WO2010123014A1 - 異種タンパク質を高生産する細胞の作製方法 - Google Patents

異種タンパク質を高生産する細胞の作製方法 Download PDF

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WO2010123014A1
WO2010123014A1 PCT/JP2010/057030 JP2010057030W WO2010123014A1 WO 2010123014 A1 WO2010123014 A1 WO 2010123014A1 JP 2010057030 W JP2010057030 W JP 2010057030W WO 2010123014 A1 WO2010123014 A1 WO 2010123014A1
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cell
dna encoding
cells
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久大 田淵
朋也 杉山
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中外製薬株式会社
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    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
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    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a cell that highly produces a heterologous protein.
  • DHFR dihydrofolate reductase
  • MTX methotrexate
  • An object of the present invention is to provide a method for producing a cell that highly produces a heterologous protein.
  • the inventors of the present invention have acquired MTX resistance when a bicarbonate transporter is strongly expressed in a host cell, and an antibody gene is introduced to produce an antibody.
  • the present inventors have found that when a bicarbonate transporter is strongly expressed in cells, MTX resistance is acquired, and antibody producing cells in which a bicarbonate transporter is strongly expressed can improve antibody production by high concentration MTX treatment. It came to complete.
  • the gist of the present invention is as follows. (1) Cells that strongly express a bicarbonate transporter and into which a DNA encoding a desired polypeptide has been introduced are cultured in the presence of high-concentration methotrexate, and cells that produce the desired polypeptide at a high level from living cells A method for producing a cell that highly produces a desired polypeptide, comprising selecting. (2) The method according to (1), wherein the cell in which a bicarbonate transporter is strongly expressed and a DNA encoding a desired polypeptide is introduced is a cell into which a DNA encoding a dihydrofolate reductase is further introduced. .
  • One molecule in which a cell that strongly expresses a bicarbonate transporter and into which a DNA encoding a desired polypeptide is introduced contains a DNA encoding the desired polypeptide and a DNA encoding dihydrofolate reductase
  • the method according to (2) which is a cell cotransformed by the method.
  • the method according to (3) wherein one molecule comprising DNA encoding a desired polypeptide and DNA encoding dihydrofolate reductase is a vector.
  • a method for producing a desired polypeptide comprising culturing the cell according to (6).
  • a method for producing a pharmaceutical comprising the polypeptide produced by the method according to (7) to (8).
  • One molecule in which a cell that strongly expresses a bicarbonate transporter and into which a DNA encoding a desired polypeptide is introduced contains a DNA encoding the desired polypeptide and a DNA encoding dihydrofolate reductase (11)
  • the method according to (11), wherein the cell is cotransformed by (13)
  • the method according to any one of (10) to (12), wherein the cell that strongly expresses the bicarbonate transporter further strongly expresses alanine aminotransferase.
  • a cell that strongly expresses a bicarbonate transporter and into which a DNA encoding a desired polypeptide is introduced is cultured in the presence of methotrexate, and a cell that highly produces the desired polypeptide is selected from the surviving cells.
  • a method for producing a cell that highly produces a desired polypeptide is selected from the surviving cells.
  • a method for producing a cell that highly produces a desired polypeptide is produced by treating a cell into which a bicarbonate transporter is strongly expressed and into which a DNA encoding a desired polypeptide has been introduced with methotrexate.
  • desired polypeptides including antibodies can be produced at a high production rate.
  • FIG. 1 shows that host cells in which anion exchanger (AE1) is strongly expressed acquire MTX resistance.
  • FIG. 2 is an anti-IL-6R antibody expression plasmid (pNeo / MRA / CAG-A).
  • FIG. 3 shows that by using DXB11y / AE1 host cells, a high antibody-producing strain higher than the parent strain DXB11y host can be obtained.
  • FIG. 4 shows that the antibody production amount of the AE1 strong expression strain increases after the high concentration MTX treatment.
  • FIG. 5 is based on the transmembrane region and orientation predicted by the TMpred program from the amino acid sequence of AE1 derived from human hepatocytes, referring to FIG. 1 of Exo Physiol 91.
  • FIG. 6 is a plasmid for selection of Hygromycin in which human AE1 (911 amino acids) was expressed.
  • FIG. 7 is a plasmid for puromycin selection in which human AE1 (911 amino acids) is expressed.
  • FIG. 6 is a plasmid for selection of Hygromycin in which human AE1 (911 amino acids) was expressed.
  • FIG. 7 is a plasmid for puromycin selection in which human AE1 (911 amino acids) is expressed.
  • FIG. 8 is a plot of anti-glypican-3 antibody production on day 12 of 50 ml shaker flask fed-batch culture
  • FIG. 10 is a survival plot on the 10th day of 50 ml shaker flask fed-batch culture.
  • FIG. 11 is a plot of anti-glypican-3 antibody production on the 8th day of 50-ml shaker flask fed-batch culture.
  • FIG. 12 is a graph showing the amount of antibody produced by 1 L Jar fed-batch culture of AA53, which is an AE1 / ALT1 co-expression strain.
  • the amount of anti-glypican-3 antibody produced on the 7th day of culture was 1.9 g / L.
  • cells in which a bicarbonate transporter is strongly expressed and a DNA encoding a desired polypeptide is introduced are cultured in the presence of high-concentration methotrexate (MTX).
  • MTX high-concentration methotrexate
  • a cell into which a bicarbonate transporter is strongly expressed and a DNA encoding a desired polypeptide is introduced is cultured in the presence of high concentration MTX.
  • the high concentration is more than twice the concentration at which the amplified gene is stably maintained (about 20 nM for CHO cells) during subculture after normal MTX cell selection. For example, no bicarbonate transporter is used.
  • the concentration at which the introduced strain will die 90% or more after 3 weeks of subculture.
  • CHO cells used for the production of recombinant proteins, such as CHO DXB11s cells are usually 50 nM or more. , Preferably 80 nM or more, more preferably 100 nM or more.
  • DNA encoding the desired polypeptide is introduced into cells that strongly express the bicarbonate transporter.
  • the desired polypeptide is not particularly limited, and antibodies (eg, anti-IL-6 receptor antibody, anti-IL-6 antibody, anti-glypican-3 antibody, anti-CD3 antibody, anti-CD20 antibody, anti-GPIIb / IIIa antibody, anti-TNF antibody) , Anti-CD25 antibody, anti-EGFR antibody, anti-Her2 / neu antibody, anti-RSV antibody, anti-CD33 antibody, anti-CD52 antibody, anti-IgE antibody, anti-CD11a antibody, anti-VEGF antibody, anti-VLA4 antibody) and bioactive proteins (granule) Sphere colony stimulating factor (G-CSF), granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), erythropoietin, interferon, interleukins such as IL-1 and IL-6, t-PA, urokinase, serum albumin, blood coagulation factor Any polypeptide such as PTH, etc., but antibodies are particularly preferred.
  • the antibody may be any antibody such as a
  • the bicarbonate transporter is a membrane protein having an exchange transport function that discharges bicarbonate anions (HCO 3 ⁇ ) or carbonate anions (CO 3 2 ⁇ ) and takes in chloride anions, sulfate anions and the like.
  • Examples of the bicarbonate transporter include SLC4 anion exchanger and SLC26 anion exchanger.
  • SLC4 anion exchanger is a membrane protein that regulates intracellular pH homeostasis and cell volume.
  • SLC4A1 AE1
  • SLC4A2 AE2
  • SLC4A3 AE3
  • SLC4A4 NBCe1
  • SLC4A5 NBCe2
  • SLC4A7 NBCn1
  • SLC4A8 kNBC3
  • SLC4A9 NBCn2
  • SLC4A9 SLC4A9
  • each, Na + -independent charge neutrality of Cl - and HCO 3 - is the exchanger of SLC4A1 (AE1), SLC4A2 (AE2 ), ALC4A3 (AE3), ALC4A9 (NBCn2 or AE4), electromotive ALC4A4 (NBCe1) of conductive, ALC4A5 (NBCe2), charge neutrality of Na + and HCO 3 - is a co-transporter ALC4A7 (NBCn1), Na + dependent manner charge neutrality of Cl - and HCO 3 It has different functions from ALC4A8 (kNBC3), ALC4A10 (NBCn3), and ALC4A11 (NaBC1), a cotransporter of electrogenic Na + and Borate.
  • AE1 contributes to transepithelial secretion and acid-base reabsorption in polar epithelial cells, and promotes osmolyte transport in sputum erythrocytes.
  • SLC4 anion exchanger SLC4A1 (AE1), SLC4A2 (AE2), SLC4A3 (AE3), SLC4A4 (NBCe1), SLC4A5 (NBCe2), SLC4A7 (NBCn1), SLC4A8 (kNBC3), SLC4A9 (NBCn) ), SLC4A11 (NaBC1) and the like, and AE1 is preferable.
  • SLC26 anion exchanger is a multifunctional membrane protein that acts in almost all organ systems, and exchanges and transports sulfate anion, iodine anion, formate anion, oxalate anion, chlorine anion, hydroxyl anion, bicarbonate anion, etc. Stuff, chloride channels, or anion-dependent molecular motors.
  • anion exchanger families SLC26A1, ⁇ 10SLC26A2, SLC26A3, SLC26A4, SLC26A5, SLC26A6, SLC26A7, SLC26A8, SLC26A9, SLC26A11).
  • SLC26A3, SLC26A4, SLC26A6, and SLC26A9 which are transporters of hydroxyl anion and bicarbonate anion, control the pH inside and outside the membrane in the same manner as the SLC4 anion exchanger.
  • SLC26A1, SLC26A2, SLC26A4, SLC26A6, SLC26A9, and SLC26A11 are expressed in the kidney.
  • SLC26A1 transports sulfate and oxalate anions, and SLC26A6 exchanges and transports various anions to take up sodium chloride.
  • SLC26A1 causes nephropathy
  • SLC26A4 and SLC26A6 cause hypertension
  • SLC26A5 causes hearing loss.
  • SLC26A7 is involved in acid-base homeostasis and blood pressure control.
  • SLC26 anion exchanger examples include SLC26A1, SLC26A2, SLC26A3, SLC26A4, SLC26A5, SLC26A6, SLC26A7, SLC26A8, SLC26A9 and SLC26A11.
  • the cells that strongly express the bicarbonate transporter are not particularly limited as long as the expression level of the bicarbonate transporter is increased as compared with natural cells.
  • Natural cells are not particularly limited, and examples include cells that are used as hosts when producing recombinant proteins such as CHO cells.
  • the bicarbonate transporter that is strongly expressed in cells may be any organism-derived bicarbonate transporter, and is not particularly limited. Specifically, rodents such as humans, mice, rats, and hamsters, mammals such as chimpanzees, cows, horses, dogs, and wolves, birds such as chickens, fish such as zebrafish and eel, and insects such as fruit fly Bicarbonate transporters derived from organisms such as humans, rodents or host cells are preferred, and for example, cells that strongly express the bicarbonate transporter are Chinese hamster ovary cells ( In the case of CHO cells, it is preferably a bicarbonate transporter derived from human or hamster.
  • Cells that strongly express the bicarbonate transporter may be any cells such as eukaryotic cells such as animal cells, plant cells, and yeast; prokaryotic cells such as Escherichia coli and Bacillus subtilis, but they are used as hosts when producing recombinant proteins.
  • Cultured cells are suitable, animal cells are preferred, and mammalian cells such as CHO cells and COS cells are particularly preferred.
  • Mammalian cells include humans, primates such as chimpanzees, rodents such as mice, rats, and hamsters, and others. Humans and rodents are preferred, and CHO cells are particularly preferred.
  • dhfr-deficient CHO cells for example, CHO cell DXB11 strain, CHO cell DG44 strain, etc.
  • dhfr-deficient CHO cells have a requirement for hypoxanthine and thymidine, they cannot grow in a medium that does not contain hypoxanthine and thymidine (hereinafter referred to as “HT-free medium”), but are transformed with a recombinant vector having a DHFR gene. It becomes possible to grow on an HT-free medium by conversion. Therefore, if dhfr-deficient CHO cells are used as hosts, it is convenient because transformed cells can be selected using the requirement for hypoxanthine and thymidine.
  • HT-free medium a medium that does not contain hypoxanthine and thymidine
  • Examples of cells that strongly express the bicarbonate transporter include cells into which a bicarbonate transporter gene (eg, SLC4 anion exchanger gene, SLC26 anion exchanger gene, etc.) has been artificially introduced.
  • a bicarbonate transporter gene eg, SLC4 anion exchanger gene, SLC26 anion exchanger gene, etc.
  • Cells into which a bicarbonate transporter gene has been artificially introduced can be produced by methods known to those skilled in the art, for example, by incorporating a bicarbonate transporter gene into a vector and transforming the vector into the cell. It is possible.
  • endogenous bicarbonate transporter gene is activated by gene activation technology (for example, see WO94 / 12650 pamphlet), and as a result, cells in which bicarbonate transporter is strongly expressed are also treated with bicarbonate transporter. Included in cells into which a gene has been artificially introduced.
  • Examples of the SLC4 anion exchanger gene to be introduced into the cell may include any of the following DNAs (a) to (e) encoding the SLC4 anion exchanger.
  • SLC4 anion exchanger activity can be measured as follows.
  • DNA encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 may be used as DNA encoding SLC4 anion exchanger.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 has an amino acid sequence in which one or more (for example, several) amino acids are substituted, deleted, added or / and inserted, and has SLC4 anion exchanger activity.
  • DNA encoding the polypeptide may be used.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is the amino acid sequence of human AE1.
  • AE1 in addition to humans, the sequence information of mice, rats, chimpanzees, cattle, horses, dogs, wolves, chickens, zebrafish, etc.
  • sequence information is registered in various databases, and these may be used.
  • polypeptide having an amino acid sequence in which one or a plurality of (for example, several) amino acids are substituted, deleted, added or / and inserted, and having SLC4 anion exchanger activity Functionally equivalent to human, mouse, rat, chicken, chimpanzee, cow, horse, dog, wolf, chicken, zebrafish SLC4 anion exchanger (hereinafter sometimes referred to as "SLC4 anion exchanger for humans") It is a polypeptide.
  • SLC4 anion exchanger for humans zebrafish SLC4 anion exchanger
  • Such polypeptides include, for example, SLC4 anion exchanger variants such as humans.
  • mutants in which 4 amino acids (L88R, E693G, V712A, H834Y) are substituted among 911 amino acids encoded by the public human SLC4 anion exchanger gene (AE1 gene) are used. It was.
  • a method for introducing a mutation into the polypeptide is known.
  • a person skilled in the art can perform site-directed mutagenesis (Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275, Zoller, MJ, and Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100 , 468-500, Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456, Kramer W, and Fritz HJ (1987) Methods. Enzymol.
  • SLC4 anion exchangers such as humans
  • a polypeptide functionally equivalent to an SLC4 anion exchanger such as human can be prepared. Amino acid mutations can also occur in nature.
  • amino acids in the amino acid sequence of an SLC4 anion exchanger such as human for example, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2) 1 or more, preferably 30 or less, more preferably 1 to 10 amino acids deleted, 1 or 2 or more, preferably 1 in the amino acid sequence of an SLC4 anion exchanger such as human 30 or less, more preferably 1 or more and 10 or less amino acid added, 1 or 2 or more, preferably 1 or more and 30 or less in the amino acid sequence of SLC4 anion exchanger such as human
  • 1 to 10 amino acids are substituted with other amino acids.
  • amino acid residue to be mutated is not particularly limited, but is preferably mutated to another amino acid that preserves the properties of the amino acid side chain.
  • amino acid side chain properties include hydrophobic amino acids (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), hydrophilic amino acids (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), amino acids having aliphatic side chains (G, A, V, L, I, P), amino acids having hydroxyl group-containing side chains (S, T, Y), sulfur atom-containing side chains Amino acids with amino acids (C, M), amino acids with carboxylic acid and amide-containing side chains (D, N, E, Q), amino groups with base-containing side chains (R, K, H), aromatic-containing side chains (H, F, Y, W) can be mentioned (all parentheses represent single letter symbols of amino acids).
  • polypeptide in which one or more amino acid residues are added to an SLC4 anion exchanger such as a human examples include a fusion polypeptide containing an SLC4 anion exchanger such as a human.
  • the fusion polypeptide is a fusion of an SLC4 anion exchanger such as human and another polypeptide.
  • the fusion polypeptide can be produced by linking a gene encoding an SLC4 anion exchanger such as a human and a gene encoding another polypeptide so that the frames coincide with each other, introducing the gene into an expression vector, and expressing it in the host. Any technique known to those skilled in the art can be used.
  • Other polypeptides that are subjected to fusion with SLC4 anion exchangers such as humans are not particularly limited.
  • Examples of other peptides subjected to fusion with human or other SLC4 anion exchanger include, for example, FLAG (Hopp, T. P. et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210), 6 HisHi ( (Histidine) 6xHis, 10xHis, influenza agglutinin (HA), human c-myc fragment, VSV-GP fragment, p18HIV fragment, T7-tag, HSV-tag, E-tag, SV40T antigen fragment, lck tag, ⁇ -tubulin fragment, B-tag, Protein C fragment, GST (glutathione-S-transferase), HA (influenza agglutinin), immunoglobulin constant region, ⁇ -galactosidase, MBP ( Maltose-binding polypeptide) and the like.
  • FLAG Hopp, T. P. et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210
  • 6 HisHi (Histidine
  • a fusion polypeptide can be prepared by fusing a commercially available gene encoding these polypeptides with a gene encoding an SLC4 anion exchanger such as human and expressing the prepared fusion gene. .
  • Hybridization conditions for isolating DNA encoding a polypeptide functionally equivalent to a human or other SLC4 anion exchanger can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • hybridization conditions include low stringency conditions.
  • Low stringent conditions include, for example, 42 ° C., 2 ⁇ SSC, 0.1% SDS, preferably 50 ° C., 2 ⁇ SSC, 0.1% SDS. More preferably, highly stringent conditions are included.
  • Examples of highly stringent conditions include 65 ° C., 2 ⁇ SSC, and 0.1% SDS. Under these conditions, not only DNA having high homology as the temperature is lowered but also DNA having low homology can be obtained comprehensively. On the contrary, it can be expected that only DNA having high homology can be obtained as the temperature is increased. However, multiple factors other than temperature, such as salt concentration, can be considered as factors affecting the stringency of hybridization, and those skilled in the art can realize the same stringency by selecting these factors as appropriate. It is.
  • Polypeptides encoded by DNA isolated by these hybridization techniques may be those that have 70% or more identity in amino acid sequence with SLC4 anion exchangers such as humans. High homology in amino acid sequence with changer. High homology usually refers to 97% or more identity, preferably 98% or more identity, more preferably 99% or more identity.
  • the algorithm described in the literature Wang, W. J. and Lipman, D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80, 726-730 was used. I just need it.
  • Polypeptides may differ in amino acid sequence, molecular weight, isoelectric point, presence or absence of sugar chains, form, etc., depending on the cells, hosts or purification methods that produce them.
  • a DNA encoding it can be used in the present invention.
  • a polypeptide when expressed in a prokaryotic cell such as E. coli, a methionine residue is added to the N-terminus of the original polypeptide amino acid sequence.
  • a eukaryotic cell such as a mammalian cell, the N-terminal signal sequence is removed.
  • DNA encoding such a polypeptide can also be used in the present invention.
  • DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 1 may be used as DNA encoding the SLC4 anion exchanger.
  • a DNA that hybridizes with a DNA complementary to the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 under stringent conditions and encodes a polypeptide having SLC4 anion exchanger activity may be used.
  • the base sequence of SEQ ID NO: 1 is the base sequence of human AE1.
  • AE1 in addition to humans, the sequence information of mice, rats, chimpanzees, cows, horses, dogs, wolves, chickens, zebrafish, etc.
  • sequence information is registered in various databases, and these may be used.
  • the DNA encoding the SLC4 anion exchanger can be used for production of the desired polypeptide as described above in “in vivo” and “in vitro”, and can also be used to produce cells that strongly express the SLC4 anion exchanger.
  • the DNA encoding the SLC4 anion exchanger may be in any form as long as it can encode the SLC4 anion exchanger. That is, it does not matter whether it is cDNA synthesized from mRNA, genomic DNA, or chemically synthesized DNA. Moreover, as long as it can code DNA which codes SLC4 anion exchanger, DNA which has arbitrary base sequences based on the degeneracy of a genetic code is contained.
  • DNA encoding SLC4 anion exchanger can be prepared by methods known to those skilled in the art. For example, it can be prepared by preparing a cDNA library from cells expressing the SLC4 anion exchanger and performing hybridization using a part of the DNA sequence of the SLC4 anion exchanger (eg, SEQ ID NO: 1) as a probe. .
  • the cDNA library may be prepared by the method described in, for example, Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, Cold Harbor Laboratory Press (1989), or a commercially available gene library may be used.
  • RNA is prepared from cells expressing the SLC4 anion exchanger, an oligo DNA is synthesized based on the DNA sequence of the SLC4 anion exchanger (eg, SEQ ID NO: 1), and this is used as a primer for PCR reaction. And amplifying the cDNA encoding the SLC4 anion exchanger.
  • genomic DNA can be isolated by screening a genomic DNA library using the obtained cDNA as a probe.
  • mRNA is isolated from cells, tissues, etc. that express SLC4 anion exchanger. Isolation of mRNA is performed by a known method such as guanidine ultracentrifugation (Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), AGPC method (Chomczynski, P. and Sacchi, N. , Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159), etc., and mRNA is purified from the total RNA using mRNA, Purification, Kit (Pharmacia), etc. Alternatively, mRNA can be directly prepared by using QuickPrep® mRNA® Purification® Kit® (Pharmacia) ®.
  • CDNA is synthesized from the obtained mRNA using reverse transcriptase.
  • Synthesis of cDNA can also be performed using “AMV”, “Reverse”, “Transcriptase”, “First-strand”, “cDNA”, “Synthesis”, “Kit” (Seikagaku Corporation) or the like.
  • 5'-Ampli INRACE Kit manufactured by Clontech
  • polymerase chain reaction polymer polymerase chain reaction; PCR
  • a recombinant vector is prepared from this, introduced into Escherichia coli, etc., and colonies are selected to prepare a desired recombinant vector.
  • the base sequence of the target DNA can be confirmed by a known method, for example, the dideoxynucleotide chain termination method.
  • DNA encoding the SLC4 anion exchanger in DNA encoding the SLC4 anion exchanger, a nucleotide sequence with higher expression efficiency can be designed in consideration of the codon usage of the host used for expression (Grantham, R. et al., Nucelic Acids Research (1981) 9, r43-74).
  • the DNA encoding the SLC4 anion exchanger can be modified by a commercially available kit or a known method. Examples of modifications include digestion with restriction enzymes, insertion of synthetic oligonucleotides and appropriate DNA fragments, addition of linkers, insertion of start codon (ATG) and / or stop codon (TAA, TGA, or TAG). .
  • the DNA encoding the SLC4 anion exchanger is also a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA complementary to the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and is functionally equivalent to the SLC4 anion exchanger Includes DNA encoding the polypeptide.
  • Stringent conditions can be appropriately selected by those skilled in the art, and examples thereof include low stringent conditions.
  • Low stringent conditions include, for example, 42 ° C., 2 ⁇ SSC, 0.1% SDS, preferably 50 ° C., 2 ⁇ SSC, 0.1% SDS. More preferably, highly stringent conditions are included. Examples of highly stringent conditions include 65 ° C., 2 ⁇ SSC, and 0.1% SDS. Under these conditions, DNA having high homology can be obtained as the temperature is increased.
  • Said hybridizing DNA may preferably be naturally derived DNA, such as cDNA or chromosomal DNA.
  • DNA isolated by these hybridization techniques usually has high identity in nucleotide sequence with DNA encoding SLC4 anion exchanger such as human.
  • the DNA encoding the SLC4 anion exchanger includes a polypeptide that is functionally equivalent to a human SLC4 anion exchanger and has a high identity with a DNA encoding a human SLC4 anion exchanger. It is. High identity usually refers to an identity of 96% or higher, preferably 98% or higher, more preferably 99% or higher.
  • the identity of the base sequence can be determined by the algorithm BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877, 1993) by Karlin and Altschul.
  • the bicarbonate transporter gene introduced into the cell may be the SLC26 anion exchanger gene.
  • DNA encoding the bicarbonate transporter may be inserted into the vector.
  • the vector for example, when Escherichia coli is used as a host, the vector is amplified in Escherichia coli (for example, JM109, DH5 ⁇ , HB101, XL1Blue), etc. And a transformed gene of E. coli (for example, a drug resistance gene that can be discriminated by any drug (ampicillin, tetracycline, kanamycin, chloramphenicol)).
  • Escherichia coli for example, JM109, DH5 ⁇ , HB101, XL1Blue
  • a transformed gene of E. coli for example, a drug resistance gene that can be discriminated by any drug (ampicillin, tetracycline, kanamycin, chloramphenicol)
  • Examples of vectors include M13 vectors, pUC vectors, pBR322, pBluescript, pCR-Script, and the like.
  • an expression vector is particularly useful when the vector is used for the purpose of producing a desired polypeptide.
  • the host is E. coli such as JM109, DH5 ⁇ , HB101, XL1-Blue, etc.
  • promoters that can be expressed efficiently in E. coli such as the lacZ promoter (Ward et al., Nature (1989) 341, 544-546; FASEB J.
  • telomeres pGEX-5X-1 (Pharmacia), “QIAexpress® system” (Qiagen), pEGFP, or pET (in this case, the host expresses T7 RNA polymerase in addition to the above vectors).
  • BL21 is preferred).
  • the vector may also contain a signal sequence for polypeptide secretion.
  • a signal sequence for polypeptide secretion a pelB signal sequence (Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) may be used when the periplasm of E. coli is used for production.
  • Introduction of a vector into a host cell can be performed using, for example, a calcium chloride method or an electroporation method.
  • examples of vectors used for producing a desired polypeptide include mammalian-derived expression vectors (for example, pcDNA3 (manufactured by Invitrogen), pEGF-BOS (Nucleic Acids) .Res.1990, 18 (17), p5322), pEF, pCDM8), insect cell-derived expression vectors (eg “Bac-to-BAC baculovairus expression system” (GIBCO BRL), pBacPAK8), plant-derived expression Vectors (eg, pMH1, pMH2), animal virus-derived expression vectors (eg, pHSV, pMV, pAdexLcw), retrovirus-derived expression vectors (eg, pZIpneo), yeast-derived expression vectors (eg, “Pichia Expression Kit”) Invitrogen), pNV11, SP-Q01), Bacillus subtilis-derived expression vectors (for example, pcDNA3 (manufactured by Invit
  • promoters necessary for expression in cells such as the SV40 promoter (Mulligan et al., Nature (1979) 277, 108), It preferably has a MMLV-LTR promoter, an EF1 ⁇ promoter (Mizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 2 18, 5322), a CMV promoter, etc., and a gene (eg, drug (for example, drug ( More preferably, it has a drug resistance gene) that can be discriminated by neomycin, G418, etc.).
  • examples of such a vector include pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, and pOP13.
  • a vector having a DHFR gene complementary to the CHO cell lacking the nucleic acid synthesis pathway for example, , PCHOI, etc.
  • amplifying with methotrexate (MTX) for example, COS with a gene expressing SV40 T antigen on the chromosome
  • COS with a gene expressing SV40 T antigen on the chromosome An example is a method of transforming with a vector (such as pcD) having an SV40 replication origin using cells.
  • a vector such as pcD
  • the replication origin those derived from polyoma virus, adenovirus, bovine papilloma virus (BPV) and the like can also be used.
  • expression vectors can include aminoglycoside transferase (APH) gene, thymidine kinase (TK) gene, E. coli xanthine guanine phosphoribosyltransferase (Ecogpt) gene, etc. as selectable markers. .
  • APH aminoglycoside transferase
  • TK thymidine kinase
  • Ecogpt E. coli xanthine guanine phosphoribosyltransferase
  • the host cell into which DNA encoding the bicarbonate transporter (which may be incorporated into the vector) is not particularly limited, and for example, Escherichia coli and various animal cells can be used. If a DNA encoding a desired polypeptide is introduced into a host cell into which a DNA encoding a bicarbonate transporter has been introduced, the host cell can strongly express the bicarbonate transporter and produce the desired polypeptide. Can be increased. A host cell into which DNA encoding a bicarbonate transporter has been introduced may be further introduced with DNA encoding ALT (which may be incorporated into a vector).
  • Production systems for producing polypeptides include in vitro and in vivo production systems. Examples of in vitro production systems include production systems that use eukaryotic cells and production systems that use prokaryotic cells.
  • the order of introduction of the bicarbonate transporter gene and the gene encoding the desired polypeptide is not particularly limited, and the bicarbonate transporter A gene encoding a desired polypeptide may be introduced after the gene has been introduced, or a bicarbonate transporter gene may be introduced after introducing a gene encoding the desired polypeptide. Alternatively, a bicarbonate transporter gene and a gene encoding a desired polypeptide may be introduced simultaneously.
  • the introduction of the bicarbonate transporter gene and the gene encoding the desired polypeptide may be introduced simultaneously by a single vector or may be introduced separately using a plurality of vectors.
  • Cells that strongly express the bicarbonate transporter may further express alanine aminotransferase (ALT).
  • ALT alanine aminotransferase
  • ALT is originally known as an enzyme that transfers the amino group of alanine to 2-oxoglutarate to produce glutamate, but by strongly expressing it in host cells such as CHO cells, alanine can be converted to pyruvate or glutamate. If the reaction that biosynthesizes can be promoted, it can be used for metabolism in the TCA cycle and glucose production by gluconeogenesis, so that the culture behavior of the cells is improved, and high production of the desired polypeptide is expected.
  • the cell that strongly expresses ALT is not particularly limited as long as the expression level of ALT is increased as compared with natural cells.
  • Natural cells are not particularly limited, and examples include cells that are used as hosts when producing recombinant proteins such as CHO cells.
  • Examples of cells that strongly express ALT include cells into which the ALT gene has been artificially introduced.
  • Cells into which the ALT gene has been artificially introduced can be produced by methods known to those skilled in the art, for example, by incorporating the ALT gene into a vector and transforming the vector into the cell. It is.
  • endogenous ALT gene is activated by gene activation technology (for example, see WO94 / 12650 pamphlet), and as a result, ALT gene is artificially introduced into cells in which ALT is strongly expressed. Included in the treated cells.
  • ALT that is strongly expressed in cells may be any ALT derived from any organism and is not particularly limited. Specifically, human, mouse, rat, dog, Xenopus, Drosophila, nematode, Japanese rice, atomic red algae, baker's yeast, filamentous fungus Ashbyabygossypii, fungus Candida albicans, fission yeast, fungus Aspergillus nidulans, fungus Aspergillus fumigatus, Aspergillus oryzae, fungus Cryptococcus neoformans, cellular slime mold Dictyostelium discoideum, Trypanosoma brucei, intracellular parasitic protozoa Leishmania major, Shigella amoeba Entamoeba histolytica or intracellular parasitic protozoa Trypanosoma cruzi, etc.
  • ALT1 is an ALT derived from the same species as the human, rodent or host cell.
  • the cell that strongly expresses ALT is a Chinese hamster ovary cell (CHO cell)
  • Variants exist in ALTs such as humans, mice, and yeasts.
  • ALT2 has 80% or more homology with ALT1 at the amino acid level. In Examples and Reference Examples described later, ALT1 was forcibly expressed.
  • Examples of the ALT gene to be introduced into cells include the following DNAs (a2) to (e2) encoding ALT.
  • KEGG / ENZYME 2.6.1.2 / Oryza sativa japonica (Japanese rice): 4342210, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Oryza sativa japonica (Japanese rice): 4348524, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Cyanidioschyzon merolae: CMM066C , KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Saccharomyces cerevisiae: YLR089C, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Saccharomyces cerevisiae: YDR111C, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Ashbya gossypii (Eremothecium gossypii): AGOS_AGR0Z 1.2 / Candida albicans: CaO19_346, KEGG / ENZYME: 2.6.
  • KEGG / ENZYME 2.6.1.2 / Oryza sativa japonica (Japanese rice): 4342210, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Oryza sativa japonica (Japanese rice): 4348524, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Cyanidioschyzon merolae: CMM066C , KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Saccharomyces cerevisiae: YLR089C, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Saccharomyces cerevisiae: YDR111C, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Ashbya gossypii (Eremothecium gossypii): AGOS_AGR0Z 1.2 / Cand ida albicans: CaO19_346, KEGG / ENZYME
  • KEGG / ENZYME 2.6.1.2 / Oryza sativa japonica (Japanese rice): 4342210, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Oryza sativa japonica (Japanese rice): 4348524, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Cyanidioschyzon merolae: CMM066C , KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Saccharomyces cerevisiae: YLR089C, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Saccharomyces cerevisiae: YDR111C, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Ashbya gossypii (Eremothecium gossypii): AGOS_AGR0Z 1.2 / Candi da albicans: CaO19_346, KEGG / ENZYME: AG
  • KEGG / ENZYME 2.6.1.2 / Oryza sativa japonica (Japanese rice): 4342210, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Oryza sativa japonica (Japanese rice): 4348524, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Cyanidioschyzon merolae: CMM066C , KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Saccharomyces cerevisiae: YLR089C, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Saccharomyces cerevisiae: YDR111C, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Ashbya gossypii (Eremothecium gossypii): AGOS_AGR0Z 1.2 / Cand ida albicans: CaO19_346, KEGG / ENZYME
  • KEGG / ENZYME 2.6.1.2 / Oryza sativa japonica (Japanese rice): 4342210, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Oryza sativa japonica (Japanese rice): 4348524, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Cyanidioschyzon merolae: CMM066C , KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Saccharomyces cerevisiae: YLR089C, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Saccharomyces cerevisiae: YDR111C, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Ashbya gossypii (Eremothecium gossypii): AGOS_AGR0Z 1.2 / Cand ida albicans: CaO19_346, KEGG / ENZYME
  • ALT activity can be measured as follows.
  • ALT activity value using alanine aminotransferase measurement reagent for automatic analysis (Lampia Liquid S-ALT (approval number 20900AMZ00597000)) and Rajamohan F. et.al. Protein Expression and Purification (2006) 48, 81-89 Ask for.
  • KEGG / ENZYME 2.6.1.2 / Homo sapiens (human): 2875, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (human): 84706, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Mus musculus (mouse): 76282, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Mus musculus (mouse): 108682, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Rattus norvegicus (rat): 81670, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 familiaris (dog): 609510, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Xenopus laevis (African clawed frog): 444533, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Drosophila melanogaster (fruit fly
  • DNA encoding a polypeptide having an amino acid sequence in which one or a plurality of amino acids are substituted, deleted, added or / and inserted and having ALT activity in the above amino acid sequence may be used.
  • Sequence numbers 3 and 4 in the sequence listing show the base sequence and amino acid sequence of the gene encoding human ALT1, respectively (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (human): 2875).
  • KEGG / ENZYME 2.6.1.2 / Homo sapiens (human): 2875, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (human): 84706, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Mus musculus (mouse): 76282, KEGG / KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Mus musculus (mouse): 108682, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Rattus norvegicus (rat): 81670, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / mCanis familiaris (dog): 609510, YEG 2.6.1.2 / Xenopus laevis (African clawed frog): 444533, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Drosophila melanogaster (fruit fly): Dmel_CG1640, KE
  • Such polypeptides include, for example, ALT variants such as humans.
  • ALT variants such as humans.
  • mutants in which 4 amino acids (R53S, Q72R, F286S, M332K) were substituted in 496 amino acids encoded by the published human ALT1 gene were used. .
  • a method for introducing a mutation into the polypeptide is known.
  • a person skilled in the art can perform site-directed mutagenesis (Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275, Zoller, MJ, and Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100 , 468-500, Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456, Kramer W, and Fritz HJ (1987) Methods. Enzymol.
  • ALT amino acids such as humans, etc.
  • Polypeptides functionally equivalent to ALT can be prepared. Amino acid mutations can also occur in nature.
  • polypeptides functionally equivalent to ALTs such as humans include the amino acid sequences of ALTs such as humans (for example, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (human): 2875, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (human): 84706, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Mus musculus (mouse): 76282, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Mus musculus (mouse): 108682, KEGG / ENZYME: 2.6.
  • KEGG / ENZYME 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 506529.420, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 506529.430, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 510889.120 or KEGG / ENZYME: 510.1.2 cruzi 40: 1) or 2 or more, preferably 1 or more and 30 or less, more preferably 1 or more and 10 or less amino acids deleted in the amino acid sequence of ALT such as human, Preferably, 1 or more and 30 or less, more preferably 1 or more and 10 or less amino acids added, 1 or 2 or more, preferably 1 or more and 30 or less in the amino acid sequence of ALT such as human More preferably, one or more and 10 or less amino acids are substituted with other amino acids.
  • amino acid residue to be mutated is not particularly limited, but is preferably mutated to another amino acid that preserves the properties of the amino acid side chain.
  • amino acid side chain properties include hydrophobic amino acids (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), hydrophilic amino acids (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), amino acids having aliphatic side chains (G, A, V, L, I, P), amino acids having hydroxyl group-containing side chains (S, T, Y), sulfur atom-containing side chains Amino acids with amino acids (C, M), amino acids with carboxylic acid and amide-containing side chains (D, N, E, Q), amino groups with base-containing side chains (R, K, H), aromatic-containing side chains (H, F, Y, W) can be mentioned (all parentheses represent single letter symbols of amino acids).
  • Examples of the polypeptide in which one or more amino acid residues are added to ALT such as human include a fusion polypeptide containing ALT such as human.
  • the fusion polypeptide is a fusion of ALT such as human and other polypeptides.
  • the fusion polypeptide can be prepared by linking a gene encoding ALT such as human and a gene encoding another polypeptide so that the frames coincide with each other, introducing this into an expression vector, and expressing it in a host.
  • Other polypeptides attached to fusion with ALT such as human are not particularly limited.
  • Examples of other peptides attached to fusion with human ALT include, for example, FLAG (Hopp, T. P. et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210), 6 His (histidine) residue 6 ⁇ His, 10 ⁇ His, influenza agglutinin (HA), human c-myc fragment, VSV-GP fragment, p18HIV fragment, T7-tag, HSV-tag, E-tag, SV40T antigen Fragment, lck tag, ⁇ -tubulin fragment, B-tag, Protein C fragment, GST (glutathione-S-transferase), HA (influenza agglutinin), immunoglobulin constant region, ⁇ -galactosidase, MBP (maltose binding poly) Peptide) and the like.
  • FLAG Hopp, T. P. et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210
  • 6 His histidine residue 6 ⁇ His, 10 ⁇
  • a fusion polypeptide can be prepared by fusing a commercially available gene encoding these polypeptides with a gene encoding ALT such as human and expressing the prepared fusion gene.
  • ALT such as human (for example, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (human): 2875, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (human): 84706, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Mus musculus (mouse): 76282, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Mus musculus (mouse): 108682, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Rattus norvegicus (670), 67081 KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Canis familiaris (dog): 609510, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Xenopus laevis (African clawed frog): 444533, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Xenopus laevis (African clawed
  • Hybridization conditions for isolating DNA encoding a polypeptide functionally equivalent to human or other ALT can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • hybridization conditions include low stringency conditions.
  • Low stringent conditions include, for example, 42 ° C., 2 ⁇ SSC, 0.1% SDS, and preferably 50 ° C., 2 ⁇ SSC, 0.1% SDS. More preferably, highly stringent conditions are included.
  • highly stringent conditions include 65 ° C., 2 ⁇ SSC, and 0.1% SDS. Under these conditions, not only DNA having high homology as the temperature is lowered but also DNA having low homology can be obtained comprehensively. On the contrary, it can be expected that only DNA having high homology can be obtained as the temperature is increased. However, multiple factors other than temperature, such as salt concentration, can be considered as factors affecting the stringency of hybridization, and those skilled in the art can realize the same stringency by selecting these factors as appropriate. It is.
  • Polypeptides encoded by DNA isolated by these hybridization techniques may be those having 70% identity or more in amino acid sequence with human ALT, but are usually high in amino acid sequence with human ALT. Have homology. High homology usually refers to 97% or more identity, preferably 98% or more identity, more preferably 99% or more identity.
  • the algorithm described in the literature Wang, W. J. and Lipman, D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80, 726-730 was used. I just need it.
  • Polypeptides may differ in amino acid sequence, molecular weight, isoelectric point, presence or absence of sugar chains, form, etc., depending on the cells, hosts or purification methods that produce them. However, as long as the obtained polypeptide has a function equivalent to ALT such as human, DNA encoding it can be used in the present invention. For example, when a polypeptide is expressed in a prokaryotic cell such as E. coli, a methionine residue is added to the N-terminus of the original polypeptide amino acid sequence. Further, when expressed in a eukaryotic cell such as a mammalian cell, the N-terminal signal sequence is removed. DNA encoding such a polypeptide can also be used in the present invention.
  • the DNA encoding ALT can be used for the production of the desired polypeptide as described above in “in vivo” and “in vitro”, as well as in the production of cells that strongly express ALT.
  • the DNA encoding ALT may be in any form as long as it can encode ALT. That is, it does not matter whether it is cDNA synthesized from mRNA, genomic DNA, or chemically synthesized DNA.
  • DNA having an arbitrary base sequence based on the degeneracy of the genetic code is included as long as it can encode DNA encoding ALT.
  • DNA encoding ALT can be prepared by methods known to those skilled in the art.
  • a cDNA library is prepared from a cell expressing ALT, and the ALT DNA sequence (eg, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (human): 2875, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (human): 84706, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Mus musculus (mouse): 76282, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Mus musculus (mouse): 108682, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Rattus nor rat): 81670, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Canis familiaris (dog): 609510, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Xenopus laevis (African clawed f
  • RNA is prepared from cells expressing ALT, and the DNA sequence of ALT (eg, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (human): 2875, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens ( human): 84706, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Mus musculus (mouse): 76282, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Mus musculus (mouse): 108682, KEGG / KEENZYME: 2.6.1.2 / Rattus norvegicus : 81670, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Canis familiaris (dog): 609510,
  • genomic DNA can be isolated by screening a genomic DNA library using the obtained cDNA as a probe.
  • mRNA is isolated from cells or tissues that express ALT. Isolation of mRNA is performed by a known method such as guanidine ultracentrifugation (Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), AGPC method (Chomczynski, P. and Sacchi, N. , Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159), etc., and mRNA is purified from the total RNA using mRNA, Purification, Kit (Pharmacia), etc. Alternatively, mRNA can be directly prepared by using QuickPrep® mRNA® Purification® Kit® (Pharmacia) ®.
  • CDNA is synthesized from the obtained mRNA using reverse transcriptase.
  • Synthesis of cDNA can also be performed using “AMV”, “Reverse”, “Transcriptase”, “First-strand”, “cDNA”, “Synthesis”, “Kit” (Seikagaku Corporation) or the like.
  • 5'-Ampli RACE Kit manufactured by Clontech
  • 5'-RACE method using polymerase chain reaction (polymerase chain reaction; PCR) (Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) it can.
  • a recombinant vector is prepared from this, introduced into Escherichia coli, etc., and colonies are selected to prepare a desired recombinant vector.
  • the base sequence of the target DNA can be confirmed by a known method, for example, the dideoxynucleotide chain termination method.
  • DNA encoding ALT a base sequence with higher expression efficiency can be designed in consideration of the codon usage of the host used for expression (Grantham, R. et al., Nucelic Acids Research ( (1981) 9, r43-74).
  • the DNA encoding ALT can be modified by a commercially available kit or a known method. Examples of modifications include digestion with restriction enzymes, insertion of synthetic oligonucleotides and appropriate DNA fragments, addition of linkers, insertion of start codon (ATG) and / or stop codon (TAA, TGA, or TAG). .
  • DNA encoding ALT is also KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (human): 2875, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (human): 84706, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Mus musculus (mouse): 76282, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Mus musculus (mouse): 108682, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Rattus norvegicus (rat): 81670, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Canis familiaris ): 609510, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Xenopus laevis (African clawed frog): 444533, KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Drosophila melanogaster (fruit fly): D
  • Stringent conditions can be appropriately selected by those skilled in the art, and examples thereof include low stringent conditions.
  • Low stringent conditions include, for example, 42 ° C., 2 ⁇ SSC, 0.1% SDS, and preferably 50 ° C., 2 ⁇ SSC, 0.1% SDS. More preferably, highly stringent conditions are included. Examples of highly stringent conditions include 65 ° C., 2 ⁇ SSC, and 0.1% SDS. Under these conditions, DNA having high homology can be obtained as the temperature is increased.
  • Said hybridizing DNA may preferably be naturally derived DNA, such as cDNA or chromosomal DNA.
  • DNAs isolated by these hybridization techniques usually have high identity in base sequence with DNA encoding ALT such as human.
  • the DNA encoding ALT includes a polypeptide that encodes a polypeptide functionally equivalent to ALT such as human and has high identity with DNA encoding ALT such as human.
  • High identity usually refers to an identity of 96% or higher, preferably 98% or higher, more preferably 99% or higher.
  • a DHFR gene may be introduced into a cell that strongly expresses a bicarbonate transporter together with DNA encoding a desired polypeptide.
  • the number of copies in the cell is amplified by MTX (gene amplification), and the cell becomes MTX resistant.
  • a cell that strongly expresses a bicarbonate transporter may be a cell that has been co-transformed with one molecule (for example, a vector) containing DNA encoding a desired polypeptide and DNA encoding DHFR.
  • a recombinant vector in which a DNA encoding a desired polypeptide is linked to a DHFR gene is introduced into cells, and the cells are cultured in the presence of MTX, cells that produce the desired polypeptide at a high yield are obtained by gene amplification.
  • the DHFR gene may be derived from any organism and its DNA sequence is known (mouse GenBank V00734, rat GenBank AF318150, human GenBank J00140), the DHFR gene is prepared according to the information and introduced into the vector. can do.
  • an expression vector pOptiVEC TM -TOPO (registered trademark) vector, INVITROGEN
  • pOptiVEC TM -TOPO registered trademark
  • a DNA encoding a desired polypeptide and a DNA encoding DHFR may be introduced after introducing the bicarbonate transporter gene into the cell, Conversely, the bicarbonate transporter gene may be introduced after introducing the DNA encoding the desired polypeptide and the DNA encoding DHFR into the cell, or the DNA encoding the bicarbonate transporter gene and the desired polypeptide DNA encoding DHFR may be simultaneously introduced into cells.
  • the introduction of the bicarbonate transporter gene (and in some cases the ALT gene) and the DNA encoding the desired polypeptide may be introduced simultaneously by a single vector or may be introduced separately using multiple vectors. Good.
  • the DNA encoding the desired polypeptide and the DHFR gene may be introduced into a single vector, or may be introduced into separate vectors. In order to efficiently establish a high-expressing cell line by gene amplification, it is preferable to introduce the DNA encoding the desired polypeptide and the DHFR gene into a single vector.
  • the DHFR gene is connected downstream of a promoter with low transcription efficiency (for example, SV40 promoter), and the DNA encoding the desired polypeptide has a high transcription efficiency (for example, CMV promoter, SR ⁇ promoter). It is preferable to connect downstream of a promoter, EF-1 ⁇ promoter, etc.).
  • the DNA encoding the desired polypeptide and the DHFR gene may be introduced into the host cell by co-introduction.
  • the vector incorporating the DNA encoding the desired polypeptide may be introduced into the host cell in an excess amount (usually about 2 to 40 times the excess amount) than the vector incorporating the DHFR gene.
  • the expression vector may be cleaved with an appropriate restriction enzyme, linearized, and then introduced into the host cell. By making it linear, the target gene expression unit is easily incorporated into the chromosome of the host cell.
  • the gene transfer method is not particularly limited, and may be any method such as a calcium phosphate method, a DEAE dextran method, a lipofection method, an electroporation method and the like. If the gene is introduced with NUCLEOFECTOR (AMAXA), multiple copies can be introduced.
  • culturing in a selective medium may be performed to select the cell into which the target gene has been introduced. For example, by inserting a DNA encoding a desired polypeptide into a vector having a drug resistance gene, transforming host cells, and then culturing in a drug-containing medium, surviving cells can be selected as transformed cells. .
  • a DNA encoding a desired polypeptide is inserted into a vector having a DHFR gene and dhfr-deficient CHO cells are transformed as host cells, the surviving cells are cultured by culturing in an HT-free medium. It can be selected as a transformed cell.
  • CHO-S-SFMII / CD-CHO mixed medium (Invitrogen) or the like can be used.
  • MTX a high production rate and a high growth rate. The growth rate can be compared by measuring the number of viable cells during subculture.
  • MTX treatment is, for example, culturing (preferably, subculture) in a medium supplemented with a high concentration of MTX.
  • High concentration means more than twice the concentration ⁇ ⁇ ⁇ (about 20 nM for CHO cells) at which the amplified gene is stably maintained during subculture after normal MTX cell selection, for example, no bicarbonate transporter
  • concentration at which the introduced strain will die 90% or more after 3 weeks of subculture.
  • CHO cells used for the production of recombinant proteins such as CHO DXB11s cells, are usually 50 nM or more. , Preferably 80 nM or more, more preferably 100 nM or more.
  • the culture period is suitably 7 to 35 days, preferably 14 to 28 days, and more preferably 21 to 28 days.
  • the MTX concentration should be increased stepwise.
  • the cells are cultured in a medium having an MTX concentration of 10 nM for 14 to 21 days, and cultured in a medium having an MTX concentration of 100 nM for 14 to 28 days.
  • CHO-S-SFMII / CD-CHO mixed medium (Invitrogen) etc. can be used as a medium to which MTX is added at a high concentration.
  • the cells that strongly express the bicarbonate transporter of the present invention have excellent resistance to MTX, as will be apparent from the examples described later, and are selected at a concentration higher than the selection concentration by normal MTX. It is possible to
  • the bicarbonate transporter strongly expressing cell of the present invention is extremely useful as a transformed cell used for MTX selection.
  • the present invention also provides a cell that is produced by the above-described method and highly produces a desired polypeptide.
  • the cells may be heterogeneous cell groups or cloned uniform cell lines.
  • the present invention also provides a method for producing a polypeptide, comprising culturing cells produced by the above method. Furthermore, in the present specification, a gene that encodes an endogenous desired polypeptide of the cell is activated by a gene activation technique (for example, see WO94 / 12650 pamphlet), so that a desired polypeptide is activated. It is also possible to produce a desired polypeptide using cells that produce the peptide.
  • a gene activation technique for example, see WO94 / 12650 pamphlet
  • a medium used in normal cell (preferably animal cell) culture can be used. These usually include amino acids, vitamins, lipid factors, energy sources, osmotic regulators, iron sources, pH buffers. The content of these ingredients is usually 0.05-1500 mg / L for amino acids, 0.001-10 mg / L for vitamins, 0-200 mg / L for lipid factors, 1-20 g / L for energy sources, 0.1 for osmotic pressure regulators. -10000 mg / L, iron source 0.1-500 mg / L, and pH buffer 1-10000 mg / L are suitable, but not limited thereto, the type of cells to be cultured, the desired polypeptide (eg, It can be determined appropriately depending on the type of antibody and the like.
  • trace metal elements for example, trace metal elements, surfactants, growth cofactors, nucleosides and the like may be added.
  • the content of these components is usually 0.00001-200 mg / L for trace metal elements, 0-5000 mg / L for surfactants, 0.05-10000 ⁇ g / L for growth cofactors, and 0.001-50 mg / L for nucleosides.
  • the present invention is not limited thereto, and can be appropriately determined depending on the type of cells to be cultured, the type of desired polypeptide, and the like.
  • L-alanine, L-arginine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-cysteine, L-cystine, L-glutamine, L-glutamic acid glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L-methionine, L-ornithine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-valine, etc.
  • L-alanine , L-arginine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-cystine, L-glutamine, L-glutamic acid glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L-methionine, L- Amino acids such as phenylalan
  • trace metal elements such as copper sulfate, manganese sulfate, zinc sulfate, magnesium sulfate, nickel chloride, tin chloride, magnesium chloride, sodium silicate and the like, preferably copper sulfate, zinc sulfate, magnesium sulfate and the like; Surfactants such as Tween80 and Pluronic F68; and recombinant insulin, recombinant IGF-1, recombinant EGF, recombinant FGF, recombinant PDGF, recombinant TGF- ⁇ , ethanolamine hydrochloride, Sodium selenate, retinoic acid, putrescine hydrochloride, etc., preferably sodium selenite, ethanolamine hydrochloride, recombinant IGF-1, putrescine hydrochloride and other growth cofactors; deoxyadenosine, deoxycytidine, deoxyguanosine,
  • pH of the medium varies depending on the cells to be cultured, generally pH 6.8 to 7.6 is appropriate, and in many cases pH 7.0 to 7.4 is appropriate.
  • D-MEM- Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • D-MEM / F-12 1 1 Mixture (Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12), RPMI1640, CHO -S-SFM II (Invitrogen), CHO-SF (Sigma-Aldrich), EX-CELL 301 (JRH Biosciences), CD-CHO (Invitrogen), IS CHO-V (Irvine Scientific), PF- It is also possible to use a medium such as ACF-CHOrich (Sigma-Aldrich).
  • the medium may be a serum-free medium.
  • the CHO cells can be cultured using methods known to those skilled in the art.
  • the culture can be usually carried out at 30-39 ° C., preferably about 37 ° C., in an atmosphere having a gas phase CO 2 concentration of 0-40%, preferably 2-10%.
  • the cell culture period suitable for producing the desired polypeptide is usually 1 day to 3 months, preferably 1 day to 2 months, more preferably 1 day to 1 month.
  • fermenter tank culture apparatus for example, fermenter tank culture apparatus, air lift culture apparatus, culture flask culture apparatus, spinner flask culture apparatus, microcarrier culture apparatus, fluidized bed culture Culture can be performed using an apparatus, a holofiber type culture apparatus, a roller bottle type culture apparatus, a filled tank type culture apparatus, or the like.
  • the culture may be any method such as batch culture, fed-batch culture, continuous culture, and the like, but fed-batch culture or continuous culture is preferred, fed-batch culture. Is more preferable.
  • the polypeptide produced by the method of the present invention has a pharmaceutically usable biological activity
  • the polypeptide is mixed with a pharmaceutically acceptable carrier or additive and formulated.
  • Pharmaceutical products can be manufactured.
  • Examples of pharmaceutically acceptable carriers and additives include water, pharmaceutically acceptable organic solvents, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, carboxyvinyl polymer, sodium carboxymethylcellulose, sodium polyacrylate, sodium alginate, water soluble Dextran, sodium carboxymethyl starch, pectin, methylcellulose, ethylcellulose, xanthan gum, gum arabic, casein, agar, polyethylene glycol, diglycerin, glycerin, propylene glycol, petrolatum, paraffin, stearyl alcohol, stearic acid, human serum albumin (HSA) , Mannitol, sorbitol, lactose, surfactants acceptable as pharmaceutical additives, and the like.
  • water pharmaceutically acceptable organic solvents
  • collagen collagen
  • polyvinyl alcohol polyvinyl pyrrolidone
  • carboxyvinyl polymer sodium carboxymethylcellulose, sodium polyacrylate, sodium alginate, water soluble Dextran, sodium carboxy
  • the purified polypeptide when used as an injectable preparation, is dissolved in a solvent such as physiological saline, buffer solution, glucose solution, etc., and an adsorption inhibitor such as Tween 80, Tween 20, gelatin, human serum albumin, etc. Can be used. Alternatively, it may be lyophilized to obtain a dosage form that is reconstituted before use, and as an excipient for lyophilization, for example, sugar alcohols or saccharides such as mannitol and glucose are used. be able to.
  • a solvent such as physiological saline, buffer solution, glucose solution, etc.
  • an adsorption inhibitor such as Tween 80, Tween 20, gelatin, human serum albumin, etc.
  • Tween 80, Tween 20, gelatin, human serum albumin, etc. Can be used.
  • it may be lyophilized to obtain a dosage form that is reconstituted before use, and as an excipient for lyophilization, for example, sugar alcohols or saccharides such
  • the effective dose of the polypeptide is appropriately selected depending on the type of polypeptide, the type of disease to be treated or prevented, the age of the patient, the severity of the disease, and the like.
  • the effective dose of the anti-glypican antibody for example, an anticancer agent
  • a dosage of 0.01 to 100,000 mg / body per patient can be selected. However, it is not limited to these doses.
  • the polypeptide can be administered either orally or parenterally, but is preferably administered parenterally.
  • injection for example, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection
  • Systemic or local administration by injection nasal administration, pulmonary administration, transdermal administration and the like.
  • the amount of polypeptide produced by a cell is enhanced by treating a cell into which a bicarbonate transporter is strongly expressed and into which a DNA encoding a desired polypeptide has been introduced with high-concentration MTX.
  • a method is provided.
  • a method for producing a cell having a high survival rate in culture in the presence of a high concentration of methotrexate comprising strongly expressing a bicarbonate transporter in the cell.
  • cells that strongly express a bicarbonate transporter and into which a DNA encoding a desired polypeptide is introduced are cultured in the presence of methotrexate, and cells that produce the desired polypeptide at a high level are selected from the surviving cells. And a method for producing a cell that highly produces a desired polypeptide.
  • the present invention also includes a method for enhancing the amount of polypeptide produced by treating a cell into which a bicarbonate transporter is strongly expressed and into which a DNA encoding a desired polypeptide has been introduced with methotrexate. .
  • a cell into which DNA has been introduced refers to a cell in which exogenous DNA has been incorporated by a genetic recombination technique, as well as a gene activation technique (see, for example, International Publication No. WO94 / 12650 pamphlet). It is a concept that includes cells in which endogenous DNA is activated, and as a result, expression of a protein corresponding to the DNA or transcription of the DNA is initiated or increased.
  • Example 1 Acquisition of MTX resistance of host cells by introduction of anion exchanger (AE1)
  • AE1 anion exchanger
  • a pHyg-AE1 expression plasmid (Reference Example 2 described later, Fig. 5) is introduced into DXB11S host cells by electroporation to strongly enhance AE1.
  • Expressed DXB11S / AE1 host cells were prepared, and their MTX sensitivity was compared with the parental DXB11S host cells. Neither host cell can survive in HT-free medium because of HT supplement requirements, but as shown in FIG. 1, the decrease in viability was similar under the conditions where MTX was not added to HT-free medium. .
  • Example 2 Construction of antibody producing strain by DXB11S / AE1 host cells that have acquired MTX resistance CHO-S-SFM II DXB11S / AE1 host cells constructed from conditioned DXB11S host cells are expressed as CS (CHO-S-SFM II / CD-CHO) acclimated to DXB11y / AE1 host cells, and the parental line of DXB11S host cells, CS-conditioned DXB11y host cells, can be used as control cells to enable transfection in a medium that does not contain Fetuin. Was established.
  • CS CHO-S-SFM II / CD-CHO
  • Anti-IL-6R antibody tocilizumab, trade name Actemra (registered trademark)
  • expression plasmid pNeo / MRA / CAG-A
  • pNeo / MRA / CAG-A pNeo / MRA / CAG-A
  • FIG. 2 1 ⁇ g was transferred to 15 ⁇ 10e5 host cells Amaxa nucleofector (Nucleofector kit V, program U- 030). Nuclefection 6 hours later, replace with HT-free CS medium, seed 7500 cells in each well of a 96 half well plate, leave at 37 ° C in a 5% CO2 incubator for 1 week, and reach a final concentration of 15 nM MTX was added as described above, and the culture was further allowed to stand for one week.
  • the cells in each well were transferred to a 96-well plate containing 100 ⁇ l of HT-free 15 nM MTX / CS medium, and then statically cultured for a further 8 days (total 200 ⁇ l).
  • 150 ⁇ l of the cell solution was transferred to a 24-well plate containing 700 ⁇ l of CS medium, and batch culture was performed at 160 rpm for 14 days.
  • the remaining cell solution 50 ⁇ l was added with 150 ⁇ l of HT-free 15 nM MTX / CS medium and continued to be expanded by passage. After 14 days, the amount of antibody production in 24-well batch culture was quantified (primary amplified strain production amount plot in FIG.
  • each of the top 5 strains was selected.
  • 1000 cells were seeded in each well of a 96 half-well plate, and statically cultured for 14 days in the presence of HT-free 150 nM MTX / CS medium (100 ⁇ l in total).
  • the antibody expression unit was secondarily amplified.
  • For expansion culture of secondary amplified cells a maximum of 20 highly proliferating cells in each well were selected (total of 100 strains or less each), and 100 ⁇ l of HT-free 150 nM MTX / CS was removed from 96 half-well plates.
  • the plate was transferred to a 96-well plate containing a medium, and further cultured for 11 days (total 200 ⁇ l).
  • 150 ⁇ l of the cell solution is cultured in a 24-well batch, and the amount of antibody produced by the proliferated cells is evaluated, so that a cell line that produces a high amount of antibody by strain construction using DXB11S / AE1 host cells can be obtained. It was shown that many can be obtained (secondary amplified strain production amount plot in FIG. 3).
  • Example 3 Increase in antibody production of AE1-strongly expressing antibody-producing strain by high concentration MTX treatment
  • high concentration MTX 100 nM or 200 nM
  • static culture in a 5% CO2 incubator at 37 ° C for 24 days 10
  • the cells were restored to the original MTX concentration (20 nM) after stationary culture for 22 days after medium passage on days 18 and 18, and cell growth was recovered (4 days by standing in T25 flask).
  • Subculture 1 subculture with 6 well plate suspension, 1 subculture with shaker flask suspension).
  • the present invention can be applied to all antibody-producing cells.
  • the obtained AE1 gene has mutations in 8 locations (t263g, t357c, a645t, a672c, c951t, a2078g, t2195c, c2500t) in 2733 bases, and 4 amino acids (L88R, L88R, 911) are encoded.
  • E693G, V712A, H834Y were different.
  • FOG. 5 since it is predicted to be a transporter having 13 transmembrane regions (FIG. 5), it was used for cell modification as an AE1 gene derived from human liver.
  • the cysteine sulfinic acid decarboxylase (CSAD) expression plasmid pPur-CSAD containing the puromycin resistance gene (implementation of WO2008 / 114673) Example 2, Fig. 7), alanine aminotransferase (ALT1) expression plasmid pPur-ALT1 (Example 2 of WO2009 / 020144, Fig. 1) containing a puromycin resistance gene, control plasmid pPur (pUR (a puromycin resistance expression vector from Clontech)) ))
  • CCD cysteine sulfinic acid decarboxylase
  • AE1 / CSAD co-expressing strain in which total RNA was prepared and the newly introduced gene was highly expressed after expansion of cell lines that were highly proliferating in static culture in the presence of Puromycin (6 ⁇ g / ml) (9 strains), AE1 / ALT1 co-expression strain (10 strains), and AE1 / pPur co-expression strain (8 strains) were selected, and the amount of antibody produced and the survival rate were compared.
  • the AE1 / CSAD co-expression strain 9 strains was compared with the control AE1 / pPur co-expression strain (8 strains) on the 10th day after the shaker culture.
  • the anti-glypican-3 antibody production amount (t test P ⁇ 0.05, FIG. 9) and the survival rate (t test P ⁇ 0.01, FIG. 10) were superior.
  • the cell line with the highest anti-glypican-3 antibody production was the AE1 / ALT1 co-expression strain (10 strains), and the control AE1 / pPur co-expression on day 8 of shaker fed-batch culture It was superior to the strain (8 strains) (t test P ⁇ 0.01, FIG. 11). Therefore, among AE1 / ALT1 co-expression strains (10 strains), AA53 (1497mg / L / 8days) that produced the highest antibody and expressed ALT1 mRNA in the shaker fed-batch culture study was the first 10 ⁇ 10 5 cells / mL.
  • the present invention can be used for protein production.

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Abstract

　ポリペプチドを高生産する細胞及びその作製方法を提供する。　Bicarbonateトランスポーターを強発現し、且つ所望のポリペプチドをコードするDNAが導入された細胞を高濃度メトトレキセートの存在下で培養し、生存する細胞から所望のポリペプチドを高産生する細胞を選択することを含む、所望のポリペプチドを高産生する細胞の作製方法。

Description

異種タンパク質を高生産する細胞の作製方法
　本発明は、異種タンパク質を高生産する細胞の作製方法に関する。
　遺伝子組換え技術を用いて、医薬として有用なタンパク質を生産する際に、動物細胞を用いると、原核細胞が行い得ないような複雑な翻訳後修飾やフォールディングが可能となるため、動物細胞は組換えタンパク質生産のための宿主細胞として多用されてきている。
　近年、抗体や生理活性タンパク質などの多くのバイオ医薬品が輩出されているが、組換えタンパク質を効率よく動物細胞に生産させる技術は、バイオ医薬品の低コスト化につながり、患者への安定な供給を約束するものである。
　従って、より生産効率の高いタンパク質の製造方法が望まれている。
　ジヒドロ葉酸還元酵素(dihydrofolate reductase; DHFR)遺伝子はメトトレキセート(MTX)によって細胞内でのコピー数が増幅され（遺伝子増幅）、細胞はMTX耐性となることが知られている。DHFR遺伝子の下に有用タンパク質の遺伝子をつないだプラスミドを動物細胞に導入し、MTXを添加した培地で培養することによって、遺伝子増幅を誘導し、タンパク質の産生量を増加させる方法（特許文献１）が工業的生産に広く用いられている。
　本発明は、異種タンパク質を高生産する細胞の作製方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意努力した結果、宿主細胞にBicarbonateトランスポーターを強発現させるとMTX耐性を獲得すること、また、抗体遺伝子が導入され、抗体を産生するようになった細胞にBicarbonateトランスポーターを強発現させるとMTX耐性を獲得すること、さらに、Bicarbonateトランスポーターを強発現させた抗体産生細胞は高濃度MTX処理により抗体産生能を向上させることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　本発明の要旨は以下の通りである。
（１）Bicarbonateトランスポーターを強発現し、且つ所望のポリペプチドをコードするDNAが導入された細胞を高濃度メトトレキセートの存在下で培養し、生存する細胞から所望のポリペプチドを高産生する細胞を選択することを含む、所望のポリペプチドを高産生する細胞の作製方法。
（２）Bicarbonateトランスポーターを強発現し、且つ所望のポリペプチドをコードするDNAが導入された細胞が、さらにジヒドロ葉酸還元酵素をコードするDNAが導入されている細胞である（１）記載の方法。
（３）Bicarbonateトランスポーターを強発現し、且つ所望のポリペプチドをコードするDNAが導入された細胞が、所望のポリペプチドをコードするDNAとジヒドロ葉酸還元酵素をコードするDNAとを含む1つの分子によって共形質転換された細胞である（２）記載の方法。
（４）所望のポリペプチドをコードするDNAとジヒドロ葉酸還元酵素をコードするDNAとを含む1つの分子が、ベクターである（３）記載の方法。
（５）Bicarbonateトランスポーターを強発現する細胞がさらにアラニンアミノトランスフェラーゼを強発現する（１）乃至（４）記載の方法。
（６）（１）乃至（５）記載の方法により作製された細胞。
（７）（６）記載の細胞を培養することを含む、所望のポリペプチドの製造方法。
（８）所望のポリペプチドが、抗体である（７）記載の製造方法。
（９）（７）乃至（８）記載の方法で製造されたポリペプチドを含有する医薬品を製造する方法。
（１０）Bicarbonateトランスポーターを強発現し、且つ所望のポリペプチドをコードするDNAが導入された細胞を高濃度メトトレキセートで処理することにより、該細胞によるポリペプチド産生量を増強する方法。
（１１）Bicarbonateトランスポーターを強発現し、且つ所望のポリペプチドをコードするDNAが導入された細胞が、さらにジヒドロ葉酸還元酵素をコードするDNAが導入されている細胞である（１０）記載の方法。
（１２）Bicarbonateトランスポーターを強発現し、且つ所望のポリペプチドをコードするDNAが導入された細胞が、所望のポリペプチドをコードするDNAとジヒドロ葉酸還元酵素をコードするDNAとを含む1つの分子によって共形質転換された細胞である（１１）記載の方法。
（１３）Bicarbonateトランスポーターを強発現する細胞がさらにアラニンアミノトランスフェラーゼを強発現する（１０）乃至（１２）記載の方法。
（１４）細胞にBicarbonateトランスポーターを強発現させることを含む、高濃度メトトレキセートの存在下での培養において、高い生存率を有する細胞の作製方法。
（１５）Bicarbonateトランスポーターを強発現し、且つ所望のポリペプチドをコードするDNAが導入された細胞をメトトレキセートの存在下で培養し、生存する細胞から所望のポリペプチドを高産生する細胞を選択することを含む、所望のポリペプチドを高産生する細胞の作製方法。
（１６）Bicarbonateトランスポーターを強発現し、且つ所望のポリペプチドをコードするDNAが導入された細胞をメトトレキセートで処理することにより、該細胞によるポリペプチド産生量を増強する方法。
　本発明により、抗体を始めとする所望のポリペプチドを高生産することができるようになった。
　本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2009‐103596の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
図１は、アニオンエクスチェンジャー（ＡＥ１）を強発現させた宿主細胞がＭＴＸ耐性を獲得することを示している。 図２は、抗ＩＬ-６Ｒ抗体発現プラスミド(pNeo/MRA/CAG-A)である。 図３は、ＤＸＢ１１ｙ/ＡＥ１宿主細胞を用いることで、親株のＤＸＢ１１ｙ宿主以上の抗体高産生株が得られることを示している。 図４は、ＡＥ１強発現株が高濃度ＭＴＸ処理後に抗体産生量が上がることを示している。 図５は、ヒト肝細胞由来AE1のアミノ酸配列からTMpred programによって予測された膜貫通領域および方向に基づいて、Exo Physiol 91. 1pp153-161, 2006, Seth L. AlperのFIG.1.を参考に作成したAE1膜トポロジーである。 図６は、ヒト AE1（911アミノ酸）を発現させたHygromycin選抜用のプラスミドである。 図７は、ヒト AE1（911アミノ酸）を発現させたPuromycin選抜用のプラスミドである。 図８は、50mlシェーカーフラスコ流加培養１２日目における抗グリピカン-3抗体産生量プロットである。　pHyg-AE1導入細胞(n=4)の抗グリピカン-3抗体産生量は、pHyg導入細胞(n=4)に対して優位であった（Ｐ＜０．０５）。 図９は、50mlシェーカーフラスコ流加培養１０日目における抗グリピカン-3抗体産生量プロットである。　pHyg-AE1導入抗体高産生細胞のpHyg-AE1-42株にpPur-CSADを導入した共発現細胞AE1/CSAD株(n=9)の抗グリピカン-3抗体産生量は、pHyg-AE1-42株にpPurを導入した共発現細胞AE1/pPur(n=8)に対して優位であった（Ｐ＜０．０５）。 図１０は、50mlシェーカーフラスコ流加培養１０日目における生存率プロットである。　pHyg-AE1導入抗体高産生細胞のpHyg-AE1-42株にpPur-CSADを導入した共発現細胞AE1/CSAD株(n=9)の生存率は、pHyg-AE1-42株にpPurを導入した共発現細胞AE1/pPur(n=8)に対して優位であった（Ｐ＜０．０１）。培養７日目における生存率においてもP<0.01であった(data not shown)。 図１１は、50mlシェーカーフラスコ流加培養８日目における抗グリピカン-3抗体産生量プロットである。　pHyg-AE1導入抗体高産生細胞であったpHyg-AE1-42株にpPur-ALT1を導入した共発現細胞AE1/ALT株(n=10)の抗グリピカン-3抗体産生量はAE1/CSAD株(n=9)以上であり、pHyg-AE1-42株にpPurを導入した共発現細胞AE1/pPur(n=8)に対して優位であった（Ｐ＜０．０1）。 図１２は、AE1/ALT1共発現株であるＡＡ５３の１L Jar流加培養の抗体産生量を示すグラフである。培養７日目における抗グリピカン-3抗体産生量は １．９ｇ/Ｌであった。
　以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。
　本発明は、Bicarbonateトランスポーターを強発現し、且つ所望のポリペプチドをコードするDNAが導入された細胞を高濃度メトトレキセート(MTX)の存在下で培養し、生存する細胞から所望のポリペプチドを高産生する細胞を選択することを含む、所望のポリペプチドを高産生する細胞の作製方法を提供する。
　本発明の方法において、Bicarbonateトランスポーターを強発現し、且つ所望のポリペプチドをコードするDNAが導入された細胞を高濃度MTXの存在下で培養する。高濃度とは、通常のMTXによる細胞選抜後の継代培養時に、増幅された遺伝子が安定に維持される濃度(CHO細胞であれば約20nM程度)の２倍以上、例えば、Bicarbonateトランスポーター未導入株が継代培養３週間後に90％以上死滅する濃度であり、細胞によっては異なるが、CHO DXB11s細胞など、組換タンパク質の製造に用いられるCHO細胞の場合、通常50 nM以上が適当であり、好ましくは80ｎM以上、さらに好ましくは100 nM以上である。
　Bicarbonateトランスポーターを強発現する細胞には、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡが導入される。
　所望のポリペプチドは特に限定されず、抗体（例えば、抗IL-6レセプター抗体、抗IL-6抗体、抗グリピカン-3抗体、抗CD3抗体、抗CD20抗体、抗GPIIb/IIIa抗体、抗TNF抗体、抗CD25抗体、抗EGFR抗体、抗Her2/neu抗体、抗RSV抗体、抗CD33抗体、抗CD52抗体、抗IgE抗体、抗CD11a抗体、抗VEGF抗体、抗VLA4抗体など）や生理活性タンパク質（顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、エリスロポエチン、インターフェロン、IL-1やIL-6等のインターロイキン、t-PA、ウロキナーゼ、血清アルブミン、血液凝固因子、PTHなど）など如何なるポリペプチドでもよいが、特に抗体が好ましい。抗体は、天然抗体、Fab、scFv、sc(Fv)2などの低分子化抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などの如何なる抗体であってもよい。
　Bicarbonateトランスポーターは、炭酸水素アニオン（HCO3 -）または炭酸アニオン（CO3 2-）を排出するとともに、塩素アニオンや硫酸アニオンなどを取り込む、交換輸送機能をもつ膜蛋白である。Bicarbonateトランスポーターとしては、SLC4アニオンエクスチェンジャー、SLC26アニオンエクスチェンジャーなどを例示することができる。
　SLC4アニオンエクスチェンジャーは、細胞内pHホメオスタシスおよび細胞容積を制御する膜蛋白である。現在、10種（SLC4A1(AE1),SLC4A2(AE2), SLC4A3(AE3), SLC4A4(NBCe1), SLC4A5(NBCe2),SLC4A7(NBCn1), SLC4A8(kNBC3), SLC4A9(NBCn2), SLC4A10(NBCn3), SLC4A11(NaBC1)）のSLC4 ファミリーが知られており、少なくとも１種以上のアイソフォームが存在する。また、それぞれは、Na+非依存的に電荷的中性なCl-とHCO3 -のエクスチェンジャーであるSLC4A1(AE1)、SLC4A2(AE2)、ALC4A3(AE3)、ALC4A9(NBCn2またはAE4)、起電性のALC4A4(NBCe1)、ALC4A5(NBCe2)、電荷的中性なNa+とHCO3 -の共輸送体であるALC4A7(NBCn1)、Na+依存的に電荷的中性なCl-とHCO3 -のエクスチェンジャーであるALC4A8(kNBC3)、ALC4A10(NBCn3)、起電性のNa+とBorateの共輸送体であるALC4A11(NaBC1)などと異なる機能を有している。これらは局所特異的な作用を有する。たとえばAE1の場合、極性をもつ上皮細胞においては経上皮分泌や酸塩基の再吸収に寄与し、鱒の赤血球においてはosmolyte輸送を促進する。SLC4アニオンエクスチェンジャーとしては、SLC4A1(AE1),SLC4A2(AE2), SLC4A3(AE3), SLC4A4(NBCe1), SLC4A5(NBCe2), SLC4A7(NBCn1), SLC4A8(kNBC3), SLC4A9(NBCn2), SLC4A10(NBCn3), SLC4A11(NaBC1)などを例示することができるが、AE1が好ましい。
　SLC26アニオンエクスチェンジャーは、ほとんどすべての臓器系で作用する多機能な膜タンパクであり、硫酸アニオン、ヨウ素アニオン、蟻酸アニオン、しゅう酸アニオン、塩素アニオン、ヒドロキシルアニオン、炭酸水素アニオンなどの交換輸送をおこなうものや、塩素イオンチャネル、あるいはアニオン依存性分子モーターが存在する。種々のアニオンのホメオスタシスに関与していると考えられ、１０種（SLC26A1, SLC26A2, SLC26A3, SLC26A4, SLC26A5, SLC26A6, SLC26A7,SLC26A8, SLC26A9, SLC26A11）のアニオンエクスチェンジャーファミリーが知られている。たとえば、ヒドロキシルアニオン、炭酸水素アニオンのトランスポーターであるSLC26A3, SLC26A4, SLC26A6, SLC26A9は、SLC4アニオンエクスチェンジャーと同様に膜内外のpHを制御している。腎臓で発現しているのは、SLC26A1, SLC26A2, SLC26A4, SLC26A6, SLC26A9, SLC26A11である。SLC26A1は硫酸アニオンとシュウ酸アニオン輸送を、SLC26A6は塩化ナトリウムを取り込むために、種々のアニオンを交換輸送する。SLC26A1は腎石症、SLC26A4とSLC26A6は高血圧症、SLC26A5は難聴の病因となる。SLC26A7はSLC26A4と同様に酸塩基のホメオスタシスや血圧制御に関与する。SLC26アニオンエクスチェンジャーとしては、SLC26A1、SLC26A2、SLC26A3、SLC26A4、SLC26A5、SLC26A6、SLC26A7、SLC26A8、SLC26A9、SLC26A11などを例示することができる。
　Bicarbonate トランスポーターを強発現する細胞は、天然の細胞と比較してBicarbonateトランスポーターの発現量が増加している細胞であれば特に限定されない。天然の細胞は特に限定されないが、例えばCHO細胞など組換えタンパク質を製造する際に宿主として用いられている細胞を挙げることができる。
　細胞に強発現させるBicarbonateトランスポーターは、如何なる生物由来のBicarbonateトランスポーターでもよく、特に限定されない。具体的には、ヒト、またはマウス、ラット、ハムスターなどのげっ歯類、チンパンジー、ウシ、ウマ、イヌ、オオカミなどの哺乳類、ニワトリなどの鳥類、ゼブラフィッシュ、ウナギなどの魚類、ショウジョウバエなどの昆虫類などの生物由来のBicarbonateトランスポーターが挙げられ、ヒト、げっ歯類或いは宿主細胞と同じ種由来のBicarbonateトランスポーターであることが好ましく、例えば、Bicarbonateトランスポーターを強発現させる細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）である場合には、ヒト或いはハムスター由来のBicarbonateトランスポーターであることが好ましい。
　Bicarbonateトランスポーターを強発現する細胞は動物細胞、植物細胞、酵母などの真核細胞；大腸菌、枯草菌などの原核細胞など如何なる細胞でもよいが、組換えタンパク質を製造する際に宿主として用いられている培養細胞が適当であり、動物細胞が好ましく、特にCHO細胞、COS細胞などの哺乳動物細胞が好ましい。哺乳動物細胞としてはヒト、チンパンジーなどの霊長類、マウス、ラット、ハムスターなどのげっ歯類、その他が挙げられ、ヒト、げっ歯類であることが好ましく、特にCHO細胞が好ましい。また、所望のポリペプチドを製造するためには、特にdhfr欠失CHO細胞（例えば、CHO細胞DXB11株、CHO細胞DG44株など）が好ましい。dhfr欠失CHO細胞はヒポキサンチンとチミジンに対する要求性があるので、ヒポキサンチンとチミジンを含まない培地（以下「ＨＴ不含培地」と標記）では生育できないが、DHFR遺伝子を持つ組換えベクターで形質転換することによりＨＴ不含培地で生育可能となる。従って、dhfr欠失CHO細胞を宿主とすれば、ヒポキサンチンとチミジンに対する要求性を利用して、形質転換細胞を選別することができるので便利である。
　Bicarbonateトランスポーターを強発現する細胞としては、例えば、Bicarbonateトランスポーター遺伝子（例えば、SLC4アニオンエクスチェンジャー遺伝子、SLC26アニオンエクスチェンジャー遺伝子など）が人為的に導入された細胞を挙げることができる。Bicarbonateトランスポーター遺伝子が人為的に導入された細胞は当業者に公知の方法により作製することが可能であり、例えばBicarbonateトランスポーター遺伝子をベクターに組込み、該ベクターを細胞に形質転換することにより作製することが可能である。さらに、本明細書では遺伝子活性化技術（例えば、国際公開第WO94/12650号パンフレット参照）により内因性Bicarbonateトランスポーター遺伝子が活性化され、その結果、Bicarbonateトランスポーターが強発現した細胞もBicarbonateトランスポーター遺伝子が人為的に導入された細胞に包含される。
　細胞に導入するSLC4アニオンエクスチェンジャー遺伝子としては、SLC4アニオンエクスチェンジャーをコードする以下の(a)～(e)のいずれかのＤＮＡを挙げることもできる。
(a) 配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
(b) 配列番号２のアミノ酸配列において、１又は複数（例えば、数個）のアミノ酸が置換、欠失、付加又は／及び挿入されたアミノ酸配列を有し、かつSLC4アニオンエクスチェンジャー活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
(c) 配列番号２のアミノ酸配列と50％以上の相同性を有し、かつSLC4アニオンエクスチェンジャー活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
(d) 配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡ
(e) 配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつSLC4アニオンエクスチェンジャー活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
　SLC4アニオンエクスチェンジャー活性とは、細胞内ｐHの恒常性や細胞容積を維持させるため、培地中のCl-やSO4 2-取り込み、細胞内のHCO3 -やBorateを排出する活性を包含する概念である。
　SLC4アニオンエクスチェンジャー活性は、以下のようにして測定することができる。
　SLC4を機能的に発現させた細胞をpH感受性色素であるBCECF-AMで処理し、Cl-やNa+を含む培地と含まない培地を潅流させたときの蛍光強度比較により、細胞内pH(pHi)の変化を測定することができる（Dahl NK. et.al., J Biol Chem 2003; 278:44949-44958; Fujinaga J. et.al., J Biol Chem 1999; 274:6626-6633）。
　本発明において、SLC4アニオンエクスチェンジャーをコードするＤＮＡとして、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを用いるとよい。その他にも、配列番号２のアミノ酸配列において、１又は複数（例えば、数個）のアミノ酸が置換、欠失、付加又は／及び挿入されたアミノ酸配列を有し、かつSLC4アニオンエクスチェンジャー活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを用いてもよい。配列番号２のアミノ酸配列は、ヒトAE1のアミノ酸配列である。AE1については、ヒト以外にも、マウス、ラット、チンパンジー、ウシ、ウマ、イヌ、オオカミ、ニワトリ、ゼブラフィッシュなどの配列情報が、マウス GenBanK NM_011403、ラット GeneBank NM_012651、チンパンジー GenBank XM_001151353、ウシ GeneBank NM_181036、ウマ GeneBank NM_001081788、イヌ GenBank AB242566、オオカミGeneBank NM_001048031、ニワトリ GenBank NM_205522、ゼブラフィッシュ GenBanK NM_198338などに登録されているので、それを利用することもできる。他のSLC4アニオンエクスチェンジャーについても、各種のデータベースに配列情報が登録されており、それらを利用してもよい。
　配列番号２のアミノ酸配列において、１又は複数（例えば、数個）のアミノ酸が置換、欠失、付加又は／及び挿入されたアミノ酸配列を有し、かつSLC4アニオンエクスチェンジャー活性を有するポリペプチドは、ヒト、マウス、ラット、ニワトリ、チンパンジー、ウシ、ウマ、イヌ、オオカミ、ニワトリ、ゼブラフィッシュSLC4アニオンエクスチェンジャー（以下、「ヒト等のSLC4アニオンエクスチェンジャー」と記すこともある）と機能的に同等なポリペプチドである。このようなポリペプチドには、例えば、ヒト等のSLC4アニオンエクスチェンジャーの変異体などが含まれる。後述の実施例では、公開されているヒトSLC4アニオンエクスチェンジャー遺伝子（AE1遺伝子）がコードしているアミノ酸911個中、４アミノ酸（L88R、E693G、V712A、H834Y）が置換されている変異体が用いられた。
　あるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調製するための、当業者によく知られた方法としては、ポリペプチドに変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275、Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Methods Enzymol. 100, 468-500、Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456、Kramer W, and Fritz HJ(1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367、Kunkel,TA(1985) Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 488-492、Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766）などを用いて、ヒト等のSLC4アニオンエクスチェンジャーのアミノ酸に適宜変異を導入することにより、ヒト等のSLC4アニオンエクスチェンジャーと機能的に同等なポリペプチドを調製することができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。
　ヒト等のSLC4アニオンエクスチェンジャーと機能的に同等なポリペプチドとしては、具体的には、ヒト等のSLC4アニオンエクスチェンジャーのアミノ酸配列（例えば、配列番号２のアミノ酸配列）中の１又は２個以上、好ましくは、１個以上３０個以下、より好ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が欠失したもの、ヒト等のSLC4アニオンエクスチェンジャーのアミノ酸配列に１又は２個以上、好ましくは、１個以上３０個以下、より好ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が付加したもの、ヒト等のSLC4アニオンエクスチェンジャーのアミノ酸配列中の１又は２個以上、好ましくは、１個以上３０個以下、より好ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたもの等が挙げられる。
　変異するアミノ酸残基は、特に限定されないが、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（G、A、V、L、I、P）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（S、T、Y）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（C、M）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（D、N、E、Q）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（R、K、H）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（H、F、Y、W）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。
　なお、あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666 、Zoller, M. J. & Smith, M. Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500 、Wang, A. et al., Science 224, 1431-1433 、 Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413 ）。
　ヒト等のSLC4アニオンエクスチェンジャーに１又は複数個のアミノ酸残基が付加されたポリペプチドとしては、例えば、ヒト等のSLC4アニオンエクスチェンジャーを含む融合ポリペプチドが挙げられる。融合ポリペプチドは、ヒト等のSLC4アニオンエクスチェンジャーと他のポリペプチドとが融合したものである。融合ポリペプチドを作製する方法は、ヒト等のSLC4アニオンエクスチェンジャーをコードする遺伝子と他のポリペプチドをコードする遺伝子をフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよく、当業者に公知の手法を用いることができる。ヒト等のSLC4アニオンエクスチェンジャーとの融合に付される他のポリペプチドとしては、特に限定されない。
　ヒト等のSLC4アニオンエクスチェンジャーとの融合に付される他のペプチドとしては、例えば、FLAG（Hopp, T. P. et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210 ）、6 個のHis （ヒスチジン）残基からなる6×His、10×His、インフルエンザ凝集素（HA）、ヒトc-myc の断片、VSV-GPの断片、p18HIVの断片、T7-tag、HSV-tag 、E-tag 、SV40T 抗原の断片、lck tag 、α-tubulinの断片、B-tag 、Protein C の断片、GST （グルタチオン－S－トランスフェラーゼ）、HA（インフルエンザ凝集素）、イムノグロブリン定常領域、β－ガラクトシダーゼ、MBP （マルトース結合ポリペプチド）等が挙げられる。
　市販されているこれらのポリペプチドをコードする遺伝子をヒト等のSLC4アニオンエクスチェンジャーをコードする遺伝子と融合させ、これにより調製された融合遺伝子を発現させることにより、融合ポリペプチドを調製することができる。
　また、あるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調製する当業者によく知られた他の方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Sambrook,J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. press, 1989）を利用する方法が挙げられる。即ち、当業者であれば、ヒト等のSLC4アニオンエクスチェンジャーをコードするDNA配列（例えば、配列番号１のDNA配列）もしくはその一部を基に、これと相同性の高いDNAを単離して、該DNAからヒト等のSLC4アニオンエクスチェンジャーと機能的に同等なポリペプチドを単離することも通常行いうることである。
　ヒト等のSLC4アニオンエクスチェンジャーと機能的に同等なポリペプチドをコードするDNAを単離するためのハイブリダイゼーションの条件としては、当業者であれば適宜選択することができる。ハイブリダイゼーションの条件は、例えば、低ストリンジェントな条件が挙げられる。低ストリンジェントな条件とは、例えば42℃、2×SSC、0.1％SDSが挙げられ、好ましくは50℃、2×SSC、0.1％SDSである。またより好ましくは、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば65℃、2×SSC及び0.1％SDSが挙げられる。これらの条件において、温度を下げる程に高い相同性を有するDNAのみならず、低い相同性しか有していないDNAまでも包括的に得ることができる。逆に、温度を上げる程、高い相同性を有するDNAのみを得られることが期待できる。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度以外にも塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
　これらハイブリダイゼーション技術により単離されるDNAがコードするポリペプチドは、ヒト等のSLC4アニオンエクスチェンジャーとアミノ酸配列において70%以上の同一性を有するものであればよいが、通常、ヒト等のSLC4アニオンエクスチェンジャーとアミノ酸配列において高い相同性を有する。高い相同性とは、通常、97％以上の同一性、好ましくは98％以上の同一性、さらに好ましくは99％以上の同一性を指す。ポリペプチドの同一性を決定するには、文献（Wilbur, W. J. and Lipman, D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80, 726-730）に記載のアルゴリズムにしたがえばよい。
　ポリペプチドは、後述するそれを産生する細胞や宿主あるいは精製方法により、アミノ酸配列、分子量、等電点又は糖鎖の有無や形態などが異なり得る。しかしながら、得られたポリペプチドが、ヒト等のSLC4アニオンエクスチェンジャーと同等の機能を有している限り、それをコードするDNAを本発明で利用することができる。例えば、ポリペプチドを原核細胞、例えば大腸菌で発現させた場合、本来のポリペプチドのアミノ酸配列のN末端にメチオニン残基が付加される。また、真核細胞、例えば哺乳動物細胞で発現させた場合、N末端のシグナル配列は除去される。このようなポリペプチドをコードするDNAも本発明で利用することができる。
　本発明において、SLC4アニオンエクスチェンジャーをコードするＤＮＡとして、配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡを用いてもよい。その他にも、配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつSLC4アニオンエクスチェンジャー活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを用いてもよい。配列番号１の塩基配列は、ヒトAE1の塩基配列である。AE1については、ヒト以外にも、マウス、ラット、チンパンジー、ウシ、ウマ、イヌ、オオカミ、ニワトリ、ゼブラフィッシュなどの配列情報が、マウス GenBanK NM_011403、ラット GeneBank NM_012651、チンパンジー GenBank XM_001151353、ウシ GeneBank NM_181036、ウマ GeneBank NM_001081788、イヌ GenBank AB242566、オオカミGeneBank NM_001048031、ニワトリ GenBank NM_205522、ゼブラフィッシュ GenBanK NM_198338、などに登録されているので、それを利用することもできる。他のSLC4アニオンエクスチェンジャーについても、各種のデータベースに配列情報が登録されており、それらを利用してもよい。
　SLC4アニオンエクスチェンジャーをコードするＤＮＡは、上述したような所望のポリペプチドの in vivo や in vitroにおける生産に利用される他、SLC4アニオンエクスチェンジャーを強発現する細胞の作製に用いることができる。SLC4アニオンエクスチェンジャーをコードするＤＮＡは、SLC4アニオンエクスチェンジャーをコードしうるものであれば、いかなる形態でもよい。即ち、mRNAから合成されたcDNAであるか、ゲノムDNAであるか、化学合成DNAであるかなどを問わない。また、SLC4アニオンエクスチェンジャーをコードするＤＮＡをコードしうる限り、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するDNAが含まれる。
　SLC4アニオンエクスチェンジャーをコードするＤＮＡは、当業者に公知の方法により調製することができる。例えば、SLC4アニオンエクスチェンジャーを発現している細胞よりcDNAライブラリーを作製し、SLC4アニオンエクスチェンジャーのDNAの配列（例えば、配列番号１）の一部をプローブにしてハイブリダイゼーションを行うことにより調製できる。cDNAライブラリーは、例えばSambrook, J. et al., Molecular Cloning、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に記載の方法により調製してもよいし、市販の遺伝子ライブラリーを用いてもよい。また、SLC4アニオンエクスチェンジャーを発現している細胞よりRNAを調製し、SLC4アニオンエクスチェンジャーのDNAの配列（例えば、配列番号１）に基づいてオリゴDNAを合成し、これをプライマーとして用いてPCR反応を行い、SLC4アニオンエクスチェンジャーをコードするcDNAを増幅させることにより調製することも可能である。
　また、得られたcDNAの塩基配列を決定することにより、それがコードする翻訳領域を決定でき、SLC4アニオンエクスチェンジャーのアミノ酸配列を得ることができる。また、得られたcDNAをプローブとしてゲノムDNA ライブラリーをスクリーニングすることにより、ゲノムDNAを単離することができる。
　具体的には、次のようにすればよい。まず、SLC4アニオンエクスチェンジャーを発現する細胞、組織などから、mRNAを単離する。mRNAの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法(Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299) 、AGPC法 (Chomczynski, P. and Sacchi, N., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159) 等により全RNAを調製し、mRNA Purification Kit (Pharmacia) 等を使用して全RNAからmRNAを精製する。また、QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia) を用いることによりmRNAを直接調製することもできる。
　得られたmRNAから逆転写酵素を用いてcDNAを合成する。cDNAの合成は、 AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (生化学工業)等を用いて行うこともできる。また、プライマー等を用いて、5'-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech製)およびポリメラーゼ連鎖反応 (polymerase chain reaction ; PCR)を用いた5'-RACE法(Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 8998-9002 ; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) にしたがい、cDNAの合成および増幅を行うことができる。
　得られたPCR産物から目的とするDNA断片を調製し、ベクターDNAと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするDNAの塩基配列は、公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法により確認することができる。
　また、SLC4アニオンエクスチェンジャーをコードするＤＮＡにおいては、発現に使用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現効率の高い塩基配列を設計することができる（Grantham, R. et al., Nucelic Acids Research (1981) 9, r43-74 ）。また、SLC4アニオンエクスチェンジャーをコードするＤＮＡは、市販のキットや公知の方法によって改変することができる。改変としては、例えば、制限酵素による消化、合成オリゴヌクレオチドや適当なDNAフラグメントの挿入、リンカーの付加、開始コドン（ATG）及び／又は終止コドン（TAA、TGA、又はTAG）の挿入等が挙げられる。
　SLC4アニオンエクスチェンジャーをコードするＤＮＡはまた、配列番号１の塩基配列を有するDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであり、かつSLC4アニオンエクスチェンジャーと機能的に同等なポリペプチドをコードするDNAを含む。
　ストリンジェントな条件としては、当業者であれば適宜選択することができるが、例えば低ストリンジェントな条件が挙げられる。低ストリンジェントな条件とは、例えば42℃、2×SSC、0.1％SDSが挙げられ、好ましくは50℃、2×SSC、0.1％SDSである。またより好ましくは、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば65℃、2×SSC及び0.1％SDSが挙げられる。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するDNAを得ることができる。上記のハイブリダイズするDNAは好ましくは天然由来のDNA、例えばcDNA又は染色体DNAであってよい。
　これらハイブリダイゼーション技術により単離されるDNAは、通常、ヒト等のSLC4アニオンエクスチェンジャーをコードするＤＮＡと塩基配列において高い同一性を有する。SLC4アニオンエクスチェンジャーをコードするＤＮＡには、ヒト等のSLC4アニオンエクスチェンジャーと機能的に同等なポリペプチドをコードし、ヒト等のSLC4アニオンエクスチェンジャーをコードするDNAと高い同一性を有するDNAも含まれる。高い同一性とは、通常、96％以上の同一性、好ましくは98％以上の同一性、さらに好ましくは99％以上の同一性を指す。塩基配列の同一性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993)によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている(Altschulet al. J. Mol. Biol.215:403-410, 1990)。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは、例えば、score = 100、wordlength = 12とする。これらの解析方法の具体的な手法は公知である(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
　細胞に導入するBicarbonateトランスポーター遺伝子としては、SLC26アニオンエクスチェンジャー遺伝子であってもよい。SLC26アニオンエクスチェンジャー遺伝子の塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列情報は、GenBank
AF331525 (ヒトputative SLC26A9)、GenBank NM_052934 (ヒトSLC26A9 variant 1)、GenBank NM_134325(ヒトSLC26A9 variant 2)、GenBank NM_134420(マウスSLC26A6)、GenBank NM_177243(マウスSLC26A9)、GenBank AY240025(ショウジョウバエSlc26d9702)、GenBank AY240023 (ショウジョウバエSlc26d6928)、GenBank AY240022 (ショウジョウバエSlc26d6125)、GenBank AY240021 (ショウジョウバエSlc26d5002)、GenBank AB084425 (ウナギSlc26A6)などに登録されているので、それを利用することができる。
　BicarbonateトランスポーターをコードするＤＮＡはベクターに挿入されるとよい。
　ベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ベクターを大腸菌（例えば、JM109、DH5α、HB101、XL1Blue）などで大量に増幅させ大量調製するために、大腸菌で増幅されるための「ori」をもち、さらに形質転換された大腸菌の選抜遺伝子（例えば、なんらかの薬剤（アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有することが好ましい。ベクターの例としては、M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、pCR-Scriptなどが挙げられる。また、cDNAのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、pGEM-T、pDIRECT、pT7などが挙げられる。所望のポリペプチドを生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主をJM109、DH5α、HB101、XL1-Blueなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、lacZプロモーター（Wardら, Nature (1989) 341, 544-546；FASEB J. (1992) 6, 2422-2427）、araBプロモーター（Betterら, Science (1988) 240, 1041-1043 ）、またはT7プロモーターなどを持っていることが好ましい。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にpGEX-5X-1（Pharmacia社製）、「QIAexpress system」（Qiagen社製）、pEGFP、またはpET(この場合、宿主はT7 RNAポリメラーゼを発現しているBL21が好ましい)などが挙げられる。
　また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。ポリペプチド分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379 ）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。
　大腸菌を宿主とする場合以外にも、例えば、所望のポリペプチドを製造するために用いられるベクターとしては、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、pcDNA3 (Invitrogen社製）や、pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322)、pEF 、pCDM8 ）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Bac-to-BAC baculovairus expression system」（GIBCO BRL社製）、pBacPAK8）、植物由来の発現ベクター（例えばpMH1、pMH2）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、pHSV、pMV、pAdexLcw ）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、pZIpneo）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia Expression Kit」（ Invitrogen社製）、pNV11、SP-Q01）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、pPL608、pKTH50）などが挙げられる。
　CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばSV40プロモーター（Mulliganら, Nature (1979) 277, 108）、MMLV-LTRプロモーター、EF1αプロモーター（Mizushimaら, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322）、CMVプロモーターなどを持っていることが好ましく、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、G418など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13などが挙げられる。
　さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したCHO細胞にそれを相補するDHFR遺伝子を有するベクター（例えば、pCHOIなど）を導入し、メトトレキセート（MTX）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つCOS細胞を用いてSV40の複製起点を持つベクター（pcDなど）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（BPV）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（APH）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子等を含むことができる。
　BicarbonateトランスポーターをコードするＤＮＡ（ベクターに組み込まれていてもよい）が導入される宿主細胞としては特に制限はなく、例えば、大腸菌や種々の動物細胞などを用いることが可能である。BicarbonateトランスポーターをコードするＤＮＡが導入された宿主細胞に所望のポリペプチドをコードするＤＮＡを導入すれば、この宿主細胞は、Bicarbonateトランスポーターを強発現することができ、所望のポリペプチドの生産を増加させることができる。BicarbonateトランスポーターをコードするＤＮＡが導入された宿主細胞には、ALTをコードするＤＮＡ（ベクターに組み込まれていてもよい）がさらに導入されてもよい。BicarbonateトランスポーターをコードするＤＮＡが導入された宿主細胞に所望のポリペプチドをコードするＤＮＡとALTをコードするＤＮＡを導入することにより、所望のポリペプチドの産生量を向上させることができる。ポリペプチド製造のための産生系は、in vitroおよびin vivo の産生系がある。in vitroの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
　Bicarbonateトランスポーター遺伝子が人為的に導入された細胞を用いて所望のポリペプチドを製造する場合、Bicarbonateトランスポーター遺伝子と所望のポリペプチドをコードする遺伝子の導入の順序は特に制限されず、Bicarbonateトランスポーター遺伝子を導入した後に所望のポリペプチドをコードする遺伝子を導入してもよいし、所望のポリペプチドをコードする遺伝子を導入した後にBicarbonateトランスポーター遺伝子を導入してもよい。又、Bicarbonateトランスポーター遺伝子と所望のポリペプチドをコードする遺伝子を同時に導入してもよい。
　Bicarbonateトランスポーター遺伝子及び所望のポリペプチドをコードする遺伝子の導入は単一のベクターにより同時に導入してもよいし、複数のベクターを用いて別々に導入してもよい。
　Bicarbonateトランスポーターを強発現する細胞は、さらに、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)を強発現してもよい。
　ALTは、本来、アラニンのアミノ基を2-オキソグルタル酸に転移させ、グルタミン酸を生成させる酵素として知られているが、CHO細胞などの宿主細胞内で強発現させることにより、アラニンからピルビン酸やグルタミン酸を生合成する反応を促進できれば、TCA回路での代謝や、糖新生によるグルコース生成に利用されて、細胞の培養挙動が改善し、所望のポリペプチドの高生産が期待される。
　ALTを強発現する細胞は、天然の細胞と比較してALTの発現量が増加している細胞であれば特に限定されない。天然の細胞は特に限定されないが、例えばCHO細胞など組換えタンパク質を製造する際に宿主として用いられている細胞を挙げることができる。
　ALTを強発現する細胞としては、例えば、ALT遺伝子が人為的に導入された細胞を挙げることができる。ALT遺伝子が人為的に導入された細胞は当業者に公知の方法により作製することが可能であり、例えば、ALT遺伝子をベクターに組込み、該ベクターを細胞に形質転換することにより作製することが可能である。さらに、本明細書では遺伝子活性化技術（例えば、国際公開第WO94/12650号パンフレット参照）により内因性ALT遺伝子が活性化され、その結果、ALTが強発現した細胞もALT遺伝子が人為的に導入された細胞に包含される。
　細胞に強発現させるALTは、如何なる生物由来のALTでもよく特に限定されない。具体的には、ヒト、マウス、ラット、イヌ、アフリカツメガエル、ショウジョウバエ、センチュウ、日本米、原子紅藻、パン酵母、糸状菌Ashbya gossypii、真菌Candida albicans、分裂酵母、真菌Aspergillus nidulans、真菌Aspergillus fumigatus、清酒麹菌Aspergillus oryzae、真菌Cryptococcus neoformans、細胞性粘菌 Dictyostelium discoideum、Trypanosoma brucei、細胞内寄生性原虫Leishmania major、赤痢アメーバEntamoeba histolytica又は細胞内寄生性原虫Trypanosoma cruziなどのALTが公知であり、これらを利用することができるが、ヒト、げっ歯類或いは宿主細胞と同じ種由来のALTであることが好ましく、例えば、ALTを強発現させる細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）である場合には、ヒト或いはハムスター由来のALTであることが好ましい。ヒト、マウス、酵母などのＡＬＴは、Variant(ALT1とALT2)が存在する。ALT2は、ALT1に対してアミノ酸レベルで８０％以上の相同性がある。後述の実施例及び参考例では、ALT1を強制発現させた。
　細胞に導入するALT遺伝子としては、ALTをコードする以下の(a2)～(e2)のいずれかのＤＮＡを挙げることができる。
(a2) KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (human):2875、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (human): 84706、KEGG / ENZYME:2.6.1.2 / Mus musculus (mouse): 76282、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Mus musculus (mouse): 108682、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Rattus norvegicus (rat): 81670、KEGG / ENZYME:2.6.1.2 / Canis familiaris (dog): 609510、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Xenopus laevis (African clawed frog): 444533、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Drosophila melanogaster (fruit fly): Dmel_CG1640、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Caenorhabditis elegans (nematode): C32F10.8、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Oryza sativa japonica (Japanese rice): 4342210、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Oryza sativa japonica (Japanese rice): 4348524、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Cyanidioschyzon merolae: CMM066C、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Saccharomyces cerevisiae: YLR089C、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Saccharomyces cerevisiae: YDR111C、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Ashbya gossypii (Eremothecium gossypii): AGOS_AGR085W、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Candida albicans: CaO19_346、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Schizosaccharomyces pombe: SPBC582.08、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus nidulans: AN1923.2、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus fumigatus: AFUA_6G07770、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus oryzae: AO090003000164、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Cryptococcus neoformans JEC21: CNG01490、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Dictyostelium discoideum: DDB_0232139、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma brucei: Tb927.1.3950、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Leishmania major: LmjF12.0630、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 /Entamoeba histolytica: 233.t00009、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 /Entamoeba histolytica: 24.t00016、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 506529.420、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 506529.430、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 510889.120又はKEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 510889.140のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
(b2) KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (human): 2875、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (human): 84706、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Mus musculus (mouse): 76282、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Mus musculus (mouse): 108682、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Rattus norvegicus (rat): 81670、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Canis familiaris (dog): 609510、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Xenopus laevis (African clawed frog): 444533、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Drosophila melanogaster (fruit fly): Dmel_CG1640、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Caenorhabditis elegans (nematode): C32F10.8、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Oryza sativa japonica (Japanese rice): 4342210、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Oryza sativa japonica (Japanese rice): 4348524、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Cyanidioschyzon merolae: CMM066C、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Saccharomyces cerevisiae: YLR089C、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Saccharomyces cerevisiae: YDR111C、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Ashbya gossypii (Eremothecium gossypii): AGOS_AGR085W、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Candida albicans: CaO19_346、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Schizosaccharomyces pombe: SPBC582.08、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus nidulans: AN1923.2、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus fumigatus: AFUA_6G07770、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus oryzae: AO090003000164、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Cryptococcus neoformans JEC21: CNG01490、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Dictyostelium discoideum: DDB_0232139、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma brucei: Tb927.1.3950、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Leishmania major: LmjF12.0630、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 /Entamoeba histolytica: 233.t00009、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 /Entamoeba histolytica: 24.t00016、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 506529.420、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 506529.430、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 510889.120又はKEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 510889.140のアミノ酸配列において、１又は複数（例えば、数個）のアミノ酸が置換、欠失、付加又は／及び挿入されたアミノ酸配列を有し、かつALT活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
(c2) KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (human): 2875、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (human): 84706、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Mus musculus (mouse): 76282、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Mus musculus (mouse): 108682、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Rattus norvegicus (rat): 81670、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Canis familiaris (dog): 609510、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Xenopus laevis (African clawed frog): 444533、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Drosophila melanogaster (fruit fly): Dmel_CG1640、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Caenorhabditis elegans (nematode): C32F10.8、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Oryza sativa japonica (Japanese rice): 4342210、KEGG /ENZYME: 2.6.1.2 / Oryza sativa japonica (Japanese rice): 4348524、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Cyanidioschyzon merolae: CMM066C、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Saccharomyces cerevisiae: YLR089C、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Saccharomyces cerevisiae: YDR111C、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Ashbya gossypii (Eremothecium gossypii): AGOS_AGR085W、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Candida albicans: CaO19_346、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Schizosaccharomyces pombe: SPBC582.08、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus nidulans: AN1923.2、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus fumigatus: AFUA_6G07770、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus oryzae: AO090003000164、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Cryptococcus neoformans JEC21: CNG01490、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Dictyostelium discoideum: DDB_0232139、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma brucei: Tb927.1.3950、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Leishmania major: LmjF12.0630、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 /Entamoeba histolytica: 233.t00009、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 /Entamoeba histolytica: 24.t00016、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 506529.420、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 506529.430、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 510889.120又はKEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 510889.140のアミノ酸配列と70％以上の同一性を有し、かつALT活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
(d2) KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (human): 2875、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (human): 84706、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Mus musculus (mouse): 76282、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Mus musculus (mouse): 108682、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Rattus norvegicus (rat): 81670、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Canis familiaris (dog): 609510、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Xenopus laevis (African clawed frog): 444533、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Drosophila melanogaster (fruit fly): Dmel_CG1640、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Caenorhabditis elegans (nematode): C32F10.8、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Oryza sativa japonica (Japanese rice): 4342210、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Oryza sativa japonica (Japanese rice): 4348524、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Cyanidioschyzon merolae: CMM066C、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Saccharomyces cerevisiae: YLR089C、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Saccharomyces cerevisiae: YDR111C、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Ashbya gossypii (Eremothecium gossypii): AGOS_AGR085W、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Candida albicans: CaO19_346、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Schizosaccharomyces pombe: SPBC582.08、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus nidulans: AN1923.2、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus fumigatus: AFUA_6G07770、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus oryzae: AO090003000164、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Cryptococcus neoformans JEC21: CNG01490、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Dictyostelium discoideum: DDB_0232139、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma brucei: Tb927.1.3950、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Leishmania major: LmjF12.0630、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 /Entamoeba histolytica: 233.t00009、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 /Entamoeba histolytica: 24.t00016、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 506529.420、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 506529.430、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 510889.120又はKEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 510889.140の塩基配列を有するＤＮＡ
(e2) KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (human): 2875、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (human): 84706、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Mus musculus (mouse): 76282、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Mus musculus (mouse): 108682、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Rattus norvegicus (rat): 81670、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Canis familiaris (dog): 609510、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Xenopus laevis (African clawed frog): 444533、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Drosophila melanogaster (fruit fly): Dmel_CG1640、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Caenorhabditis elegans (nematode): C32F10.8、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Oryza sativa japonica (Japanese rice): 4342210、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Oryza sativa japonica (Japanese rice): 4348524、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Cyanidioschyzon merolae: CMM066C、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Saccharomyces cerevisiae: YLR089C、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Saccharomyces cerevisiae: YDR111C、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Ashbya gossypii (Eremothecium gossypii): AGOS_AGR085W、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Candida albicans: CaO19_346、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Schizosaccharomyces pombe: SPBC582.08、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus nidulans: AN1923.2、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus fumigatus: AFUA_6G07770、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus oryzae: AO090003000164、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Cryptococcus neoformans JEC21: CNG01490、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Dictyostelium discoideum: DDB_0232139、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma brucei: Tb927.1.3950、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Leishmania major: LmjF12.0630、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 /Entamoeba histolytica: 233.t00009、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 /Entamoeba histolytica: 24.t00016、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 506529.420、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi:506529.430、KEGG / ENZYME:2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 510889.120又はKEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 510889.140の塩基配列を有するＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつALT活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
　ALT活性とは、アミノ酸とα-ケト酸との間のアミノ基転移を触媒する酵素活性を包含する概念である。
　ALT活性は、以下のようにして測定することができる。
自動分析用アラニンアミノトランスフェラーゼ測定試薬（ランピア リキッド S-ALT　承認番号20900AMZ00597000）や、Rajamohan F. et.al. Protein Expression and Purification (2006) 48, 81-89　で示された方法を用いてALT活性値を求める。
　本発明において、ALTをコードする遺伝子として、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (human): 2875、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (human): 84706、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Mus musculus (mouse): 76282、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Mus musculus (mouse): 108682、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Rattus norvegicus (rat): 81670、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Canis familiaris (dog): 609510、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Xenopus laevis (African clawed frog): 444533、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Drosophila melanogaster (fruit fly): Dmel_CG1640、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Caenorhabditis elegans (nematode): C32F10.8、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Oryza sativa japonica (Japanese rice): 4342210、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Oryza sativa japonica (Japanese rice): 4348524、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Cyanidioschyzon merolae: CMM066C、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Saccharomyces cerevisiae: YLR089C、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Saccharomyces cerevisiae: YDR111C、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Ashbya gossypii (Eremothecium gossypii): AGOS_AGR085W、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Candida albicans: CaO19_346、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Schizosaccharomyces pombe: SPBC582.08、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus nidulans: AN1923.2、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus fumigatus: AFUA_6G07770、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus oryzae: AO090003000164、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Cryptococcus neoformans JEC21: CNG01490、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Dictyostelium discoideum: DDB_0232139、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma brucei: Tb927.1.3950、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Leishmania major: LmjF12.0630、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 /Entamoeba histolytica: 233.t00009、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 /Entamoeba histolytica: 24.t00016、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 506529.420、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 506529.430、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 510889.120又はKEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 510889.140のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを用いるとよい。その他にも、上記アミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加又は／及び挿入されたアミノ酸配列を有し、かつALT活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを用いてもよい。配列表の配列番号３及び４は、それぞれ、ヒトALT1をコードする遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列（KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (human): 2875）を示す。
　KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (human): 2875、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (human): 84706、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Mus musculus (mouse): 76282、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Mus musculus (mouse): 108682、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Rattus norvegicus (rat): 81670、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Canis familiaris (dog): 609510、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Xenopus laevis (African clawed frog): 444533、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Drosophila melanogaster (fruit fly): Dmel_CG1640、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Caenorhabditis elegans (nematode): C32F10.8、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Oryza sativa japonica (Japanese rice): 4342210、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Oryza sativa japonica (Japanese rice): 4348524、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Cyanidioschyzon merolae: CMM066C、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Saccharomyces cerevisiae: YLR089C、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Saccharomyces cerevisiae: YDR111C、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Ashbya gossypii (Eremothecium gossypii): AGOS_AGR085W、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Candida albicans: CaO19_346、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Schizosaccharomyces pombe: SPBC582.08、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus nidulans: AN1923.2、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus fumigatus: AFUA_6G07770、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus oryzae: AO090003000164、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Cryptococcus neoformans JEC21: CNG01490、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Dictyostelium discoideum: DDB_0232139、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma brucei: Tb927.1.3950、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Leishmania major: LmjF12.0630、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 /Entamoeba histolytica: 233.t00009、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 /Entamoeba histolytica: 24.t00016、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 506529.420、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 506529.430、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 510889.120又はKEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 510889.140のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加又は／及び挿入されたアミノ酸配列を有し、かつALT活性を有するポリペプチドは、ヒト、マウス、ラット、イヌ、アフリカツメガエル、ショウジョウバエ、センチュウ、日本米、原子紅藻、パン酵母、糸状菌Ashbya gossypii、真菌Candida albicans、分裂酵母、真菌Aspergillus nidulans、真菌Aspergillus fumigatus、清酒麹菌Aspergillus oryzae、真菌Cryptococcus neoformans、細胞性粘菌Dictyostelium discoideum、Trypanosoma brucei、細胞内寄生性原虫Leishmania major、赤痢アメーバEntamoeba histolytica又は細胞内寄生性原虫Trypanosoma cruzi ALT（以下、「ヒト等のALT」と記すこともある）と機能的に同等なポリペプチドである。このようなポリペプチドには、例えば、ヒト等のALTの変異体などが含まれる。WO2009/020144の実施例及び参考例では、公開されているヒトALT1遺伝子がコードしているアミノ酸496個中、４アミノ酸（R53S、Q72R、F286S、M332K）が置換されている変異体が用いられた。
　あるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調製するための、当業者によく知られた方法としては、ポリペプチドに変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275、Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Methods Enzymol. 100, 468-500、Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456、Kramer W, and Fritz HJ(1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367、Kunkel,TA(1985) Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 488-492、Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766）などを用いて、ヒト等のALTのアミノ酸に適宜変異を導入することにより、ヒト等のALTと機能的に同等なポリペプチドを調製することができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。
　ヒト等のALTと機能的に同等なポリペプチドとしては、具体的には、ヒト等のALTのアミノ酸配列（例えば、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (human): 2875、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (human): 84706、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Mus musculus (mouse): 76282、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Mus musculus (mouse): 108682、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Rattus norvegicus (rat): 81670、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Canis familiaris (dog): 609510、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Xenopus laevis (African clawed frog): 444533、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Drosophila melanogaster (fruit fly): Dmel_CG1640、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Caenorhabditis elegans (nematode): C32F10.8、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Oryza sativa japonica (Japanese rice): 4342210、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Oryza sativa japonica (Japanese rice): 4348524、KEGG /ENZYME: 2.6.1.2 / Cyanidioschyzon merolae: CMM066C、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Saccharomyces cerevisiae: YLR089C、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Saccharomyces cerevisiae: YDR111C、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Ashbya gossypii (Eremothecium gossypii): AGOS_AGR085W、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Candida albicans: CaO19_346、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Schizosaccharomyces pombe: SPBC582.08、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus nidulans: AN1923.2、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus fumigatus: AFUA_6G07770、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus oryzae: AO090003000164、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Cryptococcus neoformans JEC21: CNG01490、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Dictyostelium discoideum: DDB_0232139、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma brucei: Tb927.1.3950、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Leishmania major: LmjF12.0630、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 /Entamoeba histolytica: 233.t00009、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 /Entamoeba histolytica: 24.t00016、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 506529.420、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 506529.430、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 510889.120又はKEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 510889.140のアミノ酸配列）中の１又は２個以上、好ましくは、１個以上３０個以下、より好ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が欠失したもの、ヒト等のALTのアミノ酸配列に１又は２個以上、好ましくは、１個以上３０個以下、より好ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が付加したもの、ヒト等のALTのアミノ酸配列中の１又は２個以上、好ましくは、１個以上３０個以下、より好ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたもの等が挙げられる。
　変異するアミノ酸残基は、特に限定されないが、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（G、A、V、L、I、P）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（S、T、Y）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（C、M）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（D、N、E、Q）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（R、K、H）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（H、F、Y、W）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。
　なお、あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666 、Zoller, M. J. & Smith, M. Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500 、Wang, A. et al., Science 224, 1431-1433 、 Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413 ）。
　ヒト等のALTに１又は複数個のアミノ酸残基が付加されたポリペプチドとしては、例えば、ヒト等のALTを含む融合ポリペプチドが挙げられる。融合ポリペプチドは、ヒト等のALTと他のポリペプチドとが融合したものである。融合ポリペプチドを作製する方法は、ヒト等のALTをコードする遺伝子と他のポリペプチドをコードする遺伝子をフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよく、当業者に公知の手法を用いることができる。ヒト等のALTとの融合に付される他のポリペプチドとしては、特に限定されない。
　ヒト等のALTとの融合に付される他のペプチドとしては、例えば、FLAG（Hopp, T. P. et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210 ）、6 個のHis （ヒスチジン）残基からなる6×His、10×His、インフルエンザ凝集素（HA）、ヒトc-myc の断片、VSV-GPの断片、p18HIVの断片、T7-tag、HSV-tag 、E-tag 、SV40T 抗原の断片、lck tag 、α-tubulinの断片、B-tag 、Protein C の断片、GST （グルタチオン－S－トランスフェラーゼ）、HA（インフルエンザ凝集素）、イムノグロブリン定常領域、β－ガラクトシダーゼ、MBP （マルトース結合ポリペプチド）等が挙げられる。
　市販されているこれらのポリペプチドをコードする遺伝子をヒト等のALTをコードする遺伝子と融合させ、これにより調製された融合遺伝子を発現させることにより、融合ポリペプチドを調製することができる。
　また、あるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調製する当業者によく知られた他の方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Sambrook,J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. press, 1989）を利用する方法が挙げられる。即ち、当業者であれば、ヒト等のALTをコードするDNA配列（例えば、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (human): 2875、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (human): 84706、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Mus musculus (mouse): 76282、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Mus musculus (mouse): 108682、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Rattus norvegicus (rat): 81670、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Canis familiaris (dog): 609510、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Xenopus laevis (African clawed frog): 444533、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Drosophila melanogaster (fruit fly): Dmel_CG1640、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Caenorhabditis elegans (nematode): C32F10.8、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Oryza sativa japonica (Japanese rice): 4342210、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Oryza sativa japonica (Japanese rice): 4348524、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Cyanidioschyzon merolae: CMM066C、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Saccharomyces cerevisiae: YLR089C、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Saccharomyces cerevisiae: YDR111C、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Ashbya gossypii (Eremothecium gossypii): AGOS_AGR085W、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Candida albicans: CaO19_346、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Schizosaccharomyces pombe: SPBC582.08、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus nidulans: AN1923.2、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus fumigatus: AFUA_6G07770、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus oryzae: AO090003000164、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Cryptococcus neoformans JEC21: CNG01490、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Dictyostelium discoideum: DDB_0232139、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma brucei: Tb927.1.3950、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Leishmania major: LmjF12.0630、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 /Entamoeba histolytica: 233.t00009、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 /Entamoeba histolytica: 24.t00016、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 506529.420、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 506529.430、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 510889.120又はKEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 510889.140のDNA配列）もしくはその一部を基に、これと相同性の高いDNAを単離して、該DNAからヒト等のALTと機能的に同等なポリペプチドを単離することも通常行いうることである。
　ヒト等のALTと機能的に同等なポリペプチドをコードするDNAを単離するためのハイブリダイゼーションの条件としては、当業者であれば適宜選択することができる。ハイブリダイゼーションの条件は、例えば、低ストリンジェントな条件が挙げられる。低ストリンジェントな条件とは、例えば42℃、2×SSC、0.1％SDSが挙げられ、好ましくは50℃、2×SSC 、0.1％SDSである。またより好ましくは、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば65℃、2×SSC及び0.1％SDSが挙げられる。これらの条件において、温度を下げる程に高い相同性を有するDNAのみならず、低い相同性しか有していないDNAまでも包括的に得ることができる。逆に、温度を上げる程、高い相同性を有するDNAのみを得られることが期待できる。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度以外にも塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
　これらハイブリダイゼーション技術により単離されるDNAがコードするポリペプチドは、ヒト等のALTとアミノ酸配列において70%以上の同一性を有するものであればよいが、通常、ヒト等のALTとアミノ酸配列において高い相同性を有する。高い相同性とは、通常、97％以上の同一性、好ましくは98％以上の同一性、さらに好ましくは99％以上の同一性を指す。ポリペプチドの同一性を決定するには、文献（Wilbur, W. J. and Lipman, D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80, 726-730）に記載のアルゴリズムにしたがえばよい。
　ポリペプチドは、後述するそれを産生する細胞や宿主あるいは精製方法により、アミノ酸配列、分子量、等電点又は糖鎖の有無や形態などが異なり得る。しかしながら、得られたポリペプチドが、ヒト等のALTと同等の機能を有している限り、それをコードするDNAを本発明で利用することができる。例えば、ポリペプチドを原核細胞、例えば大腸菌で発現させた場合、本来のポリペプチドのアミノ酸配列のN末端にメチオニン残基が付加される。また、真核細胞、例えば哺乳動物細胞で発現させた場合、N末端のシグナル配列は除去される。このようなポリペプチドをコードするDNAも本発明で利用することができる。
　本発明において、ALTをコードするＤＮＡとして、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (human): 2875、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (human): 84706、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Mus musculus (mouse): 76282、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Mus musculus (mouse): 108682、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Rattus norvegicus (rat): 81670、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Canis familiaris (dog): 609510、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Xenopus laevis (African clawed frog): 444533、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Drosophila melanogaster (fruit fly): Dmel_CG1640、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Caenorhabditis elegans (nematode): C32F10.8、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Oryza sativa japonica (Japanese rice): 4342210、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Oryza sativa japonica (Japanese rice): 4348524、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Cyanidioschyzon merolae: CMM066C、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Saccharomyces cerevisiae: YLR089C、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Saccharomyces cerevisiae: YDR111C、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Ashbya gossypii (Eremothecium gossypii): AGOS_AGR085W、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Candida albicans: CaO19_346、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Schizosaccharomyces pombe: SPBC582.08、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus nidulans: AN1923.2、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus fumigatus: AFUA_6G07770、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus oryzae: AO090003000164、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Cryptococcus neoformans JEC21: CNG01490、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Dictyostelium discoideum: DDB_0232139、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma rucei: Tb927.1.3950、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Leishmania major: LmjF12.0630、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 /Entamoeba histolytica: 233.t00009、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 /Entamoeba histolytica: 24.t00016、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 506529.420、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 506529.430、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 510889.120又はKEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 510889.140の塩基配列を有するＤＮＡを用いてもよい。その他にも、上記塩基配列を有するＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつALT活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを用いてもよい。
　ALTをコードするＤＮＡは、上述したような所望のポリペプチドの in vivo や in vitroにおける生産に利用される他、ALTを強発現する細胞の作製に用いることができる。ALTをコードするＤＮＡは、ALTをコードしうるものであれば、いかなる形態でもよい。即ち、mRNAから合成されたcDNAであるか、ゲノムDNAであるか、化学合成DNAであるかなどを問わない。また、ALTをコードするＤＮＡをコードしうる限り、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するDNAが含まれる。
　ALTをコードするＤＮＡは、当業者に公知の方法により調製することができる。例えば、ALTを発現している細胞よりcDNAライブラリーを作製し、ALTのDNAの配列（例えば、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (human): 2875、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (human): 84706、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Mus musculus (mouse): 76282、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Mus musculus (mouse): 108682、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Rattus norvegicus (rat): 81670、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Canis familiaris (dog): 609510、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Xenopus laevis (African clawed frog): 444533、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Drosophila melanogaster (fruit fly): Dmel_CG1640、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Caenorhabditis elegans (nematode): C32F10.8、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Oryza sativa japonica (Japanese rice): 4342210、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Oryza sativa japonica (Japanese rice): 4348524、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Cyanidioschyzon merolae: CMM066C、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Saccharomyces cerevisiae: YLR089C、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Saccharomyces cerevisiae: YDR111C、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Ashbya gossypii (Eremothecium gossypii): AGOS_AGR085W、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Candida albicans: CaO19_346、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Schizosaccharomyces pombe: SPBC582.08、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus nidulans: AN1923.2、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus fumigatus: AFUA_6G07770、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus oryzae: AO090003000164、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Cryptococcus neoformans JEC21: CNG01490、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Dictyostelium discoideum: DDB_0232139、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma brucei: Tb927.1.3950、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Leishmania major: LmjF12.0630、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 /Entamoeba histolytica: 233.t00009、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 /Entamoeba histolytica: 24.t00016、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 506529.420、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 506529.430、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 510889.120又はKEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 510889.140のDNA配列）の一部をプローブにしてハイブリダイゼーションを行うことにより調製できる。cDNAライブラリーは、例えばSambrook, J. et al., Molecular Cloning、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に記載の方法により調製してもよいし、市販の遺伝子ライブラリーを用いてもよい。また、ALTを発現している細胞よりRNAを調製し、ALTのDNAの配列（例えば、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (human): 2875、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (human): 84706、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Mus musculus (mouse): 76282、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Mus musculus (mouse): 108682、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Rattus norvegicus (rat): 81670、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Canis familiaris (dog): 609510、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Xenopus laevis (African clawed frog): 444533、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Drosophila melanogaster (fruit fly): Dmel_CG1640、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Caenorhabditis elegans (nematode): C32F10.8、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Oryza sativa japonica (Japanese rice): 4342210、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Oryza sativa japonica (Japanese rice): 4348524、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Cyanidioschyzon merolae: CMM066C、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Saccharomyces cerevisiae: YLR089C、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Saccharomyces cerevisiae: YDR111C、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Ashbya gossypii (Eremothecium gossypii): AGOS_AGR085W、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Candida albicans: CaO19_346、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Schizosaccharomyces pombe: SPBC582.08、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus nidulans: AN1923.2、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus fumigatus: AFUA_6G07770、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus oryzae: AO090003000164、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Cryptococcus neoformans JEC21: CNG01490、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Dictyostelium discoideum: DDB_0232139、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma brucei: Tb927.1.3950、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Leishmania major: LmjF12.0630、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 /Entamoeba histolytica: 233.t00009、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 /Entamoeba histolytica: 24.t00016、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 506529.420、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 506529.430、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 510889.120又はKEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 510889.140のDNA配列）に基づいてオリゴDNAを合成し、これをプライマーとして用いてPCR反応を行い、ALTをコードするcDNAを増幅させることにより調製することも可能である。
　また、得られたcDNAの塩基配列を決定することにより、それがコードする翻訳領域を決定でき、ALTのアミノ酸配列を得ることができる。また、得られたcDNAをプローブとしてゲノムDNA ライブラリーをスクリーニングすることにより、ゲノムDNAを単離することができる。
　具体的には、次のようにすればよい。まず、ALTを発現する細胞、組織などから、mRNAを単離する。mRNAの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法(Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299) 、AGPC法 (Chomczynski, P. and Sacchi, N., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159) 等により全RNAを調製し、mRNA Purification Kit (Pharmacia) 等を使用して全RNAからmRNAを精製する。また、QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia) を用いることによりmRNAを直接調製することもできる。
　得られたmRNAから逆転写酵素を用いてcDNAを合成する。cDNAの合成は、 AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (生化学工業)等を用いて行うこともできる。また、プライマー等を用いて、5'-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech製)およびポリメラーゼ連鎖反応(polymerase chain reaction ; PCR)を用いた5'-RACE法(Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 8998-9002 ; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) にしたがい、cDNAの合成および増幅を行うことができる。
　得られたPCR産物から目的とするDNA断片を調製し、ベクターDNAと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするDNAの塩基配列は、公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法により確認することができる。
　また、ALTをコードするＤＮＡにおいては、発現に使用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現効率の高い塩基配列を設計することができる（Grantham, R. et al., Nucelic Acids Research (1981) 9, r43-74 ）。また、ALTをコードするＤＮＡは、市販のキットや公知の方法によって改変することができる。改変としては、例えば、制限酵素による消化、合成オリゴヌクレオチドや適当なDNAフラグメントの挿入、リンカーの付加、開始コドン（ATG）及び／又は終止コドン（TAA、TGA、又はTAG）の挿入等が挙げられる。
　ALTをコードするＤＮＡはまた、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (human): 2875、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (human): 84706、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Mus musculus (mouse): 76282、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Mus musculus (mouse): 108682、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Rattus norvegicus (rat): 81670、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Canis familiaris (dog): 609510、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Xenopus laevis (African clawed frog): 444533、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Drosophila melanogaster (fruit fly): Dmel_CG1640、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Caenorhabditis elegans (nematode): C32F10.8、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Oryza sativa japonica (Japanese rice): 4342210、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Oryza sativa japonica (Japanese rice): 4348524、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Cyanidioschyzon merolae: CMM066C、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Saccharomyces cerevisiae: YLR089C、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Saccharomyces cerevisiae: YDR111C、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Ashbya gossypii(Eremothecium gossypii): AGOS_AGR085W、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Candida albicans: CaO19_346、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Schizosaccharomyces pombe: SPBC582.08、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus nidulans: AN1923.2、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus fumigatus: AFUA_6G07770、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus oryzae: AO090003000164、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Cryptococcus neoformans JEC21: CNG01490、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Dictyostelium discoideum: DDB_0232139、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma brucei: Tb927.1.3950、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Leishmania major: LmjF12.0630、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 /Entamoeba histolytica: 233.t00009、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 /Entamoeba histolytica: 24.t00016、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 506529.420、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 506529.430、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 510889.120又はKEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 510889.140の塩基配列を有するDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであり、かつALTと機能的に同等なポリペプチドをコードするDNAを含む。
　ストリンジェントな条件としては、当業者であれば適宜選択することができるが、例えば低ストリンジェントな条件が挙げられる。低ストリンジェントな条件とは、例えば42℃、2×SSC、0.1％SDSが挙げられ、好ましくは50℃、2×SSC 、0.1％SDSである。またより好ましくは、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば65℃、2×SSC及び0.1％SDSが挙げられる。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するDNAを得ることができる。上記のハイブリダイズするDNAは好ましくは天然由来のDNA、例えばcDNA又は染色体DNAであってよい。
　これらハイブリダイゼーション技術により単離されるDNAは、通常、ヒト等のALTをコードするＤＮＡと塩基配列において高い同一性を有する。ALTをコードするＤＮＡには、ヒト等のALTと機能的に同等なポリペプチドをコードし、ヒト等のALTをコードするDNAと高い同一性を有するDNAも含まれる。高い同一性とは、通常、96％以上の同一性、好ましくは98％以上の同一性、さらに好ましくは99％以上の同一性を指す。塩基配列の同一性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993)によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている(Altschul et al. J. Mol. Biol.215:403-410, 1990)。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは、例えば、score = 100、wordlength = 12とする。これらの解析方法の具体的な手法は公知である(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
　Bicarbonateトランスポーターを強発現する細胞には、所望のポリペプチドをコードするDNAと共に、DHFR遺伝子が導入されるとよい。DHFR遺伝子は、MTXによって細胞内でのコピー数が増幅され（遺伝子増幅）、細胞はMTX耐性になる。Bicarbonateトランスポーターを強発現する細胞は、所望のポリペプチドをコードするDNAとDHFRをコードするDNAとを含む1つの分子（例えば、ベクター）によって共形質転換されたものであるとよい。DHFR遺伝子に所望のポリペプチドをコードするＤＮＡをつないだ組換えベクターを細胞に導入し、この細胞をMTXの存在下で培養すると、遺伝子増幅によって所望のポリペプチドを高産生する細胞が得られる。DHFR遺伝子はいかなる生物由来のものであってもよく、それらのDNA配列は公知であるから（マウス GenBank V00734、 ラットGenBank AF318150、ヒト GenBank J00140）、その情報に従って、DHFR遺伝子を調製し、ベクターに導入することができる。また、DHFR遺伝子が導入された発現ベクター（pOptiVECTM-TOPO（登録商標）ベクター、INVITROGEN社）が市販されているので、それを利用してもよい。
　Bicarbonateトランスポーター遺伝子が人為的に導入された細胞を宿主として用いる場合、Bicarbonateトランスポーター遺伝子を細胞に導入した後に所望のポリペプチドをコードするDNAとDHFRをコードするDNAを導入してもよいし、その逆に、所望のポリペプチドをコードするDNAとDHFRをコードするDNAを細胞に導入した後にBicarbonateトランスポーター遺伝子を導入してもよいし、Bicarbonateトランスポーター遺伝子と所望のポリペプチドをコードするDNAとDHFRをコードするDNAを同時に細胞に導入してもよい。
　Bicarbonateトランスポーター遺伝子（場合によっては、ALT遺伝子も）及び所望のポリペプチドをコードするDNAの導入は単一のベクターにより同時に導入してもよいし、複数のベクターを用いて別々に導入してもよい。
　また、所望のポリペプチドをコードするDNAとDHFR遺伝子は単一のベクターに導入されてもよいし、別々のベクターに導入されてもよい。遺伝子増幅によって高発現細胞株を効率よく樹立するためには、所望のポリペプチドをコードするDNAとDHFR遺伝子は単一のベクターに導入することが好ましい。遺伝子の増幅効率を上げるためには、DHFR遺伝子は転写効率の低いプロモーター（例えば、SV40プロモーター）の下流につなぎ、所望のポリペプチドをコードするDNAは転写効率の高いプロモーター（例えば、CMVプロモーター、SRαプロモーター、EF-1αプロモーターなど）の下流につなぐことが好ましい。所望のポリペプチドをコードするDNAとDHFR遺伝子を別々のベクターに導入する場合には、共導入法で宿主細胞内に導入するとよい。この場合、所望のポリペプチドをコードするDNAを組み込んだベクターはDHFR遺伝子を組み込んだベクターより過剰量(通常２～４０倍程度の過剰量）で宿主細胞内に導入するとよい。
　CHO細胞におけるポリペプチド発現ベクター構築にあたっては、CMV immediate-earlyエンハンサー/プロモーター領域や典型的なKozak配列 (-6 GCCR (R=A/G) CCAUGG +4）（配列番号５）、薬剤耐性遺伝子マーカー（neomycin, hygromaicin, puromicinなど）の利用、さらにN末端側への分泌シグナルペプチド配列（MGWSCIILFLVATATGVHS（配列番号６）など）の付加を考慮するとよい。
　発現ベクターは適当な制限酵素で切断し、直鎖にしてから宿主細胞に導入するとよい。直鎖にすることによって、目的とする遺伝子の発現ユニットが宿主細胞の染色体に組み込まれやすくなる。遺伝子導入方法は特に限定されるものではなく、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などのいずれの方法であってもよい。NUCLEOFECTOR(AMAXA社)で遺伝子導入すれば、多コピー導入も可能である。
　宿主細胞への遺伝子導入を行った後、選択培地での培養を行い、目的の遺伝子が導入された細胞を選択するとよい。例えば、薬剤耐性遺伝子を持つベクターに所望のポリペプチドをコードするDNAを挿入し、宿主細胞を形質転換した後、薬剤含有培地で培養すれば、生存した細胞を形質転換細胞として選択することができる。また、DHFR遺伝子を持つベクターに所望のポリペプチドをコードするDNAを挿入し、宿主細胞としてdhfr欠失CHO細胞を形質転換した場合には、HT不含培地で培養することにより、生存した細胞を形質転換細胞として選択することができる。培地としては、CHO-S-SFMII /CD-CHO混合培地(Invitrogen社)などを用いることができる。形質転換細胞の培養を続け、適当な時間経過後（通常、14～21日くらい）に目的とするポリペプチドの産生量を測定する。産生量の高い細胞をMTX処理する。MTX処理する形質転換細胞は、ポリペプチドの産生量が高い他、増殖が速いことが好ましい。増殖速度は、継代培養時の生細胞数測定により比較することができる。
　MTX処理とは、例えば、高濃度のMTXを添加した培地で培養（好ましくは、継代培養）することである。高濃度とは、通常のMTXによる細胞選抜後の継代培養時に、増幅された遺伝子が安定に維持される濃度 (CHO細胞であれば約20nM程度)の２倍以上、例えば、Bicarbonateトランスポーター未導入株が継代培養３週間後に90％以上死滅する濃度であり、細胞によっては異なるが、CHO DXB11s細胞など、組換タンパク質の製造に用いられるCHO細胞の場合、通常50 nM以上が適当であり、好ましくは80ｎM以上、さらに好ましくは100 nM以上である。培養期間は、7～35日が適当であり、14～28日が好ましく、21～28日がより好ましい。
　MTXを高濃度で添加した培地で形質転換細胞を培養するにあたっては、MTXの濃度を段階的に増加させていくとよい。例えば、MTX濃度が10 nMの培地で14～21日培養し、MTX濃度が100nMの培地で14～28日培養する。
　MTXの濃度を変えて培養する工程毎に、高産生細胞株を選択するとよい。また、MTXを高濃度で添加した培地で培養することによって細胞増殖がみられなくなった場合には、MTXを低濃度で添加した培地に戻して培養を続けることによって細胞増殖を回復させるとよい。
　MTXを高濃度で添加する培地としては、CHO-S-SFMII /CD-CHO混合培地(Invitrogen社)などを用いることができる。
　MTX処理前の形質転換細胞株がほぼ均一である場合も、MTX処理によって多様性を獲得するため、均一ではなくなる。均一ではなくなった細胞群のポリペプチド産生量の総和が、MTX処理前のほぼ均一な細胞株の産生量よりも高くなるのである。多様性を獲得した細胞群から、高産生株のみをクローン化することは可能である。例えば、96well plateを用いたlimiting dilution法（限界希釈法）やセルソーターによるシングルセルクローニングが有効である。いずれも従来公知の方法を用いることができる。
　本発明のBicarbonateトランスポーターを強発現する細胞は、後述の実施例からも明らかなように、MTXに対して優れた耐性能を有しており、通常のMTXによる選抜濃度よりも高い濃度で選抜することが可能でありる。
　このように高濃度のMTXを処理して得られた本発明の細胞群から、通常のMTX処理では得ることのできない、或いは得ることの非常に難しい、所望のポリペプチドの高産生株を効率よく多数得ることができる。よって、本発明のBicarbonateトランスポーター強発現細胞は、MTX選抜に用いる形質転換細胞として極めて有用である。
　したがって、本発明は、上記の方法により作製された、所望のポリペプチドを高産生する細胞も提供する。細胞は不均一な細胞群であってもよいし、クローン化された均一な細胞株であってもよい。
　また、本発明は、上記の方法により作製された細胞を培養することを含む、ポリペプチドの製造方法も提供する。さらに、本明細書では遺伝子活性化技術（例えば、国際公開第WO94/12650号パンフレット参照）により、該細胞の内因性の所望のポリペプチドをコードする遺伝子が活性化されることにより、所望のポリペプチドを産生する細胞を用いて、所望のポリペプチドを製造することも可能である。
　細胞の培養には、通常の細胞（好ましくは、動物細胞）培養で使用されている培地を用いることができる。これらには通常、アミノ酸、ビタミン類、脂質因子、エネルギー源、浸透圧調節剤、鉄源、pH緩衝剤を含む。これらの成分の含量は、通常、アミノ酸は0.05－1500mg/L、ビタミン類は0.001－10mg/L、脂質因子は0－200mg/L、エネルギー源は1－20g/L、浸透圧調節剤は0.1－10000mg/L、鉄源は0.1－500mg/L、pH緩衝剤は1－10000mg/Lの範囲が適当であるが、これらに限定されず、培養する細胞の種類、所望のポリペプチド（例えば、抗体など）の種類などにより適宜決定できる。
　上記成分のほか、例えば、微量金属元素、界面活性剤、増殖補助因子、ヌクレオシドなどを添加しても良い。これらの成分の含量は、通常、微量金属元素は0.00001－200mg/L、界面活性剤は0－5000mg/L、増殖補助因子は0.05－10000μg/Lおよびヌクレオシドは0.001－50mg/Lの範囲が適当であるが、これらに限定されず、培養する細胞の種類、所望のポリペプチドの種類などにより適宜決定できる。
　具体的には、例えば、L-アラニン、L-アルギニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-システイン、L-シスチン、L-グルタミン、L-グルタミン酸、グリシン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リジン、L-メチオニン、L-オルニチン、L-フェニルアラニン、L-プロリン、L-セリン、L-スレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、L-バリン等、好ましくはL-アラニン、L-アルギニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-シスチン、L-グルタミン、L-グルタミン酸、グリシン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リジン、L-メチオニン、L-フェニルアラニン、L-プロリン、L-セリン、L-スレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、L-バリン等のアミノ酸類；ｉ－イノシトール、ビオチン、葉酸、リポ酸、ニコチンアミド、ニコチン酸、p-アミノ安息香酸、パントテン酸カルシウム、塩酸ピリドキサール、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、塩酸チアミン、ビタミンB12、アスコルビン酸等、好ましくはビオチン、葉酸、リポ酸、ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウム、塩酸ピリドキサール、リボフラビン、塩酸チアミン、ビタミンB12、アスコルビン酸等のビタミン類；塩化コリン、酒石酸コリン、リノール酸、オレイン酸、コレステロール等、好ましくは塩化コリン等の脂質因子；グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース等、好ましくはグルコース等のエネルギー源；塩化ナトリウム、塩化カリウム、硝酸カリウム等、好ましくは塩化ナトリウム等の浸透圧調節剤；EDTA鉄、クエン酸鉄、塩化第一鉄、塩化第二鉄、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、硝酸第二鉄等、好ましくは塩化第二鉄、EDTA鉄、クエン酸鉄等の鉄源類；炭酸水素ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、HEPES、MOPS等、好ましくは炭酸水素ナトリウム等のpH緩衝剤を含む培地を例示できる。
　上記成分のほか、例えば、硫酸銅、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸マグネシウム、塩化ニッケル、塩化スズ、塩化マグネシウム、亜ケイ酸ナトリウム等、好ましくは硫酸銅、硫酸亜鉛、硫酸マグネシウム等の微量金属元素；Tween80、プルロニックF68等の界面活性剤；および組換え型インスリン、組換え型IGF-1、組換え型EGF、組換え型FGF、組換え型PDGF、組換え型TGF-α、塩酸エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、レチノイン酸、塩酸プトレッシン等、好ましくは亜セレン酸ナトリウム、塩酸エタノールアミン、組換え型IGF-1、塩酸プトレッシン等の増殖補助因子；デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、アデノシン、シチジン、グアノシン、ウリジン等のヌクレオシドなどを添加してもよい。なお上記培地の好適例においては、ストレプトマイシン、ペニシリンGカリウム及びゲンタマイシン等の抗生物質や、フェノールレッド等のpH指示薬を含んでいても良い。
　培地のｐＨは培養する細胞により異なるが、一般的にはｐＨ６．８～７．６、多くの場合ｐＨ７．０～７．４が適当である。
　培地は、市販の動物細胞培養用培地、例えば、D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)、 D-MEM/F-12 1:1 Mixture (Dulbecco's Modified Eagle Medium : Nutrient Mixture F-12)、 RPMI1640、CHO-S-SFM II(Invitrogen社)、 CHO-SF (Sigma-Aldrich社)、 EX-CELL 301 (JRH biosciences社)、CD-CHO  (Invitrogen社)、 IS CHO-V (Irvine Scientific社)、 PF-ACF-CHO (Sigma-Aldrich社)などの培地を用いることも可能である。又、培地は無血清培地であってもよい。
　細胞がCHO細胞である場合、CHO細胞の培養は当業者に公知の方法を用いて行うことができる。例えば、通常、気相のCO2濃度が0－40%、好ましくは、2－10%の雰囲気下、30－39℃、好ましくは37℃程度で、培養することが可能である。
　所望のポリペプチドを産生するために適当な細胞の培養期間は、通常１日～３ヶ月であり、好ましくは1日～2ヶ月、さらに好ましくは1日～1ヶ月である。
　また、動物細胞培養用の各種の培養装置としては、例えば発酵槽型タンク培養装置、エアーリフト型培養装置、カルチャーフラスコ型培養装置、スピンナーフラスコ型培養装置、マイクロキャリアー型培養装置、流動層型培養装置、ホロファイバー型培養装置、ローラーボトル型培養装置、充填槽型培養装置等を用いて培養することができる。
　培養は、バッチ培養(batch culture)、流加培養(fed-batch culture)、連続培養(continuous culture)などのいずれの方法を用いてもよいが、流加培養又は連続培養が好ましく、流加培養がより好ましい。
　本発明の方法により製造されたポリペプチドが医薬として利用可能な生物学的活性を有する場合には、このポリペプチドを医薬的に許容される担体又は添加剤と混合して製剤化することにより、医薬品を製造することができる。
　医薬的に許容される担体及び添加剤の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。
　実際の添加物は、本発明治療剤の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれるが、もちろんこれらに限定するものではない。例えば、注射用製剤として使用する場合、精製されたポリペプチドを溶剤、例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等に溶解し、これに吸着防止剤、例えばＴｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ２０、ゼラチン、ヒト血清アルブミン等を加えたものを使用することができる。あるいは、使用前に溶解再構成する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよく、凍結乾燥のための賦形剤としては、例えば、マンニトール、ブドウ糖等の糖アルコールや糖類を使用することができる。
　ポリペプチドの有効投与量は、ポリペプチドの種類、治療や予防の対象とする疾患の種類、患者の年齢、疾患の重篤度などにより適宜選択される。例えば、ポリペプチドが抗グリピカン抗体である場合、抗グリピカン抗体の有効投与量（例えば、抗癌剤）は、一回につき体重１ｋｇあたり０．００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ばれる。あるいは、患者あたり０．０１～１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの投与量を選ぶことができる。しかしながら、これらの投与量に制限されるものではない。
　ポリペプチドの投与方法は、経口、非経口投与のいずれでも可能であるが、好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射（例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などによる全身又は局所投与）、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが挙げられる。
　本発明の他の実施態様として、Bicarbonateトランスポーターを強発現し、且つ所望のポリペプチドをコードするDNAが導入された細胞を高濃度MTXで処理することにより、該細胞によるポリペプチド産生量を増強する方法が提供される。
　本発明の別の実施態様として、細胞にBicarbonateトランスポーターを強発現させることを含む、高濃度メトトレキセートの存在下での培養において、高い生存率を有する細胞の作製方法が提供される。
　本発明は、Bicarbonateトランスポーターを強発現し、且つ所望のポリペプチドをコードするDNAが導入された細胞をメトトレキセートの存在下で培養し、生存する細胞から所望のポリペプチドを高産生する細胞を選択することを含む、所望のポリペプチドを高産生する細胞の作製方法を包含する。
　また、本発明は、Bicarbonateトランスポーターを強発現し、且つ所望のポリペプチドをコードするDNAが導入された細胞をメトトレキセートで処理することにより、該細胞によるポリペプチド産生量を増強する方法も包含する。
　なお、本発明において、「ＤＮＡが導入された細胞」とは、遺伝子組み換え技術により外来性ＤＮＡが組み込まれた細胞の他、遺伝子活性化技術（例えば、国際公開第WO94/12650号パンフレット参照）により内因性ＤＮＡが活性化され、その結果、当該ＤＮＡに対応する蛋白質の発現もしくは当該ＤＮＡの転写が開始或いは増加した細胞も包含する概念である。
　以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
〔実施例１〕アニオンエクスチェンジャー（AE1）導入による宿主細胞のＭＴＸ耐性獲得
　pHyg-AE1発現プラスミド（後述の参考例２、図５）をDXB11S宿主細胞にエレクトロポレーション法で導入し、AE1を強発現させたDXB11Ｓ/ AE1宿主細胞を作成し、親株のDXB11S宿主細胞とのＭＴＸ感受性を比較した。どちらの宿主細胞もＨＴサプリメント要求性のためＨＴ不含培地で生存できないが、図１に示したように、ＨＴ不含培地にＭＴＸを添加しない条件下での生存率の減少は同等であった。しかし、ＨＴ不含培地にＭＴＸを１０ｎＭあるいは２０ｎＭ添加した条件下で、DXB11S/AE1宿主細胞の培養２日目の生存率はDXB11S宿主細胞よりも高く、DXB11S/AE1宿主細胞のＭＴＸ耐性獲得が示唆された。
〔実施例２〕ＭＴＸ耐性を獲得したDXB11S/AE1宿主細胞による抗体産生株構築
　CHO-S-SFM II馴化されたDXB11S宿主細胞より構築したDXB11S/AE1宿主細胞をＣＳ（CHO-S-SFM II/CD-CHO）馴化することでDXB11y/AE1宿主細胞とし、さらにDXB11S宿主細胞の親株であるＣＳ馴化DXB11y宿主細胞をコントロール細胞として用いることによってFetuinを含まない培地でのTransfectionを可能にし、抗体産生細胞の新株構築をおこなった。抗ＩＬ-６Ｒ抗体（tocilizumab、商品名 アクテムラ（登録商標））発現プラスミド(pNeo/MRA/CAG-A)（図２） 1μgを15x10e5 個の宿主細胞へAmaxa社nucleofector（Nucleofector kit V、プログラムU-030 ）によって導入した。Nuclefection 6時間後にＨＴ不含のＣＳ培地に置換し、９６ハーフウェルプレートの各ウェルに７５００細胞ずつを播いて、37℃で5% CO2のインキュベーター中で一週間放置したのち、終濃度１５ｎＭ になるようにＭＴＸを加えてさらに一週間静置培養した。細胞の拡大培養のため、各ウェルの細胞を１００μｌのＨＴ不含１５ｎＭ ＭＴＸ/ＣＳ培地を含む９６ウェルプレートに移して、さらに８日間静置培養した（計２００μｌ）。拡大培養後、抗体産生量を評価するために、１５０μｌの細胞液を７００μｌのＣＳ培地を含む２４ウェルプレートに移して１６０ｒｐｍで１４日間のバッチ培養をおこなった。残りの細胞液（５０μｌ）は１５０μｌのＨＴ不含１５ｎＭ ＭＴＸ/ＣＳ培地を加えて、継代による拡大培養を続けた。１４日後に２４ウェルバッチ培養での抗体産生量を定量することで（図３の一次増幅株産生量プロット）、各々の上位５株を選抜した。上位５株の拡大培養は６ウェルプレートまでおこなったのち、９６ハーフウェルプレートの各ウェルに１０００細胞ずつを播き、ＨＴ不含１５０ｎＭ ＭＴＸ/ＣＳ培地存在下（計１００μｌ）で１４日間静置培養して、抗体発現ユニットを二次増幅させた。二次増幅細胞の拡大培養のために、各ウェルの高増殖な細胞を最大２０株ずつ選抜して（各々計１００株以下）、細胞を９６ハーフウェルプレートから１００μｌのＨＴ不含１５０ｎＭ ＭＴＸ/ＣＳ培地を含む９６ウェルプレートに移して、さらに１１日間静置培養した（計２００μｌ）。上記と同様の手法で、１５０μｌの細胞液を２４ウェルバッチ培養し、増殖した細胞の抗体産生量を評価することで、DXB11S/AE1宿主細胞を用いた株構築によって抗体を高産生する細胞株を多く得られることが示された（図３の二次増幅株産生量プロット）。
〔実施例３〕高濃度ＭＴＸ処理によるAE1強発現抗体産生株の抗体産生量の増加
　高濃度ＭＴＸ（１００ｎＭ　あるいは２００ｎＭ）存在下、37℃で5% CO2のインキュベーター中で２４日間静置培養（１０日目と１８日目に培地交換のため遠心継代）したのち、もとのＭＴＸ濃度（２０ｎＭ）に戻して２２日間静置培養することで細胞増殖を回復させた（T25 flask静置で4継代培養、6 well plate 懸濁で1継代培養、shaker flask 懸濁で1継代培養）。高濃度ＭＴＸでの未処理株（２０ｎＭ ＭＴＸ存在下での継代細胞）をコントロールとしてshakerを用いた懸濁生産Fed-Batch培養を14日間おこない、抗体産生量を比較した。AE1強発現させたＡＥ株（実施例１のDXB11S/AE1宿主細胞でＭＴＸ耐性獲得したもの）、ＡＥ１／ＡＬＴ１共発現株（後述の参考例２のAE1/ALT1共発現株）は、ＴａｕＴを強発現させたＴＡＵＴ／ＡＬＴ１共発現株（WO2009/020144の実施例２のTauT/ALT1共発現株）と同様に、高濃度ＭＴＸ処理することで抗体産生量の増加がみられた（図４）。
　以上の結果は、アニオンエクスチェンジャー遺伝子（ＡＥ１）を人為的に発現させることで細胞がＭＴＸ耐性を獲得し、高濃度ＭＴＸ処理により抗体をさらに高産生できることを示唆している。
　本発明は、あらゆる抗体産生細胞へ応用可能である。
〔参考例１〕ヒト肝細胞アニオンエクスチェンジャー(Anion Exchanger 1, band 3)遺伝子クローニング
　市販のHuman Liver QUICK-Clone cDNA（Clontech社）を鋳型にして、ヒト肝由来Anion Exchanger（AE1）遺伝子をPCR法によって得た。クローニングされた遺伝子は塩基配列を決定し、公開されているヒトAE1との相同性からAE1をコードしていることを確認した。得られたAE1遺伝子は、2733塩基中、8箇所（t263g,t357c,a645t,a672c,c951t,a2078g,　t2195c,c2500t）に変異がみられ、コードするアミノ酸は、911個中、４アミノ酸(L88R、E693G, V712A,H834Y)が異なっていた。しかし、１３の膜貫通領域をもつトランスポーターと予測されるため（図５）、ヒト肝由来AE1 遺伝子として細胞改変に用いた。
〔参考例２〕ヒトアニオンエクスチェンジャー遺伝子導入による抗体産生量増加
　参考例１のPCRクローニングにより取得したヒトAE1（以下AE1）遺伝子にKozak配列を加え、ＣＭＶプロモーター発現プラスミドpHyg-AE1（図６）、pPur-AE1（図７）を構築した。pHyg-AE1あるいはAE1遺伝子を含まないpHyg発現プラスミド（Clontech社のpTK5由来のHygromycin耐性遺伝子発現ユニットをpSV2-dhfrプラスミド（ATCC No.37146）に導入したプラスミドを構築後、dhfr発現ユニットを取り除いたものである。）を、親株である抗グリピカン-３抗体産生CHO細胞（国際公開第WO 2006/006693号パンフレットを参照）にエレクトロポレーション法で導入し、Hygromycin(200μg/ml) 存在下、静置培養下で高増殖であった細胞株を拡大したのち、pHyg-AE1細胞株からTotal RNAを調製し、TaqMan法によってヒトAE1を高発現していた５株を選抜した。さらに、振とう培養下で、コントロールであるｐHyg導入細胞（４株）と同程度に増殖した４株をヒトAE1導入細胞として、抗体産生量比較をおこなった。初発密度２ｘ１０５cells/mLの５０ｍlシェーカーフラスコによる流加培養において、シェーカー培養後期１２日目のpHyg-AE１導入細胞（４株）の抗グリピカン-3抗体産生量は、pHyg導入細胞（４株）に対して優位であった（ｔ検定 Ｐ＜０．０５, 図８）。
　次に、pHyg-AE１導入細胞４株中で最も抗体高産生であったAE1発現株を親株として、Puromycin耐性遺伝子を含むシステインスルフィン酸デカルボキシラーゼ(CSAD)発現プラスミドpPur-CSAD（WO2008/114673の実施例２、図７）, Puromycin耐性遺伝子を含むアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT1)発現プラスミド pPur-ALT1（WO2009/020144の実施例２、図１）, コントロールプラスミドpPur（Clontech社のpPUR (a puromycin resistance expression vector)）をエレクトロポレーション法で導入した。Puromycin(6μg/ml) 存在下、静置培養下で高増殖であった細胞株を拡大したのち、Total RNAを調製し、新たに導入された遺伝子を高発現していたAE1/CSAD共発現株（９株）、AE1/ALT1共発現株（１０株）、AE1/pPur共発現株（８株）を選抜し、抗体産生量および生存率の比較をおこなった。初発密度２ｘ１０５cells/mLの５０ｍlシェーカーフラスコによる流加培養において、AE1/CSAD共発現株（９株）はコントロールのAE1/pPur共発現株（８株）に対して、シェーカー培養後期１０日目の抗グリピカン-3抗体産生量（ｔ検定 Ｐ＜０．０５, 図９）、生存率（ｔ検定 Ｐ＜０．０１, 図１０）ともに優位であった。３種類の共発現株中、抗グリピカン-3抗体産生量の最も高かった細胞株はAE1/ALT1共発現株（１０株）であり、シェーカー流加培養８日目でコントロールのAE1/pPur共発現株（８株）に対して優位であった（ｔ検定 Ｐ＜０．０１, 図１１）。そこで、AE1/ALT1共発現株（１０株）中、シェーカー流加培養検討において最も抗体高産生、且つ、ALT1 mRNAを高発現していたAA53 (1497mg/L/8days)を初発１０ｘ１０５cells/mLで１Lジャー流加培養をおこなうと、培養７日目で1.9g /L /7day と短期培養で抗体高産生であった（図１２）。培養２１日目で5.3g/LであったTauT/ALT1発現株TA41（WO2009/020144の実施例２）は、培養７日目で1.5 g/Lであることから、AA53はTA41以上に短期に抗体を高産生できるポテンシャルを有しており、実生産に適していると考えられる。
　以上の結果は、アニオンエクスチェンジャー（AE1）を人為的に強発現させることによって、また、AE1とCSAD又はALT1を同時に強発現させることにより、抗体を高産生する細胞が得られることを示す。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
　本発明は、タンパク質の生産に利用することができる。
＜配列番号１＞
配列番号１は、ヒトAE1をコードする遺伝子の塩基配列（GenBank M27819）を示す。
＜配列番号２＞
配列番号２は、ヒトAE1のアミノ酸配列（UniProtKB/Swiss-Prot P02730）を示す。
＜配列番号３＞
配列番号３は、ヒトALT1をコードする遺伝子の塩基配列（KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (human): 2875）を示す。
＜配列番号４＞
配列番号４は、ヒトALT1のアミノ酸配列（KEGG / ENZYME:
2.6.1.2 / Homo sapiens (human): 2875）を示す。
＜配列番号５＞
配列番号５は、Kozak配列を示す。
＜配列番号６＞
配列番号６は、分泌シグナルペプチド配列を示す。
特公平６－３０５８８号公報

Claims (16)

  1. Bicarbonateトランスポーターを強発現し、且つ所望のポリペプチドをコードするDNAが導入された細胞を高濃度メトトレキセートの存在下で培養し、生存する細胞から所望のポリペプチドを高産生する細胞を選択することを含む、所望のポリペプチドを高産生する細胞の作製方法。
  2. Bicarbonateトランスポーターを強発現し、且つ所望のポリペプチドをコードするDNAが導入された細胞が、さらにジヒドロ葉酸還元酵素をコードするDNAが導入されている細胞である請求項１記載の方法。
  3. Bicarbonateトランスポーターを強発現し、且つ所望のポリペプチドをコードするDNAが導入された細胞が、所望のポリペプチドをコードするDNAとジヒドロ葉酸還元酵素をコードするDNAとを含む1つの分子によって共形質転換された細胞である請求項２記載の方法。
  4. 所望のポリペプチドをコードするDNAとジヒドロ葉酸還元酵素をコードするDNAとを含む1つの分子が、ベクターである請求項３記載の方法。
  5. Bicarbonateトランスポーターを強発現する細胞がさらにアラニンアミノトランスフェラーゼを強発現する請求項１乃至４記載の方法。
  6. 請求項１乃至５記載の方法により作製された細胞。
  7. 請求項６記載の細胞を培養することを含む、所望のポリペプチドの製造方法。
  8. 所望のポリペプチドが、抗体である請求項７記載の製造方法。
  9. 請求項７乃至８記載の方法で製造されたポリペプチドを含有する医薬品を製造する方法。
  10. Bicarbonateトランスポーターを強発現し、且つ所望のポリペプチドをコードするDNAが導入された細胞を高濃度メトトレキセートで処理することにより、該細胞によるポリペプチド産生量を増強する方法。
  11. Bicarbonateトランスポーターを強発現し、且つ所望のポリペプチドをコードするDNAが導入された細胞が、さらにジヒドロ葉酸還元酵素をコードするDNAが導入されている細胞である請求項１０記載の方法。
  12. Bicarbonateトランスポーターを強発現し、且つ所望のポリペプチドをコードするDNAが導入された細胞が、所望のポリペプチドをコードするDNAとジヒドロ葉酸還元酵素をコードするDNAとを含む1つの分子によって共形質転換された細胞である請求項１１記載の方法。
  13. Bicarbonateトランスポーターを強発現する細胞がさらにアラニンアミノトランスフェラーゼを強発現する請求項１０乃至１２記載の方法。
  14. 細胞にBicarbonateトランスポーターを強発現させることを含む、高濃度メトトレキセートの存在下での培養において、高い生存率を有する細胞の作製方法。
  15. Bicarbonateトランスポーターを強発現し、且つ所望のポリペプチドをコードするDNAが導入された細胞をメトトレキセートの存在下で培養し、生存する細胞から所望のポリペプチドを高産生する細胞を選択することを含む、所望のポリペプチドを高産生する細胞の作製方法。
  16. Bicarbonateトランスポーターを強発現し、且つ所望のポリペプチドをコードするDNAが導入された細胞をメトトレキセートで処理することにより、該細胞によるポリペプチド産生量を増強する方法。
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WO (1) WO2010123014A1 (ja)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2649148C (en) 2006-04-13 2016-08-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Taurine transporter gene
US20100233759A1 (en) 2007-03-15 2010-09-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for production of polypeptide
WO2009020144A1 (ja) * 2007-08-07 2009-02-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 異種タンパク質の製造方法
JP5337043B2 (ja) * 2007-10-15 2013-11-06 中外製薬株式会社 異種タンパク質を高生産する細胞の作製方法
CA2703493C (en) * 2007-10-24 2016-11-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha A cell for use in production of heteroproteins and production method using the same

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0630588B2 (ja) 1980-02-25 1994-04-27 アクセル，リチヤ−ド 外来ｄｎａ分子の増幅を惹き起こす方法
WO1994012650A2 (en) 1992-12-03 1994-06-09 Transkaryotic Therapies, Inc. Activating expression of an amplifying endogenous gene by homologous recombination
WO2006006693A1 (ja) 2004-07-09 2006-01-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗グリピカン３抗体
WO2008114673A1 (ja) 2007-03-15 2008-09-25 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha ポリペプチドの製造方法
WO2009020144A1 (ja) 2007-08-07 2009-02-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 異種タンパク質の製造方法
WO2009051109A1 (ja) * 2007-10-15 2009-04-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 異種タンパク質を高生産する細胞の作製方法
WO2009054433A1 (ja) * 2007-10-24 2009-04-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 異種タンパク質製造のための細胞及びそれを用いた製造方法
JP2009103596A (ja) 2007-10-24 2009-05-14 Shimadzu Corp 材料試験機

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9019812D0 (en) 1990-09-11 1990-10-24 Scotgen Ltd Novel antibodies for treatment and prevention of infection in animals and man
US6225115B1 (en) 1992-03-04 2001-05-01 Synaptic Pharmaceutical Corporation DNA encoding taurine and GABA transporters and uses thereof
JPH07507446A (ja) 1992-03-04 1995-08-24 シナプティック・ファーマスーティカル・コーポレーション タウリン及びｇａｂａの輸送体をコードするｄｎａ並びにその使用
AU695117B2 (en) 1994-10-06 1998-08-06 Hoechst Aktiengesellschaft Regulated genes by stimulation of chondrocytes with IL-1beta
JPH09203734A (ja) 1996-01-26 1997-08-05 Sumitomo Electric Ind Ltd 抗血清、抗体、リガンド及びそれらの検出方法
JPH1075787A (ja) 1996-09-02 1998-03-24 Asahi Chem Ind Co Ltd 変異型アラニンアミノトランスフェラーゼおよびその製造法
JPH10191984A (ja) 1997-01-09 1998-07-28 Oriental Yeast Co Ltd 活性型ヒトａｌｔの製造法
DE19855313A1 (de) 1998-12-01 2000-06-08 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure durch Verstärkung des panD-Gens in Mikroorganismen
ATE363074T1 (de) 1999-09-14 2007-06-15 Xenoport Inc Substrate und screeningverfahren für transportproteine
US6812339B1 (en) 2000-09-08 2004-11-02 Applera Corporation Polymorphisms in known genes associated with human disease, methods of detection and uses thereof
AU2002308701A1 (en) 2001-05-14 2002-11-25 University Of Maryland, Baltimore Novel alanine transaminase enzyme and methods of use
CA2466034C (en) 2001-11-08 2012-12-18 Protein Design Labs, Inc. Stable aqueous pharmaceutical formulations of daclizumab antibodies
ES2329778T3 (es) 2002-01-18 2009-12-01 Novozymes A/S 2,3-aminomutasa de alanina.
IL152905A0 (en) 2002-11-17 2003-06-24 Univ Ramot Dopaminergic markers induction in neuronal-like cells isolated from adult human bone marrow stromal cells: implications for novel gene therapy strategy for parkinsons disease
US20050265983A1 (en) 2002-11-17 2005-12-01 Eldad Melamed Methods, nucleic acid constructs and cells for treating neurodegenerative disorders
US20030165495A1 (en) 2003-04-01 2003-09-04 Carulli John P. Nucleic acids and polypeptides
WO2005076015A1 (en) 2004-01-30 2005-08-18 Xenoport, Inc. Taurine transporter tau1 expressed in blood brain barrier cells
KR100789645B1 (ko) 2004-04-14 2007-12-27 주식회사유한양행 Ｂ형 간염바이러스의 ｓ-표면항원을 인식하는 인간화 항체및 이의 제조방법
CA2522152A1 (en) 2004-10-07 2006-04-07 Kabushiki Kaisha Sangi Transdermal and transmucosal preparations
PE20061324A1 (es) 2005-04-29 2007-01-15 Centocor Inc Anticuerpos anti-il-6, composiciones, metodos y usos
US20070207152A1 (en) 2005-11-09 2007-09-06 Brophy Susan E Human BNP immunospecific antibodies
CN101378651B (zh) 2005-12-23 2012-03-14 阿凯迪亚生物科学公司 氮源高效利用的单子叶植物
CA2649148C (en) 2006-04-13 2016-08-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Taurine transporter gene

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0630588B2 (ja) 1980-02-25 1994-04-27 アクセル，リチヤ−ド 外来ｄｎａ分子の増幅を惹き起こす方法
WO1994012650A2 (en) 1992-12-03 1994-06-09 Transkaryotic Therapies, Inc. Activating expression of an amplifying endogenous gene by homologous recombination
WO2006006693A1 (ja) 2004-07-09 2006-01-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗グリピカン３抗体
WO2008114673A1 (ja) 2007-03-15 2008-09-25 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha ポリペプチドの製造方法
WO2009020144A1 (ja) 2007-08-07 2009-02-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 異種タンパク質の製造方法
WO2009051109A1 (ja) * 2007-10-15 2009-04-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 異種タンパク質を高生産する細胞の作製方法
WO2009054433A1 (ja) * 2007-10-24 2009-04-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 異種タンパク質製造のための細胞及びそれを用いた製造方法
JP2009103596A (ja) 2007-10-24 2009-05-14 Shimadzu Corp 材料試験機

Non-Patent Citations (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALTSCHUI ET AL., J. MOL. BIOL., vol. 215, 1990, pages 403 - 410
ALTSCHUL ET AL., J. MOL. BIOL., vol. 215, 1990, pages 403 - 410
BELYAVSKY, A. ET AL., NUCLEIC ACIDS RES., vol. 17, 1989, pages 2919 - 2932
BETTER ET AL., SCIENCE, vol. 240, 1988, pages 1041 - 1043
CHIRGWIN, J. M. ET AL., BIOCHEMISTRY, vol. 18, 1979, pages 5294 - 5299
CHOMCZYNSKI, P., SACCHI, N., ANAL. BIOCHEM., vol. 162, 1987, pages 156 - 159
DAHL NK., J BIOL CHEM, vol. 278, 2003, pages 44949 - 44958
DALBADIE-MCFARLAND, G. ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 79, 1982, pages 6409 - 6413
FASEB J., vol. 6, 1992, pages 2422 - 2427
FROHMAN, M. A. ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 85, 1988, pages 8998 - 9002
FUJMAGA J., J BIOL CHEM, vol. 274, 1999, pages 6626 - 6633
GRANTHAM, R. ET AL., NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 9, 1981, pages 43 - 74
GUO-HUI FU: "Direct interaction and cooperative role of tumor suppressor p16 with band 3 (AE1)", FEBS LETT., vol. 579, no. ISS.10, 2005, pages 2105 - 2110 *
HASHIMOTO-GOTOH, T. ET AL., GENE, vol. 152, 1995, pages 271 - 275
HOPP, T. P. ET AL., BIOTECHNOLOGY, vol. 6, 1988, pages 1204 - 1210
KARLIN, ALTSCHUL, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 90, 1993, pages 5873 - 5877
KRAMER W, FRITZ HJ, METHODS. ENZYMOL., vol. 154, 1987, pages 350 - 367
KRAMER, W. ET AL., NUCLEIC ACIDS RES., vol. 12, 1984, pages 9441 - 9456
KUNKEL, METHODS ENZYMOL, vol. 85, 1988, pages 2763 - 2766
KUNKEL, METHODS ENZYMOL., vol. 85, 1988, pages 2763 - 2766
KUNKEL, TA, PROC NATI ACAD SCI USA, vol. 82, 1985, pages 488 - 492
KUNKEL, TA, PROC NATL ACAD SCI USA., vol. 82, 1985, pages 488 - 492
LEI, S. P. ET AL., J. BACTERIOL., vol. 169, 1987, pages 4379
MARK, D. F. ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 81, 1984, pages 5662 - 5666
MIZUSHIMA ET AL., NUCLEIC ACIDS RES., vol. 18, 1990, pages 5322
MULLIGAN ET AL., NATURE, vol. 277, 1979, pages 108
NUCLEIC ACIDS. RES., vol. 18, no. 17, 1990, pages 5322
RAJAMOHAN F., PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION, vol. 48, 2006, pages 81 - 89
SAMBROOK, J ET AL.: "Molecular Cloning", 1989, COLD SPRING HARBOR LAB. PRESS, pages: 9.47 - 9.58
SAMBROOK, J. ET AL.: "Molecular Cloning", 1989, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
SETH L. ALPER, EXO PHYSIOL, vol. 91.1, 2006, pages 153 - 161
WANG, A. ET AL., SCIENCE, vol. 224, pages 1431 - 1433
WARD ET AL., NATURE, vol. 341, 1989, pages 544 - 546
WILBUR, W. J., LIPMAN, D. J., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 80, 1983, pages 726 - 730
ZOLLER, M. J., SMITH, M., NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 10, 1982, pages 6487 - 6500
ZOLLER, MJ, SMITH, M., METHODS ENZYMOL., vol. 100, 1983, pages 468 - 500

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