WO2010127420A1 - Sequências geneticamente modificadas de antígenos de plasmodium vivax - Google Patents

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Ricardo Tostes Gazzinelli
Marisa Cristina Da Fonseca
Cristiana Ferreira Alves De Brito
Flávio DA FONSECA GUIMARÃES
Cristina Lima Carrara
Leoneide Erica Maduro Bouillet
Maurício MARTINS RODRIGUES
Irene Soares
Bruna De Andrade Pereira
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Definitions

  • the present invention relates to the construction of modified genetic sequences comprising sequences for Plasmodium vivax antigens (DBP-PA, DBP-AM, AMA-1, CS and MSP-1), their recombinant proteins encoded by said sequences. genetically modified sequences and viruses expressing recombinant antigens. Further, the present invention relates to a prime-boost vaccination method using adenoviral or poxviral vectors, purified mammalian immunization proteins and vaccine compositions useful for use as a malaria vaccine.
  • Malaria is considered by WHO to be one of the three most important infectious diseases today and there is no licensed vaccine against the disease so far.
  • the most prevalent causative parasites in the world are P. vivax and P. falciparum, the first being the most frequent in Brazil where malaria is a serious public health problem aggravated in recent years by the increase in the number of cases. Due to the large genetic difference between the two parasites, the need for the development of differentiated vaccines is accepted. Much research has favorably pointed to the feasibility of malaria vaccines.
  • Recombinant viruses have been shown to be efficient for vaccine development.
  • Clinical trials with recombinant virus-based vaccine candidates for malaria, tuberculosis and AIDS show unprecedented levels of cellular immune response against recombinant virus-expressed products, as compared to vaccine formulations based on purified recombinant proteins or plasmid DNA vaccines (ROCHA).
  • Recombinant viruses as tools to induce protective cellular immunity against infectious diseases (Int. Microbiol. 2004. 7, 89-94).
  • Recombinant viral vectors are currently proven to be effective vaccine vehicles. Of these, the most used are the Poxvirus, Influenza virus and Adenovirus, and some studies with the latter are in advanced stage of clinical trials for diseases such as malaria and AIDS.
  • recombinant viruses an advantage in the use of recombinant viruses is that the viral particle itself has an adjunct effect by itself, which avoids the use of other adjuvant compounds or cytokines. Therefore, recombinant adenoviruses, influenza viruses, vaccinia viruses (MVA) stand out for their immunomodulatory properties (GUILLOT L, LE GOFFIC R., BLOCK S., WRITTEN N., AKIRA S., CHIGNARD M. SITAHAR M. Involvement of toll-like receptor 3 in the immune response of lung epithelial cells to double-stranded RNA and influenza A virus (J. Biol. Chem. 2003. 280, 5571-5580).
  • the Adenovirus Capsid Protein Hexon Contains a Highly conserveed Human CD4 + T-Cell Epitope. Hum. Gene Ther., 13 : 1167-1178) and CD8 + T cells (Fitzgerald, Julie C; Gao, Guang-Ping; Reyes-Sandoval, Arturo; Pavlakis, George N.; Xiang, Zhi Q .; Wlazlo, Anthony P.; Giles-Davis, Wynetta; Wilson, James M.; Ertl, Hildegund GC 2003. Simian Replication-Defective Adenoviral Recombinant Vaccine to HIV-1 Gag. J. Immunol., 170: 1416-1422).
  • recombinant poxvirus construction techniques including the MVA virus (Modified Vaccinia Ankara Virus), involve the homologous recombination of DNA into infected cells.
  • MVA virus Modified Vaccinia Ankara Virus
  • recombinant virus production employs transfer plasmid vectors containing an expression cassette where the exogenous gene is controlled by a strong promoter, usually early and late, of poxviruses. This cassette is flanked by DNA sequences homologous to the sequences present in the virus genome, and will serve to direct recombination to the desired locus.
  • the recombination rate is relatively high, around 0.1%, and recombinant viruses can be screened, plaque purified and amplified.
  • adenoviruses ideal candidates for vaccine development are: low pathogenicity to humans, inability to integrate into the host genome, ease of purification resulting in high viral titers and the ability to infect multiple cells, including dendritic cells (Rocha, Carolina Damas; Caetano, Bráulia Costa; Machado, Alexandre Vieira; Brufia-Romero, Oscar. 2004. Recombinant viruses as tools to induce protective cellular immunity against infectious diseases. Int. Microbiol., 7: 83- 94).
  • vaccinia virus As a vaccine vector, (i) genome capable of accommodating large exogenous DNA fragments and expressing recombinant proteins, (ii) replication occurs in the cellular cytoplasm, which prevents the genome integrate with host genetic material, (iii) ease of purification, (iv) ability to generate transgene-specific long-lasting lymphocytes inserted into their genome after a single immunization (Rocha, Carolina Damas; Caetano, Bráulia Costa; Machado, Alexandre Vieira; Bruna-Romero, Oscar 2004. Recombinant viruses as tools to induce protective cellular immunity against infectious diseases (Int. Microbiol., 7: 83-94).
  • the homologous protocols are more advantageous from the point of view of vaccine construction, since only one type of vaccine needs to be developed (a single vector to be applied in immunizations).
  • the heterologous protocol in turn, two vaccines need to be developed, each containing one of the vectors to be used in immunizations.
  • the six or eight week interval used in the present invention between the two immunizations has been shown to be effective in restimulating the primary immune response induced after the initial vaccination, demonstrating that, after that time, pre-existing immunity decreased to levels that allow the action of a second dose of vaccine.
  • WO07003384A1 describes a novel use of a malarial antigen useful for immunization against malaria.
  • This invention relates to the use of sporozoite antigens, particularly CS protein or derived immunogenic fragments, combined with suitable adjuvants.
  • US20050100558A1 describes vaccination methods for generating an effective antigen-specific immune response.
  • the invention describes the use of heterologous vaccination vectors to elicit a potentiated immune response.
  • Methods for treating and preventing diseases using the vaccination scheme of the present invention are also disclosed.
  • Patent document WO06040334A1 describes new vaccine regimens based on the prime-boost scheme. Neutralized recombinant adenoviral vectors expressing P. falciparum antigens were used. Vaccines based on recombinant DNA technology, along with appropriate adjuvants, are also described.
  • US20040131594A1 describes methods and reagents for vaccination that are capable of generating a CD8 T cell immune response against malarial, viral or tumor antigens.
  • New vaccine regimens are described and employ an initial composition (prime) and another enhancer ⁇ boost).
  • the enhancer composition comprises the use of non-replicative or replicative-deficient poxviral vectors expressing at least one CD8 T cell epitope which is also present in the initial composition.
  • US20060188527A1 is a new method for protection against malarial infection through vaccination.
  • the invention comprises the induction of an initial anti-malaria response by the use of DNA-based vaccine and, sequentially, a booster immunization using a protein vaccine is used.
  • Saccharomyces cerevisiae was the first yeast used for the purpose of producing exogenous proteins due to the knowledge about this organism, besides the acceptance for use of this yeast in experiments for human benefit (CREEG et al., 1993).
  • the S. cerevisiae expression system did not meet all expectations due to secretion and productivity inefficiency, hyperglycosylation, instability of the producing strains, difficulties in maintaining high growth rates and high population densities of recombinant cells ( SWINKELS et al., 1993).
  • SWINKELS et al., 1993 Several studies have been and are being done to use alternative yeasts for the production of recombinant proteins.
  • Pichia pastoris whose expression system has been designed, is shown to be an efficient host for the synthesis and secretion of heterologous proteins for clinical, academic or industrial applications (COS et al, 2005).
  • Pichia pastoris is a methylotrophic yeast capable of growing to high cell densities (in the order of grams per liter) and the concentration of recombinant proteins produced is often proportional to the biomass achieved (HINGGS, 1998).
  • HINGGS Several examples show that Pichia can achieve much higher yields than S. cerevisiae, E. coli or baculovirus (CREGG, VEDVICK and RASCHKE, 1993; ROMANOS et al., 1992).
  • Pichia system The success of the Pichia system is largely related to the AOX1 promoter of the gene encoding the enzyme alcohol oxidase which is repressed in glycerol-containing culture medium but induced when cells are transferred to methanol-containing medium as the sole carbon source (HINGGS). , 1998; CREEG 1999; BOETTNER et al., 2002).
  • P. pastoris Since one copy of the gene is integrated per transformed cell, increasing population density increases protein yield (CREEG et al., 1993).
  • P. pastoris has other advantages such as: high regulation by the AOX1 promoter; low glycosylation (often similar to human protein glycosylation); the simplicity of protein expression induction by methanol; the low level of native protein secretion; besides growing in simple or defined medium, using methanol as the sole carbon source (CREEG et al., 1993; DIGAN et al., 1989; CHEN et al., 1996; NOHR et al., 2003; WITTAKER et al., 2004; COS, et al., 2005).
  • the growth medium for P. pastoris in recombinant protein production is defined, inexpensive and ideal for large scale production.
  • the medium is free of complex ingredients that could generate toxins and is therefore easily accepted for use in drug production (CHEN et al., 1996; GELLISSEN et al., 2005).
  • IGF-1 insulin-like growth factor 1
  • HSA insulin-like growth factor 1
  • the expression of P. vivax DBPII by this system may be one of the most viable ways of obtaining a protein. biologically active protein allowing its use as an antigen in the immunization process and with potential to be used for human use.
  • malaria immunization may be based on the Duffy antigen-binding protein in erythrocytes that is called DARC and which has specificity for its ligand to the plasmid Duffy-Binding Protein.
  • DARC Duffy antigen-binding protein
  • This erythrocytic invasion involves a complex cascade of events and requires specific interaction between erythrocyte receptors and parasite proteins.
  • P. vivax infection has been reported to be entirely dependent on this Duffy interaction with the human erythrocyte. Much of the population in Africa is reported to be resistant to P. vivax infection and this is due to the fact that the observed population does not have the DARC receptor, which prevents covalent interaction of BPD. This makes DBP an excellent vaccine candidate, since antibodies directed against this region could block the interaction of DBP with the erythrocyte in populations where P vivax is a major cause of malaria.
  • the BPD region responsible for erythrocyte binding comprises protein II region. This region is rich in cysteine, which guarantees its structural conformation and also rich in polymorphisms, which allows evasion to the host immune system.
  • P. vivax BPD region II has been described as PvDBPII.
  • AMA-1 Apical membrane antigen 1
  • HODDER AN
  • CREWTHER CREWTHER
  • PE CAM-A
  • ANDERS RF. Specificity of the protective antibody response to apical membrane antigen 1. Infect. Immun. V 69, No. 5: pp. 3286-3294, 2001).
  • AMA-1 is stored in the micronema after synthesis and subsequently translocated to the parasite surface via roptria or during host cell invasion.
  • AMA-1 is synthesized as a 66KDa transmembrane protein except for P. falciparum. It is a typical integral protein with an N-terminal ectodomain, a transmembrane region, and a small C-terminal cytoplasmic domain (KOCKEN, CHM; WITHERS-MARTINEZ, C; DUBBELD, MA; WEL, A .; HACKETT, F .; BLACKMAN, MJ; THOMAS, AW High-level expression of the malaria blood-stage vaccine candidate Plasmodium falciparum apical membrane antigen 1 and induction of antibodies that inhibit trocyte invasion Infect. Immun. V.70, No. 8; p.4471-4476 , 2002).
  • the AMA-1 gene shows 16 ectodomain conserved Cys residues (PIZARRO, JC; NORMAND, BV; et al. Crystal structure of the malaria vaccine candidate apical membrane antigen 1. Science, v.308, p .408-411, 2005) and is divided into three domains defined by 8 disulfide bridges (HODDER, AN; CREWTHER, PE; MATTHEW, MLSM; REID, GE; MORITZ, RL; SIMPSON, RJ; ANDERS, RF of Plasmodium apical membrane antigen-1 (J. Biol. Chem. v 271, no. 46; p. 29446-29452, 1996).
  • HODDER 8 disulfide bridges
  • P. vivax AMA-1 ectodomain (PvAMA-1), corresponding to residues Pro 43 to Leu 487 confirms the division into three domains, and that domains I and II are structurally similar to other proteins belonging to the superfamily.
  • PAN whose proteins have a function related to adhesion and binding to receptors or other proteins.
  • domain II has a disorder or mobility region corresponding to residues 295 to 334, called the domain II loop (PIZARRO, JC; NORMAND, BV; et al. Crystal structure of the malaria vaccine candidate apical membrane antigen 1. Science, v. 308, p.408-411, 2005).
  • AMA-1 is produced as an 83Kda polypeptide that undergoes processing after synthesis in which a small N-terminal fragment is proteolytically cleaved, yielding mature 62-Kda protein (CREWTHER, PE; CULVENOR, JG ; SILVA, A .; COOPER, JA; ANDERS, RF Plasmodium falciparum: two antigens of similar size are located in different compartments of the rhoptry (Exp. Parasitol. V 70, no. 2, p. 193-206, 1990).
  • the ability of this molecule to induce protective immune response depends on the stability of its disulfide bond conformation (HODDER, AN; CREWTHER, PE; MATTHEW, MLSM; REID, GE; MORITZ, RL; SIMPSON, RJ; ANDERS, RF structure of Plasmodium apical membrane antigen- 1. J. Biol. Chem. v 271, no. 46; p.29446-29452, 1996), as inhibitory antibodies preferentially react with disulfide-stabilized conformation epitopes (HODDER, AN; CREWTHER, PE; ANDERS, RF. Specificity of the protective antibody response to apical membrane antigen 1. Infect. Immun (69, No. 5; pp. 3286-3294, 2001).
  • AMA-1 sequence is relatively conserved among Plasmodium species, with the level of amino acid sequence identity exceeding 50% in comparisons between all known sequences (CHENG.Q .; SAUL, A. Sequence analysis of the apical membrane. antigen 1 (AMA-1) of Plasmodium vivax (Mol. Biochem. Parasitol. v 65; p.183-187, 2004).
  • AMA-1 has no repetitive sequences and the polymorphism found in other antigens such as MSP-1 and MSP-2 (ANDERS, RF, SMYTHE, JA Polymorphic antigens in Plasmodium falciparum. Blood. V.74; p.1865-1875 , 1989).
  • AMA-1 The biological function of AMA-1 is not yet known, but there is evidence that this protein is involved in the process of merozoite invasion of the erythrocyte (KOCKEN, CHM; WITH ERS-MARTI N EZ, C; DUBBELD, MA; WEL, A. ; HACKETT, F;; BLACKMAN, MJ; THOMAS, AW High-level expression of the malaria blood-stage vaccine candidate Plasmodium falciparum apical membrane antigen 1 and induction of antibodies that inhibit erytrocyte invasion.
  • Phage-displayed peptides bind to te malarial protein apical membrane antigen-1 and inhibit the merozoite invasion of host erythocytes (J. Biol. Chem. v 277, No. 52; p.50303-50310, 2002).
  • AMA-1 targeted monoclonal antibodies were able to inhibit the invasion of merozoites, showing that AMA-1 acts in the invasion process (CREWTHER et al., 1990).
  • Mitchell et al. (2004) suggest that this protein is directly responsible for the reorientation of the merozoites during the invasion process or that AMA-1 may initiate the contact junction and relies on Duffy binding proteins for the process to occur effectively (MITCHELL, GH; THOMAS, AW; MARGOS, G .; DLUZEWSKI, AR; BANNISTER, LH Apical membrane antigen 1, the major malaria vaccine candidate, mediates the dose attachment of invasive merozoites to host red blood cells. 1; p.154-158, 2004).
  • AMA-1 is also involved in hepatocyte invasion, protein is no longer expressed after sporozoite invasion of hepatocyte and is re-expressed only in the Merozoites. Inhibition of sporozoite invasion by anti-AMA-1 antibodies indicates that AMA-1 can be considered as a potential candidate for multi-stage malaria vaccine, targeting both erythrocyte and pre-erythrocyte stages (SILVIER, 0.; FRANETICH JAR; CHARRIN, S.; MUELLER, MS et al. A role for apical antigen 1 during invasion of hepatocytes by P. falciparum sporozoites J. Biol. Chem. V. 279 (10), p.9490-6, 2004 ).
  • Antibodies against AMA-1 are known to inhibit parasite multiplication in vitro and in vivo when interacting with the surface of merozoites.
  • AMA-1 vaccine studies in animal models have shown that immunization with this purified or recombinant protein induced protective immune response when animals were challenged with Plasmodium species.
  • the 19 Kda C-terminal protein fragment is a major candidate for the vaccine.
  • Several studies demonstrate that it is capable of triggering protective immune response (KUMAR, S .; COLLINS, W.; EGAN, A.; YADAVA, A.; GARRAUD, O.; BLACKMAN, MJ; PATINO, JAG; DIGGS, C; KASLOW , DC Immunogenicity and efficacy in Aotus monkeys of four recombinant Plasmodium falciparum vaccines in multiple adjuvant formulations based on the 19-kilodalton C terminus of merozoite surface protein 1.
  • P. vivax MSP-1 (PvMSP1 19 ), similarly to MSP-1 19 from other Plasmodium species studied, consists of a pair of EGF-like (epidermal growth factor) domains presenting multiple interdomain contacts, and are closely aligned. anti-parallel to each other. This results in a U-shaped conformation that leaves the C and N-terminal ends intimately close (BABON, JJ; MORGAN, WD; KELLY.G .; ECCLESTON, JFHOLDER, AA. Structural studies on P. vivax merozoite surface protein-1. Mol. Biochem, Parasitol, V.153, p.31-40, 2007).
  • a multi-stage vaccine containing antigen specific for pre-erythrocytic and erythrocytic parasitic forms appears to be the most efficient alternative to protect against malaria.
  • Administration in priming and booster protocols that induce high simultaneous levels of long-term cellular and humoral immunity of these recombinant antigens, using recombinant viruses (adenovirus and / or poxvirus) and recombinant proteins as immunization vehicles, are choices most likely to be. protect against malaria.
  • the present invention relates to the construction of modified genetic sequences comprising P. vivax antigen sequences (DBP-PA, DBP-AM, DBP-MT, AMA-1, CS and MSP-1), their recombinant proteins encoded by said genetically engineered sequences and viruses expressing recombinant antigens. Further, the present invention relates to a prime-boost vaccination method using adenoviral or poxviral vectors, purified mammalian immunization proteins and vaccine compositions useful for use as a malaria vaccine.
  • Duffy - Duffy Binding Protein or DBP - antigen binding protein against P. vivax malaria has been modified.
  • construction of an adenovirus secreting the recombinant protein in the extracellular medium is described due to incorporation of the HASS signal peptide into the viral vector.
  • the construction is characterized by the combination of polymorphisms found in the Brazilian population in order to increase vaccine coverage.
  • sequences from patients from the Brazilian endemic area were used.
  • the DBP-PA, DBP-MT and DBP-AM sequences represent the three most frequent DBP protein polymorphisms present in Brazil, and the administration of these sequences are of fundamental importance in inducing a protective vaccine response.
  • the digestion product was purified and cloned into pcDNA3.1 HASS containing the influenza virus signal peptide that allows protein secretion by adenovirus.
  • the cloning was done between the EcoRI and Xba ⁇ site of this plasmid. Positive clones were digested to obtain the HASS-DBPII portion that was cloned into pADCMV-linkl in phase to the cytomegalovirus expression promoter. Positive clones were sequenced to confirm correct insertion into the plasmid.
  • PADCMVLinkl -HASS-DBPII was used to homologously recombine pJM17 with another plasmid. This recombination phenomenon occurs during transfection and allows the generation of adenoviruses 5.
  • Another recombinant protein was obtained from the amino acid sequence of the P. vivax CS Belem strain CS protein (Gene Bank-accession AAA29526). Epitopes of the CS protein described in the literature were chosen and inserted into strategic points of the HBcAg protein as detailed above (Fig. 6). The structural conformation of the recombinant protein designed to predict its similarity with the structure of HBcAg monomers described earlier by Böttcher et al. (1997). The result of this prediction was provided by the Swiss-Pdb Viewer server from the amino acid sequence of the recombinant protein and revealed that despite the exogenous amino acid insertions derived from the CS- protein the conformational structure remains the same.
  • the nucleotide sequence was predicted by optimizing the choice of codons for the human model. Restriction enzyme sites for the cloning process for the construction of the recombinant virus were also inserted. Based on the optimized gene sequence a synthetic gene was produced by Entelechon (Fig. 7). At the Bgl ⁇ / Nco ⁇ site of the synthetic gene the IRES sequence was cloned. Both types of constructs (HBc-CS and HBc-CS-IRES) were cloned into the Bgl ⁇ IKpn ⁇ sites of plasmid pAdCMV-link-1 (Fig. 8).
  • pJM17 contains the insert-modified human adenovirus genome (pBRX) in the E1 region.
  • pAdCMV-link-1 contains, flanking the cloning site, a Cytomegalovirus (CMV) promoter, a polyadenylation site (poly A), and homology regions with human adenovirus type 5.
  • CMV Cytomegalovirus
  • poly A polyadenylation site
  • the homology regions in pAd-HBc-CS and pAd-HBc-CS-IRES are paired and recombined with pJM17 and the transgene expression cassette is transferred to the adenovirus 5 genome, deleting the pBR insert.
  • a non-replicating human adenovirus type 5 capable of expressing P. vivax MSP-1 19 (PvMSP-1 19 ) vaccine antigen in HEK293A was also developed.
  • the use of a viral vector is justified by the fact that it mainly induces a cellular immune response and acts as an adjuvant enhancing the immune response.
  • AdMSP-1 19 a cloning strategy of the gene coding for P. vivax MSP-1 19 in pAdCMV-Link-1 was developed.
  • the recombinant protein expressed by adenovirus corresponds to the P.
  • vivax MSP-1 amino acid sequence 1616-1704 BELÉM strain, and has a histidine tail in the N-terminal region and in the C-terminal region a fusion with the universal CD4 epitope FATHER (Pan Allelic DR Epitope) (CUNHA et al., 2002).
  • this recombinant protein also has an influenza virus signal peptide (HASS) which allows its secretion into the extracellular medium.
  • HASS influenza virus signal peptide
  • Another vaccine antigen expressed by the recombinant adenovirus corresponds to P. Vax's AMA-1 ectodomain, referring to residues Pro 43 to Leu 487 of P. vivax isolate BEL-12, fused to the influenza virus signal peptide (HASS) which allows directing AMA-1 to the extracellular medium inducing humoral immune response leading to the generation of specific antibodies.
  • the recombinant virus was generated by homologous recombination, and the P. vivax AMA-1 ectodomain coding region contained in the pAdCMV-Link-1 transfer vector was inserted into the adenovirus genome.
  • the recombinant protein expressed by adenovirus corresponds to the P.
  • v / Vax AMA-1 amino acid sequence 43 - 487 of the BEL-12 isolate from a patient from Belém-PA which was obtained from plasmid pHIS- AMA-1 (RODRIGUES, MHC; RODRIGUES, KM; OLIVEIRA, TR; CODE, AN; RODRIGUES, MM; KOCKEN, CHM; THOMAS, AW; SOARES, IS Antibody Response of naturally infected individuals to recombinant Plasmodium vivax Int. J. Parasitol, v35, p185-192, 2005).
  • this recombinant protein also has an influenza virus signal peptide (HASS) which allows its secretion into the extracellular medium.
  • HASS influenza virus signal peptide
  • Non-replicative human adenovirus type 5 is capable of expressing, in HEK293A cells, the P. vivax AMA-1 vaccine antigen (PvAMA-1).
  • PvAMA-1 vaccine antigen
  • the use of a viral vector is justified by the fact that it mainly induces a cellular immune response and acts as an adjuvant enhancing the immune response.
  • the vaccine antigen expressed by the recombinant adenovirus corresponds to P. vivax AMA-1 ectodomain, referring to residues Pro 43 to Leu 487 of P. vivax isolate BEL-12, fused to the influenza virus signal peptide (HASS) which allows directing AMA-1 to the extracellular medium inducing humoral immune response leading to the generation of specific antibodies.
  • HASS influenza virus signal peptide
  • the prime-boost protocol of the present invention is based on the sequential administration of the recombinant adenovirus (human adenovirus type 5 or HuAdS) vaccine vector and recombinant vaccinia virus (WR, Copenhagen or MVA strains) capable of expressing a common heterologous protein or these proteins administered in their purified recombinant form.
  • the homologous dose booster protocol consists of the administration of the same viral vector or purified recombinant proteins in both immunizations (Ad / Ad or Prot / Prot) whereas the heterologous protocol is characterized by the use of a viral vector or recombinant protein at the booster dose.
  • Booster dose may further be performed using purified antigenic pathogen proteins following administration of adenovirus or vaccinia at the initial dose or vice versa.
  • the interval between immunizations used was 6 or 8 weeks, never less than 35 days in any case.
  • Example 1 Construction of DBPII Recombinant Adenoviruses From region II primers were designed containing enzyme restriction sites for the enzymes EcoRI and Xba ⁇ which were used for insertion of the sequence of interest into the pPIC9Z vector for P. pastoris yeast transformation and also for insertion into pTopoTA and subsequent cloning. in pcDNA3.1 HASS to obtain the influenza virus HASS signal peptide and then cloning HASS-DBPII into pAdCMV-linLysl.
  • This latter plasmid was used to homologously recombine with pJM17 to generate adenoviruses expressing DBPII.
  • the DBPII sequence obtained by PCR from the sera of these patients was individually cloned into the plasmids and the same procedure was adopted in the DBPII cloning steps.
  • HBcAg hepatitis B virus core protein
  • CS protein epitopes located at specific points in this molecule is made by the inclusion of the repeated three times P. vivax epitope B (GDRADGQPA) in the immunodominant loop of HBcAg, that is, between amino acids 78 and 79.
  • HBcAg In the N-terminal portion of HBcAg is the signal peptide of the influenza virus hemagglutinin protein (HASS signal peptide).
  • HASS signal peptide the signal peptide of the influenza virus hemagglutinin protein
  • HBcAg molecule is truncated at amino acid 149, where an internal ribosome entry site (i.e. an IRES sequence) is located.
  • portions of the P. vivax CS protein are present which include B, TCD4 and TCD8 epitopes. Such portions are arranged in six blocks separated by epitope spacers that facilitate their processing by the cell as follows: block 1: amino acids 1 through 23 of the Belém sample CS protein comprising a human TCD8 epitope between the amino acid sequence AAY (spacer) on each side; block 2: amino acids 264 to 272, comprising a human TCD8 epitope, flanked by the AAY spacer; block 3: amino acids 292 to 378, comprising epitopes B, TCD4 and TCD8, flanked by the AAY spacer; block 4: cytomegalovirus murine TCD8 epitope flanked by the AAY spacer; block 5: amino acids 301 to 309, comprising a human TCD8 epitope, flanked by the AAY spacer; block 6: amino acids 51 to 90, comprising epitopes B and TCD4, flanked at
  • Transfer plasmids basically consist of generic plasmids (such as pUC19) to which gene portions called Insert and Expression Cassettes are added ( Figure 6).
  • the insertion cassette consists of: Nucleotide sequence homologous to the 5 ' portion of the Deletion Region II and / or Deletion Region III of the MVA genome (1 ); Early / late modified promoter of Vaccinia virus (2); marker protein coding gene - Fluorescent Green Protein (GFP) or Fluorescent Red Protein (RFP) (3); cDNA / Gene cloning site of interest (4), Early / late modified Vaccinia virus promoter (5); nucleotide homologous to the 3 ' portion of the Deletion Region II and / or Deletion Region III of the MVA genome (6).
  • MSP-1 Merozoite surface protein 1
  • GPI glycosylphosphatidylinositol
  • a second cleavage separates the 19Kda C-terminal fragment from the protein complex, and only the membrane-bound portion via the GPI anchor is transferred to the newly infected erythrocytes (KAUTH, CW; EPP, C; BUJARD, H. LUTZ, R.
  • the merozoite surface protein 1 complex of human malaria parasite P. falciparum TJ Biol. Chem. V278, No. 25, p.22257-22264, 2003).
  • the gene sequences encoding the P. vivax MSP-119 proteins were PCR amplified from plasmid pET-MSP1-PADRE with the 5 'GCA GAT ATC sense primers CAT CAC CAT CAC CAT CAC and antisense 5 AAG CTT TTA AGC GGC AGC CTT CAG GGT.
  • the highlighted codons are the sites for the restriction enzymes EcoRV and Hind ⁇ , respectively, and the underlined codon corresponds to the stop codon.
  • PCR reactions were performed with the high fidelity enzyme Pfx (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions and under the following amplification conditions: one cycle of 5min at 94 ° C, 38 cycles of 40sec at 94 ° C, 45sec at 45 ° C and 1: 30min 68 ° C and a final extension cycle of 4min at 68 ° C.
  • Pfx Invitrogen
  • MSP primers specific for 9-11 was amplified a fragment of 399 bp from the pET-19 -PADRE MSP-1, which was cloned into pCR-blunt II TOPO. In this cloning, TOPO-MSP-1 19 was created and Figure 13 shows the selection of positive clone.
  • both the vector as the top- MSP-1 19 clones were digested with Eco RV and Hind ⁇ . After digestions the desired fragments were purified by the Qiaquick gel extraction kit (QIAGEN). Then were cloned into the vector. In this cloning pAdCMV-MSP-1 19 was created. Positive clones show a 388bp fragment after digestion with EcoRV and Hind? As shown in Figure 14.
  • the pAdCMV-MSP-1 19 was digested with Bgl II to linearize the plasmid and pAd32.1 was digested with BamHI yielding a fragment of 717pb. After digestion the fragments were then purified and ligated as mentioned above. In this cloning the partial pAdCMV-HASS-MSP-1 19 was created. Screening of positive clones was done with Not ⁇ , and positive clones have 1200 bp fragments, as shown in Figure 15.
  • Positive clones pAdCMV-HASS-MSP-1 i 9 part were digested with EcoRV to remove additional bases 625 bases.
  • the linearized plasmid was subsequently cut from the gel and purified with T4 DNA ligase was circularized again, yielding HASS pAdCMV-9-MSP-11. Selection of positive clones was done by Not ⁇ digestion, as shown in Figure 15.
  • Example 6 - PCR And RT-PCR of HEK 293A cells infected with recombinant adenovirus to confirm presence of transgene.
  • 400bp amplifications with the primers specific for MSP- 19 were obtained from DNA and RNA extracted from HEK293A cells infected with AdMSP-1 recombinant virus 19 .
  • the reverse transcription reaction was performed and the originated cDNA was treated with DNAse.
  • adenovirus E4 gene specific primers that amplify a 500bp fragment.
  • Example 7 Detection of recombinant proteins by antibodies.
  • HEK293A cell extract infected with recombinant adenovirus AdMSP-1 19 showed intense reactivity with serum from BALB / c mice immunized with MSP-1 19 by western blot assay. This result confirms the expression of MSP- 19 by AdMSP- 19 .
  • Animals were immunized subcutaneously with 200 ⁇ emulsion Montanide ISA 720 (30:70 protein / oil) with 20 ⁇ 9 of purified AMA-1 protein. Two immunizations were made with a 3 week interval between them, in each immunization, 50 ⁇ were applied at 4 different points on the back of the animal, totaling 200 ⁇ . Sera were collected 14 days after the last immunization.
  • the gene sequences encoding P. vivax AMA-1 proteins were PCR amplified from plasmid pHIS-AMA-1 with the 5 'sense primers GCA GAT ATC GGC AGC AGC CAT CAT CAT and antisense 5 'GGT ACC TTA TAG TAG CAT CTG CTT GTT.
  • the highlighted codons are the sites for the restriction enzymes EcoRV and Kpn ⁇ , respectively, and the underlined codon corresponds to the stop codon.
  • PCR reactions were performed with the high fidelity enzyme Pfx (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions and under the following amplification conditions: one cycle of 5min at 94 ° C, 38 cycles of 40sec at 94 ° C, 45sec at 45 ° C and 1h30min 68 ° C and a final extension cycle of 4min at 68 ° C.
  • Pfx High fidelity enzyme
  • PAd32.1 containing the HASS signal peptide was used.
  • PAdCMV-AMA-1 was digested with Bgl ⁇ which linearizes the plasmid, and pAd32.1 with BamH ⁇ , yielding a 717bp fragment, 92 bases corresponding to HASS and the remaining 625 bases served to facilitate cloning ( Figure 22 ).
  • Sg11 and SamHI have compatible ends, that is, Bgl II generated ends can be directly linked to Bam ⁇ ends, but their restriction sites are not regenerated, as depicted in Figure 23.
  • Example 10 - PCR and RT-PCR from HEK 293 cells infected with recombinant adenoviruses to confirm presence of transgene
  • AMA-1 specific primers were obtained from DNA and RNA extracted from HEK293A cells infected with the AdAMA-1 recombinant virus. For total RNA the reverse transcription reaction was performed and the originated cDNA was treated with DNAse. In addition to the AMA-1 specific primers we also used adenovirus E4 gene specific primers that amplify a 500bp fragment. These amplifications from viral DNA and viral RNA indicate that the recombinant adenovirus is expressing AMA-1. Figure 26 demonstrates the amplifications.
  • Detection of recombinant proteins by antibodies was done by western blot. Serum antibodies from BALB / c mice immunized with the recombinant proteins were used as primary antibodies. As a secondary peroxidase conjugated anti-mouse antibody (Zymed).
  • FIGURE 01 PCR amplified DBPII cloning at the Eco RI and Xba I sites of plasmid pTopoTA.
  • FIGURE 02 Cloning of DBPII taken from pTopoTA with the EcoRI and Xbal enzymes at the pcDNA3.1HASS EcoRI and Xbal enzyme sites for addition of the HASS signal peptide. The same procedure was adopted for the three patients; AM, MT and PA.
  • FIGURE 03 (A) Schematic representation of the cloning site in pAdCMV-linLysl-HASS-DBP AM, MT and PA. (B) The CMV promoter and SV40 tail. DBP AM was cloned into the EcoRV site of this plasmid. The arrows indicate the position of the primers.
  • FIGURE 04 Scheme depicting homologous recombination occurred between pAdCMV-linLys-1 and pJM17 during transfection of HELYS293 cells for generation of DBPII-expressing adenoviruses.
  • FIGURE 05 DBPII cloning scheme in vector pPIC9Z used for transformation of P. pastoris yeast by electroporation. The cloned sequence in pAdCMV-linLys-1 will be removed by the EcoRI and Xoal enzymes thus displacing the HASS signal peptide sequence. DBPII will be cloned into pPIC9Z at the respective EcoRI and Xbal sites and will have as signal peptide the S. cerevisiae meeting-alpha factor present in the pPIC9z expression system. At the end of the DBPII sequence there will be six histidine residues.
  • FIGURE 06 Design of the recombinant vaccine protein highlighting its portions: "HASS” signal peptide amino acid sequence,
  • HBcAg amino acid sequence (aa 1 to 78 and thereafter aa 79 to 149) and CS protein derived epitopes. 1: repetitive portion, containing epitope B and T CD4
  • FIGURE 07 Plasmid pAdCMV-link-1 schema showing regions of homology to the Ad5 genome, cytomegalovirus promoter, polyadenylation site and cloning site.
  • FIGURE 08 (3): (A) Transfer plasmid for construction of recombinant MVA viruses.
  • GFP Green Protein
  • RFP Fluorescent Red Protein
  • FIGURE 09 A. Transfer vector pAdCMV-Link-1: Cytomegalovirus (CMV) promoter, Cloning Site, polyadenylation site (poly A), HAdV5 homology regions. mu: map unit.
  • FIGURE 10 Plasmid pJM17: contains the insert-modified human adenovirus genome (pBRX) in the E1 region, located between the Xba ⁇ sites.
  • FIGURE 11 Schematic representation of homologous recombination between the plasmid pAdCMV-HASS-MSP-1 19 and pJM17: homology regions pAdCMV-HASS-MSP-1 i 9 (Ad Ad 0-1 and 9 -16) undergo pairing and recombination with pJM17 and the expression cassette with MSP-1 19 is transferred into the genome of the adenovirus 5 E1 eliminating pBRx with the insert.
  • FIGURE 12 Schematic representation of the cloning site of pAdCMV-SP- 19 , SVV CMV promoter and poly A tail.
  • the sequence corresponding to HASS-MSP-I 19 is located between the Not ⁇ and Hind ⁇ site.
  • the location of the primers used is represented by arrows.
  • FIGURE 13 Selection of positive clone by digestion with restriction enzymes EcoRV and Hind ⁇ , and digestions of the same clone with enzymes SamHI, EcoRV and Hind ⁇ .
  • PM Promega 100bp molecular weight standard, 1: undigested clone, 2: SamHI-digested (387 bp), 3: Hind-digested (454bp), 4: EcoRV-digested (412bp), 5: digested with EcoRV and Hind (388bp).
  • FIGURE 14 Selection of positive clones by digestion with restriction enzymes EcoRV and Hind. Positive clones pAdCMV-MSP-1 19 show a fragment of 388pb. PM: 1kb Invitrogen. Channels 1 through 4: positive clones.
  • FIGURE 15 HASS cloning process in pAdCMV-MSP-1 19: 1: Positive Clone Digestion pAdCMV-HASS-MSP-1 19 Partial with Not ⁇ , yielding a fragment of 1200pb 2: Digestion of the same clone with EcoRV, yielding a 625bp fragment that has been deleted from the vector. 3: New clone pAdCMV-HASS-MSP- 19 , which, when digested with Not ⁇ , yields a 560 bp fragment corresponding to the sequence of HASS-MSP- 19 .
  • FIGURE 16 PCR and RT-PCR from DNA and viral RNA extracted from AdMSP-1 infected HEK293A 19 .
  • 400bp amplicons were obtained with MSP-1 19 specific primers (channels 1 to 4 - viral DNA and channels 9 to 12 - viral RNA) and 500bp amplicons were obtained with adenovirus E4 gene specific primers (channels 5 to 8 - viral DNA and channels 14 to 16-viral RNA).
  • rMSP-1 ig expressed in E. coli, CN: negative control
  • AdMSP-1 expressed by recombinant adenovirus.
  • Figure 18 MSP i 9 1 recombinant expressed in E. coli and the adenovirus detected by specific antibodies by western blot assay using sera from endemic area for malaria patients.
  • rMSP- 19 expressed in E. coli, CN: negative control
  • AdMSP-1 expressed by recombinant adenovirus.
  • FIGURE 19 A: Transfer vector pAdCMV-Link-1: Cytomegalovirus (CMV) promoter, Cloning Site, polyadenylation site (poly A), HAdV5 homology regions. m.u: map unit.
  • B HASS-AMA-1 cloned into pAdCMV-Link-1. The signal peptide was cloned at the BglW site, which after cloning this site was lost and AMA-1 was cloned at the EcoRV and Kpn ⁇ sites. * Enzyme sites used for HASS-AMA-1 cloning: BglW, EcoRV and Kpn.
  • FIGURE 20 Schematic representation of homologous recombination between plasmids pAdCMV-HASS-AMA-1 and pJM17: Homology regions in pAdCMV-HASS-AMA-1 (Ad 0-1 and Ad 9 -16) undergo pairing and recombination with pJM17 and the AMA-1 expression cassette is transferred to the adenovirus 5 genome, eliminating E1 with the pBR insert.
  • FIGURE 21 Selection of positive clones by digestion with restriction enzymes EcoRV and Kpn ⁇ . Positive clones have a 1431 bp fragment. PM: 1 kb promega, 1 to 4: pAdCMV-AMA-1 positive clones.
  • FIGURE 22 Schematic representation of the 717bp fragment from pAd32.1, which was inserted into pAdCMV-AMA-1, with the initial 92 bases corresponding to the HASS sequence.
  • FIGURE 23 BamH ⁇ and BglW restriction sites with compatible ends.
  • FIGURE 24 Selection of positive clones by Not ⁇ digestion. Positive clones have a 2200bp fragment. PM: 1kb promega, 2, 4: positive clones, 6: negative clone, 1, 3 and 5: undigested plasmid DNA of respective clones in channels 2, 4 and 6.
  • FIGURE 25 pAdCMV-AMA-1: 1 HASS cloning process: Digestion of partial pAdCMV-HASS-AMA-1 positive clone with Not ⁇ , yielding a 2200bp 2 fragment: Digestion of the same clone with Eco RV, yielding a 625bp fragment that was deleted from the vector. 3: New clone pAdCMV-HASS-AMA-1, which when digested with Not ⁇ yields a 1600bp fragment corresponding to the sequence of HASS-AMA-1.
  • FIGURE 26 PCR and RT-PCR from DNA and viral RNA extracted from AdAMA-1 infected HEK293A.
  • 500bp amplicons were obtained with adenovirus E4 gene specific primers (channels 1 to 3 - viral DNA and channels 4 to 7 - viral RNA) and 1, 4Kb amplicons were obtained with AMA-1 specific primers (channels 8 to 11 - viral DNA and channels 12 to 16 - viral RNA).
  • CP positive control
  • pAdCMVAMA-1 viral DNA
  • 3 negative control
  • 4 DNAse-treated RNA RT-PCR
  • 5 DNAse-treated RNA PCR
  • 6 CP: pAdCMVAMA -1
  • 7 CN
  • 8 Molecular weight standard 1 Kb Promega
  • 9 CP: pAdCMVAMA-1
  • 10 viral DNA
  • 11 CN
  • 12 DNAse-treated RNA RT-PCR
  • 13 RNA PCR DNAse-treated
  • 14 CN, 15: CP.
  • FIGURE 27 Recombinant AMA-1 expressed in E. coli and Adenovirus detected by specific antibodies using serum from animals immunized with AMA-1.
  • rAMA- 1 Expressed in E. coli
  • AdAMA-1 Expressed by adenovirus
  • CN Negative Control.

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Abstract

A presente invenção diz respeito à construção de seqϋências genéticas modificadas que compreendem seqϋências para antígenos (DBP-PA, DBP-AM, DBP-MT, AMA-1, CS e MSP-1) de Plasmodium vivax, as respectivas proteínas recombinantes codificadas pelas referidas seqϋências e vírus geneticamente modificados que expressam antígenos recombinantes. Além disso, a presente invenção se refere a um método de vacinação dose-reforço (prime-boost) que utiliza vetores adenovirais ou poxvirais, proteínas purificadas para imunização de mamíferos e composições vacinais ύteis para serem utilizadas como vacina contra malária.

Description

SEQUENCIAS GENETICAMENTE MODIFICADAS DE ANTÍGENOS DE PLASMODIUM VIVAX
A presente invenção diz respeito à construção de sequências genéticas modificadas que compreendem sequências para antígenos (DBP-PA, DBP-AM, DBP- MT, AMA-1 , CS e MSP-1) de Plasmodium vivax, as respectivas proteínas recombinantes codificadas pelas referidas sequências e vírus geneticamente modificados que expressam antígenos recombinantes. Além disso, a presente invenção se refere a um método de vacinação dose-reforço (prime-boost) que utiliza vetores adenovirais ou poxvirais, proteínas purificadas para imunização de mamíferos e composições vacinais úteis para serem utilizadas como vacina contra malária.
A malária é considerada pela OMS como uma das três doenças infecciosas mais importantes na atualidade e não há uma vacina licenciada contra a doença até o momento. Os parasitas causadores mais prevalentes no mundo são P. vivax e P. falciparum, sendo o primeiro o mais frequente no Brasil onde a malária é um sério problema de saúde pública agravado nos últimos anos pelo aumento no número de casos. Devido à grande diferença genética entre os dois parasitas é aceita a necessidade do desenvolvimento de vacinas diferenciadas. Muitas pesquisas apontam favoravelmente para a viabilidade de vacinas para malária. Os principais argumentos existentes que apoiam essa tese são: (i) já foi conseguida proteção completa em modelos animais, assim como no ser humano, utilizando esporozoítas irradiados; (ii) os adultos que moram em áreas endémicas têm menos malária que as crianças, sugerindo que é possível a indução de imunidade acumulativa por exposição repetitiva; (iii) os soros de pacientes adultos de áreas endémicas protegem outros adultos.
Vírus recombinantes têm se mostrado eficientes para o desenvolvimento de vacinas. Testes clínicos com candidatos de vacinas baseados em vírus recombinantes para malária, tuberculose e AIDS demonstram níveis sem precedentes de resposta imunológica celular contra os produtos recombinantes expressos pelos vírus, quando em comparação com formulações vacinais baseadas em proteínas recombinantes purificadas ou vacinas de DNA plasmidiais (ROCHA C„ CAETANO B., MACHADO A., BRUNA-ROMERO O. Recombinant viruses as tools to induce protective cellular immunity against infectious diseases. Int. Microbiol. 2004. 7, 89-94). Os vetores virais recombinantes são, na atualidade, veículos vacinais comprovadamente eficazes. Destes, os mais utilizados são os Poxvírus, vírus Influenza e Adenovirus, sendo que alguns estudos com este último encontram-se em fase avançada de testes clínicos para doenças como malária e AIDS.
Uma vantagem no uso de vírus recombinantes situa-se no fato de a própria partícula virai desempenhar um efeito adjunto por ela mesma, o que permite evitar o uso de outros compostos adjuvantes ou citocinas. Portanto, adenovirus recombinantes, vírus influenza, vírus vaccínia (MVA) destacam-se pela suas propriedades imuno-modulatórias (GUILLOT L, LE GOFFIC R., BLOCK S., ESCRIOU N., AKIRA S., CHIGNARD. M. SITAHAR M. Involvement of toll-like receptor 3 in the immune response of lung epithelial cells to double-stranded RNA and influenza A virus. J. Biol. Chem. 2003. 280, 5571-5580).
Os adenovirus humanos são capazes de estimular eficientemente a resposta imune, induzir a formação de células de memória, sendo o adenovirus sorotipo 5 considerado o mais imunogênico (Abbink, Peter; Lemckert, Angélique A. C; Ewald, Bonnie A.; Lynch, Diana M.; Denholtz, Matthew; Smits, Shirley; Holterman, Lennart; Damen, Irma; Vogels, Ronald; Thorner, Anna R.; 0'Brien, Kara L.; Carville, Angela; Mansfield, Keith G.; Goudsmit, Jaap; Havenga, Menzo J.; Barouch, Dan H. 2007. Comparative Seroprevalence and Immunogenicity of Six Rare Serotype Recombinant Adenovirus Vaccine Vectors from Subgroups B and D. J. Virol., 81 : 1-10). Na resposta imune adquirida, os adenovirus induzem a formação e liberação de anticorpos pelas células B (Wohlfart, Claes. 1988. Neutralization of Adenoviruses: Kinetics, Stoichiometry, and Mechanisms. J. Immunol., 62: 2321-2328), a ativação de células T CD4+ (Olive, Melanie; Eisenlohr, Laurence; Flomenberg, Neal; Hsu, Susan; Flomenberg, Phyllis. 2002. The Adenovirus Capsid Protein Hexon Contains a Highly Conserved Human CD4+ T-Cell Epitope. Hum. Gene Ther., 13: 1167 -1178) e células T CD8+ (Fitzgerald, Julie C; Gao, Guang-Ping; Reyes-Sandoval, Arturo; Pavlakis, George N.; Xiang, Zhi Q.; Wlazlo, Anthony P.; Giles-Davis, Wynetta; Wilson, James M.; Ertl, Hildegund G. C. 2003. Simian Replication-Defective Adenoviral Recombinant Vaccine to HIV-1 Gag. J. Immunol., 170:1416-1422).
A grande maioria das técnicas de construção de poxvírus recombinantes, entre os quais se inclui o vírus MVA (Vírus Vaccinia Ankara Modificado), envolve a recombinação homóloga de DNA em células infectadas. De uma forma geral, a produção de vírus recombinantes emprega vetores plasmidiais de transferência contendo um cassete de expressão onde o gene exógeno é controlado por um promotor forte, normalmente precoce e tardio, dos poxvírus. Este cassete é flanqueado por sequências de DNA homólogas à seqiiências presentes no genoma do vírus, e servirão para dirigir a recombinação ao lócus desejado. A taxa de recombinação é relativamente alta, em torno de 0,1%, e os vírus recombinantes podem ser selecionados, purificados em placa e amplificados.
Dentre as características que tornam os adenovírus candidatos ideais para desenvolvimento de vacinas estão: a baixa patogenicidade para seres humanos, a incapacidade de se integrar ao genoma do hospedeiro, a facilidade de purificação, resultando em altos títulos virais e a capacidade de infectar diversas células, incluindo as células dendríticas (Rocha, Carolina Damas; Caetano, Bráulia Costa; Machado, Alexandre Vieira; Brufia-Romero, Oscar. 2004. Recombinant viruses as tools to induce protective cellular immunity against infectious diseases. Int. Microbiol., 7: 83-94).
Dentre as características que favorecem a utilização do vírus vaccínia como vetor vacinai destacam-se: (i) genoma capaz de acomodar grandes fragmentos de DNA exógeno e expressar proteínas recombinantes, (ii) a replicação ocorre no citoplasma celular, o que impede que o genoma virai se integre ao material genético do hospedeiro, (iii) facilidade de purificação, (iv) capacidade de gerar linfócitos de longa duração específicos ao transgene inserido no seu genoma após uma única imunização (Rocha, Carolina Damas; Caetano, Bráulia Costa; Machado, Alexandre Vieira; Bruna-Romero, Oscar. 2004. Recombinant viruses as tools to induce protective cellular immunity against infectious diseases. Int. Microbiol., 7: 83-94).
Os protocolos homólogos são mais vantajosos do ponto de vista da construção da vacina, uma vez que, necessita-se desenvolver apenas um tipo de vacina (um único vetor a ser aplicado nas imunizações). Por sua vez, no protocolo heterólogo, precisa-se desenvolver duas vacinas, cada uma contendo um dos vetores a serem utilizados nas imunizações.
Vários autores têm sugerido que o reforço realizado no protocolo homólogo não é eficaz na reestimulação das células imunes específicas devido à imunidade preexistente gerada após a primeira imunização. O intervalo de seis ou oito semanas, utilizado na presente invenção, entre as duas imunizações (dose e reforço) demonstrou ser eficiente na reestimulação da resposta imune primária, induzida após a vacinação inicial, demonstrando que, depois desse tempo, a imunidade pré-existente diminuiu até níveis que permitem a ação de uma segunda dose de vacina.
O documento de patente WO07003384A1 descreve um novo uso de um antígeno malárico útil para imunização contra malária. Esta invenção se relaciona ao uso de antígenos esporozoítas, particularmente a proteína CS ou fragmentos imunogênicos derivados, combinado com adjuvantes adequados.
O documento de patente US20050100558A1 descreve métodos de vacinação para a geração de uma resposta imune antígeno-específica eficaz. Particularmente, a invenção descreve o uso de vetores de vacinação heterólogos para elicitar uma resposta imune potencializada. Métodos para o tratamento e a prevenção de doenças que utilizam o esquema de vacinação da presente invenção também são revelados.
O documento de patente WO06040334A1 descreve novos regimes vacinais baseados no esquema prime-boost. Foram utilizados vetores adenovirais recombinantes neutralizados que expressam antígenos de P. falciparum. Vacinas baseadas na tecnologia de DNA recombinante, juntamente com adjuvantes apropriados, também são descritos.
O documento de patente US20040131594A1 descreve métodos e reagentes para vacinação que são capazes de gerar uma resposta imune celular T CD8 contra antígenos maláricos, virais ou tumorais. Novos regimes vacinais são descritos e empregam uma composição inicial {prime) e outra potencializadora {boost). A composição potencializadora compreende a utilização de vetores poxvirais não- replicativos ou replicativo-deficientes que expressam, pelo menos, um epítopo celular T CD8 que também é presente na composição inicial.
O documento de patente US20060188527A1 um novo método para a proteção contra infecção malárica através de vacinação. A invenção compreende a indução de uma resposta inicial anti-malária através da utilização de vacina baseada em DNA e, sequencialmente, utiliza-se um imunização reforço através de vacina protéica.
Saccharomyces cerevisiae foi a primeira levedura utilizada com propósito de produzir proteínas exógenas devido ao conhecimento sobre esse organismo, além da aceitação para utilização dessa levedura em experiências para benefício humano (CREEG et al., 1993). Porém, o sistema de expressão em S. cerevisiae não atendeu todas às expectativas, em razão da ineficiência de secreção e produtividade, da hiperglicosilação, da instabilidade das cepas produtoras, das dificuldades em manter altas velocidades de crescimento e altas densidades populacionais das células recombinantes (SWINKELS et al., 1993). Vários estudos foram e estão sendo feitos no sentido de utilizar leveduras alternativas para a produção de proteínas recombinantes. Entre essas, Pichia pastoris, cujo sistema de expressão foi desenhado mostra-se como uma eficiente hospedeira para a síntese e secreção de proteínas heterólogas para aplicações clínicas, académicas ou industriais (COS et al, 2005). Pichia pastoris é uma levedura metilotrófica capaz de crescer até altas densidades celulares (na ordem de gramas por litro) e a concentração de proteínas recombinantes produzida é muitas vezes proporcional à biomassa alcançada (HINGGS, 1998). Vários exemplos mostram que Pichia pode alcançar rendimentos muito maiores que S. cerevisiae, E. coli ou baculovírus (CREGG, VEDVICK e RASCHKE, 1993; ROMANOS et ai., 1992). O sucesso do sistema Pichia está relacionado em grande parte ao promotor AOX1 do gene codificador para a enzima álcool oxidase que é reprimido no meio de cultura contendo glicerol, mas induzido quando as células são transferidas para um meio contendo metanol como única fonte de carbono (HINGGS, 1998; CREEG 1999; BOETTNER et al., 2002).
Uma vez que uma cópia do gene está integrada por célula transformada o aumento da densidade populacional aumenta o rendimento da proteína (CREEG et al., 1993). Além de atingir altas densidades populacionais P. pastoris detém outras vantagens como: a alta regulação pelo promotor AOX1 ; a baixa glicosilação (muitas vezes similar à glicosilação de proteínas humanas); a simplicidade da indução da expressão de proteínas por metanol; o baixo nível de secreção de proteínas nativas; além de crescer em meio simples ou definido, utilizando metanol como única fonte de carbono (CREEG et al., 1993; DIGAN et al., 1989; CHEN et al., 1996; NOHR et al., 2003; WITTAKER et al., 2004; COS, et al., 2005).
O meio de crescimento para P. pastoris na produção de proteínas recombinantes é definido, de baixo custo e ideal para produção em alta escala. O meio é livre de ingredientes complexos, que poderiam gerar toxinas, sendo por isso, facilmente aceito para emprego na produção de fármacos (CHEN et al., 1996; GELLISSEN et al., 2005).
Várias citocinas, vacinas e outros produtos biológicos estão em desenvolvimento, como a vacinas da hepatite B, comercializada na América do Sul. Atualmente, já existem alguns peptídeos de importância biotecnológica produzidos em Pichia como o fator 1 de crescimento tipo insulina (IGF-1) e HSA, em fase de produção e comercialização no tratamento de esclerose lateral amilotrófica e como substituto de soro, respectivamente. (WILLADSEN et al., 1995; CANALES et al., 1997; CEREGHINO, 2000).
Em vista dessas observações, somado ao fato de sistema P. pastoris secretar a proteína facilitando o processo de purificação da mesma, a expressão da DBPII de P. vivax por esse sistema pode ser uma das formas mais viáveis de se obter uma proteína biologicamente ativa permitindo sua utilização como antígeno no processo de imunização e com potencial de ser utilizada para uso humano.
Dessa forma, a imunização contra malária pode ser baseada na proteína de união ao antígeno Duffy nos eritrócitos que é chamado DARC e que tem especificidade ao seu ligante a Duffy-Binding Protein do plasmódio. Essa invasão eritrocítica envolve uma complexa cascata de eventos e necessita da interação específica entre receptores eritrocíticos e proteínas do parasito. Já foi relatado que a infecção por P. vivax é inteiramente dependente dessa interação da Duffy com o eritrócito humano. Há relatos que grande parte da população na África é resistente à infecção por P. vivax e isso se deve ao fato da população observada não possuir o receptor DARC, o que impede a interação covalente da DBP. Isso torna a DBP uma excelente candidata à vacina, uma vez que anticorpos dirigidos contra essa região poderiam bloquear a interação da DBP com o eritrócito em populações onde o P vivax é o principal causador de malária.
Em estudos estruturais, foi identificada que a região da DBP responsável pela ligação ao eritrócito compreende a região II da proteína. Essa região é rica em cisteína, o que garante sua conformação estrutural e também rica em polimorfismos, o que permite a evasão ao sistema imune do hospedeiro. Para fins de nomenclatura a região II da DBP de P. vivax tem sido descrita como PvDBPII.
Pesquisadores já expressaram a PvDBPII em sua conformação correta e com atividade funcional, ou seja, capaz de se ligar aos eritrócitos e reconhecer anticorpos anti-DBPII. No entanto, a proteína produzida quando utilizada em imunizações não conferiu proteção completa.
Alguns autores sugerem que a construção da proteína mais imunogênica poderia ser a partir da sequência conservada da PvDBPII, sugerindo que as regiões polimórficas distam-se do sítio de ligação da DBPII. No entanto, estudos do polimorfismo na sequência da PvDBPII encontrados na área endémica brasileira tem demonstrado que os sítios polimórficos situam-se próximos à região de ligação. Isso poderia sugerir que uma vacina contra a DBPII de P. Vax deveria abranger a região de polimorfismo, evitando assim, a evasão do plasmódio ao sistema imune.
O antígeno 1 da membrana apical (AMA-1) está presente em todas as espécies de Plasmodium (HODDER, A.N.; CREWTHER, P.E.; ANDERS, R.F. Specificity of the protective antibody response to apical membrane antigen 1. Infect. Immun. v 69, n°5; p.3286-3294, 2001). AMA-1 é armazenada no micronema após a síntese e subsequentemente translocada para a superfície do parasito via roptria ou durante a invasão da célula hospedeira.
Em todas as espécies de plasmódio, AMA-1 é sintetizada como uma proteína transmembrana de 66KDa, exceto para P. falciparum. É uma típica proteína integral com um ectodomínio N-terminal, uma região transmembrana e um pequeno domínio citoplasmático C-terminal (KOCKEN, C.H.M.; WITHERS-MARTINEZ, C; DUBBELD, MA; WEL, A.; HACKETT, F.; BLACKMAN, MJ; THOMAS, A.W. High-level expression of the malária blood-stage vaccine candidate Plasmodium falciparum apical membrane antigen 1 and induction of antibodies that inhibit er trocyte invasion. Infect. Immun. v.70, n°8; p.4471-4476, 2002).
Em todos os Plasmodium caracterizados, o gene AMA-1 apresenta 16 resíduos de Cys conservados no ectodomínio (PIZARRO, J.C.;NORMAND, B.V.; et al. Cristal structure of the malária vaccine candidate apical membrane antigen 1. Science, v.308, p.408-411 , 2005) e é dividido em três domínios definidos por 8 pontes dissulfeto (HODDER, A.N.; CREWTHER, P.E.; MATTHEW, M.L.S.M.; REID, G.E.; MORITZ, R.L.; SIMPSON, R.J.; ANDERS, R.F. The disulfide bond structure of Plasmodium apical membrane antigen-1. J. Biol. Chem. v 271 , n° 46; p.29446-29452, 1996).
A estrutura cristalográfica do ectodomínio de AMA-1 de P. vivax (PvAMA-1), correspondente aos resíduos Pro43 a Leu487 confirma a divisão em três domínios, e que os domínios I e II são estruturalmente similares a outras proteínas pertencentes a superfamília PAN, cujas proteínas têm função relacionadas a adesão e ligação a receptores ou a outras proteínas. Além disso, o domínio II possui uma região de desordem ou mobilidade, correspondente aos resíduos 295 a 334, denominada loop do domínio II (PIZARRO, J.C.; NORMAND, B.V.; et al. Cristal structure of the malária vaccine candidate apical membrane antigen 1. Science, v.308, p.408-411 , 2005).
Em P. falciparum, AMA-1 é produzida como um polipeptídeo de 83Kda que sofre processamento após a síntese em que um pequeno fragmento N-terminal é proteoliticamente clivado, dando origem a proteína madura de 62-Kda (CREWTHER, P.E.; CULVENOR, J.G.; SILVA, A.; COOPER, J.A.; ANDERS, R.F. Plasmodium falciparum: two antigens of similar size are located in different compartments of the rhoptry. Exp. Parasitol. v 70, n° 2, p. 193-206, 1990).
A capacidade desta molécula na indução da resposta imune protetora depende da estabilidade de sua conformação por pontes dissulfetos (HODDER, A.N.; CREWTHER, P.E.; MATTHEW, M.L.S.M.; REID, G.E.; MORITZ, R.L.; SIMPSON, R.J.; ANDERS, R.F. The disulfide bond structure of Plasmodium apical membrane antigen- 1. J. Biol. Chem. v 271 , n° 46; p.29446-29452, 1996), já que anticorpos inibitórios reagem preferencialmente com epítopos com conformação estabilizada por pontes dissulfeto (HODDER, A.N.; CREWTHER, P.E.; ANDERS, R.F. Specificity of the protective antibody response to apical membrane antigen 1. Infect. Immun. v 69, n° 5; p.3286-3294, 2001).
A sequência de AMA-1 é relativamente conservada entre as espécies de Plasmodium, com o nível de identidade das sequências de aminoácidos excedendo 50% em comparações entre todas as sequências conhecidas (CHENG.Q.; SAUL, A. Sequence analysis of the apical membrane antigen 1 (AMA-1) of de Plasmodium vivax. Mol. Biochem. Parasitol. v 65; p.183-187, 2004). Além disso, AMA-1 não apresenta seqiiências repetitivas e o polimorfismo encontrado em outros antígenos como MSP-1 e MSP-2 (ANDERS, R.F., SMYTHE, J.A. Polymorphic antigens in Plasmodium falciparum. Blood. v.74; p.1865-1875, 1989).
A função biológica de AMA-1 ainda não é conhecida, mas há evidências que esta proteína esteja envolvida no processo de invasão do eritrócito pelo merozoíto (KOCKEN, C.H.M.; WITH ERS-MARTI N EZ, C; DUBBELD, M.A.; WEL, A.; HACKETT, F.; BLACKMAN, M.J; THOMAS, A.W. High-level expression of the malária blood-stage vaccine candidate Plasmodium falciparum apical membrane antigen 1 and induction of antibodies that inhibit erytrocyte invasion. Infect. Immun. v.70, n°8; p.4471-4476, 2002, LI, F.; DLUZEWSKI, A.; COLEY, A.M.; THOMAS, A.; TILLEY, L; ANDERS, R.F.; FOLEY, M. Phage-displayed peptides bind to te malarial protein apical membrane antigen-1 and inhibit the merozoite invasion of host erythocytes. J. Biol. Chem. v 277, n°52; p.50303-50310, 2002).
Anticorpos monoclonais direcionados contra AMA-1 foram capazes de inibir a invasão de merozoitos, evidenciando que AMA-1 tem atuação no processo de invasão (CREWTHER et al., 1990). Mitchell e colaboradores (2004) sugerem que esta proteína é diretamente responsável pela reorientação dos merozoitos durante o processo de invasão ou que AMA-1 pode iniciar a junção de contato e que depende de proteínas de ligação Duffy para que o processo ocorra efetivamente (MITCHELL, G.H.; THOMAS, A.W.; MARGOS, G.; DLUZEWSKI, A.R.; BANNISTER, L.H. Apical membrane antigen 1 , a major malária vaccine candidate, mediates the dose attachment of invasive merozoites to host red blood cells. Infect. Immun. v 72, n°1 ; p.154-158, 2004).
AMA-1 está envolvida também na invasão de hepatócitos, a proteína deixa de ser expressa depois da invasão do hepatocito pelo esporozoíta e é re-expressa somente nos merozoítas. A inibição da invasão de esporozoítas por anticorpos anti- AMA-1 indica que AMA-1 pode ser considerada como potencial candidata a vacina multi-estágio da malária, sendo alvo tanto no estágio eritrócitico como no pré- eritrocítico (SILVIER, 0.;FRANETICH,J.F.;CHARRIN,S.;MUELLER,M.S. et al. A role for apical antigen 1 during invasion of hepatocytes by P. falciparum sporozoites. J. Biol. Chem. V. 279(10), p.9490-6, 2004).
Sabe-se que anticorpos contra AMA-1 são capazes de inibir a multiplicação do parasito in vitro e in vivo, quando interagem com a superfície de merozoítas. Estudos de vacinas com AMA-1 em modelos animais (camundongos e macacos) demonstraram que a imunização com esta proteína purificada ou recombinante induziu resposta imune protetora quando os animais foram desafiados com espécies de Plasmodium.
O fragmento de 19 Kda C-terminal da proteína é um dos principais candidatos à vacina. Vários trabalhos demonstram que é capaz de desencadear resposta imune protetora (KUMAR, S.; COLLINS, W.; EGAN, A.; YADAVA, A.; GARRAUD, O.; BLACKMAN, M.J.; PATINO, J.A.G.; DIGGS, C; KASLOW, D.C. Immunogenicity and efficacy in Aotus monkeys of four recombinant Plasmodium falciparum vaccines in multiple adjuvant formulations based on the 19-kilodalton C terminus of merozoite surface protein 1. Infect. Immun. v 68, n°4; p.2212-2223, 2000, STOWERS et al., 2002). MSP-1 de P. vivax (PvMSP119), semelhantemente a MSP-119 de outras espécies de Plasmodium estudadas, consiste de um par de domínios EGF-like (fator de crescimento epidermal) apresentando vários contatos interdomínios, e são alinhados de forma antiparalela uma a outra. Isto resulta em uma conformação em forma de U que deixa as extremidades C e N-terminal intimamentes próximas (BABON, J.J.; MORGAN, W. D.; KELLY.G.; ECCLESTON, J.F.HOLDER, A.A. Structural studies on P. vivax merozoite surface protein-1. Mol. Biochem. Parasitol. V.153,p.31- 40, 2007).
Cunha e colaboradores (2002) compararam as propriedades imunogênicas de proteínas recombinantes PvMSP-119 expressas em distintos vetores bacterianos. Neste estudo, os pesquisadores demonstraram que MSP-119 expressa pelo vetor pET (HIS6MSP-119) foi melhor reconhecida por anticorpos de indivíduos expostos a P. vivax e que a adição do epítopo PADRE (Pan-allelic DR epitopo) a HIS6MSP-1 i9 não alterou o reconhecimento desta proteína recombinante por anticorpos humanos. Estas proteínas foram imunogênicas em C57BU6, induzindo anticorpos específicos para MSP-119, assim como a presença de células T específicas para MSP-119 foi confirmada em ensaio de proliferação de LT ou secreção de IFN-γ (CUNHA, M.G.; RODRIGUES, M.M.; SOARES, I.S. Comparison of the immunogenic properties of recombinant proteins representing the Plasmodium vivax vaccine candidate MSP-119 expressed in distinct bacterial vectors. Vaccine. v.20, p.385-396, 2002).
Os principais obstáculos a serem vencidos para conseguir uma vacina efetiva contra a malária são: a correlação entre imunogenicidade e proteção, a complexidade do ciclo do plasmódio com grande variedade de antígenos estágio-específicos, a dificuldade de indução de respostas imunes celulares e a manutenção de respostas imunes celulares e humorais de duração prolongada (memória imunológica). Uma vacina multi-estágio, contendo antígenos específicos da formas parasitárias pré- eritrocíticas e eritrocíticas parece ser a alternativa mais eficiente para poder proteger contra a malária. A administração em protocolos de iniciação e reforço que induzem níveis elevados e simultâneos de imunidade celular e humoral de longa duração desses antígenos recombinantes, utilizando como veículos de imunização vírus recombinantes (adenovírus e/ou poxvírus) e proteínas recombinantes, são escolhas com maior probabilidade de proteger contra a malária.
Descrição detalhada da invenção
A presente invenção diz respeito à construção de sequências genéticas modificadas que compreendem seqCiências para antígenos (DBP-PA, DBP-AM, DBP- MT, AMA-1 , CS e MSP-1 ) de P. vivax, as respectivas proteínas recombinantes codificadas pelas referidas seqCiências e vírus geneticamente modificados que expressam antígenos recombinantes. Além disso, a presente invenção se refere a um método de vacinação dose-reforço (prime-boost) que utiliza vetores adenovirais ou poxvirais, proteínas purificadas para imunização de mamíferos e composições vacinais úteis para serem utilizadas como vacina contra malária.
A sequência genética da proteína de união ao antígeno Duffy - Duffy Binding Protein ou DBP - contra malária causada por P. vivax foi modificada. Além disso, descreve-se a construção de um adenovírus que secreta a proteína recombinante no meio extracelular devido a incorporação do peptídeo sinal HASS no vetor virai.
É importante mencionar que a construção é caracterizada pela combinação dos polimorfismos encontrados na população brasileira a fim de aumentar a cobertura vacinai. Para obter os polimorfismos foram utilizadas seqCiências de pacientes da área endémica brasileira. As seqCiências DBP-PA, DBP-MT e DBP-AM representam os três polimorfismos mais freqCientes da proteína DBP presentes no Brasil, e a administração conjunta destas sequências têm importância fundamental na indução de uma resposta vacinai protetora.
A análise de polimorfismos foi feita com base na sequência de SAL-I depositada no GenBank cujo acesso é: [Gi160275]. A sequência utilizada nesse trabalho tem como padrão a sequência Sal-I e inicia-se no aminoácido 232 e termina no 548. Para a construção do adenovírus o soro desses pacientes foi obtido e utilizado para amplificação por PCR utilizando oligonucleotídeos específicos. Os oligonuleotídeos utilizados inseriram sítios de restrição EcoRI e Xba\ respectivamente no início e no final da sequência. Após a amplificação os clones positivos foram clonados no pTOPOTA e analisados por digestão enzimática. Desse plasmídeo a sequência foi retirada com as enzimas de restrição cujos sítios foram incorporados à sequência durante a amplificação. O produto da digestão foi purificado e clonado no pcDNA3.1 HASS que contém o peptídeo sinal do vírus influenza que permite a secreção da proteína pelo adenovírus. A clonagem foi feita entre o sítio de EcoRI e Xba\ desse plasmídeo. Os clones positivos foram digeridos para obtenção da porção HASS-DBPII que foi clonada no pADCMV-linkl em fase ao promotor de expressão do citomegalovírus. Os clones positivos foram sequenciados para confirmar a inserção correta no plasmídeo. O pADCMVLinkl -HASS-DBPII foi utilizado para recombinar de forma homóloga com outro plasmídeo o pJM17. Esse fenómeno de recombinação ocorre durante a transfecção e permite a geração dos adenovírus 5.
Outra proteína recombinante foi obtida a partir da sequência de aminoácidos da proteína CS de P. vivax linhagem Belém (Gene Bank- acesso AAA29526). Foram escolhidos epítopos da proteína CS descritos pela literatura e estes foram inseridos em pontos estratégicos da proteína HBcAg como detalhado anteriormente (Fig. 6). Foi realizada a predição da conformação estrutural da proteína recombinante desenhada a fim de verificar a semelhança desta com a estrutura dos monômeros do HBcAg descrita anteriormente por Bõttcher et al. (1997). O resultado de tal predição foi fornecido pelo servidor Swiss-Pdb Viewer a partir da sequência de aminoácidos da proteína recombinante e revelou que apesar das inserções de aminoácidos exógenos- oriundos da proteína CS- a estrutura conformacional permanece a mesma.
A partir da sequência de aminoácidos desenhada, a sequência de nucleotídeos foi predita otimizando a escolha dos códons para o modelo humano. Foram também inseridos sítios de enzimas de restrição destinadas ao processo de clonagem para a construção do vírus recombinante. Com base na sequência gênica otimizada foi produzido um gene sintético pela empresa Entelechon (Fig. 7). No sítio Bgl\\/Nco\ do gene sintético foi clonada a sequência IRES. Os dois tipos de construção (HBc-CS e HBc-CS-IRES) foram clonados nos sítios Bgl\\IKpn\ do plasmídeo pAdCMV-link-1 (Fig. 8).
Os vírus recombinantes foram gerados pelo processo de recombinação homóloga em células HEK293A transfectadas com os plasmídeos pJM17 e pAdCMV- link-1 contendo o transgene. pJM17 contém o genoma do adenovírus humano tipo 5 modificado por uma inserção (pBRX) na região E1. pAdCMV-link-1 contém, flanqueando o sítio de clonagem, um promotor do Citomegalovirus (CMV), um sítio de poliadenilação (poly A) e regiões de homologia com o adenovírus humano tipo 5. As regiões de homologia no pAd-HBc-CS e pAd-HBc-CS-IRES (Ad 0-1 e Ad 9 -16) sofrem pareamento e recombinação com o pJM17 e o cassete de expressão com o transgene é transferido para o genoma do adenovírus 5, eliminando-se a inserção pBR.
Foi também desenvolvido um adenovírus humano tipo 5 não replicativo capaz de expressar, em células HEK293A, o antígeno vacinai MSP-119 de P. vivax (PvMSP- 119). A utilização de um vetor virai justifica-se pelo fato do mesmo induzir principalmente uma resposta imune celular e por atuar como adjuvante potencializando a resposta imune. Para a geração do Adenovírus recombinante (AdMSP-119), foi elaborada uma estratégia de clonagem do gene que codifica para MSP-119 de P. vivax no pAdCMV-Link-1. A proteína recombinante expressa pelo adenovírus corresponde a sequência dos aminoácidos 1616-1704 de MSP-1 de P. vivax, cepa BELÉM, e apresenta uma cauda de histidina na região N-terminal e na região C-terminal uma fusão com o epítopo CD4 universal PADRE (Pan Allelic DR Epitopo) (CUNHA et ai., 2002). Além disso, esta proteína recombinante também apresenta também um peptídeo sinal do vírus influenza (HASS) que permite a secreção da mesma no meio extracelular.
Outro antígeno vacinai expresso pelo adenovírus recombinante corresponde ao ectodomínio de AMA-1 de P. Vax, referente aos resíduos Pro43 a Leu487 do isolado BEL-12 de P. vivax, fusionado ao peptídeo sinal do vírus influenza (HASS) que permite direcionar a AMA-1 para o meio extracelular induzindo resposta imune humoral que leva a geração de anticorpos específicos. O vírus recombinante foi gerado por recombinação homóloga, sendo que foi inserido no genoma do adenovírus a região codificadora para ectodomínio de AMA-1 de P. vivax contido no vetor de transferência pAdCMV-Link-1. A proteína recombinante expressa pelo adenovírus corresponde a sequência dos aminoácidos 43 - 487 de AMA-1 de P. v/Vax do isolado BEL-12, proveniente de um paciente de Belém-PA, que foi obtida a partir do plasmídeo pHIS- AMA-1 (RODRIGUES, M.H.C.; RODRIGUES, K.M.; OLIVEIRA, T. R.; CÔMODO, A.N.; RODRIGUES, M.M.; KOCKEN, C.H.M.; THOMAS, A.W.; SOARES, I.S. Antibody response of naturally infected individuais to recombinant Plasmodium vivax apical membrane antigen-1. Int. J. Parasitol. v35, p185-192, 2005). Além disso, esta proteína recombinante apresenta também um peptídeo sinal do vírus influenza (HASS) que permite a secreção da mesma no meio extracelular. Para a geração do Adenovírus recombinante (AdAMA-1) foi elaborada uma estratégia de clonagem do gene que codifica para AMA-1 de P. vivax no pAdCMV-Link-1.
O adenovirus humano tipo 5 não replicativo é capaz de expressar, em células HEK293A, o antígeno vacinai AMA-1 de P. vivax (PvAMA-1). A utilização de um vetor virai justifica-se pelo fato do mesmo induzir principalmente uma resposta imune celular e por atuar como adjuvante potencializando a resposta imune. O antígeno vacinai expresso pelo adenovírus recombinante corresponde ao ectodomínio de AMA-1 de P. vivax, referente aos resíduos Pro43 a Leu487 do isolado BEL-12 de P. vivax, fusionado ao peptídeo sinal do vírus influenza (HASS) que permite direcionar a AMA-1 para o meio extracelular induzindo resposta imune humoral que leva a geração de anticorpos específicos.
O protocolo do tipo dose-reforço (do inglês prime-boost) da presente invenção é baseado na administração sequencial do vetor vacinai adenovírus recombinante (adenovírus humano tipo 5 ou HuAdS) e vírus vaccinia recombinante (cepas WR, Copenhage ou MVA) capazes de expressar uma proteína heteróloga comum ou estas proteínas administradas na sua forma recombinante purificada. O protocolo dose- reforço homólogo consiste na administração do mesmo vetor virai ou das proteínas recombinantes purificadas nas duas imunizações (Ad/Ad ou Prot/Prot) enquanto que o protocolo heterólogo caracteriza-se pela utilização de um vetor virai ou proteína recombinante na dose reforço que seja diferente do(a) administrado(a) na primeira dose (Ad/Vac, Ad/Prot, ou Prot/Ad). A dose-reforço pode ainda ser realizada utilizando-se proteínas antigênicas purificadas do patógeno após a administração de adenovírus ou vaccinia na dose inicial ou vice-versa. O intervalo entre as imunizações utilizado foi de 6 ou 8 semanas, nunca menor do que 35 dias em qualquer caso.
A seguir, aspectos da presente invenção serão descritos detalhadamente através de exemplos. É necessário frisar que a invenção não está limitada a esses exemplos, mas também inclui variações e modificações dentro dos limites nos quais ela funciona. Exemplo 1 - Construção de adenovírus recombinantes DBPII A partir da região II foram desenhados primers contendo sítios de restrição enzimática para as enzimas EcoRI e Xba\ que foram utilizadas para a inserção da sequência de interesse no vetor pPIC9Z para a trasnformação da levedura P. pastoris e também para inserção no pTopoTA e posterior clonagem no pcDNA3.1 HASS para obtenção do peptídeo sinal HASS do vírus influenza e em seguida a clonagem de HASS-DBPII no pAdCMV-linLysl . Esse último plasmídeo foi utilizado para recombinar de forma homóloga com o pJM17 para gerar os adenovírus expressando a DBPII. A sequência da DBPII obtida por PCR dos soros destes pacientes foi individualmente clonada nos plasmídeos e o mesmo procedimento foi adotado nas etapas de clonagens da DBPII.
Legenda:
Localização dos Sequência Identificação
nucleotídeos
1-103 ATG GAA Peptídeo sinal HASS
103-1083 GGT GAT SeqQência da DBPII
1091 TAA Códon de terminação
Exemplo 2 - Construção de adenovírus recombinantes CS
A construção de um adenovírus humano tipo 5 que expressa a proteína do cerne do vírus da hepatite B (HBcAg) com epítopos da proteína CS localizados em pontos específicos desta molécula é feita pela inclusão do epítopo B do P. vivax (GDRADGQPA) repetido três vezes no loop imunodominante do HBcAg, ou seja, entre os aminoácidos 78 e 79.
Na porção N-terminal do HBcAg se faz presente o peptídeo sinal da proteína hemaglutinina do vírus Influenza (peptídeo sinal HASS). A molécula HBcAg é truncada no aminoácido 149, onde se localiza um sítio interno de entrada de ribossomo (ou seja, uma sequência IRES).
Após esta, estão presentes várias porções da proteína CS do P. vivax que incluem epítopos B, TCD4 e TCD8. Tais porções estão dispostas em seis blocos separados por espaçadores de epítopos que facilitam o processamento destes pela célula, da seguinte forma: bloco 1 : aminoácidos de 1 a 23 da proteína CS amostra Belém, que compreende um epítopo TCD8 humano, entre a sequência de aminoácidos AAY (espaçador) de cada lado; bloco 2: aminoácidos 264 a 272, que compreende um epítopo TCD8 humano, flanqueado pelo espaçador AAY; bloco 3: aminoácidos 292 a 378, que compreende epítopos B, TCD4 e TCD8, flanqueado pelo espaçador AAY; bloco 4: epítopo TCD8 murino oriundo do citomegalovírus, flanqueado pelo espaçador AAY; bloco 5: aminoácidos 301 a 309, que compreendem um epítopo TCD8 humano, flanqueado pelo espaçador AAY; bloco 6: aminoácidos 51 a 90, que compreendem epítopos B e TCD4, flanqueados na porção N-terminal pelo espaçador GPGPG e na porção C-terminal por um códon de parada. Além disto, anteriormente ao peptídeo sinal HASS encontra-se um sítio da enzima de restrição Bam \ e, posteriormente ao códon de parada, sítios das enzimas Bam \ e Kpn\.
Exemplo 3 - Construção de vírus MVA modificado CS
Os plasmídeos de transferência consistem, basicamente, plasmídeos genéricos (tais como pUC19) aos quais são adicionadas porções gênicas denominadas Cassetes de Inserção e Expressão (Figura 6).
O cassete de inserção e expressão é descrito na Figura 6. No sentido 5' - 3', o cassete de inserção consiste de: Sequência nucleotídica homóloga à porção 5 'da Região de Deleção II e/ou Região de Deleção III do genoma de MVA (1 ); Promotor modificado precoce/tardio do vírus Vaccínia (2); gene codificador de proteína marcadora - Proteína Verde Fluorescente (GFP) ou proteína vermelha Fluorescente (RFP) (3); sítio de clonagem para o cDNA/Gene exógeno de interesse (4), Promotor modificado precoce/tardio do vírus Vaccínia (5); nucleotídica homóloga à porção 3'da Região de Deleção II e/ou Região de Deleção III do genoma de MVA (6).
Em seguida, os recombinantes são gerados através da transfecção dos plasmídeos de transferência em células de embrião de galinha (CEF) previamente infectadas pelo vírus MVA. Os vírus são selecionados e purificados em ciclos sucessivos de purificação de placa, seguido da amplificação do clone. Exemplo 4 - Iniciadores específicos para MSP-119
Um outro antígeno da invenção, obtido por tecnologia recombinante, foi a proteína MSP-1. A proteína 1 de superfície de merozoíta ( SP-1, Merozoite surface protein 1) é um antígeno do estágio eritrocítico dos parasitos do género Plasmodium. MSP-1 é sintetizada como uma proteína precursora de aproximadamente 190-Kda. Este precursor é depositado na superfície de merozoítas em desenvolvimento via âncora GPI (glycosylphosphatidylinositol). Durante a maturação dos merozoítas, MSP- 1 passa por um processo de clivagem proteolítica originando quatro fragmentos que permanecem associados não-covalentemente na superfície dos merozoítas. No momento da invasão do eritrócito, uma segunda clivagem separa o fragmento C- terminal de 19Kda do complexo protéico, e somente a porção ligada à membrana via âncora GPI é transferida para os novos eritrócitos infectados (KAUTH, C.W.; EPP, C; BUJARD, H.; LUTZ, R. The merozoite surface protein 1 complex of human malária parasite P. falciparum. T. J. Biol. Chem. v278, n° 25, p.22257-22264, 2003).
As sequências de genes que codificam para as proteínas MSP-119 de P. vivax foram amplificadas por PCR a partir de plasmídeo pET-MSP1 -PADRE, com os iniciadores senso 5' GCA GAT ATC CAT CAC CAT CAC CAT CAC e anti-senso 5' AAG CTT TTA AGC GGC AGC CTT CAG GGT. Os códons destacados são os sítios para as enzimas de restrição EcoRV e Hind\\\, respectivamente, e o códon sublinhado corresponde ao códon de terminação. As reações de PCR foram feitas com a enzima de alta fidelidade Pfx (Invitrogen), conforme as instruções do fabricante e nas seguintes condições de amplificação: um ciclo de 5min a 94°C, 38 ciclos de 40seg a 94°C, 45seg a 45°C e 1 :30min 68°C e um ciclo final de extensão de 4min a 68°C.
Exemplo 5 - Estratégia de clonagem (MSP-119) - Clonagem no pCR-Blunt II TOPO
Com iniciadores específicos para MSP-119 foi amplificado um fragmento de 399 pb a partir do pET-MSP-119-PADRE, que foi clonado no pCR-blunt II TOPO. Nesta clonagem foi criado o TOPO-MSP-119 e a figura 13 apresenta a seleção de clone positivo.
- Clonagem no pAdCMV-Linkl
Para a clonagem no pAdCMV-Link-1 , tanto o vetor quanto os clones TOPO- MSP-119 foram digeridos com EcoRV e Hind \\ . Após as digestões os fragmentos desejados foram purificados pelo kit Qiaquick gel extraction (QIAGEN). Em seguida foram clonados no vetor. Nesta clonagem foi criado o pAdCMV-MSP-119. Os clones positivos apresentam um fragmento de 388pb após digestão com EcoRV e Hind\\\, como demonstrado na figura 14.
- Clonagem do peptídeo sinal HASS no pAdCMV-MSP-1
O pAdCMV-MSP-119 foi digerido com BglW que lineariza o plasmídeo e o pAd32.1 foi digerido com BamHI originando um fragmento de 717pb. Após digestão os fragmentos foram então purificados e ligados conforme mencionado anteriormente. Nesta clonagem foi criado o pAdCMV-HASS-MSP-119 parcial. A triagem dos clones positivos foi feita com Not\, sendo que os clones positivos apresentam fragmentos de 1200pb, como mostra a figura 15.
- Digestão com EcoRV do pAdCMV-MSP-1 parcial
Clones positivos pAdCMV-HASS-MSP-1 i9 parcial foram digeridos com EcoRV para retirada das bases 625 bases adicionais. O plasmídeo linearizado foi, posteriormente, recortado do gel, purificado e com a T4 DNA ligase foi circularizado novamente, originando o pAdCMV-HASS-MSP-119. A seleção de clones positivos foi feita por digestão com Not\, conforme demonstrado na figura 15.
Exemplo 6 - PCR E RT-PCR de células HEK 293A infectadas com o adenovírus recombinante para confirmar a presença do transgene.
Amplificações de 400pb com os iniciadores específicos para MSP-1 i9 foram obtidas a partir de DNA e RNA extraídos de células HEK293A infectadas com o vírus recombinante AdMSP-119. Para o RNA total fez-se a reação de transcrição reversa e o cDNA originado foi tratado com DNAse. Além dos iniciadores específicos para MSP-1 utilizamos também iniciadores específicos para gene E4 de adenovírus que amplificam um fragmento de 500pb. Estas amplificações a partir de DNA virai e RNA virai indicam que o adenovírus recombinante está expressando a MSP-119. A figura 16 demonstra as amplificações.
Exemplo 7 - Detecção das proteínas recombinantes por anticorpos.
O extrato celular de HEK293A infectadas com adenovírus recombinante AdMSP-119 apresentou intensa reatividade com soro de camundongos BALB/c imunizados com MSP-119 pelo ensaio de western blot. Este resultado confirma a expressão de MSP-119 pelo AdMSP-1 i9. Os animais foram imunizados por via subcutânea com 200μΙ de emulsão Montanide ISA 720 (30:70 proteína/óleo) com 20μ9 de proteína AMA-1 purificada. Foram feitas duas imunizações com intervalo entre elas de 3 semanas, em cada imunização, foram aplicados 50μΙ em 4 pontos diferentes no dorso do animal, totalizando os 200μΙ. Os soros foram coletados com 14 dias após a última imunização. O mesmo extrato celular de HEK293 infectadas com adenovírus recombinante AdMSP-119 também apresentou reatividade com soro de pacientes de área endémica para malária. As figuras 17 e 18 demonstram a reatividade da proteína recombinante com soro murino e humano, respectivamente.
Exemplo 8 - Iniciadores específicos para AMA-1
As sequências de genes que codificam para as proteínas AMA-1 de P. vivax foram amplificadas por PCR a partir de plasmídeo pHIS-AMA-1 , com os iniciadores senso 5' GCA GAT ATC GGC AGC AGC CAT CAT CAT e anti-senso 5' GGT ACC TTA TAG TAG CAT CTG CTT GTT. Os códons em destaque são os sítios para as enzimas de restrição EcoRV e Kpn\, respectivamente, e o códon sublinhado corresponde ao códon de terminação. As reações de PCR foram feitas com a enzima de alta fidelidade Pfx (Invitrogen), conforme as instruções do fabricante e nas seguintes condições de amplificação: um ciclo de 5min a 94°C, 38 ciclos de 40seg a 94°C, 45seg a 45°C e 01h30min 68°C e um ciclo final de extensão de 4min a 68°C.
Exemplo 9 - Estratégia de clonagem
- Clonagem no pAdCMV-link 1.
Para a clonagem no pAdCMV-Linkl o produto de PCR correspondente a AMA-
1 e o plasmídeo foram digeridos com as enzimas de restrição EcoRV e Kpn\ (Figura 21). Após as digestões os fragmentos desejados foram purificados pelo kit Qiaquick gel extraction (QIAGEN). O produto da ligação foi utilizado para transformar bactérias XL-1 blue. Desta forma foi criado o pAdCMV-AMA-1 e figura 21 mostra a seleção de clones positivos.
- Clonagem do peptídeo sinal HASS no pAdCMV-AMA-1
Foi utilizado o pAd32.1 que contém o peptídeo sinal HASS. O pAdCMV-AMA-1 foi digerido com Bgl \ que lineariza o plasmídeo, e o pAd32.1 com BamH\, originando um fragmento de 717pb, sendo 92 bases correspondentes ao HASS e as 625 bases restantes serviram para facilitar a clonagem (Figura 22). Sg ll e SamHI possuem extremidades compatíveis, ou seja, extremidades geradas com Bgl II podem ser diretamente ligadas as extremidades de Bam \, mas seus sítios de restrição não são regenerados, conforme representado na figura 23.
Após digestão os fragmentos foram então purificados e ligados conforme mencionado anteriormente. Nesta clonagem foi criado o pAdCMV-HASS- AMA-1 parcial. A triagem dos clones positivos foi feita com Not\, sendo que os clones positivos apresentam fragmentos de 2200pb e clones negativos 1500pb. Na figura 24 mostra a seleção de clones positivos.
- Digestão com Eco RV do pAdCMV-HASS- AMA-1 parcial
Os clones positivos pAdCMV-HASS-AMA-1 foram digeridos com EcoRV para retirada das 625 bases adicionais. O fragmento maior de 8176 bases foi recortado do gel de agarose para purificação com kit Qiaquick gel extraction (QIAGEN). O plasmídeo linearizado foi religado com a T4 DNA ligase, originando o pAdCMV-HASS- AMA-1. Assim, nesta clonagem foi criado o pAdCMVHASS-AMA-1. A figura 25 demonstra esta etapa de clonagem.
Exemplo 10 - PCR e RT-PCR a partir de células HEK 293 infectadas com os adenovirus recombinantes para confirmar a presença do transgene
Amplificações de 1 ,4kb com os iniciadores específicos para AMA-1 foram obtidas a partir de DNA e RNA extraídos de células HEK293A infectadas com o vírus recombinante AdAMA-1. Para o RNA total fez-se a reação de transcrição reversa e o cDNA originado foi tratado com DNAse. Além dos iniciadores específicos para AMA-1 utilizamos também iniciadores específicos para gene E4 de adenovirus que amplificam um fragmento de 500pb. Estas amplificações a partir de DNA virai e RNA virai indicam que o adenovirus recombinante está expressando a AMA-1. A figura 26 demonstra as amplificações.
Exemplo 11 - Detecção das proteínas recombinantes por anticorpos
A detecção das proteínas recombinantes por anticorpos foi feita por western blot. Foram utilizados como anticorpos primários soro de camundongos BALB/c imunizados com as proteínas recombinantes. Como anticorpo secundário anti- camundongo conjugado a peroxidase (Zymed).
O extrato celular de células HEK293A infectadas com adenovirus recombinante AdAMA-1 apresentou intensa reatividade com soro de camundongos BALB/c imunizados com AMA-1. Este resultado confirma a expressão de AMA-1 pelo AdAMA- 1. Os animais foram imunizados por via subcutânea com 200μΙ de emulsão Montanide ISA 720 (30:70 proteína/óleo) com 20μg de proteína AMA-1 purificada. Foram feitas duas imunizações com intervalo entre elas de 3 semanas, em cada imunização, foram aplicados 50μΙ em 4 pontos diferentes no dorso do animal, totalizando os 200μΙ. Os soros foram coletados com 14 após a última imunização. A figura 27 apresenta a reatividade de AMA-1, expressa em E. colie e AdAMA-1, com soro murino.
Breve descrição das figuras
FIGURA 01 : Clonagem de DBPII amplificada por PCR nos sítios de EcoRI e Xba\ do plasmídeo pTopoTA. FIGURA 02: Clonagem de DBPII retirada do pTopoTA com as enzimas EcoRI e Xbal nos sítios enzimáticos de EcoRI e Xbal do pcDNA3.1HASS para adição do peptídeo sinal HASS. O mesmo procedimento foi adotado para os três pacientes; AM, MT e PA.
FIGURA 03: (A) Representação esquemática do sítio de clonagem no pAdCMV- linLysl -HASS-DBP AM, MT e PA. (B) O promotor CMV e cauda do SV40. DBP AM foi clonada no sítio de EcoRV desse plasmídeo. As setas indicam a posição dos iniciadores.
FIGURA 04: Esquema representando a recombinação homóloga ocorrida entre pAdCMV-linLys-1 e pJM17 durante a transfecção das células HELYS293 para a geração dos adenovírus expressando a DBPII. FIGURA 05: Esquema de clonagem de DBPII no vetor pPIC9Z utilizado para a transformação da levedura P. pastoris por eletroporação. A sequência clonada no pAdCMV-linLys-1 será retirada através das enzimas EcoRI e Xoal dispensando assim a sequência do peptídeo sinal HASS. A DBPII será clonada no pPIC9Z nos respectivos sítios EcoRI e Xbal e terá como peptídeo sinal o fator meeting-alfa de S. cerevisiae presente no sistema de expressão pPIC9z. Ao final da sequência da DBPII haverão seis resíduos de histidina.
FIGURA 06 (1): Desenho da proteína recombinante vacinai evidenciando suas porções: Sequência de aminoácidos do peptídeo-sinal "HASS",
Sequência de aminoácidos do HBcAg (aa 1 a 78 e, posteriormente, aa 79 a 149) e Epítopos derivados da proteína CS. 1 : porção repetitiva, contendo epiotpo B e T CD4
2: peptídeo-sinal da proteína CS (epitopo T CD8- aa 1 a 23)
3: epitopo T CD8 específico para o alelo HLA-B35- aa 264 a 272
4: porção C-terminal da proteína CS- aa 292 a 378 (epitopos B, T CD4 e T CD8)
5: epitopo T CD8 murino
6: epitopo T CD8 específico para o alelo HLA-A2- aa 301 a 309
7: porção N-terminal da proteína CS- aa 51 a 90 (epitopos B e T CD4)
*: stop-códon FIGURA 07 (2): Esquema do plasmídeo pAdCMV-link-1 evidenciando as regiões de homologia com o genoma do Ad5, o promotor do citomegalovírus, o sítio de poliadenilação e o sítio de clonagem.
FIGURA 08 (3): (A) Plasmídeo de transferência para construção dos vírus MVA recombinantes. B) Detalhe do cassete de inserção e expressão contendo os seguintes elementos gênicos: Sequência nucleotídica homóloga à porção 5'da Região de Deleção II e/ou Região de Deleção III do genoma de MVA (1); Promotor modificado precoce/tardio do vírus Vaccínia (2); gene codificador de proteína marcadora - Proteína Verde Fluorescente (GFP) ou proteína vermelha Fluorescente (RFP) (3); sítio de clonagem para o cDNA/Gene exógeno de interesse (4), Promotor modificado precoce/tardio do vírus Vaccínia (5); nucleotídica homóloga à porção 3'da Região de Deleção II e/ou Região de Deleção III do genoma de MVA (6) .
FIGURA 09: A. Vetor de transferência pAdCMV-Link-1 : promotor do Citomegalovírus (CMV), Sítio de clonagem, sítio de poliadenilação (poly A), regiões de homologia com HAdV5. m.u: unidade de mapa. B. HASS-MSP-119 clonado no pAdCMV-Link-1. O peptídeo sinal foi clonado no sítio de Bgl II, que após a clonagem este sítio foi perdido e MSP-I 19 foi clonada nos sítios de EcoRV e Hind\\\. * Sítios de enzimas utilizados para clonagem de HASS-MSP-1 : BglW, EcoRV e Hind\\\.
FIGURA 10: Plasmídeo pJM17: contém o genoma do adenovírus humano tipo 5 modificado por uma inserção (pBRX) na região E1 , localizado entre os sítios de Xba\. FIGURA 11 : Representação esquemática da recombinação homóloga entre os plasmídeos pAdCMV-HASS-MSP-119 e o pJM17: as regiões de homologia no pAdCMV-HASS-MSP-1 i9 (Ad 0-1 e Ad 9 -16) sofrem pareamento e recombinação com o pJM17 e o cassete de expressão com MSP-119 é transferido para o genoma do adenovírus 5, eliminando-se E1 com a inserção pBRx.
FIGURA 12: Representação esquemática do sítio de clonagem do pAdCMV- SP-1 9, promotor CMV e cauda poli A do SV40. A sequência correspondente a HASS-MSP-I 19 localiza-se entre o sítio de Not\ e Hind\\\. A localização dos iniciadores utilizados está representada por setas.
FIGURA 13: Seleção de clone positivo por digestão com as enzimas de restrição EcoRV e Hind \\, e digestões do mesmo clone com as enzimas SamHI, EcoRV e Hind\\\. PM: Padrão de peso molecular 100pb Promega, 1 : clone não digerido, 2: digerido com SamHI (387 pb), 3: digerido com Hind\\\ (454pb), 4: digerido com EcoRV (412pb), 5: digerido com EcoRV e Hind\\\ (388pb).
FIGURA 14: Seleção de clones positivos por digestão com as enzimas de restrição EcoRV e Hind\\\. Clones positivos pAdCMV-MSP-119 apresentam um fragmento de 388pb. PM:1kb Invitrogen. Canaletas 1 a 4: clones positivos. FIGURA 15: Processo de clonagem do HASS no pAdCMV-MSP-119: 1 : Digestão de clone positivo pAdCMV-HASS-MSP-119 parcial com Not\, originando um fragmento de 1200pb 2: Digestão do mesmo clone com EcoRV, originando um fragmento de 625pb que foi eliminado do vetor. 3:Novo clone pAdCMV-HASS-MSP-1 i9, que ao ser digerido com Not\ origina um fragmento com 560pb, correspondente a sequência de HASS- MSP-119.
FIGURA 16: PCR e RT-PCR a partir de DNA e RNA virai extraídos de HEK293A infectadas com AdMSP-119. Amplicons de 400pb foram obtidos com iniciadores específicos para MSP-119 (canaletas 1 a 4 - DNA virai e canaletas 9 a 12 - RNA virai) e amplicons de 500pb foram obtidos com iniciadores específicos para o gene E4 de adenovírus (canaletas 5 a 8 - DNA virai e canaletas 14 a 16 -RNA virai). PM: 100pb Promega, 1 : CP (controle positivo):pAdCMVMSP-119, 2:DNA diluído 1 :5, 3: DNA diluído 1:10, 4:CN (controle negativo), 5: CP: pAdCMVMSP-119, 6:DNA diluído 1 :5, 7: DNA diluído 1 :10, 8:CN, 9: CP: pAdCMVMSP-119, 10: cDNA não diluído 11 : cDNA diluído1 :5, 12: cDNA diluído 1 :10, 13:CN, 14:cDNA diluído 1 :5, 15: cDNA diluído 1 :10, 16:CN FIGURA 17: MSP- 1 9 recombinante expressa em E. coli e pelo Adenovirus detectada por anticorpos específicos pelo ensaio de western blot utilizando soro de animais imunizados com MSP-119. rMSP-1 ig : expressa em E. coli, CN: controle negativo, AdMSP-1 : expressa pelo adenovirus recombinante. FIGURA 18: MSP- 1 i9 recombinante expressa em E. coli e pelo Adenovirus detectada por anticorpos específicos pelo ensaio de western blot utilizando soro de pacientes de área endémica para malária. rMSP-1 9 :expressa em E. coli, CN: controle negativo, AdMSP-1 : expressa pelo adenovirus recombinante.
FIGURA 19: A: Vetor de transferência pAdCMV-Link-1 : promotor do Citomegalovirus (CMV), Sítio de clonagem, sítio de poliadenilação (poly A), regiões de homologia com HAdV5. m.u: unidade de mapa. B. HASS-AMA-1 clonado no pAdCMV-Link-1. O peptídeo sinal foi clonado no sítio de BglW, que após a clonagem este sítio foi perdido e AMA-1 foi clonada nos sítios de EcoRV e Kpn\. * Sítios de enzimas utilizados para clonagem de HASS- AMA-1 : BglW , EcoRV e Kpn\. FIGURA 20: Representação esquemática da recombinação homóloga entre os plasmídeos pAdCMV-HASS-AMA-1 e o pJM17: as regiões de homologia no pAdCMV- HASS-AMA-1 (Ad 0-1 e Ad 9 -16) sofrem pareamento e recombinação com o pJM17 e o cassete de expressão com AMA-1 é transferido para o genoma do adenovirus 5, eliminando-se E1 com a inserção pBR. FIGURA 21 : Seleção de clones positivos por digestão com as enzimas de restrição EcoRV e Kpn\. Clones positivos apresentam um fragmento de 1431 pb. PM:1 kb promega, 1 a 4: clones positivos pAdCMV-AMA-1.
FIGURA 22: Representação esquemática do fragmento de 717pb do pAd32.1 , que foi inserido no pAdCMV-AMA-1 , sendo que as 92 bases iniciais correspondem a sequência HASS.
FIGURA 23: Sítios de restrições de BamH\ e BglW com extremidades compatíveis.
FIGURA 24: Seleção de clones positivos por digestão com Not\. Clones positivos apresentam um fragmento de 2200pb. PM: 1kb promega, 2, 4: Clones positivos, 6: clone negativo, 1 , 3 e 5: DNA plasmidial não digerido dos respectivos clones nas canaletas 2, 4 e 6. FIGURA 25: Processo de clonagem do HASS no pAdCMV-AMA-1 : 1 : Digestão de clone positivo pAdCMV-HASS-AMA-1 parcial com Not\, originando um fragmento de 2200pb 2: Digestão do mesmo clone com Eco RV, originando um fragmento de 625pb que foi eliminado do vetor. 3:Novo clone pAdCMV-HASS-AMA-1 , que ao ser digerido com Not\ origina um fragmento com 1600pb, correspondente a sequência de HASS- AMA-1.
FIGURA 26: PCR e RT-PCR a partir de DNA e RNA virai extraídos de HEK293A infectadas com AdAMA-1. Amplicons de 500pb foram obtidos com iniciadores específicos para o gene E4 de adenovírus (canaletas 1 a 3 - DNA virai e canaletas 4 a 7 - RNA virai) e amplicons de 1 ,4Kb foram obtidos com iniciadores específicos para AMA-1 (canaletas 8 a 11 - DNA virai e canaletas 12 a 16 - RNA virai). 1 :CP (controle positivo) : pAdCMVAMA-1 , 2: DNA virai, 3: CN (controle negativo), 4: RT-PCR de RNA tratado com DNAse, 5: PCR de RNA tratado com DNAse, 6: CP: pAdCMVAMA-1 , 7: CN, 8:Padrão de peso molecular 1 Kb Promega, 9: CP: pAdCMVAMA-1 , 10: DNA virai, 11 : CN, 12: RT-PCR de RNA tratado com DNAse, 13: PCR de RNA tratado com DNAse, 14: CN, 15: CP.
FIGURA 27: AMA-1 recombinante expressa em E. coli e pelo Adenovírus detectadas por anticorpos específicos utilizando soro de animais imunizados com AMA-1. rAMA- 1 (Expressa em E. coli), AdAMA-1 (Expressa pelo adenovírus), CN:Controle negativo.

Claims

REIVINDICAÇÕES
1 - SEQUÊNCIAS GENETICAMENTE MODIFICADAS DE ANTÍGENOS DE PLASMODIUM VIVAX, caracterizada pela sequência de DNA ser selecionada do grupo compreendendo Seq. ID n°(1), Seq. ID n°(2), Seq. ID n°(3), Seq. ID n°(4), Seq. ID n°(5) e Seq. ID n°(6).
2 - PROTEÍNA RECOMBINANTE DBP MSP-1 AMA-1 CS caracterizada pela sequência de aminoácidos ser selecionada do grupo compreendendo a Seq. ID n°(1), Seq. ID n°(2), Seq. ID n°(3), Seq. ID n°(4), Seq. ID n°(5) e Seq. ID n°(6).
3 - VÍRUS GENETICAMENTE MODIFICADOS QUE EXPRESSAM ANTÍGENOS RECOMBINANTES caracterizados por compreender a expressão das Seq. ID n°(1),
Seq. ID n°(2), Seq. ID n°(3), Seq. ID n°(4), Seq. ID n°(5) e Seq. ID n°(6) isoladas ou em conjunto.
4 - VÍRUS GENETICAMENTE MODIFICADOS QUE EXPRESSAM ANTÍGENOS RECOMBINANTES de acordo com a reivindicação 3, caracterizados pelo vírus ser selecionado de um grupo compreendendo adenovírus e/ou poxvírus.
5 - VÍRUS GENETICAMENTE MODIFICADOS QUE EXPRESSAM ANTÍGENOS RECOMBINANTES, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo adenovírus humano compreender o sorotipo 5.
6 - VÍRUS GENETICAMENTE MODIFICADOS QUE EXPRESSAM ANTÍGENOS RECOMBINANTES, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo vírus vaccínia compreender a cepa WR ou a cepa Copenhage, vírus Ankara modificado (MVA) ou outra cepa de Poxvírus.
7 - COMPOSIÇÃO VACINAL PARA MALÁRIA caracterizada por compreender proteínas antigênicas recombinantes purificadas definidas na reivindicação 2 e/ou vírus geneticamente modificados que expressam os antígenos recombinantes definidos nas reivindicações 3-6 e no mínimo mais um carreador fisiologicamente aceitável.
8 - COMPOSIÇÃO VACINAL PARA MALÁRIA, de acordo com as reivindicação 7, caracterizada por poder ser co-administrada ou sequencialmente administrada com outras composições terapêuticas, vacinais, antigênicas ou imunológicas.
9 - COMPOSIÇÃO VACINAL PARA MALÁRIA, de acordo com 8, caracterizada por poder ser co-administrada ou sequencialmente administrada com outras substâncias como interleucinas ou ligantes CD em quantidade suficiente para potencializar as respostas imunes CD8+ e/ou CD4+.
10 - COMPOSIÇÃO VACINAL PARA MALÁRIA, caracterizada por ser administrada pelas vias oral, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, transdérmica ou como dispositivos que possam ser implantados ou injetados.
11 - COMPOSIÇÃO VACINAL PARA MALÁRIA, de acordo com as reivindicações 7 a 10, caracterizado por ser para preparação de medicamentos para prevenir malária.
12 - MÉTODO DE VACINAÇÃO PARA MALÁRIA QUE UTILIZA VÍRUS RECOMBINANTES, caracterizado por utilizar os vírus adenovírus humano e/ou poxvírus e/ou proteínas recombinantes através de um protocolo dose-reforço.
13 - MÉTODO DE VACINAÇÃO PARA MALÁRIA QUE UTILIZA VÍRUS RECOMBINANTES de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por utilizar duas imunizações sequenciais.
14 - MÉTODO DE VACINAÇÃO PARA MALÁRIA QUE UTILIZA VÍRUS RECOMBINANTES, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pela imunização inicial compreender a utilização de adenovírus humano sorotipo 5 ou proteínas recombinantes e a imunização de reforço compreender a utilização de adenovírus humano sorotipo 5 ou vírus vaccínia da cepa WR ou da cepa Copenhage ou Ankara modificado (MVA) ou outra cepa de Poxvírus ou proteínas recombinantes purificadas . 15 - MÉTODO DE VACINAÇÃO PARA MALÁRIA QUE UTILIZA VÍRUS RECOMBINANTES, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo intervalo entre as duas imunizações compreender um período de 6 a 8 semanas.
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