号１の塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質であって、ＴＭ２と同様の結合活性を有するタンパク質であってもよい。
　ここで、「ストリンジェントな条件下」とは、中程度または高程度にストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることを意味する。具体的には、中程度にストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，第３版，第６章，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　２００１に示され、例えば５×ＳＳＣ、０．５％　ＳＤＳ、１．０ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４２℃での、約５０％ホルムアミド、２×ないし６×ＳＳＣ、好ましくは５×ないし６×ＳＳＣ、０．５％　ＳＤＳ（または約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、及び例えば、約５０℃ないし６８℃、０．１×、ないし、６×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。好ましくは中程度にストリンジェントな条件は、約５０℃、６×ＳＳＣ、０．５％　ＳＤＳのハイブリダイゼーション条件（及び洗浄条件）を含む。高ストリンジェントな条件もまた、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することが可能である。
　一般に、こうした条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度及び／又は低い塩濃度でのハイブリダイゼーション（例えば、０．５％程度のＳＤＳを含み、約６５℃、６×ＳＳＣないし０．２×ＳＳＣ、好ましくは６×ＳＳＣ、より好ましくは２×ＳＳＣ、より好ましくは０．２×ＳＳＣ、あるいは０．１×ＳＳＣのハイブリダイゼーション）及び／又は洗浄を含み、例えば上記のようなハイブリダイゼーション条件、及びおよそ６５℃、ないし６８℃、０．２×ないし０．１×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳの洗浄を伴うと定義される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の緩衝液では、ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ　ＮａＣｌおよび１５ｍＭ　クエン酸ナトリウムである）にＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４、および１．２５ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）を代用することが可能であり、洗浄はハイブリダイゼーションが完了した後で１５分間ないし１時間程度行う。
　また、プローブに放射性物質を使用しない市販のハイブリダイゼーションキットを使用することもできる。具体的には、ＥＣＬ　ｄｉｒｅｃｔ　ｌａｂｅｌｉｎｇ　＆　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を使用したハイブリダイゼーション等が挙げられる。ストリンジェントなハイブリダイゼーションとしては、例えば、キット中のｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒにＢｌｏｃｋｉｎｇ試薬を５％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌを０．５Ｍになるように加え、４２℃で４時間行い、洗浄は、０．４％　ＳＤＳ、０．５ｘＳＳＣ中で、５５℃で２０分を２回、２ｘＳＳＣ中で室温、５分を一回行う、という条件が挙げられる。
　ＴＭ２の変異体のビオチン結合活性は、公知の手法のいずれかにより測定することが可能である。例えば、Ｋａｄａら（Ｂｉｏｃｈｉｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ．，　１４２７：　３３－４３　（１９９９））に記載されるように蛍光ビオチンを用いる方法により測定してもよい。この方法は、ビオチン結合タンパク質のビオチン結合サイトに蛍光ビオチンが結合すると、蛍光ビオチンの蛍光強度が消失する性質を利用したアッセイ系である。あるいは、表面プラズモン共鳴を原理としたバイオセンサーなど、タンパク質とビオチンの結合を測定することが可能なセンサーを用いて、変異体タンパク質のビオチン結合活性を評価することもできる。
　本発明の改変タマビジンにおいて、改変しないことが望ましいアミノ酸残基については後述する。
　本発明の改変タマビジン（Ｉ型）
　本発明の改変型ＴＭ２は１態様として、
配列番号２に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中に１から複数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列、又はこの配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ビオチン結合活性を示すタンパク質（ＴＭ２あるいはＴＭ２（変異体））において、
以下のグループ：
　１）配列番号２の３６番目のセリン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換；
　２）配列番号２の８０番目のトリプトファン残基の親水性アミノ酸残基への置換；
　３）配列番号２の１１６番目のアスパラギン酸残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換；
　４）配列番号２の４６番目のプロリン残基のスレオニン、セリン若しくはチロシン残基への置換、及び、７８番目のスレオニン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換
　５）配列番号２の４６番目のプロリン残基のスレオニン、セリン若しくはチロシン残基への置換、及び、１１６番目のアスパラギン酸残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換；
：並びに
　６）配列番号２の４６番目のプロリン残基のスレオニン、セリン若しくはチロシン残基への置換、７８番目のスレオニン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換、及び、１１６番目のアスパラギン酸残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換
から選択される置換を有することを特徴とする。
　本明細書において「タマビジン２（ＴＭ２）」とは、上記で既に定義した通りである。
　本明細書において「水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換」とは、ビオチンと水素結合を形成しないと考えられるアミノ酸残基へ置換することを意味する。限定されるわけではないが、具体的な例としては、非極性すなわち疎水性のR基をもつアミノ酸であるアラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、トリプトファン（Ｗ）、フェニルアラニン（Ｆ）、及びプロリン（Ｐ）などへの、これら以外のアミノ酸残基からの置換を挙げることができる。本明細書中の実施例では、下記の改変型ＴＭ２においてセリン、スレオニン又はアスパラギン酸から、アラニン（Ａ）へ置換した改変体が記載されている。
　本明細書において「親水性アミノ酸残基への置換」とは、本技術分野で一般的に親水性であると考えられているアミノ酸残基への置換を意味する。限定されるわけではないが、具体的な例としては、極性アミノ酸が挙げられるが、その中でも生理的pHで正の電荷をもつR基を有するリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、及びヒスチジン（Ｈ）、生理的pHで負の電荷をもつR基を有するアスパラギン酸（Ｄ）やグルタミン酸（Ｅ）などへの置換を挙げることができ、下記の改変型ＴＭ２においてはトリプトファンをリジン（Ｋ）へ置換したものを述べる。
　このような改変型ＴＭ２は好ましくは、
　１－ａ）配列番号２の３６番目のセリン残基がアラニンに置換されている改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２　Ｓ３６Ａ）、
　２－ａ）配列番号２の８０番目のトリプトファン残基がリジンに置換されている改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２　Ｗ８０Ｋ）、
　３－ａ）配列番号２の１１６番目のアスパラギン酸残基がアラニンに置換されている改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２　Ｄ１１６Ａ）、
　４－ａ）配列番号２の４６番目のプロリン残基がスレオニンに置換されており、そして、７８番目のスレオニン残基がアラニンに置換されている改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２　Ｐ４６Ｔ－Ｔ７８Ａ）、
　５－ａ）配列番号２の４６番目のプロリン残基がスレオニンに置換されており、そして、１１６番目のアスパラギン酸残基がアラニンに置換されている改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２　Ｐ４６Ｔ－Ｄ１１６Ａ）、並びに、
　６－ａ）配列番号２の４６番目のプロリン残基がスレオニンに置換されており、７８番目のスレオニン残基がアラニンに置換されており、そして、１１６番目のアスパラギン酸残基がアラニンに置換されている改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２　Ｐ４６Ｔ－Ｔ７８Ａ―Ｄ１１６Ａ）、である。
　そのような改変型ＴＭ２は、好ましくは、以下の性質；
　ｉ）ビオチンを用いた精製が可能である、
　ｉｉ）配列番号２の記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の四量体構造を維持している、
　ｉｉｉ）プロテアーゼに対し耐性を有する、
　ｉｖ）大腸菌の可溶性画分において高い発現を示す、
の１ないし全部を示す。
　本明細書において「ビオチンを用いた精製が可能」とは、対象とするタンパク質が適度なビオチン結合能を有することによりビオチンとの結合及び解離が可能であるために、ビオチンとのアフィニティを利用して、対象タンパク質自体、および／または、対象タンパク質を結合した担体（カラム等）を用いた、ビオチン化物質（例えばビオチン化タンパク質等）の精製が可能であることを意味する。従って、改変型ＴＭ２は、野生型ＴＭ２に比べて、ビオチン結合能が小さい低親和性タマビジンである。
　本明細書において「四量体構造を維持している」とは、天然のＴＭ２が有する四量体のサブユニット構造を実質的に維持していることを意味する。具体的には、野生型のＴＭ２と同程度の分子量を有する状態を意味する。例えば、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（Ｆａｓｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＦＰＬＣ））によって、改変型ＴＭ２の分子量を測定し、ＴＭ２の分子量と比較することによって確認できる。
　本明細書において「プロテアーゼに対し耐性を有する」とは、プロテアーゼ処理によってタンパク質が酵素分解されない、又は実質的に分解されないことを意味する。プロテアーゼ処理は、例えば、３０℃で１５分間、プロテアーゼＫによる処理を施す。「酵素分解されない」とは、野生型のＴＭ２と同様に、酵素処理後にＳＤＳ－ＰＡＧＥを行っても当該タンパク質の四量体、二量体および／または単量体のバンドが明瞭に検出できることを意味する。すなわち、プロテアーゼに対し耐性を持たないタンパク質は、プロテアーゼ処理により小分子にまで分解されてしまい、プロテアーゼ処理後のＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて、四量体、二量体、および単量体のバンドは検出できないが、プロテアーゼに対し耐性を有するタンパク質の場合はプロテアーゼ処理によっても完全に分解されてしまうことなく、四量体構造を維持する。そしてＳＤＳ-ＰＡＧＥにおいて、四量体および／または四量体が解離した二量体や単量体のバンドとして検出される。
　本明細書において「大腸菌の可溶性画分において高い発現を示す」とは、所望の遺伝子を発現ベクターに組み込み、大腸菌に導入後、適当な培地中で適当な温度ならびに発現誘導条件下でタンパク質を発現させた場合に、その組換えタンパク質が大腸菌中において、菌体破砕後の可溶性画分に、確認可能な程度十分に、好ましくは野生型のＴＭ２とほぼ同程度、またはそれ以上に産生されることを意味する。限定されるわけではないが、培養液１Ｌ当たり、１ｍｇ以上、好ましくは５ｍｇ以上、１０ｍｇ以上、１５ｍｇ以上、特に好ましくは２０ｍｇ以上発現することを意味する。
　「ＴＭ２　Ｓ３６Ａ」及び「ＴＭ２　Ｄ１１６Ａ」はＴＭ２においてビオチンと水素結合すると考えられる部位を改変したものであり、大腸菌の可溶性画分において高発現するものである。また、これらの改変体ＴＭ２は四量体の構造を維持しており、プロテアーゼに対し高い耐性を有している。さらにこれらの改変型ＴＭ２のビオチン結合能は、１アミノ酸改変体であるにもかかわらず、それとビオチンとの結合能は、ビオチンと可逆的反応を起こさせるのに十分な程度に低下しており、ビオチン化タンパク質を非常に効率的に精製することができる。その上、イミノビオチンカラムを利用した場合であっても、これらの改変体ＴＭ２を非常に効率的に精製することができる。従って、「ＴＭ２　Ｓ３６Ａ」及び「ＴＭ２　Ｄ１１６Ａ」は、これまでの低結合能ビオチン結合性タンパク質の問題点を解決することができる、非常に優れたビオチン可逆的結合性タンパク質である。
　「ＴＭ２　Ｗ８０Ｋ」は、ＴＭ２においてビオチンと疎水結合すると考えられる部位を改変したものであり、野生型ＴＭ２（配列番号２）の８０番目のトリプトファンをリジンに改変したものである。ＴＭ２　Ｗ８０Ｋは、大腸菌の可溶性画分において高発現するものである。また、四量体の構造を維持しており、プロテアーゼに対し高い耐性を有している。さらにこれらの変異体のビオチン結合能は、１アミノ酸改変体であるにもかかわらず、ビオチンと可逆的反応を起こさせるのに十分な程度に低下しており、酢酸を用いると、ビオチン化タンパク質を非常に効率的に精製することができる。その上、イミノビオチンカラムを利用した場合であっても、非常に効率的に精製することができる。従ってＷ８０Ｋは、これまでの低結合能ビオチン結合性タンパク質の問題点を解決した、非常に優れた、ビオチン可逆的に結合する性質を有するタンパク質である。
　「ＴＭ２　Ｐ４６Ｔ－Ｔ７８Ａ」と「ＴＭ２　Ｐ４６Ｔ－Ｄ１１６Ａ」は、タマビジンのサブユニット間の結合に関与すると考えられる部位、かつ、ビオチンと水素結合すると考えられる部位を改変したものである。ＴＭ２とストレプトアビジンとのアミノ酸の相同性（両者のアミノ酸相同性は全体で４８％である）を利用して検討したところ、ストレプトアビジンにおける５５番目のバリン（Ｖａｌ）、７６番目のスレオニン（Ｔｈｒ）、１０９番目のロイシン（Ｌｅｕ）、ならびに１２５番目のバリン（Ｖａｌ）が、それぞれＴＭ２における、４６番目のプロリン（Ｐｒｏ）、６６番目のアラニン（Ａｌａ）、９７番目のロイシン（Ｌｅｕ）、１１３番目のバリン（Ｖａｌ）であると考えられた。すなわち、ＴＭ２においてそれらのアミノ酸は、サブユニット結合部位に存在すると考えられた。そしてそれらのアミノ酸に実際に変異を入れ、ビオチン結合活性を測定すると、ビオチンと可逆的に結合するが、およそ半数の改変体は二量体や単量体の混合物となる。
　ところで、ＴＭ２のサブユニット間結合に関与すると考えられる４６番目のプロリンをスレオニンに改変した「ＴＭ２　Ｐ４６Ｔ」は、サブユニット間結合を弱めることを意図した変異体であるが、四量体を維持している。そして、ビオチン結合能は予想に反して非常に高く、過剰量のビオチンを加えてもビオチン化物質を溶出させることができない。しかし、このＴＭ２　Ｐ４６Ｔの、ビオチンと水素結合すると考えられる部位である、７８番目のスレオニン又は１１６番目のアスパラギン酸をアラニンに改変した変異体は、ビオチン結合能が適度な水準に変化し、ビオチン化物質を十分に精製することができる。
　さらに、これらの変異をすべて組み合わせた「ＴＭ２　Ｐ４６Ｔ－Ｔ７８Ａ－Ｄ１１６Ａ」も、ビオチン化物質を十分に精製することができる。
　また、これらの変異体は四量体を維持しており、プロテアーゼ耐性を有している。なお、このように水素結合の変異とサブユニット間結合の変異を組み合わせることにより、適切なビオチン結合能を持たせることに成功したビオチン結合性タンパク質は、これまでに例がない。
　本発明の改変タマビジン（ＩＩ型）
　また本発明の改変型ＴＭ２は１態様として、
配列番号２に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中に１から複数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列、又はこの配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ビオチン結合活性を示すタンパク質（ＴＭ２あるいはＴＭ２（変異体））において、
　６）配列番号２の７８番目のスレオニン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換
を有することを特徴とする。
　このような改変型ＴＭ２は好ましくは、
　６－ａ）配列番号２の７８番目のスレオニン残基がアラニン残基へ置換されている改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２　Ｔ７８Ａ）である。
　本明細書において「タマビジン２（ＴＭ２）」とは、上記で既に定義した通りである。
　本明細書において「水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換」とは、上記で既に定義した通りである。
　このような改変型ＴＭ２は、好ましくは、以下の性質；
　ｉ）ビオチンを用いた精製が可能である、
　ｉｉ）配列番号２の記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の四量体構造を維持している、
　ｉｉｉ）プロテアーゼに対し耐性を有する、
　ｖ）配列番号２の記載のアミノ酸配列からなるタンパク質よりも、高い耐熱性を有する、　
の１ないし全部を示す。
　本明細書において「ビオチンを用いた精製が可能」、「四量体構造を維持している」及び「プロテアーゼに対し耐性を有する」は、上記で既に定義した通りである。
　本明細書において「高い耐熱性を有する」とは、野生型と同程度あるいはそれ以上の耐熱性を有することを意味する。非限定的に、例えば、ＳＤＳ存在下で２０分間加熱処理を行った際のＴｒ値（単量体と四量体の量比が１：１となる温度）が天然のＴＭ２と比較して、ビオチン非存在下で、好ましくは同程度、より好ましくは５℃以上、さらに好ましくは１０℃以上高いことを意味する。
　「ＴＭ２　Ｔ７８Ａ」は、大腸菌可溶性画分からのイミノビオチン－アガロースによる回収率は低いが、ビオチン－アガロースによる回収率は高く（９５％程度）、四量体を維持しプロテアーゼ耐性を有している。加えてＴＭ２　Ｔ７８Ａは、ＴＭ２　Ｓ３６ＡやＴＭ２　Ｄ１１６Ａと同様に１アミノ酸変異体であるにもかかわらず、ビオチン結合能が適度に低下しており、ビオチン化タンパク質を精製することができる（回収率は４０％～５０％程度）。さらにＴＭ２　Ｔ７８Ａは、ビオチン非存在下でのＴｒ値が８８℃であり、ＴＭ２のＴｒ値（７８℃）より１０℃も高く、またビオチン結合時のＴｍ値も１００℃以上であり、熱安定性が非常に高いタンパク質である。
　本発明の改変タマビジン（ＩＩＩ型）
　また本発明の改変型ＴＭ２は１態様として、
　配列番号２に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中に１から複数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列、又はこの配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ビオチン結合活性を示すタンパク質（ＴＭ２あるいはＴＭ２（変異体））において、
以下のグループ：
　７）配列番号２の３６番目のセリン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換、及び、１１６番目のアスパラギン酸残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換；並びに
　８）配列番号２の３６番目のセリン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換、７８番目のスレオニン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換、及び、１１６番目のアスパラギン酸残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換
から選択される置換を有することを特徴とする。
　本明細書において「タマビジン２（ＴＭ２）」とは、上記で既に定義した通りである。
　本明細書において「水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換」とは、上記で既に定義した通りである。
　このような改変型ＴＭ２は好ましくは、
　７－ａ）配列番号２の３６番目のセリン残基がアラニンに置換されており、そして、１１６番目のアスパラギン酸残基がアラニンに置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２　Ｓ３６Ａ―Ｄ１１６Ａ）；並びに
　８－ａ）配列番号２の３６番目のセリン残基がアラニンに置換されており、７８番目のスレオニン残基がアラニンに置換されており、そして、１１６番目のアスパラギン酸残基がアラニンに置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２　Ｓ３６Ａ－Ｔ７８Ａ―Ｄ１１６Ａ）
からなるグループから選択される。
　このような改変型ＴＭ２は、以下の性質；
　ｉ）ビオチンを用いた精製が可能である；
　ｉｉｉ）プロテアーゼに対し耐性を有する、
　ｖｉ）弱酸性条件下でビオチンと結合し、そして、中性条件下でビオチンと結合しない、
の１ないし全部を示す。
　本明細書において「ビオチンを用いた精製が可能である」及び「プロテアーゼに対し耐性を有する」とは、上記で既に定義した通りである。
　本態様の改変型タマビジンは、特殊なｐＨ依存性を示す。本明細書において「弱酸性」とは、ｐＨ４からｐＨ６の範囲内の水素イオン指数を意味する。「中性」とは、ｐＨ７からｐＨ８の範囲内の水素イオン指数を意味する。
　「ＴＭ２　Ｓ３６Ａ－Ｄ１１６Ａ」は、大腸菌可溶性画分からの回収率は９５％、精製度９５％（ｐＨ４で結合、ｐＨ７で解離させた場合）、四量体を維持しプロテアーゼ耐性を有している。そして、ビオチン結合に関して極めて特異的なｐＨ依存性を有する。これまで、中性付近（ｐＨ７付近）でビオチンと結合しないビオチン結合タンパク質は知られていない。この「ＴＭ２　Ｓ３６Ａ－Ｄ１１６Ａ」は、弱酸性条件（ｐＨ４～６程度）においてビオチンと非常に効率よく結合するのに対し、中性条件及びアルカリ条件（ｐＨ７、ｐＨ１２）ではビオチンと全く結合しないという、これまでのビオチン結合性タンパク質とは全く異なる特徴を有している。従ってこの改変体を用いれば、対象物質を強アルカリ性条件に曝して変性させてしまうことなく、穏和な条件で精製することができる。
　本明細書において「アルカリ条件」とは、ｐＨ９からｐＨ１３の範囲内の水素イオン指数を意味する。
　「ＴＭ２　Ｓ３６Ａ－Ｔ７８Ａ－Ｄ１１６Ａ」は、大腸菌の可溶性画分において高発現するものである。また二量体の構造を維持しており、プロテアーゼに対し高い耐性を有している。「ＴＭ２　Ｓ３６Ａ－Ｔ７８Ａ－Ｄ１１６Ａ」は、「ＴＭ２　Ｓ３６Ａ－Ｄ１１６Ａ」と同様に、弱酸性条件（ｐＨ４～６程度）においてビオチンと効率よく結合するのに対し、中性条件（ｐＨ７）ではビオチンと全く結合しないという、これまでのビオチン結合性タンパク質とは全く異なる特徴を有している。ただし、アルカリ条件下では、「ＴＭ２　Ｓ３６Ａ－Ｄ１１６Ａ」と異なり、弱酸性条件と同様にビオチンと効率良く結合した。
　「ＴＭ２　Ｓ３６Ａ－Ｔ７８Ａ－Ｄ１１６Ａ」はまた、イミノビオチンに全く結合せず、イミノビオチンで精製できないという特徴も有する。この点は、後述するＩＶ型と性質ｖｉｉ）が共通する。「イミノビオチンで精製できない」の意義はＩＶ型の説明において詳述する。
　本発明の改変タマビジン（ＩＶ型）
　また本発明の改変型ＴＭ２は１態様として、
　配列番号２に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中に１から複数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列、又はこの配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ビオチン結合活性を示すタンパク質（ＴＭ２あるいはＴＭ２（変異体））において、
　９）配列番号２の７８番目のスレオニン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換、及び、１１６番目のアスパラギン酸残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換
を有することを特徴とする。
　本明細書において「タマビジン２（ＴＭ２）」とは、上記で既に定義した通りである。
　本明細書において「水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換」とは、上記で既に定義した通りである。
　このような改変型ＴＭ２は好ましくは、
　９－ａ）配列番号２の７８番目のスレオニン残基がアラニンに置換されており、そして、１１６番目のアスパラギン酸残基がアラニンに置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２　Ｔ７８Ａ―Ｄ１１６Ａ）である。
　このような改変型ＴＭ２は、以下の性質；
　ｉ）ビオチンを用いた精製が可能である、
　ｉｉ）配列番号２の記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の四量体構造を維持している、
　ｉｉｉ）プロテアーゼに対し耐性を有する、
　ｉｖ）大腸菌の可溶性画分において高い発現を示す、
　ｖｉｉ）イミノビオチンで精製できない
の１ないし全部を示す。
　本明細書において「ビオチンを用いた精製が可能である」、「四量体構造を維持している」、「プロテアーゼ耐性を有する」及び「大腸菌の可溶性画分において高い発現を示す」とは、上記で既に定義した通りである。
　本明細書において「イミノビオチンで精製できない」とは、目的タンパク質がイミノビオチンと結合しないか、あるいはイミノビオチンと結合した目的タンパク質を溶出することができないために、イミノビオチンを用いた精製が不可能であることを意味する。
　「ＴＭ２　Ｔ７８Ａ－Ｄ１１６Ａ」は、大腸菌の可溶性画分において高発現するものである。また四量体の構造を維持しており、プロテアーゼに対し高い耐性を有している。この改変体は、イミノビオチンでは全く精製できないが、ビオチンでは極めてよく精製できる、というこれまでに全く知られていない特異な性質を有している。
　当該改変体は、例えば以下のような用途に用いることが出来る。例えばある細胞を、その細胞の表層に存在する抗原を目印に特異的に標識したい場合、まず、これらの改変体を検体に注射し、検体の血液中の内生ビオチンと結合させる。続いて、その抗原に対する特異的抗体をイミノビオチン化し、検体に導入し、当該細胞をイミノビオチンでラベルする。最後に、放射性同位元素ラベルあるいは蛍光ラベルしたアビジンやストレプトアビジン、あるいはタマビジンのようなビオチンと強く結合するタンパク質を検体に注入することで、細胞を特異的に標識することが出来る。この系では予めこれらの改変体で内生のビオチンレベルを低下させているので、バックグラウンドが低く、かつこれらの改変体は、ビオチンには結合するがイミノビオチンには結合しないので、当該細胞には結合しない。通常、ビオチン結合タンパク質はイミノビオチンとビオチンの両方に結合するので、これらの改変体を使用しなければ上記の系は成立しない。
　アミノ酸の改変方法
　ＴＭ２のアミノ酸を改変して、本発明の改変型ＴＭ２を得るための方法は、公知のアミノ酸配列に変異を施す方法を使用でき、特に限定されない。好ましくは本発明の改変タンパク質をコードする核酸の塩基配列に修飾を施し改変する。
　例えば、アミノ酸配列の特定の位置のアミノ酸を改変するには、例えばＰＣＲを利用した方法が挙げられる（Ｈｉｇｕｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ　（１９８８）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ　１６：７３５１－７３６７，　Ｈｏ　ｅｔ　ａｌ．（１９８９）　Ｇｅｎｅ　７７：５１－５９）。すなわち、標的変異のミスマッチコドンを含むプライマーを利用してＰＣＲを行ない、目的の改変体をコードするＤＮＡを作成しこれを発現させることにより、目的の改変体を得ることができる。
　また、アミノ酸の欠失、置換、挿入及び／又は付加による改変体は、野生型タンパク質をコードするＤＮＡに、前述の周知技術である部位特異的変異誘発を施すなどの方法により作成することができる。
　本発明の改変型ＴＭ２において改変されないことが望ましいアミノ酸残基
　本発明の改変型ＴＭ２におけるアミノ酸残基の改変は、改変型ＴＭ２が適切なビオチン親和性を有することにより精製が可能となるような改変である。ところで、ビオチン結合タンパク質の一つであるストレプトアビジンのビオチンポケットについては既に解明が進んでいる。このストレプトアビジンとＴＭ２のアミノ酸配列のホモロジーは５０％程度に過ぎないが、発明者らは、ＴＭ２のビオチンポケットについての知見を得るべく、ＴＭ２とストレプトアビジンのアミノ酸配列を並列させて比較した。
　すると、ストレプトアビジンのビオチンポケットを形成するアミノ酸の中で、ビオチンと直接相互作用する残基Ｎ２３、Ｓ２７、Ｙ４３、Ｓ４５、Ｎ４９、Ｗ７９、Ｓ８８、Ｔ９０、Ｗ９２、Ｗ１０８、Ｗ１２０、Ｄ１２８（Ｗｅｂｅｒ　ｅｔ　ａｌ．　（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４３：　８５－８８）は、ＴＭ２では各々、Ｎ１４、Ｓ１８、Ｙ３４、Ｓ３６、Ｄ４０、Ｗ６９、Ｓ７６、Ｔ７８、Ｗ８０、Ｗ９６、Ｗ１０８、Ｄ１１６に該当し、非常によく保存されていることが見出された。ＴＭ２とストレプトアビジンのビオチン結合ポケットは非常に似た構造を有し、これらのアミノ酸残基はビオチン結合に大きく関与していると考えられる。
　唯一、ストレプトアビジンの４９番目のＮ（アスパラギン）は、ＴＭ２においては４０番目のＤ（アスパラギン酸）になっており、例外であった。なお４９番目のアスパラギンに関しては、これをストレプトアビジンと同様にアスパラギンに改変したＴＭ２　Ｄ４０Ｎ　ＴＭ２において、ビオチン結合能が高くなるという知見を本発明者らは得ている。よって４０番目のアスパラギン酸をアスパラギンに置換した改変体はビオチン結合能が強すぎるので、上記のＴＭ２　Ｄ４０Ｎ　ＴＭ２を本発明に使用することは好ましくない。
　特に４つのトリプトファン残基（Ｗ６９、Ｗ８０、Ｗ９６、Ｗ１０８）はビオチンポケットの構造に重要な役割を果たしていると考えられるため、これまでの改変体に関する記載で特定された置換を行う場合を除き、改変されないことが望ましい。あるいは、これらを改変する場合にはビオチンとの結合を維持できるよう、性質あるいは構造が類似したアミノ酸に改変することが望ましく、例えばフェニルアラニン（Ｆ）へ改変することが望ましい。
　一方、ビオチンとの結合に関与すると考えられるその他のアミノ酸、すなわち、ＴＭ２においては、ビオチンと直接相互作用すると考えられるアミノ酸残基（Ｎ１４、Ｓ１８、Ｙ３４、Ｓ３６、Ｓ７６、Ｔ７８、Ｄ１１６）についても、これまでの記載で特定された置換を行う場合を除き、改変されないことが望ましい。あるいは、これらを改変する場合にはビオチンとの結合を維持できるよう、性質あるいは構造が類似したアミノ酸に改変することが望ましく、例えばアスパラギン（Ｎ１４）の場合は、グルタミン（Ｑ）やアスパラギン酸（Ｄ）へ、好ましくはグルタミンへ、アスパラギン酸（Ｄ４０）の場合は、アスパラギン（Ｎ）以外へ、セリン（Ｓ１８、Ｓ３６、Ｓ７６）の場合は、スレオニン（Ｔ）あるいはチロシン（Ｙ）へ、好ましくはスレオニンへ、チロシン（Ｙ３４）の場合は、セリン（Ｓ）あるいはスレオニン（Ｔ）へ、好ましくはスレオニンへ、スレオニン（Ｔ７８）の場合は、セリン（Ｓ）やチロシン（Ｙ）へ、好ましくはセリンへ、アスパラギン酸（Ｄ１１６）の場合は、グルタミン酸（Ｅ）やアスパラギン（Ｎ）へ、好ましくはグルタミン酸へ、それぞれ改変することが望ましい。
　加えてＰ４６、Ａ６６、Ｌ９７、Ｖ１１３もサブユニット結合部位であるために、これらの残基についても、これまでの記載で特定された置換を行う場合を除き、改変されないことが望ましい。これらを改変する場合にはビオチンとの結合を維持できるよう、性質あるいは構造が類似したアミノ酸に改変することが望ましく、例えばロイシン（Ｌ９７）の場合は、イソロイシンへ改変することが望ましい。
　ただし、いずれも、上記１）－９）で特定したアミノ酸残基は、１）ないし９）の各々で特定したように置換されている。
　改変型ＴＭ２タンパク質をコードする核酸
　本発明は、本発明の改変型ＴＭ２タンパク質をコードする核酸を提供する。このような核酸の塩基配列は、ＴＭ２の塩基配列（配列番号１）を、改変型ＴＭ２タンパク質の改変アミノ酸をコードする塩基配列に改変したものである。改変される塩基配列は、改変後のアミノ酸をコードする塩基配列であれば限定されない。例えば、配列番号１の塩基配列からなる核酸（以下、「ＴＭ２遺伝子」）、またはそれらの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ビオチンとの結合及び解離を可能とする、適切なビオチン結合活性を有するタンパク質をコードする核酸であって、本発明の改変を施すために塩基配列を改変させたものを含む。
　本発明の核酸は、好ましくは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８及び２０のいずれかのアミノ酸配列をコードする。本発明の核酸は、より好ましくは配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９のいずれかの核酸配列からなる。
　本発明の核酸を含むベクター
　また、本発明は、改変型ＴＭ２タンパク質をコードする核酸を含むベクターを提供する。好ましくは、改変型ＴＭ２タンパク質を発現するための発現ベクターである。
　本発明の改変型ＴＭ２のタンパク質をコードする核酸は、上記「改変型ＴＭ２タンパク質をコードする核酸」に記載された通りであり、特に限定されない。改変型ＴＭ２タンパク質をコードする核酸の上流には所望の宿主で機能するプロモーターが、またその下流にはターミネーターが配置されていることが望ましい。
　本発明のベクターは、好ましくは発現ベクターである。発現ベクターは、上記のような発現ユニット（プロモーター＋改変型ＴＭ２コード領域＋ターミネーター）の他に、所望の宿主で複製できるためのユニット、例えば複製開始点を有し、また所望の宿主細胞を選抜するための、薬剤抵抗性マーカー遺伝子を有してもよい。宿主は特に限定されないが、好ましくは大腸菌である。また、本発現ベクターに、例えば、大腸菌におけるラクトースリプレッサー系のような適当な発現制御系を組み込んでもよい。
　改変型ＴＭ２を固定化した担体
　本発明は、本発明の改変型ＴＭ２タンパク質を固定化した担体を提供する。
　担体を構成する材料は公知のものを使用可能である。例えば、セルロース、テフロン、ニトロセルロース、アガロース、高架橋アガロース、デキストラン、キトサン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリプロピレン、ナイロン、ポリジビニリデンジフルオライド、ラテックス、シリカ、ガラス、ガラス繊維、金、白金、銀、銅、鉄、ステンレススチール、フェライト、シリコンウエハ、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリ乳酸、樹脂、多糖類、タンパク（アルブミン等）、炭素又はそれらの組合せ、などを含むがこれらに限定されない。また、一定の強度を有し、組成が安定し、かつ非特異結合が少ないものが好ましい。
　固体担体の形状は、ビーズ、磁性ビーズ、薄膜、微細管、フィルター、プレート、マイクロプレート、カーボンナノチューブ、センサーチップなどを含むがこれらに限定されない。薄膜やプレートなどの平坦な固体担体は、当該技術分野で知られているように、ピット、溝、フィルター底部などを設けてもよい。
　発明の一態様において、ビーズは、約２５ｎｍ～約１ｍｍの範囲の球体直径を有しうる。好ましい態様では、ビーズは約５０ｎｍ～約１０μｍの範囲の直径を有する。ビーズのサイズは特定の適用に応じて選択されうる。
　タンパク質の担体への結合は特に限定されず、タンパク質を担体に結合させるための公知の方法を使用することが可能である。具体的な結合方法は、担体の種類等によって、当業者が適宜選択可能である。
　以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
　実施例１　低親和性（Ｌｏｗ　Ａｆｆｉｎｉｔｙ）タマビジン２（ＬＡＴＭ２）の構築と分析
　　１－１．低親和性タマビジン２（以下ＬＡＴＭ２）の設計
　本発明者らは、ストレプトアビジンの結晶構造の知見を踏まえ、ストレプトアビジンとＴＭ２のアミノ酸配列との比較検討を行い、ＴＭ２においてビオチンと相互作用するアミノ酸残基を推定し、それらのアミノ酸の配置はストレプトアビジンがビオチンと相互作用するアミノ酸のそれと似ているという知見を得た。これにより、ＴＭ２のアミノ酸配列の６９番目、８０番目、９６番目、１０８番目のトリプトファンが、ビオチンと疎水結合するアミノ酸であると推定し、さらにＴＭ２のアミノ酸配列の１４番目のアスパラギン、１８番目のセリン、３４番目のチロシン、３６番目のセリン、７６番目のセリン、７８番目のスレオニン、および、１１６番目のアスパラギン酸が、ビオチンと水素結合するアミノ酸であると推定した。また、検討の結果、４６番目のプロリン、６６番目のアラニン、９７番目のロイシン、１１３番目のバリンがＴＭ２においてサブユニット間の結合に重要であると考えられた。
　以上の知見を踏まえ、ＴＭ２とビオチンとの親和性を低下させることを目的に、ＴＭ２中にアミノ酸変異を導入した。まず、ビオチンとの疎水結合に重要な役割を果たしていると考えられるトリプトファン（６９番目、８０番目、９６番目、１０８番目のトリプトファン）、水素結合に関与すると考えられるアミノ酸（１４番目のアスパラギン、１８番目のセリン、３４番目のチロシン、３６番目のセリン、１１６番目のアスパラギン酸、７６番目のセリン、７８番目のスレオニン）に変異導入を行った。さらには、サブユニット間の結合に重要であると考えられるアミノ酸残基（４６番目のプロリン、６６番目のアラニン、９７番目のロイシン、１１３番目のバリン）についても変異導入を行った。
　即ち、ＬＡＴＭ２を構築するために以下の３０個のＴＭ２改変体を構築した。
　（１）１０８番目のトリプトファンをリジンに置換したＴＭ２（以下、「ＴＭ２　Ｗ１０８Ｋ」）；
　（２）６９番目のトリプトファンをリジンに置換したＴＭ２（以下、「ＴＭ２　Ｗ６９Ｋ」）；
　（３）８０番目のトリプトファンをリジンに置換したＴＭ２（以下、「ＴＭ２　Ｗ８０Ｋ」、塩基配列は配列番号３に記載、アミノ酸配列は配列番号４に記載）；
　（４）３６番目のセリンをアラニンに変異したＴＭ２（以下、「ＴＭ２　Ｓ３６Ａ」、塩基配列は配列番号５に記載、アミノ酸配列は配列番号６に記載）；
　（５）３６番目のセリンからアラニンへの置換と７８番目のスレオニンからアラニンへの置換と１１６番目のアスパラギン酸からアラニンへの置換を持つＴＭ２（以下、「ＴＭ２　Ｓ３６Ａ－Ｔ７８Ａ－Ｄ１１６Ａ」、塩基配列は配列番号７に記載、アミノ酸配列は配列番号８に記載）；
　（６）１４番目のアスパラギンをアラニンに変異したＴＭ２（以下、「ＴＭ２　Ｎ１４Ａ」）；
　（７）７８番目のスレオニンをアラニンに変異したＴＭ２（以下、「ＴＭ２　Ｔ７８Ａ」、塩基配列は配列番号９に記載、アミノ酸配列は配列番号１０に記載）；
　（８）１１６番目のアスパラギン酸をアラニンに変異したＴＭ２（以下、「ＴＭ２　Ｄ１１６Ａ」、塩基配列は配列番号１１に記載、アミノ酸配列は配列番号１２に記載）；
　（９）６６番目のアラニンをアルギニンに変異したＴＭ２（以下、「ＴＭ２　Ａ６６Ｒ」）；
　（１０）４６番目のプロリンからスレオニンへの置換と６６番目のアラニンからアルギニンへの置換をもつＴＭ２（以下、「ＴＭ２　Ｐ４６Ｔ－Ａ６６Ｒ」）； 
　（１１）１１３番目のバリンをアルギニンに変異したＴＭ２（以下、「ＴＭ２　Ｖ１１３Ｒ」）；
　（１２）４６番目のプロリンからスレオニンへの置換と１１３番目のバリンからアルギニンへの置換を持つＴＭ２（以下、「ＴＭ２　Ｐ４６Ｔ－Ｖ１１３Ｒ」）。
　（１３）４６番目のプロリンからスレオニンへの置換と７８番目のスレオニンからアラニンへの置換を持つＴＭ２（以下、「ＴＭ２　Ｐ４６Ｔ－Ｔ７８Ａ」、塩基配列は配列番号１３に記載、アミノ酸配列は配列番号１４に記載）。
　（１４）４６番目のプロリンからスレオニンへの置換と１１６番目のアスパラギン酸からアラニンへの置換を持つＴＭ２（以下、「ＴＭ２　Ｐ４６Ｔ－Ｄ１１６Ａ」、塩基配列は配列番号１５に記載、アミノ酸配列は配列番号１６に記載）。
　（１５）４６番目のプロリンからスレオニンへの置換と７８番目のスレオニンからアラニンへの置換と１１６番目のアスパラギン酸からアラニンへの変異を持つＴＭ２（以下、「ＴＭ２　Ｐ４６Ｔ－Ｔ７８Ａ－Ｄ１１６Ａ」、塩基配列は配列番号１７に記載、アミノ酸配列は配列番号１８に記載）。
　（１６）４６番目のプロリンからスレオニンへの置換と６６番目のアラニンからアルギニンへの置換と９７番目のロイシンからスレオニンへの変異を持つＴＭ２（以下、「ＴＭ２　Ｐ４６Ｔ－Ａ６６Ｒ－Ｌ９７Ｔ」）。
　（１７）１０８番目のトリプトファンからグルタミン酸への変異を持つＴＭ２（以下、「ＴＭ２　Ｗ１０８Ｅ」）。
　（１８）１０８番目のトリプトファンからアルギニンへの変異を持つＴＭ２（以下、「ＴＭ２　Ｗ１０８Ｒ」）。
　（１９）９６番目のトリプトファンからリジンへの変異を持つＴＭ２（以下、「ＴＭ２　Ｗ９６Ｋ」）。
　（２０）３６番目のセリンからアラニンへの置換と１１６番目のアスパラギン酸からアラニンへの置換を持つＴＭ２（以下、「ＴＭ２　Ｓ３６Ａ－Ｄ１１６Ａ」、塩基配列は配列番号１９に記載、アミノ酸配列は配列番号２０に記載）。
　（２１）１８番目のセリンからアラニンへの変異を持つＴＭ２（以下、「ＴＭ２　Ｓ１８Ａ」）。
　（２２）７８番目のスレオニンからアラニンへの置換と１１６番目のアスパラギン酸からアラニンへの置換を持つＴＭ２（以下、「ＴＭ２　Ｔ７８Ａ－Ｄ１１６Ａ」、塩基配列は配列番号２１に記載、アミノ酸配列は配列番号２２に記載）。
　（２３）３４番目のチロシンからアラニンへの変異を持つＴＭ２（以下、「ＴＭ２　Ｙ３４Ａ」）。
　（２４）４６番目のプロリンからスレオニンへの変異を持つＴＭ２（以下、「ＴＭ２　Ｐ４６Ｔ」）。
　（２５）４６番目のプロリンからスレオニンへの置換と９７番目のロイシンからスレオニンへの置換を持つＴＭ２（以下、「ＴＭ２　Ｐ４６Ｔ－Ｌ９７Ｔ」）。
　（２６）４６番目のプロリンからスレオニンへの置換と６６番目のアラニンからアルギニンへの置換と９７番目のロイシンからスレオニンへの変異と１１３番目のバリンからアルギニンへの置換を持つＴＭ２（以下、「ＴＭ２　Ｐ４６Ｔ－Ａ６６Ｒ－Ｌ９７Ｔ－Ｖ１１３Ｒ」）。
　（２７）６６番目のアラニンからアルギニンへの置換と１１３番目のバリンからアラギニンへの置換を持つＴＭ２（以下、「ＴＭ２　Ａ６６Ｒ－Ｖ１１３Ｒ」）。
　（２８）６６番目のアラニンからアルギニンへの置換と９７番目のロイシンからスレオニンへの置換と１１３番目のバリンからアラギニンへの置換を持つＴＭ２（以下、「ＴＭ２　Ａ６６Ｒ－Ｌ９７Ｔ－Ｖ１１３Ｒ」）。
　（２９）９７番目のロイシンからスレオニンへの変異を持つＴＭ２（以下、「ＴＭ２　Ｌ９７Ｔ」）。
　（３０）９７番目のロイシンからスレオニンへの変異と１１３番目のバリンからアルギニンへの置換を持つＴＭ２（以下、「ＴＭ２　Ｌ９７Ｔ－Ｖ１１３Ｒ」）。
　まず、ＬＡＴＭ２を構築するための変異導入を行うのに使用するＰＣＲ用プライマーを設計した。ＴＭ２遺伝子の５’部分の領域の配列と、その上流に制限酵素ＰｃｉＩ切断部位（ＡＣＡＴＧＴ）を配置した配列からなるプライマーＴｍ２　５’ Ｐｃｉ、ＴＭ２遺伝子の３’部分の領域と、その下流に制限酵素ＢａｍＨＩ切断部位（ＧＧＡＴＣＣ）を配置した配列からなるプライマーＴｍ２ ３’Ｂａｍを設計した。各改変タマビジン２についてのミスマッチコドンを含む一連のセンスプライマー、およびアンチセンスプライマーを、それぞれ表１に示す。なお表１において制限酵素認識部位を下線で示し、変異導入部位を点線で示した。
　［表１］　低親和性タマビジン構築用プライマー
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　　１－２　ＰＣＲによる遺伝子増幅
　ＬＡＴＭ２遺伝子を構築するために、２段階のＰＣＲを行った。１段階目のＰＣＲは、ＴＭ２遺伝子がベクターｐＴｒｃ９９Ａに組み込まれたプラスミドを鋳型にして、プライマーＴｍ２ＮｔｅｒｍＰｃｉと各改変体のミスマッチコドンを含むアンチセンスプライマー（ＴＭ２－Ｓ３６Ａ－Ｒｖ、ＴＭ２－Ｎ１４Ａ－Ｒｖ、ＴＭ２－Ｔ７８Ａ－Ｒｖ、ＴＭ２－Ｄ１１６Ａ－Ｒｖ、ＴＭ２－Ｗ１０８Ｋ－Ｒｖ、ＴＭ２－Ｗ１０８Ｅ－Ｒｖ、ＴＭ２－Ｗ１０８Ｒ－Ｒｖ、ＴＭ２－Ｗ９６Ｋ－Ｒｖ、ＴＭ２－Ｓ１８Ａ－Ｒｖ、ＴＭ２－Ｙ３４Ａ－Ｒｖ、ＴＭ２－Ｗ６９Ｋ－Ｒｖ、ＴＭ２－Ｗ８０Ｋ－Ｒｖ、ＴＭ２－Ｐ４６Ｔ－Ｒｖ、ＴＭ２－Ｖ１１３Ｒ－Ｒｖ、ＴＭ２－Ｌ９７Ｔ－Ｒｖ）のそれぞれを用いて変異遺伝子の５’部分の増幅を行った。更にミスマッチコドンを含むセンスプライマー(ＴＭ２－Ｓ３６Ａ－Ｆｗ、ＴＭ２－Ｎ１４Ａ－Ｆｗ、ＴＭ２－Ｔ７８Ａ－Ｆｗ、ＴＭ２－Ｄ１１６Ａ－Ｆｗ、ＴＭ２－Ｗ１０８Ｋ－Ｆｗ、ＴＭ２－Ｗ１０８Ｅ－Ｆｗ、ＴＭ２－Ｗ１０８Ｒ－Ｆｗ、ＴＭ２－Ｗ９６Ｋ－Ｆｗ、ＴＭ２－Ｓ１８Ａ－Ｆｗ、ＴＭ２－Ｙ３４Ａ－Ｆｗ、ＴＭ２－Ｗ６９Ｋ－Ｆｗ、ＴＭ２－Ｗ８０Ｋ－Ｆｗ、ＴＭ２－Ｐ４６Ｔ－Ｆｗ、ＴＭ２－Ｖ１１３Ｒ－Ｆｗ、ＴＭ２－Ｌ９７Ｔ－Ｆｗ)のそれぞれとＴｍ２ＣｔｅｒｍＢａｍを用いて変異遺伝子の３’部分の増幅を行った。
　ＰＣＲ反応条件は以下のとおりである。５０μＬの反応液中に鋳型ＤＮＡを５００ｎｇ、１０×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ　ｂｕｆｆｅｒ（Ｔａｋａｒａ社）を５μＬ、２．５ｍＭ　ｄＮＴＰを４μＬ、プライマーを各２５ｐｍｏｌｅｓ、５Ｕ／μＬ　Ｐｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社製）を０．５μＬ添加し、プログラムテンプコントロールシステムＰＣ－７００（ＡＳＴＥＫ）を用いて、９６℃３分を１回、９６℃１分、５５℃１分、７２℃２分を１０回、７２℃６分を１回のサイクルで加熱を行った。その結果、遺伝子の５’部分、および３’部分において、いずれも設計通りのサイズのＰＣＲ産物が得られた。
　これらのＰＣＲ産物を、低融点アガロース（ＳｅａＰｌａｑｕｅＧＴＧ、ＣＡＭＢＲＥＸ社）を用いてＴＡＥ緩衝液中でアガロース電気泳動を行った。各ＤＮＡ断片をゲルごと切り出し、ゲルと等量の２００　ｍＭ　ＮａＣｌを加え、７０℃で１０分間処理し、ゲルを融解した。このサンプルについて、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出、クロロホルム抽出を各１回行い、エタノール沈殿によって遺伝子の５’部分と３’部分のＤＮＡ断片を回収した。それぞれの各変異遺伝子の５’部分と３’部分の両ＤＮＡ断片を鋳型にして、プライマーＴｍ２ＮｔｅｒｍＰｃｉとＴｍ２ＣｔｅｒｍＢａｍを用いて、２段階目のＰＣＲを行った。反応条件は１段階目と同様とした。その結果、いずれのクローンにおいても約４３０ｂｐのＰＣＲ産物が得られた。
　　１－３）　遺伝子クローニング
　ＰＣＲによって得られたＬＡＴＭ２遺伝子断片をベクターｐＣＲ４　Ｂｌｕｎｔ　ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングした。ライゲーション反応はベクターキット添付の説明書きに従った。大腸菌ＴＢ１にエレクトロポレーション法を用いてＤＮＡを導入し、常法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．　１９８９，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ，　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ）に従ってプラスミドＤＮＡを抽出した。インサートが確認されたクローンに関して、Ｍ１３プライマー（Ｔａｋａｒａ社）を用いて、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ蛍光シークエンサー（Ｍｏｄｅｌ　３１０　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ，　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社）で、ＰＣＲ産物の塩基配列をその両端から決定し、対象塩基に目的とする変異が導入されていることを確認した。
　塩基配列を確認した後、上記プラスミドを制限酵素ＰｃｉＩとＢａｍＨＩで二重消化し、前述の方法でゲル精製を行い、ＤＮＡ断片を回収した。この断片を、あらかじめＮｃｏＩとＢａｍＨＩで消化しておいた大腸菌発現用ベクターｐＴｒｃ９９Ａに、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いてライゲーションした。ライゲーション産物を大腸菌ＴＢ１に形質転換し、常法に従いプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素分析を行い、挿入遺伝子の有無を確認した。こうして、ＬＡＴＭ２タンパク発現用のベクターである、ＴＭ２　Ｗ１０８Ｋ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２　Ｗ１０８Ｅ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２　Ｗ１０８Ｒ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２　Ｗ６９Ｋ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２　Ｗ８０Ｋ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２　Ｗ９６Ｋ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２　Ｓ１８Ａ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２　Ｙ３４Ａ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２　Ｓ３６Ａ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２　Ｎ１４Ａ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２　Ｔ７８Ａ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２　Ｄ１１６Ａ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２　Ａ６６Ｒ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２　Ｐ４６Ｔ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２　Ｌ９７Ｔ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２　Ｖ１１３Ｒ／ｐＴｒｃ９９Ａを完成させた。
　さらに、２箇所のアミノ酸変異を有するＬＡＴＭ２、および３箇所のアミノ酸変異を有するＬＡＴＭ２については、点変異を有するＬＡＴＭ２をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを鋳型とし、各改変体についてのミスマッチコドンを含むプライマーを用いて上記に記載した方法で構築した。これにより、ＴＭ２　Ｓ３６ＡＤ１１６Ａ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２　Ｓ３６ＡＤＴ７８ＡＤ１１６Ａ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２　Ｔ７８ＡＤ１１６Ａ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２　Ｐ４６ＴＬ９７Ｔ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２　Ｐ４６ＴＡ６６ＲＬ９７Ｔ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２　Ｐ４６ＴＡ６６ＲＬ９７ＴＶ１１３Ｒ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２　Ａ６６ＲＬ９７Ｔ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２　Ｐ４６ＴＡ６６Ｒ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２　Ｌ９７ＴＶ１１３Ｒ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２　Ａ６６ＲＶ１１３Ｒ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２　Ａ６６ＲＬ９７ＴＶ１１３Ｒ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２　Ｐ４６ＴＶ１１３Ｒ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２　Ｐ４６ＴＴ７８Ａ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２　Ｐ４６ＴＤ１１６Ａ／ｐＴｒｃ９９Ａ、Ｐ４６ＴＴ７８ＡＤ１１６Ａ／ｐＴｒｃ９９Ａを完成させた。
　　１－４）　ＬＡＴＭ２の大腸菌発現
　各ＬＡＴＭ２／ｐＴｒｃ９９Ａにより形質転換した大腸菌ＢＬ２１を、抗生物質アンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地６ｍＬに接種し、ＯＤ６００における吸光度が０．５に達するまで２５℃で振とう培養した。その後、１ｍＭ　ＩＰＴＧを添加し、さらに２５℃で一晩振とう培養した。培養液１ｍＬから遠心にて大腸菌を集菌し、１００ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７）１５００μＬ中に懸濁後、菌体を超音波により破砕した。破砕液を遠心（１５０００ｒｐｍ）し、その上清を可溶性画分とした。
　この可溶性画分についてウエスタンブロッティング解析を行った。可溶性画分と２×ＳＤＳ　ｓａｍｐｌｅ　ｂｕｆｆｅｒ（１２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ　６．８，　１０％　２－メルカプトエタノール、　４％　ＳＤＳ、　１０％　スクロース、０．０１％ＢＰＢ）を等量ずつ混和し、９５℃で１０分間加熱したものをＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動で展開し、ウエスタンブロッティング解析に用いた。１次抗体としてウサギ抗ＴＭ２抗体（ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３２６２６０）を用いた。さらに、２次抗体としてアルカリフォスファターゼ標識抗ウサギ　ＩｇＧ抗体（ＢＩＯ－ＲＡＤ社製）を用いた。ウエスタンブロッティング解析の結果、ＬＡＴＭ２／ｐＴｒｃ９９Ａで形質転換した大腸菌いずれにおいても、ＬＡＴＭ２遺伝子を挿入していないベクターｐＴｒｃ９９Ａで形質転換した大腸菌にはない、１５．５ｋＤａ付近のバンドが検出された。これらのバンドのサイズは、ＴＭ２のアミノ酸配列から予測される単量体の分子量１５．５ｋＤａと一致した。
　また、培養液１Ｌ当たりの可溶性ＬＡＴＭ２タンパクの発現量は、いずれもＷＴ－ＴＭ２と同程度で約２０ｍｇであった。ただし、ＴＭ２　Ｗ１０８Ｒ、ＴＭ２　Ｗ９６Ｋ、ＴＭ２　Ｓ１８Ａ、ＴＭ２　Ｙ３４Ａについては発現がほとんど見られなかったため、以後の検討は行っていない。
　　１－５）　ＬＡＴＭ２の精製
　ＬＡＴＭ２の精製は、Ｈｏｆｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９８０）の方法に従い、２－イミノビオチン－アガロース（Ｓｉｇｍａ社製）を充填したカラムを用いて行った。各ＬＡＴＭ２で形質転換した大腸菌について、大腸菌培養液２５ｍＬに、最終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加して発現誘導した。菌体を遠心分離により集菌し、５０ｍＭ　ＮａＣｌを含む５０ｍＭ　ＣＡＰＳ（ｐＨ１２）１．５ｍＬで懸濁し、超音波破砕後の遠心上清に、２－イミノビオチン－アガロース　５００μＬを添加した後、カラムに充填した。５００ｍＭ　ＮａＣｌを含む５０ｍＭ　ＣＡＰＳ（ｐＨ１２）でカラムをよく洗浄した後、５０ｍＭ　ＮＨ４ＯＡＣ（ｐＨ４）で溶出した。
　また、ビオチン－アガロース（Ｓｉｇｍａ社製）による精製は以下の方法で行った。ＬＡＴＭ２の各々の大腸菌培養液２５ｍＬに発現誘導をかけ、１００ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１．５ｍＬで菌体を懸濁し、超音波破砕後の上清にビオチン－アガロース　４００μＬを添加した後１時間転倒混和した。その後アガロースをカラムに充填し、５００ｍＭ　ＮａＣｌを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）でカラムをよく洗浄した後、１０ｍＭ　ビオチンを含むＰＢＳ１ｍＬで溶出した。
　ただし、ＴＭ２　Ｓ３６Ａ－Ｔ７８Ａ－Ｄ１１６Ａについては５０ｍＭ　ＮａＣｌを含む５０ｍＭ　ＣＡＰＳ（ｐＨ１２）　１．５ｍＬで懸濁し、超音波破砕後の上清にビオチン－アガロース　４００μＬを添加した。１時間転倒混和後、５００ｍＭ　ＮａＣｌを含む５０ｍＭ　ＣＡＰＳ（ｐＨ１２）でカラムをよく洗浄し、１０ｍＭ　ビオチンを含むＰＢＳ１ｍＬ（ｐＨ７．４）で溶出した。
　また、ＴＭ２　Ｓ３６Ａ－Ｄ１１６Ａにおいては１００ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ４．０）１．５ｍＬで懸濁し、超音波破砕後の上清にビオチン－アガロース　４００μＬを添加した。洗浄は５００ｍＭ　ＮａＣｌを含む１００ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ４）を用い、１０ｍＭ　ビオチンを含むＰＢＳ１ｍｌ（ｐＨ７）で溶出した。過剰量のビオチンで溶出したＬＡＴＭ２に結合しているビオチンは、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液で一晩透析することで除去した。
　２－イミノビオチン－アガロースとビオチン－アガロースにおける回収率と精製度の結果を表２に示す。なお、表２において回収率は、精製後のＬＡＴＭ２タンパク質の量を精製前のＬＡＴＭ２タンパク質の量で割ったものに１００を乗じて％で表した。また、精製度は、精製画分中の総タンパク質の量に占めるＬＡＴＭ２タンパク質の量の割合に１００を乗じて％で表した。ビオチン－アガロースによる精製における回収率および精製度については、ｐＨ７で結合し過剰ビオチンで溶出させたときの結果として示した。
　［表２］　ＬＡＴＭ２の回収率及び精製度
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 　２―イミノビオチン－アガロースを用いた精製において、各種ＬＡＴＭ２のうち、ＴＭ２　Ｐ４６Ｔ、ＴＭ２　Ｓ３６Ａ、ＴＭ２　Ｄ１１６Ａ、ＴＭ２　Ｐ４６Ｔ－Ｔ７８Ａ、ＴＭ２　Ｐ４６Ｔ－Ｄ１１６Ａ、ＴＭ２　Ｐ４６Ｔ－Ｔ７８Ａ－Ｄ１１６Ａ、ＴＭ２　Ｗ８０Ｋ、及びＴＭ２　Ｐ４６Ｔ－Ｌ９７Ｔについては、回収率についても、精製度についても、野生型ＴＭ２（ＷＴ－ＴＭ２：回収率９５％、精製度９５％）と同程度に精製することが可能であった。
　また、ＴＭ２　Ｗ１０８Ｋ、ＴＭ２　Ｎ１４Ａ、ＴＭ２　Ｔ７８Ａ、ＴＭ２　Ｗ１０８Ｅ、及びＴＭ２　Ｗ６９Ｋについては、２－イミノビオチン－アガロースを用いた精製において、回収率はＷＴより劣るものの、精製は可能であった。
　一方、ＴＭ２　Ｓ３６Ａ－Ｔ７８Ａ－Ｄ１１６Ａ、ＴＭ２　Ｓ３６Ａ－Ｄ１１６Ａ、ＴＭ２　Ａ６６Ｒ、ＴＭ２　Ｐ４６Ｔ－Ａ６６Ｒ、ＴＭ２　Ｔ７８Ａ－Ｄ１１６Ａ、ＴＭ２　Ｐ４６Ｔ－Ａ６６Ｒ－Ｌ９７Ｔ、ＴＭ２　Ａ６６Ｒ－Ｌ９７Ｔ、ＴＭ２　Ａ６６Ｒ－Ｌ９７Ｔ－Ｖ１１３Ｒ、ＴＭ２　Ｌ９７Ｔ－Ｖ１１３Ｒ、ＴＭ２　Ｖ１１３Ｒ、及びＴＭ２　Ｐ４６Ｔ－Ｖ１１３Ｒについては、２－イミノビオチン－アガロース（Ｓｉｇｍａ社製）に結合せず、それを用いて精製することはできなかった。しかしこれらのＬＡＴＭ２は全て、ビオチン－アガロース（Ｓｉｇｍａ社製）には結合し、精製することができた。
　一方、ＴＭ２　Ｐ４６Ｔ－Ａ６６Ｒ－Ｌ９７Ｔ－Ｖ１１３Ｒ及びＴＭ２　Ａ６６Ｒ－Ｖ１１３Ｒは、２－イミノビオチン－アガロースにも、ビオチン－アガロースにも結合しなかった。また、ＴＭ２　Ｐ４６Ｔ及びＴＭ２　Ｌ９７Ｔについてはビオチン－アガロースには結合したが、ＷＴ－ＴＭ２と同様に、過剰ビオチンによる溶出はできなかった。これはビオチンとの結合が極めて強いためと考えられた。
　ＷＴ－ＴＭ２とＴＭ２　Ｓ３６Ａをビオチン－アガロースで精製し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで解析した結果を図１Ａに示す。ＷＴ－ＴＭ２は、図１Ａにおいてフロースルー（ＦＴ）にそのバンドが見られないことから判るように、ビオチン－アガロースに効率よく吸着される。しかしビオチンとのアフィニティが非常に高いため過剰ビオチンによる溶出は不可能であり、溶出液（Ｅｌｕ）にはＷＴ－ＴＭ２は認められなかった。
　一方、同じくＦＴにＴＭ２　Ｓ３６Ａのバンドが見られないことから判るように、ＴＭ２　Ｓ３６Ａは同様にビオチン－アガロースに効率よく吸着されるものの、過剰のビオチンを添加することで溶出され、ＥｌｕにＴＭ２　Ｓ３６Ａのバンドが検出される。このビオチン結合の可逆性はＴＭ２に変異を組み込むことによって、ビオチンとのアフィニティが低下したことによりもたらされたものであると考えられた。他のＬＡＴＭ２、すなわち、ＴＭ２　Ｗ１０８Ｋ、ＴＭ２　Ｗ１０８Ｅ、ＴＭ２　Ｔ７８Ａ（図１Ｂ）、ＴＭ２　Ｄ１１６Ａ（図１Ｃ）、ＴＭ２　Ｐ４６Ｔ－Ｄ１１６Ａ（図２Ａ）、ＴＭ２　Ｐ４６Ｔ－Ｔ７８Ａ－Ｄ１１６Ａ（図２Ｂ）、ＴＭ２　Ｔ７８Ａ－Ｄ１１６（図２Ｃ）、ＴＭ２　Ｐ４６Ｔ－Ｔ７８Ａ（図２Ｄ）についても、同様の実験結果が得られた。
　　１－６）　ＴＭ２　Ｓ３６Ａ－Ｄ１１６Ａ、ＴＭ２　Ｓ３６Ａ－Ｔ７８Ａ－Ｄ１１６Ａのビオチン－アガロース結合における特異的ｐＨ依存性
　ＴＭ２　Ｓ３６Ａ－Ｄ１１６ＡおよびＴＭ２　Ｓ３６Ａ－Ｔ７８Ａ－Ｄ１１６Ａは、ビオチン－アガロース（Ｓｉｇｍａ社製）への結合において他のＬＡＴＭ２に見られないｐＨ依存性を示した。
　ＴＭ２　Ｓ３６Ａ－Ｄ１１６Ａの大腸菌培養液２５ｍＬを、１ｍＭ　ＩＰＴＧで発現誘導した菌体を、１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１．５ｍＬあるいは５０ｍＭのＣＡＰＳ（ｐＨ１２．０）　１．５ｍＬで懸濁し、超音波破砕を行った。その後遠心分離を行い、遠心後の上清にビオチン－アガロース　４００μＬを加えたところ、ビオチン－アガロースに全く結合しなかった。しかしながら、ｐＨ４.０、ｐＨ５．０、またはｐＨ６．０の１００ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液でタンパク質を抽出すると、効率よくビオチン－アガロースへ結合した。さらに、反応液のｐＨをｐＨ７．０あるいはｐＨ１２．０に上げるとＴＭ２　Ｓ３６Ａ－Ｄ１１６Ａは担体から解離し、９５％の効率で回収できた。すなわち、図３Ａにおいて、ｐＨ５とｐＨ６のリン酸カリウム緩衝液で結合させ、ｐＨ７のリン酸カリウム緩衝液で溶出させた実験系ではＴＭ２　Ｓ３６Ａ－Ｄ１１６Ａのバンドが溶出画分に単一バンドとして認められた。一方ｐＨ７のリン酸カリウム緩衝液中では、ＴＭ２　Ｓ３６Ａ－Ｄ１１６Ａは、ビオチン－アガロースには結合せず、フロースルー画分に認められた。
　ＴＭ２　Ｓ３６Ａ－Ｔ７８Ａ－Ｄ１１６ＡについてもｐＨ依存性について実験を行った。ｐＨ４．０あるいはｐＨ１２．０の緩衝液を用いて懸濁し、超音波破砕し、遠心後の上清にビオチン－アガロースを添加したところ、ビオチン－アガロースへの結合を示した。一方、ＴＭ２　Ｓ３６Ａ－Ｄ１１６Ａと同様に、ｐＨ７．０ではビオチン－アガロースには全く結合しなかった。この性質を利用して、ｐＨ４．０でビオチン－アガロースに結合させ、ｐＨ７．０で溶出させることで、高純度のＴＭ２　Ｓ３６Ａ－Ｔ７８Ａ－Ｄ１１６Ａを得ることが出来た（図３Ｂ）。
　　１－７）　ＬＡＴＭ２のサブユニット会合状態
　ＬＡＴＭ２のサブユニット会合状態を分析するために、各種ＬＡＴＭ２の分子量をＦＰＬＣにより測定した。カラムはＳｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ－１００ＨＲ(ＧＥヘルスケア社製)を用いた。分子量測定マーカーとしてＧｅｌ　Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　ＬＭＷ（ＧＥヘルスケア社製）を用いた。緩衝液は、５００ｍＭＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸カリウムを用いた。
　対照のＷＴ－ＴＭ２をインジェクションすることにより、四量体が溶出するピークの位置は４４～４７ｍｌであると規定された。さらに分子量測定マーカーをロードした結果より、単量体が溶出するピークの位置は６３～６６ｍｌ付近であり、二量体が溶出するピークの位置は５１～５４ｍｌ付近であると規定された。
　各種ＬＡＴＭ２を分析した結果を表３に示す。
　［表３］　Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ－１００ＨＲにおけるサブユニットの会合度の分析
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 　ほとんどのＬＡＴＭ２がＷＴ－ＴＭ２と同様に四量体にあたるピークを示し、四量体を維持していることが明らかとなった。しかし、ＴＭ２　Ａ６６Ｒは一部が単量体となっており（全体の約３０％が単量体）、これにさらに４６番目のプロリンからスレオニンへの変異を加えたＴＭ２　Ｐ４６Ｔ－Ａ６６Ｒは、そのほとんどが単量体化していた（全体の約７５％）。また、ＴＭ２　Ｐ４６Ｔ－Ａ６６Ｒ－Ｌ９７Ｔ、ＴＭ２　Ａ６６Ｒ－Ｌ９７Ｔはそれぞれ７２．８％、９０％が単量体化していた。
　一方、ＴＭ２　Ｓ３６Ａ、ＴＭ２　Ｔ７８Ａ，ＴＭ２　Ｄ１１６Ａは四量体を維持していたが、ＴＭ２　Ｓ３６Ａ－Ｔ７８Ａ－Ｄ１１６Ａは二量体として存在していた。さらにＴＭ２　Ｗ１０８Ｋは１００％四量体で存在するが、ＴＭ２　Ｗ１０８Ｅは四量体と二量体が混在しており、その存在比はそれぞれ３３％と６７％であった。
　　１－８）ＬＡＴＭ２のプロテアーゼ耐性
　ビオチン－アガロースにより精製した１０μＭのＬＡＴＭ２（ＴＭ２　Ｓ３６Ａ、ＴＭ２　Ｄ１１６Ａ、ＴＭ２　Ｔ７８Ａ、ＴＭ２　W８０K、ＴＭ２　Ｔ７８Ａ－Ｄ１１６Ａ、ＴＭ２　Ｐ４６Ｔ－Ｔ７８Ａ、ＴＭ２　Ｐ４６Ｔ－Ｄ１１６Ａ、ＴＭ２　Ｓ３６Ａ－Ｄ１１６Ａ、ＴＭ２　Ｓ３６Ａ－Ｔ７８Ａ－Ｄ１１６Ａ、ＴＭ２　P４６T－Ｔ７８Ａ－Ｄ１１６Ａ）を、５μＭ　ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫと５ｍＭ　ＣａＣｌ２を含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中で３０℃、１５分間反応させた。この際、一部のサンプルには最終濃度１ｍＭになるようにビオチンを添加した。その後、ＳＤＳサンプルバッファーを添加し、９５℃で１０分間熱処理することで反応を停止させた。得られたサンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥに供与しＣＢＢ染色を行った。対照として、１０μＭの野生型ＴＭ２と、１６μＭのＢＳＡを同条件で反応させた。結果を図４、図５に示す。
　その結果、ＢＳＡはビオチンの有無に関らずＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ存在下では完全に分解された（図４Ｂ）。しかしながら、野生型（ＷＴ）ＴＭ２（図４Ａ）とＴＭ２－Ｓ３６Ａ（図４Ａ）、ＴＭ２　Ｄ１１６Ａ（図４Ｃ）、ＴＭ２　Ｔ７８Ａ（図４Ｃ、図５Ａ）、ＴＭ２　Ｔ７８Ａ－Ｄ１１６Ａ（図４Ｃ）、ＴＭ２　Ｐ４６Ｔ－Ｔ７８Ａ（図５Ａ）、ＴＭ２　Ｐ４６Ｔ－Ｄ１１６Ａ（図５Ｂ）、ＴＭ２　Ｓ３６Ａ－Ｔ７８Ａ－Ｄ１１６Ａ（図５Ｃ）、ＴＭ２　Ｐ４６Ｔ－Ｔ７８Ａ－Ｄ１１６Ａ（図５Ｄ）、ＴＭ２　Ｗ８０Ｋ（図５Ｄ）はビオチンの有無に関らずＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫが存在しても殆ど分解されず、モノマー以上の分子量を維持していた。このことからＬＡＴＭ２はタンパク質分解酵素に対して安定であることが示された。
　なお、ＴＭ２　Ｓ３６Ａ－Ｄ１１６Ａは、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫの存在下でおよそ半分程度が分解して低分子量化したものの、モノマーのバンドが明瞭に見られ、当該酵素に対して耐性を有していることが示された。（図５Ａ、Ｃ）。
　　１－９）ＬＡＴＭ２の耐熱性
　ＬＡ－ＴＭ２の耐熱性を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって調査した。各タンパク質をＳＤＳサンプルバッファー中で、ビオチンの存在下及び非存在下で所定の温度で２０分間熱処理した後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色を行った。採用した加熱温度はビオチン無しの実験系では８０℃、８２℃、８４℃、８６℃、８８℃、９０℃、９２℃、及び９４℃であり、ビオチンを添加した実験系では８６℃、８８℃、９０℃、９２℃、９４℃、９６℃、９８℃、及び１００℃であった。
　その結果を図６に示す。図６において左側がビオチン無しの実験系であり、右側がビオチン有りの実験系である。図６に示すようにＴＭ２　Ｔ７８Ａにおいて、ビオチン非存在下でのＴｒ値（単量体と四量体の量比が１：１になる温度）は８８℃であり、野生型ＴＭ２のＴｒ値（７８℃）を１０℃も上回った。またビオチン存在下ではサブユニット会合力が増すためにＷＴ－ＴＭ２およびＴＭ２　Ｔ７８Ａの四量体構造が安定し耐熱性が向上すると考えられる。実際、図６に示すように、ＴＭ２　Ｔ７８Ａのビオチン存在下でのＴｒ値は１００℃以上であった。以上のことからＴＭ２　Ｔ７８Ａにおいて、熱安定性が明らかに向上していることが判った。
　実施例２　ＬＡＴＭ２によるビオチン化タンパク質の精製
　上記の様にして調製したＬＡＴＭ２を用いてビオチン化タンパク質を効率よく精製できるか否かを、ＬＡＴＭ２を固定化した担体を作製することにより確認した。
　　２－１）ＬＡＴＭ２－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅの作製
　ＬＡＴＭ２によってビオチン化タンパク質を効率よく精製することが可能であるか否かを調べるために、ＴＭ２　Ｓ３６ＡをＳｈｅｐａｒｏｓｅに固定化したＴＭ２－Ｓ３６Ａ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを作製した。
　まず、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ＨＰ（ＧＥヘルスケア社製）に詰められた樹脂を取り出し、イソプロパノールに再懸濁した。遠心(３０００ｒｐｍ)によってイソプロパノールを除去し、冷やしておいた１ｍＭ　ＨＣｌ　１０ｍＬを添加して活性化した。つぎに、遠心（３０００ｒｐｍ）後、上清を除去することで、ＨＣｌを除去した後、冷やしておいたＭｉｌｌｉ－Ｑ水１０ｍｌを添加した。
　遠心（３０００ｒｐｍ）によってＭｉｌｌｉ－Ｑ水を除去したのち、１．３ｍｇ／ｍＬのＴＭ２　Ｓ３６Ａを０．９ｍｌ添加し、室温で３時間転倒混和した。遠心（３０００ｒｐｍ）によって上清を除去後、５０ｍＭＴｒｉｓ／ＰＢＳ（ｐＨ８．０）を５ｍｌ添加し、さらに室温で２時間転倒混和した。転倒混和後のＳｅｐｈａｒｏｓｅから遠心（３０００ｒｐｍ）によって上清を除去した後、ブロッキング剤として５ｍｌの０．５％ＢＳＡ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を添加し、さらに３０分転倒混和した。最後にＰＢＳ（ｐＨ７．４）５ｍＬで洗浄し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に再懸濁した。なお担体へのＴＭ２　Ｓ３６Ａの結合量は、上清に残存するＴＭ２　Ｓ３６Ａの量を測定し、その値を担体に添加前のタンパク質の量から差し引くことで算出した。その結果、添加したタンパク質の８６％に相当する１．０１ｍｇのＴＭ２　Ｓ３６Ａが担体に結合していた。
　同様のビオチン可逆結合性を示す他のＬＡＴＭ２（ＴＭ２　Ｐ４６Ｔ－Ｔ７８Ａ、ＴＭ２　Ｐ４６Ｔ－Ｄ１１６Ａ、ＴＭ２　Ｄ１１６Ａ）についても担体への結合量を検討したところ、ＴＭ２　Ｐ４６Ｔ－Ｔ７８Ａは０．８５３ｍｇ添加し２５%の０．２１ｍｇが、ＴＭ２　Ｐ４６Ｔ－Ｄ１１６Ａは０．７６１ｍｇ添加し９３％の０．７０９ｍｇが、ＴＭ２　Ｄ１１６Ａは１．１６ｍｇ添加し８７％の１．０１ｍｇが結合していた。
　　２－２）ビオチン化ＢＳＡの精製
　作製したＴＭ２－Ｓ３６Ａ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いてビオチン化タンパク質の精製を試みた。精製するビオチン化タンパク質としてＥＺ－Ｌｉｎｋ（登録商標）ＮＨＳ－ビオチン（リンカー長１３．５オングストローム、ＰＩＥＲＣＥ社製）でビオチン化したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（以下ビオチン化ＢＳＡ）を用いた。
　本発明の改変型低親和性タマビジンを用いたビオチン化ＢＳＡの精製実験を行った。０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＴＭ２－Ｓ３６Ａ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ７５μＬに、１．６６μｇ　ビオチン化ＢＳＡ、ならびに大腸菌ＴＢ１菌体抽出液を３００μＬ添加した。菌体抽出液は、大腸菌ＴＢ１の菌体を０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で懸濁後、超音波により破砕し遠心により上清を回収したものを用いた。１．５時間転倒混和を行った後、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で三回洗浄し、５ｍＭのビオチンを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）３００μＬによって溶出した。なお対照として菌体抽出液の代わりに１．６６μｇのビオチン－ＢＳＡを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）３００μＬを用いた。その結果を図７に示す。図７において、左側がビオチン化ＢＳＡと菌体抽出液をＴＭ２－Ｓ３６Ａ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに添加した実験系、右側がビオチン化ＢＳＡのみをＴＭ２－Ｓ３６Ａ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに添加した実験系である。
　図７に示すように、精製前（ｔｏｔａｌ）のサンプルに存在したビオチン化ＢＳＡは、フロースルー（ＦＴ）の画分と洗浄液（Ｗ）においては殆ど検出されなかったが、溶出液（Ｅｌｕ）においては検出された。すなわち、ＴＭ２－Ｓ３６Ａ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いると、菌体抽出液中の様々なタンパク質から、ビオチン化ＢＳＡを特異的に結合し、精製できることが明らかとなった。ビオチン化ＢＳＡの回収率は８０％、精製度は９５％であった。なお、溶出画分にＴＭ２－Ｓ３６Ａと思われるバンドは殆ど検出されなかった。
　同様の結果がＴＭ２　Ｄ１１６Ａ、ＴＭ２　Ｐ４６Ｔ－Ｔ７８Ａ、ＴＭ２　Ｐ４６Ｔ－Ｄ１１６ＡをＳｅｐｈａｒｏｓｅに固定化したＴＭ２－Ｄ１１６Ａ－Ｓｅｐａｈａｒｏｓｅ（図８Ａ）、ＴＭ２－Ｐ４６Ｔ－Ｔ７８Ａ－Ｓｅｐａｈａｒｏｓｅ（図８Ｂ）、ＴＭ２－Ｐ４６Ｔ－Ｄ１１６Ａ－Ｓｅｐａｈａｒｏｓｅ（図８Ｃ）、においても得られた。即ち、これらの担体にビオチン化ＢＳＡを上記と同様に、効率よく結合させ、効率よく回収することが出来た。図８Ａ、Ｂにビオチン化ＢＳＡを、ＴＭ２－Ｄ１１６Ａ－ＳｅｐａｈａｒｏｓｅもしくはＴＭ２－Ｐ４６Ｔ－Ｔ７８Ａ－Ｓｅｐａｈａｒｏｓｅに結合させ、６０％の回収率、精製度９５％でビオチン化ＢＳＡを回収する例を記載した。さらに図８Ｃにはビオチン化ＢＳＡ、もしくはビオチン化ＢＳＡに大腸菌の菌体抽出液を混和したものから、ＴＭ２－Ｐ４６Ｔ－Ｄ１１６Ａ－Ｓｅｐａｈａｒｏｓｅを用いて８０％の回収率、９５％の精製度でビオチン化ＢＳＡを精製する例を記載した。
　また、ＴＭ２　Ｓ３６Ａよりもビオチン親和性が低下していると思われるＬＡＴＭ２（ＴＭ２　Ｗ８０Ｋ、ＴＭ２　Ｔ７８Ａ－Ｄ１１６Ａ、ＴＭ２　Ｐ４６Ｔ－Ｔ７８Ａ－Ｄ１１６Ａ）をＳｅｐｈａｒｏｓｅに固定化したものについても、大腸菌粗抽出液からのビオチン化タンパク質（ＢＳＡ）の精製を検討した。その結果、ＴＭ２－Ｓ３６Ａ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに比べ、精製効率が若干低下していたが、ビオチン化タンパク質を精製することができた。その回収率および精製度は、ＴＭ２－Ｗ８０Ｋ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅが回収率２５％、精製度８０％、ＴＭ２－Ｔ７８Ａ－Ｄ１１６Ａ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅが回収率６０％、精製度８５％、ＴＭ２　Ｐ４６Ｔ－Ｔ７８Ａ－Ｄ１１６Ａ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅが回収率６０％、精製度８０％であった。
　　２－３）　ＴＭ２　Ｓ３６Ａ－Ｄ１１６Ａのビオチンへの結合におけるｐＨ依存性
　ＴＭ２　Ｓ３６Ａ－Ｄ１１６Ａは、先の1－６）で述べたように、ビオチン－アガロース（Ｓｉｇｍａ社製）への結合において、特異的なｐＨ依存性を示した。そこでＴＭ２　Ｓ３６Ａ－Ｄ１１６Ａを共有結合でｓｅｐｈａｒｏｓｅに結合させたＳ３６Ａ－Ｄ１１６Ａ－ｓｅｐｈａｒｏｓｅを作製し、ビオチン化タンパク質を精製する際のｐＨ依存性を検討した。
　上記の２－１）と同様にしてＳ３６Ａ－Ｄ１１６Ａ－ｓｅｐｈａｒｏｓｅを作製した。作製したＳ３６Ａ－Ｄ１１６Ａ－ｓｅｐｈａｒｏｓｅに、ｐＨ５、ｐＨ６、あるいはｐＨ７の１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液中で、ビオチン化ＢＳＡを結合させた。５００ｍＭ　ＮａＣｌを含むｐＨ４またはｐＨ７のリン酸カリウム緩衝液でよく洗浄した後、ｐＨ７のリン酸カリウム緩衝液を加えてビオチン化ＢＳＡを溶出した。各フラクション溶液に等量の２ｘＳＤＳ　Ｓａｍｐｌｅ　Ｂｕｆｆｅｒを添加し、９５℃で１０分処理した後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供与し、さらに銀染色ＩＩキット（和光純薬社製）を用いてタンパク質を銀染色した。
　ｐＨ５、ｐＨ６、あるいはｐＨ７で結合させた場合の、精製前（ｔｏｔａｌ）、フロースルー画分（ＦＴ）、洗浄液（Ｗ）、溶出液（Ｅｌｕ）の各サンプルにおける、ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を図９に示す。図９に示されるようにｐＨ５とｐＨ６においては、溶出液中にビオチン化ＢＳＡのバンドが認められた。従ってＳ３６Ａ－Ｄ１１６Ａ－ｓｅｐｈａｒｏｓｅは、ｐＨ５あるいはｐＨ６においてはビオチン化タンパク質を結合し、ｐＨ７においてこれを解離させるという特徴的なｐＨ依存性を示した。一方ｐＨ７では、ビオチン化ＢＳＡはＳ３６Ａ－Ｄ１１６Ａ－ｓｅｐｈａｒｏｓｅに結合しなかった。
　この結果から、ＴＭ２　Ｓ３６Ａ－Ｄ１１６Ａ－ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いると、極めて穏和なｐＨ条件下（例えばｐＨ５で結合、ｐＨ７で溶出）でビオチン化タンパク質の精製が可能であることが明らかとなった。

Claims (18)

  1. 　配列番号２に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中に１から複数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列、又はこの配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ビオチン結合活性を示すタンパク質において、
    以下のグループ：
    　１）配列番号２の３６番目のセリン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換；
    　２）配列番号２の８０番目のトリプトファン残基の親水性アミノ酸残基への置換；
    　３）配列番号２の１１６番目のアスパラギン酸残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換；
    　４）配列番号２の４６番目のプロリン残基のスレオニン、セリン若しくはチロシン残基への置換、及び、７８番目のスレオニン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換；
    　５）配列番号２の４６番目のプロリン残基のスレオニン、セリン若しくはチロシン残基への置換、及び、１１６番目のアスパラギン酸残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換：並びに
    　６）配列番号２の４６番目のプロリン残基のスレオニン、セリン若しくはチロシン残基への置換、７８番目のスレオニン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換、及び、１１６番目のアスパラギン酸残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換
    から選択される置換を有することを特徴とする、改変型ビオチン結合タンパク質。
  2. 　１－ａ）配列番号２の３６番目のセリン残基がアラニンに置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２　Ｓ３６Ａ）；
    　２－ａ）配列番号２の８０番目のトリプトファン残基がリジンに置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２　Ｗ８０Ｋ）；
    　３－ａ）配列番号２の１１６番目のアスパラギン酸残基がアラニンに置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２　Ｄ１１６Ａ）；
    　４－ａ）配列番号２の４６番目のプロリン残基がスレオニンに置換されており、そして、７８番目のスレオニン残基がアラニンに置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２　Ｐ４６Ｔ－Ｔ７８Ａ）；
    　５－ａ）配列番号２の４６番目のプロリン残基がスレオニンに置換されており、そして、１１６番目のアスパラギン酸残基がアラニンに置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２　Ｐ４６Ｔ－Ｄ１１６Ａ）；並びに
    　６－ａ）配列番号２の４６番目のプロリン残基がスレオニンに置換されており、７８番目のスレオニン残基がアラニンに置換されており、そして、１１６番目のアスパラギン酸残基がアラニンに置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２　Ｐ４６Ｔ－Ｔ７８Ａ―Ｄ１１６Ａ）
    からなるグループから選択される、請求項１に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
  3. 　以下の性質：
    　ｉ）ビオチンを用いた精製が可能である；
    　ｉｉ）配列番号２の記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の四量体構造を維持している；
    　ｉｉｉ）プロテアーゼに対し耐性を有する；及び
    　ｉｖ）大腸菌の可溶性画分において高い発現を示す
    の１ないし全部を満たす、請求項１又は２に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
  4. 　配列番号２に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中に１から複数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列、又はこの配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ビオチン結合活性を示すタンパク質において、
    　６）配列番号２の７８番目のスレオニン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換
    を有することを特徴とする改変型ビオチン結合タンパク質。
  5. 　６－ａ）配列番号２の７８番目のスレオニン残基がアラニン残基へ置換されている、請求項４に記載の改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２　Ｔ７８Ａ）。
  6. 　以下の性質：
    　ｉ）ビオチンを用いた精製が可能である；
    　ｉｉ）配列番号２の記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の四量体構造を維持している；
    　ｉｉｉ）プロテアーゼに対し耐性を有する；及び
    　ｖ）配列番号２の記載のアミノ酸配列からなるタンパク質よりも、高い耐熱性を有する
    の１ないし全部を満たす、請求項４又は５に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
  7. 　配列番号２に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中に１から複数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列、又はこの配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ビオチン結合活性を示すタンパク質において、
    以下のグループ：
    　７）配列番号２の３６番目のセリン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換、及び、１１６番目のアスパラギン酸残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換；並びに
    　８）配列番号２の３６番目のセリン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換、７８番目のスレオニン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換、及び、１１６番目のアスパラギン酸残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換
    から選択される置換を有することを特徴とする、改変型ビオチン結合タンパク質。
  8. 　７－ａ）配列番号２の３６番目のセリン残基がアラニンに置換されており、そして、１１６番目のアスパラギン酸残基がアラニンに置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２　Ｓ３６Ａ―Ｄ１１６Ａ）；並びに
    　８－ａ）配列番号２の３６番目のセリン残基がアラニンに置換されており、７８番目のスレオニン残基がアラニンに置換されており、そして、１１６番目のアスパラギン酸残基がアラニンに置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２　Ｓ３６Ａ－Ｔ７８Ａ―Ｄ１１６Ａ）
    からなるグループから選択される、請求項７に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
  9. 　以下の性質：
    　ｉ）ビオチンを用いた精製が可能である；
    　ｉｉｉ）プロテアーゼに対し耐性を有する；及び
    　ｖｉ）弱酸性条件下でビオチンと結合し、そして、中性条件下でビオチンと結合しない
    の１ないし全部を満たす、請求項７又は８に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
  10. 　配列番号２に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中に１から複数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列、又はこの配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ビオチン結合活性を示すタンパク質において、
    　９）配列番号２の７８番目のスレオニン残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換、及び、１１６番目のアスパラギン酸残基の水素結合を形成しないアミノ酸残基への置換
    を有することを特徴とする、改変型ビオチン結合タンパク質。
  11. 　９－ａ）配列番号２の７８番目のスレオニン残基がアラニンに置換されていおり、そして、１１６番目のアスパラギン酸残基がアラニンに置換されている、請求項１０に記載の改変型ビオチン結合タンパク質（ＴＭ２　Ｔ７８Ａ―Ｄ１１６Ａ）。
  12. 　以下の性質：
    　ｉ）ビオチンを用いた精製が可能である；
    　ｉｉ）配列番号２の記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の四量体構造を維持している；
    　ｉｉｉ）プロテアーゼに対し耐性を有する；
    　ｉｖ）大腸菌の可溶性画分において高い発現を示す；及び
    　ｖｉｉ）イミノビオチンで精製できない
    の１ないし全部を満たす、請求項１０又は１１のいずれか１項に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
  13. 　配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質よりも、低いビオチン結合性を示す、請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
  14. 　以下のａ）－ｌ）
    　ａ）配列番号２の１４番目のアスパラギン残基は改変されていない、あるいはグルタミン又はアスパラギン酸に置換されている；
    　ｂ）配列番号２の１８番目のセリン残基は改変されていない、あるいはスレオニン又はチロシンに置換されている；
    　ｃ）配列番号２の３４番目のチロシン残基は改変されていない、あるいはセリン又はスレオニンに置換されている；
    　ｄ）配列番号２の３６番目のセリン残基は改変されていない、あるいはスレオニン又はチロシンに置換されている；
    　ｅ）配列番号２の４０番目のアスパラギン酸残基は改変されていない、あるいはアスパラギン以外の残基に置換されている；
    　ｆ）配列番号２の６９番目のトリプトファン残基は改変されていない；
    　ｇ）配列番号２の７６番目のセリン残基は改変されていない、あるいはスレオニン又はチロシンに置換されている；
    　ｈ）配列番号２の７８番目のスレオニン残基は改変されていない、あるいはセリン又はチロシンに置換されている；
    　ｉ）配列番号２の８０番目のトリプトファン残基は改変されていない；
    　ｊ）配列番号２の９６番目のトリプトファン残基は改変されていない；
    　ｋ）配列番号２の１０８番目のトリプトファン残基は改変されていない；
    　ｌ）配列番号２の１１６番目のアスパラギン酸残基は改変されていない、あるいはグルタミン酸又はアスパラギンに置換されている
    　ｍ）配列番号２の４６番目のプロリン残基は改変されていない；
    　ｎ）配列番号２の６６番目のアラニン残基は改変されていない；
    　ｏ）配列番号２の９７番目のロイシン残基は改変されていないか、イソロイシンに改変されている；及び
    　ｐ）配列番号２の１１３番目のバリン残基は改変されていない
    の１ないし全ての条件を満たす、ただし、このうち、１）ないし９）で特定したアミノ酸残基は、１）ないし９）の各々で特定したように置換されている、
    請求項１ないし１３のいずれか１項に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
  15. 　配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１ないし１４のいずれか１項に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
  16. 　請求項１ないし１５のいずれか１項に記載のタンパク質を固定化した担体。
  17. 　請求項１ないし１５のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸。
  18. 　請求項１７に記載の核酸を含むベクター。
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