CN102575256A - 编码间日疟原虫抗原的经遗传修饰的序列 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及经修饰的遗传序列(包括间日疟原虫的抗原序列(DBP-PA、DBP-AM、DBP-MT、AMA-1、CS和MSP-1))的构建、由所述序列编码的相应重组蛋白质以及表达这些重组抗原的经遗传修饰的病毒。另外，本发明还涉及使用腺病毒或痘病毒载体的初免-加强接种方法、用于哺乳动物免疫接种的纯化的蛋白质以及待用作针对疟疾的疫苗的疫苗组合物。
Description
本发明涉及经修饰的遗传序列(包括用于间日疟原虫(Plasmodiumvivax)的抗原(DBP-PA、DBP-AM、DBP-MT、AMA-1、CS和MSP-1)的序列)的构建、由提到的序列编码的相应重组蛋白质以及表达这些重组抗原的经遗传修饰的病毒。除此以外，本发明还涉及利用腺病毒或痘病毒载体的初免-加强(prime-boost)接种方法、针对免疫接种哺乳动物纯化的蛋白质以及待用作针对疟疾的疫苗的数种可能的疫苗组合物。
WHO认为疟疾是目前三种主要的传染性疾病之一，并且到目前为止尚无经许可的抗该疾病的疫苗。世界上最流行的寄生虫是间日疟原虫和恶性疟原虫(P.falciparum)，前者在巴西最常见，在巴西，疟疾是一个严重的公共卫生问题。过去数年中病例数目的增加加剧了巴西的疟疾情况。由于两种寄生虫之间存在巨大的遗传差异，因此需要不同的疫苗。数项研究支持了疟疾疫苗是可行的的想法。支持该论点的主要论据是：(i)利用经辐照的子孢子已在动物模型和人类中实现完全保护；(ii)居住在流行地的成人比儿童更少受到疟疾侵袭，提示通过重复的暴露引起免疫力累积是可能的；(iii)流行地的成人患者的血清保护其他成人。
重组病毒已证明对疫苗的开发是有效的。用于疟疾、结核病和艾滋病的基于重组病毒的疫苗候选者的临床试验显示出前所未有的针对由病毒表达的重组产物的细胞免疫应答水平。这些水平与以纯化的重组蛋白为基础的疫苗配方或DNA质粒疫苗相比要高得多(ROCHAC.，CAETANO B.，MACHADO A.，BRUNA-ROMERO O.Recombinantviruses as tools to induce protective cellular immunity against infectiousdiseases(作为引起抗传染病的保护性细胞免疫的工具的重组病毒).Int.Microbiol.2004.7，89-94)。
目前，已证实重组病毒载体是有效的疫苗媒介。在那些证实有效的病毒载体中，痘病毒、流感病毒和腺病毒是最常使用的。涉及后者的一些研究处于疾病例如疟疾和艾滋病的临床试验的晚期。
使用重组病毒的优点之一在于以下事实：病毒颗粒本身对其自身发挥佐剂作用，不需要使用其它佐剂化合物或细胞因子。因此，腺病毒重组体、流感病毒和痘/痘苗病毒以其免疫调节性质脱颖而出(GUILLOT L.，LE GOFFIC R.，BLOCK S.，ESCRIOU N.，AKIRA S.，CHIGNARD.M.SITAHAR M.Involvement of toll-like receptor 3in theimmune response of lung epithelial cells to double-stranded RNA andinfluenza A virus(toll样受体3参与肺上皮细胞对双链RNA和甲型流感病毒的免疫应答).J.Biol.Chem.2003.280，5571-5580)。
人腺病毒可有效地刺激免疫应答并引起记忆细胞形成；并且腺病毒血清型5被认为是最具免疫原性的病毒之一(Abbink，Peter；Lemckert，Angelique A.C.；Ewald，Bonnie A.；Lynch，Diana M.；Denholtz，Matthew；Smits，Shirley；Holterman，Lennart；Damen，Irma；Vogels，Ronald；Thorner，Anna R.；O’Brien，Kara L.；Carville，Angela；Mansfield，Keith G.；Goudsmit，Jaap；Havenga，Menzo J.；Barouch，DanH.2007.Comparative Seroprevalence and Immunogenicity of Six RareSerotype Recombinant Adenovirus Vaccine Vectors from Subgroups Band D(六种来自亚组B和D的罕见血清型重组腺病毒疫苗载体的血清阳性率和免疫原性的比较).J.Virol.，81：1-10)。在获得性免疫应答中，腺病毒通过B细胞(Wohlfart，Claes.1988.Neutralization ofAdenoviruses：Kinetics，Stoichiometry，and Mechanisms(腺病毒的中和：动力学、化学计量和机制).J.Immunol.，62：2321-2328)、T CD4+细胞活化(Olive，Melanie；Eisenlohr，Laurence；Flomenberg，Neal；Hsu，Susan；Flomenberg，Phyllis.2002.The Adenovirus Capsid Protein HexonContains a Highly Conserved Human CD4+T-Cell Epitope(腺病毒衣壳蛋白六邻体包含高度保守的人CD4+T细胞表位).Hum.Gene Ther.，13：1167-1178)和T CD8+细胞(Fitzgerald，Julie C.；Gao，Guang-Ping；Reyes-Sandoval，Arturo；Pavlakis，George N.；Xiang，Zhi Q.；Wlazlo，Anthony P.；Giles-Davis，Wynetta；Wilson，James M.；Ertl，Hildegund G.C.2003.Simian Replication-Defective Adenoviral Recombinant Vaccineto HIV-1 Gag(抗HIV-1 Gag的猿猴复制缺陷型腺病毒重组疫苗).J.Immunol.，170：1416-1422)，来引起抗体的形成和释放。
大多数重组痘病毒(其中包括Western Reserve(WR)、Copenhage和MVA(经修饰的痘苗病毒Ankara)毒株)的构建技术包括穿梭质粒和受感染细胞中的原始病毒之间的同源DNA重组。一般而言，利用包含表达盒的质粒转移载体产生重组病毒，在表达盒中，外源基因通常由早期和晚期痘病毒的强启动子控制。该盒侧接与病毒基因组中存在的序列同源的DNA序列，并且该盒可用于引导重组体到需要的基因座。重组率较高，为约0.1％，并且重组病毒可经平板选择、纯化并扩增。
在使腺病毒成为疫苗开发的理想候选者的特征中的是：对人类具有低致病性、不能整合到宿主基因组中以及容易纯化，导致高病毒效价以及感染数种细胞包括树突细胞(dentritic cell)的能力(Rocha，Carolina Damas；Caetano，Braulia Costa；Machado，Alexandre Vieira；Oscar.2004.Recombinant viruses as tools to induceprotective cellularimmunity against infectious diseases(作为引起抗传染病的保护性细胞免疫的工具的重组病毒).Int.Microbiol.，7：83-94)。
在支持使用痘/痘苗病毒作为疫苗载体的特征中的是：(i)能够容纳大片段外源DNA并表达重组蛋白的基因组，(ii)复制发生在细胞的细胞质中，防止病毒基因组整合到宿主遗传物质中，(iii)容易纯化，(iv)能够在单次免疫接种后产生对插入其基因组的转基因特异的持久的淋巴细胞(Rocha，Carolina Damas；Caetano，Braulia Costa；Machado，Alexandre Vieira；
Oscar.2004.Recombinant viruses astools to induce protective cellular immunity against infectious diseases(作为引起抗传染病的保护性细胞免疫的工具的重组病毒).Int.Microbiol.，7：83-94)。
初免-加强免疫接种方案对引起联合的B和T细胞免疫力是最高效的，并且依赖多次/序贯给予疫苗。从疫苗构建来看，同源初免-加强免疫接种方案是有利的，因为仅需要开发一种疫苗(待用于免疫接种的单一载体)，而对于异源方案，需要开发两种或更多种的疫苗，每一种疫苗都包含待用于免疫接种的载体/抗原之一。
数个作者提出，由于首次免疫接种后形成的预先存在的免疫力，同源方案中进行的加强在再刺激特异性免疫细胞方面不那么有效。本发明使用的6-8周的免疫接种(初免-加强剂量)间隔证实在初始接种后引起的初次免疫应答的再刺激方面是有效的，这表明，在该时间段后，预先存在的免疫力降低至允许给予第二个疫苗剂量的水平(Complete，long-lasting protection against malaria of mice primed and boosted withtwo distinct viral vectors expressing the same plasmodial antigen(用表达相同疟原虫抗原的两种不同病毒载体初免并加强的小鼠针对疟疾的完全、持久保护).2001O，Gonzáález-Aseguinolaza G，Hafalla JC，Tsuji M，Nussenzweig RS.Proc Natl Acad Sci U S A.2001年9月25日；98(20)：11491-6)。
专利文件WO07003384A1描述了可用于针对疟疾免疫接种的疟疾抗原的新用途。该发明采用结合适当佐剂的子孢子抗原，特别是CS蛋白质或免疫原性衍生片段。
专利文件US20050100558A1描述了用来产生有效抗原特异性免疫应答的接种方法。该发明主要描述了使用异源接种载体来引起加强的免疫应答。还揭示了使用该接种方案来治疗和预防疾病的方法。
专利文件WO06040334A1描述了基于初免-加强方案的新疫苗方案。该专利使用了表达恶性疟原虫抗原的中和重组腺病毒载体。还描述了基于重组DNA技术的疫苗以及适当的佐剂。
专利文件US20040131594A1描述了用于接种的方法和试剂，所述接种可产生抗疟疾、病毒或肿瘤抗原的CD8T细胞免疫应答。该专利描述了新疫苗方案并且该方案使用初免-加强组合物。加强组合物包括使用非复制或复制缺陷型痘病毒载体，其表达至少一种同样在初始组合物中存在的CD8T细胞表位。
专利文件US20060188527A1描述了通过接种防止传染疟疾的新方法。该发明包括通过使用基于DNA的疫苗来引起初始抗疟疾反应，然后使用蛋白质加强免疫接种疫苗。
由于对生物的认识及其在有益于人类健康的实验中的认可(CREEG等人，1993)，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是第一种旨在产生外源蛋白所使用的酵母。但是，酿酒酵母表达系统并不能满足所有的期望，因为其分泌和生产力效率低下、高糖基化(hyperglycosylation)、生产菌株不稳定、难以保持高的生长速度以及高的重组细胞群密度(SWINKELS等人，1993)。许多研究已经进行和正在进行，尝试使用备选酵母来生产重组蛋白。在那些研究中，其表达系统经设计的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)证实是合成和分泌用于临床、学术或工业用途的异源蛋白质的有效宿主(COS等人，2005)。
巴斯德毕赤酵母是能够生长至高细胞密度的甲基营养酵母，并且产生的重组蛋白的浓度常与获得的生物量成比例(HINGGS，1998)。数个实例显示，毕赤酵母可获得比酿酒酵母、大肠杆菌或杆状病毒好的产量(CREGG，VEDVICK e RASCHKE，1993；ROMANOS等人，1992)。毕赤酵母系统的成功主要与醇氧化酶编码的AOX1基因启动子相关，该酶在含有甘油的培养基中受到阻遏，但是当细胞被转移到含有甲醇作为唯一碳源的培养基时，该酶被诱导(HINGGS，1998；CREEG 1999；BOETTNER等人，2002)。
一旦转化细胞整合了一个基因拷贝，群体密度的增加就增加蛋白质的产量(CREEG等人，1993)。除了获得高的群体密度，巴斯德毕赤酵母还具有其它优点，例如：被AOX1启动子高度调节；低糖基化(常类似于人蛋白质的糖基化)；蛋白质表达的甲醇诱导简化；天然蛋白分泌水平低；在简单或确定成分培养基中生长；以及利用甲醇作为唯一碳源(CREEG等人，1993；DIGAN等人，1989；CHEN等人，1996；NOHR等人，2003；WITTAKER等人，2004；COS，等人，2005)。
用于使巴斯德毕赤酵母生产重组蛋白的生长培养基成分十分确定、廉价并且非常适合大规模生产。该培养基不含可产生毒素的复杂成分，因此该培养基在药物生产中易于被接受(CHEN等人，1996；GELLISSEN等人，2005)。
许多细胞因子、疫苗和其它生物制品正被开发，例如在南美洲商业化的乙肝疫苗。如今，有一些生物技术上重要的肽在毕赤酵母中生产，例如胰岛素样生长因子1(IGF-1)和HSA。这些肽用于生产阶段并用在肌萎缩性硬化的商业治疗中以及作为血清的替代物(WILLADSEN等人，1995；CANALES等人，1997；CEREGHINO，2000)。
作为这些观察的结果以及巴斯德毕赤酵母系统分泌有助于其纯化过程的蛋白质这一事实，由该系统进行的间日疟原虫的DBPII表达可能是获得生物活性蛋白最可行的方式之一。这使其作为抗原应用到免疫接种过程成为可能，具有用于人用的潜力。或者，可使用较容易的表达系统例如重组细菌大肠杆菌，前提是该系统表达的抗原会与疟疾患者的血清反应。
因此，抗疟疾的免疫接种可基于称为DARC的红细胞中的Duffy抗原的结合蛋白(疟原虫(Plasmodium)的Duffy结合蛋白)，DARC对其结合具有特异性。该红细胞侵入包括复杂的事件次序并需要红细胞受体和寄生虫蛋白质之间的特异性相互作用。已有报道，间日疟原虫传染完全依赖于Duffy与人红细胞的这种相互作用。据说，大部分非洲人群耐间日疟原虫传染，并且那是由于以下事实：所观察的人群不具有DARC受体，防止了DPB共价相互作用。这使DPB成为疫苗的优秀候选者，只要针对该区域的抗体阻断DBP和人群中的红细胞的相互作用，在所述人群中，间日疟原虫为疟疾的主要原因。
结构研究确定，负责与红细胞连接的DPB区域包括蛋白质区域II。该区域富含半胱氨酸，保证了其结构性构象。该区域还富有多态性，使其能够逃避宿主的免疫系统。出于命名原因，间日疟原虫的DBP区域II被描述为PvDBPII。
研究者已说明了呈其正确的构象和功能活性的PvDBPII，即能够与红细胞连接并识别抗DBPII抗体的PvDBPII。但是，当其用于免疫接种时，产生的蛋白质并不能给予完全的保护。
一些作者提出，更具免疫原性的蛋白质的构建可根据PvDBII保守序列进行，这提示多态性区域远离DBPII的结合位点。但是，巴西流行区中发现的PvDBII序列的多态性研究表明，多态性位点位于结合区域附近。这可提示，针对间日疟原虫的DBPII的疫苗应包含多态性区域，从而避免疟原虫逃避免疫系统。
顶膜抗原1(AMA-1)存在于所有种类的疟原虫中(HODDER，A.N.；CREWTHER，P.E.；ANDERS，R.F.Specificity of the protective antibodyresponse to apical membrane antigen 1(对顶膜抗原1反应的保护性抗体的特异性).Infect.Immun.v 69，n°5；第3286-3294页，2001)。AMA-1合成后储存于微线体(micronema)中，随后通过棒状体或在侵入宿主细胞过程中被寄生虫易位到表面。
在所有疟原虫物种中，除了恶性疟原虫以外，AMA-1作为66kDa的跨膜蛋白质合成。其是典型的整合蛋白，具有N末端胞外结构域、跨膜区和小的C末端细胞质结构域(KOCKEN，C.H.M.；WITHERS-MARTINEZ，C.；DUBBELD，M.A.；WEL，A.；HACKETT，F.；BLACKMAN，M.J；THOMAS，A.W.High-level expression of themalaria blood-stage vaccine candidate Plasmodium falciparum apicalmembrane antigen 1 and induction of antibodies that inhibit erytrocyteinvasion(疟疾血液阶段疫苗候选者恶性疟原虫顶膜抗原1的高水平表达以及抑制红细胞入侵的抗体的诱导).Infect.Immun.v.70，n°8；第4471-4476页，2002)。
在所有经表征的疟原虫中，AMA-1基因产生胞外结构域中保守的16个Cys残基(PIZARRO，J.C.；NORMAND，B.V.；等人.Cristal structureof the malaria vaccine candidate apical membrane antigen 1(疟疾疫苗候选者顶膜抗原1的晶体结构).Science.v.308，第408-411页，2005)并且被分成由8个二硫键限定的三个结构域(HODDER，A.N.；CREWTHER，P.E.；MATTHEW，M.L.S.M.；REID，G.E.；MORITZ，R.L.；SIMPSON，R.J.；ANDERS，R.F.The disulfide bond structure of Plasmodium apicalmembrane antigen-1(疟原虫顶膜抗原1的二硫键结构).J.Biol.Chem.V 271，n°46；第29446-29452页，1996)。
间日疟原虫AMA-1(PvAMA-1)胞外结构域对应于Pro43至Leu487残基的晶体结构，证实分成了三个结构域，并且结构域I和II在结构上与属于PAN超家族的其它蛋白质类似，PAN超家族的蛋白质表现出与附着和连接受体或其它蛋白质有关的功能。除此以外，结构域II具有对应于命名为结构域II的环的295-334残基的无序或活动区(PIZARRO，J.C.；NORMAND，B.V.；等人.Cristal structure of the malariavaccine candidate apical membrane antigen 1(疟疾疫苗候选者顶膜抗原1的晶体结构).Science.v.308，第408-411页，2005)。
在恶性疟原虫中，AMA-1作为83kDa的多肽产生，其在合成后经过加工，其中N末端的小片段被蛋白酶剪切，产生62kDa的成熟蛋白质(Crewther，P.E.；Culvenor，J.G.；Silva，A.；Cooper，J.A.；Anders，R.F.Plasmodium falciparum：two antigens of similar size are located indifferent compartments of the rhoptry(恶性疟原虫：大小类似的两个抗原位于棒状体的不同区室).Exp.Parasitol.v 70，n°2，第193-206页，1990)。
这种分子诱导保护性免疫应答的能力取决于通过二硫键维持的其构象的稳定性(HODDER，A.N.；CREWTHER，P.E.；MATTHEW，M.L.S.M.；REID，G.E.；MORITZ，R.L.；SIMPSON，R.J.；ANDERS，R.F.The disulfide bond structure of Plasmodium apical membraneantigen-1(疟原虫顶膜抗原1的二硫键结构).J.Biol.Chem.v 271，n°46；第29446-29452页，1996)，因为抑制性抗体优选与具有通过二硫键维持的稳定构象的表位反应(HODDER，A.N.；CREWTHER，P.E.；ANDERS，R.F.Specificity of the protective antibody response to apicalmembrane antigen 1(对顶膜抗原1反应的保护性抗体的特异性).Infect.Immun.V 69，n°5；第3286-3294页，2001)。
AMA-1序列在疟原虫物种中相对保守，其中与所有已知的序列相比，氨基酸序列的同一性水平大于50％(CHENG，Q.；SAUL，A.Sequence analysis of the apical membrane antigen 1(AMA-1)of dePlasmodium vivax(间日虐原虫的顶膜抗原1(AMA-1)的序列分析).Mol.Biochem.Parasitol.v 65；第183-187页，2004)。另外，AMA-1并不存在重复序列或在其它抗原例如MSP-1和MSP-2中发现的多态性(ANDERS，R.F.，SMYTHE，J.A.Polymorphic antigens in Plasmodiumfalciparum(恶性疟原虫中的多态抗原).Blood.v.74；第1865-1875页，1989)。
AMA-1的生物学功能仍然未知，但是有证据表明这种蛋白质通过裂殖子参与红细胞入侵过程(KOCKEN，C.H.M.；WITHERS-MARTINEZ，C.；DUBBELD，M.A.；WEL，A.；HACKETT，F.；BLACKMAN，M.J；THOMAS，A.W.High-level expression of themalaria blood-stage vaccine candidate Plasmodium falciparum apicalmembrane antigen 1and induction of antibodies that inhibit erythrocyteinvasion(疟疾血液阶段疫苗候选者恶性疟原虫顶膜抗原1的高水平表达和抑制红细胞入侵的抗体的诱导).Infect.Immun.v.70，n°8；第4471-4476页，2002，LI，F.；DLUZEWSKI，A.；COLEY，A.M.；THOMAS，A.；TILLEY，L.；ANDERS，R.F.；FOLEY，M.Phage-displayed peptidesbind to the malarial protein apical membrane antigen-1and inhibit themerozoite invasion of host erythrocytes(噬菌体展示肽与疟疾蛋白质顶膜抗原1结合并抑制宿主红细胞的裂殖子入侵).J.Biol.Chem.v 277，n°52；第50303-50310页，2002)。
针对AMA-1的单克隆抗体能够抑制裂殖子入侵，表明AMA-1在入侵过程中起作用(CREWTHER等人，1990)。Mitchell和合作者(2004)提示，这种蛋白质直接负责入侵过程中裂殖子的重新定向，或AMA-1可以启动紧密附着，和其依靠Duffy结合蛋白以使该过程有效地运行(MITCHELL，G.H.；THOMAS，A.W.；MARGOS，G.；DLUZEWSKI，A.R.；BANNISTER，L.H.Apical membrane antigen 1，a major malariavaccine candidate，mediates the close attachment of invasive merozoites tohost red blood cells(主要的疟疾疫苗候选者顶膜抗原1介导入侵性裂殖子对宿主红细胞的紧密附着).Infect.Immun.v 72，n°1；第154-158页，2004)。
AMA-1还参与入侵肝细胞。子孢子入侵肝细胞后停止表达该种蛋白质，并且该蛋白质仅在裂殖子中重新表达。抗AMA-1抗体抑制子孢子的入侵提示，AMA-1可视为多阶段疟疾疫苗的潜在候选者，并且其在红细胞内期和红细胞外期(pre-erythrocyte stage)两个阶段均为靶标(SILVIER，O.；FRANETICH，J.F.；CHARRIN，S.；MUELLER，M.S.等人.A role for apical antigen 1 during invasion of hepatocytes by P.falciparum sporozoites(顶端抗原1在恶性疟原虫子孢子入侵肝细胞过程中的作用).J.Biol.Chem.V.279(10)，第9490-6页，2004)。
已知当针对AMA-1的抗体与裂殖子表面相互作用时，针对AMA-1的抗体可抑制体外和体内寄生虫的增殖。用AMA-1在动物模型(小鼠和猴子)中进行的疫苗研究显示，当动物受到疟原虫物种的攻击时，用这种纯化或重组的蛋白质进行免疫接种诱导保护性免疫应答。
这种蛋白质19kDa的C末端片段是疫苗的主要候选者之一。数项研究显示，这种抗原能够触发保护性免疫应答(KUMAR，S.；COLLINS，W.；EGAN，A.；YADAVA，A.；GARRAUD，O.；BLACKMAN，M.J.；PATINO，J.A.G.；DIGGS，C.；KASLOW，D.C.Immunogenicity andefficacy in Aotus monkeys of four recombinant Plasmodium falciparumvaccines in multiple adjuvant formulations based on the 19-kilodalton Cterminus of merozoite surface protein 1(呈基于裂殖子表面蛋白1的19千道尔顿C末端的多佐剂制剂的四种重组恶性疟原虫疫苗在夜猴中的免疫原性和效能).Infect.Immun.v 68，n°4；第2212-2223页，2000，STOWERS等人，2002)。间日疟原虫的MSP-1(PvMSP119)与研究的其它疟原虫物种的MSP-119类似，其由一对具有数个结构域间接触的EGF(表皮生长因子)样结构域构成，并且它们相互对准成反向平行定向。这导致了U型构象，使C和N末端非常靠近(BABON，J.J.；MORGAN，W.D.；KELLY，G.；ECCLESTON，J.F.HOLDER，A.A.Structural studies on P.vivax merozoite surface protein-1(间日疟原虫裂殖子表面蛋白质1的结构研究).Mol.Biochem.Parasitol.V.153，第31-40页，2007)。
Cunha和合作者(2002)比较了在不同细菌载体中表达的重组蛋白PvMSP-119的免疫原性性质。在该研究中，研究者表示，由(HIS6MSP-119)载体表达的MSP-119较好地被暴露于间日疟原虫的个体的抗体识别，并且将PADRE(Pan等位基因DR表位)表位加到HIS6MSP-119中并不改变人抗体对这种重组蛋白的识别。这些蛋白质在C57BL/6中是免疫原性的，诱导对MSP-119特异的抗体，并且LT或IFN-γ分泌的增殖试验证实了对MSP-119特异的T细胞的存在(CUNHA，M.G.；RODRIGUES，M.M.；SOARES，I.S.Comparison of the immunogenicproperties of recombinant proteins representing the Plasmodium vivaxvaccine candidate MSP-119 expressed in distinct bacterial vectors(代表在不同细菌载体中表达的间日疟原虫疫苗候选者MSP-119的重组蛋白质的免疫原性性质比较).Vaccine.v.20，第385-396页，2002)。
为获得针对疟疾的有效疫苗要克服的主要障碍是：免疫原性与保护性之间的相关性、具有种类繁多的阶段特异性抗原的疟原虫周期的复杂性、引起细胞免疫应答和维持持久的细胞和体液免疫应答(免疫学应答)的困难。包含红细胞外(pre-erythrocyte)和红细胞寄生虫形式的特异性抗原的多阶段疫苗似乎是获得针对疟疾的保护最有效的备选。初始和加强方案的给予是具有较高概率针对疟疾提供保护的选择，这种方案利用作为免疫接种载体的重组病毒(腺病毒和/或痘病毒)以及重组蛋白质，来引起这些重组抗原的高水平且同时发生(simultaneous)水平的持久性细胞和体液免疫。
发明详述
本发明涉及经修饰的遗传序列(包括间日疟原虫的抗原序列DBP-PA、DBP-AM、DBP-MT、AMA-1、CS和MSP-1)的构建、由提到的序列编码的相应重组蛋白质以及表达重组抗原的经遗传修饰的病毒。除此之外，本发明还涉及利用腺病毒或痘病毒载体的初免-加强接种方法、用于哺乳动物免疫接种的纯化的蛋白质以及有助于用作针对疟疾的疫苗的疫苗组合物。
针对间日疟原虫引起的疟疾的Duffy抗原结合蛋白(Duffy结合蛋白或DBP)的遗传序列是经过修饰的。本发明还描述了腺病毒的构建，由于将HASS信号肽掺入病毒载体中，所述腺病毒将重组蛋白分泌到细胞外介质中。
重要的是要提及构建的特征在于，结合在巴西人群中发现的多态性，目的是增加疫苗的覆盖度。为获得多态性，使用来自巴西流行区的患者的序列。序列DBP-PA、DBP-MT和DBP-AM代表在巴西发现的最常见的DBP多态性，并且这些序列的联合给予在诱导保护性疫苗反应方面是最重要的。
多态性分析基于保藏在GenBank中的SAL-1序列进行，该序列的登记号为[Gi160275]。该研究中使用的序列用SAL-1序列作为标准并以氨基酸232开始，以氨基酸548结束。为构建腺病毒，获取这些患者的血清并利用特定的寡核苷酸将其用于PCR扩增。该寡核苷酸利用分别插入序列开头和结尾处的EcoRI和Xbal限制性位点。扩增后，阳性克隆被克隆到pTOPOTA中并通过酶消化进行分析。用其位点在扩增过程中掺入序列中的限制性内切酶将该序列从该质粒中移除。将消化产物纯化并用pcDNA3.1HASS进行克隆，pcDNA3.1HASS包含允许腺病毒分泌蛋白质的流感病毒的信号肽。克隆在该质粒的EcoRI和Xbal位点之间完成。消化阳性克隆以获得HASS-DBPII部分，将该部分克隆入pADCMV-link1中，然后是巨细胞病毒启动子的表达。对阳性克隆进行测序以证实正确的质粒插入。将pADCMVLink1-HASS-DBPII用于与另一质粒pJM17重组成同源形式。该重组现象发生在转染过程中并可供产生腺病毒5。
另一重组蛋白自CS的氨基酸序列和间日疟原虫Belém谱系(GeneBank登记号AAA29526)获得。将文献描述的CS蛋白质的表位选择并插入HBcAg蛋白的策略性点，如先前所说明的(图6)。进行对设计的重组蛋白的结构性构象的预测以证实其与先前由等人(1997)描述的HBcAg单体结构的相似性。这种预测的结果通过Swiss-PdbViewer服务器根据重组蛋白质的氨基酸序列提供，并提示，尽管插入来源于CS蛋白质的外源氨基酸，但构象结构仍然相同。
根据设计的氨基酸序列预测核苷酸序列，优化用于人类模型的密码子选择。还插入限制酶位点，用于重组病毒构建的克隆过程。基于优化的遗传序列，通过Entelechon公司生产合成基因(图7)。
在合成基因的BglII/NcoI位点处克隆IRES序列。将两个构建类型(HBc-CS和HBc-CS-IRES)克隆到pAdCMV-link-1质粒的BglII/NcoI位点中(图9)。
通过在用包含转基因的pJM17和pAdCMV-link-1质粒转染HEK293A细胞中的同源重组过程，来产生重组病毒。pJM17质粒包含人腺病毒类型5基因组，该基因组通过E1区域中的插入(pBRX)而被修饰。pAdCMV-link-1质粒包含侧接克隆位点的巨细胞病毒启动子(CMV)、聚腺苷酸化位点(聚A)和人腺病毒类型5的同源区域。pAd-HBc-CS和pAd-HBc-CS-IRES的同源区域(Ad 0-1和Ad 9-16)配对并与pJM17重组，并且将带有转基因的表达盒转移到腺病毒5基因组中，除去pBR插入物。
还开发出能够在HEK293A细胞中表达间日疟原虫的MSP-119(PvMSP-119)疫苗抗原的非复制型(nonreplicant)人腺病毒类型5。病毒载体的使用可由以下事实确证：其主要引起细胞免疫应答，并且由于其用作佐剂，加强免疫应答。为生产重组腺病毒(AdMSP-119)，开发出基因的独特克隆策略，所述基因编码在pAdCMV-Link-1中的间日疟原虫的MSP-119。由腺病毒表达的重组蛋白对应于品系间日疟原虫氨基酸序列MSP-1的1616-1704，并在N末端区域具有组氨酸尾部以及在C末端具有与CD4表位(pan等位基因DR表位(PADRE)的融合物(CUNHA等人，2002)。该重组蛋白质还具有流感病毒的信号肽(HASS)，其允许该蛋白质分泌到细胞外介质中。
由重组腺病毒表达的另一疫苗抗原对应于与流感病毒信号肽(HASS)融合的间日疟原虫AMA-1的胞外结构域(其是指分离的间日疟原虫BEL-12的Pro43至Leu487残基)，该信号肽允许将AMA-1引导到细胞外介质中，引起体液免疫应答，导致特异性抗体产生。如下产生重组病毒：通过同源重组，插入到腺病毒基因组中，将间日疟原虫AMA-1的胞外结构域的编码区包含于pAdCMV-Link-1转移载体中。由腺病毒表达的重组蛋白对应于分离的BEL-12的间日疟原虫的AMA-1的43-487氨基酸序列，BEL-12来源于Belém-PA的患者，从质粒pHIS-AMA-1中获得(RODRIGUES，M.H.C.；RODRIGUES，K.M.；OLIVEIRA，T.R.；
A.N.；RODRIGUES，M.M.；KOCKEN，C.H.M.；THOMAS，A.W.；SOARES，I.S.Antibody response of naturallyinfected individuals to recombinant Plasmodium vivax apical membraneantigen-1(自然感染个体对重组间日虐原虫顶膜抗原1的抗体反应).Int.J.Parasitol.v35，第185-192页，2005)。该重组蛋白质还具有流感病毒的信号肽(HASS)，其允许将该蛋白质分泌到细胞外介质中。为生产重组腺病毒(AdAMA-1)，建立了基因克隆策略，所述基因编码在pAdCMV-Link-1中的间日疟原虫的AMA-1。
复制缺陷型人腺病毒类型5可在HEK293A细胞中表达间日疟原虫的AMA-1(PvAMA-1)疫苗抗原。病毒载体的使用可通过以下事实确证：其主要引起细胞免疫应答以及用作加强免疫应答的佐剂。由重组腺病毒表达的疫苗抗原对应于与流感病毒信号肽(HASS)融合的间日疟原虫的AMA-1的胞外结构域(其是指分离的间日疟原虫BEL-12的Pro43至Leu487残基)，该信号肽允许将AMA-1引导到细胞外介质中引起体液免疫应答，导致特异性抗体产生。
同源初免-加强方案在于在所有免疫接种中给予相同病毒载体或纯化的重组蛋白(Ad/Ad、Prot/Prot、Ad/Ad/Ad或Prot/Prot/Prot)。本发明异源初免-加强方案基于重组腺病毒(人腺病毒类型5或HuAd5)、重组痘病毒(毒株WR、Copenhage或MVA)的序贯给予，所述病毒能够(从酵母或细菌宿主中)表达普通的间日疟原虫异源蛋白或其纯化重组形式的相同的间日疟原虫抗原。组合包括两个或三个剂量的疫苗，前提是在相同的免疫接种方案中使用至少两种不同的病毒载体或病毒载体加上纯化的蛋白质。给予初次剂量的腺病毒(Ad)或痘病毒(Pox)后，可用纯化的病原体抗原蛋白(Prot)进行初免-加强，或反过来。(例如Ad/Pox、Ad/Prot、Prot/Ad、Prot/Pox、Ad/Ad/Prot、Prot/Prot/Ad、rot/Prot/Pox、Ad/Ad/Pox)。使用的免疫接种之间的间隔为6-8周，并且不应少于30日。
本发明的各个方面将在下面通过实施例详细描述。需要强调的是，本发明不限于这些实施例，而是还包括其中其起作用的范围内的变化和修饰。
实施例1-DBPII重组腺病毒的构建
将基于区域II的引物设计成包含EcoRI和XbaI酶的酶限制性位点，这两个位点用于将目标序列插入pPIC9Z载体中以转化巴斯德毕赤酵母，还用于在HASS-DBPII克隆入pAdCMV-linLys1后，将pTopoTA和后面的克隆插入pcDNA3.1 HASS中以获得流感病毒的HASS信号肽。以同源方式将该最后的质粒与pJM17进行重组，产生表达DBPII的腺病毒。将通过这些患者血清的PCR获得的DBPII序列独立克隆到质粒中并在DBPII克隆阶段采用相同的程序。
说明：间日疟原虫经遗传修饰的DBPII抗原的结构
实施例2-CS重组腺病毒的构建
进行包含间日疟原虫的表位B(GDRADGQPA)的表达乙肝病毒核心蛋白(HBcAg)(其中CS蛋白质的表位位于该分子特异性点)的人腺病毒类型5的构建，并在HBcAg的免疫显性环(即在78-79氨基酸之间)中重复三次。
在HBcAg的N末端部分，存在流感病毒的血凝素蛋白的信号肽(信号肽HASS)。HBcAg分子在核糖体进入(ribosome entry)的内部位点(IRES序列)所在的149氨基酸处截短。
这种截短后，可得到包含B表位、TCD4和TCD8的间日疟原虫CS蛋白质的许多部分。将这些部分置于由表位间隔基隔开的六个区组(block)中，促进它们被细胞加工，区组如下：区组1：来自Belém品系的CS蛋白质的氨基酸1-23，其在每一侧的AAY氨基酸序列(间隔基)之间包含一个TCD8人表位；区组2：氨基酸265-272，其包含一个由AAY间隔基侧接的TCD8人表位；区组3：氨基酸292-378，其包含由AAY间隔基侧接的B、TCD4和TCD8表位；区组4：来自巨细胞病毒的TCD8鼠表位，由AAY间隔基侧接；区组5：氨基酸301-309，其包含一个由AAY间隔基侧接的TCD8人表位；区组6：氨基酸51-9，其包含在N末端部分由GPGPG间隔基侧接，在C末端部分由终止密码子侧接的B和TCD4表位。此外，在HASS信号肽前面有BamHI限制性内切酶位点，以及在终止密码子后面有BamHI和KpnI酶位点。
实施例3-经修饰的病毒MVA-CS或其它重组痘病毒的构建
转移质粒基本上由通用质粒(例如pUC19)构成，该质粒加入有外来基因组的痘病毒和间日疟原虫序列或限定的真核表达序列(被称为表达盒)(在图6中示例给出)。
图6描绘了通用插入盒和表达盒。在5′-3′方向，插入盒由以下构成：与MVA基因组缺失区域II和/或缺失区域III的5′末端同源的核苷酸序列(1)；经修饰的痘苗病毒的早期/晚期启动子(2)；标记蛋白质-荧光绿蛋白质(FGP)或荧光红蛋白质(FRP)的编码基因(3)；目标外源cDNA/基因的克隆位点(4)；痘苗病毒早期/晚期启动子(5)；与MVA基因组的缺失区域II和/或缺失区域II的3′末端同源的核苷酸。
然后，在先前用MVA、WR或Copenhage痘病毒株感染的鸡胚细胞(CEC)中通过转移质粒(例如pLW17、pLW44、pSC11或等价痘病毒穿梭质粒)的转染产生重组体。病毒经先平板纯化然后扩增克隆的连续循环来选择和纯化。
实施例4-特异性MSP-119引物(initiator)
通过重组技术获得的另一发明抗原是MSP-1蛋白质。裂殖子表面蛋白(MSP-1)是疟原虫物种寄生虫的红细胞内时期的抗原。MSP-1作为190kDa的前体蛋白质合成。该前体通过其GPI锚(糖基磷脂酰肌醇)附着于发育中的裂殖子表面。在裂殖子成熟过程中，MSP-1经历蛋白酶剪切过程，产生四个保持非共价缔合到裂殖子表面的片段。当发生红细胞入侵时，第二次切割将19kDa的C末端片段与蛋白质复合体分离开，并且仅将通过GPI锚与膜连接的部分转移到新的受感染的红细胞中(KAUTH，C.W.；EPP，C.；BUJARD，H.；LUTZ，R.The merozoitesurface protein 1 complex of human malaria parasite P.falciparum(人疟疾寄生虫恶性疟原虫的裂殖子表面蛋白1复合体).T.J.Biol.Chem.v278，n°25，第22257-22264页，2003)。
编码间日疟原虫蛋白质的MSP-119的基因序列通过PCR从pET-MSP1-PADRE质粒扩增，其中引物为5′GCA GAT ATC CATCAC CAT CAC CAT CAC(有义)和5′AAG CTT TTA AGC GGC AGCCTT CAG GGT(反义)。这些密码子分别是EcoRV和HindIII限制性内切酶的位点，加下划线的密码子对应终止密码子。按照制造商的说明和在以下扩增条件下，用可靠性高的酶Pfx(Invitrogen)进行PCR反应：94℃下的5分钟循环，94℃下40秒、45℃下45秒以及68℃下1:30分钟的38个循环，以及68℃下4分钟的最后延伸循环。
实施例5-克隆策略(MSP-119)
-克隆入pCR-Blunt II TOPO中
用来自克隆入pCR-blunt II TOPO中的pET-MSP-119-PADRE的MSP-119特异性引物扩增399pb的片段。在该克隆中产生了TOPO-MSP-119，并且图13显示了阳性克隆选择。
-pAdCMV-Link 1克隆
在pAdCMV-Link1克隆中，载体和TOPO-MSP-119克隆均用EcoRV和HindIII消化。消化后，所需的片段用QIA快速凝胶提取(QIAGEN)试剂盒纯化。纯化后，将其克隆入载体中。在该克隆中产生了pAdCMV-MSP-119。如图14所示，用EcoRV和HindIII消化后，阳性克隆呈现388pb的片段。
-在pAdCMV-MSP-1中克隆HASS信号肽
用BglII消化pAdCMV-MSP-119来线性化质粒，然后用BamHI消化pAd32.1，产生717pb的片段。消化后，将片段如前所述进行纯化和连接。在该克隆中产生了部分pAdCMV-HASS-MSP-119。用NotI进行阳性克隆选择。如图15所示，在阳性克隆中发现1200pb的片段。
-用EcoRV消化pAdCMV-MSP-1/部分
用EcoRV消化阳性pAdCMV-HASS-MSP-119/部分克隆，用于提取625个额外碱基。然后将线性化的质粒从凝胶中切除，纯化和用T4DNA连接酶进行再环化，导致最初pAdCMV-HASS-MSP-119的形成。如图15所示，阳性克隆选择通过用NotI消化来完成。
实施例6-对用重组腺病毒感染的HEK293A细胞进行PCR和RT-PCR以证实转基因的存在
用对MSP-1特异的引物自DNA和RNA获得400pb的扩增物，所述DNA和RNA提取自用AdMSP-119重组病毒感染的HEK293A细胞。进行总RNA的逆转录反应并用DNA酶处理产生的cDNA。除扩增500pb片段的腺病毒E4基因的特异性引物之外，我们还使用特异性MSP-1引物。这些来自病毒DNA和RNA的扩增物表明，重组腺病毒正在表达MSP-119。图16显示了这些扩增物。
实施例7-用抗体检测重组蛋白质
用AdMSP-119重组腺病毒感染的HEK293A细胞提取物经蛋白质印迹分析表明，其与用MSP-119免疫的BALB/c小鼠的血清具有高度反应性。该结果证实了MSP-119通过AdMSP-119表达。用200μl带有20μg纯化的AMA-1蛋白质的乳剂Montanide ISA 720(30∶70蛋白质/油)于皮下免疫动物。进行间隔为3周的两次免疫接种。在每次免疫接种中，在动物背部的4个不同区域施加50μl，总共200μl。最后一次免疫接种后14天收集血清。用AdMSP-119重组腺病毒感染的相同的HEK293A细胞提取物还显示出与来自疟疾流行区的患者的血清的反应性。图17和18分别显示了重组蛋白质与鼠和人血清的反应性。
实施例8-AMA-1的特异性引物
编码间日疟原虫蛋白质的AMA-1的序列通过PCR从质粒pHIS-AMA-1扩增，其中引物为5′GCA GAT ATC GGC AGC AGCCAT CAT CAT(有义)和5′GGT ACC TTA TAG TAG CAT CTG CTTGTT(反义)。高亮的密码子分别是EcoRV和KpnI限制性内切酶的位点，以及加下划线的密码子对应终止密码子。按照制造商的说明和在以下扩增条件下，用可靠性高的酶Pfx(Invitrogen)进行PCR反应：94℃下的5分钟循环，94℃下40秒、45℃下45秒以及68℃下1:30分钟的38个循环，以及68℃下4分钟的最后延伸循环。
实施例9-克隆策略
-克隆入pAdCMV-link 1中
用限制性内切酶EcoRV和HindIII消化对应于AMA-1和pAdCMV-Link1的PCR产物(图21)。消化后，所需的片段用QIA快速凝胶提取(QIAGEN)试剂盒纯化和连接。用连接产物转化大肠杆菌XL-1蓝细菌。因此，产生了pAdCMV-AMA-1。图21显示了阳性克隆的选择。
-将HASS信号肽克隆入pAdCMV-AMA-1中
使用包含HASS信号肽的pAd32.1。用BglII消化pAdCMV-AMA-1来线性化质粒并用BamHI消化pAd32.1以产生717pb的片段，其中92个碱基对应于HASS以及余下的625个碱基被用于促进克隆(图22)。
BglII和BamHI具有匹配的末端，即，用BglII产生的末端可直接与BamHI的末端连接，但它们的限制性位点并不重新生成，如图23所示。
消化后，接着将片段进行如前所述的纯化和连接。在该克隆中产生了部分pAdCMV-HASS-AMA-1。用NotI进行阳性克隆选择，其中阳性克隆呈现2200pb的片段，以及阴性克隆呈现1500pb的片段。图24显示了阳性克隆的选择。
-用EcoRV消化pAdCMV-HASS-AMA-1/部分
为提取625个额外碱基，用EcoRV消化pAdCMV-HASS-AMA-1阳性克隆。从琼脂糖凝胶中切除8176个碱基的较大片段，用QIA快速凝胶提取(QIAGEN)试剂盒进行纯化。用T4DNA连接酶重新连接线性化的质粒，产生pAdCMV-HASS-AMA-1。图25显示了该克隆阶段。
实施例10-对用重组腺病毒感染的HEK293A细胞进行PCR和RT-PCR以证实转基因的存在
从用AdAMA-1重组病毒感染的HEK293A细胞提取的DNA和RNA中，使用AMA-1特异性引物获得1.4kb的扩增物。对总RNA进行逆转录反应并用DNA酶处理产生的cDNA。除了AMA-1特异性引物之外，我们还使用扩增500pb片段的腺病毒E4基因的特异性引物。这些来自DNA病毒和RNA病毒的扩增物表明，重组腺病毒正在表达AMA-1。图26显示了这些扩增物。
实施例11-用抗体检测重组蛋白质
通过蛋白质印迹用抗体检测重组蛋白质。用重组蛋白质免疫的小鼠BALB/c血清被用作初级抗体。作为次级抗体，使用与过氧化物酶(Zymed)缀合的抗小鼠。
用AdAMA-1重组腺病毒感染的HEK293A细胞提取物显示其与用AMA-1免疫的BALB/c小鼠的血清具有高度反应性。该结果证实了AMA-1通过AdAMA-1表达。用200μl具有20μg纯化的AMA-1蛋白质的乳剂Montanide ISA 720(30∶70蛋白质/油)于皮下免疫动物。进行间隔为3周的两次免疫接种。在每次免疫接种中，在动物背部的4个不同区域施加50μl，总共200μl。最后一次免疫接种后14天收集血清。图27显示了AMA-1与大肠杆菌和AdAMA-1中表达的鼠血清的反应性。
附图简述
图01：在pTopoTA质粒的EcoRI和XbaI位点通过PCR扩增的DBPII克隆。
图02：在pcDNA3.1HASS的EcoRI和XbaI酶促位点中用EcoRI和XbaI酶自pTopoTA提取DBPII克隆以加入HASS信号肽。对三名患者采用相同的程序：AM、MT和PA。
图03：(A)pAdCMV-link1-HASS-DBP AM、MT和PA中克隆位点的示意图。(B)CMV启动子和SV40尾部。将DBP AM克隆入该质粒的EcoRV位点。箭头表示这些引物的位置。
图4：表示在用于产生表达DBPII的腺病毒的HEK293细胞转染期间发生在pAdCMV-link-1和pJM17之间的同源重组的图。
图5：用于通过电穿孔转化巴斯德毕赤酵母的pPIC9Z载体中的DBPII克隆图。克隆入pAdCMV-link1的序列将通过EcoRI和XbaI酶提取，从而配置信号肽HASS序列。在各自的EcoRI和XbaI位点将DBPII克隆入pPIC9Z中，DBPII将具有作为信号肽的pPIC9z表达系统中存在的酿酒酵母的会面-α因子(meeting-alpha factor)。在DBPII序列的末端有六个组氨酸残基。
图06(1)：显示其以下部分的疫苗重组蛋白图：
HASS信号肽的氨基酸序列
HBcAg的氨基酸序列(aa 1-78以及后面的aa 79-149)和从CS蛋白质获得的表位。
1.重复部分，包含表位B和T CD4
2.CS蛋白质的信号肽(表位T CD8-aa 1-23)
3.对HLA-B35-等位基因特异的表位T CD8aa 264-272
4.CS蛋白质的C末端部分-aa 292-378(表位B、T CD4和TCD8)
5.鼠T CD8表位
6.对HLA-A2-等位基因特异的T CD8表位aa 301-309
7.CS蛋白质的N末端部分aa 51-90(表位B和T CD4)
*：终止密码子
图07(2)：pAdCMV-link-1质粒图，显示与Ad5基因组同源的区域、巨细胞病毒启动子、聚腺苷酸化位点和克隆位点。
图08(3)：(A)用于构建MVA重组病毒的转移质粒；B)包含以下基因元件的插入和表达盒的细节：与MVA基因组缺失II区域和/或缺失III区域的5′部分同源的核苷酸序列(1)；痘苗病毒经修饰的早期/晚期启动子(2)；绿色荧光蛋白质(GFP)或红色荧光蛋白质(RFP)标记蛋白质的编码基因(3)；目标外源cDNA/基因的克隆位点(4)；痘苗病毒经修饰的早期/晚期启动子(5)；与MVA基因组的缺失II区域和/或缺失III区域的3′部分同源的核苷酸序列。
图9：A-pAdCMV-Link-1转移载体：巨细胞病毒启动子(CMV)、克隆位点、聚腺苷化位点(聚A)、与HAdV5同源的区域。m.u.：图距单位。B.克隆入pAdCMV-Link-1的HASS-MSP-119。将信号肽克隆入Bg/II位点，克隆后该位点消除；将MSP-119克隆入EcoRV和HindIII位点。*用于克隆HASS-MSP-1的酶位点：BglII、EcoRV和HindIII。
图10：pJM17质粒：包含由位于Xbal位点之间的E1区域的插入物(pBRX)修饰的人类型5腺病毒基因组。
图11：pAdCMV-HASS-MSP-119和pJM17质粒之间同源重组的示意图：pAdCMV-HASS-MSP-119中的同源区域(Ad 0-1和Ad 9-16)经历与pJM17的配对和重组，并且将表达盒MSP-119转移到腺病毒5的基因组中，通过pBRx插入消除E1。
图12：克隆位点pAdCMV-MSP-119、CMV启动子和SV40聚A尾部的示意图。对应于HASS-MSP-119的序列位于NotI和HindIII位点之间。引物的位置用箭头表示。
图13：通过用EcoRV和HindIII限制性内切酶消化以及用BamHI、EcoRV和HindIII酶消化相同的克隆进行阳性克隆选择。PM：标准分子量。100pb Promega，1：未经消化的克隆，2：用BamHI消化的(387pb)，3：用HindIII消化的(454pb)，4：用EcoRV消化的(412pb)，5：用EcoRV和HindIII消化的(388pb)。
图14：通过用EcoRV和HindIII限制性内切酶消化进行阳性克隆选择。pAdCMV-MSP-119阳性克隆产生388pb的片段。PM：1kb Invitrogen。泳道1-4：阳性克隆。
图15：将HASS克隆到pAdCMV-MSP-119中的过程：1：采用NotI消化阳性克隆pAdCMV-HASS-MSP-119部分，产生1200pb的片段。2：用EcoRV消化相同的克隆，产生625pb的片段，该片段在载体中消除。3：新克隆pAdCMV-HASS-MSP-119，其当用NotI消化时生成对应于HASS-MSP-119的序列的560pb片段。
图16：来自病毒DNA和RNA的PCR和RT-PCR，所述病毒DNA和RNA从用AdMSP-119感染的HEK293A中提取。用对MSP-119特异的引物获得400pb的扩增子(泳道1-4：病毒DNA，9-12泳道：病毒RNA)并用对腺病毒E4基因特异的引物获得500pb的扩增子(泳道5-8：病毒DNA，泳道14-16：病毒RNA)。PM：100pb Promega，1：CP(阳性对照)：pAdCMVMSP-119，2：经1∶5稀释的DNA，3：经1∶10稀释的DNA，4：CN(阴性对照)，5：CP：pAdCMVMSP-119，6：经1∶5稀释的DNA，7：经1∶10稀释的DNA，8：CN，9：CP：pAdCMVMSP-119，10：未经稀释的cDNA，11：经1∶5稀释的cDNA，12：经1∶10稀释的cDNA，13：CN，14：经1∶5稀释的cDNA，15：经1∶10稀释的cDNA，16：CN
图17：在大肠杆菌中表达和由腺病毒表达的MSP-119重组体，其通过特异性抗体经由利用经MSP-119免疫动物的血清的蛋白质印迹测定来检测。rMSP-119：在大肠杆菌中表达的，CN：阴性对照，AdMSP-1：由重组腺病毒表达的。
图18：在大肠杆菌中表达和由腺病毒表达的MSP-119重组体，其通过特异性抗体经由利用疟疾流行区的患者的血清的蛋白质印迹测定来检测。rMSP-119：在大肠杆菌中表达的，CN：阴性对照，AdMSP-1：由重组腺病毒表达的。
图19：A：pAdCMV-Link-1转移载体：巨细胞病毒(CMV)启动子、克隆位点、聚腺苷化(聚A)位点、与HAdV5同源的区域。m.u.：图距单位。B.克隆入pAdCMV-Link-1的HASS-AMA-1。将信号肽克隆入Bg/II位点，克隆后该位点将消除，并将AMA-1克隆入EcoRV和KpnI位点。*用于克隆HASS-AMA-1的酶位点：BglII、EcoRV和KpnI。
图20：pAdCMV-HASS-AMA-1和pJM17质粒之间同源重组的示意图：pAdCMV-HASS-AMA-1中的同源区域(Ad 0-1和Ad 9-16)经历与pJM17的配对和重组，并且将带有AMA-1的表达盒转移到腺病毒5的基因组中，通过pBR插入消除E1。
图21：通过用EcoRV和KpnI限制性内切酶消化来选择阳性克隆。阳性克隆产生1431pb的片段。PM：1kb promega，1-4 pAdCMV-AMA-1阳性克隆。
图22：pAd32.1的717pb片段的示意图，将该片段插入pAdCMV-AMA-1中，其中起始的92个碱基对应HASS序列。
图23：具有匹配末端的BamHI和BglII限制性位点。
图24：通过用NotI消化来进行阳性克隆选择。阳性克隆产生2200pb的片段。PM：1kb promega，2、4：阳性克隆，6：阴性克隆，1、3和5：泳道2、4和6中各自的克隆未经消化的DNA质粒。
图25：将HASS克隆到pAdCMV-AMA-1中的过程：1：采用NotI消化阳性克隆pAdCMV-HASS-AMA-1部分，产生2200pb的片段。2：用EcoRV消化相同的克隆，产生625pb的片段，该片段从载体中消除。3：新克隆pAdCMV-HASS-AMA-1，其当用NotI消化时产生对应于HASS-AMA-1的序列的1600pb片段。
图26：来自病毒DNA和RNA的PCR和RT-PCR，所述病毒DNA和RNA从用AdAMA-1感染的HEK293A中提取。用对腺病毒E4基因特异的引物获得500pb的扩增子(泳道1-3：病毒DNA，泳道4-7：病毒RNA)并用对AMA-1特异的引物获得1.4Kb的扩增子(泳道8-11：病毒DNA，泳道12-16：病毒RNA)。1：CP(阳性对照)：pAdCMVAMA-1，2：病毒DNA，3：CN(阴性对照)，4：用DNA酶处理的RNA的RT-PCR，5：用DNA酶处理的RNA的PCR，6：CP：pAdCMVAMA-1，7：CN，8：标准分子量1Kb Promega，9：CP：pAdCMVAMA-1，10：病毒DNA，11：CN，12：用DNA酶处理的RNA的RT-PCR，13：用DNA酶处理的RNA的PCR，14：CN，15：CP。
图27：在大肠杆菌中表达和由腺病毒表达的AMA-1重组体，其通过使用经AMA-1免疫的动物血清的特异性抗体进行检测。rAMA-1(在大肠杆菌中表达的)，AdAMA-1(由腺病毒表达的)，CN：阴性对照。
Claims (15)
1.经遗传修饰的间日疟原虫抗原序列，其中DNA序列选自：Seq.ID n°(1)、Seq.ID n°(2)、Seq.ID n°(3)、Seq.ID n°(4)、Seq.ID n°(5)和Seq.ID n°(6)。
2.DBP MSP-1 AMA-1 CS重组蛋白质，其中氨基酸序列选自：Seq.ID n°(1)、Seq.ID n°(2)、Seq.ID n°(3)、Seq.ID n°(4)、Seq.ID n°(5)和Seq.ID n°(6)。
3.表达重组抗原的经遗传修饰的病毒，其包括单独或一起表达Seq.ID n°(1)、Seq.ID n°(2)、Seq.ID n°(3)、Seq.ID n°(4)、Seq.ID n°(5)和Seq.ID n°(6)。
4.权利要求3的表达重组抗原的经遗传修饰的病毒，其中所述病毒选自腺病毒和/或痘病毒。
5.权利要求4的表达重组抗原的经遗传修饰的病毒，其中人腺病毒包括血清型5。
6.权利要求5的表达重组抗原的经遗传修饰的病毒，其中痘苗病毒包括WR毒株或Copenhagen毒株、经修饰的Ankara病毒(MVA)或痘病毒的其它毒株。
7.针对疟疾的疫苗组合物，包含抗原性纯化的权利要求2中定义的重组蛋白质和/或权利要求3-6中定义的表达重组抗原的经遗传修饰的病毒以及至少一种生理学上可接受的载体。
8.权利要求7的针对疟疾的疫苗组合物，其可与其它治疗组合物、疫苗组合物、抗原组合物或免疫学组合物共同给予或序贯给予。
9.权利要求8的针对疟疾的疫苗组合物，其可与足以加强CD8+和/或CD4+免疫应答的其它物质例如白细胞介素或CD配体共同给予或序贯给予。
10.针对疟疾的疫苗组合物，其通过口服、肌内、腹膜内、皮下或透皮途径递送，或作为可植入或注射的装置递送。
11.权利要求7-10的针对疟疾的疫苗组合物，其用于制备用于预防疟疾的药物。
12.利用重组病毒递送疟疾疫苗的方法，其包括在初免-加强方案中使用人腺病毒和/或痘病毒和/或重组蛋白质。
13.权利要求12的利用重组病毒递送疟疾疫苗的方法，其包括两次序贯的免疫接种。
14.权利要求13的利用重组病毒递送疟疾疫苗的方法，其中初次免疫接种包括使用人腺病毒血清型5或重组蛋白质，并且加强免疫接种包括使用人腺病毒血清型5或者痘苗病毒WR毒株或Copenhagen毒株或经修饰的Ankara(MVA)或其它痘病毒毒株或者纯化的重组蛋白质。
15.权利要求14的利用重组病毒递送疟疾疫苗的方法，包括两次免疫接种之间6-8周的间隔。
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