WO2010119144A2 - Procedimiento para la síntesis de fragmentos coleados de dna monocatenario a partir de un vector de expresión y un primer universal, y su uso en hibridación in situ - Google Patents

Procedimiento para la síntesis de fragmentos coleados de dna monocatenario a partir de un vector de expresión y un primer universal, y su uso en hibridación in situ Download PDF

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    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes

Definitions

  • the present invention falls within the field of synthesis of single stranded DNA fragments and their applications.
  • the hybridization technique consists in obtaining or manufacturing a nucleic acid chain of a certain length that is complementary to the sequence to be studied, either DNA or RNA.
  • the two chains hybridize by means of the law of base pairs of Watson and Crick, that is to say, that both the target chain and the manufactured chain or "probe" have to be single-stranded.
  • RNA Ribonucleic acid
  • ssDNA single-stranded DNA probes
  • Kitazawa In situ hybridization with polymerase chain reaction-derived single-stranded DNA tested and Sl nuclease. Histochemistry CeIl Biology, 1998, VoI
  • dsDNA double stranded template DNA fragment
  • PCR is fed by a single specific primer that directs the unidirectional amplification of a single strand of the amplified template DNA.
  • the use in this second stage of labeled deoxynucleotides allows obtaining ssDNA hybridization probes that can be used for in situ detection of specific mRNA in biological tissue samples maintained in paraffin.
  • the most widespread system for the conservation of tissue cultures is to keep them in paraffin. But this system raises the problem that it destroys most of the nucleic acids; The mRNA is reduced to an approximate amount of one tenth and is usually also deteriorated. This makes hybridization difficult by means of probes and prevents them from being more resolvable.
  • the present invention provides a solution to signal enhancement using chromatic probes for the detection of mRNA sequences.
  • the present invention relates to a method for the synthesis of single-stranded DNA fragments labeled with a hapten, obtained with asymmetric PCR using a universal primer.
  • This primer recognizes a neighbor plasmid sequence to an insert and makes its use "in situ" feasible as a probe on formalin-fixed and paraffin-embedded tissues.
  • the present invention relates to a method for the synthesis of single-stranded DNA probes, characterized in that it comprises:
  • the expression vector of step 1 is the plasmid PG&T.
  • the insert is located between the T7F and SP6R sequences of the plasmid.
  • the primers of step 2 are two oligos complementary to said T7F and SP6R sequences.
  • dsDNA double stranded DNA
  • Said dsDNA comprises the problem sequence together with an additional nucleotide sequence that originally corresponds to the vector.
  • the product of this first amplification serves as a template for a second PCR amplification.
  • said second amplification is an asymmetric PCR in which only one of the primers used in the previous amplification is used.
  • labeled nucleotides are introduced into the second PCR.
  • the labeled nucleotide is deoxyuridine (dUTP).
  • dUTP deoxyuridine
  • it is labeled with a hapten.
  • the hapten is selected from digoxigenin, biotin or fluorescein.
  • dUTP labeled with digoxigenin is introduced into the second amplification.
  • the result of this second asymmetric amplification is a single-stranded DNA that contains the test sequence together with a tail of the plasmid's own sequence.
  • That sequence tail is not hybridizing but it is labeled with uridine nucleotides as is the whole product of this amplification, so that it acts as a signal enhancer that hybridizes.
  • the labeled DNA fragments are used as a probe for the detection of gene expression; "probe” is understood as a DNA fragment used to detect and identify corresponding sequences in nucleic acids by selective hybridization with them.
  • probe is understood as a DNA fragment used to detect and identify corresponding sequences in nucleic acids by selective hybridization with them.
  • the present invention also relates to a single stranded DNA probe obtained by the described procedure.
  • said single-stranded DNA probe recognizes mRNA that is expressed in a target cell, as set forth in the "State of the Art" of the present description.
  • the present invention relates to the use of the previously defined single-stranded DNA probe in a method for the detection of gene expression by in situ hybridization.
  • said hybridization is performed on tissue sections fixed in formalin and included in paraffin.
  • said method for in situ hybridization uses as a PBS buffer at pH 7.4.
  • this process is characterized in that it also employs a hybridization buffer with the following composition: - 0.1 - 1% by weight / volume of salmon sperm DNA.
  • single-stranded DNA probes prepared according to this procedure are lyophilized for commercialization.
  • the described method eliminates unnecessary steps established in the state of the art. For example, washing with formamide and the use of saline sodium treatment, which has been shown to produce tissue background. Thus, only PBS at pH 7.4 is used as liquid support throughout the entire procedure.
  • the in situ hybridization process is simple and fast and with high specificity; it enhances the signal of the hybridized fragments, and an incubation of 1 hour is sufficient for the probe to hybridize with the mRNA present in the tissue sample.
  • the total time estimate from tissue dewaxing to visualization by the optical microscope does not exceed 3 hours.
  • the method uses a universal oligo that hybridizes with the plasmid polilinker and that can be used to clone any sequence in the insert; which standardizes the conditions of the experiment and the efficiency of the results.
  • Figure 1 The scheme shows the ringing position of the oligos and the sequences of the regions that flank the cloned fragment of interest.
  • Figure 2 Numerous erythroid islets are seen stained in brown. Bone marrow. Histosonda Hemoglobin. 10Ox.
  • Figure 3 Erythroid cells show intense cytoplasmic staining in brown.
  • SEQ ID NO: 1 (which will be the fragment to be used to generate the histosonde) is immortalized, it will be amplified by PCR using two oligos that flank the cloned region. These oligos are called SP6R and T7F according to the genes with which they hybridize. They correspond to SEQ ID NO: 2 (SP6R) and SEQ ID NO: 3 (T7F).
  • the amplification of the fragment of interest is carried out under the following conditions:
  • 1OX Buffer [500 mM Tris / HCl, 100 mM KCl, 5OmM (NH 4 ) 2 SO 4 , pH 8.3 / 25 ° C] lO ⁇ l, MgCl 2 (25 mM) 6 ⁇ l, oligo SP6R 0.2 ⁇ g, oligo T7F 0 , 2 ⁇ g, dNTPs Mix (1OmM) l ⁇ l, Taq DNA Polymerase (5U / ⁇ l) 0.4 ⁇ l, DNA plasmiprep mold 3 ⁇ l (200ng-400ng) and water 77.6 ⁇ l adding a final volume of lOO ⁇ l.
  • the time at which the sample will be kept at 72 ° C during the cycles may vary depending on the size of the fragment to be amplified (approximately 1 min. Per Kb of template DNA).
  • the result of this process is to obtain template DNA for the second PCR.
  • an agarose gel electrophoresis will be performed with a variable percentage (0.8% - 3% w / v) depending on the size of the amplified fragment, to verify that the amplified fragment is the correct size.
  • the electrophoresis is carried out in buffer 0.5E TBE (v / v) or TAE IX (v / v) at a voltage that ranges between 6OV and 180V until obtaining a separation of the bands that allows the verification of its size.
  • the next step will be the fabrication of the probe that will be developed under the following conditions:
  • the final volume will be lOO ⁇ l. If it is necessary to generate more volume the appropriate multiples of the components will be made to obtain the desired final volume. Once the mixture is done, it will be subjected to the following cycle:
  • the final product obtained is histosonde, a single-stranded DNA labeled with dUTP plus a hapten, which is complementary to an RNA fragment of interest.

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Abstract

El objeto de la presente invención refiere a un procedimiento para la obtención de sondas de DNA monocatenario según un primer paso de amplificación por PCR del fragmento escogido, seguido de su clonación en un vector de expresión. Una vez obtenido el vector puede almacenarse en una bacteria hospedadora. A partir del vector se amplifica el inserto utilizando dos cebadores complementarios a los genes del propio vector que lo flanquean. Esta PCR produce un segmento de dsDNA que contiene el inserto flanqueado a ambos extremos por secuencias adicionales de la longitud deseada. Empleando este producto como molde se realiza una segunda PCR empleando uno solo de los cebadores anteriores y oligonucleótidos marcados. Como resultado se obtienen sondas de DNA monocatenario con una cola en cada extremo; esta cola no será capaz de hibridar con la secuencia diana pero sí permitirá una mayor señal al aumentar la cantidad total de nucleótidos marcados.

Description

PROCEDIMIENTO PARA LA SÍNTESIS DE FRAGMENTOS COLEADOS DE DNA MONOCATENARIO A PARTIR DE UN VECTOR DE EXPRESIÓN Y UN PRIMER UNIVERSAL, Y SU USO EN HIBRIDACIÓN in situ.
CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se engloba dentro del campo de la síntesis de fragmentos de DNA monocatenario y sus aplicaciones.
ESTADO DE LA TÉCNICA Desde los primeros experimentos de hibridación (Pardue ML and GaIl JG.
Proc.Natl.Acad.Sci USA 64: 600-604 [1969]) se observó que la hibridación in situ era una de las técnicas que más harían avanzar el conocimiento científico de todas las ciencias biológicas.
Mediante esta técnica se puede conseguir visualizar la presencia de genes y secuencias sobre el DNA tanto en cromosomas extendidos como durante la interfase. También mediante esta técnica es posible visualizar los genes que se expresan en una célula determinada y durante una fase concreta de su ciclo biológico; lo cual establece una ventaja sobre las técnicas de procesamiento de "arrays" de nucleótidos ya que éstas no permiten determinar con exactitud qué genes del cultivo expresan en cada momento. La técnica de hibridación consiste en la obtención o fabricación de una cadena de ácido nucleico de determinada longitud que sea complementaria a la secuencia que se desea estudiar, bien sea DNA o RNA.
Las dos cadenas hibridan mediante la ley de pares de bases de Watson y Crick, es decir, que tanto la cadena diana como la cadena fabricada o "sonda" tienen que ser monocatenarias.
El ácido ribonucleico (RNA) en condiciones habituales se encuentra en forma monocatenaria. Existen diversas técnicas para la fabricación de sondas de RNA (Sambrook and Russell. Molecular Cloning, vol 2:9.29. 3a Edición. CSHL PRESS), aunque la tecnología es compleja, consume tiempo y el rendimiento en cuanto a cantidad no es muy alto. En cuanto a la producción de sondas de DNA monocatenario (ssDNA), varios autores han reportado el sistema utilizado en el presente estudio y que permite obtener la mayor eficiencia en el estado actual de la técnica.
Kitazawa (In situ hybridization with polymerase chain reaction-derived single-stranded DNA probé and Sl nuclease. Histochemistry CeIl Biology, 1998, VoI
111), describe una preparación del fragmento de DNA molde de doble cadena (dsDNA) a partir de una reacción de PCR convencional seguida de otra PCR lineal. Esta segunda
PCR está alimentada por un único cebador específico que dirige la amplificación unidireccional de una sola de las hebras del DNA molde amplificado. El uso en esta segunda etapa de desoxinucleótidos marcados (digoxigenina-11-dUTP) permite la obtención de sondas de hibridación ssDNA que pueden ser utilizadas para la detección in situ de mRNA específico en muestras de tejidos biológicos mantenidos en parafina.
Antes, Konat G.W. ("Generation of high efficiency ssDNA hybridization probes by linear polymerase chain reaction. Scannning Micros. Suppl., 1996, VoI.10), ya había puesto a punto el método de obtención de sondas con nucleótidos marcados con radiactividad o con digoxigenina (dig-11-dUTP) para poder ser utilizadas en muestras de tejidos biológicos.
An S.F. et al. ("Generation of digoxigenin-labelled double-stranded and single-stranded probes using the polymerase chain reaction", Mol. CeIl. Probes, 1992, VoI. 6. Nr. 3), obtiene sondas específicas marcadas con biotina o digoxigenina para hibridar con el virus de la hepatitis B (HBV), y su utilización en tejido de biopsia hepática.
El procedimiento había sido originalmente descrito por Finchk U. et al. ("Producing single-stranded DNA probes with the Taq DNA polymerase: a high yield protocol". Biotechniques, 1991, VoI. 10, No 1), en el que documentan el método de la doble PCR y el mareaje de la segunda con biotina- 11-dUTP y biotina-21-dUTP.
El sistema más extendido para la conservación de cultivos de tejidos es mantenerlos en parafina. Pero este sistema plantea el problema de que destruye la mayor parte de los ácidos nucleicos; el mRNA queda reducido a una cantidad aproximada de la décima parte y suele estar además deteriorado. Esto dificulta la hibridación mediante sondas e impide que éstas puedan ser más resolutivas. La presente invención aporta una solución a la potenciación de señal utilizando sondas cromáticas para la detección de secuencias de mRNA.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención trata de un procedimiento para la síntesis de fragmentos coleados de DNA monocatenario marcados con un hapteno, obtenidos con PCR asimétrica utilizando un cebador universal. Este cebador reconoce una secuencia plasmídica vecina a un inserto y hace factible su utilización "in situ" como sonda sobre tejidos fijados en formol e incluidos en parafina. Así, la presente invención se refiere a un procedimiento para la síntesis de sondas coleadas de DNA monocatenario, caracterizado porque comprende:
1. la inserción de un fragmento de DNA, obtenido por técnica de PCR y réplica de una secuencia diana, en un vector de expresión y su almacenamiento en una bacteria hospedadora, 2. la amplificación por PCR del fragmento de DNA almacenado según el paso anterior usando cebadores propios del vector,
3. la amplificación del fragmento obtenido en el paso anterior en una segunda PCR asimétrica que utiliza un único cebador descrito en el paso 2 y oligonucleótidos marcados.
En una realización concreta de la invención, el vector de expresión del paso 1 es el plásmido PG&T. En una realización preferida de la invención, el inserto se sitúa entre las secuencias T7F y SP6R del plásmido. En una realización más preferida de la invención, los cebadores del paso 2 son dos oligos complementarios a dichas secuencias T7F y SP6R.
Tras la amplificación del fragmento comprendido entre los dos cebadores según el paso 2 se obtiene un DNA de doble cadena (dsDNA). Dicho dsDNA comprende la secuencia problema junto con una secuencia adicional de nucleótidos que corresponde originalmente al vector. En una realización concreta de la invención, el producto de esta primera amplificación sirve de molde para una segunda amplificación por PCR. En una realización preferida de la invención, dicha segunda amplificación es una PCR asimétrica en la que sólo se utiliza uno de los cebadores utilizados en la amplificación anterior.
En una realización concreta de la invención, en la segunda PCR se introducen nucleótidos marcados. En otra realización concreta, el nucleótido marcado es la desoxiuridina (dUTP). En una realización concreta de la invención, se marca con un hapteno. En otra realización concreta el hapteno está seleccionado entre digoxigenina, biotina o fluoresceína.
En una realización preferente de la invención, en la segunda amplificación se introduce dUTP marcada con digoxigenina.
El resultado de esa segunda amplificación asimétrica es un DNA monocatenario que contiene la secuencia problema junto con una cola de secuencia propia del plásmido.
Esa cola de secuencia no es hibridante pero sí está marcada con nucleótidos de uridina como lo está todo el producto de esta amplificación, de forma que actúa como potenciadora de la señal de la secuencia que híbrida.
En una realización preferente de la invención, los fragmentos de DNA marcados se utilizan como sonda para la detección de expresión génica; entendiéndose como "sonda" un fragmento de DNA empleado para detectar e identificar secuencias correspondientes en ácidos nucleicos mediante su hibridación selectiva con ellas. Así, la presente invención se refiere también a una sonda de DNA monocatenario obtenida por el procedimiento descrito. En una realización concreta de la presente invención, dicha sonda de DNA monocatenario reconoce mRNA que se expresa en una célula diana, tal como se enuncia en el "Estado de la Técnica" de la presente descripción.
En un aspecto concreto, la presente invención se refiere al uso de la sonda de DNA monocatenario previamente definida en un método para la detección de la expresión génica mediante hibridación in situ. En una realización preferente, dicha hibridación se realiza sobre cortes de tejidos fijados en formol e incluidos en parafina. En una realización concreta de la invención, dicho método para la hibridación in situ emplea como tampón PBS a pH 7,4. En una realización preferente, este procedimiento está caracterizado porque además emplea un tampón de hibridación con la siguiente composición: - 0, 1 - 1 % en peso/volumen de DNA de esperma de salmón.
- tampón PBS a pH 7,4.
En una realización concreta de la invención, las sondas de DNA monocatenario preparadas según este procedimiento se liofilizan para su comercialización.
Este sistema de hibridación in situ mediante el uso de sondas de DNA monocatenario obtenidas por el procedimiento descrito resulta ventajoso frente al estado de la técnica por funcionar especialmente bien en tejidos fijados en formol e incluidos en parafina. Resuelve el problema de la destrucción de la gran parte del RNA presente descrito en "Estado de la Técnica". En este sentido, una evolución preferida de la presente invención consiste en la posibilidad de hibridar entre sí las colas marcadas de las sondas.
El método descrito elimina pasos innecesarios establecidos en el estado de la técnica. Por ejemplo, los lavados con formamida y el uso de ci trato sódico salino, que se ha comprobado que produce fondo tisular. Así, sólo se utiliza PBS a pH 7,4 como soporte líquido a lo largo de todo el procedimiento.
De este modo, el proceso de hibridación in situ resulta sencillo y rápido y con alta especificidad; potencia la señal de los fragmentos hibridados, y una incubación de 1 hora es suficiente para que la sonda hibride con el mRNA presente en la muestra de tejido. La estimación de tiempo total desde la desparafinación del tejido hasta su visualización por el microscopio óptico no excede de las 3 horas.
Asimismo, el método utiliza un oligo universal que híbrida con el polilinker del plásmido y que se puede utilizar para clonar cualquier secuencia en el inserto; lo cual estandariza las condiciones del experimento y la eficiencia de los resultados.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1: En el esquema se muestra la posición de anillamiento de los oligos y las secuencias de las regiones que flanquean al fragmento clonado de interés. Figura 2: Numerosos islotes eritroides se observan teñidos en marrón. Médula ósea. Histosonda Hemoglobina. 10Ox. Figura 3: Las células eritroides muestran una intensa tinción citoplasmática en marrón.
Histosonda Hemoglobina. 40Ox. MODO DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN
EJEMPLO 1 Para el diseño y síntesis de una sonda según la invención se llevan a cabo los pasos que se detallan a continuación.
Una vez inmortalizado el fragmento de interés SEQ ID NO: 1 (que será el fragmento que se utilizará para generar la histosonda) se amplificará mediante PCR utilizando dos oligos que flanquean la región clonada. Estos oligos se denominan SP6R y T7F de acuerdo a los genes con los que hibridan. Corresponden a la SEQ ID NO: 2 (SP6R) y SEQ ID NO: 3 (T7F).
La amplificación del fragmento de interés (PCR molde) se lleva a cabo en las siguientes condiciones:
Buffer 1OX [500 mM Tris/HCl, 100 mM KCl, 5OmM (NH4)2SO4, pH 8,3/25°C] lOμl, MgCl2 (25 mM) 6μl, oligo SP6R 0,2μg, oligo T7F 0,2μg, dNTPs Mix (1OmM) lμl, Taq DNA Polimerasa (5U/μl) 0,4μl, DNA plasmiprep molde 3μl (200ng-400ng) y agua 77,6 μl sumando todo un volumen final de lOOμl.
Figure imgf000008_0001
Figure imgf000009_0002
Para generar mas volumen de PCR molde únicamente se deberá multiplicar cada componente de manera proporcionada en función del volumen final deseado que se quiera obtener.
Una vez realizada la mezcla, se somete al siguiente ciclo en el termociclador:
95°C 10 min.
40 ciclos
Figure imgf000009_0001
72°C 2 min.
El tiempo al que se mantendrá la muestra a 72°C durante los ciclos podrá variar en función del tamaño del fragmento que se va ha amplificar (aproximadamente 1 min. por Kb de DNA molde).
El resultado de este proceso es obtener DNA molde para la segunda PCR.
Una vez finalizado el proceso se hará una electroforesis en un gel de agarosa con porcentaje variable (0,8% - 3% p/v) en función del tamaño del fragmento amplificado, para comprobar que el fragmento amplificado es del tamaño correcto. La electroforesis se lleva a cabo en tampón TBE 0,5X (v/v) o TAE IX (v/v) a un voltaje que oscila entre 6OV y 180V hasta obtener una separación de las bandas que permita la comprobación de su tamaño. Una vez comprobado, el siguiente paso será la fabricación de la sonda que se desarrollará en las siguientes condiciones:
Figure imgf000010_0001
El volumen final será de lOOμl. Si es necesario generar más volumen se harán los múltiplos apropiados de los componentes para obtener el volumen final deseado. Una vez realizada la mezcla se someterá al siguiente ciclo:
95°C 5 min. 950C 1 min. 52°C 2 min. -60 ciclos 72°C 2 min 72°C 2 min.
El producto final obtenido es la histosonda, un DNA monocatenario marcado con dUTP más un hapteno, que es complementaria a un fragmento de RNA de interés.
Todo lo que se ha descrito hasta ahora sería llevado a cabo para la generación de histosondas siempre que el fragmento de interés clonado se inserte en el plásmido de clonación en la dirección 5' a 3'; pero puede suceder que el fragmento se inserte en dirección contraria por lo que se llevara a cabo todo el proceso de la misma manera excepto para la generación de la sonda, que será necesario el oligo T7F.

Claims

REIVINDICACIONES
1.- Un procedimiento para la síntesis de sondas coleadas de DNA monocatenario caracterizado porque comprende: 1. la inserción de un fragmento de DNA, obtenido por técnica de PCR y réplica de una secuencia diana, en un vector de expresión y su almacenamiento en una bacteria hospedadora, 2. la amplificación por PCR del fragmento de DNA almacenado según el paso anterior usando cebadores propios del vector, y 3. la amplificación del fragmento obtenido en el paso anterior en una segunda
PCR asimétrica que utiliza un único cebador descrito en el paso 2 y oligonucleótidos marcados.
2. Un procedimiento para la síntesis de fragmentos de DNA monocatenario según la reivindicación 1 , caracterizado porque el vector de expresión empleado corresponde al plásmido PG&T.
3. Un procedimiento para la síntesis de fragmentos de DNA monocatenario según las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque los cebadores que se utilizan en el vector de expresión son oligos complementarios a los genes T7F y SP6R.
4. Un procedimiento para la síntesis de fragmentos de DNA monocatenario según la reivindicación 1, caracterizado porque el oligonucleótido del paso 3 contiene desoxiuridina (dUTP) marcada.
5. Un procedimiento para la síntesis de fragmentos de DNA monocatenario según las reivindicaciones 1 y 4, caracterizado porque dicho desoxinucleótido se encuentra marcado con un hapteno.
6. Un procedimiento para la síntesis de fragmentos de DNA monocatenario según la reivindicación 5 porque dicho hapteno está seleccionado entre digoxigenina, biotina o fluoresceína.
7. Un fragmento de DNA monocatenario caracterizado porque se obtiene por el procedimiento descrito en una de las reivindicaciones 1 a 6.
8. Un fragmento de DNA monocatenario según la reivindicación 7, caracterizado porque contiene una cola de nucleótidos no hibridante.
9. Un fragmento de DNA monocatenario según la reivindicación 8, caracterizado porque contiene una cola de nucleótidos no hibridante marcada.
10. Uso de un fragmento de DNA monocatenario descrito en una de las reivindicaciones 7 a 9, como sonda para la detección de expresión génica.
11. Una sonda de DNA monocatenario obtenida por el procedimiento descrito en las reivindicaciones 1 a 10.
12. Uso de una sonda definida en la reivindicación 11 en un método para la detección de la expresión génica mediante hibridación in situ.
13. Uso de una sonda según la reivindicación 12, caracterizado porque dicha hibridación se realiza sobre cortes de tejidos fijados en formol e incluidos en parafina.
14. Uso de una sonda según una de las reivindicaciones 12 ó 13, caracterizado porque dicho método para la hibridación in situ emplea un tampón de hibridación con los siguientes componentes:
0, 1 - 1 % en peso/volumen de DNA de esperma de salmón. - tampón PBS a pH 7,4.
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AN SF.: 'Generation of digoxigenin-labelled double-stranded and single-stranded probes using the polymerase chain reaction.' MOLECULAR AND CELLULAR PROBES. vol. 6, 1992, pages 193 - 200 *
KITAZAWA S.: 'In situ hybridization with polymerase chain reaction-derived single-stranded DNA probe and S 1 nuclease.' HISTOCHEMISTRY AND CELL BIOLOGY. vol. 111, 1999, pages 7 - 12 *
KONAT GW.: 'Generation of High Efficiency ssDNA Hybridization Probes by Linear Polymerase Chain Reaction (LPCR) .' SCANNING MICROSCOPY SUPPLEMENT. vol. 10, 1996, pages 57 - 60 *
MILLICAN DS.: 'Preparation of Single-Stranded Antisense cDNA Probes by Asymmetric PCR.' METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY. vol. 105, 1998, pages 337 - 350 *

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