WO2010149150A2 - Farblose, magnetische polymerpartikel für den hochempfindlichen nachweis von biologischen substanzen und pathogenen im rahmen der bioanalytik und diagnostik - Google Patents

Farblose, magnetische polymerpartikel für den hochempfindlichen nachweis von biologischen substanzen und pathogenen im rahmen der bioanalytik und diagnostik Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to colorless, magnetic polymer particles having adjustable particle size and adaptable magnetic colloid content, which contain a high proportion of white pigments, whereby the polymer particles obtain a white or whitish color.
  • the addition of the white pigments covers the deep brown or black color of the usual magnetic polymer particles, making these particles particularly well suited for optical detection in combination with colored or fluorescent particles or labeled antibodies.
  • Magnetic polymer particles have been known for years from various publications and patents. Thus, in US Pat. Nos. 4,152,210 and 4,343,901, silanized iron oxide particles and ferromagnetic particles produced by a sol-gel technique are described for the immobilization of enzymes.
  • DE 10331439B3 discloses a process for producing high metal oxide nanoparticles consisting of metal oxide polymer composites used in bioanalysis and diagnostics. To produce the magnetic particles according to the invention, high-pressure homogenization is used.
  • Spherical particles of polyacrylate and polystyrene are the subject of U.S. Patent 4,654,267. With the aid of suspension polymerization, pearled particles are produced, which are then swollen in an organic phase under defined conditions. This is followed by incubation of the polymer particles with a Fe (II) / Fe (III) salt solution, which is subsequently precipitated by addition of a base to an iron oxide which precipitates in the pores of the swollen polymer. The method provides peribular particles with particle sizes between 0.5 and 20 microns.
  • US Pat. No. 5,320,944 discloses 0.2-3 ⁇ m magnetic particles which obtain magnetic properties by coating with iron oxides. By Further coating of the particles with silanes, nylon or polystyrene, antibodies can then be coupled to the particles for use in immunoassay.
  • Ferrofluid-coated magnetic hybrid particles coated with a functional polyacrylate are disclosed in US Pat. No. 5,648,124.
  • US Pat. Nos. 6,204,033 and 6,514,688 describe polyvinyl alcohol-based spherical magnetic polymer particles which can be prepared within a short time by means of inverse suspension crosslinking.
  • All magnetic particles known from the prior art have in common that they are colored deep brown to black and thus in combinatorial applications with colored or fluorescent particles or labeled antibodies in the context of bioanalytical or diagnostic applications, the Farblich. Effectively impair fluorescence signals of the marker systems. That is, the marker signals are covered by the deep brown or black color of the magnetic particles, which are caused by the various iron oxides (FeO, Fe 2 O 3 , Fe 3 O 4 ) or ferrites, thereby minimizing or interfering with the detection sensitivity.
  • most known methods for producing magnetic particles have disadvantages in terms of the temporal and technical manufacturing process.
  • the object of the present invention is to obviate the drawbacks of the prior art products and to provide methods of producing white or whitish-colored magnetic polymer particles which do not require laborious and time-consuming coating techniques and which, because of their Color for diagnostic and analytical detection methods, which are based on optical detection are very suitable. These measures allow the polymer particles to be used more efficiently in bioanalysis and diagnostics. By covering the original brown-black color, it is possible to make detection methods, which are carried out on the principle of combination with colored or fluorescent particles, much more sensitive.
  • the colorless, magnetic polymer particles according to the invention can be used particularly advantageously in such bioanalyses, in which polymeric magnetic particles combined with colored or fluorescent particles or fluorescence-labeled antibodies are used.
  • the central concern of the present invention is to cover or avoid the usual either deep brown or black color magnetic polymer particles and thus to arrive at a colorless product.
  • This object is surprisingly achieved in that the polymer or monomer phase in addition to a magnetic colloid, a white pigment is added, which is incorporated in the polymerization in the resulting particle and is able to determine the color of the particles.
  • the originally brown-black color of the magnetic particles is covered and the polymer particles get a whitish tone.
  • the subject of this patent application are colorless, magnetic polymer particles comprising at least one polymer, at least one magnetic colloid, at least one crosslinker and at least one white pigment.
  • the term colorless herein means that the particles appear white due to the pigments admixed, that is to say they are not colored and thus have no color.
  • the polymer particles are not transparent or transparent but whitish colored.
  • the term “whitish colored” is therefore replaced by the term “colorless” or the term “colorless” is used as a synonym for "white” or “whitish”.
  • the term polymer particles refers to particles or particles consisting of one or more polymers. Included in these polymer particles are at least one type of magnetic colloid, a crosslinker and a white pigment.
  • the crosslinker is of course not included in its originally added form as Gutardialdehyd in the polymer particles, but serves to further crosslink the at least one polymer used and in this crosslinking process, the crosslinker itself is incorporated in the formed crosslinked polymer, ie chemically bonded, while the magnetic colloids and white pigments are incorporated into the newly formed cross-linked polymer particles, that is usually not covalently linked to the polymer chains, but are included in the polymer network.
  • the monomers can also be used, which are then reacted immediately by polymerization and preferably free radical polymerization to the polymer network of the polymer particles, wherein the magnetic colloids and white pigments are included.
  • white pigments or "at least one white pigment” is intended to indicate that more than one type of white pigment, eg TiO 2 and CaO, may be present in a polymer particle. It goes without saying that more than one molecule of a white pigment and more than one molecule of a magnetic colloid are contained per polymer particle.
  • the preparation of the polymer particles is not a coating with magnetic colloids or white pigments or a coating of the magnetic colloids and / or white pigments, but a mixing of all constituents or incorporation of the magnetic colloids and white pigments in the formed by crosslinking polymeric structure of the polymer particles ,
  • the subject of this patent application colorless, magnetic polymer particles containing or consisting of at least one polymer, at least one magnetic colloid, at least one crosslinker and at least one white pigment.
  • the present invention relates to colorless, magnetic polymer particles containing or consisting of at least one polymer crosslinked by means of the at least one crosslinker, at least one magnetic colloid and at least one white pigment, wherein magnetic colloid and white pigment are incorporated in the crosslinked polymer.
  • the polymer particles according to the invention are preferably spherical.
  • the polymers used are water-soluble.
  • the term water-soluble refers to those polymers with which at least 1 wt .-% solution in water at room temperature can be prepared.
  • the polymers used are water-soluble with an amount of at least 10 g per 100 ml of water, have a molecular weight of 5000 g / mol to 2 x 10 6 g / mol and / or an average degree of polymerization of 1,000 - 60,000.
  • the at least one polymer is selected from the group consisting of polyvinyl alcohol, silica gel, gelatin, polysaccharides, proteins, chitosan, agarose, dextran, polyamino acids, polyacrylamide, hyaluronic acid, polyvinylpyrrolidone, polyacrylates, polyacrylic acid, polyamides , Polyetheramides, polyethyleneamine, polyimides, carboxymethylchitosan, polyvalents, carboxymethylcellulose, cellulose, cellulose nitrates, cellulose acetates, cellulose triacetates, cellulose ethers, hydroxyethylcellulose, silicone prepolymers, copolymers of polylactides and polyglycolides, polyanhydrides, polymaleic anhydrides, polyhydroxymethacrylates, poly ( ⁇ -ethylglutamate), glycolated polyesters, polyethylene oxide propylene oxide, polyetherester, polyethylene oxide, carrageenans
  • suitable white pigments are those substances which both have a strong whitening and thus cover the color of the magnetic colloid and are able to form a finely dispersed mixture with the polymer phase.
  • Preferred white pigments for this purpose are: titanium dioxide, zinc oxide, barium sulfate (BaSO 4 ), zinc sulfide, lead carbonate, calcium carbonate, calcium aluminate sulfate, lithopones and mixtures thereof.
  • Particularly high coverage properties are achieved by titanium (iv) oxide, a mixture of barium sulfate and zinc sulfide and calcium aluminate sulfate.
  • White pigments are defined herein as achromatic inorganic pigments having a high refractive index, which is preferably greater than 1.5, and more preferably greater than 1.8.
  • the term “pigment” generally refers to colorants.Pigments are preferably insoluble in the application medium, but the term “pigments” is also to be understood as including “dyes.” Pigments or white pigments in the sense of the invention can be present in powder form or as aqueous dispersions and used.
  • Lithopones are artificial non-toxic white pigments consisting of barium sulphate (barite, BaSO 4 ) and zinc sulphide (ZnS). Lithopone can also contain up to 2% zinc oxide (ZnO). Lithopone is produced in a special manufacturing process where both components are in one operation be like. Lithopone is listed in the Color Index as Cl. Pigment White 5 performed. Lithopone is alternatively referred to as Charlton white, Chinese permanent white, opaque white, enamel white, sulfur zinc white or sulfide white.
  • a preferred particle size of the white pigments which are added to the polymer particles according to the invention is between 1 nm and 1 .mu.m, preferably between 10 nm and 500 .mu.m; particle sizes of less than 500 nm and even more preferably less than 300 nm are particularly preferred.
  • the present invention preferably consists of a colorless, magnetic polymer particle, wherein the at least one white pigment is selected from the group consisting of or consisting of CaO, Pb (OH) 2 * 2 PbCO 3 , titanium dioxide, zinc sulfide, zinc oxide, lead carbonate, calcium aluminate sulfate, barium sulfate, Calcium carbonate, lithopone, cristobalite, clay, kaolin, selenet (Marienglas) or mixtures thereof.
  • all pigments or dyes having a refractive index> 1.5 are suitable as white pigments.
  • the magnetic colloids suitable for the colorless magnetic polymer particles generally have a particle size of 10 nm to 500 nm, preferably from 30 to 150 nm, and even more preferably a particle size of 50 nm to 100 nm.
  • the addition of the magnetic colloids to the polymer solution is controlled so that their weight fraction in the finished polymer particles is between 10 and 60%, preferably between 30 and 50%.
  • magnetic colloid or “ferrofluid”
  • magnetic colloids by definition, all magnetic nanoparticles are combined which form a colloidal dispersion in water.
  • the magnetic nanoparticles or magnetic colloids in question compounds consist either of iron oxides such as FeO or Fe 2 ⁇ 3 , magnetite, transition metal oxides, ferrites or other ferro-, ferri- or superparamagnetic substances.
  • the preparation of such colloids or ferrofluids is evident from various publications and can be used without restriction by a person skilled in the art at any time: Shinkai et al. Biocatalysis, VoI 5, 61, 1991; Kondo et al., Appl. Microbiol. Biotechn., Vol. 41, 99, 1994, U.S.
  • Patent 4,827,945 U.S. Patent 4,329,241.
  • Magnetic colloids of this type are also commercially available, inter alia, from the companies FerroTec Corp., USA, Advanced Magnetics, USA, Taibo Co, Japan, Liquids Research Ltd., Wales, BASF, Schering AG, Germany.
  • a preferred colorless, magnetic polymer particle contains at least one magnetic colloid selected from the group consisting of or consisting of magnetite, maghemite, transition metal oxides, ferrites and / or other nanoparticulate ferro, ferri or superparamagnetic compounds.
  • the magnetic moments of individual particles are not independent of each other, but align spontaneously in parallel. However, the coupling of the magnetic moments does not extend over the entire material but is limited to small areas, the Weschen districts.
  • the inventive colorless, magnetic polymer particles are preferably spherical particles having a size of from 0.5 to 2000 ⁇ m, more preferably from 1 to 500 ⁇ m, more preferably from 1 to 200 ⁇ m and even more preferably from 1 to 150 ⁇ m.
  • the present invention relates to colorless, magnetic polymer particles consisting of at least one polymer, at least one magnetic colloid, at least one crosslinker and at least one white pigment.
  • these particles may include other components in trace amounts or very small amounts up to ppm (parts per million).
  • a colorless, magnetic and preferably spherical polymer particles according to the invention may further comprise stabilizers, solvents and / or oils in a very small amount.
  • the polymer particles are purified after their preparation to remove also the stabilizers, solvents, oils and other reagents used in the preparation.
  • the solidification of the polymer droplets in the organic phase to solid particles by addition of a crosslinker occurs during the dispersion.
  • the crosslinkers required to solidify the polymer droplets are either added to the polymer phase prior to dispersion, or in the case of short crosslinking reactions (polyvinyl alcohol, silica gel, alginate) during the dispersing process, if the crosslinking reaction usually lasts longer than 2 minutes.
  • Suitable crosslinkers are in principle those agents which have bifunctional or trifunctional compounds such as dialdehydes, carboxylic acid chlorides, divinyl sulfone, bisoxiranes or carboxylic acids. Dilute glutaraldehyde solutions are preferably used, since they crosslink the polymer under acid catalysis within a few minutes to form solid particles with acetal formation. The other substances require one to two hours of reaction time.
  • the crosslinking by glutaraldehyde which is usually used as a 3-12% solution, takes consistently 20 to 160 seconds. Arrive as acid catalysts in the case of glutaraldehyde crosslinking
  • mineral acids in the form of a 1-3 molar hydrochloric acid or sulfuric acid for use, wherein the volume fraction in the polymer batch is between 5 and 10%, preferably between 6 and 8%.
  • bi- or trivalent ions such as, for example, Sr 2+ , Ca 2+ , Mg 2+ , Cu 2+ , Ba 2+ , Al 3+ can also be used for crosslinking the polymer particles formed in an oil phase.
  • calcium ions are used in the form of calcium chloride.
  • This substance is inexpensive, non-toxic and can crosslink the dispersed polymer droplets to solid particles within a few seconds.
  • concentration of the crosslinking agent is generally selected such that the spherical polymer particles obtained have a sufficient mechanical stability, which also allow a more minute ultrasound treatment of the polymer particles.
  • stabilizers are also generally referred to as "stabilizers”, “surfactants” or “emulsifiers”, to the magnetic colloids.
  • stabilizer is used throughout as a synonym for “stabilizers”, “surfactants” and “emulsifiers”.
  • the stabilizers may be selected from a group comprising: alkylarylpolyethersulfonates, citrates, oleic acid, alkylnaphthalenesulfonates, alkylsulfosuccinates, laurylsulfate, sodium dodecylsulfate, phosphate esters, alcohol ether sulfates, alkylaryl polyethersulfates, pyrophosphate or petroleum sulfonates as anionic substances, DEAE-dextran, polyethyleneimines or dodecyltrimethylammonium chloride as cationic surfactants and alkylaryloxypolyethoxy-ethanols, Polyethylene glycol, nonylphenoxypolyglycidol, polyvinylpyrrolidone or nonylphenol as nonionic substances.
  • polymeric stabilizers in the form of polyethylene glycol, polyacrylic acid, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, Na pyrophosphate, starch, dextran, albumin, decyltrimethylammonium bromide, aromatic or aliphatic sulfonic acid derivatives or aliphatic Carboxylic acids proved to be particularly suitable.
  • the stabilizers for the magnetic colloids generally have a concentration of 0.1 to 5 wt .-%.
  • the magnetic colloids suitable for the compositions according to the invention generally have a particle size of 10 to 500 nm, preferably one of 30 to 150 nm.
  • the addition of the ferrofluids to the polymer solution is controlled so that their weight fraction in the polymer solution is between 10 and 60 wt .-%, preferably between 30 and 50 wt .-%.
  • the pure solvents disclosed herein are suitable for forming the basis for stable polymer dispersions, it has been found to be advantageous to be able to produce particle sizes of ⁇ 10 ⁇ m by adding certain stabilizers to the organic phase, which are preferred in the bioassay and in the Diagnostics can be used.
  • Fatty alkyl tetraglycol ether phosphoric acid esters polyethylene glycol octadecyl ethers, polyoxypropylene-ethylenediamine block copolymers, polyoxyethylene-polyoxypropylene-ethylene diamine block copolymers, polyglycerol monocarboxylic acid esters,
  • Fatty acid esters polyethylene glycols, polyoxyethylene-polyoxypropylene copolymers, polyhydroxy fatty acid-polyethylene glycol block copolymers and polystyrenesulfonic acid, phosphoric acid derivatives have proven particularly suitable.
  • Substances of this kind are commercially available, inter alia. under the trade name: Tetronic, Hypermer, Synperonic, Pripol, Arlacel, Brij, Hostaphat, Estol, Eumulgin, Pluronic, Renex, Triton, Span, Tween, Tetronic, Dehymuls, Prisorine, Isofol or Lameform.
  • the stabilizer concentrations relevant for the preparation of the magnetic particles are between 0.1 and 25 wt .-%, preferably between 0.5 and 6 wt .-%, based on the organic phase.
  • the ingredients stabilizer, solvent and oil can be added individually or together.
  • the invention preferably comprises colorless magnetic polymer particles wherein the polymer is from 1% to 20% by weight in the polymer particle and wherein the magnetic colloid is from 10% to 60% by weight in the polymer particle and wherein the crosslinker is 0 , 1 wt .-% to 5 wt .-% in the polymer particle and wherein the white pigment to 5 wt .-% to 40 wt .-% is contained in the polymer particles.
  • the invention further comprises colorless magnetic polymer particles wherein the polymer is from 1% to 20% by weight in the polymer particle and wherein the magnetic colloid is from 10% to 60% by weight in the polymer particle and wherein the crosslinker is 0 , 1 wt .-% to 5 wt .-% in the polymer particle and wherein the white pigment to 5 wt .-% to 40 wt .-% in the polymer particles and unavoidable impurities in stabilizers, solvents and / or oils are included if stabilizers and / or oils were used in the production.
  • the weight fraction of the polymer includes all substances participating in the polymerization reaction, these substances being covalently linked to one another via the polymerization.
  • polymers it was surprisingly shown that it was also possible to use, preferably, free-radically polymerizable monomers as starting material for the synthesis of the desired polymer particles.
  • Particularly preferred are polymerizable vinyl monomers.
  • Functional monomers which have carboxyl, hydroxyl, aldehyde, epoxy or amino groups are particularly suitable for this preparation.
  • Nonlimiting examples of this are: acrylic acid, methacrylic acid, 2-hydroxyethyl methacrylate, 2-hydroxyethyl acrylate, acrolein, itaconic acid, maleic acid, glycidyl methacrylate.
  • acrylic acid or methacrylic acid is used as the base monomer.
  • (meth) acrylate 3-dimethylaminopropyl (meth) acrylate, methacrylamide, N-methylol acrylamide and or N-methylol-methacrylamide.
  • preferred processes for producing colorless magnetic polymer particles are characterized in that the polymers consist of monomers which are formed by free-radical polymerization during the dispersion process.
  • Monomers preferred for this purpose are acrylic acid, methacrylic acid, 2-hydroxyethyl methacrylate, 2-hydroxyethyl acrylate, itaconic acid or acrolein or mixtures thereof.
  • these polymer particles are prepared by free-radical polymerization.
  • initiators such as free-radical initiators are preferably added in order to allow the desired reaction and to start, that is to initiate. They irreversibly participate in the reaction and are incorporated into the polymers, ie they are part of the polymers in the finished polymer particle and contribute to the proportion by weight of the polymers.
  • the same amounts of magnetic colloid and white pigment are used in principle as for the starting materials of polymers or oligomers to be crosslinked.
  • the present invention comprises a colorless, magnetic polymer particle, wherein the at least one polymer was obtained by polymerization of the following monomers: acrylic acid, methacrylic acid, 2-hydroxyethyl methacrylate, 2-hydroxyethyl acrylate, itaconic acid or acrolein N-vinylpyrrolidone, acrylamide, methacrylamide or mixtures thereof ,
  • the present invention also encompasses a process for the preparation of colorless, magnetic polymer particles which consists of or comprises the following steps:
  • crosslinkable polymers which term also includes crosslinkable oligomers, or polymerizable monomers which are preferably free-radically polymerizable, anionic or cationic polymerization also being possible, and at least one magnetic colloid and the at least one white pigment.
  • crosslinkable polymer, magnetic colloid and white pigment at least one crosslinker is additionally required.
  • These 4 components are provided as a solid, preferably as a powder or in aqueous dispersion or as a mixture. Basically, it is irrelevant which component of crosslinkable polymer, magnetic colloid and white pigment is added to which component.
  • an aqueous solution or aqueous dispersion of crosslinkable polymer, magnetic colloid and white pigment is obtained.
  • an organic and water-immiscible phase is added to this aqueous solution or aqueous dispersion.
  • the aqueous phase and the organic phase are thoroughly mixed and the polymers are crosslinked, including magnetic colloid and white pigment, by adding a crosslinker with thorough mixing of the aqueous phase-organic phase two-phase system.
  • the present invention also relates to a process consisting of or comprising the following steps:
  • crosslinkable polymers including crosslinkable oligomers
  • polymerizable monomers instead of the crosslinkable polymers (including crosslinkable oligomers), polymerizable monomers, then there is no crosslinking with the inclusion of magnetic colloid and white pigment, but a polymerization, preferably a free-radical polymerization to form polymers.
  • crosslinking polymerization takes place, in which case magnetic colloid and white pigment are included in the resulting polymer particle.
  • prepare an aqueous solution or aqueous dispersion of polymerizable monomer and magnetic colloid and white pigment add an organic solvent immiscible with water as the organic phase, and mix the aqueous and organic phases.
  • the preparation of the colorless magnetic polymer particles takes place during the mixing of the aqueous and organic phases by adding a polymerization initiator such as, for example, a free-radical former.
  • the present invention also relates to a method which consists of or comprises the following steps:
  • the starting point of the process are thus polymers, oligomers or monomers which are water-soluble and dispersed in an organic, water-immiscible phase and during the dispersing by addition of a crosslinking agent, ie a crosslinker or in the case of the monomers by means of multifunctional monomers, which then have the function of the crosslinker, be crosslinked to solid polymer particles.
  • a crosslinking agent ie a crosslinker or in the case of the monomers by means of multifunctional monomers, which then have the function of the crosslinker, be crosslinked to solid polymer particles.
  • a crosslinking agent ie a crosslinker or in the case of the monomers by means of multifunctional monomers
  • the volume ratios of organic phase to polymer / monomer phase are generally between 5: 1 and 30: 1 and 2: 1 and 4: 1 with respect to the volume ratios of polymer phase to magnetic colloid, wherein here and below with "polymer phase” defines the aqueous polymer solution
  • polymer phase defines the aqueous polymer solution
  • the proportion by weight of the magnetic nanoparticles in the polymer phase is consistently between 10% by weight and 60% by weight.
  • the white pigments are added to the polymer / monomer mixture, i. the polymer solution or the monomer solution or a solution containing polymer and monomer, together with or after the magnetic colloids in the form of a powder or a solution, preferably an aqueous solution and then dispersed in an organic phase with stirring. During the dispersing process, the droplets formed are crosslinked by adding a crosslinker or a bifunctional or trifunctional monomer to solid polymer particles.
  • the white pigments may be added either in solid form or as an aqueous emulsion or dispersion to the polymer blends or the magnetic colloid solution.
  • the pigments are finely ground using a ball mill.
  • the pigments are usually metered in such that the proportion by weight of the white pigment is from 30% by weight to 90% by weight, based on the amount of magnetic colloids, also referred to herein as magnetic nanoparticles.
  • Preferred production processes are characterized in that the polymer / monomer magnetic colloid white pigment mixture is treated with ultrasound for 10 to 120 minutes before dispersion.
  • the polymer / monomer magnetic colloid white pigment mixture is dispersed in the subsequent step in an organic phase with stirring.
  • the dispersant consists of water-immiscible organic solvents or mineral or vegetable oils. With regard to the solvents, it has surprisingly been found that, in particular, such products lead to stable dispersions which have a distribution coefficient of from 1.5 to 6, preferably between 2 and 4, according to the method described by C. Laane et al.
  • the stabilizers can be selected from the group already described above. With regard to the production of polymer particles with smaller particle sizes of ⁇ 10 ⁇ m, higher stabilizer concentrations are necessary throughout, and vice versa: for larger particles, the stabilizer concentration can be correspondingly reduced.
  • the stabilizers are generally used for the encapsulation as 0.1 to 30% strength by weight, preferably 0.3 to 15% strength by weight solutions and even more preferably 0.5 to 6% strength by weight solutions.
  • the stabilizer concentrations in the organic phase which are relevant for the preparation of the polymer particles according to the invention are between 0.1 and 30% by weight, preferably between 0.5 and 6% by weight. Therefore, a method is preferred in which the proportion of stabilizers in the organic phase is between 0.05 and 30% by weight.
  • oils are particularly preferably suitable for the dispersion of alginates, gelatin, polysaccharides and acrylates.
  • the vegetable oils which are preferably used as the organic phase for preparing the colorless, magnetic polymer particles have at room temperature a viscosity of between 30 and 200 centipoise (cP), the mineral oils and silicone oils such as between 500 and 10,000 cP.
  • cP centipoise
  • Nonlimiting examples are: palm oil, coconut oil, corn oil, sunflower oil, castor oil, rapeseed oil, soybean oil, olive oil, linseed oil and paraffin oil, light and heavy machine oil, synthetic oils or silicone oil.
  • the volume ratios of organic phase to the aqueous polymer / monomer phase are generally between 5: 1 and 30: 1.
  • the present invention further encompasses a preferred production process using as the organic phase organic solvents having a partition coefficient of between 1.5 and 6 or vegetable oils having a viscosity of from 30 cP to 200 cP.
  • the particle sizes are at a viscosity ⁇ 1000 cP in the range of 2 to 100 microns and at viscosities> 1000 cP consistently between 100 and 800 microns.
  • dispersing tools or conventional stirrers are optionally used, depending on the desired particle size.
  • conventional stirrers with bi- or aleblattrlochern be used.
  • dispersing tools with a rotation capacity of up to 36,000 rpm which operate on the rotor-stator principle (for example Ultra-Turrax®, IKA Werke, FRG), are used.
  • There is a reverse proportionality between stirring speed and particle size such that particle sizes of> 20 ⁇ m are produced by stirring speeds in the range of 500-1200 rpm, whereas particles of ⁇ 10 ⁇ m require stirring speeds of> 5000 rpm.
  • the colorless magnetic polymer particles produced are usually produced by means of a Hand magnets - preferably this neodymium-boron-iron magnets are used - separated from the organic phase. Alternatively, a separation by centrifugation can take place.
  • the method according to the invention thus preferably comprises a step of separating off the polymer particles by means of centrifugation or magnets or magnetism. This step is preferably followed by several washing steps with, for example, petroleum ether, acetone, alcohol and water. In particular, all residues of the organic solvent or the oils should be removed.
  • the resulting polymer particles are usually stored in water. Thereafter, the recovered polymer particles may be subjected to surface functionalization or activation.
  • the objective is the coupling of specific bioligands that can bind with analytes to be determined or separated.
  • the porosity of the polymer particles is determined by the bob density, which in turn is determined by the average molecular weight of the polymer and the concentration. Increasing molecular weight and / or reduced polymer concentration means less ball density and thus increasing porosity. Since the practicability of a test method, especially within the framework of routine diagnostic or analytical methods, also depends on the quantity of bound biological ligands per carrier amount, depending on the application, the porosity plays a more or less important role for the magnetic particle production. In the case of the polymer particles according to the invention, it is therefore preferable to use polymer concentrations of 2.5-10% by weight, based on the aqueous solution, and molar masses of> 40 kDa. Polymer particles produced in this way have a high porosity and a correspondingly high binding capacity both with respect to the bioligands coupled to the polymeric matrix and with respect to the surface structures bound by the ligands.
  • the addition of a 1 - 12% glutaraldehyde solution leads within 20 minutes solid, spherical gelatin particles whose sizes can be adjusted by changing the stirring speed, the dispersing modality (dispersing tool, ink-jet method) and / or the concentration of the polymer between 0.5 and 800 microns.
  • the products are usually washed first with apolar solvent such as hexane or petroleum ether, followed by multiple washing processes with acetone, methanol or ethanol and water.
  • the preparation of colorless, magnetic particles based on polysaccharides is generally assumed to be from 5 to 20% aqueous solutions.
  • Preferred for this purpose are polymers having a molar mass of between 50 and 500 kDa. Examples of these, which in no way limit the invention, are: cellulose, cellulose derivatives, hyaluronic acid, hydroxypropylcellulose, dextran, agarose.
  • the polymer phase is adjusted to pH 10 by addition of sodium hydroxide solution.
  • the crosslinking is carried out by adding 2.8 to 4% by volume (based on the polymer phase) of divinyl sulfone, which is added before the polymer mixture is introduced into the organic phase.
  • the organic phase used is preferably vegetable oil having a viscosity of 40 to 150 cP, to which 0.5 to 5% of stabilizers have been added.
  • the dispersion usually takes 20 to 30 minutes, whereby, depending on the experimental conditions (stirring speed, stirring modality and polymer concentration), colorless, spherical polymer particles in the size range of 1 to 500 microns are obtained.
  • Concentrations of the polymer are usually in the range of 0.5 to 3% by weight, with the degree of deacetylation being consistently 80 to 90%.
  • polymers having a molecular weight of 40 to 600 kDa are used.
  • the resulting mixture is dispersed in an organic solvent, according to Laane et al. Classification above.
  • the organic phase usually contains 0.5 to 3.0% by weight stabilizer.
  • the organic phase is usually present in a 10 to 20-fold volume over the polymer phase.
  • 10 to 20% by volume of a 6 to 12% glutaraldehyde solution is added. The reaction leads to solid polymer particles within 60 to 120 minutes.
  • crosslinking with glutaraldehyde it is also possible to use epichlorohydrin, a copper sulfate solution or sodium tripolyphosphate, crosslinking with Epichlorohydrin is advantageously carried out at 45 0 C over a period of 1 to 2 hours.
  • the starting point of the preparation of silica gel particles are SiO 2 sols which are synthesized by hydrolysis of alkoxysilanes with the aid of dilute mineral acids (for example HCl) or carboxylic acids (for example as described in WO 02/09125 A1, which is hereby incorporated by reference) Acetic acid).
  • the alkoxysilanes are hydrolyzed in water with the addition of acid.
  • alkoxysilanes it is possible to use silicic acid orthoesters of aliphatic alcohols, preference being given to using methyl, ethyl or propyl esters individually or as mixtures.
  • the pore structure of the silica gels can be adjusted by controlling the hydrolysis and polycondensation, whereby the binding capacities for the analytes or target substances to be bound can be influenced.
  • the viscosity of the sol phase can be used to adjust the particle and pore sizes.
  • the viscosity adjustment is derived directly from the specific mode of sol-gel formation during the aging process, which is accompanied by the formation of oxo bridges in the sol.
  • the consequent increase in viscosity is associated with a parallel particle size increase and pore size decrease.
  • aqueous solutions For the preparation of the colorless, magnetic polymer particles based on polyvinyl alcohol, 2.5 to 15% strength by weight aqueous solutions are used throughout. After addition of the corresponding magnetic colloid and white pigment amounts, the polymer-magnetic colloid-white pigment mixture is introduced into the organic phase, whereby in this case the same agents are used as in the case of silica gel production.
  • organic solvents according to the above classification are used.
  • spherical polyvinyl alcohol particles can also be produced with the aid of vegetable oils having a viscosity of 30 to 160 cP. The stabilizer concentrations are consistently between 0.5 and 2% by weight.
  • the volume ratios of organic phase to polymer phase are generally 5-15: 1.
  • aqueous solutions are generally used which, after appropriate addition of the magnetic colloid and white pigment, are introduced into a mineral oil phase containing at least two stabilizers.
  • a high viscosity silicone oil having a viscosity of 800 to 3,000 cP is preferably used.
  • the stabilizer concentration in the oil phase is usually 10 to 30% by weight, with increasing concentration, the particle sizes are shifted towards smaller values.
  • the direct relationship between viscosity or concentration of the polymer solution and particle size found in the case of the polymer particles according to the invention also applies without restriction: With increasing alginate concentration, which is equivalent to an increase in viscosity, the average particle diameter increases significantly.
  • Bi- or trivalent ions such as Sr 2+ , Ca 2+ , Mg 2+ , Cu 2+ , Ba 2+ , Al 3+ are generally used for crosslinking the polymer droplets formed in the oil phase.
  • calcium ions are used in the form of calcium chloride. This substance is inexpensive, non-toxic and can crosslink the dispersed polymer droplets to solid particles within a few seconds.
  • concentration of the crosslinker is chosen such that the obtained microspheres have sufficient mechanical stability, which also allow a multi-minute ultrasound treatment.
  • the forming magnetic calcium alginate microparticles are usually separated by centrifugation from the remaining Dispersier felt negligence and washed by several subsequent washing steps with petroleum ether, acetone, methanol and water.
  • the starting point for the synthesis of the magnetic, colorless polyacrylate particles are mixtures formed from acrylic acid, itaconic acid, methacrylic acid or other carboxyl group-containing monomers and vinyl monomers.
  • the concentration of the acrylic acid in the polymer can be adjusted by copolymerization with other vinyl monomers optionally between 30 and 90 mol%.
  • Suitable comonomers are in principle all monomers copolymerizable with acrylic acid or carboxyl group-containing monomers.
  • the invention is not limiting examples are: N-vinyl pyrrolidone, acrylamide, maleic acid, N dimethylaminopropylacrylamide 1 N, 2-hydroxyethyl methacrylate, 2-hydroxyethyl acrylate, vinyl acetate, acrolein, methoxyethyl acrylate, methoxyethyl methacrylate, 2-dimethylaminoethyl ( meth) acrylate, 2-diethylaminoethyl (meth) acrylate, 2-
  • the mixture is added, based on the monomer phase, 10 to 50 vol% of a crosslinker.
  • a crosslinker Preferably, N.N'-methylenebisacrylamide is used for this purpose.
  • the advantage of this compound in contrast to other crosslinkers which can also be used in principle, such as, for example, ethylene glycol dimethacrylate, is a high crosslinking reaction which leads to solid polymer supports after only a few minutes.
  • N.N'-methylenebisacrylamide is commonly used as a 20-35% by weight aqueous solution.
  • the neutralization with concentrated sodium hydroxide solution follows the addition of the corresponding magnetic colloid and white pigment.
  • the known from the prior art radical formers such as ammonium or potassium persulfate can be used.
  • TEMED N, N, N ', N' -Tetramethyl- ethylenediamine
  • APS ammonium persulfate
  • Radical former and accelerator takes place the polymerization and crosslinking to solid polymer particles within a few minutes.
  • the dispersing phase used are vegetable oils having a viscosity of between 40 and 160 cP, where basically analogous relationships between stirring speed and stirring mode with respect to the setting of the particle sizes apply, as in the case of the other polymers described above.
  • the invention further includes all colorless magnetic polymer particles obtainable by any of the methods described herein.
  • the invention furthermore comprises the use of the colorless, magnetic polymer particles according to the invention for analysis and diagnostics.
  • the colorless polymer particles according to the invention are coupled to the polymer particles which are capable of binding with the target substance.
  • Preferred production processes are characterized in that in an additional step on the surface of the magnetic, colorless polymer particles with bioligands coupling reactive groups are generated or functional groups of the polymers are activated.
  • a colorless, magnetic polymer particle according to the invention can have reactive groups coupling to the surface of the polymer particles with bioligands.
  • the reactive ligands coupling to bioligands may couple to proteins, peptides, oligopeptides, polypeptides, antibodies, antibody fragments, antigens, streptavidin, avidin, biotin, oligonucleotides, polynucleotides, oligosaccharides, polysaccharides or enzymes.
  • the reactive groups coupling with bioligands may be: carboxyl, hydroxyl, sulfhydryl, epoxy, nitrile, isocyanate, imidazole, aldehyde, amino groups.
  • bioligand refers to a substance which is bound to the polymer particles according to the invention by means of coupling, reactive groups and can preferentially bind to surface structures of cells or organisms or to segregated molecules Possible bonds exist, for example, between antigen and antibody or ligand and receptor Bioligands for the purposes of the invention are: antibodies, antigens, polysaccharides, streptavidin, avidin, proteins, nucleic acids, oligosaccharides, oligopeptides, and oligonucleotides
  • Surface structures in the sense of the invention are, for example, lipids, proteins, receptors, antibodies, antigens, biotinylated proteins, biotinylated Antigens, biotinylated antibodies, oligosaccharides and polys
  • mycobacteria or human immunodeficiency virus (HI) viruses by simultaneous addition of capture and marker particles, which is directed against an antibody which is directed against the Mycobacterium surface antigen lipoarabinomannan, or with an antibody which is resistant to the gp120 surface antigen of the HIV virus. This is done by the particles with the pathogen form a colored or fluorescent complex, which after appropriate magnetic separation in a simple manner by known visual methods can be detected.
  • HI human immunodeficiency virus
  • This detection principle is preferably applicable to those analytes which have a multiplicity of identical but specific epitopes, for example bacteria, viruses or fungi.
  • scavengers and marker particles coated with bioligands directed against different epitopes can also be used. This is mainly used for the detection of proteins.
  • interferon gamma which is known to be used for the detection of tuberculosis, by means of two antibodies directed against different surface structures of the IFN-gamma, which are each coupled to capture and marker probes.
  • the covalent coupling of the bioligands to the polymer particles according to the invention is carried out in analogy to the known methods for the immobilization of bioligands to polymeric carriers.
  • the following compounds which in no way limit the invention serve, however: epichlorohydrin, carbodiimides, tosyl chloride, tresyl chloride, cyanogen bromide, hexamethylene diisocyanate, 2-fluoro-1-methyl-pyridinium-toluene-4-sulfonate, N-hydroxysuccinimide, Chlorocarbonate, isonitrile, hydrazide, glutaraldehyde, 1, 1 ' , carbonyl diimidazole, 1, 4-butanediol diglycidyl ether.
  • the couplings of the bioligands can be carried out particularly advantageously with the aid of heterobifunctional, reactive compounds which can form a chemical bond both with the functional groups of the polymers (carboxyl, hydroxyl, sulfhydryl, amino groups) and with the bioligand.
  • the coupling of antibodies as bioligands to the polymer particles according to the invention plays a central role, since they are able to bind a large number of antigens or target substances which are used for the analysis or diagnosis of various diseases and infections or for other physiological Data collection can be used.
  • Non-limiting examples of such antigens are: digoxin, lidocaine, plasmin, tissue plasminogen activator (tPA), FPA, BFP, carcinogen embryonic antigen (CEA), toxoplasmic antigen, alpha-1-fetoprotein, ferritin, TSH (thyroid-stimulating homnone ) Glycoprotein19-9, apolipoprotein, beta-2-microglobulin, alpha-1-microglobulin, prostate-specific antigen (PSA), C-reactive protein, human chorionic gonadotropin (HCG), hepatitis antigen, the gp120 surface antigen of HI virus, the Surface Tissue of Human T-Lymphotropic Virus, the Surface Epitopes of Mycobacterium such as Lipoarabinomannan, Mycolic Acid, Arabinogalactans, Peptidoglycolipids, Trehalose-6-Phosphate Phosphatase, Cord Factor, Glycolipids, 19
  • Preparation of Colorless Magnetic Gelatin Particle A 20% gelatin solution is prepared by heating to 80 ° C. in a 0.01 M Na phosphate buffer, pH 8.0. Thereafter, the solution is brought to 45 ° C. 25 ml of this solution are then mixed with 7.5 ml of a stabilized magnetic colloid prepared according to a protocol of Shinkai et al. (Biocatalysis, VoI 5, 61, 1991) by oxidation of a 0.6 molar iron (II) salt solution using 0.3 M Na nitrite. This is followed by the addition of 4 ml of a 60% aqueous titanium dioxide emulsion.
  • the mixture is 30 minutes in the ultrasonic bath (Bandelin Sonorex) at 45 0 C and homogenized under nitrogen atmosphere. Thereafter, the polymer phase in 450 ml to 45 0 C preheated vegetable oil (viscosity 120 cP) in which 0.1% sesquioleate, 1, 2% Tween 80 and 1, 5% Dehymuls FCR are dissolved, registered. With gentle nitrogen supply, the mixture is dispersed with stirring (two-bladed stirrer, 1200 rpm) for 2 minutes. This is followed by the addition of 1.5 ml of 6% glutaraldehyde solution. The mixture is stirred for 15 minutes and then cooled to room temperature.
  • the ultrasonic bath Bandelin Sonorex
  • gelatin particles having a particle size between 2 and 10 ⁇ m are obtained.
  • the recovered polymer particle fraction is then suspended in 3 ml of 0.1 M Na phosphate buffer, pH 8.2, and activated with the addition of 0.5 ml of 12% glutaraldehyde solution over a period of 2 hours at room temperature. The fraction is distilled several times with dist. washed with the aid of magnetic separation. Detection method for mycobacteria
  • 20 ml of the silica sol, which has a viscosity of 36 cP at 20 ° C., are mixed with 5 ml of a magnetic colloid prepared according to the instructions of Shinkai et al. was prepared, mixed. 15% by weight of solid, finely crystalline titanium dioxide are added to the polymer-magnetic colloid mixture and the mixture is homogenized in an ultrasonic bath for 10 minutes.
  • the suspension obtained is introduced into 280 ml of 1.1.1-trichloroethane in which 0.5% by volume of Tween 80 and 0.8% by volume of prisorins are dissolved.
  • the batch is dispersed with stirring (1800 rpm) for a few seconds; 10 ml of 1% ammonia solution are then added; The dispersion is stirred for 10 sec. After 5 minutes, the magnetic particles are separated by hand magnet from the dispersion and washed three times with about 50 ml of ethanol and water. This gives magnetic particles with a particle size of 15- 40 microns.
  • amino group-containing Bioiiganden the recovered particles are reacted with 4 ml of 3-aminopropyltriethoxysilane for 2 hours at room temperature. After extensive washing with water and 0.05 M phosphate buffer, pH 8.2, the particles of 5 ml of 6% glutaraldehyde solution over a period of 1, activated for 5 hours at 35 0 C.
  • a magnetic colloid is prepared analogously to the protocol of Kondo et al., Appl. Microbiol.
  • the oil phase is then decanted off after settling of the polymer particles and washed several times alternately with petroleum ether, acetone, ethanol and aqua dest with the respective aid of the magnetic separation step, according to Example 1.
  • Example 1 Particles having an average particle size of 805 nm are formed (laser scattering).
  • the polymer particles are mixed in 10 ml of 1.5 M NaOH and 15 ml of epichlorohydrin and reacted for 2 hours at 55 ° C with vigorous stirring. It is followed by intensive washing with acetone, methanol and distilled water. with the respective application of a magnetic separation step analogously to Example 1.
  • the oxirane-containing particles are then reacted with 10 ml of aminocaproic acid (5% solution in 0.1 M borate buffer, pH 11.0) for 24 hours at room temperature. It is washed thoroughly with water.
  • a 15% strength aqueous dextran solution (MW: 40 kDa) are admixed with 20 ml of the commercially available ferrofluid EMG 705 (from FerroTec, USA). This is followed by the addition of 1.6 g of finely crystalline titanium dioxide. The mixture is then added
  • 0.8 g of the dried product are washed with molecular-sieve-dried dimethyl sulfoxide (DMSO) and subsequently each with 1 ml of dimethyl sulfoxide, dissolved in the 6 mmol of 4-dimethylamino-pyridine and 5 mmol of 2-fluoro-methyl-pyridinium-toluene sulfonate are activated for 45 min. at room temperature. It is washed several times alternately with acetone and dimethyl sulfoxide and three times with 3 ml of 0.05 M K phosphate buffer / 0.15% NaCl, pH 7.5.
  • DMSO molecular-sieve-dried dimethyl sulfoxide

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Abstract

Die Erfindung betrifft farblose, magnetische Polymerpartikel bestehend aus einem Polymer, einem Weißpigment und einem Magnetkolloid. Durch die Zugabe der weißen Pigmente wird die tiefbraune bzw. schwarze Farbe der sonst üblichen magnetischen Polymerpartikel überdeckt. Aufgrund der weißen Färbung der Partikel können diese vorteilhaft in Kombination mit gefärbten oder fluoreszierenden Biomarkern eingesetzt werden.

Description

Farblose, magnetische Polymerpartikel für den hochempfindlichen Nachweis von biologischen Substanzen und Pathogenen im Rahmen der Bioanalytik und
Diagnostik
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft farblose, magnetische Polymerpartikel mit einstellbarer Teilchengröße und adaptierbarem Magnetkolloidgehalt, die einen hohen Anteil weißer Pigmente enthalten, wodurch die Polymerpartikel eine weiße oder weißliche Farbe erhalten. Durch die Zugabe der weißen Pigmente wird die tiefbraune bzw. schwarze Farbe der sonst üblichen magnetischen Polymerpartikel überdeckt, wodurch diese Partikel sich besonders gut für optische Nachweise in Kombination mit gefärbten oder fluoreszierenden Partikeln oder markierten Antikörpern eignen.
Magnetische Polymerpartikel sind seit Jahren aus diversen Publikationen und Patenten bekannt. So werden in den US Patentschriften 4,152,210 und 4,343,901 silanisierte Eisenoxid Partikel und ferromagnetische Partikel, die durch eine SoI-GeI- Technik hergestellt werden, für die Immobilisierung von Enzymen beschrieben.
In Anal. Biochem., Vol. 201 , 166 (1992) bzw. PCT GB91/00212 sind Nukleinsäure- Separationsverfahren mit Hilfe von Magnetpartikeln beschrieben.
In DE 10331439B3 wird ein Verfahren zur Herstellung von Nanopartikeln mit einem hohen Metalloxidgehalt, die aus Metalloxid-Polymerkompositen bestehen und in der Bioanalyse und Diagnostik eingesetzt werden, offenbart. Zur Herstellung der erfindungsgemäßen magnetischen Partikel wird eine Hochdruckhomogenisierung angewendet.
Sphärische Partikel aus Polyacrylat und Polystyrol sind Gegenstand des US- Patentes 4,654,267. Mit Hilfe der Suspensionspolymerisation werden periförmige Partikel hergestellt, die anschließend in einer organischen Phase unter definierten Bedingungen gequollen werden. Es folgt eine Inkubation der Polymerpartikel mit einer Fe(ll)/Fe(lll)-Salzlösung, die anschließend durch Zugabe einer Base zu einem Eisenoxid ausgefällt wird, das sich in den Poren des aufgequollenen Polymeren niederschlägt. Das Verfahren liefert periförmige Partikel mit Teilchengrößen zwischen 0.5 und 20 μm.
Aus der US-Patentschrift 5,320,944 sind 0,2-3 μm große Magnetpartikel bekannt, die durch Beschichten mit Eisenoxiden magnetische Eigenschaften erhalten. Durch weitere Beschichtung der Partikel mit Silanen, Nylon oder Polystyrol können anschließend Antikörper für den Einsatz im Immunoassay an die Partikel gekoppelt werden.
Die aus dem Stand der Technik bekannten Partikel weisen einige Nachteile auf: So weisen Magnetpartikel auf Silica- oder Polystyrol-Basis, die mit einem magnetischen Oxid beschichtet sind, eine hohe spezifische Dichte auf, woraus eine unzureichende Dispergierbarkeit resultiert, die zum schnellen Absetzen der Teilchen führt. Dadurch wird der Einsatz im Immuno- oder Nukleinsäureassay, der vorwiegend in Suspension durchgeführt wird, nachhaltig beeinträchtigt. Man ist daher auf eine zusätzliche mechanische Durchmischung angewiesen. Ein weiterer Nachteil der mit Magnetkolloiden beschichteten Teilchen besteht darin, dass die Eisenschichten trotz anschließender Silanisierung mit der Analytenlösung in Kontakt kommen können. Dies stellt ein gravierendes Problem bei der Nukleinsäure-Analytik z.B. im Rahmen der Polymerase-Ketten-Reaktion („PCR") dar, da die bei der PCR benutzten Polymerasen im Kontakt mit Eisenverbindungen deaktiviert werden.
Ferrofluid-beschichtete magnetische Hybridpartikel, die mit einem funktionellen Polyacrylat beschichtet sind, gehen aus der US-Patentschrift 5,648,124 hervor. In den US-Patenten 6,204,033 und 6,514,688 werden sphärische magnetische Polymerpartikel auf der Basis von Polyvinylalkohol beschrieben, die mittels inverser Suspensionsvernetzung innerhalb kurzer Zeit herstellbar sind.
In der Offenlegungsschrift DE 10355409A1 werden sphärische magnetische Silica- Partikel offenbart, die mittels einer inversen Suspensionstechnik innerhalb weniger Minuten hergestellt werden können.
Allen, aus dem Stand der Technik bekannten Magnetpartikeln ist gemeinsam, dass sie tiefbraun bis schwarz gefärbt sind und dadurch in kombinatorischen Anwendungen mit gefärbten oder fluoreszierenden Partikeln oder markierten Antikörpern im Rahmen bioanalytischer oder diagnostischer Anwendungen die Farbbzw. Fluoreszenzsignale der Markersysteme nachhaltig beeinträchtigen. D.h., die Markersignale werden von der tiefbraunen bzw. schwarzen Farbe der Magnetpartikel, die von den diversen Eisenoxiden (FeO, Fe2O3, Fe3O4) oder Ferriten herrühren, überdeckt und minimieren bzw. stören dadurch die Nachweisempfindlichkeit. Darüber hinaus weisen die meisten bekannten Verfahren zur Herstellung von Magnetpartikeln Nachteile in Bezug auf den zeitlichen- und technischen Herstellungsprozess auf. Weitere Nachteile der aus dem Stand der Technik bekannten Produkte (z.B. US-Patent 4,654,267) bestehen in der Verwendung hydrophober Polymere wie z.B. Polystyrol, die erheblich zur unspezifischen Proteinadsorption neigen. Letzteres Phänomen ist vor allem bei Bioassays bekanntermaßen von großem Nachteil, da es zu unspezifischen Nachweissignalen führt.
Die vorliegende Erfindung hat sich zur Aufgabe gestellt, die Nachteile der Produkte aus dem Stand der Technik zu umgehen und Verfahren zur Herstellung weißer oder weißlich gefärbter, magnetischer Polymerpartikel zur Verfügung zu stellen, bei denen keine arbeite- und zeitaufwendigen Beschichtungstechniken erforderlich sind und welche aufgrund ihrer Farbe für diagnostische and analytische Nachweisverfahren, welche auf optischer Detektion beruhen hervorragend geeignet sind. Durch diese Maßnahmen lassen sich die Polymerpartikel effizienter in der Bioanalyse und der Diagnostik einsetzen. Durch die Überdeckung der ursprünglichen braun-schwarzen Farbe eröffnet sich die Möglichkeit, Nachweisverfahren, die auf dem Prinzip der Kombination mit gefärbten oder fluoreszierenden Partikeln durchgeführt werden, wesentlich sensitiver zu gestalten.
Die erfindungsgemäßen farblosen, magnetischen Polymerpartikel lassen sich vor allem vorteilhaft in solchen Bioanalysen (Bioassays) einsetzen, bei denen polymere Magnetpartikel kombiniert mit gefärbten oder fluoreszierenden Partikeln oder Fluoreszenz-markierten Antikörpern eingesetzt werden.
Das zentrale Anliegen der vorliegenden Erfindung besteht darin, die übliche entweder tief braune- oder schwarz Farbe magnetischer Polymerpartikel zu überdecken oder zu vermeiden und so zu einem farblosen Produkt zu gelangen. Dieses Ziel wird überraschenderweise dadurch erreicht, dass der Polymer- bzw. Monomerphase zusätzlich zu einem Magnetkolloid ein weißes Pigment zugemischt wird, welches bei der Polymerisation in das entstehende Partikel eingebaut wird und in der Lage ist, die Farbe des Partikeln zu bestimmen. Dadurch wird die ursprünglich braun-schwarze Farbe der Magnetpartikel überdeckt und die Polymerpartikel erhalten einen weißlichen Grundton. Somit sind Gegenstand dieser Patentanmeldung farblose, magnetische Polymerpartikel umfassend mindestens ein Polymer, mindestens ein Magnetkolloid, mindestens einen Vernetzer und mindestens ein Weißpigment.
Die Bezeichnung farblos bezeichnet hierin, dass die Partikel auf Grund der zugemischten Pigmente weiß erscheinen, das heißt unbunt sind und damit keine Farbe besitzen. Die Polymerpartikel sind nicht durchsichtig oder transparent sondern weißlich gefärbt. Im Folgenden wird die Bezeichnung "weißlich gefärbt" daher durch die Bezeichnung "farblos" ersetzt bzw. die Bezeichnung „farblos" als Synonym für „weiß" oder „weißlich" verwendet. Der Begriff Polymerpartikel bezieht sich hierin auf Partikel oder Teilchen, die aus einem oder mehreren Polymeren bestehen. In diesen Polymerpartikeln sind mindestens eine Art von Magnetkolloid, ein Vernetzer und ein Weißpigment eingeschlossen. Der Vernetzer ist natürlich nicht in seiner ursprünglich zugesetzten Form z.B. als Gutardialdehyd im Polymerpartikel eingeschlossen, sondern dient dazu, das mindestens eine eingesetzte Polymer weiter zu vernetzen und bei diesem Vernetzungsvorgang wird der Vernetzer selbst im gebildeten vernetzen Polymer eingebaut, d.h. chemisch gebunden, während die Magnetkolloide und Weißpigmente in das neu gebildete vernetzte Polymerpartikel eingelagert werden, d.h. in der Regel nicht kovalent mit den Polymerketten verknüpft, sondern im Polymernetzwerk eingeschlossen werden. Anstelle der Polymeren zu denen auch Oligomere gerechnet werden, können auch die Monomeren eingesetzt werden, welche dann gleich durch Polymerisation und vorzugsweise radikalische Polymerisation zu dem Polymernetzwerk der Polymerpartikel umgesetzt werden, worin die Magnetkolloide und Weißpigmente eingeschlossen sind. Der Begriff „Weißpigmente" oder „mindestens ein Weißpigment" soll andeuten, dass mehr als eine Sorte von Weißpigmenten also z.B. TiO2 und CaO in einem Polymerpartikel anwesend sein können. Es versteht sich von selbst, dass pro Polymerpartikel mehr als ein Molekül eines Weißpigments und mehr als ein Molekül eines Magnetkolloids enthalten sind.
Es handelt sich bei der Herstellung der Polymerpartikel nicht um eine Beschichtung mit Magnetkolloiden oder Weißpigmenten oder um eine Beschichtung der Magnetkolloide und/oder Weißpigmente, sondern um eine Durchmischung aller Bestandteile bzw. eine Einlagerung der Magnetkolloide und Weißpigmente in die durch Vernetzung gebildete polymere Struktur der Polymerpartikel. Somit sind Gegenstand dieser Patentanmeldung farblose, magnetische Polymerpartikel enthaltend oder bestehend aus mindestens einem Polymer, mindestens einem Magnetkolloid, mindestens einem Vernetzer und mindestens einem Weißpigment. Anders gesagt betrifft die vorliegende Erfindung farblose, magnetische Polymerpartikel enthaltend oder bestehend aus mindestens einem mittels des mindestens einen Vernetzers vernetzten Polymer, mindestens einem Magnetkolloid und mindestens einem Weißpigment, wobei Magnetkolloid und Weißpigment in dem vernetzten Polymer eingelagert sind. Bevorzugt sind die erfindungsgemäßen Polymerpartikel sphärisch.
Die eingesetzten Polymere sind wasserlöslich. Der Begriff wasserlöslich bezieht sich dabei auf solche Polymere, mit denen eine mindestens 1 Gew.-%ige Lösung in Wasser bei Raumtemperatur hergestellt werden kann. Die eingesetzten Polymere sind wasserlöslich mit einer Menge von mindestens 10 g pro 100 ml Wasser, besitzen ein Molekulargewicht von 5000 g/mol bis 2 x 106 g/mol und/oder einen durchschnittlichen Polymerisationsgrad von 1.000 - 60.000.
Bevorzugt sind farblose, magnetische Polymerpartikel, wobei das mindestens eine Polymer ausgewählt wird aus der Gruppe umfassend oder bestehend aus Polyvinylalkohol, Silicagel, Gelatine, Polysaccharide, Proteine, Chitosan, Agarose, Dextran, Polyaminosäuren, Polyacrylamid, Hyaluronsäure, Polyvinylpyrrolidon, Polyacrylate, Polyacrylsäure, Polyamide, Polyetheramide, Polyethylenamin, Polyimide, Carboxymethylchitosan, Polyvalente, Carboxymethylcellulose, Cellulose, Cellulosenitrate, Celluloseacetate, Cellulosetriacetate, Celluloseether, Hydroxyethylcellulose, Siliconpräpolymere, Copolymere der Polylactide und Polyglycolide, Polyanhydride, Polymaleinsäureanhydride, Polyhydroxymethacrylate, Poly(γ-ethylglutamat), glycolierte Polyester, Polyethylenoxid-propylenoxid, Polyetherester, Polyethylenoxid, Carrageenane, Fibrinogen, Stärke, Kollagen, Pectinsäure, Actinsäure, Casein, Albumin, Heparansulfat, Heparin, Chondroitinsulfat, ß-Cyclodextrine, Gummi arabicum sowie Copolymere derselben oder Mischungen der vorgenannten Polymere.
Als Weißpigment kommen grundsätzlich solche Substanzen in Frage, die sowohl eine starke Weißtönung aufweisen und dadurch die Farbe des Magnetkolloides überdecken als auch eine feindisperse Mischung mit der Polymerphase zu bilden vermögen. Hierfür kommen im besonderen Maße anorganische Pigmente mit einem hohen Brechungsindex, d.h. größer als 1 ,5 in Frage. Bevorzugte Weißpigmente hierfür sind: Titandioxid, Zinkoxid, Bariumsulfat (BaSO4), Zinksulfid, Bleicarbonat, Calciumcarbonat, Calciumaluminatsulfat, Lithopone sowie Mischungen derselben. Besonders hohe Deckeigenschaften werden dabei durch Titan(iv)-oxid, eine Mischung aus Bariumsulfat und Zinksulfid sowie Calciumaluminatsulfat erzielt. Weißpigmente sind hierin definiert als unbunte anorganische Pigmente mit einem hohen Brechungsindex, der bevorzugt größer 1 ,5 und besonders bevorzugt größer 1 ,8 ist. Der Begriff „Pigment" bezeichnet dabei allgemein Farbmittel. Pigmente sind im Anwendungsmedium vorzugsweise unlöslich. Der Begriff Pigmente soll hierin aber auch Farbstoffe umfassen. Pigmente bzw. Weißpigmente im Sinne der Erfindung können in Pulverform oder als wässrige Dispersionen vorliegen und eingesetzt werden.
Als Lithopone werden künstliche ungiftige Weißpigmente, bestehend aus Bariumsulfat (Baryt, BaSO4) und Zinksulfid (ZnS) bezeichnet. Lithopone kann dabei auch bis zu 2 % Zinkoxid (ZnO) enthalten. Lithopone wird in einem speziellen Herstellungsverfahren erzeugt, bei dem beide Komponenten in einem Vorgang gefällt werden. Lithopone wird im Colour Index als Cl. Pigment White 5 geführt. Lithopone wird alternativ als Charltonweiß, Chinesisches Permanentweiß, Deckweiß, Emailweiß, Schwefelzinkweiß oder Sulfidweiß bezeichnet.
Eine bevorzugte Teilchengröße der Weißpigmente die den erfindungsgemäßen Polymerpartikeln zugesetzt werden beträgt zwischen 1 nm und 1 μm, bevorzugt zwischen 10 nm und 500 μm, besonders bevorzugt sind Teilchengrößen kleiner als 500 nm und noch weiter bevorzugt kleiner als 300 nm.
Die vorliegende Erfindung besteht bevorzugt aus einem farblosen, magnetischen Polymerpartikel, wobei das mindestens eine Weißpigment ausgewählt wird aus der Gruppe umfassend oder bestehend aus CaO, Pb(OH)2 * 2 PbCO3, Titandioxid, Zinksulfid, Zinkoxid, Bleicarbonat, Calciumaluminatsulfat, Bariumsulfat, Calciumcarbonat, Lithopone, Cristobalit, Ton, Kaolin, Selenet (Marienglas) oder Mischungen derselben. Erfindungsgemäß sind als Weißpigmente sämtliche Pigmente oder Farbstoffe mit einem Brechungsindex > 1 ,5 geeignet.
Die für die farblosen, magnetischen Polymerpartikel geeigneten Magnetkolloide weisen in der Regel eine Teilchengröße von 10 nm - 500 nm, vorzugsweise eine solche von 30 bis 150 nm auf und noch weiter bevorzugt eine Teilchengröße von 50 nm bis 100 nm auf. Die Zugabe der Magnetkolloide zu der Polymerlösung wird so gesteuert, dass deren Gewichtsanteil in den fertigen Polymerpartikeln zwischen 10 und 60%, vorzugsweise zwischen 30 und 50% beträgt.
Unter „Magnetkolloid" bzw. „Ferrofluid" werden definitionsgemäß alle magnetischen Nanopartikel zusammengefasst, die in Wasser eine kolloidale Dispersion bilden. Die als magnetische Nanopartikel bzw. Magnetkolloide in Frage kommenden Verbindungen bestehen entweder aus Eisenoxiden wie z.B. FeO oder Fe2θ3, Magnetit, Übergangsmetalloxiden, Ferriten oder sonstigen ferro-, ferri- oder superparamagnetischen Substanzen. Die Herstellung solcher Kolloide bzw. Ferrofluide gehen aus verschiedenen Publikationen hervor und können von einem Fachmann auf diesem Gebiet jeder Zeit uneingeschränkt genutzt werden: Shinkai et al. Biocatalysis, VoI 5, 61 , 1991 ; Kondo et al., Appl. Microbiol. Biotechn., Vol. 41 , 99, 1994, US-Patent 4,827,945, US-Patent 4,329,241. Magnetkolloide dieser Art werden auch kommerziell u.a. von den Firmen FerroTec Corp., USA, Advanced Magnetics, USA, Taibo Co, Japan, Liquids Research Ltd., Wales, BASF, Schering AG, BRD, angeboten.
Ein bevorzugtes farbloses, magnetisches Polymerpartikel enthält mindestens ein Magnetkolloid ausgewählt aus der Gruppe umfassend oder bestehend aus Magnetit, Maghemit, Übergangsmetalloxiden, Ferriten und/oder sonstigen nanopartikulären ferro-, ferri- oder superparamagnetischen Verbindungen. Bei ferromagnetischen Verbindungen sind die magnetischen Momente einzelner Teilchen nicht unabhängig voneinander, sondern richten sich spontan parallel aus. Die Kopplung der magnetischen Momente erstreckt sich aber nicht über das ganze Material sondern ist auf kleine Bereiche, die Weißschen Bezirke, beschränkt.
Bei den erfinderischen farblosen, magnetischen Polymerpartikeln handelt es sich bevorzugt um sphärische Partikel mit einer Größe von 0,5 bis 2000 μm, weiter bevorzugt von 1 bis 500 μm, weiter bevorzugt von 1 bis 200 μm und noch weiter bevorzugt von 1 bis 150 μm.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf farblose, magnetische Polymerpartikel bestehend aus mindestens einem Polymer, mindestens einem Magnetkolloid, mindestens einem Vemetzer und mindestens einem Weißpigment. Optional können diese Partikel noch weitere Bestandteile in Spuren oder sehr geringen Mengen bis hin zu PPM (parts per million) umfassen. So kann ein erfindungsgemäßes, farbloses, magnetisches und vorzugsweise sphärisches Polymerpartikel des Weiteren Stabilisatoren, Lösungsmittel und/oder Öle in sehr geringer Menge umfassen. Vorzugsweise werden die Polymerpartikel nach ihrer Herstellung gereinigt, um auch die Stabilisatoren, Lösungsmittel, Öle und andere bei der Herstellung eingesetzte Reagenzien zu entfernen.
Im Herstellungsprozeß der Polymerpartikel geschieht die Verfestigung der Polymertröpfchen in der organischen Phase zu festen Partikeln durch Zugabe eines Vernetzers während des Dispergiervorganges. Die zur Verfestigung der Polymertröpfchen erforderlichen Vemetzer werden entweder, sofern die Vemetzungsreaktion üblicherweise länger als 2 Minuten dauert, der Polymerphase vor der Dispersion oder im Falle kurzer Vernetzungsreaktionen (Polyvinylalkohol, Silicagel, Alginat) während des Dispergiervorganges zugesetzt. Der
Dispergiervorgang bzw. die Durchmischung dauert je nach Vernetzungsreaktion des Polymeren in der Regel zwischen 10 Sekunden (Polyvinylalkohol, Silicagel, Alginat) und 30 Minuten (Polysaccharide, Acrylate). Als Vernetzer sind grundsätzlich solche Agenzien geeignet, die bi- oder trifunktionelle Verbindungen wie z.B. Dialdehyde, Carbonsäurechloride, Divinylsulfon, Bisoxirane oder Carbonsäuren aufweisen. Vorzugsweise kommen verdünnte Glutaraldehyd-Lösungen zum Einsatz, da diese unter Säurekatalyse bereits innerhalb weniger Minuten das Polymer unter Acetalbildung zu festen Partikeln vernetzen. Bei den übrigen Substanzen sind ein bis zwei Stunden Reaktionszeit erforderlich. Die Vernetzung mittels Glutaraldehyd, der in der Regel als 3-12%ige Lösung eingesetzt wird, dauert durchweg 20 bis 160 Sekunden. Als Säurekatalysatoren im Falle der Glutaraldehyd-Vemetzung gelangen in der Regel Mineralsäuren in Form einer 1-3 molaren Salz- oder Schwefelsäure zur Anwendung, wobei deren Volumenanteil im Polymeransatz zwischen 5 und 10%, vorzugsweise zwischen 6 und 8% beträgt. Zur Vernetzung der in einer Ölphase gebildeten Polymerpartikel können grundsätzlich auch bi- oder trivalente Ionen wie z.B. Sr2+, Ca2+, Mg2+, Cu2+, Ba2+, Al3+ verwendet werden. Vorzugsweise werden Calciumionen in Form von Calciumchlorid eingesetzt. Diese Substanz ist preiswert, nicht toxisch und kann die dispergierten Polymertröpfchen innerhalb weniger Sekunden zu festen Partikeln vernetzen. Die Konzentration des Vernetzers ist allgemein derart gewählt, dass die erhaltenen sphärischen Polymerpartikel eine ausreichende mechanische Stabilität besitzen, die auch eine mehrminütige Ultraschallbehandlung der Polymerpartikel zulassen.
Um während des Herstellungsverfahren zu einer homogenen und sehr feinen Kolloiddispersion zu gelangen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, den Magnetkolloiden oberflächenaktive Substanzen, die auch allgemein als "Stabilisatoren", "Tenside" oder "Emulgatoren" bezeichnet werden, zuzusetzen. Im Folgenden wird durchweg der Begriff "Stabilisator" als Synonym für "Stabilisatoren", "Tenside" und "Emulgatoren" verwendet. Die Stabilisatoren können ausgewählt werden aus einer Gruppe umfassend: Alkylarylpolyethersulfonate, Citrate, Ölsäure, Alkylnaphtalensulfonate, Alkylsulfosuccinate, Laurylsulfat, Natriumdodecylsulfat, Phosphatester, Alkoholethersulfate, Alkylarylpolyethersulfate, Pyrophosphat oder Petroliumsulfonate als anionische Substanzen, DEAE-Dextran, Polyethylenimine oder Dodecyltrimethylammoniumchlorid als kationische Tenside sowie Alkylaryloxypolyethoxyethanole, Polyethylenglykoie, Nonylphenoxypolyglycidol, Polyvinylpyrrolidon oder Nonylphenol als nicht-ionische Substanzen. In Bezug auf die optimale Feinheit der Partikel und Homogenität der Einkapselung der Magnetkolloide und Weißpigmente haben sich überraschenderweise polymere Stabilisatoren in Form von Polyethylenglykol, Polyacrylsäure, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Na-Pyrophosphat, Stärke, Dextran, Albumin, Decyltrimethylammoniumbromid, aromatische oder aliphatische Sulfonsäurederivate oder aliphatische Carbonsäuren als besonders geeignet erwiesen.
Die Stabilisatoren für die magnetischen Kolloiden weisen in der Regel eine Konzentration von 0,1 bis 5 Gew.-% auf. Die für die erfindungsgemäßen Mittel geeigneten Magnetkolloide weisen in der Regel eine Teilchengröße von 10 - 500 nm, vorzugsweise eine solche von 30 bis 150 nm auf. Die Zugabe der Ferrofluide zu der Polymerlösung wird so gesteuert, daß deren Gewichtsanteil in der Polymerlösung zwischen 10 und 60 Gew.-%, vorzugsweise zwischen 30 und 50 Gew.-% beträgt. Obwohl die hierin angegebenen reinen Lösungsmittel geeignet sind, die Basis für stabile Polymerdispersionen zu bilden, hat es sich als vorteilhaft erwiesen, dass durch die Zugabe bestimmter Stabilisatoren zu der organischen Phase Teilchengrößen von <10 μm hergestellt werden können, die bevorzugt im Bioassay und in der Diagnostik eingesetzt werden können.
Fettalkyltetraglykolether-Phosphorsäureester, Polyethylenglykol-octadecylether, Polyoxypropylen-ethylendiamin-Blockcopolymere, Polyoxyethylen-Polyoxypropylen- Ethylendiamin-Blockcopolymere, Polyglycerin-Monocarbonsäureester,
Blockcopolymere aus Rizinusöl-Derivaten, Komplexmischester aus Pentaerythrit- Fettsäureester mit Zitronensäure, modifizierte Polyester, Polyethylenglykol-Castoröl- Derivate, Polyethylenglykol-Etherderivate, Polyoxyethylen-Sorbitan-Fettsäureester, Polyglycerinfettsäureester, Alkylphenylpolyethylenglykol-Derivate, Propylenoxid- ethylenoxid-Blockcopolymere, Polyoxyethylen-Alkohol-Derivate, Sorbitan-
Fettsäureester, Polyethylenglykole, Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Copolymere, Polyhydroxyfettsäure-Polyethylenglykol-Blockcopolymere und Polystyrolsulfonsäure, Phosphorsäurederivaten als besonders geeignet erwiesen.
Substanzen dieser Art sind kommerziell im Handel u.a. unter der Handelsbezeichnung: Tetronic, Hypermer, Synperonic, Pripol, Arlacel, Brij, Hostaphat, Estol, Eumulgin, Pluronic, Renex, Triton, Span, Tween, Tetronic, Dehymuls, Prisorine, Isofol oder Lameform erhältlich. Die für die Herstellung der Magnetpartikel relevanten Stabilisatorkonzentrationen liegen zwischen 0,1 und 25 Gew.-%, vorzugsweise zwischen 0,5 und 6 Gew.-%, bezogen auf die organische Phase.
Die Bestandteile Stabilisator, Lösungsmittel und Öl können einzeln aber auch gemeinsam zugesetzt werden.
Die Erfindung umfasst bevorzugt farblose, magnetische Polymerpartikel, wobei das Polymer zu 1 Gew.-% bis 20 Gew.-% im Polymerpartikel und wobei das Magnetkolloid zu 10 Gew.-% bis 60 Gew.-% im Polymerpartikel und wobei der Vernetzer zu 0,1 Gew.-% bis 5 Gew.-% im Polymerpartikel und wobei das Weißpigment zu 5 Gew.-% bis 40 Gew.-% im Polymerpartikel enthalten ist.
Die Erfindung umfasst zudem farblose, magnetische Polymerpartikel, wobei das Polymer zu 1 Gew.-% bis 20 Gew.-% im Polymerpartikel und wobei das Magnetkolloid zu 10 Gew.-% bis 60 Gew.-% im Polymerpartikel und wobei der Vernetzer zu 0,1 Gew.-% bis 5 Gew.-% im Polymerpartikel und wobei das Weißpigment zu 5 Gew.-% bis 40 Gew.-% im Polymerpartikel und unvermeidbare Verunreinigungen an Stabilisatoren, Lösungsmitteln und/oder Ölen enthalten sind sofern Stabilisatoren und/oder Öle bei der Herstellung eingesetzt wurden. Zu dem Gewichtsanteil des Polymers zählen alle an der Polymerisationsreaktion teilnehmenden Substanzen, wobei diese Substanzen über die Polymerisation miteinander kovalent verknüpft werden.
Neben dem Einsatz von Polymeren konnte überraschenderweise gezeigt werden, dass auch vorzugsweise radikalisch polymerisierbare Monomere als Ausgangsmaterial für die Synthese der gewünschten Polymerpartikel verwendet werden konnten. Besonders bevorzugt sind polymerisierbare Vinylmonomere. Für diese Herstellungsmodalität eignen sich besonders funktionelle Monomere, die über Carboxyl-, Hydroxyl-, Aldehyd-, Epoxy- oder Aminogruppen verfügen. Die Erfindung nicht limitierende Beispiele hierfür sind: Acrylsäure, Methacrylsäure, 2-Hydroxyethyl- methacrylat, 2-Hydroxyethyl-acrylat, Acrolein, Itakonsäure, Maleinsäure, Glycidyl- methacrylat. Vorzugsweise wird Acrylsäure oder Methacrylsäure als Basismonomer eingesetzt. Es hat sich überraschenderweise als vorteilhaft erwiesen, den Carboxylgruppengehalt der Acrylsäurepolymeren durch Copolymerisation mit den genannten Monomeren auf 30 bis 80 Mol% einzustellen, um optimale Bedingungen für die anschließende Bioliganden-Kopplung zu schaffen. Weitere in Frage kommende Comonomere sind grundsätzlich solche, die mit Acrylsäure bzw. anderen Carboxylgruppen-haltigen Monomeren copolymerisierbar sind. Beispiele hierfür sind: N-Vinylpyrrolidon, Acrylamid, N,N-dimethylaminopropylacrylamid, Vinylacetat, Methoxyethyl-acrylat, Methoxyethyl-methacrylat, 2-Dimethylaminoethyl-
(meth)acrylat, 2-Diethylaminoethyl(meth)acrylat, 2-Dimethylaminopropyl-
(meth)acrylat, 3-Dimethylaminopropyl-(meth)acrylat, Methacrylamid, N-Methylol- acrylamid und oder N-Methylol-methacrylamid. Bevorzugte Verfahren zur Herstellung farbloser magnetischer Polymerpartikel sind demnach, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymere aus Monomeren bestehen, die mittels radikalischer Polymerisation während des Dispergiervorganges gebildet werden. Hierzu bevorzugt verwendete Monomere sind Acrylsäure, Methacrylsäure, 2- Hydroxyethyl-methacrylat, 2-Hydroxyethylacrylat, Itakonsäure oder Acrolein oder Mischungen derselben.
Bevorzugt werden diese Polymerpartikel mittels radikalischer Polymerisation hergestellt. Hierbei werden bevorzugt Initiatoren wie Radikalstarter zugegeben, um die gewünschte Reaktion zu ermöglichen und zu starten, sprich zu initiieren. Dabei nehmen sie irreversibel an der Reaktion teil und werden in die Polymere eingebaut, d.h. sie sind im fertigen Polymerpartikel Teil der Polymere und haben Anteil am Gewichtsanteil der Polymere. Für die mit Hilfe der radikalischen Polymerisation gebildeten Partikel werden grundsätzlich die gleichen Mengen an Magnetkolloid und Weißpigment verwendet wie für die von zu vernetzenden Polymeren oder Oligomeren ausgehenden Ansätze.
Ferner umfasst die vorliegende Erfindung ein farbloses, magnetisches Polymerpartikel, wobei das mindestens eine Polymer durch Polymerisation folgender Monomere gewonnen wurde: Acrylsäure, Methacrylsäure, 2-Hydroxyethyl- methacrylat, 2-Hydroxyethylacrylat, Itakonsäure oder Acrolein N-Vinylpyrrolidon, Acrylamid, Methacrylamid oder Mischungen derselben.
Des Weiteren umfasst die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung farbloser, magnetischer Polymerpartikel, welches aus den folgenden Schritten besteht oder diese umfasst:
a) Bereitstellung des mindestens einen Polymers und/oder zu polymerisierenden Monomeren und des mindestens einen Magnetkolloids und des mindestens einen Weißpigments, b) Lösen, des mindestens einen Polymers in Wasser, c) Zugabe des mindestens einen Magnetkolloids und des mindestens einen Weißpigments, d) Dispergieren der Magnetkolloid-Weißpigment-Polymer-Mischung in einer mit Wasser nicht mischbaren organischen Phase unter Durchmischung und e) Vernetzung von Magnetkolloid und Weißpigment und Polymer durch Zugabe eines Vernetzers zur Herstellung von festen Polymerpartikeln.
sowie ein Verfahren, welches aus den folgenden Schritten besteht oder diese umfasst:
a) Bereitstellung einer wässrigen Lösung oder wässrigen Dispersion des mindestens einen vernetzbaren Polymers oder des mindestens einen polymerisierbaren Monomers und des mindestens einen Magnetkolloids und des mindestens einen Weißpigments, b) Zugabe einer organischen nicht mit Wasser mischbaren Phase, c) Durchmischung der wässrigen Lösung oder wäßrigen Dispersion mit der organischen Phase und d) im Falle des vernetzbaren Polymers, Dispergieren der Mischung aus vernetzbarem Polymer, Magnetkolloid und Weißpigment in der mit Wasser nicht mischbaren organischen Phase und e) Vernetzung des Polymers unter Einschluss des Magnetkolloids und des Weißpigments durch Zugabe eines Vernetzers zur Herstellung von farblosen, magnetischen Polymerpartikeln oder d') im Falle des polymerisierbaren Monomers, Dispergieren der Mischung aus polymerisierbaren Monomer, Magnetkolloid und Weißpigment in der mit Wasser nicht mischbaren organischen Phase und e') Polymerisation des Monomers unter Einschluss des Magnetkolloids und des Weißpigments durch Zugabe eines Polymerisationsstarters zur Herstellung von farblosen, magnetischen Polymerpartikeln.
Das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren verwendet vernetzbare Polymere, wobei dieser Begriff auch vernetzbare Oligomere einschließt, oder polymerisierbare Monomere, welche sich vorzugsweise radikalisch polymerisieren lassen, wobei anionische oder kationische Polymerisation auch möglich ist, und mindestens ein Magnetkolloid und des mindestens ein Weißpigment. Im Falle der Kombination aus vemetzbarem Polymer, Magnetkolloid und Weißpigment wird zudem noch mindestens ein Vernetzer benötigt. Diese 4 Komponenten werden als Feststoff bevorzugt als Pulver oder in wässriger Dispersion oder als Mischung bereitgestellt. Grundsätzlich ist es unerheblich, welche Komponente von vernetzbarem Polymer, Magnetkolloid und Weißpigment zu welcher Komponente gegeben wird. Letztendlich ist nur wichtig, dass eine wässrige Lösung oder wässrige Dispersion aus vernetzbarem Polymer, Magnetkolloid und Weißpigment erhalten wird. Zu dieser wässrigen Lösung oder wässrigen Dispersion gibt man eine organische und nicht mit Wasser mischbare Phase. Wässrige Phase und organische Phase werden durchmischt und die Vernetzung der Polymere unter Einschluß von Magnetkolloid und Weißpigment erfolgt mittels Zugabe eines Vernetzers unter Durchmischung des Zweiphasensystems aus wässriger Phase und organischer Phase.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren, welches aus den folgenden Schritten besteht oder diese umfasst:
a) Bereitstellung einer wässrigen Lösung oder wässrigen Dispersion aus mindestens einem Polymer und mindestens einem Magnetkolloid und mindestens einem Weißpigment, b) Zugabe einer organischen nicht mit Wasser mischbaren Phase, c) Durchmischung der wässrigen Lösung oder Dispersion mit der organischen Phase und d) Vernetzung des Polymers unter Einschluss des Magnetkolloids und des Weißpigments durch Zugabe eines Vernetzers zur Herstellung von farblosen, magnetischen Polymerpartikeln.
Verwendet man anstelle der vernetzbaren Polymere (umfassend auch vernetzbare Oligomere), polymerisierbare Monomere, dann erfolgt keine Vernetzung unter Einschluss von Magnetkolloid und Weißpigment, sondern eine Polymerisations, vorzugsweise eine radikalische Polymerisation unter Ausbildung von Polymeren. Werden bei den polymerisierbaren Monomere auch bifuntionelle oder multifuntionelle Monomere eingesetzt, dann erfolgt eine vernetzende Polymerisation, wobei Magnetkolloid und Weißpigment im entstehenden Polymerpartikel eingeschlossen werden. Bei dieser Variante stelle man eine wässrige Lösung oder wässrige Dispersion aus polymerisierbarem Monomer und Magnetkolloid und Weißpigment bereit, gibt ein organisches nicht mit wasser mischbares Lösungsmittel als organische Phase hinzu und Durchmischt die wässrige und die organische Phase. Die Herstellung der farblosen, magnetischen Polymerpartikel erfolgt während der Durchmischung der wässrigen und organischen Phase mittels Zusatz eines Polymerisationsstarters wie beispielsweise eines Radikalbildners.
Gemäß dieser Variante betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren, welches aus den folgenden Schritten besteht oder diese umfasst:
a) Bereitstellung einer wässrigen Lösung oder wässrigen Dispersion aus mindestens einem polymerisierbaren Monomer und mindestens einem Magnetkolloid und mindestens einem Weißpigment, b) Zugabe einer organischen nicht mit Wasser mischbaren Phase, c) Durchmischung der wässrigen Lösung oder Dispersion mit der organischen Phase und d) Polymerisation des Monomers unter Einschluss des Magnetkolloids und des Weißpigments durch Zugabe eines Polymerisationsstarters zur Herstellung von farblosen, magnetischen Polymerpartikeln.
Ausgangspunkt des Verfahrens sind somit Polymere, Oligomere oder Monomere, die wasserlöslich sind und in einer organischen, nicht mit Wasser mischbaren Phase dispergiert und während des Dispergiervorganges durch Zugabe eines vernetzend wirkenden Agens, d.h. eines Vemetzers oder im Falle der Monomeren mittels multifunktioneller Monomere, welche dann die Funktion des Vemetzers haben, zu festen Polymerpartikeln vernetzt werden. Im ersten Schritt wird in der Regel eine 1 - 20 Gew-%ige wässrige Lösung des jeweiligen Polymeren hergestellt. Bevorzugte Herstellungsverfahren sind dadurch gekennzeichnet, dass Polymerlösungen verwendet werden, die eine Viskosität zwischen 5 und 800 cP (1 Centipoise = 1 cP = 10"3 kg/ms) bei Raumtemperatur aufweisen. Dieser Lösung wird im zweiten Schritt ein Magnetkolloid bzw. Ferrofluid zugesetzt.
Die Volumenverhältnisse organische Phase zu Polymer/Monomerphase liegen in der Regel zwischen 5:1 und 30:1 sowie 2:1 und 4:1 in Bezug auf die Volumenverhältnisse Polymerphase zu Magnetkolloid, wobei hier und im Folgenden mit „Polymerphase" die wäßrige Polymerlösung definiert ist. Der Gewichtsanteil der magnetischen Nanopartikel in der Polymerphase liegt durchweg zwischen 10 Gew.- % und 60 Gew.-%.
Die Weißpigmente werden der Polymer/Monomer - Mischung, d.h. der Polymerlösung oder der Monomerlösung oder einer Lösung enthaltend Polymer und Monomer, gemeinsam mit oder nach den Magnetkolloiden in Form eines Pulvers oder einer Lösung, vorzugsweise einer wässrigen Lösung zugesetzt und anschließend in einer organischen Phase unter Rühren dispergiert. Während des Dispergiervorganges werden die gebildeten Tröpfchen durch Zugabe eines Vernetzers bzw. eines bi- oder trifunktionellen Monomeren zu festen Polymerpartikeln vernetzt. Die Weißpigmente können entweder in fester Form oder als wässrige Emulsion oder Dispersion den Polymermischungen oder der Magnetkolloidlösung zugesetzt werden. Vorzugsweise werden die Pigmente, um die bevorzugte Teilchengröße <500 nm zu erreichen, mittels einer Kugelmühle feingemahlen. Die Pigmente werden üblicherweise so zudosiert, dass der Gewichtsanteil des Weißpigmentes 30 Gew.-% bis 90% Gew.-%, bezogen auf die Menge der Magnetkolloide hier auch als magnetische Nanopartikel bezeichnet beträgt. Bevorzugte Herstellungsverfahren sind dadurch gekennzeichnet, dass die Polymer/Monomer-Magnetkolloid-Weißpigment-Mischung vor der Dispersion für 10 bis 120 Minuten mit Ultraschall behandelt wird.
Die Polymer/Monomer-Magnetkolloid-Weißpigment-Mischung wird im nachfolgenden Schritt in einer organischen Phase unter Rühren dispergiert. Das Dispergiermittel besteht aus mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln oder mineralischen oder pflanzlichen Ölen. Bezüglich der Lösungsmittel hat sich überraschenderweise herausgestellt, dass vor allem solche Produkte zu stabilen Dispersionen führen, die einen, Verteilungskoeffizienten von 1 ,5 bis 6, vorzugsweise einen solchen zwischen 2 und 4 aufweisen, gemäß der von C. Laane et al. (in „Biocatalysis in Organic Media", Laane et al. Hrsg., Elsevier, Amsterdam, pp 65, 1987) eingeführten Klassifizierung anhand eines Standard Oktanol-Wasser- Zweiphasensystems. Beispiele für solche, die obigen Kriterien erfüllenden Lösungsmittel sind Tetrachlormethan, Chlorbenzol, Heptanol, Toluol, XyIoI, Chloroform, Trichlorethylen, 1.1.1-Trichlorethan, Hexan, Petrolether, Heptan und Oktan. Auch Mischungen der obigen Lösungsmittel, die eine Dichte von ca. 1 g/cm3 aufweisen, eignen sich gut zum Dispergieren. Dabei kann es von Vorteil sein, wenn das organische Lösungsmittel in einem Volumenüberschuss gegenüber der wässrigen Lösung vorliegt. Ein bevorzugter Volumenüberschuss liegt zwischen 5 und 20-fachem, bevorzugt 10 bis 15-fachem Volumen der organischen Phase im Vergleich zur wässrigen Phase.
Um zu einer homogenen und sehr feinen Kolloiddispersion zu gelangen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, der Magnetkolloidlösung oder dem organischen Lösungsmittel oberflächenaktive Substanzen, die auch allgemein als "Stabilisatoren", bezeichnet werden, zuzusetzen. Herstellungsverfahren, wobei der organischen Phase Stabilisatoren zugesetzt werden sind somit bevorzugt.
Die Stabilisatoren können dabei aus der oben bereits beschriebenen Gruppe ausgewählt werden. Im Hinblick auf die Herstellung von Polymerpartikeln mit kleineren Partikelgrößen von <10 μm sind durchweg höhere Stabilisatorkonzentrationen notwendig und umgekehrt: für größere Teilchen kann die Stabilisatorkonzentration entsprechend verringert werden. Die Stabilisatoren werden für die Einkapselung in der Regel als 0,1 bis 30 Gew-%ige, bevorzugt 0,3 bis 15 Gew-%ige Lösungen und noch weiter bevorzugt 0,5 bis 6 Gew-%ige Lösungen eingesetzt. Die für die Herstellung der erfindungsgemäßen Polymerpartikel relevanten Stabilisatorkonzentrationen in der organischen Phase liegen zwischen 0,1 und 30 Gew-%, vorzugsweise zwischen 0,5 und 6 Gew-%. Es ist daher ein Verfahren bevorzugt, wobei der Anteil der Stabilisatoren in der organischen Phase zwischen 0,05 und 30 Gew-% beträgt.
Neben den organischen Lösungsmitteln lassen sich auch herkömmliche Pflanzen- und Mineralöle verwenden. Es konnte überraschenderweise gezeigt werden, dass sich Öle besonders bevorzugt für die Dispersion der Alginate, Gelatine, Polysaccharide und Acrylate eignen. Die zur Herstellung der farblosen, magnetischen Polymerpartikel als organische Phase bevorzugt eingesetzten Pflanzenöle besitzen durchweg bei Raumtemperatur eine Viskosität zwischen 30 und 200 Centipoise (cP), die Mineralöle und Silikonöle eine solche zwischen 500 und 10.000 cP. Nicht limitierende Beispiele hierfür sind: Palmöl, Kokosöl, Maiskeimöl, Sonnenblumenöl, Rizinusöl, Rapsöl, Sojaöl, Olivenöl, Leinöl sowie Paraffinöl, leichtes und schweres Maschinenöl, synthetische Öle oder Silikonöl. Die Volumenverhältnisse von organischer Phase zur wässrigen Polymer/Monomerphase liegen in der Regel zwischen 5:1 und 30:1.
Die vorliegende Erfindung umfasst ferner ein bevorzugtes Herstellungsverfahren, wobei als organische Phase organische Lösungsmittel mit einem Verteilungskoeffizienten zwischen 1 ,5 und 6 oder Pflanzenöle mit einer Viskosität von 30 cP bis 200 cP verwendet werden.
Allgemein liegen die Partikelgrößen bei einer Viskosität <1000 cP im Bereich von 2 bis 100 μm und bei Viskositäten >1000 cP durchweg zwischen 100 und 800 μm. Zum Dispergieren unter Durchmischung des Zweiphasensystems werden wahlweise, je nach gewünschter Partikelgröße, Dispergierwerkzeuge oder konventionelle Rührer eingesetzt. Zur Unterstützung der Dispersion werden herkömmliche Rührgeräte mit Zwei- oder Vierblattrührern verwendet. Für die Herstellung besonders feiner erfindungsgemäßer Polymerpartikel (<10 μm) kommen insbesondere Dispergierwerkzeuge mit einer Umdrehungsleistung bis zu 36,000 U/min, die nach dem Rotor-Stator-Prinzip funktionieren (z.B. Ultra-Turrax®, IKA Werke, FRG), zum Einsatz. Zwischen Rührgeschwindigkeit und Teilchengröße besteht eine umgekehrte Proportionalität dergestalt, dass Teilchengrößen von >20 μm durch Rührgeschwindigkeiten im Bereich von 500-1200 U/min erzeugt werden, dagegen Teilchen von <10 μm Rührgeschwindigkeiten von >5000 U/min erfordern.
Weitere Möglichkeiten zur Herstellung sphärischer Partikel ergeben sich aus der "Ink-Jet"-Technologie. Dieses Prinzip, das der Tintenstrahltechnik moderner Drucker entlehnt ist, geht von der Polymerlösung, enthaltend mindestens ein Magnetkolloid, mindestens einen Vemetzer und mindestens ein Weißpigment aus, die durch eine feine Düse in die organische Phase gepresst wird und dabei entweder mittels mechanischer oder elektrostatischer Vibrationen unterbrochen wird. Es entstehen dabei vor allem monodisperse Teilchen. Mit Hilfe dieser Verfahrensweise, die aus dem Stand der Technik hervorgeht (s. U. Prüsse et al. Chem. Papers, Vol. 62, 2008, 364), werden Teilchen mit einem Durchmesser von >20 μm erzeugt. Sie ist vor allem für Polymerlösungen aus Alginat, Polyvinylalkohol, Agarose und Silicagel geeignet, die sich rasch innerhalb von Sekunden vernetzen lassen. Bevorzugt sind daher Herstellungsverfahren, wobei die Dispersion mit einem Dispergierwerkzeug und einer Rührgeschwindigkeit von 5000 bis 36.000 Umdrehungen pro Minute gerührt wird.
Nach der Partikelbildung in der Dispersion werden die erzeugten farblosen, magnetischen Polymerpartikel üblicherweise mit Hilfe eines Handmagneten - vorzugsweise werden hierfür Neodym-Bor-Eisen-Magnete verwendet - von der organischen Phase abgetrennt. Alternativ kann auch eine Abtrennung durch Zentrifugation stattfinden. Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst somit vorzugsweise einen Schritt der Abtrennung der Polymerpartikel mittels Zentrifugation oder Magneten bzw. Magnetismus. Diesem Schritt schließen sich vorzugsweise mehrere Waschschritte mit z.B. Petrolether, Aceton, Alkohol und Wasser an. Hierbei sollen vor allem alle Reste des organischen Lösungsmittel oder der Öle entfernt werden. Die erhaltenen Polymerpartikel werden in der Regel in Wasser aufbewahrt. Danach können die gewonnenen Polymerpartikel einer Oberflächenfunktionalisierung bzw. Aktivierung unterworfen werden. Die
Zielsetzung besteht in der Kopplung spezifischer Bioliganden, die mit zu bestimmenden bzw. abzutrennenden Analyten eine Bindung eingehen können.
Bekanntermaßen wird die Porosität der Polymerteilchen durch die Knäueldichte bestimmt, die ihrerseits durch die mittlere Molmasse des Polymeren und die Konzentration festgelegt ist. Zunehmende Molmasse und/oder verringerte Polymerkonzentration bedeutet geringere Knäueldichte und damit zunehmende Porosität. Da die Praktikabilität eines Testverfahrens besonders im Rahmen routinemäßiger diagnostischer oder analytischer Verfahren auch von der Quantität der pro Trägermenge gebundenen Bioliganden abhängt, spielt die Porosität je nach Anwendung eine mehr oder weniger wichtige Rolle für die Magnetpartikelherstellung. Bei den erfindungsgemäßen Polymerpartikeln kommen daher vorzugsweise Polymerkonzentrationen von 2.5 - 10 Gew-% bezogen auf die wässrige Lösung und Molmassen von >40 kDa zum Einsatz. Auf diese Weise hergestellte Polymerpartikel weisen eine hohe Porosität und eine entsprechend hohe Bindungskapazität sowohl in Bezug auf die an die polymere Matrix gekoppelten Bioliganden als auch in Bezug auf die von den Liganden gebundenen Oberflächenstrukturen auf.
Die spezifischen Herstellungsmodalitäten für einige erfindungsgemäße Polymerpartikel sind wie folgt:
Für die Synthese der erfindungsgemäßen Polymerpartikel aus z.B. Gelatine werden in der Regel 5 - 20 Gew-%ige Polymerlösungen verwendet, die durch Erhitzen des Feststoffes in einem 0,05 molaren Phosphat-Puffer, pH 7.5 - 8.5, auf 8O0C hergestellt werden. Diesen Lösungen werden die entsprechenden Magnetkolloide und Weißpigmente in den angegebenen Konzentrationen zugesetzt. Danach wird die auf 45°C herunter gekühlte Polymerphase in vorgewärmtem Pflanzenöl, das eine Viskosität von 40 - 150 cP aufweist und in der Regel zwei bis drei der Stabilisatoren in einer Konzentration von 0,5 bis 2,5 Gew-% enthält, unter Rühren dispergiert. Die Zugabe einer 1 - 12%igen Glutaraldehyd-Lösung führt innerhalb von 20 Minuten zu festen, sphärischen Gelatine-Partikeln, deren Größen sich durch Veränderung der Rührgeschwindigkeit, der Dispergiermodalität (Dispergierwerkzeug, Ink-Jet- Verfahren) und/oder der Konzentration des Polymeren zwischen 0,5 und 800 μm einstellen lassen. Nach Abtrennung der gebildeten Polymerpartikel mittels eines Handmagneten, werden die Produkte üblicherweise zunächst mit apolaren Lösungsmittel wie Hexan oder Petrolether gewaschen, gefolgt von mehrfachen Waschprozessen mit Aceton, Methanol oder Ethanol und Wasser.
Zur Herstellung von farblosen, magnetischen Partikeln auf der Basis von Polysacchariden wird in der Regel von 5 - 20% wässrigen Lösungen ausgegangen. Bevorzugt hierfür werden Polymere mit einer Molmassen zwischen 50 und 500 kDa. Beispiele hierfür, die die Erfindung jedoch in keiner Weise einschränken, sind: Cellulose, Cellulosederivate, Hyaluronsäure, Hydroxypropylcellulose, Dextran, Agarose. Nach entsprechendem Zusatz des Magnetkolloids sowie des
Weißpigmentes wird die Polymerphase durch Zugabe von Natronlauge auf pH 10 eingestellt. Die Vernetzung erfolgt durch Zugabe von 2,8 - 4 Vol% (bezogen auf die Polymerphase) Divinylsulfon, das vor dem Eintrag der Polymermischung in die organische Phase zugesetzt wird. Als organische Phase wird vorzugsweise Pflanzenöl mit einer Viskosität von 40 bis 150 cP, dem 0, 5 bis 5% Stabilisatoren zugemischt sind, benutzt. Der Dispergiervorgang dauert in der Regel 20 bis 30 Minuten, wodurch, je nach Versuchsbedingungen (Rührgeschwindigkeit, Rührmodalität und Polymerkonzentration), farblose, sphärische Polymerpartikel im Größenbereich von 1 bis 500 μm erhalten werden.
Für die Synthese der erfindungsgemäßen Partikel auf Basis von Chitosan wird in der Regel von 0,5 bis 1%igen, essigsauren Lösungen ausgegangen. Die
Konzentrationen des Polymeren liegen üblicherweise im Bereich von 0,5 bis 3 Gew-%, wobei der Deacetylierungsgrad durchweg 80 bis 90% beträgt. Vorzugsweise werden Polymere mit einer Molmasse von 40 bis 600 kDa eingesetzt. Nach Zugabe der entsprechenden Magnetkolloid- und weißen Pigmentmengen, wird die erhaltene Mischung in einem organischen Lösungsmittel, entsprechend obiger Klassifizierung nach Laane et al., dispergiert. Die organische Phase enthält in der Regel 0,5 bis 3,0 Gew-% Stabilisator. Die organische Phase liegt in der Regel in einem 10- bis 20-fachen Volumenüberschuss gegenüber der Polymerphase vor. Während des Dispergiervorgangs werden, bezogen auf die Polymerphase, 10 bis 20 Vol-% einer 6 bis 12%igen Glutaraldehyd-Lösung zugesetzt. Die Reaktion führt innerhalb von 60 bis 120 Minuten zu festen Polymerpartikeln. Alternativ zu der Vernetzung mit Glutaraldehyd kann auch Epichlorhydrin, eine Kupfersulfatlösung oder Na-Tripolyphosphat eingesetzt werden, wobei die Vernetzung mit Epichlorhydrin vorteilhafter weise bei 450C über einen Zeitraum von 1 bis 2 Stunden durchgeführt wird.
Ausgangspunkt der Silicagel-Partikel Herstellung sind SiO2-Sole, die entsprechend der in der Offenlegungsschrift WO 02/09125 A1 , die hiermit ergänzend als Offenbarung eingeführt wird, beschriebenen Technik durch Hydrolyse von Alkoxysilanen mit Hilfe verdünnter Mineralsäuren (z.B. HCl) oder Carbonsäuren (z.B. Essigsäure) hergestellt werden. Dazu werden die Alkoxysilane in Wasser unter Säurezugabe hydrolysiert Als Alkoxysilane können Kieselsäureorthoester aliphatischer Alkohole eingesetzt werden, wobei bevorzugt Methyl-, Ethyl- oder Propylester einzeln oder als Mischungen zum Einsatz kommen. In der Folge findet eine Kondensation zu niederpolymeren SiO2-Hydrosolen statt, die nach und nach durch weitere Polykondensation zu mehr oder weniger viskosen Solen bzw. Gelen führen. Zur mechanischen Durchmischung der Alkoxisilan-Wasser-Säure-Mischung können entweder herkömmliche mechanische Rührer oder Dispergierwerkzeuge verwendet werden.
Wie aus dem Stand der Technik hervorgeht, kann die Porenstruktur der Silicagele durch Steuerung der Hydrolyse und Polykondensation gezielt eingestellt werden, wodurch die Bindungskapazitäten für die zu bindenden Analyten bzw. Zielsubstanzen beeinflusst werden kann.
Neben der Hydrolyse und Polykondensation als strukturbestimmende Faktoren, kann auch die Viskosität der Sol-Phase zur Einstellung der Teilchen- und Porengrößen herangezogen werden. Die Einstellung der Viskosität leitet sich unmittelbar aus der spezifischen Reaktionsweise der Sol-Gel-Bildung während des Alterungsprozesses ab, der durch die Ausbildung von Oxo-Brücken im SoI begleitet wird. Die daraus folgende Viskositätserhöhung ist mit einer parallelen Teilchengrößenzunahme und Porengrößenabnahme verbunden. Unter sonst gleichen äußeren
Versuchparametern (Rührgeschwindigkeit, chemische Zusammensetzung) führen Viskositäten von <40 cP zu Teilchengrößen von <50 μm und solche mit einer Viskositäten von >40 cP zu Partikelgrößen von >50 μm. Als Dispergierphase für die Silicagel Herstellung werden üblicherweise organische Lösungsmittel gemäß der obigen Klassifizierung nach Laane et al. verwendet; sie enthalten in der Regel 0,5 bis 5 Gew-% Stabilisator. Die anschließende optionale Einführung funktioneller Gruppen in Form von Carboxyl-, Epoxy-, Aminogruppen mit Hilfe entsprechender Silane zur Kopplung der Bioliganden geht allgemein aus dem Stand der Technik hervor und kann von einem Fachmann auf dem Gebiet uneingeschränkt genutzt werden. Die Verfestigung der Sole geschieht üblicherweise durch Zugabe verdünnter Basen wie NaOH oder Ammoniak, wobei deren Volumenanteil in der Mischung durchweg zwischen 10 und 50% beträgt.
Zur Herstellung der farblosen, magnetischen Polymerpartikel auf der Basis von Polyvinylalkohol werden durchweg 2,5 bis 15 Gew-%ige wäßrige Lösungen verwendet. Nach Zugabe der entsprechenden Magnetkolloid- und weißen Pigmentmengen wird die Polymer-Magnetkolloid-Weißpigment-Mischung in die organische Phase eingetragen, wobei hierbei durchweg die gleichen Mittel zum Einsatz gelangen wie bei der Silicagel-Herstellung. Es kommen vorteilhafter Weise organische Lösungsmittel gemäß obiger Klassifizierung zum Einsatz. Alternativ lassen sich sphärische Polyvinylalkohol-Partikel auch unter Zuhilfenahme von Pflanzenölen mit einer Viskosität von 30 bis 160 cP herstellen. Die Stabilisatorkonzentrationen liegen durchweg zwischen 0,5 und 2 Gew-%. Die Volumenverhältnisse organische Phase zu Polymerphase betragen in der Regel 5-15 : 1. Mechanisches Dispergieren geschieht in gleicher Weise wie bei den anderen Polymeren entweder mittels herkömmlicher Propellerrührer oder mit Hilfe von Dispergierwerkzeugen. Auch bei diesen Polymeren hat die Viskosität der Polymerlösung mitentscheidenden Einfluss auf die Partikelgröße: Sinkende Viskosität der Polymerlösung führt im Allgemeinen zu einer entsprechenden Verringerung der Teilchengröße, wohingegen steigende Viskositäten zu einer Teilchenvergrößerung führen.
Zur Herstellung von Alginat-Partikeln werden im Allgemeinen 0,1 - 4,0 Gew-%ige wässrige Lösungen eingesetzt, die nach entsprechender Zugabe des Magnetkolloids und Weißpigments in einer mindestens zwei Stabilisatoren enthaltenden mineralischen Ölphase eingebracht werden. Als organische Phase wird vorzugsweise ein hochviskoses Silikonöl mit einer Viskosität von 800 bis 3.000 cP verwendet. Die Stabilisatorkonzentration in der Ölphase beträgt in der Regel 10 bis 30 Gew-%, wobei mit steigender Konzentration die Teilchengrößen zu kleineren Werten hin verschoben werden. Der bei den erfindungsgemäßen Polymerpartikeln festgestellte direkte Zusammenhang zwischen Viskosität bzw. Konzentration der Polymerlösung und Teilchengröße gilt auch hier uneingeschränkt: Mit steigender Alginatkonzentration, was gleichbedeutend mit einer Viskositätszunahme ist, steigt der mittlere Partikeldurchmesser deutlich an. Zur Vernetzung der in der Ölphase gebildeten Polymertröpfchen kommen grundsätzlich bi- oder trivalente Ionen wie z.B. Sr2+, Ca2+, Mg2+, Cu2+, Ba2+, Al3+ zum Einsatz. Vorzugsweise werden Calciumionen in Form von Calciumchlorid eingesetzt. Diese Substanz ist preiswert, nicht toxisch und kann die dispergierten Polymertröpfchen innerhalb weniger Sekunden zu festen Partikeln vernetzen. Die Konzentration des Vernetzers ist derart gewählt, dass die erhaltenen Mikrokugeln eine ausreichende mechanische Stabilität besitzen, die auch eine mehrminütige Ultraschallbehandlung zulassen. Die sich bildenden magnetischen Calciumalginat-Mikropartikel werden üblicherweise durch Zentrifugation von den übrigen Dispergierbestandteilen abgetrennt und durch mehrere sich anschließende Waschschritte mit Petrolether, Aceton, Methanol und Wasser gewaschen.
Ausgangspunkt für die Synthese der magnetischen, farblosen Polyacrylat-Partikel sind Mischungen gebildet aus Acrylsäure, Itakonsäure, Methacrylsäure oder anderen Carboxylgruppen-enthaltenden Monomeren und Vinylmonomeren. Die
Konzentration der Acrylsäure im Polymeren kann, je nach angestrebtem Carboxylierungsgrad, durch Copolymerisation mit anderen Vinlymonomeren wahlweise zwischen 30 und 90 Mol% eingestellt werden. Als Comonomere kommen grundsätzlich sämtliche, mit Acrylsäure bzw Carboxylgruppen-enthaltenden Monomeren copolymerisierbare Monomere in Frage. Die Erfindung nicht limitierende Beispiele sind: N-Vinylpyrrolidon, Acrylamid, Maleinsäure, N1N- dimethylaminopropylacrylamid, 2-Hydroxyethyl-methacrylat, 2-Hydroxyethyl-acrylat, Vinylacetat, Acrolein, Methoxyethyl-acrylat, Methoxyethyl-methacrylat, 2- Dimethylaminoethyl-(meth)acrylat, 2-Diethylaminoethyl-(meth)acrylat, 2-
Dimethylaminopropyl-(meth)acrylat, 3-Dimethylaminopropyl-(meth)acrylat,
Methacrylamid, N-Methylol-acrylamid, N-Methylol-methacrylamid, N-(2- Diethylaminoethyl)-(meth)acrylamid, N-(2-Dimethylaminopropyl)-(meth)acrylamid, N- (3-DimethyIaminopropyl)-(meth)acrylamid und/oder Glycidyl-methacrylat.
Der Mischung werden, bezogen auf die Monomerphase, 10 bis 50 Vol% eines Vernetzers zugesetzt. Vorzugsweise wird hierfür N.N'-Methylenbisacrylamid eingesetzt. Der Vorteil dieser Verbindung im Gegensatz zu anderen grundsätzlich auch verwendbaren Vernetzern wie z.B. Ethylenglykoldimethacrylat besteht in einer hohen Vernetzungsreaktion, die bereits nach wenigen Minuten zu festen Polymerträgern führt. N.N'-Methylenbisacrylamid wird üblicherweise als 20 - 35 Gew-%ige wässrige Lösung eingesetzt. Der Neutralisation mit konzentrierter Natronlauge folgt die Zugabe des entsprechenden Magnetkolloids und Weißpigmentes. Zur Initiierung der Polymerisation können die aus dem Stand der Technik bekannten Radikalbildner wie z.B. Ammonium- oder Kaliumpersulfat verwendet werden. Durch kombinierte Zugabe von N,N,N',N'-Tetramethyl- ethylendiamin (TEMED) und Ammoniumpersulfat (APS) kann eine signifikante Beschleunigung der Polymerisation erzielt werden. Die Konzentrationen von TEMED und APS, das üblicherweise als 20 - 40 Gew-%ige wässrige Lösung eingesetzt wird, liegen, bezogen auf die Monomerphase, zwischen 1 und 10 Vol% für TEMED und 1 und 20 Vol% für APS, wobei generell eine steigende Konzentration an TEMED und APS mit einem proportionalen Anstieg der Polymerisationsgeschwindigkeit einhergeht. Je nach Konzentration des
Radikalbildners und Beschleunigers findet die Polymerisation und Vernetzung zu festen Polymerpartikeln innerhalb weniger Minuten statt. Als Dispergierphase kommen Pflanzenöle mit einer Viskosität zwischen 40 und 160 cP zum Einsatz, wobei grundsätzlich analoge Zusammenhänge zwischen Rührgeschwindigkeit und Rührmodalität in Bezug auf die Einstellung der Teilchengrößen gelten wie bei den übrigen oben beschriebenen Polymeren.
Die Erfindung umfasst ferner alle farblosen, magnetischen Polymerpartikel, die nach einem der hier beschriebenen Verfahren erhältlich sind.
Die Erfindung umfasst femer die Verwendung der erfindungsgemäßen, farblosen, magnetischen Polymerpartikel für die Analytik und Diagnostik.
Um die erfindungsgemäßen farblosen Polymerpartikel als spezifische Fängerpartikel für bestimmte Biosubstanzen (Zielsubstanz) einsetzen zu können, werden in einem optionalen Syntheseschritt spezielle Bioliganden an die Polymerpartikel gekoppelt, die mit der Zielsubstanz eine Bindung einzugehen in der Lage sind. Bevorzugte Herstellungsverfahren sind dadurch gekennzeichnet, dass in einem zusätzlichen Schritt an der Oberfläche der magnetischen, farblosen Polymerpartikel mit Bioliganden koppelnde, reaktive Gruppen erzeugt bzw. funktionelle Gruppen der Polymere aktiviert werden. Besonders günstig sind die Kopplung der Bioliganden über sogenannte Spacer-Moleküle, heterobifunktionelle, reaktive Verbindungen, die sowohl mit den funktionellen Gruppen der Polymere (Carboxyl-, Hydroxyl-, Sulfhydryl-, Aminogruppen) als auch mit dem Bioüganden eine chemische Bindung eingehen können.
Somit kann ein erfindungsgemäßes farbloses, magnetisches Polymerpartikel an der Oberfläche der Polymerpartikel mit Bioliganden koppelnde, reaktive Gruppen aufweisen. Die mit Bioliganden koppelnden, reaktiven Gruppen können an Proteine, Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, Antikörper, Antikörper-Fragmente, Antigene, Streptavidin, Avidin, Biotin, Oligonukleotide, Polynukleotide, Oligosaccharide, Polysaccharide oder Enzyme koppeln.
Bei den mit Bioliganden koppelnden, reaktiven Gruppen kann es sich um folgende handeln: Carboxyl-, Hydroxyl-, Sulfhydryl-, Epoxy-, Nitril-, Isocyanat-, Imidazol-, Aldehyd-, Aminogruppen. Der Begriff „Bioligand" bezeichnet eine Substanz, die mittels koppelnder, reaktiver Gruppen an die erfindungsgemäßen Polymerpartikel gebunden ist und bevorzugt eine Bindung zu Oberflächenstrukturen von Zellen oder Organismen oder zu sezemierten Molekülen eingehen kann. Mögliche Bindungen bestehen beispielsweise zwischen Antigen und Antikörper oder Ligand und Rezeptor. Bioliganden im Sinne der Erfindung sind: Antikörper, Antigene, Polysaccharide, Streptavidin, Avidin, Proteine, Nukleinsäuren, Oligosaccharide, Oligopeptide, und Oligonukleotide. Oberflächenstrukturen im Sinne der Erfindung sind beispielsweise Lipide, Proteine, Rezeptoren, Antikörper, Antigene, biotinylierte Proteine, biotinylierte Antigene, biotinylierte Antikörper, Oligosaccharide und Polysaccharide, die sich auf der Oberfläche, vor allem als Bestandteil der jeweiligen Außenhülle (Zellmembran, Bakterienwand etc.), von Zellen, Bakterien, Pilzen, Parasiten oder Viren befinden. Nicht limitierende Beispiele für Bakterien und Viren sind Clostridien, Streptokokken, Staphylokokken, Listerien bzw Retroviren, Hepatitisviren, Polioviren, Pockenviren, Adenoviren, Herpesviren, Masernviren, Influenzaviren, Rötelviren, Zytomegalievirus oder Papillomaviren.
Durch die Überdeckung der ursprünglichen braun-schwarzen Farbe eröffnet sich die Möglichkeit, Nachweise von Oberflächenstrukturen von Zellen oder Pathogenen, die mit Hilfe gefärbter oder fluoreszierender Partikel durchgeführt werden, wesentlich sensitiver zu gestalten. Einem möglichen Nachweisprinzip liegt zugrunde, dass die farblosen, magnetischen Polymerpartikel und die gefärbten oder fluoreszierenden Partikel simultan als Fänger- (capture beads) und Markerpartikel (marker beads) eingesetzt werden. Zu diesem Zweck tragen sowohl Markersonden und Fängerpartikel durchweg die gleichen, gegen bestimmte Oberflächenstrukturen (Epitope) der Analyten gerichteten Bioliganden. Alternativ zu den partikulären Markersonden können auch fluoreszenzmarkierte Antikörper eingesetzt werden. Solche als Marker eingesetzten Moleküle gehen aus dem Stand der Technik hervor - hier als Referenz beigefügt: T. Alefantis et al. Molecular Cellular Probes, Vol. 18, 379-382, 2004; D. Müller-Schulte et al., J. Magn. Magn. Mater., Vol. 293, 2005, 135- 143 - und können daher von einem Fachmann auf diesem Gebiet jeder Zeit und uneingeschränkt genutzt werden. Auf diese Weise können beispielsweise Mykobakterien oder HI-Viren (Humanes Immundefizienz Virus) durch simultane Zugabe von Fänger- und Markerpartikeln, die mit einem Antikörper, der gegen das Mykobakterium-Oberflächenantigen Lipoarabinomannan gerichtet ist, bzw. mit einem Antikörper, der gegen das gp120 Oberflächenantigen des HI-Virus gerichtet ist, nachgewiesen werden. Dies geschieht indem die Partikel mit dem Pathogen einen gefärbten oder fluoreszierenden Komplex bilden, der nach entsprechender magnetischer Abtrennung in einfacher Weise mittels bekannter visueller Methoden nachgewiesen werden kann. Dieses Nachweisprinzip ist vorzugsweise anwendbar bei solchen Analyten, die über eine Vielzahl gleicher aber spezifischer Epitope verfügen wie beispielsweise Bakterien, Viren oder Pilze. Alternativ lassen sich auch Fänger und Markerpartikel einsetzen, die mit, gegen unterschiedliche Epitope gerichtete Bioliganden beschichtet sind. Dies kommt vor allem beim Nachweis von Proteinen zum Einsatz. Überraschenderweise lässt sich so Interferon-Gamma, das bekanntermaßen zum Nachweis der Tuberkulose herangezogen wird, durch zwei gegen verschiedene Oberflächenstrukturen des IFN-Gamma gerichtete Antikörper, die jeweils auf Fänger- und Markersonden gekoppelt sind, nachweisen.
Die kovalente Kopplung der Bioliganden an die erfindungsgemäßen Polymerpartikel erfolgt in Analogie zu den bekannten Verfahren zur Immobilisierung von Bioliganden an polymere Träger. Als Kopplungsagenzien können die folgenden Verbindungen, die die Erfindung jedoch in keiner Weise limitieren, dienen: Epichlorhydrin, Carbodiimide, Tosylchlorid, Tresylchlorid, Bromcyan, Hexamethylendiisocyanat, 2- Fluor-1 -methyl-pyridinium-toluol-4-sulfonat, N-Hydroxysuccinimid, Chlorcarbonat, Isonitril, Hydrazid, Glutaraldehyd, 1 ,1 ',-Carbonyl-diimidazol, 1 ,4-Butandiol- diglycidylether. Darüber hinaus lassen sich die Kopplungen der Bioliganden besonders vorteilhaft mit Hilfe heterobifunktioneller, reaktiver Verbindungen, die sowohl mit den funktionellen Gruppen der Polymere (Carboxyl-, Hydroxyl-, Sulfhydryl-, Aminogruppen) als auch mit dem Bioliganden eine chemische Bindung eingehen können, durchführen. Beispiele hierfür sind: Succinimidyl-4-(N-maleiimido- methyl)-cyclohexan-1-carboxylat, 4-Succinimidyloxycarbonyl-α-(2-pyridyldithio)toluol, Succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrat, N-γ-Maleimidobutyryloxysuccinimidester, 3-(2-Pyridyldithio)propionylhydrazid, Sulfosuccinimidyl-2-(p-azidosalicylamido)ethyl- 1,3'-dithiopropionat. Ohne auf weitere detaillierte Ausführungen diese Kopplungen und Modifikationen betreffend einzugehen, die u.a. in „Scientific and Clinical Applications of Magnetic Carriers", Häfeli et al. (Hrsg.), Plenum Press, New York, 1997, und „Methods in Enzymology", Mosbach Hrsg, VoI 135 Part B, Academic Press, 1987, S. 3-169, beschrieben sind, wird davon ausgegangen, dass ein Fachmann auf diesem Gebiet die speziellen Reaktionsmethoden hinreichend kennt und daher die Beschreibung grundsätzlich nutzen kann. Die beschriebenen Ausführungsformen sind daher in keiner Weise als limitierende Offenbarungen aufzufassen.
Im besonderen Maße spielt die Kopplung von Antikörpern als Bioliganden an die erfindungsgemäßen Polymerpartikel eine zentrale Rolle, da diese eine Vielzahl von Antigenen bzw. Zielsubstanzen zu binden vermögen, die zur Analyse bzw. Diagnose diverser Krankheiten und Infektionen oder zur sonstigen physiologischen Datenerfassung benutzt werden können. Die Erfindung nicht limitierende Beispiele für solche Antigene sind: Digoxin, Lidocain, Plasmin, Gewebeplasminogen Aktivator (tPA), FPA, BFP, Carcinogen Embryonales Antigen (CEA), toxoplasmatisches Antigen, Alpha-1-Fetoprotein, Ferritin, TSH (thyroid-stimulating homnone) Glykoprotein19-9, Apolipoprotein, Beta-2-Mikroglobulin, Alpha-1-Mikroglobulin, Prostata-spezifisches Antigen (PSA), C-reaktives Protein, Humanes Choriongonadotropin (HCG), Hepatitis Antigen, das gp120 Oberflächenantigen des HI-Virus, das Oberflächenantigen des Humanen T-lymphotropen Virus, die Oberflächenepitope des Mykobakteriums wie Lipoarabinomannan, Mykolsäure, Arabinogalactane, Peptidoglycolipide, Trehalose-6-Phosphat Phosphatase, Cord Faktor, Glykolipide, 19 kDa-Protein, 38 kDa-Antigen, 14 kDa (TB68 epitope)-Antigen, HSP 65 (heat shock protein), 16 kDa-Antigen, 27-kDa-Antigen, 25-kDa-Antigen oder 40 kDa-Antigen.
Die Gewinnung solcher Antikörper als monoklonale, polyklonale oder rekombinante Spezies, sofern sie nicht kommerziell erhältlich sind, gehen aus dem Stand der Technik hervor und können jeder Zeit von einem Fachmann auf diesem Gebiet genutzt werden (s. PJ. Cummings et al., Hybridoma, Vol. 17 (2), 151 ,1998). Neben den Antikörpern sind auch Antikörper-Fragmente wie Fab oder F(ab')2, Einzelkettenmoleküle (scFv), künstliche Konstrukte wie „Diabodies", „Triabodies" oder "Minibodies" einsetzbar.
In den nachfolgenden Beispielen werden die erfindungsgemäßen Verfahren und Produkte näher beschrieben, ohne diese zu begrenzen. Dem Fachmann geläufige Abwandlungen der hierin beschriebenen Ausführungsformen fallen mit unter den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung und werden als für den Fachmann naheliegend und somit als offenbart angesehen.
Beispiele
Beispiel 1
Herstellung eines farblosen, magnetischen Gelatinepartikels Eine 20 %ige Gelatine-Lösung wird durch Erwärmen auf 800C in einem 0,01 M Na- Phosphat-Puffer, pH 8.0, hergestellt. Danach wird die Lösung auf 45°C gebracht. 25 ml dieser Lösung werden sodann mit 7,5 ml eines stabilisierten Magnetkolloids, das nach einer Vorschrift von Shinkai et al. (Biocatalysis, VoI 5, 61 , 1991) durch Oxidation einer 0,6 molaren Eisen(ll)salz-Lösung unter Verwendung von 0,3 M Na- Nitrit hergestellt wurde, zugegeben. Es folgt die Zugabe von 4 ml einer 60%igen wässrigen Titandioxid-Emulsion. Die Mischung wird 30 Minuten im Ultraschallbad (Bandelin Sonorex) bei 450C und unter Stickstoffatmosphäre homogenisiert. Danach wird die Polymerphase in 450 ml auf 450C vorgewärmtes Pflanzenöl (Viskosität 120 cP), in dem 0,1% Sesquioleat, 1 ,2% Tween 80 und 1 ,5% Dehymuls FCR gelöst sind, eingetragen. Unter leichter Stickstoffzuführung wird die Mischung unter Rühren (Zweiblattrührer, 1200 U/min) 2 Minuten dispergiert. Es folgt die Zugabe von 1 ,5 ml 6%iger Glutaraldehydlösung. Die Mischung wird 15 Minuten weitergerührt und anschließend auf Raumtemperatur abgekühlt. Nach magnetischer Separation mit Hilfe eines Neodym-Bor-Eisen Handmagneten und mehrfachem Waschen mit Petrolether, Ethanol und Wasser fallen Gelatinepartikel mit einer Teilchengröße zwischen 2 bis 10 μm an. Die gewonnene Polymerpartikelfraktion wird sodann in 3 ml 0,1 M Na-Phosphat-Puffer, pH 8.2, suspendiert und unter Zugabe von 0,5 ml 12%iger Glutaraldehyd-Lösung über einen Zeitraum von 2 Stunden bei Raumtemperatur aktiviert. Die Fraktion wird mehrfach mit aqua dest. unter Zuhilfenahme der Magnetabtrennung gewaschen. Nachweisverfahren für Mykobakterien
2 ml der gewaschenen Fraktion werden mit 4 ml 0.05 M Phosphat-Puffer, pH 8.0, in dem 1 ,2 mg anti-Lipoarabinomannan-lgG und 2 mg Cyanborhydrid gelöst sind, über einen Zeitraum von 3 Stunden unter leichtem Schütteln zur Reaktion gebracht. Es wird mehrfach mit aqua dest und PBS-Puffer, pH 7.2, nachgewaschen. Die so gewonnene Probe kann in Verbindung mit gefärbten oder fluoreszierenden, ebenfalls mit anti-Lipoarabinomannan-lgG gekoppelten Partikeln oder fluoreszenzmarkiertem anti-Lipoarabinomannan-lgG zum Nachweis von Mykobakterien im Sputum oder Urin verwendet werden.
Beispiel 2
Herstellung von farblosen, magnetischen Silicapartikeln
Gemäß einer Vorschrift in WO 02/09125 A1 wird eine Mischung aus 55 ml
Tetraethoxylsilan und 15 ml 0,05 M HCl in einem Ultraschallbad für 25 Minuten unter Eiskühlung beschallt. 20 ml des Silica-Sols, das bei 200C eine Viskosität von 36 cP aufweist, werden mit 5 ml eines Magnet-Kolloides, das gemäß der Vorschrift von Shinkai et al. hergestellt wurde, vermischt. Der Polymer-Magnetkolloid-Mischung werden 15 Gew-% festes, feinkristallines Titandioxid zugesetzt und die Mischung 10 Minuten im Ultraschallbad homogenisiert. Die erhaltene Suspension wird in 280 ml 1.1.1-Trichlorethan, in dem 0,5 Vol% Tween 80 und 0,8 Vol% Prisorine gelöst sind, eingetragen. Der Ansatz wird unter Rühren (1800 U/min) einige Sekunden dispergiert; es werden anschließend 10 ml 1 %ige Ammoniak-Lösung zugefügt; die Dispersion wird noch 10 Sek. weitergerührt. Nach 5 Minuten werden die Magnetpartikel mittels Handmagnet aus der Dispersion abgetrennt und je dreimal mit ca. 50 ml Ethanol und Wasser nachgewaschen. Man erhält Magnetpartikel mit einer Teilchengröße von 15 - 40 μm. Zur Kopplung von Aminogruppen-haltigen Bioiiganden werden die gewonnenen Teilchen mit 4 ml 3-Aminopropyltriethoxysilan 2 Stunden bei Raumtemperatur umgesetzt. Nach intensivem Waschen mit Wasser und 0,05 M Phosphat-Puffer, pH 8.2, werden die Teilchen mit 5 ml 6%iger Glutaraldehydlösung über eine Zeitraum von 1 ,5 Stunden bei 350C aktiviert.
Beispiel 3
Herstellung von farblosen, magnetischen Polyacrylsäurepartikeln
Ein Magnetkolloid wird analog der Vorschrift von Kondo et al., Appl. Microbiol.
Biotechn., Vol. 41 , 1994, 99-105, hergestellt. 3 ml des wässrigen Kolloids werden mit
2 ml wässriger Polyacrylsäurelösung (20Gew-%, Molmasse 5 kDa) versetzt und zweimal für 30 Minuten im Ultraschallbad homogenisiert. Das Kolloid wird sodann mit
3 ml einer 60%igen wässrigen Zinksulfid-Bariumsulfat-Emulsion vermischt und anschließend in eine Mischung, bestehend aus 10 ml Acrylsäure, 2 ml Acrylamid (30%ige wässrige Lösung) und 1 ml N,N'-Methylenbisacrylamid (30%ige wässrige Lösung), eingetragen. Die Polymer-Kolloidphase wird mit 3 M NaOH auf neutralen pH Wert eingestellt und anschließend unter Stickstoffatmosphäre und Eiskühlung 10 Minuten im Ultraschallbad homogenisiert. Nach Zugabe von 1 ml Ammoniumpersulfat (35%ige wässrige Lösung) wird die Mischung in 180 ml Pflanzenöl (Viskosität 105 cP), in dem 1 Vol% Tween 20, 0,5 Vol% Eumulgin RO40 gelöst sind, unter Rühren (1200 U/Min) und Stickstoffeinleitung 30 Sekunden dispergiert. Nach Zugabe von 0,5 ml N,N,N',N'-Tetramethyl-ethylendiamin wird über einen Zeitraum von 5 Minuten unter weiterer Stickstoffzuführung weitergerührt. Man läßt die Dispersion für weitere 30 Minuten ohne Rühren abreagieren. Die Ölphase wird sodann nach Absetzen der Polymerpartikel abdekantiert und mehrfach abwechselnd mit Petrolether, Aceton, Ethanol und aqua dest unter jeweiliger Zuhilfenahme des magnetischen Abtrennschrittes, gemäß Beispiel 1 , gewaschen. Es fallen Polymerpartikel mit einer mittleren Teilchengröße von 5,2 μm an (Laserstreuung, AccuSizer 780, Particle Sizing Systems, Inc., USA). 2 ml der gewonnen Teilchen werden sodann mehrfach mit 0,01 N HCl gewaschen. Dem schließt sich eine 30minütige Aktivierung in einem ml 0,1 M 2-Morpholino- ethansulfonsäure-Puffer (MES), pH 4.5, in dem mit 0,2 mM N-(3- DimethyIaminopropyl)-N'-ethyl-carbodiimid-hydrochlorid und 0,4 mM N- Hydroxysuccinimid zuvor gelöst wurden, an. Das aktivierte Produkt wird fünfmal mit eiskaltem 0,1 M Phosphat-Puffer, pH 7.2, unter Anwendung eines jeweiligen magnetischen Abtrennschrittes gewaschen. Es folgt die Inkubation mit einer Lösung, bestehend aus 1 ml 0,1 M MES-Puffer, pH 5.5, in dem 1 ,25 x 10-4 mM anti-gp120- IgG gelöst sind, über einen Zeitraum von 12 Stunden bei 4°C. Nach erfolgter Kopplung wird mehrfach mit 0,1 M Phosphat-Puffer/O, 15 M NaCl/0,1 % Tween 20, pH 7.2, nachgewaschen. Dem schließt sich eine dreistündige Deaktivierung in 2 ml 0,2 M Ethanolamin-Lösung, pH 8.0, an.
Beispiel 4
Herstellung von farblosen, magnetischen Polyvinylpartikel
20 ml 10%ige wässrige Polyvinylalkohol-Lösung (MW: 48 kDa) werden mit 12 ml Magnetkolloid, das gemäß Beispiel 1 hergestellt wurde, und 1,5 ml 1,5 M HCl vermischt. Der Mischung werden 6 ml einer 60%igen wäßrigen Lithopone-Emulsion zugesetzt, die anschließend 10 Minuten im Ultraschallbad homogenisiert wird. Die Mischung wird in 250 ml XyIoI, in dem 1.2 Vol% Span 83, 0,1 Vol% Tween 85 und 0,6 Gew-% Dehymuls HRE gelöst sind, unter Zuhilfenahme eines Dispergierwerkzeuges (T25 Ultra-Turrax; 12.000 U/Min.) unter Stickstoffeinleitung 30 Sekunden dispergiert. Danach lässt man das Produkt für weitere 30 Minuten ohne mechanisches Rühren abreagieren. Es folgen diverse Waschschritte analog Beispiel 1. Es werden Partikel mit einer mittleren Partikelgröße von 805 nm gebildet (Laserstreuung). Die Polymerpartikel werden in 10 ml 1 ,5 M NaOH und 15 ml Epichlorhydrin versetzt und 2 Stunden bei 55°C unter intensivem Rühren umgesetzt. Es folgt intensives Waschen mit Aceton, Methanol und aqua dest. unter jeweiliger Anwendung eines magnetischen Abtrennschrittes analog Beispiel 1. Die Oxirangruppen-enthaltenden Partikel werden sodann mit 10 ml Aminocapronsäure (5%ige Lösung in 0.1 M Borat-Puffer, pH 11.0) 24 Stunden bei Raumtemperatur umgesetzt. Es wird intensiv mit Wasser nachgewaschen. Zwei ml des so gewonnenen Produktes werden anschließend analog Beispiel 3 mit N-(3- Dimethylaminopropyl)-N'-ethyl-carbodiimid-hydrochlorid und N-Hydroxysuccinimid aktiviert. Danach werden die Teilchen mit 1 ,5 mg Streptavidin, die in 1 ,5 ml 0,1 M MES-Puffer, pH 5.5, gelöst sind, über einen Zeitraum von 6 Stunden bei Raumtemperatur zur Reaktion gebracht. Nach 3stündiger Deaktivierung mit einer 20 mMol Mercaptoethanol enthaltenden 0.1 M Tris-HCI Pufferlösung, pH 8.5, werden die Teilchen mehrmals mit 0,1 M Phosphat-Puffer, pH 7.2, gewaschen.
Beispiel 5
Herstellung von farblosen, magnetischen Dextranpartikeln
50 ml einer 15%igen wässrigen Dextran-Lösung (MW: 40 kDa) werden mit 20 ml des käuflichen Ferrofluids EMG 705 (Fa. FerroTec, USA) versetzt. Dem schließ sich die Zugabe von 1 ,6 g fein kristallinem Titandioxid an. Die Mischung wird anschließend
10 Minuten im Ultraschallbad homogenisiert. Nach Einstellen der Suspension auf pH
11 durch Zugabe verdünnter Natronlauge, werden 4 ml Divinylsulfon zugegeben. Die Mischung wird in 650 ml Pflanzöl (Viskosität 85 cP), das 2,8 Vol% Span 80 enthält, eingetragen und 30 Minuten gerührt (KPG-Zweiblattrührer, 1200 U/Minuten). Nach dem Dispersionsvorgang lässt man die Suspension noch weitere 2 Stunden ohne mechanisches Rühren abreagieren. Danach erfolgen die üblichen Waschschritte mit Petrolether, Methanol und aqua dest. Es fallen Partikel mit einer mittleren Teilchengröße von 3,6 μm an (Laserstreuung). Die gewonnenen Partikel werden sodann im Exsikkator über Phosphorpentoxid bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. 0,8 g des getrockneten Produktes werden mit über Molekularsieb getrocknetem Dimethylsulfoxid (DMSO) gewaschen und im folgenden mit je 1 ml Dimethylsulfoxid, in dem 6 mMol 4-Dimethylamino-pyridin und 5 mMol 2-Fluor-methyl-pyridinium-toluol- sulfonat gelöst sind, 45 Min. bei Raumtemperatur aktiviert. Es wird mehrfach abwechselnd mit Aceton und Dimethylsulfoxid sowie dreimal mit je 3 ml 0.05 M K- Phosphat-Puffer/0,15% NaCI, pH 7.5, gewaschen. Anschließend werden 1 ,5 ml 0.05 M K-Phosphat-Puffer/0,15 %NaCl, pH 7.5, der 5x10"4 mM gegen das Staphylokokken Enterotoxin B gerichtete Antikörper gelöst enthält, über eine Zeitraum von 6 Stunden inkubiert. Es folgt mehrfaches Waschen mit PBS-Puffer/0.5% NaCI/0.1%Tween 20, pH 7.2. Dem schließt sich ein dreistündiger Deaktivierungsprozess mit 4 ml 0,1 M Tris-Puffer/1 % Ethanolamin, pH 8.5, an. Die erfindungsgemäßen Magnetpartikel können in Verbindung mit Enterotoxin B spezifischen fluoreszierenden oder gefärbten Markersonden oder markierten Antikörpern nach den bekannten Verfahren zum Nachweis des Toxins im Rahmen der Diagnostik oder Analytik verwendet werden.

Claims

Patentansprüche
1. Farbloses, magnetisches Polymerpartikel umfassend mindestens ein Polymer, mindestens ein Magnetkolloid, mindestens einen Vernetzer und mindestens ein Weißpigment.
2. Farbloses, magnetisches Polymerpartikel nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Polymer zu 1 Gew.-% bis 20 Gew.-% im Polymerpartikel und wobei das Magnetkolloid zu 10 Gew.-% bis 60 Gew.-% im Polymerpartikel und wobei der Vernetzer zu 0,1 Gew.-% bis 5 Gew.-% im Polymerpartikel und wobei das Weißpigment zu 5 Gew.-% bis 40 Gew.-% im Polymerpartikel enthalten sind.
3. Farbloses, magnetisches Polymerpartikel nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das mindestens eine Polymer ausgewählt wird aus der Gruppe umfassend oder bestehend aus Polyvinylalkohol, Silicagel, Gelatine, Polysaccharide, Proteine, Chitosan, Agarose, Dextran, Polyaminosäuren, Polyacrylate sowie Copolymere derselben und Mischungen der vorgenannten Polymere.
4. Farbloses, magnetisches Polymerpartikel nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das mindestens eine Polymer durch Polymerisation folgender Monomere gewonnen wurde: Acrylsäure, Methacrylsäure, 2- Hydroxyethyl-methacrylat, 2-Hydroxyethylacrylat, Itakonsäure oder Acrolein N-Vinylpyrrolidon, Acrylamid, Methacrylamid oder Mischungen derselben.
5. Farbloses, magnetisches Polymerpartikel nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das mindestens eine Magnetkolloid ausgewählt wird aus der Gruppe umfassend oder bestehend aus Magnetit, Maghemit, Übergangsmetalloxiden, Ferriten und/oder sonstigen nanopartikulären ferro-, ferri- oder superparamagnetischen Verbindungen.
6. Farbloses, magnetisches Polymerpartikel nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das mindestens eine Weißpigment einen Brechungsindex > 1 ,5 besitzt.
7. Farbloses, magnetisches Polymerpartikel nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Oberfläche der Polymerpartikei mit Bioliganden koppelnde, reaktive Gruppen aufweist.
8. Farbloses, magnetisches Polymerpartikel nach Anspruch 7, wobei die mit Bioliganden koppelnden, reaktiven Gruppen an Proteinen, Peptiden, Oligopeptiden, Polypeptiden, Antikörpern, Antikörper-Fragmenten, Antigenen, Streptavidin, Avidin, Biotin, Oligonukleotiden, Polynukleotiden, Oligosacchariden, Polysacchariden oder Enzymen koppeln.
9. Verfahren zur Herstellung farbloser, magnetischer Polymerpartikel umfassend die Schritte: a) Bereitstellung des mindestens einen Polymers und/oder zu polymerisierenden Monomeren und des mindestens einen Magnetkolloids und des mindestens einen Weißpigments, b) Lösen, des mindestens einen Polymers in Wasser, c) Zugabe des mindestens einen Magnetkolloids und des mindestens einen Weißpigments, d) Dispergieren der Magnetkolloid-Weißpigment-Polymer-Mischung in einer mit Wasser nicht mischbaren organischen Phase unter Durchmischung und e) Vernetzung von Magnetkolloid und Weißpigment und Polymer durch Zugabe eines Vernetzers zur Herstellung von festen Polymerpartikeln.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die zu polymerisierenden Monomeren mittels Polymerisation während des Dispergiervorgangs zu Polymeren umgesetzt werden.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 oder 10, wobei als organische Phase organische Lösungsmittel mit einem Verteilungskoeffizienten zwischen 1 ,5 und 6 verwendet werden.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 - 11 , wobei als organische Phase Pflanzenöle mit einer Viskosität bei Raumtemperatur zwischen 30 cP und 200 cP verwendet werden.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 - 12, wobei als organische Phase Mineralöle oder Silikonöle mit einer Viskosität bei Raumtemperatur zwischen 500 cP und 10.000 cP verwendet werden.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 - 13, wobei die Dispersion mit einem Dispergierwerkzeug und einer Rührgeschwindigkeit von 5000 bis 36.000 Umdrehungen pro Minute gerührt wird.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 - 14, wobei die Magnetkolloide derart zugemischt werden, dass das Volumenverhältnis von Polymerlösung zu Magnetkolloid zwischen 2:1 und 4:1 und der Gewichtsanteil des Magnetkolloids in den festen Polymerpartikeln zwischen 10 und 60 Gew-% beträgt.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 - 15, wobei der organischen Phase Stabilisatoren zugesetzt werden.
17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Stabilisatoren ausgewählt werden aus der Gruppe umfassend oder bestehend aus Fettalkyltetraglykolether- Phosphorsäureester, Polyethylenglykol-octadecylether, Polyoxypropylen- Ethylendiamin-Blockcopolymere, Polyoxyethylen-Polyoxypropylen- Ethylendiamin-Blockcopolymere, Polyglycerin-Monocarbonsäureester, Blockcopolymere aus Rizinusöl-Derivaten, Komplexmischester aus Pentaerythrit-Fettsäureester mit Zitronensäure, modifizierte Polyester, Polyethylenglykol-Castoröl-Derivate, Polyethylenglykol-Etherderivate, Polyoxyethylen-Sorbitan-Fettsäureester, Polyglycerinfettsäureester, Alkylphenylpolyethylenglykol-Derivate, Propylenoxid-Ethylenoxid- Blockcopolymere, Polyoxyethylen-Alkohol-Derivate, Sorbitan-Fettsäureester, Polyethylenglykole, Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Copolymere, Polyhydroxyfettsäure-Polyethylenglykol-Blockcopolymere oder Mischungen derselben.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 oder 17, wobei der Anteil der Stabilisatoren in der organischen Phase zwischen 0,05 und 30 Gew-% beträgt.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 - 18, wobei an der Oberfläche der Polymerpartikel mit Bioliganden koppelnde, reaktive Gruppen erzeugt werden.
20. Farblose, magnetische Polymerpartikel erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 9 - 19.
21. Verwendung der farblosen, magnetischen Polymerpartikel gemäß eines der Ansprüche 1 - 8 oder 20 für die Analytik und Diagnostik.
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