JP2015167475A - 転写制御因子manR及びxlnRを二重強制発現させた麹菌を用いる多糖類の分解方法 - Google Patents
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Abstract
Description
第1の発明は、manR遺伝子又はその相同遺伝子及びxlnR遺伝子又はその相同遺伝子を強制発現させた形質転換体用いて多糖類を分解する方法に関する。より具体的には、下記の遺伝子(a)(manR遺伝子又はその相同遺伝子)及び遺伝子(b)(xlnR遺伝子又はその相同遺伝子)が強制発現される。
(a) 下記(a-1)〜(a-5)のいずれかの遺伝子:
(a-1) 配列番号1記載の塩基配列から成る遺伝子、
(a-2) 配列番号3記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子、
(a-3) 配列番号1記載の塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列から成る、糖質加水分解酵素の転写制御因子をコードする遺伝子、
(a-4) 配列番号3記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列から成る、糖質加水分解酵素の転写制御因子をコードする遺伝子、あるいは
(a-5) 配列番号3記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列から成る、糖質加水分解酵素の転写制御因子をコードする遺伝子、並びに
(b) 下記(b-1)〜(b-5)のいずれかの遺伝子:
(b-1) 配列番号2記載の塩基配列から成る遺伝子、
(b-2) 配列番号4記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子、
(b-3) 配列番号2記載の塩基配列から成る遺伝子と90%以上の同一性を有する塩基配列から成る、糖質加水分解酵素の転写制御因子をコードする遺伝子、
(b-4) 配列番号4記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列から成る、糖質加水分解酵素の転写制御因子をコードする遺伝子、あるいは
(b-5) 配列番号4記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列から成る、糖質加水分解酵素の転写制御因子をコードする遺伝子。
本発明の組換えベクターは、manR遺伝子及びxlnR遺伝子を適当なベクター上に連結することにより得ることができる。ベクターとしては、形質転換する宿主中で該2種転写制御因子を強制発現であればどのようなものでも用いることができ、例えば、染色体組み込み型に限らず、糸状菌において保持可能な自立複製型プラスミドなどのベクターを用いることもできる。
アスペルギルス・ソーヤNBRC4239株については、そのドラフトゲノム解析の結果が2011年に公開されており(DNA Research;18, 165−176、2011)、本菌のスキャッフォールドの塩基配列は、DDBJ/ENA/Genbankアクセッション番号DF093557からDF093585として登録・公開されている。
配列番号1番及び配列番号2番に示す遺伝子を、醤油麹菌にて同時に強制発現させた場合に、本菌のセルラーゼ・ヘミセルラーゼ生産能を増強させる効果があるか検証した。
アスペルギルス・ソーヤの液体培養用培地としては、デキストリン−ペプトン培地(ポリペプトン 1%、デキストリン 2%、リン酸二水素カリウム 0.5%、硝酸ナトリウム 0.1%、硫酸マグネシウム 0.05%、カザミノ酸 0.1%、pH 6.0)を使用した。
ベクター作製時のFusion PCRの鋳型DNAなどに使用する麹菌アスペルギルス・ソーヤNBRC4239株のゲノムDNAは、下記の手順にて抽出・精製を行った。糸状菌菌体又は分生子を、150ml容の三角フラスコに入った40mlのデキストリン−ペプトン培地に植え、30℃、150rpmで3日間培養した。培養終了後、ろ過により菌体を回収し、ペーパータオルで挟み、水分を除いた後、液体窒素を用いて急速に凍結させた。
菌体をマルツ寒天培地にて30℃、7日間培養し分生子を形成させた。この分生子を、プレート1枚あたり5mLの滅菌済み0.01% Tween溶液に懸濁後して回収した。得られた分生子懸濁液500 μLを遠心分離後、沈殿を800μLのNuclei Lysis Solution (Promega社製) に再懸濁したのち、これを直径0.5mmのガラスビーズ(500μL分)を入れたスクリューキャップ付き2.0mLに移し、ビーズショッカー(安井機器社製)により破砕した。破砕液を650μL分取後、300μLのProtein Precipitation Solution(Promega社製)を加えて混合したのち、12,000xgで15分間遠心分離し、上清を650μL分取した。ここに650μLのフェノール・クロロフォルム・イソアミルアルコール(ニッポンジーン社製)を加えた後、ボルテックスミキサーにより激しく混合し、12,000xgで10分間遠心分離した。水層を600μL分取し、2−propanol沈殿により濃縮後、沈殿を50μLのTEバッファーにより溶解し、これをゲノムDNAとした。
実施例2に記載するmanR−xlnR二重強制発現株は、アスペルギルス・ソーヤ KPA−del−S2−5R株(ΔpyrG,ΔadeA、Δku70)(アスペルギルス・ソーヤNBRC4239株誘導体)を宿主として作製した。
アスペルギルス・ソーヤKP−del株に、pyrGをループアウトにより除去可能な状態で、adeA遺伝子座に導入した。adeA除去用ベクターはFusion PCR法を用いて調製した。
xlnR強制発現用ベクターの概要を図5に記した。
今回強制発現させるターゲット遺伝子は転写制御因子であるため、ベクターのコピー数の増加を実施すると、菌体に負荷がかかりすぎ、悪影響を生じることが懸念される。そのため、もともとあったxlnRのプロモーターをより強力なアルカリプロテアーゼ遺伝子のプロモーターに置換し、固体培養時にのみxlnRが高発現されるようにした。
次に、xlnR−OEΔpyrG株を宿主とし、manR−xlnR二重強制発現株を作製した。manR強制発現用ベクターの構造を図7に記した。manRについてもxlnRと同様に転写制御因子遺伝子であるため、コピー数の増加を伴う強制発現を行った場合、菌体に悪影響があることが懸念された。そのため、manR遺伝子のもともとのプロモーターを、トランスレーションエロンゲーションファクターのプロモーターであるプロモーターに置換する方法での遺伝子強制発現を行った。
manR単独強制発現株については、manR−xlnR−OE株のゲノムを鋳型とし、manR強制発現用カセットをPCRにより増幅し、アスペルギルス・ソーヤKP−del(Δku70、ΔpyrG)株へ導入することで作製した。PCR用のオリゴヌクレオチドプライマーには、配列番号27及び配列番号34を使用し、PCR用酵素にはTOYOBO社のKOD Plus Neoを使用した。
xlnR−OEΔpyrG株は栄養要求性があるため、この株をmanR−xlnR−OE株の比較対照として用いることは適切でないと思われる。そこでxlnR―OEΔpyrG株のpyrG遺伝子を復元させた株を作製した。アスペルギルス・ソーヤNBRC4239株のゲノムDNAを鋳型とし、表6に示したオリゴヌクレオチドプライマー(配列番号15及び配列番号16)を用いたPCRを行い、pyrG遺伝子全長を含む6.6kbのDNAフラグメントを増幅した。PCRの温度サイクルの条件は、94℃ 2分間の加熱ののち、98℃ 10秒間 68℃9分間を35サイクルとした。得られたDNAフラグメントを2−プロパノール沈殿により濃縮したのち、xlnR―OEΔpyrG株に導入し、1.2Mソルビトールを含む最少培地で選抜することで形質転換体を得た。本形質転換体をxlnR―OEΔpyrG株作製時と同様の方法にて確認した。
実施例2において作製した形質転換体において、目的とする転写制御因子が正しく強制発現され、各種糖質分解酵素の生産量の増加が生じているかを検証した。
各形質転換体をマルツ寒天培地に接種し、30℃にて7日間培養し分生子を形成させた。この分生子を、滅菌済み0.01% Tween溶液を用いて回収し、滅菌済み70μmメッシュのセルストレーナー(BDファルコン社製)に通して混入してきた菌糸を除去したのち、血球計算盤を用いて各懸濁液中の分生子数をカウントした。この計測値をもとに各懸濁液の分生子数が5.0x107/mLになるよう0.01% Tween溶液を用いて希釈した。7gの原料(脱脂大豆:小麦:水=1:1:1.3)を150mL容三角フラスコに入れ、オートクレーブにより滅菌した。これに上記希釈済み分生子を200μLずつ接種し、30℃で40時間培養した。培養が終了した150mL容三角フラスコに、20mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.0を20mL加えてゴム栓をし、100回激しく撹拌した。これを4℃にて一晩静置し、ADVANTEC社のNo.5Cのろ紙にてろ過し、ろ液を酵素活性測定に使用した。
β―マンナナーゼ活性測定
50mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.5)に2%になるようアゾ−カロブガラクトマンナン(メガザイム)を溶解させた基質溶液150μLに、75μLの50mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.5)及び、50mM酢酸ナトリウム緩衝液により適宜希釈した粗酵素溶液75μLを加え、40℃にて30分間インキュベートした。ここに800μLの100%エタノールを加え10分間静置後、1,500xgで15分間遠心分離したのち、上清のOD590nmを測定することによりマンナナーゼ活性を測定した。なおブランクとしては、酵素溶液より前に反応停止用の100%エタノールを添加したものを使用した。また、各検体のOD590nmからブランクのOD590nmを差し引いたものをΔOD590nmとし、コントロール(NBRC4239Δku70)におけるΔOD590nmの平均値を1倍とし、各検体の相対活性を求めた。
50mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.5)に0.25%となるようにRBBキシランを溶解させた基質溶液250μLに、50mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.5)により希釈した粗酵素溶液50μLを添加し、40℃にて20分間インキュベートした。ここに、1,000μLの100%エタノールを添加し、10分間室温にて静置したのち、15,000xgにて10分間遠心分離を行った。この遠心分離後の上清のOD595nmを測定することで、キシラナーゼ活性を求めた。なおブランクとしては、酵素溶液より前に反応停止用の100%エタノールを添加したものを使用した。また、各検体のOD595 nmからブランクのOD595nmを差し引いたものをΔOD595nmとし、コントロール(NBRC4239Δku70)におけるΔOD595nm平均値を1倍とし、各検体の相対活性を求めた。
50mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.5)に2.0%となるようにアゾ−カルボキシメチルセルロース(メガザイム社製)を溶解させた基質液150μLに、緩衝液により5倍希釈した粗酵素溶液を150μL添加し、40℃にて20分間インキュベートした。反応液に反応停止液(2%酢酸ナトリウム−0.2%酢酸亜鉛溶液pH5.0と99.5%エタノールを1:4で混合したもの)を800μL加えたのち、1,500xgにて10分間遠心分離を行った。この上清のOD590nmを測定することによりエンドグルカナーゼ活性を測定した。なおブランクとしては、酵素溶液より前に反応停止液を添加したものを使用した。また、各検体のOD590nmからブランクのOD590nmを差し引いたものをΔOD590nmとし、コントロール(NBRC4239Δku70)におけるΔOD590nm平均値を1倍とし、各検体の相対活性を求めた。
50mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.5)に6.0%となるようにアゾ−アビセル(メガザイム社製)を均一に分散させた基質液300μLに、粗酵素溶液原液を300μL添加し、40℃にて24時間、180rpmにて振盪しながらインキュベートした。反応液を95℃15分間処理し反応停止後、1,500xgにて10分間遠心分離した。この遠心分離後の上清のOD590nmを測定することで、セロビオハイドロラーゼ活性を求めた。なおブランクとしては、酵素溶液を添加後直ちに95℃、15分間処理したものを使用した。また、各検体のOD590nmからブランクのOD590nmを差し引いたものをΔOD590nmとし、コントロール(NBRC4239Δku70)におけるΔOD590nm平均値を1倍とし、各検体の相対活性を求めた。
(α−ガラクトシダーゼ、及び β−キシロシダーゼ)
1.25mMになるように50mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.5)に溶解した合成基質溶液(各糖質のp−ニトロフェニル−誘導体)400μLに、緩衝液により適宜希釈した菌体外酵素液を100μL加え、40℃で15分間インキュベートした。ここに、500μLの0.5M炭酸ナトリウム溶液を加えることで反応を停止したのち、加水分解反応により遊離したp−ニトロフェノールの吸収極大である405nmにおける吸光度(OD405nm)を測定することで、各種加水分解酵素活性を測定した。また、1.25 mM合成基質溶液に0.5M炭酸ナトリウムを先に添加したのち、希釈済み酵素溶液を加えた系列をブランクとした。酵素反応を行った系列のOD405nm値からブランクのOD405を引いた値をΔOD405nmとし、コントロール(NBRC4239Δku70)におけるΔOD405nmの平均値を1倍として、各検体の相対活性を求めた。
各検体のβ−マンノシダーゼ及びα−ガラクトシダーゼの活性測定結果を図11に示した。manR−OE株では、β−マンナナーゼ及びα−ガラクトシダーゼ活性がコントロール株(NBRC4239Δku70)と比較し、顕著に上昇していた。これは、ManRが醤油麹菌アスペルギルス・ソーヤでもマンナン加水分解酵素群の正の制御因子として機能していることを示すも結果であった。これは、以前アスペルギルス・オリゼーにおいて観測されていたのと同様の現象である(Fungal Genet. Biol.; 49、987−995、2012)。また、manR−xlnR−OE株では、β−マンナナーゼについては顕著に増大する傾向が見られ、α−ガラクトシダーゼについても上昇する傾向が見られた。
実施例2にて示したとおり、アスペルギルス・ソーヤにおけるmanR―xlnR二重強制発現では、本菌のセルラーゼ・ヘミセラーゼの生産能が大幅に向上していることが確認された。そこで、本菌を用いた醤油原料の短期間分解試験を行い、本菌株が醤油製造における原料由来の多糖成分の分解促進に有効であるか検討を行った。
脱脂大豆、小麦及び水を1:1:1.3の割合で混合したのち、15g秤量し、150mL容の三角フラスコにいれ、綿栓をしてオートクレーブにより滅菌した。これに、2.7 x 107個のmanR−xlnR−OE株、manR−OE株、xlnR−OE株又はNBRC4239 Δku70株(ネガティブコントロール)の分生子をそれぞれ接種し、よくまぜた(盛込み)。これを30℃で培養し盛込みから46時間を経過したところで出麹とした。なお、それぞれの実験は3反復で行った。
脱脂大豆、小麦及び水を1:1:1.3の割合で混合したのち、15g秤量し、150mL容の三角フラスコにいれ、綿栓をしてオートクレーブにより滅菌した。これに、2.7 x 107個のmanR−xlnR−OE株、manR−OE株、xlnR−OE株又はNBRC4239 Δku70株(ネガティブコントロール)の分生子をそれぞれ接種し、よくまぜた(盛込み)。これを30℃で培養し盛込みから46時間を経過したところで出麹とした。なお、それぞれの実験は3反復で行った。
実施例2から3までに示したデータは、いずれもアスペルギルス・ソーヤNBRC4239株の誘導体にて取得したデータである。アスペルギルス属状菌の場合、同じ属種であっても系列の異なる株で遺伝子強制発現を行っ場合に効果が現れないこともありうる。
そこで、NBRC4239株とは異なる系列のである、アスペルギルス・ソーヤNBRC4241株の系統を宿主とした場合でも、manR−xlnR二重強制発現の効果があるか検証を行った。
上記形質転換体が、醤油原料の分解に有効であるか、短期間分解試験を実施し評価した。脱脂大豆、小麦及び水を1:1:1.3の割合で混合したのち、15g秤量し、150mL容の三角フラスコにいれ、綿栓をしてオートクレーブにより滅菌した。これに、2.7 x 107個のXROE−N2株、MROE−N2株、MXOE−N2株又はアスペルギルス・ソーヤDku株(コントロール)の分生子をそれぞれ接種し、よくまぜた(盛込み)。これを30℃で培養し盛込みから43時間を経過したところで出麹とした。なお、それぞれの実験は3反復で行った。
分解反応終了後、サンプルを25 mL容のポリプロピレンチューブに移し、回転粘度計(TOKIMEC Viscometer BLII) により粘度を測定した。
短期間分解反応終了後の諸味を、漏斗にセットした110mm径のワットマンNo.1のろ紙上に約25g分取し、その量を天秤にて測定した。ろ過により得られた液汁を、あらかじめ重量を測定しておいた15mL容ポリプロピレンチューブにより回収し、その全体重量を経時適に測定することで、諸味から自然だれにより回収される液汁(原料分解液)の量を計測した。この回収される液汁の重量をろ紙上にアプライした諸味重量(g)で割ることで、諸味1gあたりから得られる液汁量を求めた。
図18Aは、諸味粘度を測定した結果である。manR−xlnR二重強制発現株であるMXOE−N2株では諸味粘度が他の検体と比較して顕著に低下していた。
manR−xlnR二重強制発現株であるMXOE−N2株を用いて醤油を試醸した際に、諸味粘度の低下と自然だれによる液汁の回収量の増加が見られるか確認を行った。
脱脂大豆と小麦及び水を1:1:1.3の比率で混合した醤油原料55gをフェルンバッハフラスコに入れ、オートクレーブにより滅菌し室温まで冷却した。ここに、4.0 x 107/mLに希釈したXROE−N2株、MROE−N2株、MXOE−N2株及びコントロール株(Dku株)の分生子を2.5 mLずつ接種しよく混合した(盛込み)。これを30℃で18時間インキュベート後一手入れを行ってほぐしたのち、30℃でさらに6時間インキュベートし二手入れを行って再度ほぐした。二手入れ後、温度を25℃に下げたのち19時間培養し、盛込みから43時間経過した時点で出麹とした。
出麹サンプル40gを滅菌済みの100mLプラスチックボトルに移し、ここに35mLの30%食塩水(w/v)を加えて混合し諸味とした。これに、純粋培養した醤油乳酸菌テトラジェノコッカス・ハロフィルス及び醤油酵母ジゴサッカロミセス・ルキシーを添加し、15℃から30℃にて90日間発酵させた。
90日間発酵の諸味を25mL容のポリプロピレンチューブに移し、25℃にて1時間保温した。この保温済みの諸味の粘度を、回転粘度計(TOKIMEC Viscometer BLII)により測定した。
発酵試験が終了した醤油諸味を、漏斗にセットした110mm径のワットマンNo.1のろ紙上に約24g分取し、その量を天秤にて測定した。ろ過により得られた液汁を、あらかじめ重量を測定しておいた15mL容ポリプロピレンチューブにより回収し、その全体重量を経時的に測定することで、諸味から自然だれにより回収される液汁(原料分解液)の量を計測した。この回収される液汁の重量をろ紙上にアプライした諸味重量(g)で割ることで、諸味1gあたりから得られる液汁量を求めた。
Claims (8)
- 多糖類を分解する方法であって、
下記の遺伝子(a)及び(b)を強制発現させた形質転換体を用いることを特徴とする方法:
(a) 下記(a-1)〜(a-5)のいずれかの遺伝子:
(a-1) 配列番号1記載の塩基配列から成る遺伝子、
(a-2) 配列番号3記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子、
(a-3) 配列番号1記載の塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列から成る、糖質加水分解酵素の転写制御因子をコードする遺伝子、
(a-4) 配列番号3記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列から成る、糖質加水分解酵素の転写制御因子をコードする遺伝子、あるいは
(a-5) 配列番号3記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列から成る、糖質加水分解酵素の転写制御因子をコードする遺伝子、並びに
(b) 下記(b-1)〜(b-5)のいずれかの遺伝子:
(b-1) 配列番号2記載の塩基配列から成る遺伝子、
(b-2) 配列番号4記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子、
(b-3) 配列番号2記載の塩基配列から成る遺伝子と90%以上の同一性を有する塩基配列から成る、糖質加水分解酵素の転写制御因子をコードする遺伝子、
(b-4) 配列番号4記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列から成る、糖質加水分解酵素の転写制御因子をコードする遺伝子、あるいは
(b-5) 配列番号4記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列から成る、糖質加水分解酵素の転写制御因子をコードする遺伝子。 - 前記遺伝子(a)がトランスレーションエロンゲーションファクターのプロモーターの支配下、そして、前記遺伝子(b)がアルカリプロテアーゼのプロモーターの支配下にある、請求項1に記載の方法。
- 宿主が糸状菌である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記糸状菌がアスペルギルス・ソーヤ(Aspergillus sojae)である、請求項3に記載の方法。
- 前記多糖類が醤油原料由来である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法に従い、醤油原料由来の多糖類を分解する工程を含む、醤油の製造方法。
- 以下の遺伝子を含む組換えベクター。
(a) 下記(a-1)〜(a-5)のいずれかの遺伝子:
(a-1) 配列番号1記載の塩基配列から成る遺伝子、
(a-2) 配列番号3記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子、
(a-3) 配列番号1記載の塩基配列から成る遺伝子と90%以上の同一性を有する塩基配列から成る、糖質加水分解酵素の転写制御因子をコードする遺伝子、
(a-4) 配列番号3記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列から成る、糖質加水分解酵素の転写制御因子をコードする遺伝子、あるいは
(a-5) 配列番号3記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列から成る、糖質加水分解酵素の転写制御因子をコードする遺伝子、並びに
(b) 下記(b-1)〜(b-5)のいずれかの遺伝子:
(b-1) 配列番号2記載の塩基配列から成る遺伝子、
(b-2) 配列番号4記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子、
(b-3) 配列番号2記載の塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列から成る、糖質加水分解酵素の転写制御因子をコードする遺伝子、
(b-4) 配列番号4記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列から成る、糖質加水分解酵素の転写制御因子をコードする遺伝子、あるいは
(b-5) 配列番号4記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列から成る、糖質加水分解酵素の転写制御因子をコードする遺伝子。 - 請求項7に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
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