WO2010104242A1 - 미생물을 이용한 비만 및 비만으로 야기된 대사성 질환의 예방과 치료 - Google Patents

미생물을 이용한 비만 및 비만으로 야기된 대사성 질환의 예방과 치료 Download PDF

Info

Publication number
WO2010104242A1
WO2010104242A1 PCT/KR2009/003036 KR2009003036W WO2010104242A1 WO 2010104242 A1 WO2010104242 A1 WO 2010104242A1 KR 2009003036 W KR2009003036 W KR 2009003036W WO 2010104242 A1 WO2010104242 A1 WO 2010104242A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
obesity
lactic acid
kctc
free fatty
microorganism
Prior art date
Application number
PCT/KR2009/003036
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
김현진
홍성출
Original Assignee
주식회사 지니스
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 지니스 filed Critical 주식회사 지니스
Priority to MX2011009508A priority Critical patent/MX2011009508A/es
Priority to EP09841555.7A priority patent/EP2407170B1/en
Priority to BRPI0924418-2A priority patent/BRPI0924418A2/ko
Priority to US13/255,838 priority patent/US8986675B2/en
Priority to CN2009801591839A priority patent/CN102438638B/zh
Priority to JP2011553927A priority patent/JP5665196B2/ja
Priority to KR1020117023816A priority patent/KR101292714B1/ko
Priority to CA2755140A priority patent/CA2755140A1/en
Publication of WO2010104242A1 publication Critical patent/WO2010104242A1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A61K35/747—Lactobacilli, e.g. L. acidophilus or L. brevis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/853—Lactobacillus
    • Y10S435/854—Lactobacillus acidophilus

Definitions

  • the present invention relates to the prevention and treatment of obesity and metabolic diseases caused by obesity, and more particularly to the prevention and treatment using microorganisms.
  • Obesity is a chronic disease that is a problem all over the world. There is no effective treatment and it is a serious disease that continues to increase. Obesity also causes many other serious chronic diseases. Metabolic diseases caused by obesity include hypertension, diabetes, hyperlipidemia, arteriosclerosis, ischemic heart disease, fatty liver, gallstones, arthritis. Pulmonary dysfunction and genital abnormalities.
  • sibutramine Abbott's Meridia
  • oriststat Fubott's Zenical
  • Sibutramine reduces food intake by controlling appetite by preventing reabsorption of noradrenaline and serotonin.
  • sibutramine has side effects that affect the heart rate and blood pressure due to its properties that act on the central nervous system.
  • the oristat acts locally.
  • Oriststat is an inhibitor of lipase, a lipolytic enzyme in the stomach and small intestine, which interferes with the hydrolysis of fat, so that about 30% of the fat consumed as food is not absorbed into the body and is excreted. Has an effect.
  • the present inventors have carried out experiments in which the intestinal bacterial guns of obese and underweight mice have been transplanted into sterile mice, so that the composition of the bacterial guns in the GI track can cause a difference in the calorie intake efficiency from food, thereby resulting in a change in body weight.
  • the results show that even a slight change in calorie intake in the gastrointestinal tract significantly increases or decreases body weight. Therefore, in view of the fact that the fat, which is the main source of calories, is consumed by the body in the form of free fatty acids, the present inventors inhabit microorganisms that reduce free fatty acids in the gastrointestinal tract, so that the microorganisms remove the free fatty acids immediately before absorption in the body.
  • the fat intake can be effectively reduced from food, and this has been determined to be a therapeutic agent for obesity by lowering the calorie intake rate, thereby completing the present invention by proving this through experiments.
  • An object of the present invention is to provide a preventive and therapeutic agent and a method for preventing and treating metabolic diseases caused by new obesity and obesity.
  • an anti-obesity agent that solves the side effects of the problems of the existing anti-obesity agent sibutramine or orist.
  • the Lactobacillus acidophilus ( Lactobacillus acidophilus ), which is a general lactic acid bacterium, is gradually mutated to obtain an improved lactic acid bacterium (fatty acid robbing microbe, FARM) with improved free fatty acid absorption compared to general lactic acid bacteria, which is ingested for a certain period of time.
  • the experiment was conducted to confirm the effects on the body fat accumulation and weight gain in rats, and as a result, the same weight loss effect as the orlistat, which is currently widely used as an anti-obesity drug, is confirmed.
  • the present invention confirms that the absorption of fatty acids in the gastrointestinal tract can be reduced by improving the characteristics of the small intestine bacteria and transplanting by ingesting the microbial agent having improved free fatty acid absorption ability, which is obesity by the microbial agent and method of the present invention. That means you can cure.
  • microorganisms that can live in the gastrointestinal tract of mammals and have free fatty acid absorption as an active ingredient.
  • the microorganism included in the pharmaceutical composition provided as an active ingredient in the gastrointestinal tract of a mammal is a microorganism capable of living in the gastrointestinal tract and having free fatty acid absorption, preferably derived from a microorganism constituting a human intestinal flora or the intestine of a human.
  • Lactobacillus ashdophyllus FARM1 (KCTC 11513BP), Lactobacillus ashdophyllus FARM2 (KCTC 11514BP) and Lactobacillus ashdophyllus FARM3 (KCTC) as improved lactic acid bacteria with an increased absorption capacity of free fatty acids. 11515BP).
  • the present invention provides a functional food for the prevention and improvement of obesity and obesity caused by obesity, including lactic acid bacteria that can live in the gastrointestinal tract of mammals and have free fatty acid absorption ability.
  • functional food is a food added with a specific functionality in addition to the original purpose of food, it is meant to include all health food, health functional food and the like.
  • the desired functionality of the functional food of the present invention is the prevention and improvement of obesity.
  • Lactobacillus ashdophyllus FARM1 (KCTC 11513BP), Lactobacillus ashdophyllus FARM2 (KCTC 11514BP) and Lactobacillus ashdophyllus FARM3 (KCTC 11515BP), which are improved lactic acid bacteria with improved free fatty acid absorption, to provide.
  • the present invention a method for preventing and treating metabolic diseases caused by obesity and obesity, including reducing the absorption of free fatty acids in the body by administering a microorganism capable of living in the gastrointestinal tract of a mammal and having free fatty acid absorption ability to provide.
  • Administration or ingestion of a microorganism having free fatty acid absorption ability according to the present invention can reduce the absorption of free fatty acids in the body, and thus can be an effective method for preventing and treating metabolic diseases caused by obesity and obesity.
  • High calorie intake from food is also the most important determinant in obesity and also the fastest growing factor in obesity. In most cases, calorie intake exceeds 1% of the body's calorie consumption, causing body fat to accumulate, which in turn leads to obesity.
  • the pharmaceutical composition of the present invention by transplanting lactic acid bacteria with improved free fatty acid intake into the small intestine of the host to limit the caloric intake of the host to bring about an anti-obesity effect that is the most widely used as an anti-obesity drug and Is also at a similar level.
  • the pharmaceutical composition of the present invention containing the microorganism having the ability to absorb free fatty acids as an active ingredient has the following excellent advantages over the conventional obesity treatment.
  • intestinal bacterial flora is associated with various complex diseases such as infectious diseases, cancer and allergic diseases in addition to obesity. Therefore, treatment through live cell transplantation has the potential to be applied to various diseases related to the intestinal flora.
  • the present invention demonstrates the ability to transplant enterobacteriaceae with improved free fatty acid intake into the small intestine to effectively change the intestinal flora of the host and to treat host diseases. It also means opening up possibilities.
  • Figure 2 is the result of measuring the calorie intake change in the host colonized lactic acid bacteria.
  • Figure 3 is the result of measuring the weight change of the experimental group.
  • Figure 5 shows the visceral fat accumulation image of 22 weeks high fat diet group and FARM lactic acid bacteria intake group.
  • Figure 6 shows the change in blood lipid concentration of the experimental group, TG is triglycerides; TC is total cholesterol; HDL is a high-density lipoprotein cholesterol; LDL represents low-density lipoprotein cholesterol.
  • Figure 7 shows the change in blood insulin and leptin concentration of the experimental group
  • Figure 8 shows the blood glucose change in the experimental group.
  • Lactobacillus acidophilus Lactobacillus acidophilus
  • KCTC 3179 a type of lactic acid bacteria present in the human body
  • NTG N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine
  • This modified lactic acid bacterium is more than 2.1 times more capable of absorbing free fatty acids from the surrounding environment than normal lactic acid bacteria. It was named Lactobacillus ashdophilus FARM1 (fatty acid robbing microbe 1), and it was designated as Korea on May 19, 2009. It was deposited with the accession number KCTC 11513BP to the Biotechnology Center, Biotechnology Research Institute.
  • FARM1 In the present invention, it is abbreviated as "FARM1".
  • FARM1 was used to induce a secondary mutation with 4NQO (4-nitroquinoline 1-oxide), resulting in an improved strain, FARM2, which significantly increased the absorption of free fatty acids, and as of May 19, 2009, the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology It was deposited in the repository with accession number KCTC 11514BP.
  • FARM2 According to radiolabeling experiments, FARM2 had a characteristic of absorbing free fatty acids more than 3.1 times faster than normal strains.
  • the most important characteristic of edible lactic acid bacteria is the colony formation, ie colony formation, which grows and grows in the small intestine of the host after ingestion.
  • colony formation and growth ability in the small intestine were examined with the improved strains FARM1 and FARM2.
  • FARM1 and FARM2 maintained normal growth and acidification during fermentation with yogurt and successfully colonized in the small intestine of rats after ingestion in yogurt form. These results indicate that FARM1 and FARM2 with improved fatty acid absorption capacity retain the properties of lactic acid bacteria.
  • the lactic acid bacteria When we consume lactic acid bacteria, the lactic acid bacteria temporarily form a flora in the small intestine, which is where the fatty acids, which are fat breakdown products, are absorbed.
  • FARM consumes free fatty acids, which reduces free fatty acids that can be absorbed by the human body, thus acting as a bio-sequestrant, which reduces the calorie intake of the host.
  • Rats were fed yogurt fermented with FARM strains for eight weeks to test whether FARM actually reduced the host's calorie intake by removing free fatty acids from the small intestine.
  • the visceral fat of rats was measured by MRI using open-type 0.3 Tesla MRI at the end of the lactobacillus feeding experiment.
  • Visceral fat levels in the untreated control group, rats fed with Lactobacillus, rats fed FARM1, and rats fed FARM2 were 27%, 24%, 14%, and 13%, respectively.
  • FARM colonizes the host's small intestine
  • FARM reduces the absorption of free fatty acids in the small intestine, which in turn prevents the body from gaining weight and accumulating body fat.
  • the body loses visceral fat and weight due to reduced calorie intake.
  • Obesity is closely associated with metabolic syndrome such as insulin resistance, glucose tolerance, hyperlipidemia and cardiovascular disease. Therefore, biochemical analysis in serum related to metabolic syndrome was performed at the end of the experiment.
  • the levels of TG, TC and LDL-cholesterol in the control group that did not consume any lactic acid bacteria and rats that received normal lactic acid bacteria were higher in the rats that received FARM1 and FARM2.
  • HDL cholesterol levels were low in the control group but high in the FARM group.
  • FARM lactobacillus which showed anti-obesity effect, showed excellent effect in diabetes as expected. Ingestion of FARM1 and FARM2 reduced serum insulin levels by 23% and 30%, respectively, compared to the control group that had no lactobacillus.
  • Serum leptin levels were also decreased by 20% and 45%, respectively, compared to the control group that did not consume any lactic acid bacteria.
  • Serum glucose levels were also 122.1 mg / dl and 123.4 mg / dl in the control group that did not consume any lactic acid bacteria, and 122.1 mg / dl in the rats fed normal lactic acid bacteria, whereas the rats fed FARM1 and FARM2 consumed 107.6 mg / dl and 108.4 mg / dl, respectively. It was found to decrease. As the body weight increases, the body becomes less susceptible to leptin and insulin, and at the same time, the serum lipid profile is deteriorated, which increases blood levels of leptin, insulin, glucose, LDL cholesterol, and total cholesterol. . These results show that FARM lactic acid bacteria are effective in improving blood lipid profile and inhibiting insulin and leptin resistance by preventing weight gain. It also shows that FARM lactic acid bacteria have excellent properties as a treatment for obesity.
  • mice with colonization of FARM have excellent properties that reduce the intake of free fatty acids and thereby prevent weight gain and visceral fat accumulation
  • the possibility of anti-obesity treatment of FARM lactic acid bacteria with improved free fatty acid intake is tested. It was.
  • the third strain was mutated with EMS (ethylmethane sulfonate) to find the lactobacillus strains with improved free fatty acid intake.
  • the third mutant strain, FARM3 was identified as Lactobacillus ashdophyllus FARM3 (fatty acid robbing microbe 3), which is 5.0 times more free fatty acid intake than normal lactic acid bacteria.
  • FARM3 When yogurt fermented with FARM3 was ingested 3ml daily for 4 weeks, the rats lost more than 18% of their body weight compared to the control group fed with lactic acid bacteria. The weight loss of FARM3 is comparable to that of orally stat. Unlike Oriststat, FARM3 did not show side effects such as fatty stools, in addition to effective weight loss. This means that FARM3 is a drug substance that can be developed as a safe and effective treatment for obesity. In the present invention, the experiment with the lactic acid bacteria FARM3, but the technical concept of the present invention is not limited to FARM3 or lactic acid bacteria.
  • the technical idea of the present invention regarding the treatment of obesity can be applied to any microorganism capable of living in the gastrointestinal tract of a mammal, especially a human, and having a free fatty acid absorption ability, which can be applied to those skilled in the art.
  • Reagents were purchased from Sigma except for the following.
  • Liquid scintillation cocktail (LSC): PerkinElmer Life Sciences
  • Anaerobic culture performed in anaerobic jars of BBL Gas-Pack anaerobic systems.
  • MRI images were obtained with Bruker Biospec 47/40 4.7-Tesla instrument (Bruker) and analyzed with Image J (NIH).
  • Serum Analyzed with Rat / Mouse ELISA kit (LINCO research), Leptin ELISA kit (R D System), a blood glucose meter (Accu-Chek) and cholesterol ELISA kits (Asan Pharm. Co), respectively.
  • L. ashdophilus KCTC3179 lactic acid bacteria were inoculated in MRS medium and anaerobically cultured to B7.2 Gas-Pack at pH 7.2 and 37 ° C. Mutation experiments to obtain a FARM strain with improved free fatty acid uptake was performed as follows. After L. ashdophilus KCTC3179 lactic acid bacteria were purified for 24 hours, NTG (N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine) was added to the liquid culture solution at a concentration of 2 mg / ml. After incubation for 30 minutes at 25 °C washed three times with MRS broth and suspended again in MRS broth.
  • the treated cells were placed on an MRS agar plate, incubated for 48 hours at 37 ° C. in an anaerobic state, and then inoculated into a 384-well plate containing 50 ⁇ l of MRS broth. After incubation, 384-pin replicator was used as a 384-well plate containing only MRS broth medium and 384-well plate containing MRS broth medium containing 0.1 nCi / mL of 14 C-palmitic acid. Replica.
  • the replicated plates were wrapped in parafilm, incubated for 30 minutes with gentle shaking at 37 ° C, and then 2 ⁇ l of the radiolabeled culture solution at 14 C was transferred to nylon membranes, respectively, and dried in a semi-dry system.
  • the dried membrane was washed three times with MRS broth to remove the adhered 14 C-palmitic acid and then exposed to X-ray film (X-ray film) for 3 days at -80 °C.
  • the radioactivity obtained from the X-ray film was analyzed by Gel-Pro analyzer software, and colonies with strong signal were selected, and finally, Lactobacillus strains with improved fatty acid absorption were named FARM1 (fatty acid robbing microbe 1).
  • FARM1 was treated with 4NQO (4-nitroquinoline 1-oxide) in the same manner as above to obtain FARM2, and FARM2 was also treated with EMS (ethylmethane sulphonate) in the same manner to obtain FARM3.
  • EMS ethylmethane sulphonate
  • the lactic acid bacteria were cultured with radiolabeled 14 C palmitic acid and the radioactivity was measured. To this end, the lactic acid bacteria were inoculated in 2 ml of MRS broth, incubated, reached the algebraic growth period, centrifuged, and inoculated in an MRS medium containing 14 C-palmitic acid at a concentration of 1 nCi / ml, followed by 1 hour at 37 ° C. Incubated.
  • Lactic acid bacteria were anaerobicly cultured at 37 ° C. in MRS medium to reach a logarithmic growth period, and 1 ml of cell culture solution was inoculated into 100 ml containing aseptic skim milk (10%) and glucose (2%). The pH change was measured at 24 hour intervals while incubating.
  • 5 ml of yogurt made after fermentation for 48 hours was transferred to a 15 ml conical tube and vortexed.
  • 1 ml of the homogenized mixture was diluted with PBS, 50 ⁇ l of the dilution was plated on an MRS plate and subjected to anaerobic incubation for 48 hours before counting the colonies.
  • mice All animal experiments were conducted according to the regulations of the Institutional Animal Care and Use Committee. Two male SD rats weighing 200-220 g were placed in cages and freely fed normal feed and water for the first week. During the experiment, the illumination was changed day and night every 12 hours, and the temperature was kept constant at 22 ⁇ 1 °C and humidity at 40-50%. A week later, rats were randomly divided into 14 animals per group, and the control group (high fat diet), 3179 group ( L.acidophilus KCTC3179 lactobacillus fermented yogurt intake of high fat diet), FARM group ( L.acidophilus FARM lactobacillus fermented yogurt in high fat diet) Intake groups).
  • control group high fat diet
  • 3179 group L.acidophilus KCTC3179 lactobacillus fermented yogurt intake of high fat diet
  • FARM group L.acidophilus FARM lactobacillus fermented yogurt in high fat diet
  • the high fat diet used in this experiment was obtained by adding 20% pig lard to normal rat feed (complex-carbohydrate 60%, protein 22%, fat 3.5%, fiber 5%, crudeash 8%, calcium 0.6%, andphosphorus 1.2%).
  • the composition consists of 48% complex carbohydrates, 17.6% protein, 22.8% fat, 4% fiber, 6.4% ash, 0.48% calcium, and 0.96% phosphorus.
  • the yogurt for dietary experiments is 10% skim milk powder, 2% sugar and 1% L. acidophilus culture with cell concentration above 10 9 / ml.
  • the rats were freely fed their diet, and 3 ml of fermented yogurt was fed directly to the oral cavity. Body weights were measured between 9 am and 1 am after 12 hours of fasting.
  • Rats were fed with L. acidophilus fermented yogurt for 8 weeks and then randomly selected 4 rats from each experimental group, and then anesthetized with ether and sacrificed. Gastrointestinal tissues such as stomach and small intestine were immediately collected from the rats, transferred to 50 ml conical tubes, and diluted with sterile saline. Next, homogenizer was used to discharge the contents of the gastrointestinal tract tissue, and then plated onto lactobacillus selective agar plates and anaerobic culture for 48 hours. The number of lactic acid colonies formed in the lactic acid bacteria selection medium was counted and calculated as log 10 CFU per gram (wet weight) for each tissue region in the gastrointestinal tract.
  • triolein a type of triglyceride having a long chain structure.
  • Triolein radiolabeled with [ 14 C] was made into a benzene solution and used at -70 ° C. 1 ⁇ Ci of triolein radiolabeled with [ 14 C] was mixed with unlabeled triolein and the solvent was volatilized using nitrogen gas at room temperature. The triolein mixture was fed to the rats ingested with lactic acid bacteria for 22 weeks at 0.5 mmol per 100 g of body weight, and blood samples of the rats were collected by cardiacpuncture at intervals of 2 hours for 10 hours.
  • Bruker Biospec 47/40 4.7-Tesla instrument was used to analyze body fat in visceral fat region using magnetic resonance imaging (MRI). Mice used in the experiment were anesthetized with zoletil (25 mg / kg) and rompun (10 mg / kg). Rats were placed on a magnetic plate to record images and recorded using the body coil as transmitter and receiver. In order to measure visceral fat and subcutaneous fat area, 8 cm up and 8 cm down between 4-5 lumbar spine were obtained by T1 emphasis image. Visceral fat and subcutaneous fat were analyzed by Image J program.
  • MRI magnetic resonance imaging
  • Rat / Mouse ELISA kit (insulin), Leptin ELISA kit (leptin), blood glucose meter, ELISA kit (Serum total cholesterol, HDL-cholesterol, LDL-cholesterol, triglyceride) were used for serum biochemical analysis. .
  • Three-month-old SD male rats were fed a high-fat diet for eight weeks to induce obesity to achieve an average weight of 425 g.
  • the rats were randomly divided into 14 rats per group, and 3179 groups ( L.acidophilus KCTC3179 lactobacillus fermented yogurt in high-fat diet), FARM3 group ( L.acidophilus FARM3 lactobacillus fermented yogurt in high-fat diet), Orist group (High-fat diet with Xenical® added to a 200 mg / kg diet).
  • the rats were free to eat their diet, and their weight was measured between 9 am and 1 am after a 12-hour fast.
  • FARM1 lactic acid bacteria discovered by mutating Lactobacillus ashdophilus KCTC 3179 (denoted as “3179”) to NTG (N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine) had increased fatty acid uptake.
  • Figure 2 is the result of measuring the change in calorie intake in the host colonized (l) colonized (lactic acid). Decrease in calorie intake was confirmed in hosts colonized with FARM lactic acid bacteria. FARM lactobacillus or Lactobacillus L.acidophilus KCTC 3179 was fed to SD rats for 8 weeks to colonize lactic acid bacteria in the GI tracks, followed by 14 C-labeled triolein and blood samples The change in calorie intake of the host was measured by measuring the degree of radioactivity in the host.
  • Lactic acid bacteria were inoculated into 100 ml of skim milk (10%) containing aseptic glucose (2%) and fermented with yoghurt at 37 ° C.
  • the pH change was measured after 24 hours, after 48 hours, and after 72 hours. The measured values of ten samples were expressed as mean ⁇ standard deviation. The results are shown in Table 1 below.
  • Rats were fed with L. acidophilus (KCTC3179 or FARM) fermented yogurt for 8 weeks and then collected gastrointestinal tract tissues such as stomach and small intestine to obtain log 10 CFU per gram (wet weight) for each tissue in the gastrointestinal tract.
  • the control group was not treated with lactic acid bacteria, and the measured values of the five samples were expressed as the mean value ⁇ standard deviation. The results are shown in Table 2 below.
  • Rats were fed with L. acidophilus (KCTC3179 or FARM) fermented yogurt for 4 weeks, and then gastrointestinal tissues such as stomach and small intestine were collected to obtain log 10 CFU per gram (wet weight) for each tissue in the gastrointestinal tract.
  • the control group was not treated with lactic acid bacteria, and the measured values of the five samples were expressed as the mean value ⁇ standard deviation. The results are shown in Table 3 below.
  • FIGS. 3 to 5 The results are shown in FIGS. 3 to 5.
  • Figure 3 is the result of measuring the weight change of the experimental group. Weighing 200-220 g amount of 3-month-old SD rats were randomly divided into 14 per group so that a male control group (high fat diet), 3179 group (L.acidophilus KCTC 3179 lactic acid bacteria fermentation of yogurt intake on a high-fat feed group), FARM It was divided into groups ( L. acidophilus FARM lactic acid bacteria fermented yogurt intake in high fat feed). For the next 22 weeks, the rats were free to eat the corresponding diet, and the weight change was expressed as mean ⁇ standard deviation.
  • Figure 5 shows the visceral fat accumulation image of 22 weeks high fat diet group and FARM lactic acid bacteria intake group.
  • FIGS. 6 to 8 Three-month-old SD rats weighing 200-220 g were randomly divided to 14 per group, and the control group (high fat diet), 3179 group ( L.acidophilus KCTC3179 lactobacillus fermented yogurt intake of high fat diet), FARM It was divided into groups ( L. acidophilus FARM lactic acid bacteria fermented yogurt intake in high fat feed). Serum values obtained from blood collected at the start and end of the experiment were expressed as standard deviations.
  • Figure 6 shows the change in blood lipid concentration, TG is triglycerides; TC is total cholesterol; HDL is a high-density lipoprotein cholesterol; LDL represents low-density lipoprotein cholesterol.
  • 7 shows changes in blood insulin and leptin concentrations
  • FIG. 8 shows changes in blood glucose levels.
  • FIGS. 9 and 10. 9 compares the in vitro fatty acid uptake capacity of FARM3 lactic acid bacteria with 3179 lactic acid bacteria.
  • FARM3 obtained by tertiary mutation of FARM2 lactobacillus with ethylmethane sulphonate (EMS) has improved fatty acid uptake capacity than FARM2.
  • FARM lactobacillus or Lactobacillus L.acidophilus KCTC3179 was fed to SD rats for 8 weeks to colonize lactic acid bacteria in the GI tracks, followed by 14 C-labeled triolein, and blood collected The change in calorie intake of the host was measured by measuring the degree of radioactivity. First, three-month-old SD male rats were fed a high-fat diet for eight weeks to induce obesity so that their average weight was 425 g.
  • the rats were randomly divided into 14 dogs per group, and 3179 groups ( ⁇ , L. acidophilus KCTC3179 lactobacillus fermented yogurt intake of high-fat diet), FARM3 group ( ⁇ , L. acidophilus FARM3 lactobacillus fermented yogurt intake for high-fat diet) ), And the Oristed group ( ⁇ , group fed with 200 mg / kg diet of Xenical® in high fat diet). During the next four weeks, the rats were free to eat the corresponding diet, and the weight change was expressed as mean ⁇ standard deviation.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Dairy Products (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 비만 및 비만으로 야기된 대사성 질환의 예방과 치료에 관한 것으로, 특히 장내 세균총 변화를 통해 비만을 예방 및 치료하는 것에 관한 것이다. 본 발명에서는 자유지방산 흡수능이 개선된 미생물제제의 섭취를 통해 소장내 세균의 특성 개선 및 이식으로 위장관 내에서의 지방산 흡수를 줄일 수 있음이 확인된다. 본 발명에서는 이러한 실험결과를 토대로, 비만과 비만으로 야기된 대사성 질환의 예방 및 치료방법, 예방 및 치료용 약학적 조성물과 기능성 식품, 그리고 이러한 목적으로 사용할 수 있는 개량 유산균주가 제공된다. 본 발명은 현재 항비만 치료제로 가장 널리 쓰고 있는 오리스탯과 같은 수준의 체중감소 효과가 있다. 본 발명은 소장 내 세균의 특성 개선 및 이식을 통해 위장관 내에서의 지방산 흡수를 막아주게 됨으로써 비만을 치료할 수 있음을 보여준다.

Description

미생물을 이용한 비만 및 비만으로 야기된 대사성 질환의 예방과 치료
본 발명은 비만 및 비만으로 야기된 대사성 질환의 예방과 치료에 관한 것으로, 특히 미생물을 이용한 예방과 치료에 관한 것이다.
비만은 전세계으로 문제가 되고 있는 만성질환으로 효과적인 치료방법이 없고 계속 증가추세에 있는 심각한 질환이다. 또, 비만은 다른 여러 심각한 만성질환을 유발한다. 비만으로 야기되는 대사성 질환에는 고혈압, 당뇨병, 고지혈증, 동맥경화증, 허혈성 심장질환, 지방간, 담석증, 관절염. 폐기능 장애, 생식기 이상 등이 있다.
현재 비만치료제로 사용되고 있는 처방약은 시부트라민 (애보트의 메리디아)과 오리스탯 (로쉬의 제니칼)이다. 시부트라민은 노르아드레날린과 세로토닌의 재흡수를 막음으로써 식욕을 조절하여 음식물의 섭취량을 줄여준다. 그러나 시부트라민은 중추신경계에 작용하는 물질이라는 특성으로 인해 심장박동과 혈압 등에 영향을 주는 부작용을 가지고 있다. 시부트라민과 달리 오리스탯은 국소적으로 작용한다. 오리스탯은 위와 소장의 지방분해효소인 리파제(lipase)의 저해제로서 지방의 가수분해를 방해하는 역할을 하므로, 음식물로 섭취된 지방의 30% 정도가 체내로 흡수되지 않고 배출되게 되어 이로 인한 체중조절효과를 가진다. 그러나 소화되지 않은 지방이 위장관 (gastrointestinal track)을 따라 이동하면서 설사, 지방변과 같은 부작용을 일으키는데 이는 불편할 뿐만 아니라 정상적인 사회생활이 어려운 수준의 부작용들이다. 따라서 기존의 비만 치료제가 가지고 있는 이러한 문제점들로 인해 새로운 개념의 비만치료제가 요구되고 있다.
[참고문헌]
1. B. S. Drew, A. F. Dixon, J. B. Dixon, Vasc. Health Risk Manag. 3, 817(2007)
2. P. G. Kopelman, Nature 404, 635(2000)
3. Must et al., J.Am.Med.Assoc. 282, 1523(1999)
4. R.Padwal, SK Li, DC Lau, Cochrane DatabaseSyst.Rev. 3, CD004094(2003)
5. R. S. Padwal, S. R. Majumdar, Lancet 369, 71(2007)
6. J.Rolls, D.J.Shide, M. L. Thorwart, J. S. Ulbrecht, Obes.Res. 6, 1(1998)
7. G. A. Bray etal.,Obes.Res. 7, 189(1999)
8. R. Guercolini, Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord. 21, S12(1997)
9. J.B.Hauptman, F.S.Jeunet, D. Hartmann, Am. J. Clin. Nutr. 55, 309S(1992)
10. J. O. Hill, et al., Am.J.Clin.Nutr. 69, 1108(1999)
11. R. E. Ley, P.J. Turnbaugh, S. Klein, J. I. Gordon, Nature 444, 1022(2006)
12. P. J. Turnbaugh, R. E. Ley, M. A. Mahowald, V. Magrini, E. R. Mardis, J. I. Gordon, Nature 444, 1027(2006)
13. P. J. Turnbaugh, F. Backhed, L. Fulton, J. I. Gordon, Cell Host Microbe 3, 213(2008)
14. W. H. Lin, C. F. Hwang, et al., Food Microb. 23, 74(2006)
15. Appl Environ Microbiol. 59, 15(1993)
16. R. Leenen et al., Am.J.Physiol. 263, E913(1992)
17. Y. Keno et al., Int.J.Obes. 15, 205(1991)
18. Molavi, N. Rasouli, P. A. Kern, Curr. Opin. Cardiol. 21, 479(2006)
19. R. T. Spiotta, G. B. Luma, Am. Fam. Physician78, 1052 (2008)
20. S. Rand, J.ChronicDis. 40, 911(1987)
21. National Heart Lung and Blood Institute, Obes. Res. 6, 51S(1998)
22. J. O. Hill, Endocr.Rev. 27, 750(2006)23. C. Thompson-Chagoyon, J.Maldonado, A.Gil, Dig. Dis. Sci. 52, 2069(2007)
23. C. Thompson-Chagoyon, J.Maldonado, A.Gil, Dig. Dis. Sci. 52, 2069(2007)
24. B. Stecher, W. D. Hardt, Trends. Microbiol. 16, 107(2008)
25. Isolauri, M. Kalliomaki, K. Laitinen, S. Salminen, Curr Pharm Des. 14, 1368 (2008)
26. W. Jia, H. Li, L. Zao, J. K. Nicholson, Nature Rev. Drug Disc. 7, 123(2008)
본 발명자들은 비만 쥐와 저체중 쥐의 장내 세균총을 무균쥐로 이식한 실험을 통해 위장관 (GI track) 내의 세균총의 조성을 변화시키면 음식물로부터의 칼로리 섭취 효율에 차이를 가져오고 이로 인해 체중의 변화를 가져오게 된다는 결론을 얻었다. 이 결과에 의하면 위장관에서의 칼로리 섭취 효율이 약간만 변하더라도 체중이 의미 있게 늘거나 감소하게 된다. 따라서 본 발명자들은 가장 주요한 칼로리 섭취원인 지방이 체내에서 자유지방산 형태로 섭취된다는 사실을 감안하여, 만약 위장관 내에서 자유지방산을 줄여주는 미생물을 서식시키면 이 미생물이 체내 흡수 직전의 자유지방산을 제거하게 되므로 음식물로부터 지방섭취를 효과적으로 줄일 수 있게 되고 이는 칼로리 섭취율을 낮추게 됨으로써 비만치료제가 될 수 있다고 판단하였으며, 실험을 통해 이를 입증함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 새로운 비만 및 비만으로 야기된 대사성 질환의 예방·치료제 및 예방·치료방법을 제공하는 것이다. 특히 체내에서 지방 분해물인 자유지방산을 제거함으로써 음식물을 통한 지방섭취를 줄이는 방법 및 이를 위한 약학적 조성물을 제공하는 데 본 발명의 목적이 있다. 또한 기존의 비만치료제인 시부트라민이나 오리스탯의 문제점인 부작용을 해소한 비만치료제를 제공하는데에도 본 발명의 목적이 있다.
본 발명에서는 일반 유산균인 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus)를 단계적으로 돌연변이시켜 일반 유산균에 비해서 자유지방산 흡수능이 개선된 개량 유산균(fatty acid robbing microbe, FARM)을 얻고, 이를 쥐에 일정기간 섭취시켜 쥐의 체지방 축적과 체중 증가에 미치는 효과를 확인하는 실험을 실시하며, 그 결과 현재 항비만 치료제로 가장 널리 쓰이고 있는 오리스탯(orlistat)과 같은 수준의 체중감소 효과를 확인한다. 즉, 본 발명에서는 자유지방산 흡수능이 개선된 미생물제제의 섭취를 통해 소장내 세균의 특성 개선 및 이식으로 위장관 내에서의 지방산 흡수를 줄일 수 있음을 확인하며, 이는 본 발명의 미생물제제 및 방법으로 비만을 치료할 수 있음을 의미하는 것이다.
본 발명에서는 이러한 실험결과를 토대로,
포유류의 위장관 내에서 서식할 수 있고 자유지방산 흡수능이 있는 미생물을 유효성분으로 함유하는 비만 및 비만으로 야기된 대사성 질환의 예방과 치료를 위한 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명에서 제공하는 약학적 조성물이 유효성분으로 포함하는 미생물은 포유류의 위장관 내에서 서식할 수 있고 자유지방산 흡수능이 있는 미생물로, 바람직하게는 사람의 장내 세균총을 구성하는 미생물 또는 사람의 장관으로부터 유래된 미생물이다. 더욱 바람직하게는 상기 미생물은 유산균이다. 본 발명의 실시예에서는 자유지방산의 흡수능력이 증가된 개량 유산균주로 락토바실러스 애시도필러스 FARM1(KCTC 11513BP), 락토바실러스 애시도필러스 FARM2(KCTC 11514BP) 및 락토바실러스 애시도필러스 FARM3(KCTC 11515BP)를 얻었다.
또한 본 발명에서는, 포유류의 위장관 내에서 서식할 수 있고 자유지방산 흡수능이 있는 유산균을 포함하는 비만 및 비만으로 야기된 대사성 질환의 예방과 개선을 위한 기능성 식품을 제공한다. 본 명세서에서 “기능성 식품”은 식품 본래 목적 외에 특정한 기능성이 부가된 식품으로, 건강식품, 건강기능성식품 등을 모두 포함하는 의미이다. 본 발명의 기능성 식품이 목적하는 기능성은 비만 예방 및 개선이다.
또한 본 발명에서는, 자유지방산 흡수능이 개선된 개량 유산균인 락토바실러스 애시도필러스 FARM1(KCTC 11513BP), 락토바실러스 애시도필러스 FARM2(KCTC 11514BP) 및 락토바실러스 애시도필러스 FARM3(KCTC 11515BP)를 제공한다.
또한, 본 발명에서는, 포유류의 위장관 내에서 서식할 수 있고 자유지방산 흡수능이 있는 미생물을 투여하여 체내에서의 자유지방산 흡수를 줄여주는 것을 포함하는 비만과 비만으로 야기된 대사성 질환의 예방 및 치료방법을 제공한다.
본 발명에 따라 자유지방산 흡수능이 있는 미생물을 투여 또는 섭취하면 체내에서 자유지방산 흡수를 줄여줄 수 있으므로, 효과적인 비만 및 비만으로 야기된 대사성 질환의 예방과 치료방법이 될 수 있다.
음식물로부터의 칼로리 과다섭취는 비만에서 가장 중요한 결정 요소이고 또한 저개발 국가에서 비만이 가장 빠르게 증가하는 요인이기도 하다. 대부분의 경우 체내 칼로리 소비보다 1% 라도 칼로리 섭취가 초과되면 체지방이 축적되게 되고 이는 결국 비만으로 이어진다. 본 발명의 약학적 조성물은 자유지방산 섭취능이 개선된 유산균을 숙주의 소장관 내에 이식시킴으로써 숙주의 칼로리 섭취를 제한하여 항비만 효과를 가져오게 되는데 그 정도가 항비만 치료제로 가장 널리 쓰이고 있는 오리스탯과도 유사한 수준이다. 뿐만 아니라 자유지방산 흡수능이 있는 미생물을 유효성분으로 함유하는 본 발명의 약학적 조성물은, 기존의 비만치료제에 비해서 다음과 같은 매우 우수한 장점을 가지고 있다. 첫째, 중추신경계에 작용하지 않기 때문에 시브트라민과 같이 중추신경계에 작용하는 약물에 비해서 훨씬 뛰어난 장기 안전성을 가지고 있다. 둘째, 지방 분해에 관여하지 않기 때문에 소장관 내에서 설사나 지방변과 같은 부작용을 일으키지 않는다. 셋째, 유산균 등 우리 몸에 유익한 미생물을 유효성분으로 하고 있기 때문에 의약품 소재로서 매우 우수한 안전성을 확보하고 있다.
또한, 장 세균총은 비만 이외에도 감염질환, 암, 알러지 질환과 같은 다양한 복합 질환과 관련되어 있다. 따라서 생균 이식을 통한 치료는 장내 세균총과 관련된 다양한 질환에 적용될 수 있는 가능성을 가지고 있다. 본 발명은 자유지방산 섭취능이 개선된 장내세균을 소장관 내로 이식시켜 숙주의 장 세균총을 효과적으로 변화시키고 숙주의 질환을 치료할 수 있음을 증명함으로써 앞으로 장내세균총과 관련된 다양한 질환에 대해 생균 이식을 통한 치료의 가능성을 열었다는 의미를 갖기도 한다.
도 1은 유산균의 지방산 흡수능을 측정한 결과이다.
도 2는 유산균이 colonization된 숙주에서 칼로리 섭취 변화를 측정한 결과이다.
도 3은 실험군의 체중변화를 측정한 결과이다.
도 4는 실험군의 내장지방을 자기공명영상장치(MRI)로 측정하여 영상분석프로그램(Image J, USA)으로 분석한 결과이다.
도 5는 22주간의 고지방 식이군과 FARM 유산균 섭취군의 내장지방 축적 이미지를 나타낸 것이다.
도 6은 실험군의 혈중 지질 농도 변화를 나타낸 것으로, TG는 triglycerides; TC는 total cholesterol; HDL는 high-density lipoprotein cholesterol; LDL은 low-density lipoprotein cholesterol을 나타낸다.
도 7은 실험군의 혈중 인슐린과 렙틴 농도 변화를 나타낸 것이며,
도 8은 실험군의 혈당 변화를 나타낸 것이다.
도 9는 FARM3 유산균의 in vitro 지방산 흡수능을 3179 유산균과 비교한 것이다.
도 10은 FARM 유산균이 colonization된 숙주에서 칼로리 섭취의 감소를 보여주는 결과이다.
자유지방산의 흡수능력이 증가된 개량 균주
인체에 존재하는 유산균의 일종인 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) KCTC 3179를 NTG(N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine)로 처리하여 돌연변이를 유도한 후 자유지방산의 흡수능력이 증가된 개량 유산균 균주를 찾았다. 이 개량 유산균은 일반 유산균에 비해서 주변 환경으로부터 자유 지방산을 흡수하는 능력이 2.1배 이상인 균주로 락토바실러스 애시도필러스 FARM1(fatty acid robbing microbe 1)로 명명하였으며, 이를 2009년 5월 19일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 수탁번호 KCTC 11513BP로 기탁하였다. 본 발명에서는 이를 “FARM1”로 약칭한다. 그리고 FARM1을 이용하여 4NQO(4-nitroquinoline 1-oxide)로 2차 돌연변이를 유도한 결과 자유지방산의 흡수능이 훨씬 증가된 개량균주 FARM2를 얻었으며, 이를 2009년 5월 19일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에에 수탁번호 KCTC 11514BP로 기탁하였다. 본 발명에서는 이를“FARM2”로 약칭한다. 방사능 표지 실험에 의하면 FARM2는 일반 균주에 비해서 자유지방산을 3.1배 이상 빠르게 흡수하는 특성을 가지고 있었다.
식용유산균의 가장 중요한 특징은 섭취된 후 숙주의 소장관 내에서 집락을 형성하고 성장하는 특성 즉 콜로니형성능(colonization)이다. 유산균으로서의 특성을 조사하기 위하여 개량균주 FARM1 및 FARM2를 가지고 소장관내에서의 집락형성 및 성장 능력을 조사하였다. FARM1 및 FARM2는 요구르트로 발효하는 과정에서 정상적인 성장과 산성화 능력을 유지하였으며 숙주에 요구르트 형태로 섭취 된 이후에도 쥐의 소장관 내에서 성공적으로 콜로니형성(colonization)이 되었다. 이러한 결과는 지방산 흡수능이 향상된 FARM1 및 FARM2가 유산균의 특성을 유지하고 있다는 것을 나타낸다.
자유지방산의 흡수능력이 증가된 유산균이 소장관의 자유지방산을 제거함으로써 실제로 숙주의 칼로리 섭취를 줄여주게 되는지 확인
우리가 유산균을 섭취시 유산균은 소장에 일시적으로 균총을 형성하게 되는데, 소장은 체내에서 지방 분해물인 지방산이 주로 흡수되는 곳이다. 대부분의 지방산이 섭취되는 소장에서 FARM이 자유지방산을 소모하게 되면 이는 인체로 흡수 가능한 자유지방산을 줄여주게 되므로 일종의 bio-sequestrant로 작용하게 되며, 이는 숙주의 칼로리 섭취량을 줄여주게 된다. FARM이 소장관의 자유지방산을 제거함으로써 실제로 숙주의 칼로리 섭취를 줄여주게 되는지를 실험하기 위해 FARM 균주로 발효시킨 요구르트를 쥐에게 8주간 섭취시켰다. FARM 유산균이 쥐의 소장관 내에 콜로니형성(colonization)을 하는 것을 확인한 후, 방사능표지 된 트리올레인(triolein)을 급이하고 혈청내의 방사능 양을 측정하였다. 이 결과는 결국 방사능표지 트리올레인의 소화물인 방사능표지 자유지방산의 흡수가 얼마나 감소되었는지를 나타내게 된다. FARM을 콜로니형성(colonization)시킨 쥐의 경우 GI track에 정착된 개량균주가 주변으로부터 자유지방산을 섭취하는 능력이 훨씬 향상됐음을 보여주었고 이에 비례하여 숙주의 자유지방산 섭취가 감소함을 보여주었다. FARM1 및 FARM2를 콜로니 형성시킨 쥐의 경우, 일반 유산균으로 콜로니 형성시킨 쥐에 비해서, 숙주의 자유지방산 섭취가 각각 35% 와 47% 줄어드는 것을 볼 수가 있다. 이는 FARM1 및 FARM2가 쥐의 소장관 내에서 흡수 가능한 자유 지방산을 줄여줌으로써 결국 숙주로 섭취되는 음식물 칼로리 양을 줄여주는 결과를 의미한다.
자유지방산의 흡수능력이 증가된 소장관 내 유산균에 의한 칼로리 섭취 감소가 비만에 미치는 효과
소장관 내의 FARM에 의한 칼로리 섭취감소가 비만에 미치는 효과를 보기 위해서 비만 쥐에게 22주 동안 FARM으로 발효시킨 요구르트를 섭취시켰다. 일반유산균 또는 FARM 유산균을 발효시켜 1㎖ 당 109 CFU를 함유하고 있는 요구르트 3㎖을 매일 섭취시키게 되면 4주 후에 쥐의 소장관 내에 유산균이 콜로니형성(colonization)하게 된다. 예상한 바와 같이 정상유산균을 섭취시킨 쥐와 비교해서 FARM1 및 FARM2 유산균을 섭취시킨 쥐는 몸무게 증가가 각각 15%와 19%로 줄어드는 효과를 나타내었다. 포유동물에서 칼로리 과다섭취는 내장지방으로 대부분 축적되기 때문에 몸무게 증가는 내장지방 증가량과 비례한다. 따라서 유산균 급이실험 종료일에 open-type 0.3 Tesla MRI을 이용해서 쥐의 내장지방을 MRI로 측정하였다. 비처리대조군, 일반유산균을 섭취시킨 쥐 실험군, FARM1을 섭취시킨 쥐 실험군, FARM2를 섭취시킨 쥐 실험군의 내장지방양은 각각 27%, 24%, 14%, 그리고 13% 였다. 이 결과는 FARM이 숙주의 소장관 내에 콜로니형성(colonization)을 하면 FARM이 소장관 내의 자유지방산 흡수를 줄여주어 결국 숙주의 체중증가와 체지방 축적을 막아주는 효과를 가지는 것을 의미한다. 숙주의 자유지방산 섭취/흡수량을 줄여줌으로써 칼로리 섭취 감소로 인해 내장지방과 체중을 줄여주는 것이다.
대사성 증후군과 관련되어 있는 혈청 내 생화학 분석
비만은 인슐린 저항성, 글루코오스 내성, 고지혈증, 심혈관질환 등 대사성 증후군(syndrome)과 밀접하게 연관되어 있다. 따라서 유산균 급이 실험 종료일에 대사성 증후군과 관련되어 있는 혈청 내 생화학 분석을 하였다. 유산균을 전혀 섭취시키지 않은 대조군과 일반 유산균을 섭취시킨 쥐에서의 TG, TC 및 LDL-콜레스테롤양은 FARM1과 FARM2를 섭취시킨 쥐에서 보다 높았다. 반면 예상한 바와 같이 HDL 콜레스테롤 수치는 대조군에서는 낮았으나 FARM 그룹에서는 높았다. 항비만 효과를 보여준 FARM 유산균은 예상과 같이 당뇨에서도 뛰어난 효과를 보였다. FARM1과 FARM2를 섭취시키게 되면 유산균을 전혀 섭취시키지 않은 대조군에 비해서 혈청 인슐린 수치가 각각 23%와 30% 감소하였다. 혈청 렙틴(leptin) 수치 역시 유산균을 전혀 섭취시키지 않은 대조군에 비해서 FARM1과 FARM2는 각각 20%와 45% 감소하였다. 혈청 글루코스 수치 역시 유산균을 전혀 섭취시키지 않은 대조군과 일반 유산균을 섭취시킨 쥐의 경우 122.1 ㎎/dl 과 123.4 ㎎/dl인데 비해 FARM1과 FARM2를 섭취시킨 쥐에서는 각각 107.6 ㎎/dl 과 108.4 ㎎/dl 정도로 감소한 것으로 나타났다. 체중이 증가함에 따라 인체는 렙틴과 인슐린에 대한 감수성이 줄어들게 되고 동시에 혈청 지질 프로파일은 악화되는데 이로 인해 렙틴(leptin), 인슐린, 글루코오스, LDL 콜레스테롤, 총콜레스테롤(total cholesterol)의 혈중 농도가 증가하게 된다. 이러한 결과는 FARM 유산균이 체중 증가를 막아줌으로써 혈중 지질 프로파일을 개선하고 인슐린과 렙틴의 내성을 저해하는데 효과적이라는 것을 보여준다. 또한 FARM 유산균이 비만 치료제로서 우수한 성질을 가지고 있다는 것을 보여준다.
자유지방산의 흡수능력이 증가된 유산균의 항비만 치료제로서의 가능성
FARM을 콜로니형성(colonization)시킨 쥐는 자유 지방산의 섭취를 감소시키고 그 결과 체중 증가와 내장 지방 축적을 막아주는 우수한 특성을 가지고 있기 때문에, 자유 지방산 섭취능이 개선된 FARM 유산균의 항비만 치료제로서의 가능성을 실험하였다. FARM2 유산균을 이용하여 EMS(ethylmethane sulfonate)로 3차 돌연변이를 시킴으로써 자유지방산 섭취능이 더욱 향상된 유산균주를 발굴하였다. 발굴된 3차 돌연변이주 FARM3는 일반 유산균보다 자유지방산 섭취능이 5.0배 이상 개선된 균주로, 락토바실러스 애시도필러스 FARM3(fatty acid robbing microbe 3)로 명명하였으며, 이를 2009년 5월 19일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에에 수탁번호 KCTC 11515BP로 기탁하였다. 본 발명에서는 이를“FARM3”로 약칭한다. FARM3로 발효시킨 요구르트를 날마다 매일 3㎖씩 쥐에게 4주 동안 섭취시키게 되면 일반 유산균을 섭취시킨 대조군에 비해서 체중이 18% 이상 감소하는 결과가 나타났다. 이러한 FARM3의 체중감소 정도는 현재 의약품으로 쓰이고 있는 오리스탯과 유사한 수준이다. 그리고 오리스탯과는 달리 FARM3의 경우는 섭취 시 체중의 효과적인 감소 이외에 지방변과 같은 부작용을 보이지 않았다. 이것은 FARM3가 안전하면서도 효과적인 비만 치료제로 개발될 수 있는 의약품 소재라는 것을 의미한다. 본 발명에서는 유산균 FARM3를 가지고 실험하였으나, 본 발명의 기술사상이 FARM3나 유산균에 한정되는 것은 아니다. 비만치료에 관한 본 발명의 기술사상은 포유류, 특히 사람의 위장관 내에서 서식할 수 있고 자유지방산 흡수능이 있는 미생물이라면 모두 적용될 수 있는 것으로, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.
[ 실시예]
이하 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
시약
시약은 다음을 제외하고는 시그마(Sigma)로부터 구입하여 사용하였다.
[1-14C]-palmitic acid : PerkinElmer Life Sciences
liquid scintillation cocktail (LSC) : PerkinElmer Life Sciences
[carboxyl-14C]-triolein : Research Products International
Man-Rogosa-Sharpe (MRS) : Difco
오리스탯(Xenical) : Roche
The sterilizable 384-well plate and 384-pin replicator : Nunc
Membrane semi-dry system : Bio-Rad
X-ray film : Kodak
Gel-Pro analyzer software : Media cybernetics.
혐기배양 : BBL Gas-Pack anaerobic systems의 혐기성 쟈(anaerobic jar)에서 수행됨.
Male Sprague-Dawley (SD) rats : Dae Han Biolink Co., Ltd.
MRI images 는 Bruker Biospec 47/40 4.7-Tesla instrument (Bruker)로 얻고, Image J (NIH)으로 분석됨.
Serum : 각각 Rat/Mouse ELISA kit (LINCO research), Leptin ELISA kit (R D System), a blood glucose meter (Accu-Chek) 및 cholesterol ELISA kits (Asan Pharm. Co)로 분석됨.
돌연변이를 통한 지방산 흡수능 개선 유산균 개발
L. 애시도필러스 KCTC3179 유산균을 MRS 배지에 접종하여 BBL Gas-Pack에서 pH 7.2, 37℃로 혐기배양하였다. 자유지방산 흡수능이 개선된 FARM 균주를 얻기 위한 돌연변이 실험은 다음과 같이 수행되었다. L. 애시도필러스 KCTC3179 유산균을 24시간 정제배양한 후 액상배양액에 NTG(N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine)을 2 ㎎/㎖ 농도로 첨가하였다. 25℃에서 30분간 배양한 후 MRS broth로 3번 세척하여 MRS broth에 다시 현탁하였다. serial dilution 후 처리된 세포들을 MRS agar plate에 깔고 혐기상태로 37℃에서 48 시간 배양한 후 50 ㎕의 MRS broth가 들어있는 384-well plate 에 접종하여 37℃에서 12시간 혐기배양하였다. 배양이 끝난 후 MRS broth 배양액만 들어있는 384-well plate 와 0.1 nCi/㎖ of 14C- 팔미트산(palmitic acid)이 포함된 MRS broth 배양액이 들어있는 384-well plate로 384-pin replicator를 이용하여 replica 하였다. 복제된 plates는 파라필름으로 싼 후 37℃에서 부드럽게 흔들어 주면서 30분간 배양한 후 14C로 방사능 표지된 배양액 2㎕씩을 각각 나일론 멤브레인으로 옮긴 후 반건조 시스템(semi-dry system)으로 건조시켰다. 건조된 막은 MRS broth로 3번 세척하여 붙어있는 14C-팔미트산을 제거한 후 -80℃에서 3일간 엑스-선 필름(X-ray film)에 노출시켰다. 엑스-선 필름으로부터 얻어진 방사능 정도는 Gel-Pro analyzer software로 분석하여 신호가 강한 콜로니를 선별하였으며 이로부터 최종적으로 지방산 흡수능이 개선된 유산균주를 찾아 FARM1(fatty acid robbing microbe 1)로 명명하였다. 다음으로 FARM1에 위와 같은 방법으로 4NQO(4-nitroquinoline 1-oxide)을 처리하여 FARM2을 얻었으며, 역시 같은 방법으로 FARM2에 EMS(ethylmethane sulphonate)을 처리하여 FARM3을 얻었다.
In vitro 지방산 흡수능 평가
발굴된 유산균주의 지방산 흡수능을 평가하기 위해서 유산균주들을 방사능 표지된 14C 팔미트산(palmitic acid)과 함께 배양한 후 방사능 정도를 측정하였다. 이를 위해 유산균주들을 MRS broth 2 ㎖에 접종한 후 배양하여 대수생장기에 도달한 후 원심분리하여 1 nCi/㎖ 의 농도로 14C-팔미트산이 들어있는 MRS배지에 접종한 후 37℃에서 1시간 배양하였다. 14C로 표지된 세포들을 MRS broth로 3번 세척한 후 MRS broth 1㎖에 현탁하고 그중 0.2㎖을 2㎖의 liquid scintillation cocktail이 들어있는 scintillation vial로 옮겼다. 혼합물은 1분간 vortex 한 후 liquid scintillation spectrophotometry를 이용하여 14C activity를 측정하였다.
유산능 평가
유산균주들을 MRS 배지에서 37℃로 혐기 배양하여 대수생장기에 도달한 후 1 ㎖의 세포배양액을 무균상태의 탈지우유(10%)와 글루코오스(2%)를 함유한 100 ㎖ 에 접종한 후 37에서 배양하면서 24시간 간격으로 pH 변화를 측정하였다. 세포 생장곡선을 측정하기 위해서는 48시간 발효 후 만들어진 요구르트 5 ㎖를 15 ㎖ conical tube로 옮긴 후 vortex하였다. 균질화된 혼합물 1 ㎖를 PBS로 희석하여 희석액 50 ㎕를 MRS 플레이트에 도말하고 48시간 혐기배양한 후 콜로니 수를 세었다.
동물실험
모든 동물실험은 동물관리 및 이용위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 규정에 따라 수행되었다. 체중이 200-220 g 정도인 SD 쥐 수컷을 두 마리씩 우리에 넣고 처음 1주일 동안 일반 사료와 물을 자유 급이하였다. 실험기간 동안 12시간 간격으로 밤낮 조명을 바꾸었으며 온도는 22±1℃, 습도는 40~50%로 일정하게 유지하였다. 일주일 후 쥐들을 한 그룹당 14마리가 되도록 무작위로 분리하여 대조군 (고지방 사료), 3179 그룹 (고지방 사료에 L.acidophilus KCTC3179 유산균 발효 요구르트 섭취군), FARM 그룹(고지방 사료에 L.acidophilus FARM 유산균 발효 요구르트 섭취군)으로 나누었다. 이 실험에 사용된 고지방사료는 일반 쥐사료(complex-carbohydrate 60%, protein 22%, fat 3.5%, fiber 5%, crudeash 8%, calcium 0.6%, andphosphorus 1.2%)에 돼지 lard를 20% 첨가한 특수사료로, 조성은 복합탄수화물 48%, 단백질 17.6%, 지방 22.8%, 섬유소 4%, 재6.4%, 칼슘 0.48%, 인 0.96%로 구성되어 있다. 식이실험을 위한 요구르트는 탈지분유 10%, 설탕 2%와 109/㎖ 이상의 균체농도를 가진 L.acidophilus 배양액 1% 이다. 실험기간 동안 쥐들은 각자 해당하는 식이를 자유롭게 섭취하였으며 발효요구르트 3㎖ 가 구강으로 직접 급이되었다. 체중은 12시간 금식 후 오전 9시에서 1시 사이에 측정되었다.
1. 위장관 집락형성능
쥐에게 각 실험군에 따른 L. acidophilus 발효 요구르트를 8주간 급이한 후 각 실험군으로부터 4마리의 쥐를 무작위로 택하여 에테르(ether)로 마취시킨 후 희생시켰다. 쥐로부터 위와 소장과 같은 위장관 조직을 즉시 수거하여 50 ㎖ conical tubes로 옮긴 후 무균 식염수로 희석하였다. 다음으로 위장관 조직의 내용물을 배출하기 위해 호모게나이저(homogenizer)를 이용하여 균질화한 후 유산균 선별 agar plates(lactobacillus selective agar plates)에 도말하고 48시간 동안 혐기배양하였다. 유산균 선별배지에서 형성된 유산균 콜로니 수를 세어 위장관 내 조직 부위별 log10 CFU per gram(wet weight)으로 계산하였다.
2. FARM 유산균의 비만 유도 억제 효과
긴사슬 구조를 가지고 있는 트리글리세라이드(triglyceride)의 일종인 트리올레인(triolein)을 이용하여 FARM 유산균의 비만 유도 억제 효과 실험이 수행되었다. [14C]로 방사능 표지한 트리올레인을 벤젠용액으로 만들어 -70℃에 보관하여 사용하였다. [14C]로 방사능 표지한 트리올레인 1μCi를 방사능 표지되지 않은 트리올레인과 섞은후 실온에서 질소가스를 이용하여 용매를 휘발시켰다. 트리올레인 혼합물을 유산균을 22주간 섭취시킨 쥐에 쥐체중 100g당 0.5mmol로 급이한 후 10시간 동안 2시간 간격으로 심장천자(cardiacpuncture)로 쥐의 혈액샘플을 수거하였다. 각 혈청으로부터 0.l ㎖를 1.8 ㎖의 LSC에 첨가한 후 liquid scintillation spectrophotometry로 14C activity를 측정하였다. FARM 유산균의 비만유도억제는 각 유산균 발효 요구르트 섭취 쥐에서의 지방산 섭취능 차이로 인한 혈청내 방사능 정도 차이를 측정함으로써 판단하였다.
3. 내장지방의 자기공명영상 측정
내장지방부위의 체지방을 자기공명영상(MRI) 기기로 분석하기 위해 Bruker Biospec 47/40 4.7-Tesla 기기를 사용하였다. 실험에 사용된 쥐는 zoletil (25 ㎎/㎏)과 rompun(10 ㎎/㎏)로 마취하였다. 영상을 얻기 위해 쥐들을 자석판에 위치시키고 body coil을 송신기와 수신기로 사용하여 기록하였다. 내장지방과 피하지방 부위를 측정하기 위해 제 4-5 요추 사이에서 위로 8 ㎝, 아래로 8 ㎝ 부위를 T1강조영상으로 얻었다. 내장지방과 피하지방 부위는 이미지 제이 프로그램(Image J program)으로 분석되었다.
4. 혈청 생화학 분석
실험 쥐들의 혈액이 실험 개시일과 종료일인 22주 후에 수거되어 생화학 분석에 사용되었다. 혈액 채취 전 모든 실험동물은 절식하였으며 에테르로 마취한 상태에서 cardiac puncture로 전 혈액을 얻어내었다. 혈액을 2,000 x g로 4℃에서 10분간 원심분리하여 얻어진 혈청은 분석할 때까지 70°C에 보관하였다. 혈청 생화학 분석을 위해 Rat/Mouse ELISA kit (인슐린), Leptin ELISA kit (렙틴), 혈당 측정기(blood glucose meter), ELISA 키트 (Serum total cholesterol, HDL-cholesterol, LDL-cholesterol, triglyceride) 등이 사용되었다.
5. FARM3 유산균의 항비만 효과
3개월 된 SD 수컷 쥐를 8주 동안 고지방 식이를 하여 평균 몸무게가 425g이 되도록 비만을 유도하였다. 이 쥐들을 한 그룹당 14마리가 되도록 무작위로 분리하여 3179 그룹 (고지방 사료에 L.acidophilus KCTC3179 유산균 발효 요구르트 섭취군), FARM3 그룹(고지방 사료에 L.acidophilus FARM3 유산균 발효 요구르트 섭취군), 오리스탯 그룹(고지방 사료에 Xenical®을 200㎎/㎏ diet로 첨가하여 섭취시킨 군)으로 나누었다. 이후 4주 동안 쥐들은 각자 해당하는 식이를 자유롭게 섭취하였으며 체중은 12시간 금식 후 오전 9시에서 1시 사이에 측정되었다.
6. 통계처리
모든 데이터는 평균값 ± 표준편차로 표시되었으며 ANOVA(analysis of variance) 테스트에 의해 p<0.05 인 경우 통계적으로 유의하다고 판단되었다.
결과
1. 유산균의 지방산 흡수능 및 유산균이 colonization된 숙주의 칼로리 섭취 변화
도 1은 유산균의 지방산 흡수능을 측정한 결과이다. 락토바실러스 애시도필러스 KCTC 3179 (“3179”로 표시됨) 유산균을 NTG(N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine)로 돌연변이시켜 발굴된 FARM1 유산균은 지방산 흡수능이 증가되어 있었다. FARM1 유산균을 4NQO(4-nitroquinoline 1-oxide)로 2차 돌연변이시켜 얻은 FARM2는 FARM1보다 더 개선된 지방산 흡수능을 가지고 있었다. 외부로부터 지방산을 흡수하는 능력 차이는, 1 nCi/㎖ 농도로 14C 방사능 표지된 팔미트산과 유산균을 1시간 배양한 후 유산균의 방사능 정도를 liquid scintillation spectroscopy로 측정하였으며, 표준편차(n=4)로 표시되었다.
도 2는 유산균이 콜로니형성(colonization)된 숙주에서 칼로리 섭취 변화를 측정한 결과이다. FARM 유산균이 콜로니형성(colonization)된 숙주에서 칼로리 섭취의 감소가 확인되었다. SD 쥐에 8주간 FARM 유산균 또는 일반 유산균 L.acidophilus KCTC 3179를 급이하여 위장관(GI tracks)에 유산균을 콜로니형성(colonization)시킨 후 14C-표지된 트리올레인을 섭취시키고 혈액을 채취하여 혈청 내 방사능 정도를 측정함으로써 숙주의 칼로리 섭취 변화를 측정하였다.
도 1 및 2의 결과로부터 FARM 유산균의 지방산 흡수능과 FARM 유산균이 콜로니형성(colonization)된 숙주의 위장관에서 지방 흡수는 반비례하는 것으로 나타났다.
2. 유산능
유산균주들을 무균상태의 glucose (2%)를 함유한 탈지우유 (10%) 100 ㎖ 에 접종하여 37℃에서 요구르트로 발효시켰다. 요구르트로 발효되는 과정에서 유산균의 유산능을 측정하기 위해 pH 변화를 24시간 후, 48시간 후, 72시간 후 측정하였다. 10개 시료의 측정값은 평균값 ± 표준편차로 표시되었다. 결과는 다음 표 1과 같다.
표 1
Figure PCTKR2009003036-appb-T000001
3. 위장관 내 집락형성(colonization) 능력
쥐에게 각 실험군에 따른 L. acidophilus (KCTC3179 또는 FARM) 발효 요구르트를 8주간 급이한 후 위와 소장과 같은 위장관 조직을 수거하여 위장관 내 조직 부위별 log10 CFU per gram(wet weight)을 얻었다. 대조군은 유산균 무처리군이며 5개 시료의 측정값은 평균값 ± 표준편차로 표시되었다. 결과는 다음 표 2와 같다.
표 2
Figure PCTKR2009003036-appb-T000002
4. 식이로 비만을 유도하는 동안 L. acidophilus KCTC3179, FARM1, FARM2의 위장관 내 집락형성(colonization) 능력
쥐에게 각 실험군에 따른 L. acidophilus (KCTC3179 또는 FARM) 발효 요구르트를 4주간 급이한 후 위와 소장과 같은 위장관 조직을 수거하여 위장관 내 조직 부위별 log10 CFU per gram(wet weight)을 얻었다. 대조군은 유산균 무처리군이며 5개 시료의 측정값은 평균값 ± 표준편차로 표시되었다. 결과는 다음 표 3과 같다.
표 3
Figure PCTKR2009003036-appb-T000003
5. 고지방 식이로 유도된 비만에 대한 FARM의 칼로리 섭취 감소 효과
결과는 도 3 내지 5와 같다. 도 3은 실험군의 체중변화를 측정한 결과이다. 몸무게가 200-220 g 정도의 3개월 된 SD 쥐 수컷을 한 그룹당 14마리가 되도록 무작위로 분리하여 대조군(고지방 사료), 3179 그룹(고지방사료에 L.acidophilus KCTC 3179 유산균 발효 요구르트 섭취군), FARM 그룹(고지방사료에 L.acidophilus FARM 유산균 발효 요구르트 섭취군)으로 나누었다. 이후 22주 동안 쥐들은 각자 해당하는 식이를 자유롭게 섭취하였으며 체중변화는 평균값 ± 표준편차로 표시되었다.
도 4는 실험군의 내장지방을 자기공명영상장치(MRI)로 측정하여 분석하여 영상분석프로그램(Image J, USA)으로 분석한 결과이다. 내장 지방양의 변화는 평균값 ± 표준편차로 표시되었다.
도 5는 22주간의 고지방 식이군과 FARM 유산균 섭취군의 내장지방 축적 이미지를 나타낸 것이다.
6. 일반 유산균 KCTC 3179 와 FARM 유산균 급이 후의 혈청 수치 비교 결과
결과는 도 6 내지 8과 같다. 몸무게가 200-220 g 정도의 3개월 된 SD 쥐 수컷을 한 그룹 당 14마리가 되도록 무작위로 분리하여 대조군 (고지방 사료), 3179 그룹(고지방사료에 L.acidophilus KCTC3179 유산균 발효 요구르트 섭취군), FARM 그룹(고지방사료에 L.acidophilus FARM 유산균 발효 요구르트 섭취군)으로 나누었다. 실험 개시일 및 종료일에 채취된 혈액으로부터 얻어진 혈청수치를 분석한 결과는 표준편차로 표시되었다. 도 6은 혈중 지질 농도 변화를 나타낸 것으로, TG는 triglycerides; TC는 total cholesterol; HDL는 high-density lipoprotein cholesterol; LDL은 low-density lipoprotein cholesterol을 나타낸다. 도 7은 혈중 인슐린과 렙틴 농도 변화를 나타낸 것이며, 도 8은 혈당 변화를 나타낸 것이다.
7. 식이로 유도된 비만에 대한 FARM3의 항비만 효과
결과는 도 9 및 10과 같다. 도 9는 FARM3 유산균의 in vitro 지방산 흡수능을 3179 유산균과 비교한 것이다. FARM2 유산균을 EMS(ethylmethane sulphonate)로 3차 돌연변이시켜 얻어진 FARM3는 FARM2 보다 개선된 지방산 흡수능을 가진다. 외부로부터 지방산을 흡수하는 능력 차이는, 1 nCi/㎖ 농도로 14C 방사능 표지된 팔미트산과 유산균을 1시간 배양한 후 유산균의 방사능 정도를 liquid scintillation spectroscopy로 측정하였으며, 표준편차(n=4)로 표시되었다.
도 10은 FARM 유산균이 colonization된 숙주에서 칼로리 섭취의 감소를 보여주는 결과이다. SD 쥐에 8주간 FARM 유산균 또는 일반 유산균 L.acidophilus KCTC3179를 급이하여 위장관(GI tracks)에 유산균을 콜로니형성(colonization)시킨 후 14C-표지된 트리올레인을 섭취시키고 혈액을 채취하여 혈청 내 방사능 정도를 측정함으로써 숙주의 칼로리 섭취 변화를 측정하였다. 먼저, 3개월 된 SD 수컷 쥐를 8주 동안 고지방 식이를 하여 평균 몸무게가 425g이 되도록 비만을 유도하였다.
이 쥐들을 한 그룹 당 14마리가 되도록 무작위로 분리하여 3179 그룹(○, 고지방 사료에 L. acidophilus KCTC3179 유산균 발효 요구르트 섭취군), FARM3 그룹(●, 고지방 사료에 L. acidophilus FARM3 유산균 발효 요구르트 섭취군), 오리스텟 그룹(△, 고지방 사료에 Xenical®을 200 ㎎/㎏ diet로 첨가하여 섭취시킨 군)으로 나누었다. 이후 4주 동안 쥐들은 각자 해당하는 식이를 자유롭게 섭취하였으며 체중변화는 평균값 ± 표준편차로 표시되었다.
[규칙 제26조에 의한 보정 25.06.2009]　
Figure WO-DOC-1
[규칙 제26조에 의한 보정 25.06.2009]　
Figure WO-DOC-2
[규칙 제26조에 의한 보정 25.06.2009]　
Figure WO-DOC-3

Claims (14)

  1. 포유류의 위장관 내에서 서식할 수 있고 자유지방산 흡수능이 있는 미생물을 유효성분으로 함유하는 비만 및 비만으로 야기된 대사성 질환의 예방과 치료를 위한 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 사람의 장내 세균총을 구성하는 미생물 또는 사람의 장관으로부터 유래된 미생물인 약학적 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 미생물은 유산균인 약학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 미생물은 락토바실러스 애시도필러스 FARM1(KCTC 11513BP); 락토바실러스 애시도필러스 FARM2(KCTC 11514BP); 및 락토바실러스 애시도필러스 FARM3(KCTC 11515BP) 중에서 선택된 어느 하나인 약학적 조성물.
  5. 포유류의 위장관 내에서 서식할 수 있고 자유지방산 흡수능이 있는 유산균을 포함하는 비만의 예방 및 개선을 위한 기능성 식품.
  6. 제5항에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 애시도필러스 FARM1(KCTC 11513BP); 락토바실러스 애시도필러스 FARM2(KCTC 11514BP); 및 락토바실러스 애시도필러스 FARM3(KCTC 11515BP) 중에서 선택된 어느 하나인 기능성 식품.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 식품은 요구르트인 기능성 식품.
  8. 자유지방산 흡수능이 있는 락토바실러스 애시도필러스 FARM1(KCTC 11513BP).
  9. 자유지방산 흡수능이 있는 락토바실러스 애시도필러스 FARM2(KCTC 11514BP).
  10. 자유지방산 흡수능이 있는 락토바실러스 애시도필러스 FARM3(KCTC 11515BP).
  11. 포유류의 위장관 내에서 서식할 수 있고 자유지방산 흡수능이 있는 미생물을 투여하여 체내에서의 자유지방산 흡수를 줄여주는 것을 포함하는 비만과 비만으로 야기된 대사성 질환의 예방 및 치료방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 미생물은 사람의 장내 세균총을 구성하는 미생물 또는 사람의 장관으로부터 유래된 미생물인 예방 및 치료방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 미생물은 유산균인 예방 및 치료방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 미생물은 락토바실러스 애시도필러스 FARM1(KCTC 11513BP); 락토바실러스 애시도필러스 FARM2(KCTC 11514BP); 및 락토바실러스 애시도필러스 FARM3(KCTC 11515BP) 중에서 선택된 어느 하나인 예방 및 치료방법.
PCT/KR2009/003036 2009-03-10 2009-06-05 미생물을 이용한 비만 및 비만으로 야기된 대사성 질환의 예방과 치료 WO2010104242A1 (ko)

Priority Applications (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
MX2011009508A MX2011009508A (es) 2009-03-10 2009-06-05 Prevencion y tratamiento de la obesidad y enfermedades metabolicas inducidas por la obesidad mediante el uso de microorganismos.
EP09841555.7A EP2407170B1 (en) 2009-03-10 2009-06-05 Prevention and treatment of obesity and metabolic diseases induced by obesity using microorganisms
BRPI0924418-2A BRPI0924418A2 (ko) 2009-03-10 2009-06-05 Prevention and treatment of metabolic diseases caused by obesity and obesity using microorganisms
US13/255,838 US8986675B2 (en) 2009-03-10 2009-06-05 Compositions and methods for prevention and treatment of obesity and obesity related metabolic syndrome
CN2009801591839A CN102438638B (zh) 2009-03-10 2009-06-05 利用微生物的肥胖及肥胖所引起的代谢性疾病的预防和治疗
JP2011553927A JP5665196B2 (ja) 2009-03-10 2009-06-05 微生物を利用した肥満及び肥満によって引き起こされた代謝性疾患の予防と治療
KR1020117023816A KR101292714B1 (ko) 2009-03-10 2009-06-05 미생물을 이용한 비만 및 비만으로 야기된 대사성 질환의 예방과 치료
CA2755140A CA2755140A1 (en) 2009-03-10 2009-06-05 Compositions and methods for prevention and treatment of obesity and obesity related metabolic syndrome

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2009-0020474 2009-03-10
KR20090020474 2009-03-10

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2010104242A1 true WO2010104242A1 (ko) 2010-09-16

Family

ID=42728512

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2009/003036 WO2010104242A1 (ko) 2009-03-10 2009-06-05 미생물을 이용한 비만 및 비만으로 야기된 대사성 질환의 예방과 치료

Country Status (9)

Country Link
US (1) US8986675B2 (ko)
EP (1) EP2407170B1 (ko)
JP (1) JP5665196B2 (ko)
KR (1) KR101292714B1 (ko)
CN (1) CN102438638B (ko)
BR (1) BRPI0924418A2 (ko)
CA (1) CA2755140A1 (ko)
MX (1) MX2011009508A (ko)
WO (1) WO2010104242A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022131428A1 (ko) * 2020-12-18 2022-06-23 주식회사 엔테로바이옴 오를리스타트 및 아커만시아 뮤시니필라 eb-amdk19 균주를 포함하는 조성물

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6453534B2 (ja) * 2012-09-28 2019-01-16 小林製薬株式会社 脂質代謝促進剤
WO2015003001A1 (en) * 2013-07-01 2015-01-08 The Washington University Methods for identifying supplements that increase gut colonization by an isolated bacterial species, and compositions derived therefrom
WO2015066625A1 (en) 2013-11-01 2015-05-07 Washington University Methods to establish and restore normal gut microbiota function of subject in need thereof
KR102125548B1 (ko) 2015-02-10 2020-06-24 주식회사 지니스 비만 억제능을 갖는 균주 및 이를 함유하는 약학 조성물

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20040027180A (ko) * 2002-09-27 2004-04-01 (주)바이오니아 비만 또는 당뇨병의 예방 및 치료 효과를 갖는 유산균발효 유제품 및 그 제조방법
KR20050059860A (ko) * 2003-12-15 2005-06-21 학교법인 경영교육재단 비만 예방 및 치료용 조성물 및 이의 용도
KR100543114B1 (ko) * 2003-09-15 2006-01-20 주식회사한국야쿠르트 바실러스 서브틸리스 케이와이 912
KR100851586B1 (ko) * 2006-08-18 2008-08-12 이우정 락토바실러스를 유효성분으로 포함하는 비만 억제용 조성물

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0696537B2 (ja) * 1986-05-02 1994-11-30 雪印乳業株式会社 血清コレステロ−ル上昇抑制剤
US6080401A (en) * 1998-11-19 2000-06-27 Reddy; Malireddy S. Herbal and pharmaceutical drugs enhanced with probiotics
JP4580542B2 (ja) * 2000-05-17 2010-11-17 株式會社バイオニア 肥満又は糖尿病治療用微生物及びその微生物を含む医薬組成物
SE529185C2 (sv) * 2005-10-07 2007-05-22 Arla Foods Amba Användning av probiotiska bakterier för tillverkning av livsmedel eller läkemedel för förhindrande av övervikt
RU2008134892A (ru) * 2006-01-27 2010-03-10 Даниско А/С (Dk) Применение пробиотичеких микроорганизмов для лечения и профилактики ожирения и связанных с ним расстройств
JP2008214253A (ja) * 2007-03-02 2008-09-18 Snow Brand Milk Prod Co Ltd 内臓脂肪減少剤
JP2010534074A (ja) * 2007-07-25 2010-11-04 カンピナ ネーデルランド ホールディング ビー．ブイ． 飽和および／または充足を誘発するプロバイオティックス

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20040027180A (ko) * 2002-09-27 2004-04-01 (주)바이오니아 비만 또는 당뇨병의 예방 및 치료 효과를 갖는 유산균발효 유제품 및 그 제조방법
KR100543114B1 (ko) * 2003-09-15 2006-01-20 주식회사한국야쿠르트 바실러스 서브틸리스 케이와이 912
KR20050059860A (ko) * 2003-12-15 2005-06-21 학교법인 경영교육재단 비만 예방 및 치료용 조성물 및 이의 용도
KR100851586B1 (ko) * 2006-08-18 2008-08-12 이우정 락토바실러스를 유효성분으로 포함하는 비만 억제용 조성물

Non-Patent Citations (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Obes. Res.", vol. 6, NATIONAL HEART LUNG AND BLOOD INSTITUTE, pages: 5 1
APPL ENVIRON MICROBIOL., vol. 59, 1993, pages 15
B. S. DREW, A. F. DIXON, J. B. DIXON, VASC. HEALTH RISK MANAG., vol. 3, 2007, pages 817
B. STECHER, W. D. HARDT, TRENDS. MICROBIOL., vol. 16, 2008, pages 107
C. THOMPSON-CHAGOYON, J.MALDONADO, A.GII, DIG. DIS. SCI., vol. 52, 2007, pages 2069
C. THOMPSON-CHAGOYON, J.MALDONADO, A.GIL, DIG. DIS. SCI., vol. 52, 2007, pages 2069
G. A. BRAY ET AL., OBES.RES., vol. 7, 1999, pages 189
ISOLAURI, M. KALLIOMAKI, K. LAITINEN, S. SALMINEN, CURR PHARM DES., vol. 14, 2008, pages 1368
J. O. HILL ET AL., AM.J.CLIN.NUTR., vol. 69, 1999, pages 1108
J. O. HILL, ENDOCR.REV., vol. 27, 2006, pages 750
J.B.HAUPTMAN, F.S.JEUNET, D. HARTMANN, AM. 1. CLIN. NUTR., vol. 55, 1992, pages 309
J.ROLLS, D.J.SHIDE, M. L. THORWART, J. S. ULBRECHT, OBES.RES., vol. 6, 1998, pages 1
MOLAVI, N. RASOULI, P. A. KERN, CURR. OPIN. CARDIOL., vol. 21, 2006, pages 479
MUST ET AL., J.AM.MED.ASSOC., vol. 282, 1999, pages 1523
P. G. KOPELMAN, NATURE, vol. 404, 2000, pages 635
P. J. TUMBAUGH, R. E. LEY, M. A. MAHOWALD, V. MAGRINI, E. R. MARDIS, J. I. GORDON, NATURE, vol. 444, 2006, pages 1027
P. J. TURNBAUGH, F. BACKHED, L. FULTON, J. I. GORDON, CELL HOST MICROBE, vol. 3, 2008, pages 213
R. E. LEY, P.J. TURNBAUGH, S. KLEIN, J. I. GORDON, NATURE, vol. 444, 2006, pages 1022
R. GUERCOLINI, INT. J. OBES. RELAT. METAB. DISORD., vol. 21, 1997, pages 12
R. LEENEN ET AL., AM.J.PHYSIOL., vol. 263, 1992, pages E913
R. S. PADWAL, S. R. MAJUMDAR, LANCET, vol. 369, 2007, pages 71
R. T. SPIOTTA, G. B. LUMA, AM. FAM. PHYSICIAN, vol. 78, 2008, pages 1052
R.PADWAL, SK LI, DC LAU, COCHRANE DATABASESYST.REV., vol. 3, 2003, pages CD004094
S. RAND, J.CHRONICDIS., vol. 40, 1987, pages 911
See also references of EP2407170A4 *
W. H. LIN, C. F. HWANG ET AL., FOOD MICROB., vol. 23, 2006, pages 74
W. JIA, H. LI, L. ZAO, J. K. NICHOLSON, NATURE REV. DRUG DISC., vol. 7, 2008, pages 123
Y. KENO ET AL., INT.J.OBES., vol. 15, 1991, pages 205

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022131428A1 (ko) * 2020-12-18 2022-06-23 주식회사 엔테로바이옴 오를리스타트 및 아커만시아 뮤시니필라 eb-amdk19 균주를 포함하는 조성물

Also Published As

Publication number Publication date
EP2407170A1 (en) 2012-01-18
EP2407170B1 (en) 2015-03-25
US8986675B2 (en) 2015-03-24
KR20120022764A (ko) 2012-03-12
CN102438638B (zh) 2013-12-18
EP2407170A4 (en) 2012-11-21
CN102438638A (zh) 2012-05-02
JP5665196B2 (ja) 2015-02-04
BRPI0924418A2 (ko) 2018-10-16
MX2011009508A (es) 2011-10-24
KR101292714B1 (ko) 2013-08-05
JP2012520292A (ja) 2012-09-06
CA2755140A1 (en) 2010-09-16
US20120121753A1 (en) 2012-05-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11116806B2 (en) Composite probiotic lactic acid bacteria powder and preparation method and use thereof
Yang et al. Lactobacillus acidophilus ameliorates H. pylori-induced gastric inflammation by inactivating the Smad7 and NFκB pathways
Minemura et al. Gut microbiota and liver diseases
WO2021137603A1 (ko) 락토바실러스 플란타럼 균주 및 이를 포함하는 대사질환의 예방 또는 치료용 조성물
Goyal et al. Lactobacillus rhamnosus GG antagonizes Giardia intestinalis induced oxidative stress and intestinal disaccharidases: an experimental study
Pedrosa et al. Survival of yogurt-containing organisms and Lactobacillus gasseri (ADH) and their effect on bacterial enzyme activity in the gastrointestinal tract of healthy and hypochlorhydric elderly subjects
Daniel et al. Selecting lactic acid bacteria for their safety and functionality by use of a mouse colitis model
Shibolet et al. Variable response to probiotics in two models of experimental colitis in rats
Bai et al. Probiotics and inflammatory bowel diseases
JP4350170B2 (ja) ラクトバチルス・カセイ・ラムノススを含む薬学的調製物
WO2017082611A1 (ko) 비만 억제능을 갖는 균주 및 이를 함유하는 약학 조성물
Gaon et al. Effect of lactobacillus strains (L. casei, L. acidophillus strains CERELA) on bacterial overgrowth-related chronic diarrhea
WO2021137602A1 (ko) 락토바실러스 퍼멘텀 균주 및 이를 포함하는 대사질환의 예방 또는 치료용 조성물
WO2021137600A1 (ko) 락토바실러스 퍼멘텀 균주 및 이를 포함하는 대사질환의 예방 또는 치료용 조성물
WO2010104242A1 (ko) 미생물을 이용한 비만 및 비만으로 야기된 대사성 질환의 예방과 치료
WO2018030732A1 (ko) 바실러스 속 세균 유래 나노소포 및 이의 용도
WO2021194040A1 (ko) 간기능 개선 또는 지방축적 억제 미생물 및 그의 용도
Frizzo et al. Intestinal populations of Lactobacilli and coliforms after in vivo Salmonella dublin challenge and their relationship with microbial translocation in calves supplemented with lactic acid bacteria and lactose
WO2015088227A1 (ko) 신규한 유산균 및 이를 포함하는 영유아의 설사병 예방 또는 치료용 조성물
WO2019117654A1 (ko) 신장질환 진행 억제 및 예방용 프로바이오틱스 및 이를 포함하는 신장질환 진행 억제 및 예방용 조성물
WO2018014833A1 (zh) 脆弱拟杆菌在制备抑制艰难梭菌粘附的组合物中的应用
Guo et al. Screening of bile salt hydrolase-active lactic acid bacteria for potential cholesterol-lowering probiotic use
WO2020045972A1 (ko) 항비만 활성을 갖는 인체 유래 락토바실러스 퍼멘툼 엠지4231 또는 락토바실러스 퍼멘툼 엠지4244 균주 및 이를 포함하는 조성물
Kim et al. Genomic and Toxicity Studies on Bifidobacterium bifidum IDCC 4201 and Bifidobacterium longum IDCC 4101 Isolated from Feces of Breast-Fed Infants
Mojgani et al. Invitro and Invivo Analysis of Human Milk Lactic Acid Bacteria Isolates for Their Anti-hypercholesterolemia Actions

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200980159183.9

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 09841555

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2011553927

Country of ref document: JP

Ref document number: 2755140

Country of ref document: CA

Ref document number: MX/A/2011/009508

Country of ref document: MX

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 12011501821

Country of ref document: PH

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 7641/DELNP/2011

Country of ref document: IN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2009841555

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20117023816

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13255838

Country of ref document: US

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: PI0924418

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: PI0924418

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20110909