ES2326578B1 - Procedimiento para la sintesis de fragmentos coleados de dna monocatenario a partir de un vector de expresion y un cebador universal, y su uso en hibridacion in situ. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la síntesis de fragmentos
coleados de DNA monocatenario a partir de un vector de expresión y
un cebador universal, y su uso en hibridación in situ.
El objeto de la presente invención refiere a un
procedimiento para la obtención de sondas de DNA monocatenario
según un primer paso de amplificación por PCR del fragmento
escogido, seguido de su clonación en un vector de expresión. Una
vez obtenido el vector puede almacenarse en una bacteria
hospedadora.
A partir del vector se amplifica el inserto
utilizando dos cebadores complementarios a los genes del propio
vector que lo flanquean. Esta PCR produce un segmento de dsDNA que
contiene el inserto flanqueado a ambos extremos por secuencias
adicionales de la longitud deseada.
Empleando este producto como molde se realiza
una segunda PCR empleando uno solo de los cebadores anteriores y
oligonucleótidos marcados. Como resultado se obtienen sondas de DNA
monocatenario con una cola en cada extremo; esta cola no será capaz
de hibridar con la secuencia diana pero sí permitirá una mayor
señal al aumentar la cantidad total de nucleótidos marcados.
Description
Procedimiento para la síntesis de fragmentos
coleados de DNA monocatenario a partir de un vector de expresión y
un cebador universal, y su uso en hibridación in situ.
La presente invención se engloba dentro del
campo de la síntesis de fragmentos de DNA monocatenario y sus
aplicaciones.
Desde los primeros experimentos de hibridación
(Pardue ML and Gall JG. Proc. Natl. Acad. Sci USA 64:
600-604 [1969]) se observó que la hibridación in
situ era una de las técnicas que más hartan avanzar el
conocimiento científico de todas las ciencias biológicas.
Mediante esta técnica se puede conseguir
visualizar la presencia de genes y secuencias sobre el DNA tanto en
cromosomas extendidos como durante la interfase. También mediante
esta técnica es posible visualizar los genes que se expresan en una
célula determinada y durante una fase concreta de su ciclo
biológico; lo cual establece una ventaja sobre las técnicas de
procesamiento de "arrays" de nucleótidos ya que éstas no
permiten determinar con exactitud qué genes del cultivo expresan en
cada momento.
La técnica de hibridación consiste en la
obtención o fabricación de una cadena de ácido nucleico de
determinada longitud que sea complementaria a la secuencia que se
desea estudiar, bien sea DNA o RNA.
Las dos cadenas hibridan mediante la ley de
pares de bases de Watson y Crick, es decir, que tanto la cadena
diana como la cadena fabricada o "sonda" tienen que ser
monocatenarias.
El ácido ribonucleico (RNA) en condiciones
habituales se encuentra en forma monocatenaria. Existen diversas
técnicas para la fabricación de sondas de RNA (Sambrook and
Russell. Molecular Cloning, vol 2:9.29. 3ª Edición. CSHL
PRESS), aunque la tecnología es compleja, consume tiempo y el rendimiento en cuanto a cantidad no es muy alto.
PRESS), aunque la tecnología es compleja, consume tiempo y el rendimiento en cuanto a cantidad no es muy alto.
En cuanto a la producción de sondas de DNA
monocatenario (ssDNA), varios autores han reportado el sistema
utilizado en el presente estudio y que permite obtener la mayor
eficiencia en el estado actual de la técnica.
Kitazawa (In situ hybridization with
polymerase chain reaction-derived
single-stranded DNA probe and S 1 nuclease.
Histochemistry Cell Biology, 1998, Vol 111), describe una
preparación del fragmento de DNA molde de doble cadena (dsDNA) a
partir de una reacción de PCR convencional seguida de otra PCR
lineal. Esta segunda PCR está alimentada por un único cebador
específico que dirige la amplificación unidireccional de una sola
de las hebras del DNA molde amplificado. El uso en esta segunda
etapa de desoxinucleótidos marcados
(digoxigenina-11-dUTP) permite la
obtención de sondas de hibridación ssDNA que pueden ser utilizadas
para la detección in situ de mRNA específico en muestras de
tejidos biológicos mantenidos en parafina.
Antes, Konat G.W. ("Generation of high
efficiency ssDNA hybridization probes by linear polymerase chain
reaction". Scam-ling Micros. Suppl., 1996,
Vol.10), ya había puesto a punto el método de obtención de sondas
con nucleótidos marcados con radiactividad o con digoxigenina
(dig-11-dUTP) para poder ser
utilizadas en muestras de tejidos biológicos.
An S.F. et al. ("Generation of
digoxigenin-labelled double-stranded
and single-stranded probes using the polymerase
chain reaction", Mol. Cell. Probes, 1992, Vol. 6. Nr. 3),
obtiene sondas específicas marcadas con biotina o digoxigenina para
hibridar con el virus de la hepatitis B (HBV), y su utilización en
tejido de biopsia hepática.
El procedimiento había sido originalmente
descrito por Finchk U. et al. ("Producing
single-stranded DNA probes with the Taq DNA
polymerase: a high yield protocol". Biotechniques, 1991, Vol.
10, No 1), en el que documentan el método de la doble PCR y el
marcaje de la segunda con
biotina-11-dUTP y
biotina-21-dUTP.
El sistema más extendido para la conservación de
cultivos de tejidos es mantenerlos en parafina. Pero este sistema
plantea el problema de que destruye la mayor parte de los ácidos
nucleicos; el mRNA queda reducido a una cantidad aproximada de la
décima parte y suele estar además deteriorado. Esto dificulta la
hibridación mediante sondas e impide que éstas puedan ser más
resolutivas.
La presente invención aporta una solución a la
potenciación de señal utilizando sondas cromáticas para la
detección de secuencias de mRNA.
La presente invención trata de un procedimiento
para la síntesis de fragmentos coleados de DNA monocatenario
marcados con un hapteno, obtenidos con PCR asimétrica utilizando un
cebador universal. Este cebador reconoce una secuencia plasmídica
vecina a un inserto y hace factible su utilización "in
situ" como sonda sobre tejidos fijados en formol e incluidos
en parafina.
Así, la presente invención se refiere a un
procedimiento para la síntesis de sondas coleadas de DNA
monocatenario, caracterizado porque comprende:
- 1.
- la inserción de un fragmento de DNA, obtenido por técnica de PCR y réplica de una secuencia diana, en un vector de expresión y su almacenamiento en una bacteria hospedadora,
- 2.
- la amplificación por PCR del fragmento de DNA almacenado según el paso anterior usando cebadores propios del vector,
- 3.
- la amplificación del fragmento obtenido en el paso anterior en una segunda PCR asimétrica que utiliza un único cebador descrito en el paso 2 y oligonucleótidos marcados.
En una realización concreta de la invención, el
vector de expresión del paso 1 es el plásmido PG&T. En una
realización preferida de la invención, el inserto se sitúa entre
las secuencias T7F y SP6R del plásmido. En una realización
más
preferida de la invención, los cebadores del paso 2 son dos oligos complementarios a dichas secuencias T7F y SP6R.
preferida de la invención, los cebadores del paso 2 son dos oligos complementarios a dichas secuencias T7F y SP6R.
Tras la amplificación del fragmento comprendido
entre los dos cebadores según el paso 2 se obtiene un DNA de doble
cadena (dsDNA). Dicho dsDNA comprende la secuencia problema junto
con una secuencia adicional de nucleótidos que corresponde
originalmente al vector.
En una realización concreta de la invención, el
producto de esta primera amplificación sirve de molde para una
segunda amplificación por PCR. En una realización preferida de la
invención, dicha segunda amplificación es una PCR asimétrica en la
que sólo se utiliza uno de los cebadores utilizados en la
amplificación anterior.
En una realización concreta de la invención, en
la segunda PCR se introducen nucleótidos marcados. En otra
realización concreta, el nucleótido marcado es la desoxiuridina
(dUTP). En una realización concreta de la invención, se marca con un
hapteno. En otra realización concreta el hapteno está seleccionado
entre digoxigenina, biotina o fluoresceína.
En una realización preferente de la invención,
en la segunda amplificación se introduce dUTP marcada con
digoxigenina.
El resultado de esa segunda amplificación
asimétrica es un DNA monocatenario que contiene la secuencia
problema junto con una cola de secuencia propia del plásmido. Esa
cola de secuencia no es hibridante pero sí está marcada con
nucleótidos de uridina como lo está todo el producto de esta
amplificación, de forma que actúa como potenciadora de la señal de
la secuencia que hibrida.
En una realización preferente de la invención,
los fragmentos de DNA marcados se utilizan como sonda para la
detección de expresión génica; entendiéndose como "sonda" un
fragmento de DNA empleado para detectar e identificar secuencias
correspondientes en ácidos nucleicos mediante su hibridación
selectiva con ellas.
Así, la presente invención se refiere también a
una sonda de DNA monocatenario obtenida por el procedimiento
descrito. En una realización concreta de la presente invención,
dicha sonda de DNA monocatenario reconoce mRNA que se expresa en una
célula diana, tal como se enuncia en el "Estado de la Técnica"
de la presente descripción.
En un aspecto concreto, la presente invención se
refiere al uso de la sonda de DNA monocatenario previamente
definida en un método para la detección de la expresión génica
mediante hibridación in situ. En una realización preferente,
dicha hibridación se realiza sobre cortes de tejidos fijados en
formol e incluidos en parafina. En una realización concreta de la
invención, dicho método para la hibridación in situ emplea
como tampón PBS a pH 7,4.
En una realización preferente, este
procedimiento está caracterizado porque además emplea un tampón de
hibridación con la siguiente composición:
- -
- 0,1-1% en peso/volumen de DNA de esperma de salmón.
- -
- tampón PBS a pH 7,4.
En una realización concreta de la invención, las
sondas de DNA monocatenario preparadas según este procedimiento se
liofilizan para su comercialización.
Este sistema de hibridación in situ
mediante el uso de sondas de DNA monocatenario obtenidas por el
procedimiento descrito resulta ventajoso frente al estado de la
técnica por funcionar especialmente bien en tejidos fijados en
formol e incluidos en parafina. Resuelve el problema de la
destrucción de la gran parte del RNA presente descrito en "Estado
de la Técnica". En este sentido, una evolución preferida de la
presente invención consiste en la posibilidad de hibridar entre sí
las colas marcadas de las sondas.
El método descrito elimina pasos innecesarios
establecidos en el estado de la técnica. Por ejemplo, los lavados
con formamida y el uso de citrato sódico salino, que se ha
comprobado que produce fondo tisular. Así, sólo se utiliza PBS a pH
7,4 como soporte líquido a lo largo de todo el procedimiento.
De este modo, el proceso de hibridación in
situ resulta sencillo y rápido y con alta especificidad;
potencia la señal de los fragmentos hibridados, y una incubación de
1 hora es suficiente para que la sonda hibride con el mRNA presente
en la muestra de tejido. La estimación de tiempo total desde la
desparafinación del tejido hasta su visualización por el
microscopio óptico no excede de las 3 horas.
Asimismo, el método utiliza un oligo universal
que hibrida con el polilinker del plásmido y que se puede utilizar
para clonar cualquier secuencia en el inserto; lo cual estandariza
las condiciones del experimento y la eficiencia de los
resultados.
Figura 1: En el esquema se muestra la posición
de anillamiento de los oligos y las secuencias de las regiones que
flanquean al fragmento clonado de interés.
Figura 2: Numerosos islotes eritroides se
observan teñidos en marrón. Médula ósea. Histosonda Hemoglobina.
100x.
Figura 3: Las células eritroides muestran una
intensa tinción citoplasmática en marrón. Histosonda Hemoglobina.
400x.
Ejemplo
1
Para el diseño y síntesis de una sonda según la
invención se llevan a cabo los pasos que se detallan a
continuación.
Una vez inmortalizado el fragmento de interés
SEQ ID NO: 1 (que será el fragmento que se utilizará para generar
la histosonda) se amplificará mediante PCR utilizando dos oligos
que flanquean la región clonada.
Estos oligos se denominan SP6R y T7F de acuerdo
a los genes con los que hibridan. Corresponden a la SEQ ID NO: 2
(SP6R) y SEQ ID NO: 3 (T7F).
La amplificación del fragmento de interés (PCR
molde) se lleva a cabo en las siguientes condiciones:
Buffer 10X [500 mM Tris/HCl, 100 mM KCl, 50 mM
(NH_{4})_{2}SO_{4}, pH 8,3/25ºC] 10 \mul, MgCl_{2}
(25 mM) 6 \mul, oligo SP6R 0,2 \mug, oligo T7F 0,2 \mug, dNTPs
Mix (10 mM) 1 \mul, Taq DNA Polimerasa (5 U/\mul) 0,4 \mul,
DNA plasmiprep molde 3 \mul (200 ng-400 ng) y agua
77,6 \mul sumando todo un volumen final de 100 \mul.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para generar mas volumen de PCR molde únicamente
se deberá multiplicar cada componente de manera proporcionada en
función del volumen final deseado que se quiera obtener.
\vskip1.000000\baselineskip
Una vez realizada la mezcla, se somete al
siguiente ciclo en el termociclador:
\vskip1.000000\baselineskip
El tiempo al que se mantendrá la muestra a 72ºC
durante los ciclos podrá variar en función del tamaño del fragmento
que se va ha amplificar (aproximadamente 1 min. por Kb de DNA
molde).
El resultado de este proceso es obtener DNA
molde para la segunda PCR.
Una vez finalizado el proceso se hará una
electroforesis en un gel de agarosa con porcentaje variable (0,8% -
3% p/v) en función del tamaño del fragmento amplificado, para
comprobar que el fragmento amplificado es del tamaño correcto. La
electroforesis se lleva a cabo en tampón TBE 0,5X (v/v) o TAE 1X
(v/v) a un voltaje que oscila entre 60 V y 180 V hasta obtener una
separación de las bandas que permita la comprobación de su
tamaño.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Una vez comprobado, el siguiente paso será la
fabricación de la sonda que se desarrollará en las siguientes
condiciones:
El volumen final será de 100 \mul. Si es
necesario generar más volumen se harán los múltiplos apropiados de
los componentes para obtener el volumen final deseado.
\newpage
Una vez realizada la mezcla se someterá al
siguiente ciclo:
El producto final obtenido es la histosonda, un
DNA monocatenario marcado con dUTP más un hapteno, que es
complementaria a un fragmento de RNA de interés.
Todo lo que se ha descrito hasta ahora sería
llevado a cabo para la generación de histosondas siempre que el
fragmento de interés clonado se inserte en el plásmido de donación
en la dirección 5' a 3'; pero puede suceder que el fragmento se
inserte en dirección contraria por lo que se llevara a cabo todo el
proceso de la misma manera excepto para la generación de la sonda,
que será necesario el oligo T7F.
<110> CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR
(CENBIMO)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento para la síntesis de
fragmentos coleados de DNA monocatenario a partir de un vector de
expresión y un cebador universal, y su uso en hibridación
in-situ.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 5.070.021/MAD
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 158
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento de la secuencia de
\alpha-Hemoglobina utilizado para el desarrollo
de la sonda de ssDNA.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccgcgaatt cactagtgat
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcactatag ggcgaattgg
\hfill20
Claims (16)
1. Un procedimiento para la síntesis de sondas
coleadas de DNA monocatenario caracterizado porque
comprende:
- 1.
- la inserción de un fragmento de DNA, obtenido por técnica de PCR y réplica de una secuencia diana, en un vector de expresión y su almacenamiento en una bacteria hospedadora,
- 2.
- la amplificación por PCR del fragmento de DNA almacenado según el paso anterior usando cebadores propios del vector, y
- 3.
- la amplificación del fragmento obtenido en el paso anterior en una segunda PCR asimétrica que utiliza un único cebador descrito en el paso 2 y oligonucleótidos marcados.
2. Un procedimiento para la síntesis de
fragmentos de DNA monocatenario según la reivindicación 1,
caracterizado porque el vector de expresión empleado
corresponde al plásmido PG&T.
3. Un procedimiento para la síntesis de
fragmentos de DNA monocatenario según las reivindicaciones 1 y 2,
caracterizado porque los cebadores que se utilizan en el
vector de expresión son oligos complementarios a los genes T7F y
SP6R.
4. Un procedimiento para la síntesis de
fragmentos de DNA monocatenario según la reivindicación 1,
caracterizado porque el oligonucleótido del paso 3 contiene
desoxiuridina (dUTP) marcada.
5. Un procedimiento para la síntesis de
fragmentos de DNA monocatenario según las reivindicaciones 1 y 4,
caracterizado porque dicho desoxinucleótido se encuentra
marcado con un hapteno.
6. Un procedimiento para la síntesis de
fragmentos de DNA monocatenario según la reivindicación 5 porque
dicho hapteno está seleccionado entre digoxigenina, biotina o
fluoresceína.
7. Un fragmento de DNA monocatenario
caracterizado porque se obtiene por el procedimiento
descrito en una de las reivindicaciones 1 a 6.
8. Un fragmento de DNA monocatenario según la
reivindicación 7, caracterizado porque contiene una cola de
nucleótidos no hibridante.
9. Un fragmento de DNA monocatenario según la
reivindicación 8, caracterizado porque contiene una cola de
nucleótidos no hibridante marcada.
10. Uso de un fragmento de DNA monocatenario
descrito en una de las reivindicaciones 7 a 9, como sonda para la
detección de expresión génica.
11. Una sonda de DNA monocatenario obtenida por
el procedimiento descrito en las reivindicaciones 1 a 10.
12. Uso de una sonda definida en la
reivindicación 11 en un método para la detección de la expresión
génica mediante hibridación in situ.
13. Uso de una sonda según la reivindicación 12,
caracterizado porque dicha hibridación se realiza sobre
cortes de tejidos fijados en formol e incluidos en parafina.
14. Uso de una sonda según una de las
reivindicaciones 12 ó 13, caracterizado porque dicho método
para la hibridación in situ emplea un tampón de hibridación
con los siguientes componentes:
- -
- 0,1-1% en peso/volumen de DNA de esperma de salmón.
- -
- tampón PBS a pH 7,4.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200702523A ES2326578B1 (es) | 2007-09-26 | 2007-09-26 | Procedimiento para la sintesis de fragmentos coleados de dna monocatenario a partir de un vector de expresion y un cebador universal, y su uso en hibridacion in situ. |
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| ES200702523A ES2326578B1 (es) | 2007-09-26 | 2007-09-26 | Procedimiento para la sintesis de fragmentos coleados de dna monocatenario a partir de un vector de expresion y un cebador universal, y su uso en hibridacion in situ. |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2326578A1 ES2326578A1 (es) | 2009-10-14 |
| ES2326578B1 true ES2326578B1 (es) | 2010-07-08 |
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|---|---|---|---|
| ES200702523A Expired - Fee Related ES2326578B1 (es) | 2007-09-26 | 2007-09-26 | Procedimiento para la sintesis de fragmentos coleados de dna monocatenario a partir de un vector de expresion y un cebador universal, y su uso en hibridacion in situ. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2326578B1 (es) |
-
2007
- 2007-09-26 ES ES200702523A patent/ES2326578B1/es not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| AN SF. Generation of digoxigenin-labelled double-stranded and single-stranded probes using the polymerase chain reaction. Molecular and Cellular Probes. 1992, Vol 6, páginas 193-200, página 194, columnas 1-2; página 198 columna 1 - página 200, columna 2. * |
| KITAZAWA S. In situ hybridization with polymerase chain reaction- derived single-stranded DNA probe and S1 nuclease. Histochemistry and Cell Biology. 1999, Vol 111, páginas 7-12, todo el documento. * |
| KONAT GW. Generation of High Efficiency ssDNA Hybridization Probes by Linear Polymerase Chain Reaction (LPCR. Scanning Microscopy Supplement. 1996, Vol 10, páginas 57-60, todo el documento. * |
| MILLICAN DS. Preparation of Single-Stranded Antisense cDNA Probes by Asymmetric PCR. Methods in Molecular Biology. 1998, Vol 105, páginas 337-350, páginas 338-340. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2326578A1 (es) | 2009-10-14 |
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| EC2A | Search report published |
Date of ref document: 20091014 Kind code of ref document: A1 |
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| FG2A | Definitive protection |
Ref document number: 2326578B1 Country of ref document: ES |
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