MX2011009508A - Prevencion y tratamiento de la obesidad y enfermedades metabolicas inducidas por la obesidad mediante el uso de microorganismos. - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con la prevención y el tratamiento de la obesidad y de enfermedades metabólicas inducidas por la obesidad, particularmente la prevención y el tratamiento de la obesidad por el cambio de la flora intestinal. En la presente invención se descubrió que las características de las bacterias intestinales se transforman por la administración de una preparación de microorganismos que mejora la capacidad que tienen las bacterias para absorber ácidos grasos libres, y de esta manera la absorción de ácidos grasos libres en el tracto gastrointestinal disminuye por la introducción de las mismas. Se provee un método para prevenir y tratar la obesidad y enfermedades metabólicas inducidas por la obesidad, una composición farmacéutica y un alimento funcional para la prevención y el tratamiento de las mismas, y una cepa de Lactobacillus modificada útil para dichos propósitos que se basa en estos resultados experimentales. La presente invención muestra un efecto de pérdida de peso igual al del Orlistat el cual se utiliza ampliamente como un agente terapéutico contra la obesidad. La presente invención muestra que la absorción de ácidos grasos en el tracto gastrointestinal se bloquea mejorando las características de las bacterias intestinales y su transplante, permitiendo así el tratamiento de la obesidad.

Description

PREVENCION Y TRATAMIENTO DE LA OBESIDAD Y ENFERMEDADES METABÓLICAS INDUCIDAS POR LA OBESIDAD MEDIANTE EL USO DE MICROORGANISMOS CAMPO TÉCNICO La presente invención se relaciona con composiciones y métodos para la prevención y el tratamiento de la obesidad y del síndrome metabólico relacionado con la obesidad mediante el uso de microorganismos.

TECNICA ANTECEDENTE La obesidad es una enfermedad epidémica, estigmatizada y costosa, que rara vez es curable y su prevalencia está aumentando en la mayor parte del mundo. Representa un riesgo mayor para varias enfermedades crónicas serias. El exceso de peso representa riesgos mayores para varias enfermedades metabólicas serias, tales como hipertensión, diabetes tipo II, dislipidemia , arterieesclerosis, enfermedad cardiaca isquémica, esteatosis hepática, cálculos biliares, osteoartritis , cánceres reproductivos y gastrointestinales, y apnea del sueño .

Los productos de prescripción principal actualmente aprobados para la obesidad son sibutramina (Meridia® de Abbott) y orlistat (Xenical™ de Roche) . La sibutramina inhibe la recaptación de noradrenalina y serotonina, controlando el apetito y por lo tanto disminuyendo la ingesta de alimento. Sin embargo, la sibutramina tiene efectos secundarios bien conocidos asociados con propiedades simpaticomimeticas, afectando la frecuencia cardiaca y la presión sanguínea. En contraste con la sibutramina, el orlistat actúa localmente. El orlistat es un inhibidor de lipasa gástrica y pancreática que previene la hidrólisis de grasas, reduciendo por lo tanto la absorción de grasa dietética en aproximadamente 30%. Sin embargo, la grasa no digerida a lo largo del tracto gastrointestinal provoca efectos secundarios, los cuales no solo son incómodos sino también socialmente inaceptables. Por lo tanto, necesita encontrarse activamente un nuevo tipo de tratamiento contra la obesidad debido a que los medicamentos farmacéuticos actuales no son ideales para el tratamiento de la obesidad.

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DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Problema Técnico La evidencia reciente mostró que la microflora intestinal juega un papel complejo en la regulación del peso corporal (11-13). Los experimentos de trasplante de la microflora de ratones obesos y delgados en ratones libres de microbios también demostraron que el cambio en la composición de la microflora en el tracto gastrointestinal (GI) dio como resultado diferencias en la eficiencia de la extracción calórica del alimento, que eventualmente contribuyeron a diferenciales de pesos corporales (12, 13). Estos resultados sugieren que cambios pequeños en la extracción calórica en el tracto GI por bacterias intestinales manipuladas xenobióticamente pueden dar lugar a una reducción significativa en el peso corporal. Dado que la grasa se degrada como ácido graso (FA, por sus siglas en inglés) antes de absorberse en el cuerpo, la remoción de FA en el tracto GI por el trasplante de una bacteria extractora de FA podría ser una idea para disminuir la captación de grasa por el cuerpo del huésped para tratar la obesidad. De hecho, la reducción de la captación de grasa dietética en el cuerpo por remoción de FA disponible es ufta mejor elección que inhibir la hidrólisis de grasa que resulta en un problema inevitable de grasa no digerida.

Un objeto de la presente invención es ofrecer la prevención o el tratamiento de la obesidad y el síndrome metabólico relacionado con la obesidad mediante el uso de microorganismos. Particularmente, la presente invención proporciona un método y composiciones farmacéuticas para reducir la ingesta dietética de grasa eliminando los ácidos grasos para absorción. Otro objeto de la presente invención es proporcionar composiciones farmacéuticas para la obesidad sin efectos secundarios, a diferencia de los medicamentos farmacéuticos actuales, sibutramina y orlistat .

Solución Técnica En la presente invención se mutagenizó una cepa probiótica de Lactobacillus acidophilus para aislar un mutante que tiene una capacidad mejorada para la eliminación de FA. La administración de este microbio absorbedor de ácidos grasos, FARM (por sus siglas en inglés), a ratas dio como resultado la pérdida de peso que fue igual a la ocasionada por el farmacéutico contra la obesidad más popular, Orlistat™. Por lo tanto, la presente invención proporciona un método para reducir la absorción de FA en el tracto GI por la administración de una cepa probiótica con capacidad mejorada para la absorción de FA y por lo tanto su eliminación del tracto GI del huésped. La presente invención proporciona un medicamento microbiano para la obesidad.

Con base en datos experimentales, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para la prevención o el tratamiento de la obesidad y del síndrome metabólico relacionado con la obesidad, que comprende microorganismos que pueden colonizarse y extraer ácidos grasos libres en el tracto gastrointestinal de mamíferos. Preferentemente, los microorganismos son de la microflora intestinal o se derivan de la microflora intestinal. Más preferentemente, los microorganismos son cepas probióticas.

En los ejemplos de la presente invención, se obtienen Lactobacillus acidophilus FARM1 KCTC 11513BP, Lactobacillus acidophilus FARM2 KCTC 11514BP, Lactobacillus acidophilus FARM3 KCTC 11515BP a partir de una cepa probiótica comercial de Lactobacillus acidophilus, mejorando su capacidad de absorción de FA.

La presente invención proporciona un FARM el cual puede colonizarse en el tracto GI y tiene una capacidad de absorción de FA mejorada como ingrediente activo de un suplemento dietético para la prevención o el tratamiento de la obesidad y del síndrome metabólico relacionado con la obesidad.

En la presente invención, el "suplemento dietético" se refiere a cualquier alimento con una función de salud específica además de su función nutriente, incluyendo nutracéuticos , alimento funcional, alimento diseñado, alimento saludable. El propósito del suplemento dietético en la presente invención es prevenir o tratar la obesidad y el síndrome metabólico relacionado con la obesidad .

La presente invención también proporciona un FARM que puede colonizarse en el tracto GI y tiene una capacidad de absorción de FA mejorada, es decir, Lactobacillus acidophilus FARM1 KCTC 11513BP, Lactobacillus acidophilus FARM2 KCTC 11514BP, Lactobacillus acidophilus FARM3 KCTC 11515BP.

La presente invención también proporciona un método para tratar la obesidad y el síndrome metabólico relacionado con la obesidad mediante la administración del FARM el cual puede colonizarse en el tracto GI y tiene capacidad de absorción de FA mejorada. La presente invención proporciona un método efectivo para la obesidad y el síndrome metabólico relacionado con la obesidad que reduce la ingesta de energía dietética después de la administración del FARM.

Efectos Ventajosos La ingesta calórica adicional de la grasa dietética es el determinante más importante de la obesidad lo cual puede observarse del rápido incremento en países subdesarrollados . Para-, la vasta mayoría de los humanos, incluso una ingesta calórica que excede 1% más del gasto calórico resulta en la acumulación de grasa corporal, lo cual da lugar a la obesidad.

La presente invención demostró que el trasplante del Lactobacillus manipulado xenobióticamente , FARM, extrae activamente FA en el GI para limitar la ingesta calórica del huésped, lo cual mostró un efecto contra la obesidad como el del medicamento farmacéutico contra la obesidad más popular, el Orlistat™. Además, el FARM como un medicamento contra la obesidad tiene ventajas obvias con respecto a los farmacéuticos actuales para la obesidad. En primer lugar, no actúa en el cerebro, sino que actúa periféricamente y, por lo tanto, tiene un perfil de riesgo-beneficio superior con respecto a los medicamentos que actúan centralmente, tal como la sibutramina. En segundo lugar, el FARM no actúa en la hidrólisis de lipidos que ocasiona el inevitable efecto secundario del tracto GI tal como incontinencia fecal y secreciones grasosas. En tercer lugar, el FARM es una cepa de Lactobacillus que es un probiótico benéfico y conlleva una seguridad considerable como un candidato de medicamento .

Dado que la microflora intestinal está asociada con varias enfermedades complejas tales como enfermedad infecciosa, obesidad, cáncer, enfermedades alérgicas, etc., el trasplante de bacterias intestinales vivientes modificadas xenobióticamente en un huésped tiene un fuerte potencial para tratar las varias enfermedades relacionadas con la microflora. La presente invención también demostró la hipótesis de que el trasplante de bacterias intestinales manipuladas específicamente puede cambiar con éxito la 52-734 flora microbiana en el tracto GI para tratar las enfermedades de huéspedes.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 es una gráfica que ilustra la capacidad de extracción de ácidos grasos del Lactobacillus FARM de conformidad con la presente invención.

La figura 2 es una gráfica que ilustra el cambio de la ingesta calórica por un huésped colonizado con Lactobacillus FARM de conformidad con la presente invenció .

La figura 3 es una gráfica que ilustra el cambio en el peso corporal de un huésped colonizado con Lactobacillus FARM de conformidad con la presente invención.

La figura 4 muestra el análisis de grasa visceral del huésped colonizado con Lactobacillus FARM medida usando MRI y analizada con un programa de análisis de imágenes (Image J, EE.UU.), de conformidad con la presente invención.

La figura 5 muestra imágenes de MRI de la acumulación de grasa visceral de las ratas alimentadas con una dieta elevada en grasas y con FARM diariamente después de 22 semanas de conformidad con la presente invención.

La figura 6 muestra un cambio en los perfiles de 52-734 lipidos en el plasma en ratas de conformidad con la presente invención. TG, se refiere a triglicéridos ; TC se refiere a colesterol total; HDL se refiere a colesterol de lipoproteina de alta densidad; LDL se refiere a colesterol de lipoproteina de baja densidad.

La figura 7 muestra un cambio de las concentraciones de insulina y de leptina en el plasma en ratas de conformidad con la presente invención.

La figura 8 muestra un cambio de concentraciones de glucosa en la sangre en ratas de conformidad con la presente invención.

La figura 9 ilustra la comparación de la capacidad de absorción de FA in vitro del Lactobacillus FARM de conformidad con la presente invención.

La figura 10 ilustra la reducción de la ingesta calórica por medio de Lactobacillus FARM o de Orlistat de conformidad con la presente invención.

MEJOR MODO Cepa de FARM con capacidad de absorción de FA mejorada Se mutagenizó una cepa probiótica comercial de Lactobacillus acidophilus KCTC 3179 por medio de N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) para aislar mutantes que tienen la mayor capacidad de absorción de FA. Inicialmente aislamos un mutante gue absorbe/sustrae 2.1 veces más 52-734 ácidos grasos del ambiente circundante que la cepa de tipo silvestre. El mutante identificado, el microbio absorbedor de ácidos grasos 1 ( FARM1 ) se depositó como KCTC 11513BP en la Colección Coreana para Cultivos de Tipos el 19 de mayo de 2009. FARMl se mutagenizó de nuevo por medio de 1-óxido de nitroquinolina (4NQO) para aislar un mutante, FARM2, con más extracción mejorada del FA libre. FARM2 se depositó como KCTC 11514BP en la Colección Coreana para Cultivos de Tipos el 19 de mayo de 2009. La mutagénesis produjo el mutante FARM2 que absorbió ácido palmitico marcado con 14C hasta 3.1 veces más que la cepa de tipo silvestre. Con las cepas de FARM identificadas, se examinaron las capacidades de acidificación durante su crecimiento y colonización en el tracto gastrointestinal de huéspedes después del consumo, dado que éstas son las características más importantes del Lactobacillus comestible. Ambos mutantes, FARMl y FAR 2 , mantuvieron un crecimiento normal y la actividad de acidificación durante la fermentación de yogur. Las cepas de mutantes también se colonizaron con éxito en el tracto GI de ratas después de la administración de mutantes como una forma de yogur. Estos resultados indican que tanto FARMl como FARM2 funcionan como un Lactobacillus normal excepto por su capacidad de extracción mejorada de FA. 52-734 Reducción de la ingesta calórica por el huésped que se colonizó con FAR s que extraen FA libre en el tracto GI Las bacterias intestinales con capacidad mejorada para la extracción de FA pudieron colonizar el intestino delgado, en donde la mayoría de las FA son absorbidas en el cuerpo. El FARM pudo remover activamente FA en el intestino delgado y funciona como un biosecuestrante, dando como resultado la remoción de FA que están disponibles para ser absorbidos por el cuerpo del huésped. Subsiguientemente, los FA secuestrados por bacterias de rápida extracción de FA gradualmente se transferirían al intestino grueso para excreción fecal, reduciendo así la extracción calórica por el huésped.

Para probar si los FARM realmente extraen ácido graso en el tracto GI del huésped para reducir la extracción calórica del cuerpo del huésped, alimentamos los yogures fermentados con FARM en ratas durante 8 semanas para colonizar el tracto GI de las ratas. Después de colonizar el tracto GI de ratas con FARM y Lactobacillus normal, se administró oralmente trioleína marcada con 1C a ratas para evaluar la absorción de FA en las ratas por medición de la radioactividad de FA, del producto digerido de trioleína marcada con 14C, en su sangre. Las ratas colonizadas con FARM mostraron mayor capacidad de extracción de FA de su ambiente circundante mostrando a la 52-734 vez menor capacidad de captación de FA de su cuerpo en una forma dependiente de la dosis. Las ratas colonizadas con FARM1 y FARM2 redujeron la absorción de FA hasta en 35% y 47%, respectivamente, en comparación con ratas colonizadas con Lactobacillus de tipo silvestre. Este resultado implica que tanto FARM1 como FAR 2 extrajeron con éxito FA absorbible en el tracto GI de las ratas, reduciendo con ello la extracción calórica por el cuerpo del huésped.

Efecto de la extracción calórica en la obesidad mediante FARM en el tracto GI Se evaluó el efecto de la extracción calórica en la obesidad por medio de FARMs en el tracto GI mediante la alimentación de yogur fermentado con FARM a ratas macho durante 22 semanas mientras se inducía la obesidad a través de la dieta. La administración diaria de 3 mi de yogur con un contenido de aproximadamente 109 CFU por sus siglas en inglés, por mi de L. Acidophilus tipo silvestre o FARM, dio como resultado la colonización exitosa en el tracto GI de las ratas después de 4 semanas. Como se esperaba, la colonización de FARM1 y FARM2 en las ratas redujo la ganancia de peso corporal hasta en 15% y 19%, respectivamente, en comparación con las ratas colonizadas con la cepa 3179.

La ingesta calórica adicional en mamíferos se 52-734 acumula principalmente como grasa visceral de tal manera que la grasa visceral se correlaciona con el peso corporal total. En este trabajo, medimos el área de grasa visceral usando MRI de 0.3 Teslas de tipo abierto al final de los experimentos de alimentación. El contenido de grasa visceral de las ratas de control sin alimentación de Lactobacillus y de ratas colonizadas con L. Acidophilus de tipo silvestre, FARMl o FARM2 fueron de 27%, 24% 14% y 13%, respectivamente. Estos resultados mostraron claramente que la colonización del tracto GI de ratas con FARM redujo tanto la ganancia de peso corporal como la acumulación de grasa visceral, indicando que los FARM en realidad absorben FA en el tracto GI del huésped. Consecuentemente, reduce la ingesta de FA por el huésped, reduciendo con ello la acumulación de grasa visceral y la ganancia de peso corporal .

Análisis de los parámetros bioquímicos de suero en relación con el síndrome metabólico Dado que la obesidad está asociada con el síndrome metabólico tal como resistencia a la insulina, tolerancia a la glucosa, dislipidemi , enfermedad de la arteria coronaria, etc., se analizaron los parámetros bioquímicos del suero en relación con el síndrome metabólico al final de los experimentos de alimentación. 52-734 Los niveles de TG, TC y colesterol LDL en las ratas de control sin alimentación de Lactobacillus y ratas colonizadas con L. Adophilus tipo silvestre 3179, fueron mayores que en los grupos de FARM1 y FARM2 mientras que los niveles de colesterol HDL se invirtieron, fueron bajos en los grupos de control pero altos en los grupos FARM. Las cepas de FARM también mostraron un efecto antidiabético como se esperaba de su efecto contra la obesidad. La alimentación de FARM1 y FARM2 redujo significativamente los niveles de insulina en suero en aproximadamente 23% y 30%, respectivamente, en comparación con el control no tratado. Asimismo, FARM1 y FARM2 redujeron significativamente los niveles de leptina promedio en suero a 20% y 45%, respectivamente, en comparación con el control no tratado. Los niveles de glucosas en suero fueron ligeramente menores en los grupos FARM1 y FARM2 (107.6 mg/dl y 108.4 mg/dl), en comparación con el no tratado y el control 3179 (122.1 mg/dl y 123.4 mg/dl) . Cuando el cuerpo gana peso, se sabe que el cuerpo se hace menos sensible a la leptina y la insulina asi también empeora el perfil de lipidos en él plasma, lo cual da lugar a mayores concentraciones de leptina, insulina, glucosa, colesterol LDL y colesterol total en el plasma. Nuestros resultados mostraron que FARM es efectivo en inhibir la insensibilidad de la insulina y leptina y mejora el perfil de lipidos en la sangre 52-734 inhibiendo la ganancia de peso corporal. Los análisis bioquímicos en sueros de ratas solidifica el potencial del FARM como un tratamiento efectivo para la obesidad.

Posibilidad de usar FARM como medicamento contra la obesidad Debido a que los ratones colonizados con FARM mostraron una reducción en la absorción de FA por el huésped inhibiendo eventualmente la ganancia en peso corporal y la acumulación de grasa visceral, exploramos la posibilidad de usar FARM como un medicamento viviente contra la obesidad para la obesidad inducida por dieta después del mejoramiento adicional de la capacidad de absorción de FA libre del FARM. FARM2 se sometió a mutagénesis de tercer ciclo con EMS para generar Lactobacillus con mejor capacidad de extracción de ácidos grasos. Fuimos capaces de aislar un mutante, FARM3 que extrae ácido graso libre 5 veces más rápido que la cepa de tipo silvestre. FARM3 se depositó como KCTC 11515BP en la Colección Coreana para Cultivos de Tipos el 19 de mayo de 2009.

La administración diaria de 3 mi de yogur fermentado con FARM3 a ratas SD macho durante 4 semanas dio como resultado la reducción del peso corporal en aproximadamente 18%, en comparación con el grupo de 52-734 alimentación de Lactobacillus 3179 de tipo silvestre. El grado de reducción del peso corporal por medio de FARM3 fue básicamente similar al de la rata a la cual se le administró una dosis farmacéuticamente efectiva de Orlistat. Además de la reducción efectiva del peso corporal, las ratas alimentadas con FARM3 no produjeron secreciones grasosas a diferencia del grupo alimentado con Orlistat™. Estos resultados implican que FARM3 puede usarse como un médicamente viviente contra la obesidad que no solo es seguro sino también efectivo como muchos de los medicamentos farmacéuticos.

El aspecto tecnológico de la presente invención no se limita a FARM o probióticos. Está claro para todos aquellos con conocimientos generales que el aspecto tecnológico de la presente invención puede aplicarse a cualquier microbio que pueda colonizar el tracto GI de mamíferos, especialmente humanos y contribuye a la reducción en la ingesta de grasa dietética.

Ejemplo La presente invención puede entenderse mejor con referencia a los ejemplos anexos que tienen como propósito solo la ilustración y no debe considerarse que limitan el alcance de la invención, como se define por medio de las reivindicaciones adjuntas. 52-734 Reactivos Los reactivos fueron de Sigma, excepto: ácido palmitico [1-14C] (PerkinElmer Life Sciences), cóctel de centelleo liquido (LSC, por sus siglas en inglés, PerkinElmer Life Sciences), [carboxil-14C] -trioleina (Research Products International), Man-Rogosa-Sharpe (MRS, Difco) , Orlistat (Xenical™, Roche) . La placa con 384 receptáculos esterilizable y el replicador de .384 puntas fueron de Nunc . El sistema de membrana semiseco fue de Bio-Rad. La película de rayos X fue de Kodak. El software Gel-Pro Analyzer fue de Media Cybernetics . L. acidophilus KCTC3179 es una cepa de Lactobacillus derivada de humanos de la Colección de Tipos de Cultivo de Corea (KCTC, por sus siglas en inglés) . El cultivo Anaeróbico se llevó a cabo en una jarra anaeróbica (sistemas anaeróbicos BBL Gas-Pack) . Se obtuvieron ratas Sprague-Dawley (SD) macho de Dae Han Biolink Co. , Ltd. Se obtuvieron imágenes de MRI con un instrumento Bruker Biospec 47/40 de 4.7 Tesla (Bruker) y se analizó con Image J (NIH) . Se analizó suero con un kit ELISA para Ratas/Ratones (LINCO Research), un kit ELISA para leptina (R D System) , un medidor de glucosa en la sangre (Accu-Chek) , y kits ELISA para colesterol (Asan Pharm. Co) , respectivamente. 52-734 Obtención de FARM a partir de mutagénesis Se cultivaron estadísticamente células de Lactobacillus KCTC3179 en medio MRS, pH de 7.2, a 37 °C en BBL Gas-Pack para cultivo anaeróbico en este experimento, indicado anteriormente. Se efectuó una mutagénesis química del Lactobacillus KCTC3179 como se describe más adelante para obtener un mutante FARM1. Después de 24 horas de cultivo del Lactobacillus KCTC3179, se añadió la N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) hasta una concentración final de 2 mg/ml en el caldo de MRS conteniendo células KCTC 3179. Después de agitar a 25°C durante 30 minutos, se lavaron los Lactobacillus tres veces con caldo de MRS fresco y se resuspendieron en el caldo de MRS fresco. Después de una dilución en serie, las células tratadas se dispersaron sobre una placa de agar de MRS y se incubaron a 37°C bajo condiciones anaeróbicas. Después de 48 horas, las colonias de mutantes se transfirieron a un receptáculo separado de una placa de 384 receptáculos conteniendo 50 µ? de caldo de MRS. Las colonias inoculadas se cultivaron bajo condiciones anaeróbica a 37°C sin agitación. Después de incubar durante toda la noche, la placa se replicó usando un replicador de 384 puntas en dos nuevas placas, una cón caldo de MRS fresco y otra con el mismo caldo conteniendo 0.1 nCi/ml de 1<3C-ácido palmítico. Después, las placas se envolvieron con película Parafilm y se incubaron a 37 *C 52-734 durante 30 minutos con agitación suave. Después de la incubación, se transfirieron 2 µ? del cultivo marcado Con 14C en cada receptáculo con un replicador de 384 puntas sobre una membrana de nylon. Después de secar la membrana con el sistema semiseco, se removió el 1 C-ácido palmitico libre en las manchas bacterianas sobre la membrana por lavado con caldo de MRS tres veces. La membrana lavada se expuso a una película de rayos X a -80°C durante 3 días. Después del desarrollo, la película de rayos X se escaneó y se analizó la densidad de puntos relativa con el software Gel-Pro Analyzer. Se seleccionaron colonias de alta densidad de puntos y se identificó la cepa con la mayor capacidad de extracción/sustracción de ácidos grasos y se nombró como el microbio absorbedor de ácidos grasos 1 (FARM1) . Después de obtener FARM1 de la mutagénesis con NTG, se trató FARM1 con 1-óxido de 4-nitroquinolina (4NQO, por sus siglas en inglés) para la generación del mutante de segundo ciclo FARM1 y el FARM2 se trató con sulfonato de etilmetano (EMS, por sus siglas en inglés) para generar el mutante de tercer ciclo FARM3, respectivamente.

Evaluación de la capacidad de extracción de ácido graso in vitro Para evaluar la capacidad de extracción de ácido graso in vitro de la cepa identificada, se midió la 52-734 radioactividad del Lactobacillus después de una incubación in vitro con ácido palmitico marcado con 14C. Primero, se inocularon L. Acidophilus o cepas de FARM identificadas, en 2 mi de caldo de MRS y se incubaron. Al final de la fase de crecimiento exponencial, se estimó de nuevo la densidad de células midiendo la absorbancia a 600 nm. Las células se cosecharon por centrifugación y se resuspendieron en caldo de MRS fresco conteniendo 1 nCi/ml de 14C-ácido palmitico. Después de una incubación adicional durante 1 hora a 37°C, las células marcadas con 14C se lavaron 3 veces con caldo de MRS. Después de resuspender en 1 mi de caldo de MRS fresco, se transfirieron con cuidado 200 µ? de la suspensión de células a un vial de centelleo de 4 mi conteniendo 2 mi de cóctel de centelleo liquido. La mezcla se sometió a agitación vorticial vigorosa durante 1 minuto y después se determinó la actividad de 14C por espectrofotometría de centelleo liquido.

Evaluación de la capacidad de producción de ácido Para probar la producción de ácido, se cultivó L.

Acidophilus a 37 °C en caldo de MRS hasta el final de la fase de crecimiento exponencial. Se inoculó un mi de cultivo celular en una botella conteniendo 100 mi de leche descremada estéril reconstituida (10%) y glucosa (2%). Los cambios de pH del yogur se determinaron después de la 52-734 incubación durante 24 horas, 48 horas y 72 horas, respectivamente. Para mediciones de crecimiento celular, se transfirieron 5 mi del yogur resultante después de 48 horas de cultivo a un tubo cónico de 15 mi y se sometió a agitación vorticial vigorosa. Después, se diluyó en serie 1 mi de la muestra homogeneizada con PBS estéril y 50 µ? de cada dilución se depositaron sobre una placa de MRS . Las placas se cultivaron bajo condiciones anaeróbicas durante 48 horas para contar las colonias visibles.

Experimento en Animales Todos los procedimientos realizados con animales estuvieron conformes con las guias establecidas y fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidados y Usos de Animales. Se alojaron dos Ratas SD macho con pesos corporales de 200-220 g en cada jaula y se les suministró alimento normal para ratas y agua a discreción durante la primera semana. Todos los animales se mantuvieron bajo un ciclo de 12 horas de luz y oscuridad hasta el final del experimento. La temperatura se mantuvo constante a 22 ± 1°C y la' humedad fue de 40-50%. Después de 1 semana de familiarización en este ambiente, las ratas se dividieron aleatoriamente en grupos de control o experimentales (n= 14 por grupo) : grupo de control (solo dieta alta en grasa), grupo 3179 (dieta alta en grasa con 52-734 yogur fermentado mediante la cepa de L. aci ophilus KCTC3179) , grupo FARM (dieta alta en grasa con yogur fermentado mediante mutante FARM), respectivamente. La dieta alta en grasa en este estudio se realizó con alimento de rata estándar (complejo de carbohidratos 60%, protéina 22%, grasa 3.5%, fibra 5%, cenizas brutas 8%, calcio 0.6%, y fósforo 1.2%) más 20% de manteca de cerdo. La composición de la dieta alta en grasa es la siguiente: complejo de carbohidratos 48%, proteina 17.6%, grasa 22.8%, fibra 4%, cenizas brutas 6.4%, calcio 0.48%, y fósforo 0.96%. El yogur para alimentación se fermentó con 10% de leche sin grasa, 2% de azúcar, y 1% de cultivo de L. Acidophilus a una concentración de = 109/ml. A lo largo de los periodos experimentales, las ratas tuvieron libre acceso a cada dieta mientras que se administraron oralmente 3 mi de yogur fermentado para el propósito de cada experimento. El peso corporal se midió cada semana entre 9 y 10 A.M. después de 12 horas de ayuno. 1. Capacidad de colonización del tracto gastrointestinal Después de 8 semanas de alimentación de L. Acidophilus para colonización, se seleccionaron aleatoriamente cuatro ratas de cada grupo de control o experimental y se sacrificaron bajo anestesia con éter. Los órganos gastrointestinales incluyendo el estómago y el 52-734 intestino delgado de las ratas se recuperaron inmediatamente y se pesaron. Las muestras se transfirieron en tubos cónicos de 50 mi y se diluyeron con solución salina estéril para obtener una dilución de 10 veces (peso/volumen) . Después, las muestras en solución salina se homogeneizaron con un homogeneizador para liberar el contenido de los órganos gastrointestinales. Después de la dilución en serie, los homogeneizados se depositaron en placas sobre placas de agar selectivo al lactobacillus y se incubaron anaeróbicamente durante 48 horas. Se evaluaron los números de lactobacilos viables por conteo de colonias formadas en las placas seleccionadas y se expresaron como logio CFU por gramo (peso húmedo) de varias regiones de los órganos gastrointestinales. 2. Efecto in vivo de FARM en la inducción de la obesidad inducida por dieta En este experimento se empleó el triglicérido de cadena larga, trioleina, como el sustrato. La trioleina marcada con [14C] en solución de benceno se mantuvo a -70°C hasta el día antes de su uso. Se añadió aproximadamente 1 µ?? de trioleina marcada con [1 C] por mi de troleina no marcada y el solvente se evaporó a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante toda la noche. La mezcla de trioleina se administró en una cantidad de 0.5 mmol/100 g 52-734 de peso corporal a los animales después de alimentar lactobacillus durante 22 semanas. Después de la administración oral, se recolectaron muestras de sangre por punción cardiaca a los 120 minutos, 240 minutos, 360 minutos, 480 minutos, y 600 minutos, respectivamente. Se mezclaron inmediatamente 0.1 mi de cada muestra de suero con 1.8 mi de LSC y se determinó la actividad de 14C por espectrofotometria de centelleo liquido. Se investigó el efecto in vivo de FARM en la inducción de la obesidad inducida por dieta midiendo las capacidades de absorción de ácidos grasos in vivo de FARM después de alimentar yogur fermentado con Lactobacillus. 3. Análisis de MRI del contenido de grasa visceral Se efectuó un análisis de imagenologia por resonancia magnética nuclear para medir la grasa visceral subcutánea abdominal y visceral con un instrumento Bruker Biospec 47/40 de 4.7 Tesla. Las ratas se anestesiaron con una combinación de zoletil (25 mg/kg) y rompun (10 mg/kg) . Para obtener imágenes, las ratas se colocaron en una posición de decúbito prono en el imán. Se registraron las MRI usando la bobina del cuerpo como transmisor y receptor. Se adquirió una serie de barridos transaxiales ponderados por TI para la medición de grasa intra-abdominal y subcutánea de una región que se extiende desde 8 cm por arriba hasta 8 cm por abajo del cuarto y quinto interespacio lumbar. Se midieron áreas de grasa intra-abdominal y subcutánea usando el programa Image J. 4. Análisis Bioquímico de Suero Se recolectaron muestras de sangre de las ratas experimentales al principio y a las 22 semanas para determinar los valores bioquímicos del suero. Todos los animales se sometieron a ayuno durante toda la noche antes de la recolección de sangre. Todas las muestras sanguíneas de las ratas se recolectaron por punción cardíaca bajo anestesia con éter. Después de la centrifugación a 2,000 x g durante 10 minutos a 4°C, se tomaron alícuotas de las muestras de suero y se almacenaron a -70°C hasta el análisis. El suero se analizó para determinar las características bioquímicas con kits disponibles, tales como niveles de insulina (kit ELISA para ratas/ratones), leptina (kit ELISA para leptina) y glucosa en suero (medidor de glucosa en la sangre).. La concentración de colesterol total, colesterol HDL, colesterol LDL, y triglicéridos en suero se detectó con kits ELISA. 5. Efecto de FARM3 en la obesidad inducida por dieta A las ratas SD macho de tres meses de edad se les dio alimento (descrito arriba) durante 8 semanas hasta desarrollar obesidad inducida por dieta con un peso corporal promedio de 425 g. Las ratas se dividieron aleatoriamente en grupos (n =14 por grupo) y recibieron yogur fermentado o medicamento bajo la condición de dieta continua alta en grasa: grupo 3179 (dieta alta en grasa con yogur fermentado por medio de la cepa de L. Acidophilus KCTC 3179) , grupo FARM3 (dieta alta en grasa con yogur fermentado por el mutante FARM3 ) , Orlistat (dieta alta en grasa con Xenical™ en una cantidad de 200 mg/kg de dieta) . 6. Análisis Estadístico Todos los datos se expresaron como la media ± desviación estándar. Se realizaron comparaciones estadísticas por análisis de prueba de varianza (ANOVA) . Un valor de P<0.05 se consideró estadísticamente significativo .

Resultados 1. Diferentes capacidades de extracción de ácidos grasos de FARM y reducción de la ingesta calórica La figura 1 muestra las diferentes capacidades de extracción de ácidos grasos de los FARM de su ambiente circundante. La capacidad de extracción de ácidos grasos de los FARM se relacionó inversamente con la ingesta calórica por el huésped cuyo tracto GI se colonizó con FAR s . Se mutagenizó el Lactobacillus aciclophilus KCTC 3179 (rotulado como "3179") con N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) para generar FARM1 con mayor capacidad de extracción de ácidos grasos. FARM1 se mutagenizó de nuevo con 1-óxido de 4 -nitroquinolina (4NQO) para generar FARM2 con mejor capacidad de extracción de FA. Las capacidades de extracción de FA de los FARM se determinaron midiendo la radioactividad en lactobacilos usando espectroscopia de centelleo liquido después de la incubación de lactobacilos con 1 nCi/ml de ácido palmitico marcado con 14C durante 1 hora. Los valores son la media CPM ± desviación estándar (n= 4) .

La figura 2 muestra la reducción de la ingesta calórica en el huésped que se colonizó con FARM.

Los tractos GI de las ratas SD se colonizaron durante 8 semanas con FARM o con L. acidophilus KCTC 3179. Después de la administración de trioleina marcada con 14C en las ratas colonizadas con diferentes lactobacilos (FARM1, FARM2 , KCTC 3179) y ratas sin alimentación de Lactobacillus (control) , se recolectaron muestras sanguíneas para el análisis de radioactividad para determinar la ingesta calórica relativa del huésped.

La capacidad de extracción del FARM se correlaciona inversamente con la absorción de FA por él 52-734 huésped . 2. Capacidad de producción de ácido Cada una de las células de Lactobacillus se inoculó en leche descremada reconstituida estéril suplementada con 2% de glucosa para elaborar yogur. Los valores de pH de cada yogur se determinó en los puntos de tiempo indicados (24 horas, 48 horas y 72 horas) para medir sus actividades de acidificación. Los valores son medias ± SEM de cada 10 muestras.

La tabla 1 muestra las características de acidificación de leche por medio de Lactobacillus acidophilus KCTC 3179, FARMl y FARM2.

Tabla 1 Los valores son medias ± SEM de cada 10 muestras Tiempo Valores de pH del yogur 3179 FARMl FARM2 24 6.78 ± 0.16 7.12 ± 0, .16 6.59 ± 0. .24 48 3.82 ± 0.24 4.42 ± 0. .05 3.77 ± 0. .14 72 3.66 ± 0.13 3.97 ± 0. .12 3.69 ± 0. .12 3. Capacidad de colonización en el tracto GI Después de alimentar a las ratas con yogur fermentado con Lactobacillus acidophilus KCTC 3179, FARMl y FAR 2 durante 8 semanas para cada uno, se tomaron muestras 52-734 del estómago y del intestino delgado de cada grupo para contar las unidades formadoras de colonias (CFU) . El control se refiere a ratas sin alimentación de yogur. Los valores son medias + SEM de cada 5 muestras. La tabla 2 muestra la colonización de Lactobacillus KCTC 3179, FARMl y FAR 2 en el tracto GI de ratas.

Tabla 2 Los valores son medias + SEM de cada 5 muestras Cepa Log10[CFU de lactobacilos/g (peso húmedo) de órgano] Estómago Intestino Delgado Control No detectable 6.64 + 0.22 3179 8.54 ± 0.20 8.64 ± 0.14 FARM1 8.61 ± 0.19 8.50 ± 0.19 FARM2 8.50 ± 0.22 8.63 ± 0.23 4. Capacidad de colonización bajo obesidad inducida por dieta Después de alimentar a cada una de las ratas con yogur fermentado con Lactobacillus acidophilus KCTC 3179, FARMl y FAR 2 durante 4 semanas, se tomaron muestras del estómago y del intestino delgado de cada grupo para contar las unidades formadoras de colonias (CFU) . El control se refiere a ratas sin alimentación de yogur. Los valores son medias + SEM de cada 5 muestras. La tabla 3 muestra la colonización de Lactobacillus KCTC 3179, FARMl y FAR 2 en el tracto GI de ratas cuando se indujo la obesidad mediante 52-734 Tabla 3 Los valores son medias + SEM de cada 5 muestras Cepa Logio[CFU de lactobacilos/g (peso húmedo) de órgano] Estómago Intestino Delgado Control No detectable 5.98 ± 0.21 3179 8.15 ± 0.29 9.14 + 0.24 FARM1 8.32 ± 0.23 8.89 ± 0.22 FARM2 8.19 ± 0.17 9.05 ± 0.19 5. Efecto de la extracción calórica por los FARM en el tracto GI en la inducción de la obesidad inducida por dieta La figura 3 mostró los cambios en el peso corporal del huésped que se colonizó con Lactobacillus.

Se dividieron, aleatoriamente ratas SD macho de tres meses de edad (200-220 g) en cuatro grupos (n= 14 por grupo) ; ratas alimentadas solo con dieta alta en grasa (control) y ratas alimentadas con lactobacilos (KCTC 3179, FARM1, o FARM2) diariamente durante 22 semanas. El cambio en el peso corporal se muestra como la media ± SEM.

La figura 4 muestra el análisis de grasa visceral del huésped que se colonizó con Lactobacillus.

Se midieron las áreas de grasa visceral de los grupos experimentales de las ratas usando imagenologia de resonancia magnética (MRI, por sus siglas en inglés) después de terminar el experimento de alimentación y se analizaron con un programa de análisis de imágenes ( Image 52-734 J, EE.UU.). Las diferencias en la acumulación de grasa visceral entre los grupos experimentales de las ratas se presentan como la media ± SE .

La figura 5 muestra las imágenes de MRI en huéspedes que se colonizaron con Lactobacillus . Imágenes representativas de la acumulación de grasa visceral de las ratas alimentadas solo con dieta alta en grasa (control) y con lactobacilos (KCTC 3179, FARM1, o FAR 2) diariamente durante 22 semanas. 6. Comparación de los parámetros de suero de la sangre después de alimentar cepas de Lactobacillus 3179 o FARM Se dividieron aleatoriamente ratas SD macho (200-220 g) de tres meses de edad en cuatro grupos (n= 14 por grupo) , y se alimentaron solo con dieta alta en grasa o con lactobacilos durante 22 semanas; grupo de control (solo dieta alta en grasa), grupo 3179 (dieta alta en grasa con yogur fermentado mediante la cepa L. acidophilus KCTC3179) , grupo FARM (dieta alta en grasa con yogur fermentado por el mutante FARM) , respectivamente. Se recolectaron las muestras sanguíneas de las ratas experimentales al principio y al final del periodo experimental, y se analizó para determinar el cambio de los parámetros del suero sanguíneo. Todos los datos se expresaron como la media ± SEM. Se realizaron comparaciones estadísticas por análisis de prueba de varianza (ANOVA) . Un valor de P<0.05 se consideró estadísticamente significativo.

La figura 6 muestra el cambio de los perfiles de lípidos en el plasma en ratas. TG, se refiere a triglicéridos; TC se refiere a colesterol total; HDL se refiere a colesterol de lipoproteína de alta densidad; LDL se refiere a colesterol de lipoproteína de baja densidad.

La figura 7 muestra el cambio de las concentraciones de insulina y leptina en el plasma en ratas.

La figura 8 muestra el cambio de las concentraciones de glucosa en la sangre en ratas. 7. Efecto de FARM3 en la obesidad inducida por dieta La figura 9 muestra la capacidad de absorción de ácidos grasos in vitro del FARM3 de su ambiente circundante. FARM2 se mutagenizó con sulfonato de etilmetano (E S) para generar FARM3 con mejor capacidad de extracción de ácidos grasos. La capacidad de extracción de ácidos grasos del FARM3 se determinó midiendo la radioactividad en lactobacilos usando espectroscopia de centelleo líquido después de la incubación de lactobacilos con 1 nCi/ml de ácido palmítico marcado con 1 C durante 1 hora. Los valores son la media ± desviación estándar (n= 4 ) .

La figura 10 muestra la reducción de la ingesta calórica por Lactobacillus u Orlistat™.

A las ratas SD macho de 3 meses de edad se les dio alimento alto en grasa durante 8 semanas para desarrollar obesidad 'inducida por dieta con un peso corporal promedio de 425 g. A las ratas obesas inducidas por dieta se les administró diariamente yogur fermentado con Lactobacillus tipo silvestre 3179 (O, dieta alta en grasa con yogur fermentado por medio de la cepa L. Acidophilus KCTC3179) , yogur fermentado con FAR 3 (·, dieta alta en grasa con yogur fermentado por medio de FARM3 ) u Orlistat (?, dieta alta en grasa con Xenical™ 200 mg/kg de dieta) bajo la condición de dieta continua alta en grasa durante 4 semanas. El cambio en el peso corporal (n= 14) se muestra como la media ± SEM.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica para la prevención o el tratamiento de la obesidad o del síndrome metabólico relacionado con la obesidad, que comprende microorganismos que pueden colonizar y extraer ácidos grasos libres en el tracto gastrointestinal de mamíferos.

2. La composición farmacéutica según la reivindicación 1, en donde los microorganismos son de la microflora intestinal o derivados de la microflora intestinal .

3. La composición farmacéutica según la reivindicación 1 ó 2, en donde los microorganismos son cepas probióticas.

. La composición farmacéutica según la reivindicación 3, en donde el microorganismo se selecciona del grupo que consiste de Lactobacillus acidophilus FARM1 KCTC 11513BP; Lactobacillus acidophilus FARM2 KCTC 11514BP; y Lactobacillus acidophilus FARM3 KCTC 11515BP.

5. Un suplemento dietético para la prevención o el tratamiento de la obesidad y del síndrome metabólico relacionado con la obesidad, que comprende microorganismos que pueden colonizar y extraer ácidos grasos libres en el tracto gastrointestinal de mamíferos.

6. El suplemento dietético según la 52-734 reivindicación 5, en donde los microorganismos se seleccionan del grupo que consiste de Lactobacillus acidophilus FARM1 KCTC 11513BP; Lactobacillus acidophilus FAR 2 KCTC 11514BP; y Lactobacillus acidophilus FARM3 KCTC 11515BP.

7. La composición según la reivindicación 5 ó 6, en donde el suplemento dietético es yogur probiótico.

8. Un Lactobacillus acidophilus FARM1 KCTC 11513BP con capacidad de absorción mejorada para ácidos grasos libres.

9. Un Lactobacillus acidophilus FARM2 KCTC 11514BP con capacidad de absorción mejorada para ácidos grasos libres.

10. Un Lactobacillus acidophilus FARM3 KCTC 11515BP con capacidad de absorción mejorada para ácidos grasos libres.

11. Un método para la prevención o el tratamiento de la obesidad o del síndrome metabólico relacionado con la obesidad, que comprende administrar a un mamífero que necesita dicha prevención o tratamiento una cantidad de microorganismos que pueden colonizar y extraer ácidos grasos libres en el tracto gastrointestinal de mamíferos .

12. El método según la reivindicación 11, en donde los microorganismos son de la microflora intestinal o 52-734 se derivan de la microflora intestinal.

13. El método según la reivindicación 11 ó 12, en donde los microorganismos son cepas probióticas

14. El método según la reivindicación 13, en donde el microorganismo se selecciona del grupo que consiste de Lactobacillus acidophilus FARM1 KCTC 11513BP; Lactobacillus acidophilus FARM2 KCTC 11514BP; y Lactobacillus acidophilus FARM3 KCTC 11515BP. 52-734