COMPOSITION COSMETIQUE A BASE D'ESTER D'OPC DE PIN
L'invention concerne une composition cosmétique pour réparer et éventuellement prévenir les effets du vieillissement de la peau à base d'un extrait d'écorce de pin maritime dont les oligomères procyanidoliques (OPC) sont estérifiés avec un acide gras. Ces compositions sont utiles notamment pour augmenter la synthèse de collagène, pour apaiser la peau, ou encore protéger la peau des radicaux libres.
Les Oligomères ProCyanidoliques (OPC), également appelés proantho- cyanidines ou oligomères proanthocyanidiques, sont des molécules naturelles très répandues dans la nature. En effet, on les trouve dans les légumes, les fruits, les céréales mais également dans les pépins de raisin et l'écorce de pin. L'intérêt nutritionnel et physiologique de ces molécules est lié à leurs propriétés antioxydantes et à leur bénéfice sur le système cardiovasculaire.
Les OPC appartiennent à la famille chimique des polyphénols et plus particulièrement à la classe des flavonoïdes, composés reconnus pour leurs propriétés antioxydantes. Les OPC sont constitués par une ou plusieurs unités monomères répétées de flavan-3-ol, ces unités étant indépendamment choisies parmi la catéchine, ou l'épicatéchine ou épicatéchine gallate. Ces unités sont généralement répétées de 2 à 4 fois, les OPC les plus courants étant généralement sous forme dimère.
Structure biochimique d'un OPC
(trimère de catéchine)
Toutefois, les fonctions phénoliques des OPC rendent ces composés particulièrement sensibles aux différents facteurs de dégradation tels que la lumière,
l'air et les pH acide ou basique. Cette instabilité constitue, dans la majorité des cas, un frein à l'exploitation de leurs effets bénéfiques. Pour stabiliser ces composés, il a notamment été proposé d'estérifier les extraits oligomères polyphénoliques par des dérivés d'acides gras à longues chaînes hydrocarbonées (FR 2 723 943). Les inventeurs ont maintenant mis en évidence qu'un extrait d'écorce de pin dont les oligomères procyanidoliques (OPC) sont estérifiés avec un acide gras, présentait des propriétés cosmétiques particulièrement intéressantes. Il a ainsi été mis en évidence que les esters d'OPC extraits d'écorce de pin permettaient d'augmenter la synthèse de collagène par les fibroblastes de derme humain, et donc de réparer les effets du vieillissement cutané. Il a également été mis en évidence que ces esters d'OPC présentaient en outre des propriétés antiinflammatoires et anti-radicalaires, les rendant ainsi particulièrement utiles pour apaiser la peau et prévenir les effets du vieillissement cutané.
La présente invention a ainsi pour objet une composition cosmétique pour réparer les effets du vieillissement cutané comprenant : a) les oligomères procyanidoliques (OPC) extraits d'écorces de pin, lesdits oligomères étant estérifiés avec au moins un acide gras ; et b) un véhicule cosmétiquement acceptable.
Selon un mode de réalisation préféré, les compositions cosmétiques selon l'invention comprennent : a) un extrait d'écorce de pin dont les oligomères procyanidoliques (OPC) sont estérifiés avec au moins un acide gras, et b) un véhicule cosmétiquement acceptable.
Par « véhicule cosmétiquement acceptable », on entend un véhicule adapté pour une utilisation en contact avec des cellules humaines et animales, en particulier les cellules de l'épiderme, sans toxicité, irritation, réponse allergique indue et similaire, et proportionnée à un rapport avantage/risque raisonnable.
Les extraits d'écorce de pin, notamment maritime, contiennent une grande variété d'oligomères procyanidoliques, dont notamment des monomères de catéchine, et de taxifoliol ainsi que des oligomères procyanidoliques de 2 à 5 unités flavan-3-ol, les monomères et les dimères étant présents de façon majoritaire.
La composition des extraits d'écorce de pin se différencie de façon qualitative et/ou quantitative de celle des autres extraits d'origine végétale, en particulier des extraits de pépin de raisin, que l'on trouve notamment dans le commerce sous la dénomination VITAFLAVAN®. Plus précisément, les oligomères procyanolidiques extraits d'écorce de pin comprennent notamment du taxifoliol, du taxifoliol glucoside,
du férulate glucoside et différents acides phénoliques, qui ne sont pas présents dans les extraits de pépin de raisin. A la différence de ceux-ci, ils ne comprennent pas en revanche, d'épicatéchine ou d'épicatéchine gallate. Les OPC représentent généralement environ 70% en poids du poids total de l'extrait d'écorce de pin. Les extraits d'écorce de pin maritime sont disponibles commercialement
(OLIGOPIN®, DRT). Ils peuvent être également obtenus par un procédé d'extraction classique tel que celui décrit dans le brevet FR 998 508.
L'extrait d'écorce de pin peut être notamment un extrait de pin maritime français (Pinus pinasteή, tel que le pin des Landes. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, les oligomères procyanidoliques (OPC) contenus dans les extraits d'écorce de pin maritime sont estérifiés avec un acide gras selon le procédé décrit dans la demande de brevet FR 2 723 943. Plus particulièrement, les OPC sont estérifiés selon le procédé comprenant les étapes de : a) mise en contact de l'extrait d'écorce de pin maritime dans un milieu liquide non solvant pour ledit extrait mais solvant pour les esters à obtenir, de façon à obtenir une suspension ; b) ajout à ladite suspension d'au moins une aminé tertiaire aliphatique à bas poids d'ébullition, en présence d'une quantité catalytique d'au moins une base organique autre que la pyridine, et c) introduction dans ce mélange d'au moins un chlorure d'acide gras, le mélange réactionnel étant agité à une température inférieure à 4O0C puis concentré par évaporation pour obtenir un extrait dont les OPC sont estérifiés.
De préférence, les OPC sont estérifiés par des acides gras saturés, notamment l'acide palmitique et l'acide stéarique, plus préférentiellement l'acide palmitique.
L'application d'une composition cosmétique selon l'invention est effectuée par voie topique.
La composition est destinée plus particulièrement au traitement de la peau et peut se présenter sous forme d'onguent, de crème, d'huile, de lait, de pommade, de poudre, de tampon imbibé, de solution, de gel, de spray, de lotion, de suspension, de savon.
Les compositions selon l'invention peuvent être des compositions cosmétiques sous la forme d'émulsion huile-dans-eau ou eau-dans-huile, ou d'émulsions multiples, de micro-émulsion, de gel hydroalcoolique, de crème, d'huile, de lotion hydroalcoolique.
De manière préférentielle, les compositions cosmétiques selon l'invention peuvent comprendre de 0,1 à 2,5% dudit extrait estérifié exprimé en poids par rapport au poids total de la composition, de préférence de 0,2 à 1 ,0%.
Les compositions cosmétiques selon l'invention sont particulièrement utiles pour augmenter la synthèse de collagène, notamment par les fibroblastes de derme humain. Elles sont en outre avantageusement utiles pour apaiser la peau, et/ou pour protéger la peau des radicaux libres. Ils sont ainsi particulièrement utiles pour prévenir les effets du vieillissement cutané, notamment le photovieillissement.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'une composition cosmétique comprenant : a) les oligomères procyanidoliques (OPC) extraits d'écorce de pin, lesdits oligomères étant estérifiés avec au moins un acide gras ; et b) un véhicule cosmétiquement acceptable, pour réparer les effets du vieillissement cutané. La présente invention concerne également une méthode de traitement cosmétique, comprenant l'application, notamment topique, d'une composition cosmétique telle que définie ci-dessus.
Ainsi, la présente invention concerne une méthode de traitement cosmétique, pour réparer les effets du vieillissement cutané, comprenant l'application d'une composition cosmétique comprenant les oligomères procyanidoliques (OPC) extraits d'écorces de pin, lesdits oligomères étant estérifiés avec au moins un acide gras ; et un véhicule cosmétiquement acceptable.
La présente invention concerne également une méthode de traitement cosmétique, pour réparer les effets du vieillissement cutané, comprenant l'application d'une composition cosmétique comprenant un extrait d'écorce de pin dont les oligomères procyanidoliques (OPC) sont estérifiés avec au moins un acide gras, et un véhicule cosmétiquement acceptable.
Les exemples qui suivent illustrent l'invention sans toutefois la limiter.
EXEMPLES
Exemple 1 Préparation d'un extrait d'écorce de pin maritime contenant des OPC estérifiés
L'extrait d'écorce de pin (Oligopin®) est estérifié avec l'acide palmitique selon le procédé décrit dans la demande de brevet FR 2 723 943.
Dans les exemples qui suivent, les termes « esters d'OPC de pin » se réfèrent à l'extrait d'écorce de pin estérifié selon le présent exemple 1.
Exemple 2
Etude de l'activité cvtotoxique des esters d'OPC de pin sur une monocouche de cellule en culture
1. Objectif de l'étude
Le but de cette étude est d'évaluer, par un test in vitro, la capacité des esters d'OPC de pin préparés selon l'exemple 1 à induire des effets cytotoxiques sur monocouche de fibroblastes humains.
2. Principe de l'étude
L'objectif de l'étude est d'évaluer la capacité des esters d'OPC de pin à induire des effets cytotoxiques sur une culture primaire de fibroblastes humains normaux. Après application du produit sur les cellules pendant 24 heures, la viabilité cellulaire est évaluée par la mesure de l'activité de la succinate déshydrogénase mitochondriale des cellules vivantes. Cette enzyme transforme le MTT (bromure de 3(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium) en cristaux de formazan bleu. Après dissolution de ces cristaux, on réalise une lecture spectro-photométrique. Les absorbances mesurées sont proportionnelles au nombre de cellules vivantes.
3. Système d'essai
Les cellules utilisées sont des fibroblastes de tissu de peau humaine (prépuce enfant caucasien), au passage 1.
4. Déroulement de l'étude
Eléments de référence :
Les contrôles suivants sont inclus à chaque analyse
- Témoin négatif : milieu de culture complet
- Témoin positif : SDS
Définition des séries :
Six dilutions de chaque échantillon, préparées dans du milieu de culture à 0,005 % de tween 60 et 0,05 % d'huile de coton, sont testées à raison de 5 puits de tests par concentration. Les éléments de référence sont testés sur 5 puits.
5. Expression et interprétation des résultats
L'absorbance est mesurée à 540 nm. Les résultats sont exprimés sous forme de pourcentage de mortalité comparé au contrôle négatif :
. ... . Abs contrôle négatif - Abs échantillon . nn
Vc mortalité = x100
Abs contrôle négatif
6. Résultats
Le contrôle positif présente une mortalité supérieure à 30%, ceci valide le test.
7. Conclusion
Dans les conditions expérimentales retenues, les esters d'OPC de pin selon l'exemple 1 ne présentent pas d'effet cytotoxique significatif. Pour toutes études d'efficacité, la concentration maximale utilisée devra être 1000 μg/ml.
Exemple 3 Etude de screeninq du potentiel anti-inflammatoire et anti-radicalaire
1. Principe de l'étude
On reconstruit in vitro un épiderme humain dans des inserts de culture. On dépose sur le « stratum corneum » un disque de papier filtre sur lequel a été déposée la substance à l'essai (traitement préventif). 24 heures après, on irradie par les UVB puis on applique de nouveau la substance à l'essai (traitement curatif). 24 heures après, on réalise :
- une étude de la cytotoxicité (MTT),
- un dosage de NL-I a, médiateur pro-inflammatoire dans le milieu de culture, - un dosage de MDA (malonaldéhyde) (produit terminal formé lors du processus de peroxydation lipidique induit par la formation d'espèces radicalaires, ou d'espèces activées par l'oxygène).
2. Identification de la substance à l'essai OPC estérifié selon l'exemple 1 en solution à 1 % (p/p) dans le solvant E (50
% isopropanol - 50 % isopropyl myristate en p/p)
3. Protocole
3.1 . Préparation du système réactif : feuillets épidermiques humains reconstruits :
- Culture de kératinocytes humains au 3e passage exempts de mycoplasmes
- Les kératinocytes sont ensemencés à la densité de 10O x 103 cellules/cm2 dans des inserts dont le fond est constitué d'une membrane en polycarbonate (porosité 0,4 μm - 1 cm2).
- Les cellules sont incubées à 370C en atmosphère humide contenant 5 % (v/v) de CO2 pendant 24 heures, en "situation immergée" dans le milieu de culture : MCDB/153 supplémenté par l'EGF (5 ng/mL), l'insuline (5 μg/mL), l'hydrocortisone (0,5 μg/mL), le BPE (70 μg/mL). - Le milieu de culture est remplacé par le même milieu de culture supplémenté par 1 mM de Ca++ afin d'induire la stratification de la monocouche en "situation immergée" pendant 6 jours. Le milieu de culture est changé tous les trois jours.
- Le feuillet épidermique est mis en "situation émergée" au 6e jour, c'est-à-dire qu'il n'est plus nourri que par l'intermédiaire des cellules basales, le stratum corneum étant exposé à l'air. Le milieu de culture est changé tous les trois jours.
3.2. Préparation de la substance à l'essai :
Au 14e jour d'incubation, le milieu de culture est changé et remplacé par le même milieu de culture supplémenté par des antibiotiques à 1 % (10 000 U Penicillin - 10 000 μg/mL Streptomycin - 25 μg/mL Amphotericin) 20 μL de la substance à l'essai (3 concentrations non-cytotoxiques), ou 20 μL des témoins négatifs (milieu de culture) ou des témoins solvants sont appliqués, en conditions stériles, sur un disque de papier filtre (Whatman n °3MMChr) couvrant la surface de l'épiderme reconstruit, le côté sur lequel ont été déposés la substance à l'essai, et les témoins, au contact du « stratum corneum ».
3.3. Définition des séries :
Les séries suivantes sont mises en oeuvre en triplicate :
- 3 séries substance à l'essai (5, 50 et 500 μg/mL) constituées de 3 épidermes chacune (à irradier),
- 1 série témoin négatif absolu (non irradiée),
- 1 série témoin négatif absolu (à irradier),
- 1 série témoin solvant (non irradiée),
- 1 série témoin solvant (à irradier), - 1 série témoin positif 1 (Vit E : 200 μg/mL) (à irradier),
- 1 série témoin positif 2 (Indométhacine : 10 μg/mL) (à irradier),
Les huit premières séries sont mises à incuber pendant 24 heures à 370C en atmosphère humide contenant 5% (v/v) de CO2 (traitement préventif pour les séries traitées).
La neuvième série, correspondant au témoin positif 2 (Indométhacine), est constituée en déposant 20 μl_ d'une solution d'indométhacine à 10 μg/mL sur un disque de papier filtre (Whatmann n ° 3 MMChr) déposé au contact de l'épiderme reconstruit et incubé pendant 3 heures à 37°C, 21 h après la mise en oeuvre des séries précédentes.
Ensuite, les disques de papier filtre sont soigneusement retirés et toutes les séries sont irradiées par les UVB (0,6 J/cm2) (Spectroline modèle X-15N/F, λ = 312 nm) exceptée la série correspondant au témoin négatif absolu et au témoin solvant.
Le traitement curatif est ensuite mis en oeuvre comme décrit plus haut pour le traitement préventif sur une période de 24 heures, sauf pour la série témoin positif 2
(Indométhacine).
3.4. Estimation de la population cellulaire (Test au MTT*) : Le test au MTT est réalisé selon les conditions décrites dans les publications Hausen M. B, Nielsen S. E. et Berg K. Re-examination and further development of a précise and rapid dyemethod for measuring cell growth/cell kill. J. Immunol. Methods. 1989, 1 19, 203 ; et Mosmann T., Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival : Application to prolifération and cytotoxic assays, J. Immunol. Methods. 1983, 65, 55-63. A la fin du temps d'incubation choisi, le disque de papier Whatman est soigneusement prélevé, le « stratum corneum » rincé, et la membrane poreuse portant le feuillet épidermique est détachée de l'insert à l'aide d'un bistouri. Les milieux de culture sont utilisés pour le dosage de I1IL- 1 α et du MDA.
Le feuillet épidermique est : - rincé avec du PBS (2 fois),
- incubé pendant 3 heures, à 370C, à l'obscurité, en présence de 2 mL de MTT (bromure de 3-{4,5-dimethylthiazol-2-yl}- 2,5 - diphenyl tetrazolium) à 0,5 mg/mL de milieu de culture,
- rincé avec du PBS (2 fois). Les cristaux violets de formozan produits par le clivage du MTT par les enzymes mitochondriaux sont dissous dans 2 mL de DMSO sous agitation douce pendant une heure à température ambiante.
Pour chaque feuillet, on pipette 200 μL de la solution obtenue dans une plaque de 96 puits pour réaliser la spectrométrie avec un lecteur de plaques (FL600 - BIO-TEK) à λ = 540 nm.
3.5. Dosage de Tl L- 1 α :
Le dosage de l'I L- 1 α est réalisé dans les milieux de culture prélevés (n = 3) dilués au 1/10e et au 1/20ème conformément au protocole décrit dans le kit de dosage.
3.6. Dosage du MDA :
Préparation de la gamme étalon de MDA :
- solution mère à 10 μM de malonaldéhyde bi[diméthylacetal] dans l'acide sulfurique à 1 % (v/v) (2 heures à température ambiante),
- des dilutions sont réalisées entre 0,1 et 10 μM (0,1 - 1 - 2,5 - 5 et 10 μM). 500 μL de milieu de culture (ou 500 μL de gamme étalon) sont mélangés énergiquement au Vortex à 1 mL d'une solution « TCA, TBA, HCI » (TCA (acide trichloroacétique) à 0,15 % (p/v), de TBA (acide 2-thiobarbiturique) à 0,375 % (p/v), d'HCI 0,25 M (chauffée 15 minutes à 100° C pour dissoudre le TBA, puis laissée refroidir).
Le mélange est mis à incuber 15 minutes à 100° C et la DO mesurée à λ = 535 nm contre un blanc constitué de la solution « TCA, TBA, HCI ».
4. Résultats
1«
Tableau 1
*UA : unités arbitraires
Tableau 2
UA unîtes arbitraires
4.1. Cytotoxicité
• Le témoin négatif absolu irradié : on observe une diminution de 37 % (P < 0,05) de la DO (UA MTT) par rapport au témoin négatif absolu, ce qui correspond à l'effet cytotoxique généralement obtenu pour la dose d'irradiation utilisée (0,6 J/cm2) et valide l'irradiation.
• Le témoin négatif absolu irradié, traité par l'indométhacine 3 heures avant l'irradiation : il n'y a pas d'effet protecteur de l'indométhacine en ce qui concerne la cytotoxicité.
• Le témoin négatif irradié, traité par la Vitamine E 24 heures avant l'irradiation : on observe un effet protecteur de la Vitamine E puisque l'effet cytotoxique n'est
plus que de 13% (NS), soit environ le tiers de celui observé en l'absence de Vitamine E.
• Le témoin solvant : il n'a pas modifié significativement la prolifération cellulaire. • Le témoin solvant irradié : il n'est pas significativement différent du témoin négatif absolu irradié.
• La substance à l'essai : on observe un effet protecteur. Pour 500 μg/mL, l'effet cytotoxique est de 17 % (NS).
4.2. Etude du dosage de I1IL- 1 α (Tableau 1 ) :
• Témoin négatif absolu irradié : Le taux d'IL-1 α dans le milieu de culture est très important : + 290 % (P < 0,02) par rapport au témoin négatif absolu. Ce résultat valide le système réactif qui apparaît particulièrement réactif.
• Témoin négatif absolu irradié traité par l'indométhacine 3 heures avant l'irradiation : l'indométhacine utilisée en préventif inhibe partiellement (- 20 %) la synthèse et la sécrétion d'IL-1 α dans le milieu de culture. Bien que n'étant pas statistiquement significatif cet effet correspond aux valeurs habituellement obtenues.
• Témoin solvant : il n'est pas significativement différent du témoin négatif absolu. • Témoin solvant irradié : comme pour le témoin négatif absolu irradié le taux d'IL-1 α est fortement augmenté. Cette augmentation n'est pas significativement différente de celle observée pour le témoin négatif absolu irradié.
• La substance à l'essai (esters d'OPC de pin) : on observe une diminution du taux d'IL-1 α dans le milieu de culture ; cet effet est particulièrement net pour la concentration la plus forte (500 μg/mL) : - 41 % (P < 0,02) par rapport au solvant irradié, ce qui représente le double de l'inhibition induite par l'indométhacine.
4.3. Etude du MDA (Tableau 2) :
• Le témoin négatif absolu irradié : le taux de MDA est augmenté de 175 % (P<0,02) par rapport au témoin négatif absolu non-irradié, ce qui valide le système réactif.
• Le témoin négatif absolu irradié, traité par la Vitamine E avant et après irradiation : l'augmentation du taux de MDA n'est plus que de 58% (P<0,05), ce qui représente le tiers du taux observé pour le témoin négatif absolu irradié non traité. • Le témoin solvant non-irradié : il n'a pas d'effet significatif sur le taux de
MDA, par rapport au témoin négatif absolu.
• Le témoin solvant irradié : il n'a pas d'effet significatif sur le taux de MDA, par rapport au témoin négatif absolu irradié.
• La substance à l'essai (esters d'OPC de pin) : on observe une diminution du taux de MDA dans le milieu de culture pour toutes les concentrations étudiées. Pour 50 μg/mL, on observe une inhibition de 43 % par rapport au témoin solvant irradié par les UVB.
5. Conclusion
Pour les concentrations non-cytotoxiques étudiées, 5, 50 et 500 μg/mL, la substance à l'essai, OPC estérifié selon l'exemple 1 , en solution à 1 % (p/p) dans le solvant E (50 % isopropanol - 50 % isopropyl myristate en p/p) :
- protège l'épiderme irradié de la cytotoxicité induite par les UVB ;
- diminue le taux d'IL-1 α sécrété dans le milieu de culture après irradiation par les UVB : - 42 % par rapport au témoin solvant irradié pour 500 μg/mL ; - diminue le taux de MDA sécrété dans le milieu de culture : 35 % à 45 %.
Ces résultats de « screening » montrent une activité anti-inflammatoire et même antiradicalaire.
Les témoins positifs et négatifs ont validé l'expérimentation.
Exemple 4
Etude de l'effet d'un élément d'essai (esters d'OPC de pin de l'exemple 1) sur la synthèse du collaqène par des fibroblastes humains
1. Objectif de l'étude Le but de cette étude est d'évaluer, par un test in vitro, l'effet des esters d'OPC de pin selon l'exemple 1 sur la synthèse du collagène par une culture de fibroblastes primaires humains.
2. Principe de l'étude
Les fibroblastes sont les principales cellules du derme. Ils sont spécialisés dans la synthèse de deux types de fibres protéiques : les fibres de collagène et les fibres d'élastine constituants de la matrice extra-cellulaire. Le collagène constitue 70 % des protéines du derme et lui confère sa résistance aux tensions et aux tractions. L'objectif de cette étude est d'évaluer l'effet de l'élément d'essai sur la synthèse de collagène après un contact de 24 heures avec une mono-couche de fibroblastes humain normal.
3. Système d'essai Cellules utilisées :
Les cellules utilisées sont des fibroblastes de tissu de peau humaine enfant (garçon, Caucasien), au passage 2. Les fibroblastes sont préparés et mis à jour selon le mode opératoire en vigueur.
Eléments de référence :
Les contrôles suivants sont inclus à chaque analyse : - Control négatif : milieu complet - Control positif : TGFβ 10ng/ml
Définition des séries :
Trois dilutions non cytotoxiques de chaque échantillon, préparées dans du milieu de culture à 0,005 % de tween 60 et 0,05 % d'huile de coton, sont testées à raison de 3 puits par concentration.
Les éléments de référence sont également testés en trois exemplaires.
4. Déroulement de l'étude
Mise en contact des cellules avec le produit à l'étude : Les cellules sont ensemencées à raison de 50 000 cellules /cm2. Après 24 heures de culture (37<€, 5% CO2J, elles sont incubées avec le produit à l'étude et l'élément de référence pendant 24 heures dans un milieu de 1% de SVF. Dosage du collagène :
Le collagène est dosé dans la matrice extra-cellulaire et dans le milieu de culture à l'aide du coffret de dosage Sircol, Biocolor Ltd, Irlande, selon le protocole décrit dans le coffret.
Le dosage est réalisé à l'aide du colorant rouge Sirius (Direct Red 80) qui présente une affinité spécifique pour la structure en triple hélice (GIy-X-Y)n du collagène natif. L'absorbance du complexe colorant-collagène est lue au spectrophotomètre à
540 nm.
Une courbe standard est réalisée entre 0 et 50 μg/ml de collagène de type I.
Mesure de la densité cellulaire : La densité cellulaire est évaluée dans les mêmes conditions que précédemment, par la mesure de l'activité de la succinate déshydrogénase
mitochondriale des cellules vivantes. Cette enzyme transforme le MTT (bromure de 3(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium) en cristaux de formazan bleu. Après dissolution de ces cristaux, on réalise une lecture spectro-photométrique. Les absorbances mesurées sont proportionnelles au nombre de cellules vivantes.
5. Expression et interprétation des résultats
Pour l'évaluation de la densité cellulaire, l'absorbance mesurée est exprimée en unité de MTT (U MTT). Elle est proportionnelle à la quantité de cellules présentes dans chaque puits.
La concentration en collagène est exprimée en μg de collagène/ml/U MTT dans la matrice extra-cellulaire et dans le milieu de culture.
Résultats
Véhicule : milieu de culture à 0,005 % de tween 60 et 0,05 % d'huile de coton
Le TGF β1 à 10 μg/ml stimule de façon significative (38 %) la synthèse totale de collagène. Ce résultat valide le modèle utilisé. La stimulation est particulièrement efficace au niveau de la matrice cellulaire (88 %).
En ce qui concerne l'effet du produit à l'essai, on peut noter une stimulation de la synthèse du collagène total très significative avec un maximum de plus de 175 % pour une concentration de 50 μg/ml du produit.
On peut constater également que le produit présente un effet essentiellement sur la sécrétion du collagène à l'inverse de ce que l'on peut observer pour le contrôle positif (TGF β1 ).
L'effet est maximum pour les concentrations 200 et 50 μg/ml.
A 500 μg/ml, l'effet reste très marqué mais il est moins important. A 5 μg/ml, le produit n'a plus d'effet. Ce type de réponse, en « cloche », est très souvent observé dans ce type d'étude.
6. Conclusion
Dans les conditions expérimentales retenues, les esters d'OPC de pin selon l'exemple 1 présentent un effet important sur la synthèse du collagène.