WO2010101129A1 - マンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群転写制御因子及び該転写制御因子遺伝子 - Google Patents
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Abstract
【課題】マンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群の遺伝子の転写・発現を制御する以下の転写制御因子等を提供すること。 以下の(ａ)、(ｂ)又は(ｃ)の蛋白質。 (ａ) 配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質; (ｂ) 配列番号２で表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸(例えば、１乃至５個)が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつマンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群の遺伝子の転写制御能を有する蛋白質;又は (ｃ) 配列番号２で表されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む蛋白質又はその部分断片であり、かつマンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群の遺伝子の転写制御能を有する蛋白質、及び該蛋白質をコードする遺伝子等。
Description
本発明は、マンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群転写制御（調節）因子、該制御因子をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該ベクターによって形質転換された形質転換体、該形質転換体を用いた該転写制御因子、マンナン加水分解酵素群及びセルロース加水分解酵素群の製造方法に関する。
グルコマンナンやガラクトマンナン等のβ－マンナン類は１，４－β－Ｄ－マンノシド結合を有する化合物であり、植物の細胞壁の主要な成分の一つである、ヘミセルロースの構成要素として広く天然界に存在する。この１，４－β－Ｄ－マンノシド結合は、β－１，４－マンナナーゼ（ＥＣ３．２．１．７８）や、β－マンノシダ－ゼ（ＥＣ３．２．１．２５）により加水分解される。また、ガラクトマンナンに存在するα－１,６－ガラクトシド結合は、α-ガラクトシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２２）により加水分解される。さらにβ－マンナン類がアセチル化されている場合には、アセチルマンナンエステラーゼ（ＥＣ３．１．１．６）の作用により、脱アセチル化される。（本明細書では、β－１，４－マンナナーゼ、β―マンノシダーゼ、α―ガラクトシダーゼ及びアセチルマンナンエステラーゼを併せて「マンナン加水分解酵素群」と記載する）。これらマンナン加水分解酵素群の中でも、β－１，４－マンナナーゼは工業的に有用な酵素であり、食品、畜産、製紙等の産業に広く利用されている（本明細書では、β－１，４－マンナナーゼをマンナナーゼと、β－１，４－マンノシダーゼをマンノシダーゼと記載する）。
マンナナーゼとしては、トリコデルマ・リーゼイ（例えば、非特許文献１参照）、アスペルギルス・アキュレアタス（例えば、特許文献１参照）等の子嚢菌類糸状菌由来のもの、担子菌類糸状菌のアガリクス・ビスポラス（例えば、非特許文献２参照）由来のものが知られている。バクテリア由来のものでは、（例えば、非特許文献３参照）、ストレプトマイセス・リビダンス（例えば、非特許文献４参照）、シュードモナス・フルオレッセンス（例えば、非特許文献５参照）由来のもの等が知られている。以上のマンナナーゼは、遺伝子についても報告されている。
また、酵素のみが知られていて、遺伝子についての報告が無いものとしては、アスペルギルス・タマリ（例えば、非特許文献６参照）、ペニシリウム・マルチカラー（例えば、特許文献２参照）由来のもの等がある。
黄麹菌であるアスペルギルス・オリゼ及びアスペルギルス・ソーヤは、醤油・味噌・日本酒などの、日本における醸造食品の製造に古くから使われており、その高い酵素生産性と、長年の利用による安全性に対する信頼の高さから、産業上重要な微生物である。これら黄麹菌については、アスペルギルス・オリゼ由来のマンナナーゼについての報告があり（例えば、非特許文献７参照）、精製酵素、及び遺伝子についても既に報告がなされている（例えば、特許文献３参照）。
上記のマンナナーゼにおいて、その遺伝子の発現を正又は負に制御する転写制御因子としては、原核生物ではバチルス・ズブチルス由来の負の制御因子（リプレッサー）が報告されている（例えば、非特許文献８参照）。しかしながらカビを含む真核生物由来のマンナナーゼの転写制御因子は未だ発見されていない。さらに、真核生物においてマンナナーゼとともにマンナン類の加水分解に関与するマンノシダーゼ及びα－ガラクトシダーゼについても、その遺伝子の発現を制御する転写制御因子は発見されていない。そのため、該転写制御因子を強制発現させることによるマンナン加水分解酵素群の生産性を増強した真核微生物菌株の作製についても検討はなされていない。
また、木質バイオマスの分解では、マンナン加水分解酵素群とともにセルロース加水分解酵素群（セルラーゼ、セロビオハイドロラーゼ類若しくは、β‐グルカナーゼ類、又は、セロビオハイドロラーゼやグルカナーゼの作用により生じるオリゴ糖類を分解するβ‐グルコシダーゼ等）の働きも重要である。そのため、マンナン加水分解酵素群とともにセルロース加水分解酵素群を同時に大量に生産することができれば、木質バイオマス分解用酵素剤の効率的生産に有効であると考えられる。もし該転写制御因子がマンナン加水分解酵素群とともにセルロース加水分解酵素群の遺伝子発現を正に制御するのであれば、該転写制御因子を強制発現させ両加水分解酵素群の生産能を増強した真核微生物菌株の育種が可能であると考えられる。しかし、現在までにそのような検討がなされた事例はない。
Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６１（３）：１０９０－７，１９９５
Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６７（５）：２２９８－３０３，２００１
Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．，１２４３（３）：５５２－４，１９９５
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２９０（Ｐｔ３）：８５７－６３，１９９３
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３０５（Ｐｔ３）：１００５－１０１０，１９９５
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２１９（３）：８５７－８６３，１９８４
Ｃｙｔｏｂｉｏｓ，１０５（４０９）：１１５－３０，２００１
ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ，２７９：１０３－１０９，２００８
本発明の課題は、マンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群の遺伝子の転写・発現を制御する新規転写制御因子、該転写制御因子をコードする新規遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該ベクターによって形質転換された形質転換体、該形質転換体を用いた該転写制御因子及びマンナン加水分解酵素群及びセルロース加水分解酵素群の効率的な製造方法を提供することにある。
本発明者は、上記課題を解決するため研究を重ね、黄麹菌アスペルギルス・オリゼよりマンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群の遺伝子発現の転写制御能を有する蛋白質（本明細書中において、以下、単に、「転写制御因子」ともいう）をクローニングすることに成功し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下の各態様にかかる。
１）以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の蛋白質：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、マンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群の遺伝子の転写制御能を有する蛋白質；又は
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む蛋白質又はその部分断片であり、かつ、マンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群の遺伝子の転写制御能を有する蛋白質。
２）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の蛋白質をコードする遺伝子：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、マンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群の遺伝子の転写制御能を有する蛋白質；又は
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む蛋白質又はその部分断片であり、かつ、マンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群の遺伝子の転写制御能を有する蛋白質。
３）以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡから成る遺伝子：
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を含むＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列又はその相補鎖を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、マンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群の遺伝子の転写制御能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする核酸又はその相補鎖を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、マンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群の遺伝子の転写制御能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；又は
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列のＤＮＡと７０％以上の配列同一性を示し、かつ、マンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群の遺伝子の転写制御能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
４）前記遺伝子を含有する組換えベクター。
５）前記組換えベクターを含む形質転換体。
６）前記形質転換体を培養し、得られる培養物から転写制御因子を回収することを特徴とする、転写制御因子の製造方法。
７）前記形質転換体を培養し、得られる培養物からマンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群を回収することを特徴とするマンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群の製造方法。
８）前記形質転換体を培養し、該形質転換体によるマンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群の産生を増強させる方法。
１）以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の蛋白質：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、マンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群の遺伝子の転写制御能を有する蛋白質；又は
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む蛋白質又はその部分断片であり、かつ、マンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群の遺伝子の転写制御能を有する蛋白質。
２）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の蛋白質をコードする遺伝子：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、マンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群の遺伝子の転写制御能を有する蛋白質；又は
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む蛋白質又はその部分断片であり、かつ、マンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群の遺伝子の転写制御能を有する蛋白質。
３）以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡから成る遺伝子：
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を含むＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列又はその相補鎖を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、マンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群の遺伝子の転写制御能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする核酸又はその相補鎖を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、マンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群の遺伝子の転写制御能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；又は
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列のＤＮＡと７０％以上の配列同一性を示し、かつ、マンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群の遺伝子の転写制御能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
４）前記遺伝子を含有する組換えベクター。
５）前記組換えベクターを含む形質転換体。
６）前記形質転換体を培養し、得られる培養物から転写制御因子を回収することを特徴とする、転写制御因子の製造方法。
７）前記形質転換体を培養し、得られる培養物からマンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群を回収することを特徴とするマンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群の製造方法。
８）前記形質転換体を培養し、該形質転換体によるマンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群の産生を増強させる方法。
本発明により、新規なマンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群の転写制御因子、該転写制御因子遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター及び形質転換体を提供することができる。また、本発明により該転写制御因子の生産方法を提供し、さらにマンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群の生産増強方法を提供することができる。その結果、麹菌によるマンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群の効率的な生産が行えるようになる。さらに、上記転写制御因子の蛋白質工学的な改良が行えるようになり、食品加工用の酵素生産、醸造食品の生産に用いる真核微生物の改良にも用いることができる。
本発明の転写制御因子は、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質である。該転写制御因子は、例えば、アスペルギルス・オリゼなどの黄麹菌の菌体破砕液より得ることができる。また、該転写制御因子は、上記黄麹菌等からクローニングした転写制御因子遺伝子を適当な宿主－ベクター系で発現させることにより得られる。
転写制御因子は、転写制御能を有する限り、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸（例えば、１乃至５個）が欠失、置換若しくは付加されていてもよい。さらに、転写制御活性を有する限り、配列番号２で表されるアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、最も好ましくは９０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む蛋白質、又はその部分断片であってもよい。
２つのアミノ酸配列又は塩基配列における配列同一性を決定するために、配列は比較に最適な状態に前処理される。例えば、一方の配列にギャップを入れることにより、他方の配列とのアラインメントの最適化を行う。その後、各部位におけるアミノ酸残基又は塩基が比較される。第一の配列における、ある部位に、第二の配列の相当する部位と同じアミノ酸残基又は塩基が存在する場合、それらの配列は、その部位において同一である。２つの配列における配列同一性は、配列間での同一である部位数の全部位（全アミノ酸又は全塩基）数に対する百分率で示される。
上記の原理に従い、２つのアミノ酸配列又は塩基配列における配列同一性は、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｈｕｌのアルゴリズム（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４－２２６８，１９９０及びＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５８７７，１９９３）により決定される。このようなアルゴリズムを用いたＢＬＡＳＴプログラムがＡｌｔｓｈｕｌらによって開発された（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０，１９９０）。さらに、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴはＢＬＡＳＴより感度良く配列同一性を決定するプログラムである（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２，１９９７）。上記のプログラムは、主に与えられた配列に対し、高い配列同一性を示す配列をデータベース中から検索するために用いられる。これらは、例えば米国Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのインターネット上のウェブサイトにおいて利用可能である。
配列間の配列同一性として、Ｔａｔｉａｎａ Ａ． Ｔａｔｕｓｏｖａらによって開発されたＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓソフトウェア（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．，１７４：２４７－２５０，１９９９）を用いて決定した値を用いる。このソフトウェアは米国Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのインターネット上のウェブサイトにおいて利用可能であり、入手も可能である。用いるプログラム及びパラメーターは以下のとおりである。アミノ酸配列の場合、ｂｌａｓｔｐプログラムを用いパラメーターとしては、Ｏｐｅｎ ｇａｐ：１１ ａｎｄ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｇａｐ：１ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ，ｇａｐ ｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ：５０，ｅｘｐｅｃｔ：１０，ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ：３，Ｆｉｌｔｅｒ：ＯＮを用いる。塩基配列の場合、ｂｌａｓｔｎプログラムを用いパラメーターとしては、Ｒｅｗａｒｄ ｆｏｒ ａ ｍａｔｃｈ：１，Ｐｅｎａｌｔｙ ｆｏｒ ａ ｍｉｓｍａｔｃｈ：－２， Ｓｔｒａｎｄ ｏｐｔｉｏｎ：Ｂｏｔｈ ｓｔｒａｎｄｓ， Ｏｐｅｎ ｇａｐ：５ ａｎｄ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｇａｐ：２ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ，ｇａｐ ｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ：５０，ｅｘｐｅｃｔ：１０，ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ：１１，Ｆｉｌｔｅｒ：ＯＮを用いる。いずれのパラメーターも、ウェブサイト上でデフォルト値として用いられているものである。
ただし、上記ＢＬＡＳＴソフトウェアで有意な配列同一性を示す配列が見つからない場合には、さらに高感度なＦＡＳＴＡソフトウェア（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｄ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４－２４４８，１９８８）を用いて配列同一性を示す配列をデータベースから検索することもできる。ＦＡＳＴＡソフトウェアは、例えば、ゲノムネットのウェブサイトで利用できる。この場合も、パラメーターはデフォルト値を用いる。例えば、塩基配列についての検索を行う場合は、データベースにｎｒ－ｎｔを用い、ｋｔｕｐ値は６を用いる。ただし、いずれの場合も、全体の３０％以上、５０％以上又は７０％以上のオーバーラップを示さない場合は、機能的に相関しているとは必ずしも推定されないため、２つの配列間の配列同一性を示す値としては用いない。
本発明の転写制御因子遺伝子は、例えば、アスペルギルス・ソーヤやアスペルギルス・オリゼなどの黄麹菌、その他の糸状菌、又はその他の真菌類から得ることができる。さらに具体的には、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株（寄託機関：独立行政法人酒類総合研究所、寄託番号ＩＤ：ＲＩＢ４０）が挙げられる。これらの菌体を、マンナン加水分解酵素群の生産を誘導する条件の培地で培養したものから、常法により全ＲＮＡを回収する。培地としては、例えば、１％グルコマンナンを炭素源としたＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ最少培地を用いることができる。上記培地で適当な時間、例えば、２０時間振とう培養したのち、菌体を回収し液体窒素を満たした乳鉢中に適量、例えば、０．３ｇを移し、乳棒を用いて粉砕し、Ｃａｔｈａｌａらの方法（ＤＮＡ，２：３２９－３３５，１９８３）で全ＲＮＡを調製する。
こうして得られた全ＲＮＡを鋳型として、ＲＴ－ＰＣＲを行う。プライマーとしては、本発明の転写制御因子遺伝子を増幅することのできる組み合せであればどのような組み合せのものを用いてもよいが、例えば、後述の配列番号３５及び配列番号３６の配列のオリゴヌクレオチドを用いることができる。
ＲＴ－ＰＣＲは、市販のキット、例えば、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ－ＰＣＲ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて常法により行うことができる。
得られた本発明のマンナナーゼ遺伝子を含むＤＮＡは、例えば、常法によりプラスミドに組み込むことができる。
このようにして得られたＤＮＡの塩基配列は、サンガー法により、市販の試薬及びＤＮＡシークエンサーを用いて決定することができる。得られる本発明の転写制御因子遺伝子を含むＤＮＡ及びそれによりコードされる転写制御因子の例をそれぞれ配列番号１及び２に例示する。
ＲＴ－ＰＣＲは、市販のキット、例えば、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ－ＰＣＲ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて常法により行うことができる。
得られた本発明のマンナナーゼ遺伝子を含むＤＮＡは、例えば、常法によりプラスミドに組み込むことができる。
このようにして得られたＤＮＡの塩基配列は、サンガー法により、市販の試薬及びＤＮＡシークエンサーを用いて決定することができる。得られる本発明の転写制御因子遺伝子を含むＤＮＡ及びそれによりコードされる転写制御因子の例をそれぞれ配列番号１及び２に例示する。
転写制御因子遺伝子は、マンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群の遺伝子の転写制御能を有する限り、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸（例えば、１乃至５個）が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む蛋白質をコードしているものであってもよい。このような遺伝子は、後述するハイブリダイゼーションによる選択のほか、種々の公知の変異導入方法によって得ることもできる。
転写制御因子遺伝子は、ハイブリダイゼーションによる選択法を用いて得ることもできる。遺伝子源としては、例えば、アスペルギルス・ソーヤやアスペルギルス・オリゼなどの黄麹菌があげられる。これらの生物から、常法によりＲＮＡ又はゲノムＤＮＡを調製し、プラスミド又はファージに組み込み、ライブラリーを調製する。
続いて、プローブとして用いる核酸を検出法に応じた方法で標識する。プローブとして用いる核酸は、十分な特異性を得られる長さであればよく、例えば、配列番号１に記載の配列の少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、最も好ましくは４５０塩基以上の部分又は全体を含むものが挙げられる。
続いて、プローブとして用いる核酸を検出法に応じた方法で標識する。プローブとして用いる核酸は、十分な特異性を得られる長さであればよく、例えば、配列番号１に記載の配列の少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、最も好ましくは４５０塩基以上の部分又は全体を含むものが挙げられる。
次いで、標識したプローブにストリンジェントな条件でハイブリダイズするクローンを上記ライブラリーから選択する。ハイブリダイゼーションは、プラスミドライブラリーならコロニーハイブリダイゼーションによって、ファージライブラリーならプラークハイブリダイゼーションによって行うことができる。
ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドのシグナルが非特異的なハイブリッドのシグナルと明確に識別される条件であり、使用するハイブリダイゼーションの系と、プローブの種類、配列及び長さによって異なる。条件は、ハイブリダイゼーションの温度を変えること、洗浄の温度及び塩濃度を変えることにより決定可能である。例えば、非特異的なハイブリッドのシグナルまで強く検出されてしまう場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を上げるとともに、必要に応じて洗浄の塩濃度を下げることにより特異性を上げることができる。
また、特異的なハイブリッドのシグナルも検出されない場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を下げるとともに、必要に応じて洗浄の塩濃度を上げることにより、ハイブリッドを安定化させることができる。このような最適化は、本技術分野の研究者が容易に行いうるものである。
ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドのシグナルが非特異的なハイブリッドのシグナルと明確に識別される条件であり、使用するハイブリダイゼーションの系と、プローブの種類、配列及び長さによって異なる。条件は、ハイブリダイゼーションの温度を変えること、洗浄の温度及び塩濃度を変えることにより決定可能である。例えば、非特異的なハイブリッドのシグナルまで強く検出されてしまう場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を上げるとともに、必要に応じて洗浄の塩濃度を下げることにより特異性を上げることができる。
また、特異的なハイブリッドのシグナルも検出されない場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を下げるとともに、必要に応じて洗浄の塩濃度を上げることにより、ハイブリッドを安定化させることができる。このような最適化は、本技術分野の研究者が容易に行いうるものである。
ストリンジェントな条件の具体例としては、例えば、ハイブリダイゼーションは、５×ＳＳＣ、１．０％（Ｗ／Ｖ）核酸ハイブリダイゼーション用ブロッキング試薬（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）、０．１％（Ｗ／Ｖ）Ｎ－ラウロイルサルコシン、０．０２％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳを用い一晩（８～１６時間程度）で行い、洗いは、０．５×ＳＳＣ、０．１％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ、好ましくは０．１×ＳＳＣ、０．１％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳを用い、１５分間、２回行う。ハイブリダイゼーションと洗いの温度は、５２℃以上、好ましくは５７℃以上、さらに好ましくは６２℃以上、最も好ましくは６７℃以上である。
さらに、配列番号１に記載の塩基配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、最も好ましくは９０％以上の配列同一性を示す塩基配列は、本発明の転写制御因子と実質的に同等の活性を有する蛋白質をコードしていると考えられる。このようなＤＮＡは、上記のハイブリダイゼーションを指標に得ることもできるが、ゲノム塩基配列解析等によって得られた機能未知のＤＮＡ群や公共データベースのなかから、例えば、前述のＢＬＡＳＴソフトウェアを用いた検索により発見することも容易である。このような検索は、本技術分野の研究者が通常用いている方法である。
得られたＤＮＡがマンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群転写制御能を有する蛋白質をコードしていることは、後述のように、適当な宿主において対象遺伝子を破壊し、破壊株をグルコマンナンを唯一の炭素源とした最少培地上で培養し、破壊株のマンナナーゼ活性が消失若しくは著しく減少すること、又は、適当な宿主において対象とする遺伝子を強制発現させ、強制発現株をカルボキシメチルセルロースを唯一の炭素源とした最少培地上で培養し、セルラーゼ活性が消失若しくは著しく増大することにより確認することができる。
本発明の組換えベクターは、転写制御因子遺伝子を適当なベクター上に連結することにより得ることができる。ベクターとしては、形質転換する宿主中で転写制御因子を生産させうるものであればどのようなものでも用いることができ、例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、染色体組み込み型、人工染色体などのベクターを用いることができる。
ベクターには、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。
マーカー遺伝子としては、例えば、ｕｒａ３、ｎＩａＤのような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子や、アンピシリンやカナマイシン、オリゴマイシンなどの薬剤に対する抵抗遺伝子などが挙げられる。
また、組換えベクターは、宿主細胞中で本発明の遺伝子を発現することのできるプロモーター又はその他の制御配列、例えば、エンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等を含むことが望ましい。
プロモーターとしては、例えば、ＧＡＬ１プロモーター、ＴＥＦ１プロモーター、ｌａｃプロモーター等が挙げられる。また、精製のためのタグをつけることもできる。具体的には、転写制御因子遺伝子の下流に適宜リンカー配列を接続し、ヒスチジンをコードする塩基配列を６コドン以上接続することにより、ニッケルカラムを用いた精製を可能にすることができる。
マーカー遺伝子としては、例えば、ｕｒａ３、ｎＩａＤのような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子や、アンピシリンやカナマイシン、オリゴマイシンなどの薬剤に対する抵抗遺伝子などが挙げられる。
また、組換えベクターは、宿主細胞中で本発明の遺伝子を発現することのできるプロモーター又はその他の制御配列、例えば、エンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等を含むことが望ましい。
プロモーターとしては、例えば、ＧＡＬ１プロモーター、ＴＥＦ１プロモーター、ｌａｃプロモーター等が挙げられる。また、精製のためのタグをつけることもできる。具体的には、転写制御因子遺伝子の下流に適宜リンカー配列を接続し、ヒスチジンをコードする塩基配列を６コドン以上接続することにより、ニッケルカラムを用いた精製を可能にすることができる。
形質転換体の取得本発明の形質転換体は、宿主を、組換えベクターで形質転換することにより得られる。宿主としては、転写制御因子を生産することができるものであれば特に限定されず、例えば、サッカロミセス・セルビシエ、チゴサッカロミセス・ルキシー等の酵母、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー等の糸状菌、エシェリヒア・コリ、バチルス・ズブチルス等の細菌であってもよい。尚、ＴＥＦ１プロモーターのような構成的プロモーターを使用することにより強制発現株を作製することができ、この強制発現株によって制御対象の蛋白質を強制的に発現させることができる。
形質転換は、宿主に応じて公知の方法で行うことができる。宿主に酵母を用いる場合は、例えば、酢酸リチウムを用いるＭｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５，２５５－２６９（１９９５）に記載の方法が利用できる。糸状菌を用いる場合は、例えば、プロトプラスト化した後ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いるＭｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１８：９９－１０４，１９８９に記載の方法が利用できる。細菌を用いる場合は、例えば、エレクトロポレーションによるＭｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４：１８２－１８７，１９９０に記載の方法が利用できる。
形質転換は、宿主に応じて公知の方法で行うことができる。宿主に酵母を用いる場合は、例えば、酢酸リチウムを用いるＭｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５，２５５－２６９（１９９５）に記載の方法が利用できる。糸状菌を用いる場合は、例えば、プロトプラスト化した後ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いるＭｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１８：９９－１０４，１９８９に記載の方法が利用できる。細菌を用いる場合は、例えば、エレクトロポレーションによるＭｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４：１８２－１８７，１９９０に記載の方法が利用できる。
本発明の転写制御因子の製造法は、転写制御因子遺伝子を発現させた形質転換体を培養し、常法によって、得られる培養物から転写制御因子の蛋白質を効率よく回収することからなる。培地及び培養方法は、宿主の種類と組換えベクター中の発現制御配列によって適当なものを選ぶ。例えば、宿主がサッカロミセス・セレビシエであり、発現制御配列がＧＡＬ１プロモーターである場合、ラフィノースを炭素源とする液体最少培地で前培養した菌体を、ガラクトースとラフィノースを炭素源とする液体最少培地に希釈・接種し、培養することにより、本発明の転写制御因子を生産させることができる。
また、宿主がアスペルギルス・ソーヤであり、発現制御配列がａｍｙＢプロモーターである場合、例えば、マルトースを炭素源とする液体最少培地で培養することにより、本発明の転写制御因子を高発現させることがでる。宿主が大腸菌であり、発現制御配列がｌａｃプロモーターである場合、例えば、ＩＰＴＧを含有する液体培地で培養することにより、転写制御因子を生産させることができる。転写制御因子が菌体内又は菌体表面に生産された場合は、菌体を培地から分離し、その菌体を適当に処理することにより転写制御因子を得ることができる。例えば、サッカロミセス・セルビシエの菌体表面に生産された場合、破砕した後、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｔｗｅｅｎ－２０、あるいはＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０等の非イオン性の界面活性剤を低濃度で作用させ、遠心分離した上清より転写制御因子を回収することができる。培養液中に転写制御因子が生産された場合は、遠心分離・ろ過等により菌体を除去することにより転写制御因子を得ることができる。何れの場合も、硫安分画、各種クロマトグラフィー、アルコール沈殿、限外ろ過等を用いた常法により、得られた転写制御因子をさらに純度の高いものとして得ることもできる。
本発明の転写制御因子は、マンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群の発現を正に制御する転写制御因子である。そのため、宿主として使用する生物種のマンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群が該転写制御因子により制御される場合には、該転写制御因子を強制発現させることにより、マンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群の産生が増強され、該酵素群を効率よく生産することができる。
宿主は、転写制御因子により、その生物種の有しているマンナン加水分解酵素群の遺伝子の発現が制御されるものであれば特に限定されないが、具体的にはアスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガーなどが挙げられる。培地及び培養方法は、宿主の種類と組換えベクター中の発現制御配列によって適当なものを選ぶことができる。
例えば、宿主がアスペルギルス・オリゼであり、発現制御配列がＴＥＦ１プロモーターである場合、該転写制御因子を高発現させた形質転換体を、小麦フスマ等を用いた固体培養い、マンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群を効率的に生産させることが可能である。
転写制御因子の強制発現によりマンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群が菌体内又は菌体表面に生産された場合は、菌体を培地から分離し、その菌体を適当に処理することによりマンナン加水分解酵素群を得ることができる。
例えば、アスペルギルス・オリゼ菌体表面に生産された場合、菌体そのものを酵素剤として用いることもできるが、破砕した後、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｔｗｅｅｎ－２０、あるいはＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０等の非イオン性の界面活性剤を低濃度で作用させ、遠心分離した上清よりマンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群を回収することができる。
培養液中にマンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群が生産された場合は、遠心分離・ろ過等により菌体を除去することによりマンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群を得ることができる。何れの場合も、硫安分画、各種クロマトグラフィー、アルコール沈殿、限外ろ過等を用いた常法により、得られたマンナン加水分解酵素群をさらに純度の高いものとして得ることもできる。
宿主は、転写制御因子により、その生物種の有しているマンナン加水分解酵素群の遺伝子の発現が制御されるものであれば特に限定されないが、具体的にはアスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガーなどが挙げられる。培地及び培養方法は、宿主の種類と組換えベクター中の発現制御配列によって適当なものを選ぶことができる。
例えば、宿主がアスペルギルス・オリゼであり、発現制御配列がＴＥＦ１プロモーターである場合、該転写制御因子を高発現させた形質転換体を、小麦フスマ等を用いた固体培養い、マンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群を効率的に生産させることが可能である。
転写制御因子の強制発現によりマンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群が菌体内又は菌体表面に生産された場合は、菌体を培地から分離し、その菌体を適当に処理することによりマンナン加水分解酵素群を得ることができる。
例えば、アスペルギルス・オリゼ菌体表面に生産された場合、菌体そのものを酵素剤として用いることもできるが、破砕した後、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｔｗｅｅｎ－２０、あるいはＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０等の非イオン性の界面活性剤を低濃度で作用させ、遠心分離した上清よりマンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群を回収することができる。
培養液中にマンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群が生産された場合は、遠心分離・ろ過等により菌体を除去することによりマンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群を得ることができる。何れの場合も、硫安分画、各種クロマトグラフィー、アルコール沈殿、限外ろ過等を用いた常法により、得られたマンナン加水分解酵素群をさらに純度の高いものとして得ることもできる。
菌体外マンナナーゼの活性の有無は、以下の方法で検定できる。１．０％グルコマンナン（Ｍｅｇａｚｙｍｅ社製）を含むＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ最少培地（０．０５％ ＫＣｌ，０．２％ ＮａＮＯ３，０．１％ ＫＨ２ＰＯ４，０．０５％ ＭｇＳＯ４，０．００１％ＦｅＳＯ４，２．０％ ａｇａｒ）のプレートに試験する検体を接種し、３０℃にて２～４日間程度培養する。
なお、培養日数及び培養温度については検体にあわせ適宜調整を行う必要がある。培養終了後、プレート中に約８ｍｌの０．２５％コンゴーレッドを加え１５分間染色後、約８ｍｌの１．０Ｍ ＮａＣｌ溶液にて３０分間、３回洗浄する。洗浄が完了したらプレートに約３～５ｍｌの５．０％酢酸を添加し室温で１０分間程度放置し、コンゴーレッドを青く発色させ、菌体外マンナナーゼ活性により形成されるハロを検出する。
又、菌体外セルラーゼ活性は以下の方法で検定できる。
２．０％カルボキシメチルセルロース（シグマ-アルドリッチ社製）を唯一の炭素原として含むＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ最少培地（０．０５％ ＫＣｌ，０．２％ ＮａＮＯ３，０．１％ ＫＨ２ＰＯ４，０．０５％ ＭｇＳＯ４，０．００１％ＦｅＳＯ４，２．０％ ａｇａｒ）のプレートに試験する検体を接種し、３０℃にて３～４日間程度培養する。なお、培養日数及び培養温度については検体にあわせ適宜調整を行う必要がある。培養終了後、上記の菌体外マンナナーゼ活性の検定法と同様に、コンゴーレッドによる染色を実施しハロを検出することで、菌体外セルラーゼ活性を検定することができる。
なお、培養日数及び培養温度については検体にあわせ適宜調整を行う必要がある。培養終了後、プレート中に約８ｍｌの０．２５％コンゴーレッドを加え１５分間染色後、約８ｍｌの１．０Ｍ ＮａＣｌ溶液にて３０分間、３回洗浄する。洗浄が完了したらプレートに約３～５ｍｌの５．０％酢酸を添加し室温で１０分間程度放置し、コンゴーレッドを青く発色させ、菌体外マンナナーゼ活性により形成されるハロを検出する。
又、菌体外セルラーゼ活性は以下の方法で検定できる。
２．０％カルボキシメチルセルロース（シグマ-アルドリッチ社製）を唯一の炭素原として含むＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ最少培地（０．０５％ ＫＣｌ，０．２％ ＮａＮＯ３，０．１％ ＫＨ２ＰＯ４，０．０５％ ＭｇＳＯ４，０．００１％ＦｅＳＯ４，２．０％ ａｇａｒ）のプレートに試験する検体を接種し、３０℃にて３～４日間程度培養する。なお、培養日数及び培養温度については検体にあわせ適宜調整を行う必要がある。培養終了後、上記の菌体外マンナナーゼ活性の検定法と同様に、コンゴーレッドによる染色を実施しハロを検出することで、菌体外セルラーゼ活性を検定することができる。
以下、実施例に即して本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの記載によって、なんら制限されるものではない。
［麹菌の転写制御因子（ｍａｎＲ）のスクリーニング］
麹菌アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株のゲノム配列は、２００５年に決定されており（Ｎａｔｕｒｅ，４３８：１１５７，２００５）、その情報はＤＯＧＡＮのデータベースから入手可能である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ.ｂｉｏ.ｎｉｔｅ.ｇｏ.ｊｐ／ｄｏｇａｎ／ＭｉｃｒｏＴｏｐ?ＧＥＮＯＭＥ＿ＩＤ＝ａｏ）。以前、本発者らは、このゲノム情報をもとにマニュアルで転写制御因子遺伝子のアノテーションを実施し、その遺伝子を網羅的に破壊した転写制御因子遺伝子破壊株ライブラリーを作製している（５ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｎｏ．１６，２００８，Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，ＵＫ）。
麹菌アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株のゲノム配列は、２００５年に決定されており（Ｎａｔｕｒｅ，４３８：１１５７，２００５）、その情報はＤＯＧＡＮのデータベースから入手可能である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ.ｂｉｏ.ｎｉｔｅ.ｇｏ.ｊｐ／ｄｏｇａｎ／ＭｉｃｒｏＴｏｐ?ＧＥＮＯＭＥ＿ＩＤ＝ａｏ）。以前、本発者らは、このゲノム情報をもとにマニュアルで転写制御因子遺伝子のアノテーションを実施し、その遺伝子を網羅的に破壊した転写制御因子遺伝子破壊株ライブラリーを作製している（５ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｎｏ．１６，２００８，Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，ＵＫ）。
本転写制御因子遺伝子破壊株ライブラリーの作製において使用した菌株は、アスペルギルス・オリゼＲｋｕＮ１６ｐｔｒ１株（Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２７５：４６０，２００６, Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，７０：１３５，２００６）及びその誘導体である、アスペルギルス・オリゼＲｋｕｐｔｒＰ２－１ ５－ＦＯＡ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎ ｎｏ．２株（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７４：７６８４，２００８）である。これらの２種類の株はいずれも、ゲノムシーケンスが行われたアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株の誘導体である。
本明細書では、アスペルギルス・オリゼＲｋｕｐｔｒＰ２－１ ５－ＦＯＡ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎ ｎｏ．２株をＲｋｕｐｔｒＰ２－１ΔＡＦ株または宿主株と標記する。ＲｋｕＮ１６ｐｔｒ１株では、遺伝子ターゲッティング効率の向上のために、非相同組換えに関与する遺伝子であるＫｕ７０を破壊してあり（Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２７５：４６０，２００６）、栄養要求性による選抜を可能とするためｐｙｒＧ遺伝子が破壊され、ウリジン要求性株となっている。さらに、ＲｋｕｐｔｒＰ２－１ΔＡＦ株では、ＲｋｕＮ１６ｐｔｒ１株のアフラトキシン生合成クラスターが除去され、予期せぬアフラトキシンの生産が起こらないようになっている（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７４：７６８４，２００８）。上記の変異部位以外については、いずれの２株も野生株であるアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０と同じ配列を有している。なお、後述の麹菌マンナンナーゼ転写制御因子破壊株（＝ＴＦ１５０破壊株、＝ｍａｎＲ破壊株）はＲｋｕｐｔｒＰ２－１ΔＡＦ株を宿主とし作製したものである。以後、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株を野生株と標記する。我々は、本破壊株ライブラリーより転写制御因子を見出すことを目的とし、破壊株ライブラリーのマンナナーゼ活性のハロアッセイによるによるスクリーニングを実施した。
本明細書では、アスペルギルス・オリゼＲｋｕｐｔｒＰ２－１ ５－ＦＯＡ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎ ｎｏ．２株をＲｋｕｐｔｒＰ２－１ΔＡＦ株または宿主株と標記する。ＲｋｕＮ１６ｐｔｒ１株では、遺伝子ターゲッティング効率の向上のために、非相同組換えに関与する遺伝子であるＫｕ７０を破壊してあり（Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２７５：４６０，２００６）、栄養要求性による選抜を可能とするためｐｙｒＧ遺伝子が破壊され、ウリジン要求性株となっている。さらに、ＲｋｕｐｔｒＰ２－１ΔＡＦ株では、ＲｋｕＮ１６ｐｔｒ１株のアフラトキシン生合成クラスターが除去され、予期せぬアフラトキシンの生産が起こらないようになっている（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７４：７６８４，２００８）。上記の変異部位以外については、いずれの２株も野生株であるアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０と同じ配列を有している。なお、後述の麹菌マンナンナーゼ転写制御因子破壊株（＝ＴＦ１５０破壊株、＝ｍａｎＲ破壊株）はＲｋｕｐｔｒＰ２－１ΔＡＦ株を宿主とし作製したものである。以後、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株を野生株と標記する。我々は、本破壊株ライブラリーより転写制御因子を見出すことを目的とし、破壊株ライブラリーのマンナナーゼ活性のハロアッセイによるによるスクリーニングを実施した。
本ライブラリーの破壊株は、ｐｙｒＧポジティブセレクションにより取得したものであるため、全てｐｙｒＧ＋株となっている。そのため、作成した破壊株を用いた転写制御因子のスクリーニングを実施するにあたり、ｐｙｒＧ欠失株である宿主株をコントロールとして用いることは適切ではない。そこで、宿主株のｐｙｒＧ遺伝子を復元した株を作製しコントロールとして使用した。その作成方法は下記の通りである。なお、本宿主株の作成方法についてはＦｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４７，１０－１８，２０１０にも記載されている。
配列番号３及び配列番号４に記したオリゴヌクレオチドプライマーを用い、野生株のｐｙｒＧ遺伝子の構造遺伝子、プロモーター及びターミネーターを含む約４．１ＫｂのＤＮＡフラグメントをＰＣＲにより増幅した。
酵素には正確性の高いＫＯＤ ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を使用し、鋳型ＤＮＡには１５０ｎｇの野生株由来ゲノムＤＮＡを用いた。反応系は全量３００μｌで実施した。反応液中のＭｇＳＯ４の終濃度は１．２ｍＭとし、終濃度が５．０％となるよう、ジメチルスルフォキシド（シグマ・アルドリッチジャパン社製）を添加し、ＰＣＲ反応は、９４℃２分の後、９４℃１０秒、５５℃１５秒、６８℃５分の３ステップサイクルを３０サイクル行った。
増幅産物の一部を０．８％アガロースゲルにて電気泳動を行い、約４．１ｋｂのＤＮＡフラグメントが増幅されていることを確認した。ＰＣＲ反応による増幅の確認後、残っている反応液全量を０．８％アガロースゲルにより電気泳動し、ゲル抽出によりＤＮＡフラグメントを精製した後、アルコール沈殿によりＤＮＡフラグメントを濃縮した。これをｐｙｒＧ復元用ベクターとした。
本ベクターを、前述の宿主株に常法であるプロトプラスト－ＰＥＧ法（Ｇｅｎｅ，６１：３８５，１９８７）を用いて導入した。
形質転換体の選抜は、ウリジンを含まず１．２Ｍソルビトールを含むＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ最少培地を利用したｐｙｒＧポジティブセレクションを実施し形質転換体を得た。
増幅産物の一部を０．８％アガロースゲルにて電気泳動を行い、約４．１ｋｂのＤＮＡフラグメントが増幅されていることを確認した。ＰＣＲ反応による増幅の確認後、残っている反応液全量を０．８％アガロースゲルにより電気泳動し、ゲル抽出によりＤＮＡフラグメントを精製した後、アルコール沈殿によりＤＮＡフラグメントを濃縮した。これをｐｙｒＧ復元用ベクターとした。
本ベクターを、前述の宿主株に常法であるプロトプラスト－ＰＥＧ法（Ｇｅｎｅ，６１：３８５，１９８７）を用いて導入した。
形質転換体の選抜は、ウリジンを含まず１．２Ｍソルビトールを含むＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ最少培地を利用したｐｙｒＧポジティブセレクションを実施し形質転換体を得た。
［形質転換体からのゲノムＤＮＡの調製］
形質転換体のｐｙｒＧ遺伝子復元の確認実験を実施するために、各検体からのゲノムＤＮＡの調製を行った。形質転換体、宿主株及び野生株を、１５０ｍｌ容の三角フラスコに入った４０ｍｌのデキストリン－ペプトン培地に植え、３０℃、１５０ｒｐｍで３日間培養した。
宿主株を培養する場合には、培地中に終濃度が１５ｍＭになるよう、ろ過滅菌したウリジンを添加した。培養終了後、ろ過により菌体を回収し、ペーパータオルで挟み、水分を除いた後、液体窒素を用いて急速に凍結させた。
次に、液体窒素を注いであらかじめ冷却してある乳鉢に凍結した菌体を入れ、あらかじめ液体窒素で冷却してある乳棒を用いて念入りに粉砕した。粉砕された菌体から、Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（プロメガ社製）を用いて全ＤＮＡを抽出したのち、ＤＮａｓｅ ｆｒｅｅ のＲＮａｓｅ Ｉ（ニッポンジーン社製）にて検体を処理し、混入していたＲＮＡを分解し以降の実験に用いた。
形質転換体のｐｙｒＧ遺伝子復元の確認実験を実施するために、各検体からのゲノムＤＮＡの調製を行った。形質転換体、宿主株及び野生株を、１５０ｍｌ容の三角フラスコに入った４０ｍｌのデキストリン－ペプトン培地に植え、３０℃、１５０ｒｐｍで３日間培養した。
宿主株を培養する場合には、培地中に終濃度が１５ｍＭになるよう、ろ過滅菌したウリジンを添加した。培養終了後、ろ過により菌体を回収し、ペーパータオルで挟み、水分を除いた後、液体窒素を用いて急速に凍結させた。
次に、液体窒素を注いであらかじめ冷却してある乳鉢に凍結した菌体を入れ、あらかじめ液体窒素で冷却してある乳棒を用いて念入りに粉砕した。粉砕された菌体から、Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（プロメガ社製）を用いて全ＤＮＡを抽出したのち、ＤＮａｓｅ ｆｒｅｅ のＲＮａｓｅ Ｉ（ニッポンジーン社製）にて検体を処理し、混入していたＲＮＡを分解し以降の実験に用いた。
［ｐｙｒＧ復元株のＰＣＲ法による確認］
前記方法により調製した形質転換体のゲノムＤＮＡ約１５０ｎｇを鋳型とし、配列番号３及び４のオリゴヌクレオチドプライマーを用いＰＣＲを行い、形質転換体中のｐｙｒＧ遺伝子が復元されているかを調べた。コントロールには、宿主株及び野生株由来のゲノムＤＮＡを鋳型とした反応系を用いた。ＰＣＲ用の酵素にはＥｘＴａｑ（タカラバイオ社製）を用い、反応系の終濃度が５．０％となるようにジメチルスルフォキシド（シグマ・アルドリッチジャパン社製）を添加した。それ以外の反応条件については、酵素添付のマニュアルにしたがい、反応液量は全量２０μｌで実施した。ＰＣＲ反応は、９４℃２分の後、９４℃１０秒、６８℃５分のシャトルサイクルを３０サイクル行った。その結果を図１に示す。
形質転換体、宿主株および野生株ともにシングルバンドが検出された。また、宿主株ではバンドが約２．８ｋｂに観測されたが形質転換体および野生株では約４．１ｋｂに観測された。このことから、形質転換体中のｐｙｒＧ遺伝子は野生株と同じ状態に復元されており、さらに核も純化されていることが示唆された。
前記方法により調製した形質転換体のゲノムＤＮＡ約１５０ｎｇを鋳型とし、配列番号３及び４のオリゴヌクレオチドプライマーを用いＰＣＲを行い、形質転換体中のｐｙｒＧ遺伝子が復元されているかを調べた。コントロールには、宿主株及び野生株由来のゲノムＤＮＡを鋳型とした反応系を用いた。ＰＣＲ用の酵素にはＥｘＴａｑ（タカラバイオ社製）を用い、反応系の終濃度が５．０％となるようにジメチルスルフォキシド（シグマ・アルドリッチジャパン社製）を添加した。それ以外の反応条件については、酵素添付のマニュアルにしたがい、反応液量は全量２０μｌで実施した。ＰＣＲ反応は、９４℃２分の後、９４℃１０秒、６８℃５分のシャトルサイクルを３０サイクル行った。その結果を図１に示す。
形質転換体、宿主株および野生株ともにシングルバンドが検出された。また、宿主株ではバンドが約２．８ｋｂに観測されたが形質転換体および野生株では約４．１ｋｂに観測された。このことから、形質転換体中のｐｙｒＧ遺伝子は野生株と同じ状態に復元されており、さらに核も純化されていることが示唆された。
［ｐｙｒＧ復元株のサザンハイブリダイゼーションによる確認］
形質転換体のサザンハイブリダイゼーションによる確認を実施した。形質転換体、宿主株及び野生株のゲノムＤＮＡ約５．０μｇを制限酵素ＢｇｌＩＩにより３７℃で一晩消化を行った後、０．８％アガロースゲルにより電気泳動を行った。泳動した核酸を、ポジティブ電荷を持つナイロン膜であるハイボンドＮ＋（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）にブロットした後、ジコキシゲニン（ＤＩＧ）－ラベルを行ったプローブを用い４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。ＤＩＧ－ラベルプローブの作製には、ＤＩＧ ＰＣＲ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ(ロシュダイアグノスティクス社製)を使用し、ＰＣＲ用の酵素にはＥｘＴａｑ（タカラバイオ社製）を、鋳型には１５０ｎｇの野生株のゲノムＤＮＡを用いた。ＰＣＲ用プライマーは配列番号５及び６に示すオリゴヌクレオチドプライマーを使用し、反応系は全量２５μｌで実施した。
形質転換体のサザンハイブリダイゼーションによる確認を実施した。形質転換体、宿主株及び野生株のゲノムＤＮＡ約５．０μｇを制限酵素ＢｇｌＩＩにより３７℃で一晩消化を行った後、０．８％アガロースゲルにより電気泳動を行った。泳動した核酸を、ポジティブ電荷を持つナイロン膜であるハイボンドＮ＋（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）にブロットした後、ジコキシゲニン（ＤＩＧ）－ラベルを行ったプローブを用い４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。ＤＩＧ－ラベルプローブの作製には、ＤＩＧ ＰＣＲ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ(ロシュダイアグノスティクス社製)を使用し、ＰＣＲ用の酵素にはＥｘＴａｑ（タカラバイオ社製）を、鋳型には１５０ｎｇの野生株のゲノムＤＮＡを用いた。ＰＣＲ用プライマーは配列番号５及び６に示すオリゴヌクレオチドプライマーを使用し、反応系は全量２５μｌで実施した。
ハイブリダイゼーション後のメンブレンの洗浄及びシグナルの検出は、ＤＩＧ ｓｙｓｔｅｍ（ロシュダイアグノスティクス社製）の取扱説明書に従い実施した。その結果を図２に示す。
宿主株ではｐｙｒＧ遺伝子が欠失しているためバンドが確認されないが、形質転換体では約３ｋｂにシングルバンドが確認され、そのサイズは野生株で検出されたバンドのサイズと一致していた。これらのことから、取得した形質転換体中のｐｙｒＧ遺伝子は野生株と同じ状態に復元されていると判断した。ＰＣＲによる確認では、本形質転換体の核は純化されていることが確認され、さらに、取得した形質転換体はいずれも明確にｐｙｒＧ＋株の表現型を示した。以上の結果より、得られた形質転換体は核純化された宿主株のｐｙｒＧ復元株であると判断した。そしてこの株をＲｋｕｐｔｒＰ２－１ΔＡＦ／Ｐ株と名づけ、以降の実施例にて使用した。また、本明細書では以降、ＲｋｕｐｔｒＰ２－１ΔＡＦ／Ｐ株をコントロール株と標記した。
宿主株ではｐｙｒＧ遺伝子が欠失しているためバンドが確認されないが、形質転換体では約３ｋｂにシングルバンドが確認され、そのサイズは野生株で検出されたバンドのサイズと一致していた。これらのことから、取得した形質転換体中のｐｙｒＧ遺伝子は野生株と同じ状態に復元されていると判断した。ＰＣＲによる確認では、本形質転換体の核は純化されていることが確認され、さらに、取得した形質転換体はいずれも明確にｐｙｒＧ＋株の表現型を示した。以上の結果より、得られた形質転換体は核純化された宿主株のｐｙｒＧ復元株であると判断した。そしてこの株をＲｋｕｐｔｒＰ２－１ΔＡＦ／Ｐ株と名づけ、以降の実施例にて使用した。また、本明細書では以降、ＲｋｕｐｔｒＰ２－１ΔＡＦ／Ｐ株をコントロール株と標記した。
［スクリーニングの方法］
該転写制御因子のスクリーニング方法は次の通りである。１．０％グルコマンナン（Ｍｅｇａｚｙｍｅ社製）を含むＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ最少培地（０．０５％ ＫＣｌ，０．２％ ＮａＮＯ３，０．１％ ＫＨ２ＰＯ４，０．０５％ ＭｇＳＯ４，０．００１％ＦｅＳＯ４，２．０％ ａｇａｒ）のプレートに試験する検体を接種し、３０℃にて３日間培養した。培養終了後、プレート中に約８ｍｌの０．２５％コンゴーレッドを加え１５分間染色後、約８ｍｌの１．０Ｍ ＮａＣｌ溶液にて３０分間、３回洗浄した。洗浄後、プレートに約３～５ｍｌの５．０％酢酸を添加し室温で１０分間程度放置しコンゴーレッドを青く発色させ、菌体外マンナナーゼ活性により形成されるハロを検出した。本実験では、コントロール株をポジティブコントロールとして使用した。約１８０株の転写制御因子遺伝子破壊株をスクリーニング試験に供したところ、６株においてハロの著しい減少がみられた（図３）。
その６株のなかで、機能未知でカビ由来の転写制御因子にてよく見出される、Ｚｎ２Ｃｙｓ６タイプのジンクフィンガーモチーフを有する転写制御因子を一つ見出した（表３、ＴＦ１５０）。本転写制御因子を麹菌におけるマンナン加水分解酵素群転写制御因子とし、ｍａｎＲと名づけた。
該転写制御因子のスクリーニング方法は次の通りである。１．０％グルコマンナン（Ｍｅｇａｚｙｍｅ社製）を含むＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ最少培地（０．０５％ ＫＣｌ，０．２％ ＮａＮＯ３，０．１％ ＫＨ２ＰＯ４，０．０５％ ＭｇＳＯ４，０．００１％ＦｅＳＯ４，２．０％ ａｇａｒ）のプレートに試験する検体を接種し、３０℃にて３日間培養した。培養終了後、プレート中に約８ｍｌの０．２５％コンゴーレッドを加え１５分間染色後、約８ｍｌの１．０Ｍ ＮａＣｌ溶液にて３０分間、３回洗浄した。洗浄後、プレートに約３～５ｍｌの５．０％酢酸を添加し室温で１０分間程度放置しコンゴーレッドを青く発色させ、菌体外マンナナーゼ活性により形成されるハロを検出した。本実験では、コントロール株をポジティブコントロールとして使用した。約１８０株の転写制御因子遺伝子破壊株をスクリーニング試験に供したところ、６株においてハロの著しい減少がみられた（図３）。
その６株のなかで、機能未知でカビ由来の転写制御因子にてよく見出される、Ｚｎ２Ｃｙｓ６タイプのジンクフィンガーモチーフを有する転写制御因子を一つ見出した（表３、ＴＦ１５０）。本転写制御因子を麹菌におけるマンナン加水分解酵素群転写制御因子とし、ｍａｎＲと名づけた。
［ｍａｎＲ破壊株の作製方法］
転写制御因子破壊株ライブラリー中のｍａｎＲ破壊株（＝ＴＦ１５０破壊株）は、下記に記した方法にて作製したものである。本発者は、マニュアルアノテーションにより、１つのＺｎ２Ｃｙｓ６タイプのジンクフィンガーモチーフを有する転写制御因子遺伝子が、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０の第８染色体ＳＣ０１０内の５４５６０１から５４３１１５の間に存在していると予想した。
ライブラリー作製時には、本領域に存在すると考えられる遺伝子をターゲットとし遺伝子破壊用ベクターの設計を実施し、配列番号７から１２までのオリゴヌクレオチドプライマーの設計を行った。
転写制御因子破壊株ライブラリー中のｍａｎＲ破壊株（＝ＴＦ１５０破壊株）は、下記に記した方法にて作製したものである。本発者は、マニュアルアノテーションにより、１つのＺｎ２Ｃｙｓ６タイプのジンクフィンガーモチーフを有する転写制御因子遺伝子が、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０の第８染色体ＳＣ０１０内の５４５６０１から５４３１１５の間に存在していると予想した。
ライブラリー作製時には、本領域に存在すると考えられる遺伝子をターゲットとし遺伝子破壊用ベクターの設計を実施し、配列番号７から１２までのオリゴヌクレオチドプライマーの設計を行った。
遺伝子破壊用ベクターの作製方法は次のとおりである。始めに、相同組換え用の左右のアーム部分（フラグメントＬ及びＲ）及び形質転換時のマーカー遺伝子であるｐｙｒＧ（フラグメントＰ）のＤＮＡフラグメントをＰＣＲ法により増幅した。
ＰＣＲには、正確性の高いＫＯＤ ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を使用した。反応液中のＭｇＳＯ４の終濃度は、フラグメントＬ及びＲの増幅では１．２ｍＭ、Ｐフラグメントの増幅時は２．０ｍＭにし、必要に応じて終濃度が５．０から７．０％となるよう、ジメチルスルフォキシド（シグマ・アルドリッチジャパン社製）を添加した。
ＰＣＲ用のプライマーは、フラグメントＬの増幅では配列番号７と８、フラグメントＲの増幅では配列番号１１と１２を、そしてフラグメントＰの増幅では配列番号９及び１０をセットとして使用した。
ＰＣＲ反応の鋳型には１５０ｎｇの野生株のゲノムＤＮＡを使用し、反応系は全量５０μｌで実施した。
ＰＣＲ反応は、９４℃、２分の後、９４℃１０秒、５５℃１５秒、６８℃２分３０秒を３０サイクル行った。増幅産物の一部を０．８％アガロースゲルで電気泳動し、フラグメントＬ及びＲでは約１．６ｋｂと約１．５ｋｂのＤＮＡフラグメントが増幅されており、フラグメントＰでは２．２ｋｂのＤＮＡフラグメントが増幅されていることを確認した。
ＰＣＲには、正確性の高いＫＯＤ ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を使用した。反応液中のＭｇＳＯ４の終濃度は、フラグメントＬ及びＲの増幅では１．２ｍＭ、Ｐフラグメントの増幅時は２．０ｍＭにし、必要に応じて終濃度が５．０から７．０％となるよう、ジメチルスルフォキシド（シグマ・アルドリッチジャパン社製）を添加した。
ＰＣＲ用のプライマーは、フラグメントＬの増幅では配列番号７と８、フラグメントＲの増幅では配列番号１１と１２を、そしてフラグメントＰの増幅では配列番号９及び１０をセットとして使用した。
ＰＣＲ反応の鋳型には１５０ｎｇの野生株のゲノムＤＮＡを使用し、反応系は全量５０μｌで実施した。
ＰＣＲ反応は、９４℃、２分の後、９４℃１０秒、５５℃１５秒、６８℃２分３０秒を３０サイクル行った。増幅産物の一部を０．８％アガロースゲルで電気泳動し、フラグメントＬ及びＲでは約１．６ｋｂと約１．５ｋｂのＤＮＡフラグメントが増幅されており、フラグメントＰでは２．２ｋｂのＤＮＡフラグメントが増幅されていることを確認した。
配列中に示した下線は、フュージョンＰＣＲで使用するための付加配列であり、第一段階目のＰＣＲではテンプレートＤＮＡとアニーリングしない領域である。
電気泳動による増幅の確認後、残っているＬ、Ｒ及びＰのＤＮＡフラグメントの全量を０．８％アガロースゲルにて電気泳動を行い、サーバーグリーンＩ（タカラバイオ社製）により染色したのち、ＤＮＡが損傷することを防ぐため、可視光照射下でＤＮＡのバンドを切り出した。
切り出したバンドよりＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＤＮＡフラグメントを精製したのち、Ｌフラグメント１．８μｌ、Ｒフラグメント１．８μｌ及びＰのフラグメント５．４μｌを混合しフュージョンＰＣＲ用の鋳型とした。
切り出したバンドよりＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＤＮＡフラグメントを精製したのち、Ｌフラグメント１．８μｌ、Ｒフラグメント１．８μｌ及びＰのフラグメント５．４μｌを混合しフュージョンＰＣＲ用の鋳型とした。
次に、フュージョンＰＣＲによりＬ、Ｒ及びＰのフラグメントを結合させた。ＰＣＲには先程と同様にＫＯＤ ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を使用した。反応液中のＭｇＳＯ４の終濃度は１．２ｍＭとし、終濃度が５．０％となるよう、ジメチルスルフォキシド（シグマ・アルドリッチジャパン社製）を添加した。ＰＣＲ用のプライマーは、配列番号７及び１２をセットとし使用した。ＰＣＲ反応の鋳型には、先程作製した９μｌのＬ、Ｒ及びＰの混合液を用い、反応系は全量３００μｌで実施した。ＰＣＲ反応は、９４℃２分の後、９４℃１０秒、６８℃６分３０秒のシャトルサイクルを３０サイクル行った。
増幅産物の一部を、０．８％アガロースゲルにより電気泳動し、約５－ｋｂのＤＮＡフラグメントが増幅されていることを確認した。ＰＣＲ反応による増幅の確認後、残っている反応液全量を０．８％アガロースゲルにより電気泳動し、サーバーグリーンＩ（タカラバイオ社製）により染色したのち、ＤＮＡが損傷することを防ぐため、可視光照射下でＤＮＡのバンドを切り出した。切り出したバンドより、Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＤＮＡフラグメントを精製し、アルコール沈殿により濃縮後、沈殿を１０μｌのＴＥ緩衝液に溶解させた。これを麹菌のｍａｎＲ破壊用ベクターとした。
本ベクターを、前述の宿主株に常法であるプロトプラスト－ＰＥＧ法（Ｇｅｎｅ，６１：３８５，１９８７）を用いて導入した。
形質転換体の選抜は、ウリジンを含まず１．２Ｍソルビトールを含むＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ最少培地を利用したｐｙｒＧポジティブセレクションにより実施した。得られた形質転換体中のｍａｎＲ遺伝子の破壊は、ＰＣＲ法及びサザンハイブリダイゼーション法により確認した。
ｍａｎＲ破壊の概要については、図４に記すとおりである。
増幅産物の一部を、０．８％アガロースゲルにより電気泳動し、約５－ｋｂのＤＮＡフラグメントが増幅されていることを確認した。ＰＣＲ反応による増幅の確認後、残っている反応液全量を０．８％アガロースゲルにより電気泳動し、サーバーグリーンＩ（タカラバイオ社製）により染色したのち、ＤＮＡが損傷することを防ぐため、可視光照射下でＤＮＡのバンドを切り出した。切り出したバンドより、Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＤＮＡフラグメントを精製し、アルコール沈殿により濃縮後、沈殿を１０μｌのＴＥ緩衝液に溶解させた。これを麹菌のｍａｎＲ破壊用ベクターとした。
本ベクターを、前述の宿主株に常法であるプロトプラスト－ＰＥＧ法（Ｇｅｎｅ，６１：３８５，１９８７）を用いて導入した。
形質転換体の選抜は、ウリジンを含まず１．２Ｍソルビトールを含むＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ最少培地を利用したｐｙｒＧポジティブセレクションにより実施した。得られた形質転換体中のｍａｎＲ遺伝子の破壊は、ＰＣＲ法及びサザンハイブリダイゼーション法により確認した。
ｍａｎＲ破壊の概要については、図４に記すとおりである。
［ｍａｎＲ破壊株からのゲノムＤＮＡの調製］
作製したｍａｎＲ破壊株において、対象とする遺伝子領域が正しく破壊されているかを、ＰＣＲ法により確認した。ｍａｎＲ破壊株及び宿主株を、１５０ｍｌ容の三角フラスコに入った４０ｍｌのデキストリン－ペプトン培地に植え、３０℃、１５０ｒｐｍで３日間培養した。宿主株を培養する場合には、培地中に終濃度が１５ｍＭになるよう、ろ過滅菌したウリジンを添加した。培養終了後、ろ過により菌体を回収したのち、実施例１に記したゲノムＤＮＡの調製方法と同じ方法を用い、ゲノムＤＮＡを抽出・精製した。
作製したｍａｎＲ破壊株において、対象とする遺伝子領域が正しく破壊されているかを、ＰＣＲ法により確認した。ｍａｎＲ破壊株及び宿主株を、１５０ｍｌ容の三角フラスコに入った４０ｍｌのデキストリン－ペプトン培地に植え、３０℃、１５０ｒｐｍで３日間培養した。宿主株を培養する場合には、培地中に終濃度が１５ｍＭになるよう、ろ過滅菌したウリジンを添加した。培養終了後、ろ過により菌体を回収したのち、実施例１に記したゲノムＤＮＡの調製方法と同じ方法を用い、ゲノムＤＮＡを抽出・精製した。
［ｍａｎＲ破壊株のＰＣＲ法による確認］
前記の方法に従って調製したｍａｎＲ破壊株のゲノムＤＮＡ約１５０ｎｇを鋳型とし、配列番号１３及び１４のオリゴヌクレオチドプライマーを用いＰＣＲを行った。コントロールには、宿主株由来のＤＮＡを鋳型とした反応系を用いた。ＰＣＲ用の酵素にはＥｘＴａｑ（タカラバイオ社製）を用い、反応系の終濃度が５．０％となるようにジメチルスルフォキシド（シグマ・アルドリッチジャパン社製）を添加した。それ以外の反応条件については、酵素添付のマニュアルにしたがい、反応液量は全量２０μｌで実施した。ＰＣＲ反応は、９４℃２分の後、９４℃１０秒、６８℃８分のシャトルサイクルを３０サイクル行った。
前記の方法に従って調製したｍａｎＲ破壊株のゲノムＤＮＡ約１５０ｎｇを鋳型とし、配列番号１３及び１４のオリゴヌクレオチドプライマーを用いＰＣＲを行った。コントロールには、宿主株由来のＤＮＡを鋳型とした反応系を用いた。ＰＣＲ用の酵素にはＥｘＴａｑ（タカラバイオ社製）を用い、反応系の終濃度が５．０％となるようにジメチルスルフォキシド（シグマ・アルドリッチジャパン社製）を添加した。それ以外の反応条件については、酵素添付のマニュアルにしたがい、反応液量は全量２０μｌで実施した。ＰＣＲ反応は、９４℃２分の後、９４℃１０秒、６８℃８分のシャトルサイクルを３０サイクル行った。
増幅産物の一部を０．７％アガロースゲルにより電気泳動し確認したところ、ｍａｎＲ破壊株由来の増幅産物のバンドが、宿主株由来の増幅産物と比較してシフトしていることがわかった。またｍａｎＲ破壊株由来の増幅産物のバンドは１本しかみられなかったことから、得られている形質転換体はホモカリオンであることが示唆された（図５）。
［ｍａｎＲ破壊株のサザンハイブリダイゼーション法による確認］
形質転換体のサザンハイブリダイゼーションによる確認を実施した。ｍａｎＲ破壊株及び宿主株のゲノムＤＮＡ約５．０μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢｇｌＩＩにより３７℃で一晩消化を行った後、０．８％アガロースゲルにより電気泳動を行った。泳動した核酸を、ポジティブ電荷を持つナイロン膜であるハイボンドＮ＋（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）にブロットした後、ジコキシゲニン（ＤＩＧ）－ラベルを行ったプローブを用い、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。ＤＩＧ－ラベルプローブの作製には、ＤＩＧ ＰＣＲ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ(ロシュダイアグノスティクス社製)を使用し、ＰＣＲ用の酵素にはＥｘＴａｑ（タカラバイオ社製）を、鋳型には１００ｎｇのアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０のゲノムＤＮＡを用いた。ＰＣＲ用プライマーは配列番号１５及び１６に示すオリゴヌクレオチドプライマーを使用し、反応系は全量２５μｌで実施した。
形質転換体のサザンハイブリダイゼーションによる確認を実施した。ｍａｎＲ破壊株及び宿主株のゲノムＤＮＡ約５．０μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢｇｌＩＩにより３７℃で一晩消化を行った後、０．８％アガロースゲルにより電気泳動を行った。泳動した核酸を、ポジティブ電荷を持つナイロン膜であるハイボンドＮ＋（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）にブロットした後、ジコキシゲニン（ＤＩＧ）－ラベルを行ったプローブを用い、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。ＤＩＧ－ラベルプローブの作製には、ＤＩＧ ＰＣＲ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ(ロシュダイアグノスティクス社製)を使用し、ＰＣＲ用の酵素にはＥｘＴａｑ（タカラバイオ社製）を、鋳型には１００ｎｇのアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０のゲノムＤＮＡを用いた。ＰＣＲ用プライマーは配列番号１５及び１６に示すオリゴヌクレオチドプライマーを使用し、反応系は全量２５μｌで実施した。
反応は、９４℃２分の後、９４℃１０秒、５５℃１５秒、６０℃１分間を３０サイクル実施した。ＰＣＲ反応終了後、反応液の一部を２％アガロースゲルにより電気泳動を行い、本ＰＣＲ産物にＤＩＧラベルされたヌクレオチドが取り込まれることを確認した。本ＤＩＧラベル化プローブをハイブリダイゼーションに使用した。ハイブリダイゼーション後のメンブレンの洗浄及びシグナルの検出は、ＤＩＧ ｓｙｓｔｅｍ（ロシュダイアグノスティクス社製）の取扱説明書に従い実施した。その結果を図６に示す。ｍａｎＲ破壊株及び宿主株ともにシングルバンドが検出されていた。また、宿主株ではバンドが約４．０ｋｂに観測されたが破壊株では約６．４ｋｂに観測され、両者では明確な違いがあることがわかった。また、このバンドサイズは、理論値と合致するものであった。上記のとおり、ｍａｎＲ破壊株の破壊用ベクターは正しく導入されており、その株の核は純化されていることを確認した。
［麹菌の液体培養時におけるｍａｎＲ破壊によるマンナン分解活性への影響］
麹菌アスペルギルス・オリゼよりマンナナーゼが生産された場合には、培地に存在する多糖であるグルコマンナンが分解されることにより、単糖やオリゴ糖などの還元糖が生成する。この還元糖の量の測定により、ｍａｎＲ破壊により麹菌のマンナナーゼ生産量に影響が及ぼされるかを調べた。実験の条件は以下のとおりである。
ｍａｎＲ破壊株及びコントロール株の分生子約１０，０００，０００個を１５０ｍｌ容の三角フラスコに入った４０ｍｌのＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ最少培地（３．０％ ｇｌｕｃｏｓｅ，０．０５％ ＫＣｌ，０．２ ％ ＮａＮＯ３，０．１％ ＫＨ２ＰＯ４，０．０５％ ＭｇＳＯ４，０．００１％ ＦｅＳＯ４，ｐＨ ６．０）にて、２０時間培養し分生子を発芽させた。培養終了後、菌体を滅菌済みのミラクロス（カルビオケム社製）により回収したのち、集めた菌体を１．０％グルコマンナン（メガザイム社製）を炭素源としたＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ最少培地中で３０℃、２０時間、１５０ｒｐｍにて培養し、滅菌済みのミラクロスを用いてろ過することにより菌体を除去した。
得られた培養液１．０ｍｌを１．５ｍｌ容のプラスチック製マイクロチューブに移し、１００℃で１０分間加熱することにより培地中に存在する酵素類を失活させた後、室温で３０分以上放置し冷却した。冷却後、反応液中に生成している還元糖をソモギー・ネルソン法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．；１９５，１９，１９５２）により測定した。
検体量線の作成には、マンノースを標準として用いた。なお、還元糖の定量時には測定の有効範囲に入るよう適宜超純水を用いて希釈を行った。実験は培養から破壊株及びコントロール株ともに培養から独立した４連で実施した。本測定結果を図７に示す。
生成されていた還元糖量平均値は、ｍａｎＲ破壊株では１０．０μｍｏｌ／ｍｌであったのに対しコントロール株では４５．１μｍｏｌ／ｍｌと約４．５倍の差が見られた。この差は、菌体外に分泌されるマンナナーゼの発現量がｍａｎＲの破壊により少なくなることから、グルコマンナンから遊離される還元糖の量に差が出たためであると考えられる。ｍａｎＲ破壊株では、グルコマンナンプレートを用いたハロアッセイにおいても、その菌体外のマンナナーゼ活性が低下することが確認されている。
以上のことから、麹菌アスペルギルス・オリゼのｍａｎＲは、菌体外のマンナン加水分解酵素群の発現を正に制御する因子であることが強く示唆された。
麹菌アスペルギルス・オリゼよりマンナナーゼが生産された場合には、培地に存在する多糖であるグルコマンナンが分解されることにより、単糖やオリゴ糖などの還元糖が生成する。この還元糖の量の測定により、ｍａｎＲ破壊により麹菌のマンナナーゼ生産量に影響が及ぼされるかを調べた。実験の条件は以下のとおりである。
ｍａｎＲ破壊株及びコントロール株の分生子約１０，０００，０００個を１５０ｍｌ容の三角フラスコに入った４０ｍｌのＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ最少培地（３．０％ ｇｌｕｃｏｓｅ，０．０５％ ＫＣｌ，０．２ ％ ＮａＮＯ３，０．１％ ＫＨ２ＰＯ４，０．０５％ ＭｇＳＯ４，０．００１％ ＦｅＳＯ４，ｐＨ ６．０）にて、２０時間培養し分生子を発芽させた。培養終了後、菌体を滅菌済みのミラクロス（カルビオケム社製）により回収したのち、集めた菌体を１．０％グルコマンナン（メガザイム社製）を炭素源としたＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ最少培地中で３０℃、２０時間、１５０ｒｐｍにて培養し、滅菌済みのミラクロスを用いてろ過することにより菌体を除去した。
得られた培養液１．０ｍｌを１．５ｍｌ容のプラスチック製マイクロチューブに移し、１００℃で１０分間加熱することにより培地中に存在する酵素類を失活させた後、室温で３０分以上放置し冷却した。冷却後、反応液中に生成している還元糖をソモギー・ネルソン法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．；１９５，１９，１９５２）により測定した。
検体量線の作成には、マンノースを標準として用いた。なお、還元糖の定量時には測定の有効範囲に入るよう適宜超純水を用いて希釈を行った。実験は培養から破壊株及びコントロール株ともに培養から独立した４連で実施した。本測定結果を図７に示す。
生成されていた還元糖量平均値は、ｍａｎＲ破壊株では１０．０μｍｏｌ／ｍｌであったのに対しコントロール株では４５．１μｍｏｌ／ｍｌと約４．５倍の差が見られた。この差は、菌体外に分泌されるマンナナーゼの発現量がｍａｎＲの破壊により少なくなることから、グルコマンナンから遊離される還元糖の量に差が出たためであると考えられる。ｍａｎＲ破壊株では、グルコマンナンプレートを用いたハロアッセイにおいても、その菌体外のマンナナーゼ活性が低下することが確認されている。
以上のことから、麹菌アスペルギルス・オリゼのｍａｎＲは、菌体外のマンナン加水分解酵素群の発現を正に制御する因子であることが強く示唆された。
［ｍａｎＲ破壊株のＤＮＡマイクロアレイ解析によるｍａｎＲ制御下にあるマンナン加水分解酵素の同定］
ｍａｎＲの制御下に有るマンナン加水分解酵素遺伝子を特定するため、ｍａｎＲ破壊株のＤＮＡマイクロアレイ解析を実施した。
まず、サンプルのＴｏｔａｌ ＲＮＡの抽出を実施した。ｍａｎＲ破壊株及びコントロール株の分生子約１０，０００，０００個を１５０ｍｌ容の三角フラスコに入った４０ｍｌのＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ最少培地にて、２０時間培養し分生子を発芽させた。
培養終了後、菌体を滅菌済みのミラクロス（カルビオケム社製）により回収したのち、集めた菌体を１．０％グルコマンナン（メガザイム社製）を炭素源としたＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ最少培地にて３０℃、２０時間、１５０ｒｐｍにて培養した。滅菌済みのミラクロスを用いて菌体をろ過により回収し、ペーパータオルにより挟み水分を除いた後、液体窒素を用いて急速に凍結させた。
次に、液体窒素を注いであらかじめ冷却してある乳鉢に凍結した菌体を入れ、液体窒素であらかじめ冷却してある乳棒を用いて念入りに粉砕した。粉砕された菌体から、ＩＳＯＧＥＮ Ｋｉｔ(ニッポンジーン社製)を使用してＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した後、ＲＮａｓｅ ＦｒｅｅのＤＮａｓｅＩ（タカラバイオ社製）により混入しているＤＮＡを分解し、さらにＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｃｏｌｕｍｎ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製を行った。
精製後、ＲＮＡ濃度及び純度は分光光度計ＧｅｎｅＳｐｅｃIII（日立社製）を用いて測定し、ＲＮＡの品質はバイオアナライザー２１００（アジレント社製）を用いたキャピラリー電気泳動法により確認した。電気泳動のチップにはＲＮＡ６０００ ＬａｂＣｈｉｐを使用した。
品質チェックの結果、ＲＮＡ Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ Ｎｕｍｂｅｒ（ＲＩＮ）が５．８以上のサンプルをＤＮＡマイクロアレイ解析に使用した。
ｍａｎＲの制御下に有るマンナン加水分解酵素遺伝子を特定するため、ｍａｎＲ破壊株のＤＮＡマイクロアレイ解析を実施した。
まず、サンプルのＴｏｔａｌ ＲＮＡの抽出を実施した。ｍａｎＲ破壊株及びコントロール株の分生子約１０，０００，０００個を１５０ｍｌ容の三角フラスコに入った４０ｍｌのＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ最少培地にて、２０時間培養し分生子を発芽させた。
培養終了後、菌体を滅菌済みのミラクロス（カルビオケム社製）により回収したのち、集めた菌体を１．０％グルコマンナン（メガザイム社製）を炭素源としたＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ最少培地にて３０℃、２０時間、１５０ｒｐｍにて培養した。滅菌済みのミラクロスを用いて菌体をろ過により回収し、ペーパータオルにより挟み水分を除いた後、液体窒素を用いて急速に凍結させた。
次に、液体窒素を注いであらかじめ冷却してある乳鉢に凍結した菌体を入れ、液体窒素であらかじめ冷却してある乳棒を用いて念入りに粉砕した。粉砕された菌体から、ＩＳＯＧＥＮ Ｋｉｔ(ニッポンジーン社製)を使用してＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した後、ＲＮａｓｅ ＦｒｅｅのＤＮａｓｅＩ（タカラバイオ社製）により混入しているＤＮＡを分解し、さらにＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｃｏｌｕｍｎ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製を行った。
精製後、ＲＮＡ濃度及び純度は分光光度計ＧｅｎｅＳｐｅｃIII（日立社製）を用いて測定し、ＲＮＡの品質はバイオアナライザー２１００（アジレント社製）を用いたキャピラリー電気泳動法により確認した。電気泳動のチップにはＲＮＡ６０００ ＬａｂＣｈｉｐを使用した。
品質チェックの結果、ＲＮＡ Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ Ｎｕｍｂｅｒ（ＲＩＮ）が５．８以上のサンプルをＤＮＡマイクロアレイ解析に使用した。
上記工程により得られたＴｏｔａｌ ＲＮＡを使用し、ＤＮＡマイクロアレイ解析を実施した。サンプルとしてｍａｎＲ破壊株を培養して得られたＲＮＡを、コントロールとしてコントロール株を培養して得られたＲＮＡを用いた。
破壊株及びコントロール株ともに、培養から独立した４連で実験を行った。また、色素バイアスを避けるため、４枚アレイの中で２枚はコントロール株をＣｙ－３側に、破壊株をＣｙ－５側においた実験を行い、残りの２枚はカラースワップをした実験を行った。５００ｎｇのＴｏｔａｌ ＲＮＡをＬｏｗ ＲＮＡ Ｉｎｐｕｔ Ｌｉｎｅｒ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ(アジレント社製)を用いてＣｙ－３もしくはＣｙ－５により標識した。標識方法は本キット付属の取扱説明書に従った。次に標識したＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｃｏｌｕｍｎ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製後、得られたＲＮＡの量及び品質を分光光度計ＧｅｎｅＳｐｅｃIII（日立社製）及びキャピラリー電気泳動装置バイオアナライザー２１００(アジレント社製)を用いて確認した。
得られた標識済みＲＮＡをそれぞれ８５０ｎｇずつ混合後、麹菌の全遺伝子を搭載したＤＮＡマイクロアレイ（アジレント４Ｘ４４ Ｋ フォーマットカスタムアレイ；野田産業科学研究所製）にハイブリダイズさせた。
アレイのハイブリダイゼーション及び洗浄、スキャン方法はアジレント社の取扱説明書にしたがって実施した。アレイスライドはＧ２５０５Ｂマクロアレイスキャナー（アジレント社製）を用いてスキャンし、スキャン後のデータはＦｅａｔｕｒｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｖｅｒｓｉｏｎ９．５．１（アジレント社製）を用いて数値化及び色素バイアスの除去を行った。
補正後のデータ解析では、４アレイのＲａｔｉｏの平均値と標準偏差を主に使用した。また、必要に応じて市販の統計解析ソフトであるアジレントＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ｖｅｒｓｉｏｎ ７．３．１やフリーの統計解析ソフトのパッケージであるＲ２．４．１．（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒ－ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／）を使用した。
破壊株及びコントロール株ともに、培養から独立した４連で実験を行った。また、色素バイアスを避けるため、４枚アレイの中で２枚はコントロール株をＣｙ－３側に、破壊株をＣｙ－５側においた実験を行い、残りの２枚はカラースワップをした実験を行った。５００ｎｇのＴｏｔａｌ ＲＮＡをＬｏｗ ＲＮＡ Ｉｎｐｕｔ Ｌｉｎｅｒ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ(アジレント社製)を用いてＣｙ－３もしくはＣｙ－５により標識した。標識方法は本キット付属の取扱説明書に従った。次に標識したＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｃｏｌｕｍｎ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製後、得られたＲＮＡの量及び品質を分光光度計ＧｅｎｅＳｐｅｃIII（日立社製）及びキャピラリー電気泳動装置バイオアナライザー２１００(アジレント社製)を用いて確認した。
得られた標識済みＲＮＡをそれぞれ８５０ｎｇずつ混合後、麹菌の全遺伝子を搭載したＤＮＡマイクロアレイ（アジレント４Ｘ４４ Ｋ フォーマットカスタムアレイ；野田産業科学研究所製）にハイブリダイズさせた。
アレイのハイブリダイゼーション及び洗浄、スキャン方法はアジレント社の取扱説明書にしたがって実施した。アレイスライドはＧ２５０５Ｂマクロアレイスキャナー（アジレント社製）を用いてスキャンし、スキャン後のデータはＦｅａｔｕｒｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｖｅｒｓｉｏｎ９．５．１（アジレント社製）を用いて数値化及び色素バイアスの除去を行った。
補正後のデータ解析では、４アレイのＲａｔｉｏの平均値と標準偏差を主に使用した。また、必要に応じて市販の統計解析ソフトであるアジレントＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ｖｅｒｓｉｏｎ ７．３．１やフリーの統計解析ソフトのパッケージであるＲ２．４．１．（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒ－ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／）を使用した。
アレイ解析結果の概要を図８に示す。
本アレイの解析において、４枚のアレイ実験すべてにおいて有意に発現していた遺伝子数は、９，６８８個で全体の７４．７％であった。一方、発現が確認されない又は擬陽性の遺伝子数は、３，２８５個で、全体の２５．３％であった。
また、有意に発現していることが確認された遺伝子の中で、ｍａｎＲ破壊株とコントロール株を比較して５倍以上発現が増加した遺伝子は１５９個（１．６％）、５倍以上発現が減少した遺伝子は１３３個（１．４％）、変化が見られない遺伝子は９，３９６個（９７．０％）であった。図９は、ｍａｎＲ破壊により発現が低下した遺伝子の中から上位２５位までを示したものである。
図９に記載されている遺伝子の発現量の減少量は最も少ないものでも１３．６倍（２５位）、最も大きいものでは４４．１倍（１位）であった。図９に示される遺伝子の中には、糖質加水分解酵素の遺伝子が７個含まれており、そのうちの２つは糖質加水分解酵素ファミリー５（ＧＨ５）に分類されるマンナナーゼをコードすると予想される遺伝子であった（ＡＯ０９００１００００１２２及びＡＯ０９００３８０００４４４）。
また、マンノオリゴ糖を分解する、糖質加水分解酵素ファミリー２（ＧＨ２）に分類されるマンノシダーゼをコードする遺伝子も２つ含まれていた（ＡＯ０９０００５０００７４０及びＡＯ０９００１００００２０８）。
さらに、ガラクトマンナンの側鎖に結合しているガラクトースを加水分解する、糖質加水分解酵素ファミリー２７（ＧＨ２７）に分類されるα－ガラクトシダーゼをコードする遺伝子も１つ含まれていた（ＡＯ０９０００３００１３０５）。以上の結果から、ｍａｎＲはマンナン類の加水分解に関与する酵素群を包括的に制御する転写制御因子であることが示唆された。
本アレイの解析において、４枚のアレイ実験すべてにおいて有意に発現していた遺伝子数は、９，６８８個で全体の７４．７％であった。一方、発現が確認されない又は擬陽性の遺伝子数は、３，２８５個で、全体の２５．３％であった。
また、有意に発現していることが確認された遺伝子の中で、ｍａｎＲ破壊株とコントロール株を比較して５倍以上発現が増加した遺伝子は１５９個（１．６％）、５倍以上発現が減少した遺伝子は１３３個（１．４％）、変化が見られない遺伝子は９，３９６個（９７．０％）であった。図９は、ｍａｎＲ破壊により発現が低下した遺伝子の中から上位２５位までを示したものである。
図９に記載されている遺伝子の発現量の減少量は最も少ないものでも１３．６倍（２５位）、最も大きいものでは４４．１倍（１位）であった。図９に示される遺伝子の中には、糖質加水分解酵素の遺伝子が７個含まれており、そのうちの２つは糖質加水分解酵素ファミリー５（ＧＨ５）に分類されるマンナナーゼをコードすると予想される遺伝子であった（ＡＯ０９００１００００１２２及びＡＯ０９００３８０００４４４）。
また、マンノオリゴ糖を分解する、糖質加水分解酵素ファミリー２（ＧＨ２）に分類されるマンノシダーゼをコードする遺伝子も２つ含まれていた（ＡＯ０９０００５０００７４０及びＡＯ０９００１００００２０８）。
さらに、ガラクトマンナンの側鎖に結合しているガラクトースを加水分解する、糖質加水分解酵素ファミリー２７（ＧＨ２７）に分類されるα－ガラクトシダーゼをコードする遺伝子も１つ含まれていた（ＡＯ０９０００３００１３０５）。以上の結果から、ｍａｎＲはマンナン類の加水分解に関与する酵素群を包括的に制御する転写制御因子であることが示唆された。
［ｍａｎＲ により制御されると予想されるマンナン加水分解酵素群の機能解析］
ＤＮＡマイクロアレイ解析によってｍａｎＲの制御下にあることが示唆された５つのマンナン加水分解酵素群遺伝子について、酵母サッカロミセス・セレビシエ においてポリヒスチジンタグ融合蛋白質として発現させ、実際にマンナン加水分解酵素群として機能するものであるかを調べた。使用したオリゴヌクレオチドプライマーは表７に記す通りである。
ＤＮＡマイクロアレイ解析によってｍａｎＲの制御下にあることが示唆された５つのマンナン加水分解酵素群遺伝子について、酵母サッカロミセス・セレビシエ においてポリヒスチジンタグ融合蛋白質として発現させ、実際にマンナン加水分解酵素群として機能するものであるかを調べた。使用したオリゴヌクレオチドプライマーは表７に記す通りである。
アニーリングに関与しない付加配列を下線で、酵母発現用ベクターに組み込むための制限酵素サイト部分を斜体で示した。また、上流側プライマーには翻訳効率の向上のため、開始コドンの手前に９塩基のＡを導入した。
次に、上記のオリゴヌクレオチドプライマーを用い、ＲＴ－ＰＣＲにより発現させる遺伝子を増幅した。まず、実施例６に示した方法にて、１．０％グルコマンナン培地にてコントロール株を培養し、その菌体よりＴｏｔａｌ ＲＮＡを回収し濃度及び品質の確認を行った。
このＴｏｔａｌ ＲＮＡ１００ｎｇを鋳型とし、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ(タカラバイオ社製)を用いて逆転写反応を行った。反応液の組成は本酵素付属の取扱説明書に従い、逆転写時のオリゴヌクレオチドプライマーは、キット付属のオリゴｄＴプライマーを使用し、全量２０μｌにて反応を実施した。逆転写反応は、５０℃にて３０分実施し、７０℃で１０分間加熱することにより逆転写酵素を失活させたのち、次のＰＣＲを実施するまで４℃で保管した。ＰＣＲ用酵素には正確性の高いＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （東洋紡績社製）を使用した。反応系に終濃度が５．０％となるように分子生物学用のジメチルスルフォキシド（シグマ・アルドリッチジャパン社製）を添加した。それ以外の反応条件については酵素添付のマニュアルに従い、前述のｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして１．０ μｌ添加し、オリゴヌクレオチドプライマーはそれぞれ終濃度が１．０μＭになるように加え、全量５０μｌで反応を行った。
オリゴヌクレオチドプライマーの組み合せは、ＡＯ０９００３８０００４４４の増幅時には配列番号１７と１８を、ＡＯ０９００１００００１２２の増幅時には配列番号１９番と２０番を、ＡＯ０９００１００００２０８の増幅時には配列番号２１と２２を、ＡＯ０９０００５０００７４０の増幅時には配列番号２３と２４を、そしてＡＯ０９０００３００１３０５の増幅時には配列番号２５と２６を使用した。ＰＣＲ反応は、９４℃２分の後、９４℃１０秒、５８℃１５秒、７２℃４分００秒を３０サイクル行った。
このＴｏｔａｌ ＲＮＡ１００ｎｇを鋳型とし、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ(タカラバイオ社製)を用いて逆転写反応を行った。反応液の組成は本酵素付属の取扱説明書に従い、逆転写時のオリゴヌクレオチドプライマーは、キット付属のオリゴｄＴプライマーを使用し、全量２０μｌにて反応を実施した。逆転写反応は、５０℃にて３０分実施し、７０℃で１０分間加熱することにより逆転写酵素を失活させたのち、次のＰＣＲを実施するまで４℃で保管した。ＰＣＲ用酵素には正確性の高いＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （東洋紡績社製）を使用した。反応系に終濃度が５．０％となるように分子生物学用のジメチルスルフォキシド（シグマ・アルドリッチジャパン社製）を添加した。それ以外の反応条件については酵素添付のマニュアルに従い、前述のｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして１．０ μｌ添加し、オリゴヌクレオチドプライマーはそれぞれ終濃度が１．０μＭになるように加え、全量５０μｌで反応を行った。
オリゴヌクレオチドプライマーの組み合せは、ＡＯ０９００３８０００４４４の増幅時には配列番号１７と１８を、ＡＯ０９００１００００１２２の増幅時には配列番号１９番と２０番を、ＡＯ０９００１００００２０８の増幅時には配列番号２１と２２を、ＡＯ０９０００５０００７４０の増幅時には配列番号２３と２４を、そしてＡＯ０９０００３００１３０５の増幅時には配列番号２５と２６を使用した。ＰＣＲ反応は、９４℃２分の後、９４℃１０秒、５８℃１５秒、７２℃４分００秒を３０サイクル行った。
反応終了後、反応液の一部を０．８％アガロースゲルにより電気泳動を行い、それぞれの目的の産物が増幅していることを確認した。確認終了後、残りの反応液を０．８％アガロースゲルにより電気泳動し、サイバーグリーンＩ（タカラバイオ社製）により染色した後、ＤＮＡの損傷を避けるため可視光照射下で目的のサイズのＤＮＡバンドを切り出した。
切り出したバンドよりＧｅｎｅ ＣｌｅａｎＩＩ Ｋｉｔ （ＱＢｉｏｇｅｎｅ社製）を用いてＤＮＡフラグメントを精製したのち、ＴａＫａＲａ Ｍｉｇｈｔｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ （Ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ； タカラバイオ社製）を用いて精製ＤＮＡフラグメントを平滑末端化及びリン酸化後、ｐＵＣ１１８のＨｉｎｃＩＩサイトにライゲーションした。
ライゲーション反応後、反応により得られたプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９株に導入し形質転換体を得た。本形質転換体よりＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドを抽出・精製した。
得られたプラスミド５０ｎｇをＢａｍＨＩにて消化し０．８％アガロースゲルにより電気泳動を行い、目的とするＤＮＡ断片が連結されているプラスミドを選別した。インサートが挿入されていたプラスミドについては、対象配列の増幅時に使用したオリゴヌクレオチドプライマーを用い、サンガー法による塩基配列の解析を実施し、得られた遺伝子に変異が導入されていないことを確認した。
得られたプラスミドはそれぞれ、ＡＯ０９００３８０００４４４をサブクローニングしたプラスミドはｐＵＣ－ＡｏｍａｎＡと、ＡＯ０９００１００００１２２をサブクローニングしたプラスミドはｐＵＣ－ＡｏｍａｎＢと、ＡＯ０９００１００００２０８をサブクローニングしたプラスミドはｐＵＣ－ＡｏｍｎｄＡと、ＡＯ０９０００５０００７４０をサブクローニングしたプラスミドはｐＵＣ－ＡｏｍｎｄＢと、そしてＡＯ０９０００３００１３０５をサブクローニングしたプラスミドをｐＵＣ－ＡｏａｇａＡと名づけた。
切り出したバンドよりＧｅｎｅ ＣｌｅａｎＩＩ Ｋｉｔ （ＱＢｉｏｇｅｎｅ社製）を用いてＤＮＡフラグメントを精製したのち、ＴａＫａＲａ Ｍｉｇｈｔｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ （Ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ； タカラバイオ社製）を用いて精製ＤＮＡフラグメントを平滑末端化及びリン酸化後、ｐＵＣ１１８のＨｉｎｃＩＩサイトにライゲーションした。
ライゲーション反応後、反応により得られたプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９株に導入し形質転換体を得た。本形質転換体よりＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドを抽出・精製した。
得られたプラスミド５０ｎｇをＢａｍＨＩにて消化し０．８％アガロースゲルにより電気泳動を行い、目的とするＤＮＡ断片が連結されているプラスミドを選別した。インサートが挿入されていたプラスミドについては、対象配列の増幅時に使用したオリゴヌクレオチドプライマーを用い、サンガー法による塩基配列の解析を実施し、得られた遺伝子に変異が導入されていないことを確認した。
得られたプラスミドはそれぞれ、ＡＯ０９００３８０００４４４をサブクローニングしたプラスミドはｐＵＣ－ＡｏｍａｎＡと、ＡＯ０９００１００００１２２をサブクローニングしたプラスミドはｐＵＣ－ＡｏｍａｎＢと、ＡＯ０９００１００００２０８をサブクローニングしたプラスミドはｐＵＣ－ＡｏｍｎｄＡと、ＡＯ０９０００５０００７４０をサブクローニングしたプラスミドはｐＵＣ－ＡｏｍｎｄＢと、そしてＡＯ０９０００３００１３０５をサブクローニングしたプラスミドをｐＵＣ－ＡｏａｇａＡと名づけた。
次に、目的蛋白質の酵母サッカロミセス・セレビシエでの発現用のベクターを構築した。本実施例８にて前述のｐＵＣ１１８に対象遺伝子を挿入したプラスミド５種類１．５μｇを制限酵素消化し、それぞれのプラスミドに挿入されているインサートを切り出した。制限酵素は、ｐＵＣ－ＡｏｍａｎＡ、ｐＵＣ－ＡｏｍｎｄＢ及びｐＵＣ－ＡｏａｇａＡを消化するときにはＢａｍＨＩとＸｈｏＩを、ｐＵＣ－ＡｏｍａｎＢを消化するときには、ＢｇｌＩＩとＸｈｏＩを、ｐＵＣ－ＡｏｍｎｄＢを消化するときにはＢａｍＨＩとＳａｌＩを使用し、３７℃で一晩反応させた。反応終了後、反応液を０．８％アガロースゲルによって電気泳動し、前記の方法によりインサートＤＮＡフラグメントを精製した。
精製した各フラグメントを、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩにより消化・脱リン酸化後、精製を行ってある酵母／大腸菌シャトルベクターｐＹＥＳ２／ＣＴ（インビトロジェン社製）にライゲーションし、本実施例８のｐＵＣ１１８への対象遺伝子の挿入にて記したプラスミドの確認方法に従い、プラスミドの選抜及び確認を行った。なお、ｐＹＥＳ２／ＣＴには、選択マーカー用のＵＲＡ３、ＧＡＬ１プロモーター、ＣＹＣ１ターミネーターそしてポリヒスチジンタグをコードしている領域が存在する。この、ポリヒスチジンタグ部分と目的遺伝子が融合蛋白質となるように組み込んだ。作製したプラスミドはそれぞれ、ＡＯ０９００３８０００４４４発現用ベクターはｐＹＥＳ－ＡＯ－ｍａｎＡＨ６、ＡＯ０９００１００００１２２発現用ベクターはｐＹＥＳ－ＡＯ－ｍａｎＢＨ６、ＡＯ０９００１００００２０８発現用ベクターはｐＹＥＳ－ＡＯ－ｍｎｄＡＨ６、ＡＯ０９０００５０００７４０発現用ベクターはｐＹＥＳ－ＡＯ－ｍｎｄＢＨ６、そしてＡＯ０９０００３００１３０５発現用ベクターはｐＹＥＳ－ＡＯ－ａｇａＡＨ６と名づけた。酵母発現用ベクターの例として、ｐＹＥＳ－ＡＯ－ｍａｎＡＨ６の構造を図１０に記した。その他の４種類のベクターに関しても基本的な構造はｐＹＥＳ－ＡＯ－ｍａｎＡＨ６と同じであり、発現させるＯＲＦの部分のみが異なっている。
精製した各フラグメントを、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩにより消化・脱リン酸化後、精製を行ってある酵母／大腸菌シャトルベクターｐＹＥＳ２／ＣＴ（インビトロジェン社製）にライゲーションし、本実施例８のｐＵＣ１１８への対象遺伝子の挿入にて記したプラスミドの確認方法に従い、プラスミドの選抜及び確認を行った。なお、ｐＹＥＳ２／ＣＴには、選択マーカー用のＵＲＡ３、ＧＡＬ１プロモーター、ＣＹＣ１ターミネーターそしてポリヒスチジンタグをコードしている領域が存在する。この、ポリヒスチジンタグ部分と目的遺伝子が融合蛋白質となるように組み込んだ。作製したプラスミドはそれぞれ、ＡＯ０９００３８０００４４４発現用ベクターはｐＹＥＳ－ＡＯ－ｍａｎＡＨ６、ＡＯ０９００１００００１２２発現用ベクターはｐＹＥＳ－ＡＯ－ｍａｎＢＨ６、ＡＯ０９００１００００２０８発現用ベクターはｐＹＥＳ－ＡＯ－ｍｎｄＡＨ６、ＡＯ０９０００５０００７４０発現用ベクターはｐＹＥＳ－ＡＯ－ｍｎｄＢＨ６、そしてＡＯ０９０００３００１３０５発現用ベクターはｐＹＥＳ－ＡＯ－ａｇａＡＨ６と名づけた。酵母発現用ベクターの例として、ｐＹＥＳ－ＡＯ－ｍａｎＡＨ６の構造を図１０に記した。その他の４種類のベクターに関しても基本的な構造はｐＹＥＳ－ＡＯ－ｍａｎＡＨ６と同じであり、発現させるＯＲＦの部分のみが異なっている。
［発現ベクターのサッカロミセス・セレビシエＩＮＶＳｃ１株への導入］
サッカロミセス・セレビシエＩＮＶＳｃ１株は、ウラシル要求性ｕｒａ３－５２変異を持つ株であり、ｕｒａ３を有するｐＹＥＳ２／ＣＴベクターによる形質転換が可能である。本菌株のコンピテントセルはＳ．ｃ．Ｅａｓｙ酵母コンピテントセル作製キット（インビトロジェン社製）を用いて作製した。本コンピテントセルに実施例８に記したマンナン加水分解酵素群の発現用ベクター５種をそれぞれ導入し、ウラシルを含まないＳＣ最少培地上で選択することにより、それぞれの形質転換体を得た。菌株名はそれぞれ、ＡＯ０９００３８０００４４４発現株はＩＮＶ－ＡＯ－ｍａｎＡ株、ＡＯ０９００１００００１２２発現株はＩＮＶ－ＡＯ－ｍａｎＢ株、ＡＯ０９００１００００２０８発現株はＩＮＶ－ＡＯ－ｍｎｄＡ株、ＡＯ０９０００５０００７４０発現株はＩＮＶ－ＡＯ－ｍｎｄＢ株、そしてＡＯ０９０００３００１３０５発現株はＩＮＶ－ＡＯ－ａｇａＡ株と名づけた。
また、酵母発現実験のコントロールとして、ＩＮＶＳｃ１株にｐＹＥＳ２／ＣＴ／ｌａｃＺ（ベクターにｌａｃＺ遺伝子が組込まれたプラスミド）を導入したＩＮＶＳｃ１／ｐＹＥＳ２ｌａｃＺ株も作製した。
サッカロミセス・セレビシエＩＮＶＳｃ１株は、ウラシル要求性ｕｒａ３－５２変異を持つ株であり、ｕｒａ３を有するｐＹＥＳ２／ＣＴベクターによる形質転換が可能である。本菌株のコンピテントセルはＳ．ｃ．Ｅａｓｙ酵母コンピテントセル作製キット（インビトロジェン社製）を用いて作製した。本コンピテントセルに実施例８に記したマンナン加水分解酵素群の発現用ベクター５種をそれぞれ導入し、ウラシルを含まないＳＣ最少培地上で選択することにより、それぞれの形質転換体を得た。菌株名はそれぞれ、ＡＯ０９００３８０００４４４発現株はＩＮＶ－ＡＯ－ｍａｎＡ株、ＡＯ０９００１００００１２２発現株はＩＮＶ－ＡＯ－ｍａｎＢ株、ＡＯ０９００１００００２０８発現株はＩＮＶ－ＡＯ－ｍｎｄＡ株、ＡＯ０９０００５０００７４０発現株はＩＮＶ－ＡＯ－ｍｎｄＢ株、そしてＡＯ０９０００３００１３０５発現株はＩＮＶ－ＡＯ－ａｇａＡ株と名づけた。
また、酵母発現実験のコントロールとして、ＩＮＶＳｃ１株にｐＹＥＳ２／ＣＴ／ｌａｃＺ（ベクターにｌａｃＺ遺伝子が組込まれたプラスミド）を導入したＩＮＶＳｃ１／ｐＹＥＳ２ｌａｃＺ株も作製した。
［ポリヒスチジンタグ融合蛋白質の発現・精製・活性測定］
実施例９にて作製した５種類の融合タンパク質発現株およびコントロールであるＩＮＶＳｃ１／ｐＹＥＳ２ｌａｃＺ株を培養し、ポリヒスチジンタグ融合蛋白質を得た。その手順は以下の通りである。
まずそれぞれの株を、２％グルコースを含みかつウラシルを含まないＳＣ最少寒天培地に白金耳を用いて塗布し、３０℃にて４日間培養しコロニーを得た。そのコロニーを、２％ラフィノースを含みかつウラシルを含まない２０ｍｌのＳＣ最少培地に接種し、３０℃、１８０ｒｐｍにて４８時間振盪培養した。培養終了後、それぞれの６００ｎｍにおける吸光度を測定し、５０ｍｌの誘導培地に接種したときに吸光度が０．４になる量の培養液を滅菌遠沈管にとり、遠心分離により上清を除いた。得られたそれぞれの菌体を、２％ガラクトースを含み、かつ、ウラシルを含まない５０ｍｌのＳＣ培地（誘導培地）に懸濁し、３０℃、１８０ｒｐｍにて２４時間振盪培養した。培養終了後、培養液全量を遠心分離し菌体を回収したのち、沈殿を１０ｍｌの冷水により洗浄した後、菌体を回収し－８０℃で保存した。
実施例９にて作製した５種類の融合タンパク質発現株およびコントロールであるＩＮＶＳｃ１／ｐＹＥＳ２ｌａｃＺ株を培養し、ポリヒスチジンタグ融合蛋白質を得た。その手順は以下の通りである。
まずそれぞれの株を、２％グルコースを含みかつウラシルを含まないＳＣ最少寒天培地に白金耳を用いて塗布し、３０℃にて４日間培養しコロニーを得た。そのコロニーを、２％ラフィノースを含みかつウラシルを含まない２０ｍｌのＳＣ最少培地に接種し、３０℃、１８０ｒｐｍにて４８時間振盪培養した。培養終了後、それぞれの６００ｎｍにおける吸光度を測定し、５０ｍｌの誘導培地に接種したときに吸光度が０．４になる量の培養液を滅菌遠沈管にとり、遠心分離により上清を除いた。得られたそれぞれの菌体を、２％ガラクトースを含み、かつ、ウラシルを含まない５０ｍｌのＳＣ培地（誘導培地）に懸濁し、３０℃、１８０ｒｐｍにて２４時間振盪培養した。培養終了後、培養液全量を遠心分離し菌体を回収したのち、沈殿を１０ｍｌの冷水により洗浄した後、菌体を回収し－８０℃で保存した。
酵母の破砕には、ＦａｓｔＰＲＯＴＥＩＮ ＲＥＤ Ｋｉｔ （エムピーバイオ社製）を用いた。まず、Ｙｅａｓｔ ｂｒｅａｋｉｇ ｂｕｆｆｅｒ １０ｍｌに１錠のコンプリート・ミニ・ＥＤＴＡフリー（プロテアーゼインヒビターカクテル、ロシュダイアグノスティクス社製）を溶解させ氷上にて使用時まで保管した（以後本溶液をＹＢＢ＋ＰＩと標記する）。次に、凍結保存している菌体を氷上で穏やかに解凍した後、菌体（約３００－４００ｍｇ）を２．０ｍｌのＹＢＢ＋ＰＩに懸濁させ、Ａｃｉｄ ｗａｓｈ済みガラスビーズの入った２ｍｌ容スクリューキャップ着きチューブ２本に、約１．２ｍｌずつ分注した。このチューブを４℃にてボルテックスミキサーにより１分間激しく撹拌したのち氷上にて１分間冷却するサイクルを５回行い、菌体を破砕した。破砕後、１０，０００×ｇにて１０分間、４℃にて遠心分離することによりガラスビーズおよび菌体の残骸を除去した。この上清に対して当量の４０ｍＭイミダゾールを含む３Ｍ ＮａＣｌ・１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を加えたのち穏やかに混合した。これを、あらかじめ２０ｍＭイミダゾールを含む１．５Ｍ ＮａＣｌ・５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）により平衡化した１ｍｌ容ＨｉｓＴｒａｐＨＰカラム（ニッケルアフィニティーカラム、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）にアプライした。そしてこのカラムを、２０ｍｌの平衡化に使用したものと同じ緩衝液により洗浄したのち、５ｍｌの５００ｍＭのイミダゾールを含む１．５ＭＮａＣｌ・５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を流し目的タンパク質を溶出させた。さらにＭｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ３０（限外ろ過器、分画分子量３０，０００、ミリポア社製）を用い、溶出画分の濃縮および脱塩を行った。
精製・濃縮したポリヒスチジンタグ融合蛋白質の各種糖質加水分解酵素活性の測定方法は下記の通りである。
まず、検体のマンナナーゼ活性は次の方法を用いて測定した。５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に２％（Ｗ／Ｖ）のＡｚｏ－Ｃａｒｏｂ－Ｇａｌａｃｔｏｍａｎｎａｎ（メガザイム社製）を溶解させた基質溶液５０μｌに、５０μｌの濃縮・脱塩済みの検体を加えボルテックスミキサーにより５秒間撹拌したのち、３７℃にて１時間反応させた。本反応液に、２５０μｌの９９．５％エタノールを添加して反応を停止し、室温にて１０分間静置した。さらにこの溶液を５００×ｇで１０分間遠心分離し未反応の高分子物質を沈殿させたのち、上清中の加水分解によって遊離したアゾ色素の吸収極大である５９０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、マンナナーゼ活性を定量した。また、酵素溶液をあらかじめ１００℃で１０分間処理し失活させたものを用いて検体と同様に反応を行い、その測定値を各サンプルのブランク値として用いた。
また、検体のマンノシダーゼ活性は次の方法により測定した。３０μｌの濃縮・脱塩済みの検体に、３０μｌの５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）と４０μｌの２．５ｍＭ ｐ－ニトロフェニル－β－Ｄ－マンノピラノシド（シグマ・アルドリッチ社製）を加え、３７℃にて１２時間反応させた。反応液に１００μｌの５００ｍＭ炭酸ナトリウム溶液を加え反応を停止させ、加水分解により遊離したｐ－ニトロフェノールの吸収極大である４０５ｎｍの吸光度を測定することにより、マンノシダーゼ活性を定量した。またブランクでは、検体の代わりに５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて反応を行い、基質の自己分解量の測定を行った。
また、検体のα―ガラクトシダーゼ活性は次の方法により測定した。始めに、各サンプルを５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を用いて２０倍希釈した。２０μｌの希釈済みの検体に４０μｌの５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）と４０μｌの２．５ｍＭ ｐ－ニトロフェニルーαーＤ－ガラクトピラノシド（和光純薬工業社製）を加え、３７℃にて３０分間反応させた。反応液に１００μｌの５００ｍＭ炭酸ナトリウム溶液を加え反応を停止させ、加水分解により遊離したｐ－ニトロフェノールの吸収極大である４０５ｎｍの吸光度を測定することにより、α―ガラクトシダーゼ活性を定量した。またブランクとして、検体の代わりに５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を用いて反応を行い、基質の自己分解量の測定を行った。測定後、希釈倍率である２０を検体の測定値からブランク値を差し引いた値（ΔＯＤ４０５ｎｍ）にかけ、検体原液中の酵素活性を算出した。
まず、検体のマンナナーゼ活性は次の方法を用いて測定した。５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に２％（Ｗ／Ｖ）のＡｚｏ－Ｃａｒｏｂ－Ｇａｌａｃｔｏｍａｎｎａｎ（メガザイム社製）を溶解させた基質溶液５０μｌに、５０μｌの濃縮・脱塩済みの検体を加えボルテックスミキサーにより５秒間撹拌したのち、３７℃にて１時間反応させた。本反応液に、２５０μｌの９９．５％エタノールを添加して反応を停止し、室温にて１０分間静置した。さらにこの溶液を５００×ｇで１０分間遠心分離し未反応の高分子物質を沈殿させたのち、上清中の加水分解によって遊離したアゾ色素の吸収極大である５９０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、マンナナーゼ活性を定量した。また、酵素溶液をあらかじめ１００℃で１０分間処理し失活させたものを用いて検体と同様に反応を行い、その測定値を各サンプルのブランク値として用いた。
また、検体のマンノシダーゼ活性は次の方法により測定した。３０μｌの濃縮・脱塩済みの検体に、３０μｌの５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）と４０μｌの２．５ｍＭ ｐ－ニトロフェニル－β－Ｄ－マンノピラノシド（シグマ・アルドリッチ社製）を加え、３７℃にて１２時間反応させた。反応液に１００μｌの５００ｍＭ炭酸ナトリウム溶液を加え反応を停止させ、加水分解により遊離したｐ－ニトロフェノールの吸収極大である４０５ｎｍの吸光度を測定することにより、マンノシダーゼ活性を定量した。またブランクでは、検体の代わりに５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて反応を行い、基質の自己分解量の測定を行った。
また、検体のα―ガラクトシダーゼ活性は次の方法により測定した。始めに、各サンプルを５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を用いて２０倍希釈した。２０μｌの希釈済みの検体に４０μｌの５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）と４０μｌの２．５ｍＭ ｐ－ニトロフェニルーαーＤ－ガラクトピラノシド（和光純薬工業社製）を加え、３７℃にて３０分間反応させた。反応液に１００μｌの５００ｍＭ炭酸ナトリウム溶液を加え反応を停止させ、加水分解により遊離したｐ－ニトロフェノールの吸収極大である４０５ｎｍの吸光度を測定することにより、α―ガラクトシダーゼ活性を定量した。またブランクとして、検体の代わりに５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を用いて反応を行い、基質の自己分解量の測定を行った。測定後、希釈倍率である２０を検体の測定値からブランク値を差し引いた値（ΔＯＤ４０５ｎｍ）にかけ、検体原液中の酵素活性を算出した。
活性測定の結果を図１１に示した。まず、発現コントロールであるＩＮＶＳｃ１／ｐＹＥＳ２ｌａｃＺ株では、高いβ―ガラクトシダーゼ活性が見られたが、マンナナーゼ、マンノシダーゼおよびα―ガラクトシダーゼ活性は認められなかった。このことから、Ｈｉｓ－Ｔｒａｐ－ＨＰカラムを用いて精製した画分には、酵母由来のマンナナーゼ、マンノシダーゼおよびα―ガラクトシダーゼが混入しないことがわかった。次にＡＯ０９００３８０００４４４とＡＯ０９００１００００１２２のマンナナーゼ活性について調べたところ、両検体ともに有意な活性を有していることがわかった。次に、ＡＯ０９００１００００２０８とＡＯ０９０００５０００７４０のマンノシダーゼ活性について検討したところ、ＡＯ０９００１００００２０８では有意な活性が見られたが、ＡＯ０９０００５０００７４０では活性が見られなかった。また、両検体ともにマンナナーゼ活性は見られなかった。さらに、ＡＯ０９０００３００１３０５のα―ガラクトシダーゼ活性を調べたところ、非常に高い活性を有していることがわかった。
本実施例にて活性を有することが確認できた４つの遺伝子の働きを併せると、側鎖を有するガラクトマンナンを単糖であるマンノースとガラクトースにまで分解することが可能である。このことからｍａｎＲは、麹菌が天然界に広く存在しているガラクトマンナンを分解するのに必要な糖質加水分解酵素群の発現を、包括的に制御している転写制御因子であることがわかった。
本実施例にて活性を有することが確認できた４つの遺伝子の働きを併せると、側鎖を有するガラクトマンナンを単糖であるマンノースとガラクトースにまで分解することが可能である。このことからｍａｎＲは、麹菌が天然界に広く存在しているガラクトマンナンを分解するのに必要な糖質加水分解酵素群の発現を、包括的に制御している転写制御因子であることがわかった。
［ｍａｎＲのスプライシング済み転写産物の配列解析］
ｍａｎＲ遺伝子のスプライシング済みの（イントロンが除去済み）転写産物の配列を調べるためＲＴ－ＰＣＲを行い、得られたｃＤＮＡフラグメントの塩基配列の解析を行った。まず、実施例６に示した方法にて、１．０％グルコマンナンを炭素源としたＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ培地にてコントロール株を培養し、その菌体よりＴｏｔａｌ ＲＮＡを回収し濃度及び品質の確認を行った。
このＴｏｔａｌ ＲＮＡ１００ｎｇを鋳型とし、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｐｔａｓｅ(タカラバイオ社製)を用いて逆転写反応を行い、スプライシング済み（イントロン除去済み）ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡを得た。反応液の組成は本酵素付属の取扱説明書に従い、逆転写時のオリゴヌクレオチドプライマーは、キット付属のオリゴｄＴプライマーを使用し、全量２０μｌにて反応を実施した。逆転写反応は、５０℃にて３０分実施し、７０℃で１０分間加熱することにより逆転写酵素を失活させたのち、次のＰＣＲを実施するまで４℃で保管した。
ｍａｎＲ遺伝子のスプライシング済みの（イントロンが除去済み）転写産物の配列を調べるためＲＴ－ＰＣＲを行い、得られたｃＤＮＡフラグメントの塩基配列の解析を行った。まず、実施例６に示した方法にて、１．０％グルコマンナンを炭素源としたＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ培地にてコントロール株を培養し、その菌体よりＴｏｔａｌ ＲＮＡを回収し濃度及び品質の確認を行った。
このＴｏｔａｌ ＲＮＡ１００ｎｇを鋳型とし、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｐｔａｓｅ(タカラバイオ社製)を用いて逆転写反応を行い、スプライシング済み（イントロン除去済み）ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡを得た。反応液の組成は本酵素付属の取扱説明書に従い、逆転写時のオリゴヌクレオチドプライマーは、キット付属のオリゴｄＴプライマーを使用し、全量２０μｌにて反応を実施した。逆転写反応は、５０℃にて３０分実施し、７０℃で１０分間加熱することにより逆転写酵素を失活させたのち、次のＰＣＲを実施するまで４℃で保管した。
上記ｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを実施した。ＰＣＲ用の酵素には正確性の高いＫＯＤ ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を用い、反応系に終濃度が５．０％になるようにジメチルスルフォキシド（シグマ・アルドリッチジャパン社製）を添加した。
それ以外の反応条件については、酵素添付のマニュアルに従い、鋳型であるｃＤＮＡは１．０μｌ添加し、反応液量は全量５０μｌで実施した。
ＰＣＲ反応は、９４℃２分の後、９４℃１０秒、５５℃１５秒、６８℃２分を３０サイクル行った。ＲＴ－ＰＣＲにて増幅した４本のフラグメント（フラグメントＡ、Ｂ、Ｃ及びＤ）の概略を図１２に示す。
オリゴヌクレオチドプライマーは、Ａフラグメントの増幅時には配列番号２７と２８を、Ｂフラグメントの増幅時には配列番号２９と３０を、Ｃフラグメントの増幅時には配列番号３１と３２を、フラグメントＤの増幅では配列番号３３と３４のプライマーを用いた。
それ以外の反応条件については、酵素添付のマニュアルに従い、鋳型であるｃＤＮＡは１．０μｌ添加し、反応液量は全量５０μｌで実施した。
ＰＣＲ反応は、９４℃２分の後、９４℃１０秒、５５℃１５秒、６８℃２分を３０サイクル行った。ＲＴ－ＰＣＲにて増幅した４本のフラグメント（フラグメントＡ、Ｂ、Ｃ及びＤ）の概略を図１２に示す。
オリゴヌクレオチドプライマーは、Ａフラグメントの増幅時には配列番号２７と２８を、Ｂフラグメントの増幅時には配列番号２９と３０を、Ｃフラグメントの増幅時には配列番号３１と３２を、フラグメントＤの増幅では配列番号３３と３４のプライマーを用いた。
反応液の一部を、１．５％アガロースゲルを用いた電気泳動により確認したところ、フラグメントＡを増幅したものでは約４００ｂｐの産物が、フラグメントＢを増幅したものでは約８５０ｂｐの産物が、フラグメントＣを増幅したものでは約１２００ｂｐの産物が、そしてフラグメントＤを増幅したものでは約９００ｂｐの産物が増幅されていた。
増幅を確認後、フラグメントＡ、Ｂ、Ｃ及びＤの全ての検体において残っていたＰＣＲ産物全量を１．５％アガロースゲルにより電気泳動し、ゲル抽出によりＤＮＡフラグメントを精製したのち、得られたフラグメントをサンガー法によるＤＮＡシーケンス解析に用いた。各ＤＮＡフラグメントの塩基配列の解析は、各フラグメントを増幅したプライマーをそれぞれ用い、対象配列の両側より塩基配列の決定を行った。なお、本塩基配列の決定の操作は、バイオマトリックス研究所に委託し実施した。
増幅を確認後、フラグメントＡ、Ｂ、Ｃ及びＤの全ての検体において残っていたＰＣＲ産物全量を１．５％アガロースゲルにより電気泳動し、ゲル抽出によりＤＮＡフラグメントを精製したのち、得られたフラグメントをサンガー法によるＤＮＡシーケンス解析に用いた。各ＤＮＡフラグメントの塩基配列の解析は、各フラグメントを増幅したプライマーをそれぞれ用い、対象配列の両側より塩基配列の決定を行った。なお、本塩基配列の決定の操作は、バイオマトリックス研究所に委託し実施した。
得られた４つのＲＴ－ＰＣＲ産物のＤＮＡシーケンスを解析した結果、フラグメントＡおよびＤの配列は公開されているアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０のゲノムＤＮＡの配列と完全に一致していた。一方、フラグメントＢ及びフラグメントＣでは公開されているアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０のゲノムＤＮＡと比較して１２３ｂｐおよび４８ｂｐの欠失部分が存在した。それ以外の塩基配列はゲノムＤＮＡ上の配列と完全に一致していた。また、上記２つのフラグメントの欠失部分に対応するゲノムＤＮＡの配列は、いずれもＧＴで始まりＡＧで終わるイントロンに特徴的なものであった（ＧＴ－ＡＧ規則）。以上のことから、ゲノム中のｍａｎＲ遺伝子中には１２３ｂｐと４８ｂｐの２つのイントロンが存在していることがわかった。また、本結果は配列番号１に示すｍａｎＲ転写産物の配列が混入したゲノム由来のものではなく、本菌株中で実際に発現しているｍＲＮＡに由来することを示すものでもあった。
さらに、これら４本のフラグメントの配列をフラグメント同士でオーバーラップしている部分を元に１つの配列に統合し解析を進めた。その結果、統合して得られたスプライシング済み（イントロン除去済み）の配列中には、２，３１６ｂｐのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が含まれていた。本ＯＲＦを、公開されているアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０のゲノムの塩基配列に照らし合わせたところ、本ＯＲＦの開始コドンの位置はｍａｎＲのマニュアルアノテーション結果と同じ第８染色体ＳＣ０１０内の５４５６０１に相当し、終止コドンの位置も予測ｍａｎＲの領域と一致していた（ＳＣ０１０－５４３１１５）。本解析により得られたスプライシング済み（イントロン除去済み）のｍａｎＲ転写産物に由来したｃＤＮＡの塩基配列を、配列番号１に記載する。
配列番号１の塩基配列をＧＥＮＥＴＹＸ ｖｅｒｓｉｏｎ ９（ジェネティクス社製）を用いて解析したところ、このＤＮＡは、７７１アミノ酸からなる、推定分子質量８６．５ｋＤａの蛋白質をコードしていることが予想された。このアミノ酸配列を配列番号２に記載する。
さらに、これら４本のフラグメントの配列をフラグメント同士でオーバーラップしている部分を元に１つの配列に統合し解析を進めた。その結果、統合して得られたスプライシング済み（イントロン除去済み）の配列中には、２，３１６ｂｐのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が含まれていた。本ＯＲＦを、公開されているアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０のゲノムの塩基配列に照らし合わせたところ、本ＯＲＦの開始コドンの位置はｍａｎＲのマニュアルアノテーション結果と同じ第８染色体ＳＣ０１０内の５４５６０１に相当し、終止コドンの位置も予測ｍａｎＲの領域と一致していた（ＳＣ０１０－５４３１１５）。本解析により得られたスプライシング済み（イントロン除去済み）のｍａｎＲ転写産物に由来したｃＤＮＡの塩基配列を、配列番号１に記載する。
配列番号１の塩基配列をＧＥＮＥＴＹＸ ｖｅｒｓｉｏｎ ９（ジェネティクス社製）を用いて解析したところ、このＤＮＡは、７７１アミノ酸からなる、推定分子質量８６．５ｋＤａの蛋白質をコードしていることが予想された。このアミノ酸配列を配列番号２に記載する。
［スプライシング済みｍａｎＲ転写産物全長のクローニング］
配列番号１に示される、スプライシング済みｍａｎＲ転写産物の全長を得るために、ＲＴ－ＰＣＲを行った。上記に示した解析により得られた塩基配列の情報をもとに、配列番号３５及び３６に示すオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。
配列番号１に示される、スプライシング済みｍａｎＲ転写産物の全長を得るために、ＲＴ－ＰＣＲを行った。上記に示した解析により得られた塩基配列の情報をもとに、配列番号３５及び３６に示すオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。
ＰＣＲ用酵素には正確性の高いＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を使用した。反応系の組成は酵素添付のマニュアルに従い、鋳型ＤＮＡは、実施例１３における逆転写反応において作製したｃＤＮＡを１．０μｌ添加し、オリゴヌクレオチドプライマーは配列番号３５と３６を、終濃度が１．０μＭになるように加え、全量５０μｌで反応を行った。
ＰＣＲ反応は、９４℃１分の後、９４℃１０秒、５８℃１５秒、７２℃４分を３８サイクル行った。反応終了後、反応液の一部を０．８％アガロースゲルにより電気泳動し、約２．５ｋｂのＤＮＡフラグメントが増幅されていることを確認した。
確認終了後、残りの反応液全量を０．８％アガロースゲルにより電気泳動し、ゲル抽出によりＤＮＡフラグメントを精製したのち、ＴａＫａＲａ Ｍｉｇｈｔｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ；タカラバイオ社製）を用いて精製ＤＮＡフラグメントを平滑末端化及びリン酸化後、ｐＵＣ１１８のＨｉｎｃＩＩサイトにライゲーションした。
ライゲーション反応後、反応により得られたプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９株に導入し形質転換体を得た。本形質転換体よりＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドを抽出精製した。次に得られたプラスミド５０ｎｇを、制限酵素ＥｃｏＲI（ニッポンジーン社製）により消化し、０．８％アガロースゲルにより電気泳動を行い、約６．０ｋｂのバンドが確認されたものを、インサートを有するプラスミドとして選抜した。
選抜したプラスミドのうちの１つについて、配列番号２７～３６に示したオリゴヌクレオチドプライマーをそれぞれ使用し、サンガー法による塩基配列の解析を行ったところ、得られたプラスミドに挿入されているＤＮＡフラグメントは、スプライシング済み（イントロン除去済み）のｍａｎＲ転写産物全長に由来したｃＤＮＡであり、さらにＰＣＲによる変異の導入が生じていないことを確認した。このスプライシング済みｍａｎＲ遺伝子全長が挿入されているｐＵＣ１１８をｐＡＯｍａｎＲ－ｃ２．５と名づけた。なお、本実施例ではコントロール株よりＴｏｔａｌ ＲＮＡを得たが、コントロール株は野生株の誘導体であり、ｍａｎＲの領域については野生株と完全に一致した配列を有する株である。したがって、本実施例のコントロール株を野生株に変更して実施しても、配列番号１に記した配列と完全に一致した塩基配列を有する、スプライシング済みのｍａｎＲ転写産物を得ることが可能である。
ＰＣＲ反応は、９４℃１分の後、９４℃１０秒、５８℃１５秒、７２℃４分を３８サイクル行った。反応終了後、反応液の一部を０．８％アガロースゲルにより電気泳動し、約２．５ｋｂのＤＮＡフラグメントが増幅されていることを確認した。
確認終了後、残りの反応液全量を０．８％アガロースゲルにより電気泳動し、ゲル抽出によりＤＮＡフラグメントを精製したのち、ＴａＫａＲａ Ｍｉｇｈｔｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ；タカラバイオ社製）を用いて精製ＤＮＡフラグメントを平滑末端化及びリン酸化後、ｐＵＣ１１８のＨｉｎｃＩＩサイトにライゲーションした。
ライゲーション反応後、反応により得られたプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９株に導入し形質転換体を得た。本形質転換体よりＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドを抽出精製した。次に得られたプラスミド５０ｎｇを、制限酵素ＥｃｏＲI（ニッポンジーン社製）により消化し、０．８％アガロースゲルにより電気泳動を行い、約６．０ｋｂのバンドが確認されたものを、インサートを有するプラスミドとして選抜した。
選抜したプラスミドのうちの１つについて、配列番号２７～３６に示したオリゴヌクレオチドプライマーをそれぞれ使用し、サンガー法による塩基配列の解析を行ったところ、得られたプラスミドに挿入されているＤＮＡフラグメントは、スプライシング済み（イントロン除去済み）のｍａｎＲ転写産物全長に由来したｃＤＮＡであり、さらにＰＣＲによる変異の導入が生じていないことを確認した。このスプライシング済みｍａｎＲ遺伝子全長が挿入されているｐＵＣ１１８をｐＡＯｍａｎＲ－ｃ２．５と名づけた。なお、本実施例ではコントロール株よりＴｏｔａｌ ＲＮＡを得たが、コントロール株は野生株の誘導体であり、ｍａｎＲの領域については野生株と完全に一致した配列を有する株である。したがって、本実施例のコントロール株を野生株に変更して実施しても、配列番号１に記した配列と完全に一致した塩基配列を有する、スプライシング済みのｍａｎＲ転写産物を得ることが可能である。
配列番号２に示したｍａｎＲ遺伝子産物（ＭａｎＲ）のアミノ酸配列を、Ｆｉｎｎらが開発した隠れマルコフモデルを用いたモチーフ検索法であるＰｆａｍ２３．０（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．；Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ ３６，Ｄ２８１，２００８）により解析し、ＭａｎＲに存在する有意なモチーフを検索した。
その結果、ＭａｎＲには二つの有意なモチーフが存在していることがわかった。一つ目の有意なモチーフは、Ｐｆａｍ００１７２のＺｎ＿Ｃｌｕｓ、Ｆｕｎｇａｌ Ｚｎ（２）－Ｃｙｓ（６）ｂｉｎｕｃｌｅａｒ ｃｌｕｓｔｅｒ ｄｏｍａｉｎであり、ＭａｎＲの３５残基目から７２残基目にかけて存在していた（３５－ＴＬＲＡＣＴＳＣＲＨＲＫＩＫＣＤＧＥＫＰＣＥＡＣＲＷＹＫＫＡＤＱＣＨＹＡＤＰＲＰ―７２、Ｚｎ２Ｃｙｓ６ジンクフィンガーモチーフに典型的な６つのシステイン残基を下線で表示した）。Ｅ－ｖａｌｕｅは４ｅ－０５であった。二つ目の有意なモチーフはＰｆａｍ０４０８２のＦｕｎｇａｌ＿ｔｒａｎｓ，Ｆｕｎｇａｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｄｏｍａｉｎであり、ＭａｎＲの３４１残基目から４３９残基目に存在していた。(３４１－ＨＩＥＴＩＱＴＬＧＬＬＧＧＱＹＬＨＹＶＳＱＰＮＬＡＹＳＬＭＧＡＡＬＲＭＡＡＡＬＧＬＨＫＥＦＳＤＮＱＥＧＳＣＫＱＮＩＹＳＴＤＬＫＲＲＶＷＷＳＬＦＣＬＤＴＷＧＣＭＴＬＧＲＰＳＭＧＲＦＧＰＴＩＴＶＫＬＰＱ－４３９)。そのＥ－ｖａｌｕｅは２ｅ－０６であった。本解析の結果、ＭａｎＲはＺｎ２Ｃｙｓ６ジンクフィンガーモチーフのＤＮＡ結合部位を有する、カビに特徴的な転写制御因子であることが示唆された。
その結果、ＭａｎＲには二つの有意なモチーフが存在していることがわかった。一つ目の有意なモチーフは、Ｐｆａｍ００１７２のＺｎ＿Ｃｌｕｓ、Ｆｕｎｇａｌ Ｚｎ（２）－Ｃｙｓ（６）ｂｉｎｕｃｌｅａｒ ｃｌｕｓｔｅｒ ｄｏｍａｉｎであり、ＭａｎＲの３５残基目から７２残基目にかけて存在していた（３５－ＴＬＲＡＣＴＳＣＲＨＲＫＩＫＣＤＧＥＫＰＣＥＡＣＲＷＹＫＫＡＤＱＣＨＹＡＤＰＲＰ―７２、Ｚｎ２Ｃｙｓ６ジンクフィンガーモチーフに典型的な６つのシステイン残基を下線で表示した）。Ｅ－ｖａｌｕｅは４ｅ－０５であった。二つ目の有意なモチーフはＰｆａｍ０４０８２のＦｕｎｇａｌ＿ｔｒａｎｓ，Ｆｕｎｇａｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｄｏｍａｉｎであり、ＭａｎＲの３４１残基目から４３９残基目に存在していた。(３４１－ＨＩＥＴＩＱＴＬＧＬＬＧＧＱＹＬＨＹＶＳＱＰＮＬＡＹＳＬＭＧＡＡＬＲＭＡＡＡＬＧＬＨＫＥＦＳＤＮＱＥＧＳＣＫＱＮＩＹＳＴＤＬＫＲＲＶＷＷＳＬＦＣＬＤＴＷＧＣＭＴＬＧＲＰＳＭＧＲＦＧＰＴＩＴＶＫＬＰＱ－４３９)。そのＥ－ｖａｌｕｅは２ｅ－０６であった。本解析の結果、ＭａｎＲはＺｎ２Ｃｙｓ６ジンクフィンガーモチーフのＤＮＡ結合部位を有する、カビに特徴的な転写制御因子であることが示唆された。
［ｍａｎＲ遺伝子産物のＰＳＯＲＴＩＩによる細胞内局在の予測］
配列番号２に示したｍａｎＲ遺伝子産物（ＭａｎＲ）の推定アミノ酸配列を用い、Ｎａｋａｉらの開発したＰＳＯＲＴＩＩ（ｈｔｔｐ：／／ｐｓｏｒｔ. ｉｍｓ.ｕ－ｔｏｋｙｏ.ａｃ.ｊｐ／）を用いて本蛋白質の細胞内局在を予想した。
その結果、核に局在する確立は３４．８％、細胞質膜に局在する確立は２１．７％、そして液胞に存在する確立は１７．４％であった。一方、ＭａｎＲが、小胞体、ミトコンドリア、ゴルジ体及び細胞外への分泌小胞に局在する確立はいずれも１０．０％以下であった。
以上のように本予測結果では、ＭａｎＲは核に局在する確立が最も高いと予想された。上記に示したｐｆａｍ検索の結果においてもＭａｎＲはカビに特徴的なＺｎ２Ｃｙｓ６ジンクフィンガーモチーフを有する転写制御因子であると予測されていることから、ＭａｎＲが核内に局在する可能性が高いという予測結果は合理的な結果であると考えられる。
配列番号２に示したｍａｎＲ遺伝子産物（ＭａｎＲ）の推定アミノ酸配列を用い、Ｎａｋａｉらの開発したＰＳＯＲＴＩＩ（ｈｔｔｐ：／／ｐｓｏｒｔ. ｉｍｓ.ｕ－ｔｏｋｙｏ.ａｃ.ｊｐ／）を用いて本蛋白質の細胞内局在を予想した。
その結果、核に局在する確立は３４．８％、細胞質膜に局在する確立は２１．７％、そして液胞に存在する確立は１７．４％であった。一方、ＭａｎＲが、小胞体、ミトコンドリア、ゴルジ体及び細胞外への分泌小胞に局在する確立はいずれも１０．０％以下であった。
以上のように本予測結果では、ＭａｎＲは核に局在する確立が最も高いと予想された。上記に示したｐｆａｍ検索の結果においてもＭａｎＲはカビに特徴的なＺｎ２Ｃｙｓ６ジンクフィンガーモチーフを有する転写制御因子であると予測されていることから、ＭａｎＲが核内に局在する可能性が高いという予測結果は合理的な結果であると考えられる。
［ｍａｎＲ遺伝子産物（蛋白質）の同一性検索］
配列番号２に記載したＭａｎＲのアミノ酸配列を公知のアミノ酸配列データベースに対して配列同一性の高い配列を検索した。検索には、ＮＣＢＩ ｂｌａｓｔｐ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）を用い、データベースとしては、ｎｒを指定した。
その結果、一致する配列は無く、最も高い同一性が見られたのはアスペルギルス・クラバタスＮＲＲＬ １のＰｕｔａｔｉｖｅ Ｃ６ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＡＷ１０９８９）であり、７１％の同一性を示した。
また、ネオサルトリヤ・フィスチェリＮＲＲＬ１８１のＰｕｔａｔｉｖｅ Ｃ６ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｐｕｔａｔｉｖｅ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＡＷ２０８７１）及びアスペルギルス・テレウス ＮＩＨ２６２４のｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＡＵ３０８１７）は、いずれも７１％とアスペルギルス・クラバタス由来のＰｕｔａｔｉｖｅ Ｃ６ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒと同程度の高い同一性を示した。
これらの同一性が高いという結果が得られた蛋白質は、転写制御因子であるということが予想されているものもあるが、その作用対象が明らかになっているものは存在しなかった。また、これら３つの蛋白質以外に７０％以上の高い同一性を示した蛋白質は見出されなかった。さらに、Ｅ－ｖａｌｕｅが１．０ｅ－１５以下であった蛋白質についてその機能について検索を行ったが、解明されているものは存在しなかった。
配列番号２に記載したＭａｎＲのアミノ酸配列を公知のアミノ酸配列データベースに対して配列同一性の高い配列を検索した。検索には、ＮＣＢＩ ｂｌａｓｔｐ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）を用い、データベースとしては、ｎｒを指定した。
その結果、一致する配列は無く、最も高い同一性が見られたのはアスペルギルス・クラバタスＮＲＲＬ １のＰｕｔａｔｉｖｅ Ｃ６ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＡＷ１０９８９）であり、７１％の同一性を示した。
また、ネオサルトリヤ・フィスチェリＮＲＲＬ１８１のＰｕｔａｔｉｖｅ Ｃ６ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｐｕｔａｔｉｖｅ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＡＷ２０８７１）及びアスペルギルス・テレウス ＮＩＨ２６２４のｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＡＵ３０８１７）は、いずれも７１％とアスペルギルス・クラバタス由来のＰｕｔａｔｉｖｅ Ｃ６ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒと同程度の高い同一性を示した。
これらの同一性が高いという結果が得られた蛋白質は、転写制御因子であるということが予想されているものもあるが、その作用対象が明らかになっているものは存在しなかった。また、これら３つの蛋白質以外に７０％以上の高い同一性を示した蛋白質は見出されなかった。さらに、Ｅ－ｖａｌｕｅが１．０ｅ－１５以下であった蛋白質についてその機能について検索を行ったが、解明されているものは存在しなかった。
［ｍａｎＲ遺伝子（核酸）の同一性検索］
配列番号１の塩基配列について配列同一性の高い配列を検索した。検索には、ＮＣＢＩ ｂｌａｓｔｎ（ｈｔｔｐ：//ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/ＢＬＡＳＴ/）を用い、データベースとしては、ｎｒを指定した。
その結果、ｍａｎＲ遺伝子のソースであるアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０の第８染色体、ＳＣ０１０に存在する配列と完全に一致しており、クエリー配列の１００％をカバーしていた。
また、次に高い同一性を示したのはネオサルトリヤ・フィスチェリＮＲＲＬ１８１のＰｕｔａｔｉｖｅ Ｃ６ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ （ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＡＷ２０８７１）で、クエリー配列の８７％をカバーしており最も高い部分で７６％の相同性を示した。その次に高い同一性を示したのはアスペルギルス・クラバタスＮＲＲＬ １のＰｕｔａｔｉｖｅ Ｃ６ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＡＷ１０９８９）で、クエリー配列の８７％をカバーしており最も高い部分で７５％の同一性を示した。
蛋白質の同一性検索において上記の２株とともに高い同一性を示したアスペルギルス・テレウスＮＩＨ２６２４のｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＡＵ３０８１７）については、クエリー配列の８１％をカバーしており、最も高い部分で６９％の同一性を示し、塩基配列についても有る程度高い同一性が見られているが、その値は蛋白質での比較結果と比べ若干低くなる傾向が見られた。
塩基配列の同一性をもとに検索した場合においても、Ｅ－ｖａｌｕｅが１．０ｅ－１５以下であった遺伝子の中でその機能が解明されているものは存在しなかった。
以上の結果から、本発明の配列番号１で示されるｍａｎＲ遺伝子及び配列番号２で示されるＭａｎＲ蛋白質は、これら類似の遺伝子群の中で初めて機能が解明されたものであることが確認できた。
配列番号１の塩基配列について配列同一性の高い配列を検索した。検索には、ＮＣＢＩ ｂｌａｓｔｎ（ｈｔｔｐ：//ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/ＢＬＡＳＴ/）を用い、データベースとしては、ｎｒを指定した。
その結果、ｍａｎＲ遺伝子のソースであるアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０の第８染色体、ＳＣ０１０に存在する配列と完全に一致しており、クエリー配列の１００％をカバーしていた。
また、次に高い同一性を示したのはネオサルトリヤ・フィスチェリＮＲＲＬ１８１のＰｕｔａｔｉｖｅ Ｃ６ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ （ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＡＷ２０８７１）で、クエリー配列の８７％をカバーしており最も高い部分で７６％の相同性を示した。その次に高い同一性を示したのはアスペルギルス・クラバタスＮＲＲＬ １のＰｕｔａｔｉｖｅ Ｃ６ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＡＷ１０９８９）で、クエリー配列の８７％をカバーしており最も高い部分で７５％の同一性を示した。
蛋白質の同一性検索において上記の２株とともに高い同一性を示したアスペルギルス・テレウスＮＩＨ２６２４のｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＡＵ３０８１７）については、クエリー配列の８１％をカバーしており、最も高い部分で６９％の同一性を示し、塩基配列についても有る程度高い同一性が見られているが、その値は蛋白質での比較結果と比べ若干低くなる傾向が見られた。
塩基配列の同一性をもとに検索した場合においても、Ｅ－ｖａｌｕｅが１．０ｅ－１５以下であった遺伝子の中でその機能が解明されているものは存在しなかった。
以上の結果から、本発明の配列番号１で示されるｍａｎＲ遺伝子及び配列番号２で示されるＭａｎＲ蛋白質は、これら類似の遺伝子群の中で初めて機能が解明されたものであることが確認できた。
［ｍａｎＲに隣接する遺伝子の種類と位置関係］
ゲノム上のｍａｎＲ遺伝子と、その前後に位置する遺伝子の概略について調べた結果を図１３に示す。ｍａｎＲ遺伝子は、マンノシダーゼ遺伝子であるＡＯ０９００１００００２０８と、マンノシルトランスフェラーゼではないかと予想される遺伝子であるＡＯ０９００１００００２０７との間に存在していた。
また、ｍａｎＲの３’末端部分に近い領域はＡＯ０９００１００００２０７と重なっていることが示された。しかし、ＡＯ０９００１００００２０７の遺伝子領域についてＢｌａｓｔＸやｔＢｌａｓｔＮ等のプログラムにより近縁種の予測遺伝子情報と比較し、予測をマニュアルアノテーションにより予測しなおすと、開始コドンの位置はＡＯ０９００１００００２０７よりも下流側に存在する可能性が高いと考えられ、ｍａｎＲと下流側に隣接している遺伝子のＯＲＦが重なっている可能性は低いことが予想された。
以上の予測結果を踏まえて考えると、ｍａｎＲはマンノシダーゼ遺伝子と、マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子にはさまれるように存在しており、マンノース代謝系としてクラスターを形成している可能性も考えられ、ｍａｎＲがマンナン代謝系の一環を担っている遺伝子であることが示唆された。
ゲノム上のｍａｎＲ遺伝子と、その前後に位置する遺伝子の概略について調べた結果を図１３に示す。ｍａｎＲ遺伝子は、マンノシダーゼ遺伝子であるＡＯ０９００１００００２０８と、マンノシルトランスフェラーゼではないかと予想される遺伝子であるＡＯ０９００１００００２０７との間に存在していた。
また、ｍａｎＲの３’末端部分に近い領域はＡＯ０９００１００００２０７と重なっていることが示された。しかし、ＡＯ０９００１００００２０７の遺伝子領域についてＢｌａｓｔＸやｔＢｌａｓｔＮ等のプログラムにより近縁種の予測遺伝子情報と比較し、予測をマニュアルアノテーションにより予測しなおすと、開始コドンの位置はＡＯ０９００１００００２０７よりも下流側に存在する可能性が高いと考えられ、ｍａｎＲと下流側に隣接している遺伝子のＯＲＦが重なっている可能性は低いことが予想された。
以上の予測結果を踏まえて考えると、ｍａｎＲはマンノシダーゼ遺伝子と、マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子にはさまれるように存在しており、マンノース代謝系としてクラスターを形成している可能性も考えられ、ｍａｎＲがマンナン代謝系の一環を担っている遺伝子であることが示唆された。
［ｍａｎＲ遺伝子の麹菌での強制発現］
麹菌のマンナン加水分解酵素群の発現増強を目的とし、ｍａｎＲを強制発現させた麹菌を作製した。強制発現系の概要を図１４に示した。ｍａｎＲのプロモーター部分とｍａｎＲの構造遺伝子の間にマーカー遺伝子であるｐｙｒＧとＴＥＦ１プロモーターを挿入し、ｍａｎＲがＴＥＦ１プロモーターの支配下となり、構成的に発現するようにした。強制発現株の作製方法は下記の通りである。始めに、フュージョンＰＣＲを用いたベクターの作製を行った。本ＰＣＲにて使用したオリゴヌクレオチドプライマーの配列を表１０に記した。
麹菌のマンナン加水分解酵素群の発現増強を目的とし、ｍａｎＲを強制発現させた麹菌を作製した。強制発現系の概要を図１４に示した。ｍａｎＲのプロモーター部分とｍａｎＲの構造遺伝子の間にマーカー遺伝子であるｐｙｒＧとＴＥＦ１プロモーターを挿入し、ｍａｎＲがＴＥＦ１プロモーターの支配下となり、構成的に発現するようにした。強制発現株の作製方法は下記の通りである。始めに、フュージョンＰＣＲを用いたベクターの作製を行った。本ＰＣＲにて使用したオリゴヌクレオチドプライマーの配列を表１０に記した。
配列中に示した下線は、フュージョンＰＣＲで使用するための付加配列であり、第一段階目のＰＣＲではテンプレートＤＮＡとアニーリングしない領域である。
まず、相同組換え用の左右のアーム部分（フラグメントＬ及びＲ）、ＴＥＦ１プロモーター及び形質転換時のマーカー遺伝子であるｐｙｒＧ（フラグメントＰ）のＤＮＡフラグメントをＰＣＲ法により増幅した。
ＰＣＲには、正確性の高いＫＯＤ ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を使用した。反応液中のＭｇＳＯ４の終濃度は、フラグメントＬ、ＲおよびＴＥＦ１プロモーターの増幅では１．２ｍＭ、Ｐフラグメントの増幅時は２．０ｍＭにし、必要に応じて終濃度が５．０－７．０％となるよう、ジメチルスルフォキシド（シグマ・アルドリッチジャパン社製）を添加した。
ＰＣＲ用のプライマーは、フラグメントＬの増幅では配列番号３７と３８、フラグメントＲの増幅では配列番号４３と４４を、ＴＥＦ１プロモーターの増幅では配列番号４１と４２を、そしてフラグメントＰの増幅では配列番号３９及び４０をセットとして使用した。ＰＣＲ反応の鋳型には１５０ｎｇの野生株のゲノムＤＮＡを使用し、反応系は全量５０μｌで実施した。ＰＣＲ反応は、９４℃２分の後、９４℃１０秒、５５℃１５秒、６８℃２分３０秒を３０サイクル行った。増幅産物の一部を０．８％アガロースゲルで電気泳動し確認したところ、フラグメントＬとＲでは２．１ｋｂと２．８ｋｂのＤＮＡフラグメントが増幅されており、ＴＥＦ１プロモーターでは０．９ｋｂのＤＮＡフラグメントが増幅されていることを確認した。また、フラグメントＰでは２．２ｋｂのＤＮＡフラグメントが増幅されていた。
ＰＣＲには、正確性の高いＫＯＤ ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を使用した。反応液中のＭｇＳＯ４の終濃度は、フラグメントＬ、ＲおよびＴＥＦ１プロモーターの増幅では１．２ｍＭ、Ｐフラグメントの増幅時は２．０ｍＭにし、必要に応じて終濃度が５．０－７．０％となるよう、ジメチルスルフォキシド（シグマ・アルドリッチジャパン社製）を添加した。
ＰＣＲ用のプライマーは、フラグメントＬの増幅では配列番号３７と３８、フラグメントＲの増幅では配列番号４３と４４を、ＴＥＦ１プロモーターの増幅では配列番号４１と４２を、そしてフラグメントＰの増幅では配列番号３９及び４０をセットとして使用した。ＰＣＲ反応の鋳型には１５０ｎｇの野生株のゲノムＤＮＡを使用し、反応系は全量５０μｌで実施した。ＰＣＲ反応は、９４℃２分の後、９４℃１０秒、５５℃１５秒、６８℃２分３０秒を３０サイクル行った。増幅産物の一部を０．８％アガロースゲルで電気泳動し確認したところ、フラグメントＬとＲでは２．１ｋｂと２．８ｋｂのＤＮＡフラグメントが増幅されており、ＴＥＦ１プロモーターでは０．９ｋｂのＤＮＡフラグメントが増幅されていることを確認した。また、フラグメントＰでは２．２ｋｂのＤＮＡフラグメントが増幅されていた。
電気泳動による増幅の確認後、残っているＬ、Ｒ及びＰのＤＮＡフラグメントの全量を０．８％アガロースゲルにて電気泳動を行い、ゲル抽出にてＤＮＡフラグメントを精製したのち、Ｌフラグメント１．１μｌ、Ｒフラグメント１．１μｌ、ＴＥＦ１プロモーター３．４μｌ、及びＰのフラグメント３．４μｌを混合しフュージョンＰＣＲ用の鋳型とした。
次に、フュージョンＰＣＲにより４つのフラグメントを結合させた。ＰＣＲには正確性の高いＫＯＤ ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を使用した。反応液中のＭｇＳＯ４の終濃度は１．２ｍＭとし、終濃度が５．０％となるよう、ジメチルスルフォキシド（シグマ・アルドリッチジャパン社製）を添加した。ＰＣＲ用のプライマーは、配列番号３７と４４をセットとし使用した。ＰＣＲ反応の鋳型には、先程作製した９μｌのＬ、Ｒ、ＴＥＦ１及びＰの混合液を用い、反応系は全量３００μｌで実施した。ＰＣＲ反応は、９４℃２分の後、９４℃１０秒、５８℃１５秒、６８℃９分の３ステップサイクルを３０サイクル行った。
増幅産物の一部を０．７％アガロースゲルにより電気泳動し、約７．９ｋｂのＤＮＡフラグメントが増幅されていることを確認した。ＰＣＲ反応による増幅の確認後、残っている反応液全量を０．７％アガロースゲルにより電気泳動し、ゲル抽出によりＤＮＡフラグメントを精製した後、アルコール沈殿によりＤＮＡフラグメントを濃縮した。これを麹菌のｍａｎＲ強制発現用ベクターとした。
本ベクターを、前述の宿主株に常法であるプロトプラスト－ＰＥＧ法（Ｇｅｎｅ，６１，３８５，１９８７）を用いて導入した。
形質転換体の選抜は、ウリジンを含まず１．２Ｍソルビトールを含むＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ最少培地を利用したｐｙｒＧポジティブセレクションを実施した。得られた形質転換体中へのベクターの導入は、サザンハイブリダイゼーション法及びＰＣＲ法により確認した。
増幅産物の一部を０．７％アガロースゲルにより電気泳動し、約７．９ｋｂのＤＮＡフラグメントが増幅されていることを確認した。ＰＣＲ反応による増幅の確認後、残っている反応液全量を０．７％アガロースゲルにより電気泳動し、ゲル抽出によりＤＮＡフラグメントを精製した後、アルコール沈殿によりＤＮＡフラグメントを濃縮した。これを麹菌のｍａｎＲ強制発現用ベクターとした。
本ベクターを、前述の宿主株に常法であるプロトプラスト－ＰＥＧ法（Ｇｅｎｅ，６１，３８５，１９８７）を用いて導入した。
形質転換体の選抜は、ウリジンを含まず１．２Ｍソルビトールを含むＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ最少培地を利用したｐｙｒＧポジティブセレクションを実施した。得られた形質転換体中へのベクターの導入は、サザンハイブリダイゼーション法及びＰＣＲ法により確認した。
作製したｍａｎＲ強制発現株にベクターが正しく導入されているかを、ＰＣＲ法により確認した。始めに、強制発現株および宿主株より、実施例３に記した方法を用いゲノムＤＮＡを調製した。このゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号３７及び４４のプライマーセットを用いＰＣＲを行った。ＰＣＲ用の酵素には、ＥｘＴａｑ（タカラバイオ社製）を用いた。ＰＣＲ反応は、９４℃２分の後、９４℃１０秒、５８℃１５秒、７２℃９分の３ステップサイクルを３０サイクル行った。本ＰＣＲの結果を図１５に示す。
形質転換に用いた宿主株では約５．６ｋｂのシングルバンドが確認されたのに対して、強制発現株では約７．９ｋｂにシングルバンドが確認された。このことから、得られた形質転換体にはベクターが正しく導入され、核も純化されていることが示唆された。
形質転換に用いた宿主株では約５．６ｋｂのシングルバンドが確認されたのに対して、強制発現株では約７．９ｋｂにシングルバンドが確認された。このことから、得られた形質転換体にはベクターが正しく導入され、核も純化されていることが示唆された。
また、作製したｍａｎＲ強制発現株にベクターが正しく導入されているかを、サザンハイブリダイゼーション法により確認した。実施例３に記した方法に従い、宿主株およびｍａｎＲ強制発現株を液体培養後、ゲノムＤＮＡの抽出・精製を行った。得られたゲノムＤＮＡ５．０μｇをそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩ（ニッポンジーン社製）にて３７℃で一晩消化し、０．８％アガロースゲルにより電気泳動後、ハイボンドＮ＋（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）にブロットした。ブロット後、ジコキシゲニン（ＤＩＧ）－ラベルを行ったプローブを用い４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。なお、ラベル化プローブには実施例５に記したものと同じものを使用した。また、ハイブリダイゼーション後のメンブレンの洗浄及びシグナルの検出は、ＤＩＧ ｓｙｓｔｅｍ（ロシュダイアグノスティクス社製）の取扱説明書に従い実施した。その結果を図１６に示す。
ｍａｎＲ強制発現株及び宿主株ともにシングルバンドで検出されていた。また、宿主株ではバンドが約６．１ｋｂに観測されたが破壊株では約８．１ｋｂに観測され、両者では明確な違いがあることがわかった。また、このバンドサイズは、理論値と合致するものであった。上記の結果より、ｍａｎＲ強制発現のベクターは正しく導入されており、その株の核は純化されていると判断した。また、本ｍａｎＲ強制発現株（アスペルギルス・オリゼ ＰＴＥＦ１ｍａｎＲ，２－１－２）は、特許手続上微生物の寄託等の「国際的承認に関するブタペスト条約下で、茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６に所在の独立行政法人産業技術総合研究所の特許生物寄託センターに平成２１年（２００９年）３月３日付で寄託されている（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ－１１１０４）。
ｍａｎＲ強制発現株及び宿主株ともにシングルバンドで検出されていた。また、宿主株ではバンドが約６．１ｋｂに観測されたが破壊株では約８．１ｋｂに観測され、両者では明確な違いがあることがわかった。また、このバンドサイズは、理論値と合致するものであった。上記の結果より、ｍａｎＲ強制発現のベクターは正しく導入されており、その株の核は純化されていると判断した。また、本ｍａｎＲ強制発現株（アスペルギルス・オリゼ ＰＴＥＦ１ｍａｎＲ，２－１－２）は、特許手続上微生物の寄託等の「国際的承認に関するブタペスト条約下で、茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６に所在の独立行政法人産業技術総合研究所の特許生物寄託センターに平成２１年（２００９年）３月３日付で寄託されている（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ－１１１０４）。
［ｍａｎＲ強制発現株のグルコマンナンプレートを用いたハロアッセイ］
ｍａｎＲの強制発現によるマンナン加水分解酵素群への影響を調べるために、グルコマンナンプレートを用いたハロアッセイを実施した。１．０％グルコマンナン（Ｍｅｇａｚｙｍｅ社製）を含むＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ最少培地に、ｍａｎＲ破壊株、ｍａｎＲ強制発現株およびコントロール株の分生子をそれぞれ１点に２５０，０００個ずつ接種し、３０℃にて２日間培養した。培養終了後、実施例２に記したマンナナーゼのハロアッセイ法にて記した方法に従い、菌体外マンナナーゼ活性により形成されるハロを検出した。本ハロアッセイの結果を図１７に記す。
図１７Ａに示したとおり、これら３株のコロニーの形状には大きな変化は見られなかったが、ｍａｎＲ強制発現株の生育が若干悪くなる傾向が見られた。また図１７Ｂに示したハロアッセイの結果を見ると、ｍａｎＲ強制発現株ではコントロール株と比較しハロのサイズが顕著に大きくなり、ｍａｎＲ強制発現によるマンナン加水分解酵素群の生産増強が確認された。一方、ｍａｎＲ破壊株ではマンナナーゼのハロは見られなくなった。試験に供した３株の生育速度には極端な違いがなかったことから考えると、このハロの大きさの差は各株の生育の差に起因するものでなく、マンナナーゼ生産量の違いに起因すると考えられる。以上のことから、麹菌のマンナナーゼ生産量はｍａｎＲの発現量に応じて変化することがわかった。また、本実施例のデータからも、ｍａｎＲが麹菌のマンナン加水分解酵素群の発現を正に制御しているということを裏付けることができた。
ｍａｎＲの強制発現によるマンナン加水分解酵素群への影響を調べるために、グルコマンナンプレートを用いたハロアッセイを実施した。１．０％グルコマンナン（Ｍｅｇａｚｙｍｅ社製）を含むＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ最少培地に、ｍａｎＲ破壊株、ｍａｎＲ強制発現株およびコントロール株の分生子をそれぞれ１点に２５０，０００個ずつ接種し、３０℃にて２日間培養した。培養終了後、実施例２に記したマンナナーゼのハロアッセイ法にて記した方法に従い、菌体外マンナナーゼ活性により形成されるハロを検出した。本ハロアッセイの結果を図１７に記す。
図１７Ａに示したとおり、これら３株のコロニーの形状には大きな変化は見られなかったが、ｍａｎＲ強制発現株の生育が若干悪くなる傾向が見られた。また図１７Ｂに示したハロアッセイの結果を見ると、ｍａｎＲ強制発現株ではコントロール株と比較しハロのサイズが顕著に大きくなり、ｍａｎＲ強制発現によるマンナン加水分解酵素群の生産増強が確認された。一方、ｍａｎＲ破壊株ではマンナナーゼのハロは見られなくなった。試験に供した３株の生育速度には極端な違いがなかったことから考えると、このハロの大きさの差は各株の生育の差に起因するものでなく、マンナナーゼ生産量の違いに起因すると考えられる。以上のことから、麹菌のマンナナーゼ生産量はｍａｎＲの発現量に応じて変化することがわかった。また、本実施例のデータからも、ｍａｎＲが麹菌のマンナン加水分解酵素群の発現を正に制御しているということを裏付けることができた。
[ｍａｎＲの強制発現による麹菌マンナン加水分解酵素群生産の増強]
実施例１９に記した寒天培地を用いたハロアッセイでは、ｍａｎＲの強制発現が麹菌マンナン加水分解酵素群の発現量を増強させることを確認することができた。しかし、麹菌のグルコアミラーゼなどの糖質加水分解酵素生産量は、寒天培地にて培養したときよりも固体培養を行ったときのほうが多くなることが知られている。そこで小麦フスマを用いた固体培養時に、麹菌のｍａｎＲの強制発現がマンナン加水分解酵素群の生産量の増強に効果を示すかを検討した。その方法は以下の通りである。１５０ｍｌ容の三角フラスコに８０％散水の小麦フスマを５ｇ入れ綿栓により栓をし、１２１℃で３０分間オートクレーブにより滅菌した。これに、ｍａｎＲ強制発現株およびコントロール株の分生子をそれぞれ１０，０００，０００個ずつ接種し３０℃にて培養した。培養開始から２１時間後、検体をほぐしつつ攪拌（手入れ）したのち、さらに４３時間３０℃にて培養をおこなった。培養終了後、それぞれの検体に２０ｍｌの５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を加えよく懸濁したのち、ろ紙（Ｎｏ．２、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）にて懸濁液をろ過した。得られたろ液を１ｍｌ分取後、１．５ｍｌ容のプラスチック製マイクロチューブに入れ、１０，０００×ｇで１５分間、４℃にて遠心分離を行い固形物を除去した。本サンプルを以降の酵素活性測定に用いた。
実施例１９に記した寒天培地を用いたハロアッセイでは、ｍａｎＲの強制発現が麹菌マンナン加水分解酵素群の発現量を増強させることを確認することができた。しかし、麹菌のグルコアミラーゼなどの糖質加水分解酵素生産量は、寒天培地にて培養したときよりも固体培養を行ったときのほうが多くなることが知られている。そこで小麦フスマを用いた固体培養時に、麹菌のｍａｎＲの強制発現がマンナン加水分解酵素群の生産量の増強に効果を示すかを検討した。その方法は以下の通りである。１５０ｍｌ容の三角フラスコに８０％散水の小麦フスマを５ｇ入れ綿栓により栓をし、１２１℃で３０分間オートクレーブにより滅菌した。これに、ｍａｎＲ強制発現株およびコントロール株の分生子をそれぞれ１０，０００，０００個ずつ接種し３０℃にて培養した。培養開始から２１時間後、検体をほぐしつつ攪拌（手入れ）したのち、さらに４３時間３０℃にて培養をおこなった。培養終了後、それぞれの検体に２０ｍｌの５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を加えよく懸濁したのち、ろ紙（Ｎｏ．２、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）にて懸濁液をろ過した。得られたろ液を１ｍｌ分取後、１．５ｍｌ容のプラスチック製マイクロチューブに入れ、１０，０００×ｇで１５分間、４℃にて遠心分離を行い固形物を除去した。本サンプルを以降の酵素活性測定に用いた。
まず、上記小麦フスマ抽出液のマンナナーゼ活性を測定した。５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に２％（w/v）のＡｚｏ－Ｃａｒｏｂ－Ｇａｌａｃｔｏｍａｎｎａｎ（メガザイム社製）を溶解させた基質溶液５０μｌに、５０μｌの抽出液を加えボルテックスミキサーにより５秒間撹拌したのち、３７℃にて３０分間反応させた。本反応液に、２５０μｌの９９．５％エタノールを添加して反応を停止し、室温にて１０分間静置した。該溶液を５００×ｇで１０分間遠心分離し未反応の高分子物質を沈殿させたのち、上清中の加水分解によって遊離したアゾ色素の吸収極大である５９０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、マンナナーゼ活性を定量した。また、酵素溶液をあらかじめ１００℃で１０分間処理し失活させたものを用いて、検体と同様に反応を行い、その測定値を各サンプルのブランク値として用いた。なお本実験は培養から独立した３連でおこなった。活性測定の結果を図１８に示す。
ｍａｎＲ強制発現株由来抽出物は、コントロール株由来抽出物と比較して約９．４倍高いマンナナーゼ活性を有していた。このことから、麹菌のｍａｎＲの強制発現は、小麦フスマを用いた固体培養においても非常に効果的にマンナナーゼの生産増強を促すことが明らかとなった。
ｍａｎＲ強制発現株由来抽出物は、コントロール株由来抽出物と比較して約９．４倍高いマンナナーゼ活性を有していた。このことから、麹菌のｍａｎＲの強制発現は、小麦フスマを用いた固体培養においても非常に効果的にマンナナーゼの生産増強を促すことが明らかとなった。
次に、上記小麦フスマ抽出液のα―ガラクトシダーゼ活性を測定した。始めにそれぞれの抽出液を５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）により１００倍に希釈した。本希釈液２０μｌに４０μｌの５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）と４０μｌの２．５ｍＭ ｐ－ニトロフェニル－α－Ｄ－ガラクトピラノシド（和光純薬工業社製）を加え、３７℃にて１５分間反応させた。本反応液に、１００μｌの５００ｍＭ炭酸ナトリウム溶液を加え反応を停止させ、加水分解により遊離したｐ－ニトロフェノールの吸収極大である４０５ｎｍにおける吸光度を測定することにより、α―ガラクトシダーゼ活性を定量した。またブランクでは、検体の代わりに５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を用いて反応を行い、基質の自己分解量の測定を行った。測定後、希釈倍率である１００倍を検体の測定値からブランクの値を差し引いた値（ΔＯＤ４０５ｎｍ）にかけ、抽出液原液中の酵素活性を算出した。なお本実験は培養から独立した３連でおこなった。活性測定の結果を図１９に示す。
ｍａｎＲ強制発現株由来抽出物は、コントロール株由来抽出物と比較して約２．８倍高いα―ガラクトシダーゼ活性を有していた。このことから、麹菌のｍａｎＲの強制発現は小麦フスマを用いた固体培養において、マンナナーゼだけでなくガラクトマンの側鎖の分解に必要なα―ガラクトシダーゼの生産量の増強も促すことができることが明らかとなった。
実施例２０において示した結果は、麹菌の転写制御因子「ｍａｎＲ」の強制発現が、工業用酵素の生産において汎用される固体培養条件において、マンナン加水分解酵素群の発現を効率的に増強できることを実証するものである。
ｍａｎＲ強制発現株由来抽出物は、コントロール株由来抽出物と比較して約２．８倍高いα―ガラクトシダーゼ活性を有していた。このことから、麹菌のｍａｎＲの強制発現は小麦フスマを用いた固体培養において、マンナナーゼだけでなくガラクトマンの側鎖の分解に必要なα―ガラクトシダーゼの生産量の増強も促すことができることが明らかとなった。
実施例２０において示した結果は、麹菌の転写制御因子「ｍａｎＲ」の強制発現が、工業用酵素の生産において汎用される固体培養条件において、マンナン加水分解酵素群の発現を効率的に増強できることを実証するものである。
[ｍａｎＲ強制発現株および破壊株における菌体外セルラーゼ活性のハロアッセイ]
該転写制御因子がマンナン加水分解酵素群とともにセルロース加水分解酵素群の遺伝子発現を正に制御するのであれば、該転写制御因子を強制発現させることにより、両加水分解酵素を過剰生産する麹菌が育種できることが期待される。そこでｍａｎＲの強制発現及び破壊を下記に記すセルラーゼハロアッセイに供し、ｍａｎＲの発現量の変化が麹菌のセルラーゼ生産量に影響を及ぼすかを調べた。２．０％カルボキシメチルセルロース（シグマアルドリッチ社製）を唯一の炭素源とするＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ最少培地（０．０５％ ＫＣｌ，０．２％ ＮａＮＯ３，０．１％ ＫＨ２ＰＯ４，０．０５％ ＭｇＳＯ４，０．００１％ＦｅＳＯ４，２．０％ ａｇａｒ）のプレートに試験する検体を接種し、３０℃にて３日間培養した。培養終了後、プレート中に約８ｍｌの０．２５％コンゴーレッドを加え１５分間染色後、約８ｍｌの１．０Ｍ ＮａＣｌ溶液にて３０分間、３回洗浄した。洗浄後、プレートに約３～５ｍｌの５．０％酢酸（Ｖ／Ｖ）を添加し室温で１０分間程度放置しコンゴーレッドを青く発色させ、菌体外セルラーゼ活性により形成されるハロを検出した。本実験では、コントロール株をポジティブコントロールとして使用した。その結果を図２０に記す。
ｍａｎＲ強制発現株ではコントロール株と比較して有意にセルラーゼ活性が増加していた。一方、破壊株ではコントロール株と比較して顕著にハロのサイズが減少していた。このことから、ｍａｎＲは麹菌において菌体外マンナナーゼの生産とともに菌体外セルラーゼ生産の制御も行っており、ｍａｎＲの強制発現により麹菌の菌体外セルラーゼ生産能を増強することが可能であることが明らかとなった。
該転写制御因子がマンナン加水分解酵素群とともにセルロース加水分解酵素群の遺伝子発現を正に制御するのであれば、該転写制御因子を強制発現させることにより、両加水分解酵素を過剰生産する麹菌が育種できることが期待される。そこでｍａｎＲの強制発現及び破壊を下記に記すセルラーゼハロアッセイに供し、ｍａｎＲの発現量の変化が麹菌のセルラーゼ生産量に影響を及ぼすかを調べた。２．０％カルボキシメチルセルロース（シグマアルドリッチ社製）を唯一の炭素源とするＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ最少培地（０．０５％ ＫＣｌ，０．２％ ＮａＮＯ３，０．１％ ＫＨ２ＰＯ４，０．０５％ ＭｇＳＯ４，０．００１％ＦｅＳＯ４，２．０％ ａｇａｒ）のプレートに試験する検体を接種し、３０℃にて３日間培養した。培養終了後、プレート中に約８ｍｌの０．２５％コンゴーレッドを加え１５分間染色後、約８ｍｌの１．０Ｍ ＮａＣｌ溶液にて３０分間、３回洗浄した。洗浄後、プレートに約３～５ｍｌの５．０％酢酸（Ｖ／Ｖ）を添加し室温で１０分間程度放置しコンゴーレッドを青く発色させ、菌体外セルラーゼ活性により形成されるハロを検出した。本実験では、コントロール株をポジティブコントロールとして使用した。その結果を図２０に記す。
ｍａｎＲ強制発現株ではコントロール株と比較して有意にセルラーゼ活性が増加していた。一方、破壊株ではコントロール株と比較して顕著にハロのサイズが減少していた。このことから、ｍａｎＲは麹菌において菌体外マンナナーゼの生産とともに菌体外セルラーゼ生産の制御も行っており、ｍａｎＲの強制発現により麹菌の菌体外セルラーゼ生産能を増強することが可能であることが明らかとなった。
［ｍａｎＲ強制発現株ならびに破壊株のＤＮＡマイクロアレイ解析によるｍａｎＲ制御下にあるセルロース加水分解酵素の同定］
ｍａｎＲの制御下に有るセルロース加水分解酵素遺伝子を特定するため、ｍａｎＲ破壊株のＤＮＡマイクロアレイ解析を実施した。その方法は以下の通りである。ｍａｎＲ強制発現株、破壊株及びコントロール株の分生子約１０，０００，０００個を１５０ｍｌ容の三角フラスコに入った４０ｍｌのＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ最少培地にて、１８時間培養し分生子を発芽させた。培養終了後、菌体を滅菌済みのミラクロス（カルビオケム社製）により回収したのち、集めた菌体を２．０％アビセル（微結晶セルロース，シグマアルドリッチ社製）を唯一の炭素源としたＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ最少培地にて３０℃、６時間、１５０ｒｐｍにて培養した。滅菌済みのミラクロスを用い菌体をろ過により回収し、ペーパータオルにより挟み水分を除いた後、液体窒素を用いて急速に凍結させた。この菌体より実施例７に記した方法によりＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出したのち、得られたＴｏｔａｌ ＲＮＡの量および品質の検定を実施した。各検体より５００ｎｇのＴｏｔａｌ ＲＮＡを用い、実施例７に記した方法に従いＤＮＡマイクロアレイ解析を実施した。ＤＮＡマイクロアレイ実験の結果より、破壊株における発現量が１／１０以下に低下した遺伝子を抽出し図２１に記す。
抽出された遺伝子群のなかには、セロビオハイドロラーゼ Ｄ（ＧＨ ｆａｍｉｌｙ ７，ＡＯ０９００１２０００９４１）、セロビオハイドロラーゼ Ａ（ＧＨ ｆａｍｉｙ６，ＡＯ０９００３８０００４３９）およびセロビオハイドロラーゼ Ｃ（ＧＨ ｆａｍｉｌｙ ７，ＡＯ０９０００１０００３４８）等のセロビオハイドロラーゼ類やエンドグルカナーゼ（ＧＨ ｆａｍｉｌｙ ５，ＡＯ０９０００５００１５５３）やエンド－１，３（４）－β－グルカナーゼ（ＧＨ ｆａｍｉｌｙ １６，ＡＯ０９０１１３０００１０５）等のβ‐グルカナーゼ類、さらにセロビオハイドロラーゼやグルカナーゼの作用により生じるオリゴ糖類を分解するβ‐グルコシダーゼ（ｂｇｌ３，ＡＯ０９０００３０００４９７，ＧＨ ｆａｍｉｌｙ １）等、複数のセルロース加水分解酵素群が確認された。さらに、上記６種のセルロース加水分解酵素群の遺伝子はｍａｎＲの強制発現により、コントロールと比較して約８．７倍～約３３倍と顕著に発現が増大していた。また、実施例７で示したコンニャクマンナンを炭素源としたときのＤＮＡマイクロアレイ解析の際に顕著変化が見られたマンナン加水分解酵素群（エンド－β－マンナナーゼ、α－ガラクトシダーゼ及びβ－マンノシダーゼなど）に関しても、ｍａｎＲの破壊株でその発現が顕著に減少し、逆に強制発現株ではその発現があきらかに増大していた。以上のことから、ｍａｎＲはマンナン加水分解酵素群の遺伝子と同時にセルロース加水分解酵素群につても制御を行うことができることが示唆された。また、本実験では炭素源にはマンナン類が含まれていないにもかかわらず、ｍａｎＲにより制御される遺伝子を特定することに成功した。このことから、セルロースの加水分解産物であるセロビオース等のセロオリゴ糖もｍａｎＲ機能する際に必要な誘導物質となりうる事が示唆された。
ｍａｎＲの制御下に有るセルロース加水分解酵素遺伝子を特定するため、ｍａｎＲ破壊株のＤＮＡマイクロアレイ解析を実施した。その方法は以下の通りである。ｍａｎＲ強制発現株、破壊株及びコントロール株の分生子約１０，０００，０００個を１５０ｍｌ容の三角フラスコに入った４０ｍｌのＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ最少培地にて、１８時間培養し分生子を発芽させた。培養終了後、菌体を滅菌済みのミラクロス（カルビオケム社製）により回収したのち、集めた菌体を２．０％アビセル（微結晶セルロース，シグマアルドリッチ社製）を唯一の炭素源としたＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ最少培地にて３０℃、６時間、１５０ｒｐｍにて培養した。滅菌済みのミラクロスを用い菌体をろ過により回収し、ペーパータオルにより挟み水分を除いた後、液体窒素を用いて急速に凍結させた。この菌体より実施例７に記した方法によりＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出したのち、得られたＴｏｔａｌ ＲＮＡの量および品質の検定を実施した。各検体より５００ｎｇのＴｏｔａｌ ＲＮＡを用い、実施例７に記した方法に従いＤＮＡマイクロアレイ解析を実施した。ＤＮＡマイクロアレイ実験の結果より、破壊株における発現量が１／１０以下に低下した遺伝子を抽出し図２１に記す。
抽出された遺伝子群のなかには、セロビオハイドロラーゼ Ｄ（ＧＨ ｆａｍｉｌｙ ７，ＡＯ０９００１２０００９４１）、セロビオハイドロラーゼ Ａ（ＧＨ ｆａｍｉｙ６，ＡＯ０９００３８０００４３９）およびセロビオハイドロラーゼ Ｃ（ＧＨ ｆａｍｉｌｙ ７，ＡＯ０９０００１０００３４８）等のセロビオハイドロラーゼ類やエンドグルカナーゼ（ＧＨ ｆａｍｉｌｙ ５，ＡＯ０９０００５００１５５３）やエンド－１，３（４）－β－グルカナーゼ（ＧＨ ｆａｍｉｌｙ １６，ＡＯ０９０１１３０００１０５）等のβ‐グルカナーゼ類、さらにセロビオハイドロラーゼやグルカナーゼの作用により生じるオリゴ糖類を分解するβ‐グルコシダーゼ（ｂｇｌ３，ＡＯ０９０００３０００４９７，ＧＨ ｆａｍｉｌｙ １）等、複数のセルロース加水分解酵素群が確認された。さらに、上記６種のセルロース加水分解酵素群の遺伝子はｍａｎＲの強制発現により、コントロールと比較して約８．７倍～約３３倍と顕著に発現が増大していた。また、実施例７で示したコンニャクマンナンを炭素源としたときのＤＮＡマイクロアレイ解析の際に顕著変化が見られたマンナン加水分解酵素群（エンド－β－マンナナーゼ、α－ガラクトシダーゼ及びβ－マンノシダーゼなど）に関しても、ｍａｎＲの破壊株でその発現が顕著に減少し、逆に強制発現株ではその発現があきらかに増大していた。以上のことから、ｍａｎＲはマンナン加水分解酵素群の遺伝子と同時にセルロース加水分解酵素群につても制御を行うことができることが示唆された。また、本実験では炭素源にはマンナン類が含まれていないにもかかわらず、ｍａｎＲにより制御される遺伝子を特定することに成功した。このことから、セルロースの加水分解産物であるセロビオース等のセロオリゴ糖もｍａｎＲ機能する際に必要な誘導物質となりうる事が示唆された。
実施例２０に記したｍａｎＲの強制発現による麹菌マンナン加水分解酵素群生産の増強では、様々な種類の炭素源が含まれている「小麦フスマ」を炭素源として実験を行っている。本条件においてｍａｎＲを強制発現させた場合にも、セルラーゼ加水分解酵素群の遺伝子発現量が増加しうるかを、ＤＮＡマイクロアレイを用いて調べた。その方法は下記の通りである。１５０ｍｌ容の三角フラスコに８０％散水の小麦フスマを５ｇ入れ綿栓により栓をし、１２１℃で３０分間オートクレーブにより滅菌した。これに、ｍａｎＲ強制発現株、破壊株およびコントロール株の分生子をそれぞれ１０，０００，０００個ずつ接種し３０℃にて培養した。培養開始から２１時間後、検体をほぐしつつ撹拌（手入れ）したのち、さらに２７時間３０℃にて培養を行った。培養終了後、各培養物を液体窒素により急速に凍結した後、実施例７に記した方法に従ってＴｏｔａｌ ＲＮＡの抽出、定量、品質判定を実施した。各検体より５００ｎｇのＴｏｔａｌ ＲＮＡを分取し、実施例７に記した方法にしたがいＤＮＡマイクロアレイ解析を実施した。ＤＮＡマイクロアレイ実験の結果より、破壊株における発現量が１／８以下に低下した遺伝子を抽出し図２２に記す。
抽出された遺伝子群のなかには、アビセルを唯一の炭素源とした実験（実施例２２）でｍａｎＲ依存的発現が見られたセロビオハイドロラーゼ Ｄ（ＧＨ ｆａｍｉｌｙ ７，ＡＯ０９００１２０００９４１）、及びセロビオハイドロラーゼ Ｃ（ＧＨ ｆａｍｉｌｙ ７，ＡＯ０９０００１０００３４８）、及びエンドグルカナーゼ（ＧＨ ｆａｍｉｌｙ ５，ＡＯ０９０００５００１５５３）が含まれていた。一方アビセルを唯一の炭素源とした実験においてｍａｎＲ依存的発現が確認された、セロビオハイドロラーゼ Ａ（ＧＨ ｆａｍｉｙ６，ＡＯ０９００３８０００４３９）、エンド－１，３（４）－β－グルカナーゼ（ＧＨ ｆａｍｉｌｙ１６，ＡＯ０９０１１３０００１０５）、そしてβ－グルコシダーゼ（ｂｇｌ３，ＡＯ０９０００３０００４９７，ＧＨ ｆａｍｉｌｙ １）等の遺伝子については見出されなくなったが、その代わりにエンド－１，４－β－グルカナーゼ，ＣｅｌＢ（ＧＨ ｆａｍｉｌｙ ７，ＡＯ０９００１００００３１４）、エンドグルカナーゼ（ＧＨ Ｆａｍｉｌｙ １２，ＡＯ０９０００３０００９０５）、エンドグルカナーゼ（ＧＨ Ｆａｍｉｌｙ ６１，ＡＯ０９００２３０００７８７）、エンドグルカナーゼ（ＧＨ Ｆａｍｉｙ ６，ＡＯ０９００３８０００４３９）等別のセルロース加水分解酵素群が確認されるようなった。また、本実験により抽出されたセルロース加水分解酵素群では、エンドグルカナーゼ（ＧＨ Ｆａｍｉｌｙ ６１，ＡＯ０９００２３０００７８７）だけはｍａｎＲの強制発現の影響を受けなかったが、それ以外のセルロース加水分解酵素群の発現はｍａｎＲ強制発現株において、コントロールと比較して増加していることが確認された。また、実施例２２と同様にエンド－β－マンナナーゼ、α－ガラクトシダーゼ及びβ－マンノシダーゼ等の多くのマンナン加水分解酵素群に関しても、ｍａｎＲの破壊株でその発現が顕著に減少し、逆に強制発現株ではその発現が増大する傾向がみられた。以上の結果から、小麦フスマを炭素源とした場合には、影響を及ぼすセルロース加水分解酵素群の種類がセルロースを唯一の炭素源としたときと異なる部分もあるが、ｍａｎＲの強制発現がマンナン加水分解酵素群及びセルロース加水分解酵素群の発現の増強に寄与することが明らかとなった。培養条件によりｍａｎＲの強制発現により影響を受けるセルロース加水分解酵素群の種類が変化する原因としては、セルロース加水分解酵素群のなかにはｍａｎＲだけでなく他の転写制御因子による制御も同時に受けているものがあるためであると考えられる。
抽出された遺伝子群のなかには、アビセルを唯一の炭素源とした実験（実施例２２）でｍａｎＲ依存的発現が見られたセロビオハイドロラーゼ Ｄ（ＧＨ ｆａｍｉｌｙ ７，ＡＯ０９００１２０００９４１）、及びセロビオハイドロラーゼ Ｃ（ＧＨ ｆａｍｉｌｙ ７，ＡＯ０９０００１０００３４８）、及びエンドグルカナーゼ（ＧＨ ｆａｍｉｌｙ ５，ＡＯ０９０００５００１５５３）が含まれていた。一方アビセルを唯一の炭素源とした実験においてｍａｎＲ依存的発現が確認された、セロビオハイドロラーゼ Ａ（ＧＨ ｆａｍｉｙ６，ＡＯ０９００３８０００４３９）、エンド－１，３（４）－β－グルカナーゼ（ＧＨ ｆａｍｉｌｙ１６，ＡＯ０９０１１３０００１０５）、そしてβ－グルコシダーゼ（ｂｇｌ３，ＡＯ０９０００３０００４９７，ＧＨ ｆａｍｉｌｙ １）等の遺伝子については見出されなくなったが、その代わりにエンド－１，４－β－グルカナーゼ，ＣｅｌＢ（ＧＨ ｆａｍｉｌｙ ７，ＡＯ０９００１００００３１４）、エンドグルカナーゼ（ＧＨ Ｆａｍｉｌｙ １２，ＡＯ０９０００３０００９０５）、エンドグルカナーゼ（ＧＨ Ｆａｍｉｌｙ ６１，ＡＯ０９００２３０００７８７）、エンドグルカナーゼ（ＧＨ Ｆａｍｉｙ ６，ＡＯ０９００３８０００４３９）等別のセルロース加水分解酵素群が確認されるようなった。また、本実験により抽出されたセルロース加水分解酵素群では、エンドグルカナーゼ（ＧＨ Ｆａｍｉｌｙ ６１，ＡＯ０９００２３０００７８７）だけはｍａｎＲの強制発現の影響を受けなかったが、それ以外のセルロース加水分解酵素群の発現はｍａｎＲ強制発現株において、コントロールと比較して増加していることが確認された。また、実施例２２と同様にエンド－β－マンナナーゼ、α－ガラクトシダーゼ及びβ－マンノシダーゼ等の多くのマンナン加水分解酵素群に関しても、ｍａｎＲの破壊株でその発現が顕著に減少し、逆に強制発現株ではその発現が増大する傾向がみられた。以上の結果から、小麦フスマを炭素源とした場合には、影響を及ぼすセルロース加水分解酵素群の種類がセルロースを唯一の炭素源としたときと異なる部分もあるが、ｍａｎＲの強制発現がマンナン加水分解酵素群及びセルロース加水分解酵素群の発現の増強に寄与することが明らかとなった。培養条件によりｍａｎＲの強制発現により影響を受けるセルロース加水分解酵素群の種類が変化する原因としては、セルロース加水分解酵素群のなかにはｍａｎＲだけでなく他の転写制御因子による制御も同時に受けているものがあるためであると考えられる。
［マンナナーゼの誘導物質の探索とマンナナーゼの誘導物質依存的発現へのＭａｎＲの関与］
これまで、カビ由来の転写制御因子介した多糖類分解酵素の誘導には、転写制御因子とともに何らかの誘導物質が必要である事が報告されている。例えば、アミラーゼの転写制御因子であるＡｍｙＲではイソマルトースがその誘導物質であることが報告されている（Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅｔ，４２：４３‐５０，２００２）。また、キシラン加水分解酵素群及びセルロース加水分解酵素群の転写制御因子であるＸｌｎＲではＤ－キシロースならびにＤ－セロビオースがその誘導物質であることが報告されている（Ｊ． Ｇｅｎ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４７， １－１９，２００１）。上記のように、カビ類の多糖分解酵素の転写制御因子では、それら転写制御因子によって分解が制御される酵素の産物が誘導物質として働く例が見受けられる。そこでＭａｎＲを介したエンド－β－マンナナーゼの誘導に関しても同様の誘導物質が存在するかどうか検討した。本実験には、グルコマンナン及びガラクトマンナンの分解によって生じると考えられる、Ｄ－マンノース、Ｄ－グルコース、Ｄ－セロビオース、Ｄ－ガラクトース（和光純薬工業社製）又は１，４－β－Ｄ－マンノビオース（メガザイム社製）を使用した。これら糖類の構造を図２３に記す。
これまで、カビ由来の転写制御因子介した多糖類分解酵素の誘導には、転写制御因子とともに何らかの誘導物質が必要である事が報告されている。例えば、アミラーゼの転写制御因子であるＡｍｙＲではイソマルトースがその誘導物質であることが報告されている（Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅｔ，４２：４３‐５０，２００２）。また、キシラン加水分解酵素群及びセルロース加水分解酵素群の転写制御因子であるＸｌｎＲではＤ－キシロースならびにＤ－セロビオースがその誘導物質であることが報告されている（Ｊ． Ｇｅｎ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４７， １－１９，２００１）。上記のように、カビ類の多糖分解酵素の転写制御因子では、それら転写制御因子によって分解が制御される酵素の産物が誘導物質として働く例が見受けられる。そこでＭａｎＲを介したエンド－β－マンナナーゼの誘導に関しても同様の誘導物質が存在するかどうか検討した。本実験には、グルコマンナン及びガラクトマンナンの分解によって生じると考えられる、Ｄ－マンノース、Ｄ－グルコース、Ｄ－セロビオース、Ｄ－ガラクトース（和光純薬工業社製）又は１，４－β－Ｄ－マンノビオース（メガザイム社製）を使用した。これら糖類の構造を図２３に記す。
糖類添加によるエンド－β－マンナナーゼ遺伝子の発現変動は定量ＲＴ－ＰＣＲを使用し測定を行った。その方法は次の通りである。コントロール株及びｍａｎＲ強制発現株の分生子約１０，０００，０００個を、６０ｍＬの３．０％クエン酸を主たる炭素源とし、０．２％のペプトンを添加したＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ培地に植え、３０℃，１５０ｒｐｍにて１８時間培養し分生子を発芽させた。滅菌したミラクロスによりろ過し菌体を回収後、１．０％クエン酸を唯一の炭素源としたＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ培地により洗浄した。この菌体を１５０ｍＬ容の三角フラスコに入った２０ｍＬの１．０％のクエン酸を唯一の炭素源とするＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ培地に移した後、終濃度が０．５ｍＭになるようフィルター滅菌を実施した単糖及びオリゴ糖を添加した。上記糖質添加し各検体を３０℃で２時間１５０ｒｐｍで培養したのち、ろ過により菌体を回収した。この菌体より、上記方法に従いＲＮＡを精製・確認した後、マンナナーゼ遺伝子（ＡＯ０９００１００００１２２）の発現量を定量ＲＴ-ＰＣＲ法により測定した。定量ＲＴ－ＰＣＲ法としては、Ｓｙｂｅｒ Ｇｒｅｅｎ Ｉを用いたインターカレート法を使用し、試薬にはＢｒｉｌｌｉａｎｔ ＩＩ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＱＲＴ－ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ，１－Ｓｔｅｐ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、装置にはＭＸ３０００Ｐ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いた。定量ＲＴ－ＰＣＲの反応はメーカーの取扱説明書に従い、２５μＬの反応系に対し１００ｎｇのＴｏｔａｌ ＲＮＡを添加し測定した。プライマー濃度はそれぞれ５０ ｐｍｏｌであり、内部標準としてはＨＩｓｔｏｎｅ Ｈ２Ｂ遺伝子(ＡＯ０９００２００００００６)を使用した。データーの解析には、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ＣＴ法(ΔΔＣＴ ｍｅｔｈｏｄ）を使用しソフトウエアにはＭｘＰｒｏ ｖｅｒｓｉｏｎ３．２（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用した。本定量ＲＴ－ＰＣＲにて使用したオリゴヌクレオチドプライマーの配列を表１１に記した。
本定量ＲＴ－ＰＣＲの結果を図２４に示す。
マンナナーゼの発現はβ－１，４－Ｄ－マンノビオースを用いたときに非添加時と比較して１６倍以上増加していた。このことら、β－１，４－Ｄ－マンノビオースはマンナナーゼの強力な誘導物質であることがわかった。また、マンノース、グルコース及びセロビオースを用いた場合においても、２倍以下と弱いながらも本遺伝子の発現が誘導され、これらの物質もマンナナーゼの弱い誘導物質であることが示唆された。Ｄ－グルコースやＤ－セロビオースが誘導物質の一つであることは、実施例２２及び２３の結果から考えても合理的であると考えられる。一方Ｄ－ガラクトースは、添加した場合でもネガティブコントロールと比較して変化がみられなかったことから、エマンナナーゼの誘導には寄与しないことが示唆された。
次にコントロールと同様の条件でｍａｎＲ破壊株を用いた試験を実施し、誘導物質を介したマンナナーゼの誘導にはＭａｎＲが必要であるかどうかを調べた。その結果、ｍａｎＲを破壊した場合には、β－１，４－Ｄ－マンノビオースを始め、その他の糖類を添加しても、ネガティブコントロールと同じ発現パターンになり、本酵素の誘導が見られなくなった（図２４）。以上のことから麹菌マンナナーゼの誘導物資を介した発現誘導には、ＭａｎＲの存在が必須である事がわかった。
マンナナーゼの発現はβ－１，４－Ｄ－マンノビオースを用いたときに非添加時と比較して１６倍以上増加していた。このことら、β－１，４－Ｄ－マンノビオースはマンナナーゼの強力な誘導物質であることがわかった。また、マンノース、グルコース及びセロビオースを用いた場合においても、２倍以下と弱いながらも本遺伝子の発現が誘導され、これらの物質もマンナナーゼの弱い誘導物質であることが示唆された。Ｄ－グルコースやＤ－セロビオースが誘導物質の一つであることは、実施例２２及び２３の結果から考えても合理的であると考えられる。一方Ｄ－ガラクトースは、添加した場合でもネガティブコントロールと比較して変化がみられなかったことから、エマンナナーゼの誘導には寄与しないことが示唆された。
次にコントロールと同様の条件でｍａｎＲ破壊株を用いた試験を実施し、誘導物質を介したマンナナーゼの誘導にはＭａｎＲが必要であるかどうかを調べた。その結果、ｍａｎＲを破壊した場合には、β－１，４－Ｄ－マンノビオースを始め、その他の糖類を添加しても、ネガティブコントロールと同じ発現パターンになり、本酵素の誘導が見られなくなった（図２４）。以上のことから麹菌マンナナーゼの誘導物資を介した発現誘導には、ＭａｎＲの存在が必須である事がわかった。
[麹菌における転写制御因子を介したセルロース加水分解酵素群ならびにヘミセルロース加水分解酵素群の生産制御]
本発明の転写制御因子（ＭａｎＲ）が麹菌のセルロース加水分解酵素群及びヘミセルロース加水分解酵素群の遺伝子発現制御系において、どの部分にて機能するかを図２５に記す。
キシランはβ－マンナン類とともにヘミセルロースの主要な成分のひとつである。このキシランを加水分解するキシラナーゼ群はＸｌｎＲという転写制御において制御されていることが知られている（Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔ Ｂｉｏｌ ３５： １５７－１６９，２００２）。さらに、このＸｌｎＲはセロビオハイドロラーゼ類やエンドグルカナーゼ類などのセルロース加水分解酵素群の発現についても制御することが知られている（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，５２８：２７９－２８２，２００２）。本発明のＭａｎＲは、キシラナーゼ遺伝子群の発現制御能を有していない代わりに、マンナン加水分解酵素群の制御能を有していた。また、ＭａｎＲはＸｌｎＲと同様にセルロース加水分解酵素群の発現制御能を有していた。言い換えれば、麹菌のセルロース加水分解酵素群はＸｌｎＲとＭａｎＲの少なくとも２種以上の転写制御因子によりその発現がコントロールされていると考えられた。植物細胞壁中に含まれるヘミセルロースの種類と含量は針葉樹と広葉樹ではことなっていることが知られている（Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ７９，１６５－１７８，２００８）。麹菌は、バリエーションのあるヘミセルロースの組成に対し対応できるようにキシラン分解系はＸｌｎＲで、β‐マンナン分解系はＭａｎＲでというように両転写制御因子を使い分けていることが推測された。
本発明の転写制御因子（ＭａｎＲ）が麹菌のセルロース加水分解酵素群及びヘミセルロース加水分解酵素群の遺伝子発現制御系において、どの部分にて機能するかを図２５に記す。
キシランはβ－マンナン類とともにヘミセルロースの主要な成分のひとつである。このキシランを加水分解するキシラナーゼ群はＸｌｎＲという転写制御において制御されていることが知られている（Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔ Ｂｉｏｌ ３５： １５７－１６９，２００２）。さらに、このＸｌｎＲはセロビオハイドロラーゼ類やエンドグルカナーゼ類などのセルロース加水分解酵素群の発現についても制御することが知られている（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，５２８：２７９－２８２，２００２）。本発明のＭａｎＲは、キシラナーゼ遺伝子群の発現制御能を有していない代わりに、マンナン加水分解酵素群の制御能を有していた。また、ＭａｎＲはＸｌｎＲと同様にセルロース加水分解酵素群の発現制御能を有していた。言い換えれば、麹菌のセルロース加水分解酵素群はＸｌｎＲとＭａｎＲの少なくとも２種以上の転写制御因子によりその発現がコントロールされていると考えられた。植物細胞壁中に含まれるヘミセルロースの種類と含量は針葉樹と広葉樹ではことなっていることが知られている（Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ７９，１６５－１７８，２００８）。麹菌は、バリエーションのあるヘミセルロースの組成に対し対応できるようにキシラン分解系はＸｌｎＲで、β‐マンナン分解系はＭａｎＲでというように両転写制御因子を使い分けていることが推測された。
以上により、配列番号１記載のＤＮＡを組込んだ組換えベクターにより形質転換された形質転換体により、マンナン加水分解酵素群及びセルロース加水分解酵素群の生産を増強できることが確認できた。また、配列番号１記載の塩基配列によりコードされる配列番号２記載のアミノ酸配列を含む蛋白質がマンナン加水分解酵素群及びセルロース加水分解酵素群の遺伝子の転写制御能を有することも明らかになった。
Claims (8)
- 以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の蛋白質：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、マンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群の遺伝子の転写制御能を有する蛋白質；又は
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む蛋白質又はその部分断片であり、かつ、マンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群の遺伝子の転写制御能を有する蛋白質。 - （ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の蛋白質をコードする遺伝子：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、マンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群の遺伝子の転写制御能を有する蛋白質；又は
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む蛋白質又はその部分断片であり、かつ、マンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群の遺伝子の転写制御能を有する蛋白質。 - 以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡから成る遺伝子：
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を含むＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列又はその相補鎖を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、マンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群の遺伝子の転写制御能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする核酸又はその相補鎖を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、マンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群の遺伝子の転写制御能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；又は
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列のＤＮＡと７０％以上の配列同一性を示し、かつ、マンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群の遺伝子の転写制御能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。 - 請求項２又は３に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
- 請求項４記載の組換えベクターを含む形質転換体。
- 請求項５記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からマンナン加水分解酵素遺伝子群転写制御因子を回収することを特徴とする該転写制御因子の製造方法。
- 請求項５記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からマンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群を回収することを特徴とするマンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群の製造方法。
- 請求項５記載の形質転換体を培養し、該形質転換体によるマンナン加水分解酵素群又はセルロース加水分解酵素群の産生を増強させる方法。
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