WO2010133776A2 - Dispositif et procede d'isolement de cibles biologiques ou chimiques - Google Patents

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WO2010133776A2
WO2010133776A2 PCT/FR2010/000374 FR2010000374W WO2010133776A2 WO 2010133776 A2 WO2010133776 A2 WO 2010133776A2 FR 2010000374 W FR2010000374 W FR 2010000374W WO 2010133776 A2 WO2010133776 A2 WO 2010133776A2
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reaction chamber
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capture
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Sylvaine Chabaud
Cyril Delattre
Dorothée JARY
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles

Definitions

  • the present invention relates to the field of detection of biological or chemical targets from liquid sample collection.
  • the object of the present invention is to meet the need for collection and / or concentration of biological or chemical targets and thus be useful in the context of the detection of undesirable elements such as pathogenic microorganisms or chemical pollutants.
  • samples such as river water, cooling tower fluids, sanitary or drinking water networks, etc.
  • the biological or chemical targets may be present in very small quantities in the samples and their detection is not then possible only by the removal of large volumes (greater than 50 ml).
  • Biological or chemical target means microorganisms, ie enveloped or non-enveloped viruses, Gram-positive and negative vegetative bacteria, spore-forming bacteria, protozoa, microscopic fungi and fungi. yeasts, microplankton, pollen, animal cells and plant cells; we also mean chemical molecules (fertilizers, drugs, chemical molecules polluting such as by-products of the chemical industry, phytosanitary products ...) or biochemicals (antigen, protein, hormones or disrupting compound of the endocrine system ...) .
  • US Patent Application 2006/0141450 describes a method for capturing cells, organelles or viruses present in samples of physiological origin using the properties of unspecific paramagnetic adsorption of magnetic beads.
  • the foregoing methods are directed to the processing of samples having a volume of about 1 ml, they are not suitable for processing samples larger than 50 ml.
  • the Pathatrix device of Matrix Microscience proposes the capture of targets such as pathogenic microorganisms in 250 ml samples by a loop circulation of the sample in a tubular circuit in which magnetic functionalized capture beads are immobilized on a plane magnet. The beads being immobilized, this device leads to a low capture efficiency which does not allow in particular to detect targets present at a low concentration.
  • the subject of the invention relates to an automatic device for treating a liquid sample of a volume V greater than or equal to 10 ml, preferably 50 ml and even more preferentially to 500 ml, comprising a reaction chamber, a volume v between 10 .mu.l and 5 ml, in which functionalized magnetic beads are placed allowing the capture of biological or chemical targets in an amount such that the ratio of the area of capture of the beads to the volume of the reaction chamber is between 0.2 and 200 m 2 / l, preferably between 0.2 and 20 m 2 / l and more preferably between 0.2 and 10 m 2 / l, said reaction chamber being equipped with: a system of non-invasive agitation allowing homogeneous dispersion of said beads; - a magnetic field that can be activated (ON position) or inactivated (OFF position); a fluid displacement
  • FIG. 1 is a schematic representation of the device according to the invention comprising a reaction chamber (1) in which functionalized magnetic balls (2), a stirring system for example, an ultrasonic bath (3), a field are placed.
  • magnetic (4) can be activated (ON position) or inactivated (OFF position) and a fluid displacement system (5) for introduction (51) and evacuation (52) of all or part of the contents of the chamber reaction.
  • the reaction chamber has a volume of preferably between 50 and
  • the reaction chamber is coated with a hydrophobic surface so as to avoid the adhesion of the capture beads on its inner walls; this hydrophobic surface is chosen from teflon, ETFE (ethylene trifluoroethylene), PFA (perfluoroalkoxy copolymer resin) and PTFE (polytetrafluoroethylene).
  • teflon ethylene trifluoroethylene
  • PFA perfluoroalkoxy copolymer resin
  • PTFE polytetrafluoroethylene
  • sample for example, from cooling circuit), environmental water (stream 3), or drinking water intended for human or animal consumption, and by extension any sample in which the target (s) biological or chemical detectors are in solution or in suspension.
  • This sample may itself have been obtained from a sample or other sample likely to contain the desired biological or chemical targets, for example a food product, a body fluid, a sample of air, obtained by physical treatment and / or chemical, and / or biological according to any method adaptable by those skilled in the art.
  • the device according to the invention has a capture capacity at very low target concentrations, it is therefore particularly suitable for the treatment of liquid samples that may contain only a very small quantity of biological or chemical targets; in particular, in the case of biological targets, the device according to the invention is thus capable of detecting biological targets present in an amount of less than or equal to 100 units per liter of sample, preferably in an amount less than or equal to 10 units per liter of sample, more preferably in an amount equal to one unit per liter of sample.
  • the liquid samples are preferably taken or prepared under clean conditions with sterile material.
  • the liquid samples are prepared according to techniques known to those skilled in the art (Stachowiak JC et al., Anal Chem., 2007; 79 (15): 5763-70 ).
  • the fluid displacement system for introducing and evacuating all or part of the contents of the reaction chamber makes it possible to introduce a fraction of liquid sample into the reaction chamber. in order to capture the biological or chemical targets and then evacuate this fraction of the liquid sample after the step capture. This system also makes it possible to introduce the functionalized magnetic beads at the beginning and to evacuate them at the end of the treatment of the liquid sample.
  • this fluid displacement system preferably consists of a pressure regulating system (Fluigent) or a pump (53) such as a piston pump, a diaphragm pump or a peristaltic pump.
  • a pressure regulating system Frluigent
  • a pump such as a piston pump, a diaphragm pump or a peristaltic pump.
  • the stirring system allowing homogeneous dispersion of the beads is non-invasive, that is to say that it does not require the introduction of a stirring accessory into the reaction chamber thus avoiding the risk of contaminating the reaction medium. liquid sample.
  • It may be a stirring system of magnetic beads functionalized by a moving magnetic field implemented by one or more rotating magnets; by setting the balls in motion by causing the contents of the reaction chamber to be returned and returned by means of the fluid displacement system; or by ultrasonic agitation.
  • the stirring system is preferably an ultrasonic stirring (elastic waves whose frequency is between 15 kHz and a few hundred MHz) implemented by ultrasound transmission by water in an ultrasonic bath or directly by a ultrasonic transducer (Borthwick et al (2005) Journal of Microbiological Methods 60, 207-216, Belgrader et al (1999) Analitical Chemistry 71 (19), 4232-4236).
  • the ultrasonic bath has a power of between 5 and 100 W / l, preferably 40 W / l and an effective power of between 50 and 400 W.
  • An ultrasonic bath that can be used for the device according to the invention is the ultrasonic washer S -line from Fisher Scientific.
  • the device according to the invention may optionally comprise an ultrasonic stirring system and another non-invasive stirring system of the functionalized magnetic beads.
  • the magnetic field is produced by a permanent magnet or an electromagnet.
  • a magnet of dimensions L ⁇ l ⁇ p 20 ⁇ 13 ⁇ 10 mm and having as characteristics a neodymium iron boron (NdFeB) magnetization grade N38 and a nickel / copper / nickel coating.
  • NdFeB neodymium iron boron
  • the characteristics of the electromagnets are for example the following: 12Vdc traction electromagnets 10 W and 1.8 mm stroke.
  • 12Vdc traction electromagnets 10 W and 1.8 mm stroke When a permanent magnet is used, it must be able to be positioned both near the reaction chamber to attract the functionalized magnetic beads (ON position) and at a distance from the reaction chamber sufficient for it no longer exerts attraction force on the balls (OFF position); the passage between these two positions can be obtained by different means of displacement of the permanent magnet.
  • an electromagnet When an electromagnet is used, it is positioned against or near the reaction chamber and is either in operating mode (ON) in order to attract the functionalized magnetic beads, or inactive (OFF), it then exerts attractive force on the functionalized magnetic beads.
  • the effectiveness of the magnetic attraction of the magnetic beads functionalized by the magnet or electromagnet can be improved by adding to the reaction chamber a metal foam as described in US Pat. No. 6,159,378, preferably nickel metal foams.
  • the magnetic beads are microspheres having a diameter ranging from nanometers to a few micrometers; preferably, the functionalized magnetic beads used in the device according to the invention have a diameter of between 0.5 and 10 ⁇ m, and more preferably of 1 ⁇ m in diameter. Care should be taken to select beads of a size greater than or equal to that of the biological or chemical target (s).
  • the magnetic nature of the beads allows to control them in a container using a magnet. Beads do not have a magnetic property in the absence of an external magnetic field, which prevents the formation of aggregates and allows their reuse. Any type of magnetic beads known to those skilled in the art can be used in the device according to the invention; as such, mention may be made of the functionalized magnetic beads marketed by the Dynal or Chemicell companies.
  • the magnetic beads are functionalized, that is to say that their outer surface is covered with molecules having the property of binding more or less specifically with one or more biological or chemical targets; these molecules are called capture material.
  • the surface of the balls covered by the capture material constitutes the capture surface.
  • this capture area is between 1.10 3 and 10 10 -2 m 2 .
  • the electrostatic interactions the targets are captured according to the charges present on their surface.
  • the capture surfaces contain end groups anion exchangers or cations of greater or lesser strength. It may be carboxyl, sulfone, phosphate, di-ethylaminoethyl (DEAE), poly-lysine, polyethyleneimine (PEI) and more generally charged polymers (Deponte et al., Anal Bioanal Chem 2004: 379: 419-426); hydrophobic interactions: the targets are captured according to the difference in hydrophobicity of surfaces.
  • the hydrophobic regions of targets such as proteins, peptides or nucleic acids in an aqueous medium preferentially bind to a hydrophobic capture material such as a hydrocarbon chain from 1 (methyl) to 18 (octadecyl) carbon atoms; covalent bonds: functional end groups grafted onto the beads make it possible to bind the target ligands covalently; it is in particular amino group, hydroxyl, thiol, polyglutaraldehyde ....; the affinity bonds: the beads are covered with ligands allowing highly specific and selective binding such as interactions between an antigen and an antibody, hybridization between two nucleotide fragments, between biotin and streptavidin ...
  • a hydrophobic capture material such as a hydrocarbon chain from 1 (methyl) to 18 (octadecyl) carbon atoms
  • covalent bonds functional end groups grafted onto the beads make it possible to bind the target ligands covalently; it is in particular amino group,
  • the magnetic beads are functionalized with two or more different capture materials for capturing two or more targets.
  • Magnetic beads coated with several different capture materials are used; or several types of magnetic beads, each type of beads being covered with a different capture material.
  • the functionalized magnetic beads are introduced into the reaction chamber in an amount such that the ratio of the capture surface to the volume of the the sample is between 0.2 and 200 m 2 / l, preferably between 0.2 and 20 m 2 / l, more preferably between 0.5 and 10 m 2 / l and most preferably between 1 and 5 m 2 / l, for example 2.8 m 2 / l.
  • the device according to the invention has the advantage of allowing the treatment of liquid samples of large volume, greater than or equal to 10 ml, preferably 50 ml and even more preferably 500 ml, while keeping a small reaction chamber (Maximum of a few milliliters) thus allowing to retain the advantages of a capture of biological or chemical targets in small volume, that is to say: a smaller footprint and low cost of the device due to its small size; - greater ease and speed of recovery of the magnetic beads;
  • This device is also advantageous in that it offers a good capture surface ratio with respect to the volume of the reaction chamber and a wide range of capture materials chosen according to the biological or chemical targets sought; finally, the functionalized magnetic beads can be recovered and reused.
  • the automated processing of high volume liquid samples by the device according to the invention advantageously replaces the usual techniques for treating such samples, such as filtration or ultrafiltration.
  • This device thus makes it possible to take a sample fraction likely to contain biological or chemical targets, to capture said targets and to concentrate in order to process them to confirm or even quantify their presence.
  • this device can be positioned at the sampling location so that it performs regular sampling and analysis.
  • the device according to the invention may be supplemented by a liquid sample collection system consisting of a fluid sampling system (61) such as a pump and a storage tank (62) of the sample. sample upstream of the reaction chamber ( Figure 2).
  • the liquid sample collection system is connected either directly or via one or more intermediate reservoirs to the fluid displacement system for introducing a fraction of the liquid sample into the reaction chamber (51).
  • the present invention also relates to a method for capturing biological or chemical targets likely to be present in a liquid sample of volume V of greater than or equal to 10 ml, preferably 50 ml and more preferably 500 ml, at the same time.
  • the automation of the method according to the invention is programmed and controlled by a suitable computer system.
  • the treatment of the biological or chemical targets captured on the functionalized magnetic beads may be carried out in the reaction chamber of the device according to the invention or in a tank connected to the fluid displacement system allowing the contents of the reaction chamber (52 ).
  • this treatment consists of:
  • the biological or biochemical analysis may for example consist in the cultivation on selective media of the biological targets eluted in the case of microorganisms and their characterization; or else the detection by antibodies of the biological targets ...
  • the eluted biological targets are lysed in order to release their nucleic acids.
  • the methods of lysis are widely known to those skilled in the art, it may be a chemical lysis using a lysis buffer containing detergents such as sodium dodecyl sulphate (SDS), lithium dodecyl sulphate (LiDS), sarcosyl or chaotropic agents such as guanidium hydrochloride (GHCl), guanidium thiocyanate (GTC), sodium iodide (NaI), perchlorate ..., enzymatic lysis with using proteinase K or lysozyme ... or mechanical lysis for example by coupling the effect of beads and ultrasound or by thermal gradient.
  • GHCl guanidium hydrochloride
  • GTC guanidium thiocyanate
  • NaI sodium iodide
  • perchlorate ... enzymatic lysis with using proteinase K or lysozyme ... or mechanical lysis for example by coupling the effect of beads and ultrasound or by thermal gradient.
  • the treatment consists of: elution of the chemical targets using an elution elution buffer that the person skilled in the art according to said target then the analysis of the targets recovered by conventional chemical techniques such as nuclear magnetic resonance, chromatography, UV or IR spectroscopy, electrochemistry ...
  • the detection is carried out by the techniques available to humans of the job he chooses according to the biochemical target, for example, a coupling of the target with a radioactively labeled antigen or by fluorescence etc.
  • the invention also relates to a method for detecting biological or chemical targets comprising the steps a) to f) of the above capture method characterized in that it further comprises the steps of: g) elution said targets; and h) detecting said eluted targets in step g).
  • step h) may consist in the lysis of said targets and in the detection of nucleic acids released during lysis.
  • Figure 1 is a schematic representation of the device according to the invention.
  • Figure 2 is a schematic representation of the device according to the invention further comprising a liquid sample collection system.
  • Figure 3 illustrates the mounting of the device according to the invention used in the following example; said device comprises two identical assemblies in parallel each consisting of a reaction chamber (1), the two reaction chambers are positioned in an ultrasound bath (3) equipped with a magnet (4), they are connected, on the one hand , to a waste container (7) via a pump (53) and, on the other hand, to a reservoir (9) containing the sample, the sample supply of the reaction chambers is via solenoid valves (8).
  • Figures 4 to 7 are histograms representing and comparing the amount of genomic units identified in samples according to the method of the invention (N) or initially present in the samples (NO).
  • Example catching bacteria in a river water sample
  • Fluid circulation is ensured by an Ismatec IPC-N peristaltic pump connected to PFA flexible tubes with an external diameter of 1.6 mm and an internal diameter of 1 mm.
  • These flexible tubes act as a reaction chamber in which the magnetic beads are stored.
  • the balls are controlled by a magnet.
  • the position of the magnet is controlled by the arm of an electromagnet; in its ON position, the magnet is in contact with the hose, in the OFF position, it is moved away from it.
  • the region of the flexible reaction chamber and where the beads are positioned is immersed in an ultrasonic bath whose function is to disperse the aggregates formed by the beads after their capture in the magnetic field.
  • the flexible tube Downstream, the flexible tube is connected to a 6-way valve (Upchurch V-1471-DC) to select the inlet liquid.
  • a 6-way valve Upchurch V-1471-DC
  • This volume v is positioned in the hose at the balls; the magnet is then put in the OFF position; the ultrasounds are lit and allow the beads to disperse in the fraction of volume v. The ultrasounds are then extinguished; the sample is moved in the flexible tube in order to resuspend the beads possibly deposited on the wall by ultrasonic action.
  • the beads are left in contact with the sample for 45 seconds allowing target capture.
  • the magnet is then set to ON, the balls are then captured by the magnetic field and agglomerated against the inner wall of the hose.
  • the sample is pushed by the pump towards a trash at a speed of 300 ⁇ l / min and a new fraction of volume v of the sample is positioned in the reaction chamber where the beads are. This capture cycle is repeated 50 to 100 times.
  • the system comprising several valves, it is possible to select a new input connected to a reservoir containing the elution buffer (or lysis if necessary). By action of the pump, this buffer is positioned at the storage area of the balls.
  • ultrasound is applied to disperse the beads in the buffer.
  • the targets are then eluted from the surface of the beads and optionally lysed.
  • the magnet is then turned ON; the beads aggregate and are retained while the sample of elution buffer and, optionally, lysis comprising the targets is recovered through the pump.
  • Detailed protocol The principle of this capture was implemented on two liquid samples, one of 20 ml of 10 mM pH 8 Tris-HCl buffer and the other of 10 ml of a river water (Rhône) taken on same day, these two samples were doped with targets: cells of Escherichia coli and Bacillus subtilis at about 10 6 genomic units (corresponds to about 10 6 bacteria).
  • the magnetic beads used are super paramagnetic beads coated with a layer of polyethyleneimine (SiMAG-PEI Chemicell) which allows electrostatic type interactions with targets (bacterial cells); indeed, the bacteria are globally negatively charged and the PEI is a strong anion exchanger.
  • the bead area / volume ratio of the sample fraction is 2.8 m 2 / l.
  • the beads are recovered in 100 ⁇ l of 10 mM Tris-HCl. Then the DNA extraction is carried out directly on the beads: the lysis of the cells is carried out at 37 ° C. in a lysis buffer (5M guanidine-HC, 20 mM Tris pH 8, 1% sarcosyl). After 10 minutes of incubation, the mixture is placed for two minutes in an ultrasonic bath at 37 ° C.
  • a lysis buffer 5M guanidine-HC, 20 mM Tris pH 8, 1% sarcosyl.
  • the beads are pooled with a magnet and the supernatant is recovered and placed in 4 times its volume of 3M guanidine HCl solution, 20 mM Tris-HCl, 80% ethanol (v / v) pH 4; the DNA is then captured on 2.5 .mu.l of magnetic beads functionalized with silanol (SiMAG-Silanol, Chemicell). After two rinsing with a solution of 2 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 75% ethanol (v / v), the purified DNA is eluted in 10 .mu.l of 10 mM Tris-HCl, pH 8 after 2 minutes in an ultrasonic bath .
  • the DNA extraction and purification protocol may also be performed automatically with the instrumental device used in the previous capture step.
  • the amount of DNA extracted is determined by quantitative PCR and is expressed in genomic unit. For this, 5 .mu.l of extracted DNA suspension are mixed with 5 .mu.l of the following PCR reagents: 0.3 .mu.M primers, 2.5 .mu.M GoId Taq polymerase, BSA (1.4 mg / ml), buffer IX (delivered with AmpliTaq Gold® DNA Polymerase from Applied Biosystems), MgCl 2 3 M, dNTP 200 ⁇ M, betaine 0.65 mM.
  • the primers used have the following sequence: Esche ⁇ chia coli (16S ribosomal RNA gene) CoIiTQF Forward 5'-CATGCCGCGTGTATGAAGAA coliTQR Reverse 5'-CGGGTAACGTCAATGAGCAAA
  • the number of genomic units initially present in the sample is determined by PCR by mixing 5 .mu.l of the starting liquid sample previously sonicated for 10 minutes with 5 .mu.l of the PCR reagent mixture described above. . Results target detection in Tris-HCl buffer samples
  • results obtained show that the differences observed between the amount of DNA captured by the device according to the invention (N) and the amount of DNA present in the corresponding starting sample (NO) are lower than at 0.41 klo, which means that almost all the cells initially present were captured. target detection in river water samples
  • results obtained show that the differences observed between the quantity of DNA captured by the device according to the invention (N) and the quantity of DNA present in the corresponding starting sample. (NO) are less than 0.21 g / l, which again shows that almost all the cells initially present were captured.

Abstract

La présente invention se rapporte à un dispositif de collecte et de concentration de cibles biologiques ou chimiques en vue de leur détection; le dispositif comprenant une chambre réactionnelle (1) dans laquelle sont placées des billes magnétiques fonctionnalisées (2), un système d'agitation par ultrasons (3), un champ magnétique (4) pouvant être activé (position ON) ou inactivé (position OFF) et un système de déplacement de fluide (5) pour l'introduction (51) et l'évacuation (52) de tout ou partie du contenu de la chambre réactionnelle. La présente invention se rapporte également à un procédé de capture de cibles biologiques ou chimiques mettant en œuvre ledit dispositif.

Description

DISPOSITIF ET PROCEDE D'ISOLEMENT DE CIBLES BIOLOGIQUES OU
CHIMIQUES
La présente invention concerne le domaine de la détection de cibles biologiques ou chimiques à partir de prélèvement d'échantillon liquide.
Plus précisément, le but de la présente invention est de répondre au besoin de collecte et/ou de concentration de cibles biologiques ou chimiques et être ainsi utile dans le cadre de la détection d'éléments indésirables comme des micro-organismes pathogènes ou des polluants chimiques dans des échantillons tels que des eaux de rivières, des fluides de tours aéro-réfrigérantes, de réseaux d'eau sanitaire ou potable etc .. Les cibles biologiques ou chimiques peuvent être présentes en quantité très faible dans les échantillons et leur détection n'est alors possible que par le prélèvement de volumes importants (supérieurs à 50 ml).
Par cible biologique ou chimique, on entend des micro-organismes, c'est- à-dire des virus enveloppés ou non enveloppés, des bactéries végétatives à Gram positif et négatif, des bactéries sous forme sporulée, des protozoaires, des champignons microscopiques et des levures, du microplancton, du pollen, des cellules animales et des cellules végétales ; on entend également des molécules chimiques (engrais, médicaments, molécules chimiques polluantes telles que des sous-produits de l'industrie chimique, produits phytosanitaires...) ou biochimiques (antigène, protéine, hormones ou composé perturbateur du système endocrinien...).
Il est connu d'utiliser des billes magnétiques fonctionnalisées, c'est-à- dire portant à leur surface des molécules capables de se lier à des cibles recherchées, comme système de capture destiné à isoler et/ou détecter des cibles biologiques ou chimiques et divers procédés de capture de cibles par des billes magnétiques ont déjà été décrits ; en effet, l'avantage de l'utilisation des billes magnétiques fonctionnalisées est qu'elles présentent une grande surface de capture, qu'elles peuvent être facilement récupérées à l'aide d'un aimant et éventuellement réutilisées après élution des cibles capturées. En particulier, la Demande de Brevet US 2003/015028 décrit une méthode de capture peu spécifique de micro-organismes à l'aide d'un support solide sur lequel est lié un nutriment, notamment un glucide, desdits micro-organismes ; le support solide est de préférence des billes magnétiques. Le fonctionnement de cette méthode réside dans le choix du nutriment permettant la capture des micro-organismes.
La Demande de Brevet US 2006/0141450 décrit une méthode de capture de cellules, organites ou virus présents dans des échantillons d'origine physiologique utilisant les propriétés d'adsorption paramagnétique peu spécifiques de billes magnétiques.
Les méthodes qui précèdent visent le traitement d'échantillons ayant un volume d'environ 1 ml, elles ne sont pas adaptées au traitement d'échantillons de volume supérieur à 50 ml.
La Demande Internationale WO 2008/131554 décrit un dispositif adapté à la détection de micro-organismes pathogènes à partir d'échantillons alimentaires ; ce dispositif comporte un flacon Erlenmeyer de 500 ml positionné sur un support agitateur équipé d'un champ magnétique. La mise en œuvre de ce dispositif prévoit une étape préalable de culture de l'échantillon dans un milieu de culture sélectif adapté à la croissance des micro-organismes recherchés ; ensuite, ces micro-organismes sont capturés à l'aide de particules magnétiques sur lesquelles sont greffés des anticorps se liant aux micro-organismes recherchés. Cette méthode très spécifique de détection de microorganismes résout le problème de la faible quantité de cibles biologiques dans l'échantillon par l'étape de culture qui permet la multiplication des micro-organismes recherchés et en facilite ainsi la détection. Si elle peut s'adapter au traitement d'échantillons ayant un volume de quelques dizaines de millilitres, sa mise en œuvre reste néanmoins limitée en terme de volume des échantillons car se pose alors le problème de l'obtention d'une bonne dispersion des billes magnétiques de capture au sein de l'échantillon ; enfin un tel dispositif est difficilement automatisable ; il ne permet pas le traitement en série de plusieurs échantillons. Les mêmes limites s'appliquent au dispositif d'agitation et de séparation de billes magnétiques décrit dans la Demande de Brevet US 2005/0013741 ; ce dispositif comporte deux aimants permanents positionnés de part et d'autre d'un récipient contenant des billes magnétiques ; ces aimants sont mobiles verticalement ; en fonction du mouvement qui leur est imprimé, ils peuvent soit agiter les billes afin de les mettre ou de les maintenir en suspension, soit les regrouper pour les séparer de l'échantillon. Ce dispositif vise des récipients d'un volume maximum de quelques dizaines de millilitres. Le problème rencontré lors du traitement de volumes plus importants est la difficulté d'obtenir une bonne dispersion des billes magnétiques et de les récupérer ensuite. Enfin, le dispositif Pathatrix de Matrix Microscience propose la capture de cibles telles que des micro-organismes pathogènes dans des échantillons de 250 ml par une circulation en boucle de l'échantillon dans un circuit tubulaire dans lequel des billes magnétiques fonctionnalisées de capture sont immobilisées sur un aimant plan. Les billes étant immobilisées, ce dispositif conduit à un faible rendement de capture qui ne permet notamment pas de détecter des cibles présentes à une faible concentration.
Ainsi, il ressort de ce qui précède qu'aucun dispositif de l'état de la technique ne permet une détection sensible de cibles présentes en faible quantité dans un échantillon liquide de grand volume par un traitement automatisé. L'objet de l'invention se rapporte à un dispositif automatique de traitement d'échantillon liquide d'un volume V supérieur ou égal à 10 ml, de préférence à 50 ml et encore préférentiellement à 500 ml, comprenant une chambre réactionnelle, d'un volume v compris entre 10 μl et 5 ml, dans laquelle sont placées des billes magnétiques fonctionnalisées permettant la capture de cibles biologiques ou chimiques en quantité telle que le rapport entre la surface de capture des billes sur le volume de la chambre réactionnelle est compris entre 0,2 et 200 m2/l, de préférence entre 0,2 et 20 m2/l et de façon encore préférée entre 0,2 et 10 m2/l, ladite chambre réactionnelle étant équipée : d'un système d'agitation non invasif permettant une dispersion homogène desdites billes ; - d'un champ magnétique pouvant être activé (position ON) ou inactivé (position OFF) ; d'un système de déplacement de fluide pour l'introduction et l'évacuation de tout ou partie du contenu de la chambre réactionnelle.
La Figure 1 est une représentation schématique du dispositif selon l'invention comprenant une chambre réactionnelle (1) dans laquelle sont placées des billes magnétiques fonctionnalisées (2), un système d'agitation par exemple, un bain à ultrasons (3), un champ magnétique (4) pouvant être activé (position ON) ou inactivé (position OFF) et un système de déplacement de fluide (5) pour l'introduction (51) et l'évacuation (52) de tout ou partie du contenu de la chambre réactionnelle. La chambre réactionnelle a un volume de préférence compris entre 50 et
500 μl, et de manière encore préférée 100 μl.
Elle peut se présenter sous la forme d'un réservoir ou bien d'un système tubulaire tel que par exemple un capillaire. De préférence, la chambre réactionnelle est revêtue d'une surface hydrophobe de manière à éviter l'adhérence des billes de capture sur ses parois intérieures ; cette surface hydrophobe est choisie parmi le téflon, l'ETFE (éthylène trifluoroéthylène), le PFA (résine copolymère de perfluoroalkoxy) et le PTFE (polytétrafluoroéthylène). Par « échantillon liquide », on entend un prélèvement d'eau industrielle
(par exemple, provenant de circuit de refroidissement), d'eau environnementale (cours d'eau...), ou encore d'eau potable destinée à la consommation humaine ou animale, et par extension tout échantillon dans lequel la ou les cibles biologiques ou chimiques à détecter sont en solution ou en suspension. Cet échantillon peut lui-même avoir été obtenu à partir d'un prélèvement ou autre échantillon susceptible de contenir les cibles biologiques ou chimiques recherchées, par exemple un produit alimentaire, un fluide corporel, un prélèvement d'air, obtenu par traitement physique et/ou chimique, et/ou biologique selon toute méthode adaptable par l'homme du métier.
Le dispositif selon l'invention présente une capacité de capture à de très faibles concentrations en cibles, il est donc particulièrement adapté au traitement d'échantillons liquides susceptibles de ne contenir qu'une très faible quantité de cibles biologiques ou chimiques ; en particulier, s'agissant de cibles biologiques, le dispositif selon l'invention est ainsi capable de détecter des cibles biologiques présentes en une quantité inférieure ou égale à 100 unités par litre d'échantillon, de préférence, en une quantité inférieure ou égale à 10 unités par litre d'échantillon, de façon encore préférée, en une quantité égale à une unité par litre d'échantillon.
De façon à éviter toute contamination exogène, les échantillons liquides sont préférentiellement prélevés ou préparés dans des conditions de grande propreté avec du matériel stérile. Dans le cas de l'analyse de la qualité microbiologique de l'air, les échantillons liquides sont préparés selon des techniques connues de l'homme du métier (Stachowiak JC et al, Anal Chem. 2007 ;79(15):5763-70).
Il n'existe aucune limite théorique au volume maximum dudit échantillon liquide ; dans la pratique, il ne dépasse généralement pas 10 1. Le système de déplacement de fluide pour l'introduction et l'évacuation de tout ou partie du contenu de la chambre réactionnelle permet d'introduire une fraction d'échantillon liquide dans la chambre réactionnelle en vue de la capture des cibles biologiques ou chimiques puis d'évacuer cette fraction d'échantillon liquide après l'étape de capture. Ce système permet également d'introduire les billes magnétiques fonctionnalisées au début et de les évacuer à la fin du traitement de l'échantillon liquide.
Concrètement, ce système de déplacement de fluide consiste de préférence en un système de régulation de pression (Fluigent) ou une pompe (53) telle qu'une pompe à piston, une pompe à membrane ou une pompe péristaltique.
Le système d'agitation permettant une dispersion homogène des billes est non invasif, c'est-à-dire qu'il ne nécessite pas l'introduction d'un accessoire d'agitation dans la chambre réactionnelle évitant ainsi le risque de contaminer l'échantillon liquide.
Il peut s'agir d'un système d'agitation des billes magnétiques fonctionnalisées par un champ magnétique mobile mis en œuvre par un ou plusieurs aimants en rotation ; par la mise en mouvement des billes en provoquant un aller-retour du contenu de la chambre réactionnelle à l'aide du système de déplacement de fluide ; ou encore par une agitation par ultrasons.
Le système d'agitation est de préférence une agitation par ultrasons (ondes élastiques dont la fréquence est comprise entre 15 kHz et quelques centaines de MHz) mise en œuvre par transmission des ultrasons par de l'eau dans un bain à ultrasons ou directement par un transducteur à ultrasons (Borthwick et al. (2005) Journal of microbiological methods 60, 207-216; Belgrader et al (1999) Analitical chemistry 71 (19), 4232-4236). Le bain à ultrasons a une puissance comprise entre 5 et 100 W/l, de préférence 40 W/l et une puissance effective comprise entre 50 et 400 W. Un bain à ultrason utilisable pour le dispositif selon l'invention est le laveur ultrason S-line de la société Fisher Scientific.
Le dispositif selon l'invention peut optionnellement comprendre un système d'agitation par ultrasons et un autre système d'agitation non invasif des billes magnétiques fonctionnalisées.
Le champ magnétique est produit par un aimant permanent ou un électroaimant.
A titre d'exemple non limitatif, on peut utiliser un aimant de dimensions L x l x p = 20 x l3 x l0 mm et ayant comme caractéristiques un grade néodyme fer bore (NdFeB) magnétisation N38 et un revêtement Nickel/Cuivre/Nickel.
Les caractéristiques des électroaimants sont par exemple les suivantes : électroaimants tirants 12Vcc 10 W et 1,8 mm de course. Lorsqu'un aimant permanent est utilisé, il doit pouvoir être positionné à la fois à proximité de la chambre réactionnelle pour attirer les billes magnétiques fonctionnalisées (position ON) et à une distance de la chambre réactionnelle suffisante pour qu'il n'exerce plus de force d'attraction sur les billes (position OFF) ; le passage entre ces deux positions peut être obtenu par différents moyens de déplacement de l'aimant permanent.
Lorsqu'un électroaimant est utilisé, il est positionné contre ou à proximité de la chambre réactionnelle et est soit en mode de fonctionnement (ON) afin d'attirer les billes magnétiques fonctionnalisées, soit inactif (OFF), il n'exerce alors plus de force d'attraction sur les billes magnétiques fonctionnalisées.
L'efficacité de l'attraction magnétique des billes magnétiques fonctionnalisées par l'aimant ou l' électroaimant peut être améliorée en ajoutant dans la chambre réactionnelle une mousse métallique telle que décrite dans le Brevet US 6,159,378, de préférence, les mousses métalliques de nickel. De façon usuelle, les billes magnétiques sont des microsphères possédant un diamètre allant du nanomètre à quelques micromètres ; de préférence, les billes magnétiques fonctionnalisées utilisées dans le dispositif selon l'invention ont un diamètre compris entre 0,5 et 10 μm, et de façon encore préférée, d' 1 μm de diamètre. On veillera à choisir des billes d'une dimension supérieure ou égale à celle de la ou des cibles biologiques ou chimiques.
Le caractère magnétique des billes permet de les contrôler dans un récipient à l'aide d'un aimant. Les billes ne possèdent pas de propriété magnétique en absence d'un champ magnétique extérieur, ce qui évite la formation d'agrégats et permet leur réutilisation. Tout type de billes magnétiques connu de l'homme du métier peut être utilisé dans le dispositif selon l'invention ; à ce titre, on peut citer les billes magnétiques fonctionnalisées commercialisées par les sociétés Dynal ou Chemicell.
On peut également citer les billes magnétiques fonctionnalisées pour la capture de cibles biologiques décrites dans le brevet US 4,628,037. Les billes magnétiques sont fonctionnalisées, c'est-à-dire que leur surface externe est recouverte de molécules ayant la propriété de se lier de façon plus ou moins spécifique avec une ou plusieurs cibles biologiques ou chimiques ; ces molécules sont appelées matériau de capture. La surface des billes recouverte par le matériau de capture constitue la surface de capture. De préférence, cette surface de capture est comprise entre 1.10'3 et l0.10"2 m2.
Différents types de liaisons entre le matériau de capture et les cibles peuvent intervenir : - les interactions électrostatiques : les cibles sont capturées en fonction des charges présentes à leur surface. Les surfaces de capture contiennent des groupements terminaux échangeurs d'anions ou de cations de force plus ou moins importante. Il peut s'agir de carboxyle, sulfone, phosphate, di-éthyl-amino-éthyl (DEAE), poly-lysine, poly- éthylène imine (PEI) et plus généralement de polymères chargés (Deponte et al. Anal. Bioanal. Chem. 2004 ; 379 : 419-426) ; les interactions hydrophobes : les cibles sont capturées selon la différence d'hydrophobicité de surfaces. Par exemple, les régions hydrophobes de cibles telles que protéines, peptides ou acides nucléiques en milieu aqueux se lient préférentiellement à un matériau de capture hydrophobe tel qu'une chaine hydrocarbonée de 1 (méthyl) à 18 (octadécyl) atomes de carbone ; les liaisons covalentes : des groupes terminaux fonctionnels greffés sur les billes permettent de lier de façon covalente les ligands cibles ; il s'agit notamment de groupe aminé, hydroxyle, thiol, polyglutaraldéhyde.... ; les liaisons d'affinité : les billes sont recouvertes de ligands permettant des liaisons hautement spécifiques et sélectives telles que des interactions entre un antigène et un anticorps, une hybridation entre deux fragments nucléotidiques, entre la biotine et la streptavidine... (Ergin et al. Microbial CeIl Factories 2007 ; 6 :18 ; Steingroewer et al. J. Magnetism Magnet. Material 2007 ; 31 1 :295-299 ; Aim et al. J. of Virology 2005 79(1) :622-625). Le choix du matériau de capture est fait en fonction de la ou des cible(s) biologique(s) ou chimique(s) recherchée(s).
Selon une variante du dispositif selon l'invention, les billes magnétiques sont fonctionnalisées avec deux ou plus matériaux de capture différents permettant la capture de deux ou plus de cibles. On utilise soit des billes magnétiques recouvertes par plusieurs matériaux de capture différents; soit plusieurs types de billes magnétiques, chaque type de billes étant recouvert d'un matériau de capture différent.
Les billes magnétiques fonctionnalisées sont introduites dans la chambre réactionnelle en quantité telle que le rapport entre la surface de capture sur le volume de l'échantillon est compris entre 0,2 et 200 m2/l, de préférence, entre 0,2 et 20 m2/l, de façon encore préférée, entr 0,5 et 10 m2/l et tout préférentiellement, entre 1 et 5 m2/l, par exemple 2,8 m2/l.
A titre d'exemple, dans le cas de billes de 1 μm de diamètre fonctionnalisées avec du PEI (Chemicell), on pourra utiliser un nombre de billes compris entre 9.10 et 9.10 représentant une surface de capture comprise entre 2,83.10" m2 et 2,83.10"2 m2.
Le dispositif selon l'invention présente l'avantage de permettre le traitement d'échantillons liquides de grand volume, supérieur ou égal à 10 ml, de préférence à 50 ml et encore préférentiellement à 500 ml, tout en gardant une chambre réactionnelle de petite taille (au maximum de quelques millilitres) permettant ainsi de conserver les avantages d'une capture de cibles biologiques ou chimiques en petit volume, c'est-à-dire : un moindre encombrement et coût faible du dispositif grâce à sa petite taille ; - une plus grande facilité et vitesse de récupération des billes magnétiques ;
- une plus grande facilité de dispersion et de mélange des billes magnétiques ; une diminution du volume de réactifs nécessaires et du temps consacré au traitement des billes magnétiques après capture ; une augmentation de la sensibilité de détection des cibles ; - une forte concentration des cibles capturées.
Ce dispositif est également avantageux en ce qu'il offre un bon rapport surface de capture par rapport au volume de la chambre réactionnelle et un large éventail de matériaux de capture choisi en fonction des cibles biologiques ou chimiques recherchées ; enfin, les billes magnétiques fonctionnalisées peuvent être récupérées et réutilisées.
Le traitement automatisé d'échantillons liquides de grands volumes par le dispositif selon l'invention remplace avantageusement les techniques habituelles de traitement de ce type d'échantillons telles que la filtration ou l'ultrafiltration.
Ce dispositif permet ainsi de prélever une fraction d'échantillon susceptible de contenir des cibles biologiques ou chimiques, de capturer lesdites cibles et de concentrer afin de les traiter pour confirmer voire quantifier leur présence.
Ainsi automatisé, ce dispositif peut être positionné à l'endroit de l'échantillonnage afin qu'il réalise des prélèvements et analyses réguliers. Le dispositif selon l'invention peut être complété par un système de collecte d'échantillon liquide constitué d'un système fluidique de prélèvement de l'échantillon (61) tel qu'une pompe et d'un réservoir de stockage (62) de l'échantillon en amont de la chambre réactionnelle (Figure 2). Le système de collecte d'échantillon liquide est relié soit directement, soit via un ou plusieurs réservoirs intermédiaires, au système de déplacement de fluide permettant l'introduction d'une fraction de l'échantillon liquide dans la chambre réactionnelle (51).
La présente invention se rapporte encore à un procédé de capture de cibles biologiques ou chimiques susceptibles d'être présentes dans un échantillon liquide de volume V supérieur ou égal à 10 ml, de préférence à 50 ml et encore préférentiellement à 500 ml, à l'aide d'un dispositif selon l'invention comprenant les étapes de : a) prélèvement d'une fraction de volume v dudit échantillon liquide ; b) mise en contact de ladite fraction avec des billes magnétiques fonctionnalisées dans la chambre réactionnelle dudit dispositif où le champ magnétique est désactivé ; c) dispersion homogène des billes à l'aide du système d'agitation non invasif pendant une durée d'au moins 5 seconde, de préférence comprise entre 15 seconde et 10 minutes, de façon encore préférée, d'envi son 30 secondes ; d) capture des billes à l'aide du champ magnétique activé ; e) évacuation de ladite fraction ; f) renouvellement des étapes a) à e) un nombre de fois n tel que n est compris entre 1 et V/v, de préférence n = V/v.
L'automatisation du procédé selon l'invention est programmée et contrôlée par un système informatique approprié.
Le traitement des cibles biologiques ou chimiques capturées sur les billes magnétiques fonctionnalisées peut être réalisé dans la chambre réactionnelle du dispositif selon l'invention ou bien dans un réservoir relié au système de déplacement de fluide permettant l'évacuation du contenu de la chambre réactionnelle (52). Dans le cas de cibles biologiques, ce traitement consiste en :
- l'élution des cibles biologiques à l'aide d'un tampon d'élution que l'homme du métier en fonction de ladite cible puis
- l'analyse biologique ou biochimique des cibles ainsi éluées. L'analyse biologique ou biochimique peut par exemple consister en la culture sur milieux sélectifs des cibles biologiques éluées lorsqu'il s'agit de microorganismes et leur caractérisation ; ou encore la détection par anticorps des cibles biologiques... Selon une variante préférée, les cibles biologiques éluées sont lysées afin de libérer leurs acides nucléiques. Les méthodes de lyse sont largement connues de l'homme du métier, il peut s'agir d'une lyse chimique à l'aide d'un tampon de lyse contenant des détergents comme le dodécylsulfate de sodium (SDS), le dodécylsulfate de lithium (LiDS), le sarcosyl ou des agents chaotropiques tels que l' hydrochlorure de guanidium (GHCl), le thiocyanate de guanidium (GTC), l'iodure de sodium (NaI), le perchlorate ..., d'une lyse enzymatique à l'aide de la protéinase K ou du lysozyme... ou encore d'une lyse mécanique par exemple par couplage de l'effet des billes et des ultrasons ou par gradient thermique. Puis les acides nucléiques obtenus sont analysés, par exemple par PCR ou hybridation. Selon cette variante, une seconde étape de purification et de concentration des acides nucléiques obtenus peut également être mise en œuvre avec le dispositif selon l'invention comprenant des billes magnétiques fonctionnalisées à l'aide d'un matériau de capture d'acides nucléiques.
Dans le cas de cibles chimiques, le traitement consiste en : - l'élution des cibles chimiques à l'aide d'un tampon d'élution d'élution que l'homme du métier en fonction de ladite cible puis l'analyse des cibles récupérées par des techniques chimique classiques telles que la résonance magnétique nucléaire, la chromatographie, la spectroscopie UV ou IR, l' électrochimie... Lorsque les cibles sont de nature biochimique, la détection est réalisée par les techniques à la disposition de l'homme du métier qu'il choisit en fonction de la cible biochimique, par exemple, un couplage de la cible avec un antigène marqué radioactivement ou par fluorescence etc..
Ainsi, l'invention se rapporte aussi à un procédé de détection de cibles biologiques ou chimiques comprenant les étapes a) à f) du procédé de capture ci-avant caractérisé en ce qu'il comprend en outre les étapes : g) d'élution desdites cibles ; et h) de détection desdites cibles éluées à l'étape g). Lorsque le procédé de détection selon l'invention vise des cibles biologiques, l'étape h) peut consister en la lyse desdites cibles et en la détection des acides nucléiques libérés lors de la lyse.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfèrent à des exemples de mise en œuvre de la présente invention, ainsi qu'aux figures annexées dans lesquelles :
La Figure 1 est une représentation schématique du dispositif selon l'invention. La Figure 2 est une représentation schématique du dispositif selon l'invention comprenant en outre un système de collecte d'échantillon liquide.
La Figure 3 illustre le montage du dispositif selon l'invention utilisé dans l'exemple qui suit ; ledit dispositif comprend deux montages identiques en parallèle constitués chacun d'une chambre réactionnelle (1), les deux chambres réactionnelles sont positionnées dans un bain à ultrason (3) équipé d'un aimant (4), elles sont reliées, d'une part, à un récipient poubelle (7) via une pompe (53) et, d'autre part, à un réservoir (9) contenant l'échantillon, l'alimentation en échantillon des chambres réactionnelles se faisant par des électrovannes (8).
Les Figures 4 à 7 sont des histogrammes représentant et comparant la quantité d'unités génomiques identifiées dans des échantillons selon le procédé de l'invention (N) ou présentes initialement dans les échantillons (NO).
Exemple : capture de bactéries dans un échantillon d'eau de rivière
Instrumentation
Deux dispositifs identiques ont été disposés sur des voies parallèles (Figure 3).
La circulation des fluides est assurée par une pompe péristaltique Ismatec IPC-N reliée à des tubes flexibles en PFA d'un diamètre externe de 1,6 mm et d'un diamètre interne de 1 mm. Ces tubes flexibles font office de chambre réactionnelle dans laquelle sont stockées les billes magnétiques. Le contrôle des billes est réalisé par un aimant. La position de l'aimant est contrôlée par le bras d'un électroaimant ; dans sa position ON, l'aimant est en contact avec le flexible, dans la position OFF, il en est éloigné. La zone du flexible servant de chambre réactionnelle et où sont positionnées les billes est plongée dans un bain à ultrasons dont la fonction est de disperser les agrégats formés par les billes après leur capture dans le champ magnétique.
En aval, le tube flexible est relié à une vanne 6 voies (Upchurch V- 1471- DC) permettant de sélectionner le liquide en entrée.
Le contrôle de l'ensemble de ces composants est automatisé et réalisé à l'aide d'un logiciel LabView de la société Nation Instrument.
Principe de fonctionnement de l'instrumentation pour la capture de cibles sur un volume de 20 ml L'échantillon complet d'un volume V de 20 ml est stocké dans un réservoir.
Une quantité équivalente à un volume de 10 μl, soit 1,8.108 billes de 1 μm de diamètre sont introduites dans le tube flexible au niveau de l'aimant en position ON. Une fraction de volume v de 100 μl est prélevée dans l'échantillon avec la pompe.
Ce volume v est positionné dans le flexible au niveau des billes ; l'aimant est alors mis en position OFF ; les ultrasons sont allumés et permettent la dispersion des billes dans la fraction de volume v. Les ultrasons sont ensuite éteints ; l'échantillon est déplacé dans le tube flexible dans le but de remettre en suspension les billes éventuellement déposées sur la paroi par action des ultrasons.
Les billes sont laissées en contact avec l'échantillon pendant 45 secondes permettant la capture des cibles. L'aimant est alors positionné sur ON, les billes sont alors capturées par le champ magnétique et s'agrègent contre la paroi intérieure du flexible. L'échantillon est poussé par la pompe en direction d'une poubelle à une vitesse de 300 μl/min et une nouvelle fraction de volume v de l'échantillon est positionnée dans la chambre réactionnelle où se trouvent les billes. Ce cycle de capture est répété 50 à 100 fois.
Elution des cibles
Le système comportant plusieurs vannes, il est possible de sélectionner une nouvelle entrée reliée à un réservoir contenant le tampon d'élution (voire de lyse si nécessaire). Par action de la pompe, ce tampon est positionné au niveau de la zone de stockage des billes.
L'aimant étant en position OFF, les ultrasons sont appliqués pour assurer la dispersion des billes dans le tampon. Les cibles sont alors éluées de la surface des billes et éventuellement lysées.
L'aimant est ensuite mis en position ON ; les billes s'agrègent et sont retenues alors que l'échantillon de tampon d'élution et, éventuellement, de lyse comprenant les cibles est récupéré grâce à la pompe. Protocole détaillé Le principe de cette capture a été mis en œuvre sur deux échantillons liquides, l'un de 20 ml de tampon Tris-HCl 10 mM pH 8 et l'autre de 10 ml d'une eau de rivière (Rhône) prélevée le jour même, ces deux échantillons ont été dopés avec des cibles : des cellules d'Escherichia coli et de Bacillus subtilis à environ 106 unités génomiques (correspond à environ 106 bactéries). Les billes magnétiques utilisées sont des billes super paramagnétiques recouvertes d'une couche de polyéthylèneimine (SiMAG-PEI Chemicell) qui permet des interactions de type électrostatiques avec les cibles (cellules bactériennes) ; en effet, les bactéries sont globalement chargées négativement et le PEI est un échangeur fort d'anion. Le rapport surface de billes/volume de la fraction d'échantillon est de 2,8 m2/l. Pour prélever les 20 ml de Tris-HCl 1O mM pH8, il est nécessaire de réaliser 100 cycles de 100 μl sur les deux dispositifs montés en parallèle. Selon le même calcul, il faudra réaliser 50 cycles pour traiter les 10 ml d'eau de rivière.
Afin d'évaluer l'efficacité de ce système de capture, 100 μl des échantillons préparés sont additionnés de 106 unités génomiques et traités en un cycle afin d'obtenir une efficacité de capture de référence.
A la fin du cycle de capture, les billes sont récupérées dans 100 μl de Tris-HCl 1O mM. Puis l'extraction d'ADN est réalisée directement sur les billes : la lyse des cellules est réalisée à 37°C dans un tampon de lyse (5M de guanidine-HC, 20 mM de Tris pH 8, 1% sarcosyl). Après 10 minutes d'incubation, le mélange est placé deux minutes dans un bain à ultrasons à 37°C. Les billes sont regroupées à l'aide d'un aimant et le surnageant est récupéré et placé dans 4 fois son volume de solution guanidine HCl 3 M, Tris-HCl 20 mM, éthanol 80% (v/v) pH 4 ; l'ADN est alors capturé sur 2,5 μl de billes magnétiques fonctionnalisées avec du silanol (SiMAG-Silanol, Chemicell). Après deux rinçages avec une solution de NaCl 2 mM, Tris-HCl 10 mM, éthanol 75% (v/v), l'ADN purifié est élue dans 10 μl de Tris-HCl 1O mM, pH 8 après 2 minutes dans un bain à ultrasons.
Le protocole d'extraction et de purification d'ADN peut également être réalisé de façon automatique avec le dispositif instrumental ayant servi à l'étape précédente de capture.
La quantité d'ADN extraite (N) est déterminée par PCR quantitative et est exprimée en unité génomique. Pour cela, 5 μl de suspension d'ADN extrait sont mélangés à 5 μl des réactifs de PCR suivants : amorces 0,3 μM, GoId Taq polymerase 2,5 U, BSA (l,4 mg/ml), tampon IX (livré avec l'AmpliTaq Gold® DNA Polymerase d'Applied Biosystems), MgCl2 3 M, dNTP 200 μM, bétaïne 0,65 mM.
Les amorces utilisées ont pour séquence : Escheήchia coli (16S ribosomal RNA gène) CoIiTQF Forward 5'-CATGCCGCGTGTATGAAGAA coliTQR Reverse 5'-CGGGTAACGTCAATGAGCAAA
Sonde 5'-TATTAACTTTACTCCCTTCCTCCCCGCTGAA
Bacillus subtilis (16S ribosomal RNA gène)
BacFbis Forward bis 5'-ACGTGGGTAACCTGCCTGTAAG
BacRbis Reverse bis 5'-TAGCCGAAGCCACCTTTTATGT Sonde 5'-TACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGT
Le nombre d'unités génomiques présentes initialement dans l'échantillon (NO) est déterminé par PCR en mélangeant 5 μl de l'échantillon liquide de départ préalablement passé aux ultrasons pendant 10 minutes avec 5 μl du mélange de réactifs de PCR décrit ci-avant. Résultats détection des cibles dans les échantillons de tampon Tris-HCl
Les résultats obtenus (Figures 4 et 5) montrent que les écarts observés entre la quantité d'ADN capturée par le dispositif selon l'invention (N) et la quantité d'ADN présente dans l'échantillon de départ correspondant (NO) sont inférieurs à 0,41oglO, ce qui signifie que la quasi-totalité des cellules initialement présentes ont été capturées. détection des cibles dans les échantillons d'eau de rivière De la même façon, les résultats obtenus (Figure 6 et 7) montrent que les écarts observés entre la quantité d'ADN capturée par le dispositif selon l'invention (N) et la quantité d'ADN présente dans l'échantillon de départ correspondant (NO) sont inférieurs à 0,21oglO, ce qui montre là encore que la quasi-totalité des cellules initialement présentes ont été capturées.

Claims

REVENDICATIONS
1. Dispositif automatique de traitement d'échantillon liquide d'un volume V supérieur ou égal à 10 ml, comprenant une chambre réactionnelle, d'un volume v compris entre 10 μl et 5 ml, dans laquelle sont placées des billes magnétiques fonctionnalisées permettant la capture de cibles biologiques ou chimiques en quantité telle que le rapport entre la surface de capture des billes sur le volume de la chambre réactionnelle est compris entre 0,2 et 200 m2/l, ladite chambre réactionnelle étant équipée : d'un système d'agitation non invasif permettant une dispersion homogène desdites billes ; d'un champ magnétique pouvant être activé ou inactivé ; d'un système de déplacement de fluide pour l'introduction et l'évacuation de tout ou partie du contenu de la chambre réactionnelle.
2. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que la chambre réactionnelle a un volume de préférence compris entre 50 et 500 μl, et vaut préférentiellement environ 100 μl.
3. Dispositif selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la chambre réactionnelle est revêtue d'une surface hydrophobe choisie parmi le téflon, l'ETFE, le PFA et le PTFE.
4. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit d'un système d'agitation non invasif est un système d'agitation par ultrasons.
5. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit champ magnétique est produit par un aimant permanent ou un électroaimant.
6. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que lesdites billes magnétiques fonctionnalisées ont un diamètre compris entre 0,5 et 10 μm.
7. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte en outre un système de collecte d'échantillon liquide constitué d'un système fluidique de prélèvement de l'échantillon tel qu'une pompe et d'un réservoir de stockage en amont de la chambre réactionnelle.
8. Procédé de capture de cibles biologiques ou chimiques susceptibles d'être présentes dans un échantillon liquide de volume V supérieur ou égal à 10 ml avec d'un dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 comprenant les étapes de : a) prélèvement d'une fraction de volume v dudit échantillon liquide ; b) mise en contact de ladite fraction avec des billes magnétiques fonctionnalisées dans la chambre réactionnelle dudit dispositif où le champ magnétique est désactivé ; c) dispersion homogène des billes à l'aide du système d'agitation non invasif pendant une durée d'au moins 5 secondes ; d) capture des billes à l'aide du champ magnétique activé ; e) évacuation de ladite fraction ; f) renouvellement des étapes a) à e) un nombre de fois n tel que n est compris entre 1 et V/v.
9. Procédé de capture selon la revendication 8, caractérisé en ce que n = V/v.
10. Procédé de détection de cibles biologiques ou chimiques comprenant les étapes a) à f) du procédé de capture selon la revendication 8 ou 9, caractérisé en ce qu'il comprend en outre les étapes : g) d'élution desdites cibles et h) de détection desdites cibles éluées à l'étape g).
1 1. Procédé de détection de cibles biologiques selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'étape h) consistent la Iy se desdites cibles et en la détection des acides nucléiques libérés lors de la lyse.
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