WO2010095422A1 - 悪性腫瘍治療剤 - Google Patents

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ribonuclease
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法男 井口
鈴木　孝
弘子 小林
恵市 田畑
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    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/27—Endoribonucleases producing 3'-phosphomonoesters (3.1.27)
    • C12Y301/27003—Ribonuclease T1 (3.1.27.3)

Definitions

  • the present invention relates to a malignant tumor therapeutic agent containing a new ribonuclease.
  • Ribonuclease is an enzyme that degrades RNA, and examples include ribonuclease T2 regardless of the type of base, ribonuclease A that cleaves only a portion having a pyrimidine base, and ribonuclease T1 that degrades only a guanine portion.
  • ⁇ -sarcin having antitumor activity has a structure close to that of RNase T1, but is not a T1 type RNase.
  • An object of the present invention is to provide an antineoplastic therapeutic agent containing a new ribonuclease.
  • T1 type ribonuclease derived from oyster mushrooms has a particularly strong tumor cell growth inhibitory action compared to ribonuclease derived from Yamabushitake which is the same T1 type ribonuclease. And was found to be particularly useful as a therapeutic agent for malignant tumors among T1-type ribonucleases, thereby completing the present invention.
  • the present invention provides a therapeutic agent for malignant tumors containing T1 type ribonuclease derived from oyster mushrooms.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for the treatment of malignant tumors comprising a oyster mushroom-derived T1 type ribonuclease and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the present invention also provides use of oyster mushroom-derived T1-type ribonuclease for the production of a therapeutic agent for malignant tumors.
  • the present invention provides a method for treating malignant tumors, characterized by administering an effective amount of T1-type ribonuclease derived from oyster mushrooms.
  • the therapeutic agent for malignant tumor of the present invention has an excellent tumor cell growth inhibitory action, is stable in the vicinity of neutrality, and has high thermal stability, so that it can be easily applied as a pharmaceutical product.
  • the active ingredient of the malignant tumor therapeutic agent of the present invention is a oyster mushroom-derived T1 type ribonuclease (hereinafter sometimes abbreviated as RNase Po1).
  • Oyster mushrooms are edible mushrooms belonging to the genus Oyster mushrooms, among which Pleurotus ostereatus is particularly preferable.
  • the T1 type ribonuclease used in the present invention can be extracted from the oyster mushroom fruit body, but can also be extracted from a transformant of a microorganism such as Escherichia coli by a genetic recombination method.
  • RNase Po1 has a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and ribonuclease Proteins with activity are included.
  • the amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is one having 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, particularly Those having an identity of 95% or more are preferred.
  • the oyster mushroom fruit body is chopped or pulverized, homogenized with an aqueous sodium acetate solution, and solids are removed by centrifugation. Next, a protein fraction can be obtained from this supernatant by ammonium sulfate fractionation and fractionated by gel filtration, ion exchange chromatography, or the like (J. Biochem. 116, 26-33 (1994)).
  • a part of amino acid sequence such as N-terminal and C-terminal of RNase Po1 purified from the fruit body of oyster mushroom is determined by a known method, and an oligonucleotide corresponding thereto is synthesized. After extracting the oyster mushroom total RNA using the synthesized oligonucleotide as a probe, the cDNA fragment obtained by the reverse transcriptase reaction may be cloned.
  • the host used for cloning is not particularly limited, but it is appropriate to use Escherichia coli as the host in terms of operability and convenience.
  • an expression control signal A recombinant expression vector in which a transcription initiation signal and a translation initiation signal are linked upstream is prepared.
  • a transcription initiation signal when E. coli is used as a host, lac promoter, trp promoter, tac promoter (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 80, 21 (1983), Gene, 20, 231) (1982)), trc promoter (J. Biol. Chem., 260, 3539 (1985)) and the like.
  • the vector various plasmid vectors, phage vectors, etc.
  • plasmid vector When Escherichia coli is specifically used as a host, pBR322 (Gene, 2, 95 (1975)), pUC18, pUC19 (Gene, 33, 103 (1985)) and the like can be exemplified. A microorganism is transformed using the prepared recombinant vector.
  • the host microorganism is not particularly limited as long as it is safe and easy to handle. For example, microorganisms commonly used for DNA recombination operations such as Escherichia coli and yeast can be used.
  • Escherichia coli is advantageous, and for example, BL21 strain, K12 strain, C600 strain, JM105 strain, JM109 strain (Gene, 33, 103-119 (1985)) used for recombinant DNA experiments can be used. .
  • Many methods for transforming microorganisms have already been reported, and may be appropriately selected according to the microorganism used as a host.
  • Escherichia coli can be transformed by a method (J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)) in which a plasmid is introduced into the cells after treatment with calcium chloride at a low temperature.
  • the obtained transformant is grown in a medium in which the microorganism can grow, and further cultured until the enzyme accumulates in large amounts inside or outside the cell by inducing the expression of the cloned RNase Po1 gene. Do.
  • the transformant may be cultured according to a conventional method using a medium containing a nutrient source necessary for the growth of the microorganism, such as a carbon source and a nitrogen source.
  • Escherichia coli when Escherichia coli is used as a host, a medium commonly used for culturing Escherichia coli such as 2 ⁇ YT medium (Methods in Enzymology, 100, 20 (1983)), LB medium, M9CA medium (Molecular Cloning, the above) is used as a medium. It can be used at a culture temperature of 20 to 40 ° C., if necessary, with aeration and stirring.
  • culture is performed by adding an appropriate amount of an antibiotic (such as ampicillin or kanamycin depending on the drug resistance marker of the plasmid) to the culture medium in order to prevent the plasmid from dropping during culture. To do.
  • an antibiotic such as ampicillin or kanamycin depending on the drug resistance marker of the plasmid
  • the expression of the gene is induced by a method commonly used for the promoter used.
  • a method commonly used for the promoter used for example, when the lac promoter or tac promoter is used, an appropriate amount of isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside (hereinafter abbreviated as IPTG), which is an expression inducer, is added in the middle of the culture.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • a purified product obtained from the culture supernatant thus obtained by using a treatment usually used for enzyme purification such as ammonium sulfate salting-out treatment, dialysis treatment, solvent treatment such as ethanol, and various chromatographic treatments alone or in combination.
  • a treatment usually used for enzyme purification such as ammonium sulfate salting-out treatment, dialysis treatment, solvent treatment such as ethanol, and various chromatographic treatments alone or in combination.
  • RNase Po1 has an isoelectric point of 8.7, so it can be transferred into cells. In addition, since there are many pairs of disulfide bonds, the thermal stability is also excellent. Furthermore, since the optimum pH is 7.5, the enzyme activity can be expressed to the maximum in the cell.
  • RNase Po1 suppresses the growth of various tumor cells at a low concentration and is useful as a therapeutic agent for malignant tumors in mammals including humans.
  • RNase Po1 is a T1 type ribonuclease, but has a particularly strong antitumor effect compared to the ribonuclease derived from Yamabushitake belonging to the same T1 type and the typical fungus-derived RNase T1.
  • the malignant tumors that are targets of the malignant tumor therapeutic agent of the present invention include blood and hematopoietic tissue tumors such as leukemia and lymphoma, and solid tumors.
  • Solid tumors include epithelial cell cancers such as skin cancer, lung cancer, colon cancer, stomach cancer, breast cancer, prostate cancer, thyroid cancer; and sarcomas such as leiomyosarcoma and osteosarcoma.
  • the medicament or pharmaceutical composition of the present invention comprises RNase Po1, excipient, binder, lubricant, disintegrant, coating agent, emulsifier, suspending agent, solvent, stabilizer, absorption aid, ointment base Add one or more pharmaceutically acceptable carriers as appropriate, and formulate it into a dosage form (pharmaceutical composition) suitable for oral administration, injection administration, rectal administration, external use, etc. by conventional methods. Obtained by.
  • Preparations for oral administration include granules, tablets, dragees, capsules, pills, liquids, emulsions, suspensions, etc .; preparations for injection administration include intravenous injection, intramuscular injection, subcutaneous injection, infusion Preparations for injection and the like; suppositories, soft capsules and the like are preferable as preparations for rectal administration.
  • the medicament of the present invention can be administered to mammals including humans as a preparation as described above.
  • the medicament of the present invention is preferably administered as 1 to 4 times of about 1 to 500 mg / kg per day as RNase Po1.
  • Reference example 1 Add 3 kg of oyster mushroom fruit body and homogenize by adding 0.01 M acetate buffer (pH 6.0). Centrifuge for 30 minutes at 10,000 rpm and use the supernatant. Add 90% saturated ammonium sulfate, centrifuge after ammonium sulfate fractionation, dissolve the precipitate in buffer, and dialyze against purified water. Gel filtration with Sephadex G50, gel filtration with Ultragel AcA54, followed by ion exchange chromatography with SP-Toyopearl 650M. Further, ion exchange chromatography using DEAE-Toyopearl 650M is performed, and gel filtration is performed by HPLC using a TSK Gel G2000SW column. RNase Po1 was obtained by the above operation.
  • Reference example 2 Purification of rRNase Po1 Escherichia coli for expression introduced with pET-pelB-Po1 (BL21 (DE3) pLys S) is inoculated into a liquid TB medium supplemented with 100 ⁇ g / mL ampicillin, and one day later, IPTG is brought to a final concentration of 0.5 mM.
  • RRNase Po1 was purified using about 2 L of culture supernatant that was added to the above and subjected to transcription induction in a dark place at 25 ° C. for 7 days while shaking at 80 rpm. The isoelectric point estimated from the cDNA sequence of rRNase Po1 was 8.7.
  • a flowchart of the purification method of rRNase Po1 is shown in FIG.
  • Example 1 Effects of RNase T1 (derived from fungi) and basidiomycete-derived T1 type RNase, RNase Po1, and Hericium erinaceum (Yamabushitake) on the growth of tumor cells using human neuroblastoma cells (IMR-32) It was investigated.
  • Cell growth inhibitory action Cells were diluted with RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal calf serum to give 5 ⁇ 10 3 cells / 100 ⁇ L or 3 ⁇ 10 5 cells / mL. RNase having a final concentration of 0 to 10 ⁇ M was added to 100 ⁇ L or 200 ⁇ L of the cell culture solution, respectively, and cultured at 37 ° C. for 72 hours under 5% CO 2 condition. The cell growth inhibition rate was calculated by MTT method.
  • Intracellular uptake Each RNase with a final concentration of 6 ⁇ M was added to 2 mL of 3 ⁇ 10 5 cell / mL cell suspension diluted with RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal calf serum, and 37 ° C. under 5% CO 2 condition. After culturing for 30 minutes, the cells were collected by centrifugation, freeze-thawed with 0.5% Triton X-100, centrifuged again, and the RNase activity of the supernatant was determined as an index.
  • RNase T1 and RNase Po1 have cell growth inhibitory effects on IMR-32 cells in a concentration-dependent manner.
  • RNase Po1 has a viable cell count of about 10% when 3 ⁇ M is added. It decreased to the following (FIG. 2).
  • the cell growth inhibitory effect of RNase Po1 on P388 cells was stronger than that of RNase He1. That is, RNase Po1 reduced the number of viable cells to about 30% by addition of 10 ⁇ M, while RNase He1 showed almost no cell growth inhibition even at 10 ⁇ M.
  • the amount of RNase incorporated into tumor cells was 0.5% for RNase Po1, 0.03% for RNase T1, and 0.01% for RNase He1.
  • Example 2 The growth inhibitory action of RNase Po1 on human leukemia HL-60 cells was examined.
  • HL-60 cells were diluted with RPMI1640 medium supplemented with 10% fetal calf serum, and 200 ⁇ L of this cell culture solution adjusted to 3 ⁇ 10 5 cells / mL was added with RNase Po1 at a final concentration of 0 to 10 ⁇ M, under 5% CO 2 conditions.
  • the cells were cultured at 37 ° C. for 72 hours, and the cell growth inhibition rate was calculated by the MTT method.
  • HL-60 cells acute promyelocytic leukemia cells

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Abstract

　本発明は、ヒラタケ由来のＴ１タイプリボヌクレアーゼを含有する悪性腫瘍治療薬に関する。

Description

悪性腫瘍治療剤
　本発明は、新たなリボヌクレアーゼを含有する悪性腫瘍治療薬に関する。
　リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）はＲＮＡを分解する酵素であり、塩基の種類を問わないリボヌクレアーゼＴ２、ピリミジン塩基のある部分だけを切断するリボヌクレアーゼＡ、グアニンの部分のみを分解するリボヌクレアーゼＴ１などが挙げられる。
　リボヌクレアーゼの中で、リボヌクレアーゼＡに属するウシガエル由来のリボヌクレアーゼやウシ膵臓由来のリボヌクレアーゼに抗腫瘍活性があることは知られている（特許文献１、２及び非特許文献１）。また、抗腫瘍活性を有するα－サルシンはＲＮａｓｅ　Ｔ１に近い構造を有しているが、Ｔ１タイプのＲＮａｓｅではない。
特表２００２－５３２０６７号公報 特表２００７－５３０００２号公報
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２００２，Ｊａｎ　１：２０（１）：２７４－２８１
　本発明の課題は、さらに新たなリボヌクレアーゼを含有する抗悪性腫瘍治療薬を提供することにある。
　そこで本発明者は、Ｔ１タイプのリボヌクレアーゼに着目して種々検討してきたところ、ヒラタケ由来のＴ１タイプリボヌクレアーゼは、同じＴ１タイプのリボヌクレアーゼであるヤマブシタケ由来のリボヌクレアーゼ等に比べて特に強い腫瘍細胞増殖抑制作用を有し、Ｔ１タイプのリボヌクレアーゼの中でも特に悪性腫瘍治療薬として有用であることを見出し、本発明を完成した。
　本発明は、ヒラタケ由来のＴ１タイプリボヌクレアーゼを含有する悪性腫瘍治療薬を提供するものである。
　また、本発明は、ヒラタケ由来のＴ１タイプリボヌクレアーゼ、及び薬学的に許容される担体を含有する悪性腫瘍治療用医薬組成物を提供するものである。
　また、本発明は、ヒラタケ由来のＴ１タイプリボヌクレアーゼの、悪性腫瘍治療薬製造のための使用を提供するものである。
　さらに、本発明は、ヒラタケ由来のＴ１タイプリボヌクレアーゼの有効量を投与することを特徴とする、悪性腫瘍治療方法を提供するものである。
　本発明の悪性腫瘍治療剤は、優れた腫瘍細胞増殖抑制作用を有し、中性付近で安定で、かつ熱安定性も高いので、医薬品としての応用が容易である。
ｒＲＮａｓｅ　Ｐｏ１の精製工程を示す図である。 ＩＭＲ－３２細胞に対する各種ＲＮａｓｅの増殖抑制作用を示す図である。 ＲＮａｓｅ　Ｐｏ１のＩＭＲ－３２細胞及びＨＬ－６０細胞の生育に対する作用を示す図である。 ＲＮａｓｅ　Ｐｏ１のＨＬ－６０細胞の生育に対する作用を示す図である。
　本発明の悪性腫瘍治療剤の有効成分は、ヒラタケ由来のＴ１タイプリボヌクレアーゼ（以下、ＲＮａｓｅ　Ｐｏ１と略することもある）である。ヒラタケは、ヒラタケ科ヒラタケ属に属する食用キノコであり、このうちＰｌｅｕｒｏｔｕｓ　ｏｓｔｒｅａｔｕｓが特に好ましい。本発明で用いるＴ１タイプリボヌクレアーゼは、ヒラタケ子実体から抽出することもできるが、遺伝子組換え法により大腸菌等の微生物の形質転換体から抽出することもできる。
　ＲＮａｓｅ　Ｐｏ１には、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、及び配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつリボヌクレアーゼ活性を有するタンパク質が含まれる。ここで、配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列としては、配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するもの、特に９５％以上の同一性を有するものが好ましい。
　ヒラタケ子実体からＲＮａｓｅ　Ｐｏ１を抽出するには、例えばヒラタケ子実体を細切又は粉砕し、酢酸ナトリウム水溶液を加えてホモジナイズし、遠心分離により固形物を除去する。次いでこの上清から硫安分画によりタンパク画分を得、ゲル濾過、イオン交換クロマト等により分画することにより得ることができる（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１６，２６－３３（１９９４））。
　一方、遺伝子組換え法によるＲＮａｓｅ　Ｐｏ１の採取法については、例えば第５１回日本薬学会関東支部大会（２００７年１０月１６日）講演要旨集Ｊ１２記載の方法を用いることができる。まず遺伝子のクローニングをし、クローニングしたＤＮＡ断片を用いた発現ベクターの調製、発現ベクターを用いたＲＮａｓｅ　Ｐｏ１の調製を行うが、これらの操作は周知の技術であり、具体的には、例えば「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ」（Ｍａｎｉａｔｉｓら編、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８２））に記載の方法に従って行うことができる。
　例えば、ヒラタケの子実体から精製したＲＮａｓｅ　Ｐｏ１のＮ－末端、Ｃ－末端などのアミノ酸配列の一部を既知の方法で決定し、それに相当するオリゴヌクレオチドを合成する。合成したオリゴヌクレオチドをプローブとしてヒラタケのトータルＲＮＡを抽出後、逆転写酵素反応で得たｃＤＮＡ断片をクローニングすればよい。
　クローン化に用いる宿主は特に限定されないが、操作性及び簡便性から大腸菌を宿主とするのが適当である。
　クローン化した遺伝子の高発現系を構築するためには、たとえばマキザム－ギルバートの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５，４９９（１９８０））もしくはダイデオキシチェーンターミネーター法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１０１，２０（１９８３））などを応用してクローン化したＤＮＡ断片の塩基配列を解析して当該遺伝子のコーディング領域を特定し、宿主微生物に応じて当該遺伝子が微生物菌体中で発現可能となるように発現制御シグナル（転写開始及び翻訳開始シグナル）をその上流に連結した組換え発現ベクターを作製する。
　ＲＮａｓｅ　Ｐｏ１を異種微生物内で大量に産生させるために使用する発現制御シグナルとしては、人為的制御が可能で、ＲＮａｓｅ　Ｐｏ１の生産量を上昇させるような強力な転写開始並びに翻訳開始シグナルを用いることが望ましい。このような転写開始シグナルとしては、宿主として大腸菌を用いる場合には、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８０，２１（１９８３）、Ｇｅｎｅ，２０，２３１（１９８２））、ｔｒｃプロモーター（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０，３５３９（１９８５））などを例示することができる。
　ベクターとしては、種々のプラスミドベクター、ファージベクターなどが使用可能であるが、微生物菌体内で複製可能であり、適当な薬剤耐性マーカーと特定の制限酵素切断部位を有し、菌体内のコピー数の高いプラスミドベクターを使用するのが望ましい。具体的に大腸菌を宿主とする場合には、ｐＢＲ３２２（Ｇｅｎｅ，２，９５（１９７５））、ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１９（Ｇｅｎｅ、３３，１０３（１９８５））などを例示することができる。作製した組換えベクターを用いて微生物を形質転換する。宿主となる微生物としては安全性が高く取扱いやすいものであれば特に限定されない。例えば、大腸菌、酵母などＤＮＡ組換え操作に常用されている微生物を使用することができる。その中でも、大腸菌が有利であり、例えば組換えＤＮＡ実験に使用されるＢＬ２１株、Ｋ１２株、Ｃ６００菌、ＪＭ１０５菌、ＪＭ１０９菌（Ｇｅｎｅ，３３，１０３－１１９（１９８５））などが使用可能である。
　微生物を形質転換する方法はすでに多くの方法が報告されており、宿主として使用する微生物に応じて適宜選択すればよい。例えば大腸菌を宿主として使用する場合、低温下、塩化カルシウム処理して菌体内にプラスミドを導入する方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３，１５９（１９７０））により大腸菌を形質転換することができる。
　得られた形質転換体は、当該微生物が増殖可能な培地中で増殖させ、さらにクローン化したＲＮａｓｅ　Ｐｏ１遺伝子の発現を誘導して菌体内又は菌体外に当該酵素が大量に蓄積するまで培養を行う。形質転換体の培養は、炭素源、窒素源などの当該微生物の増殖に必要な栄養源を含有する培地を用いて常法に従って行えばよい。例えば、大腸菌を宿主として使用する場合、培地として２ｘＹＴ培地（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１００，２０（１９８３））、ＬＢ培地、Ｍ９ＣＡ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、前述）などの大腸菌の培養に常用されている培地を用い、２０～４０℃の培養温度で必要により通気攪拌しながら培養することができる。また、ベクターとしてプラスミドを用いた場合には、培養中におけるプラスミドの脱落を防ぐために適当な抗生物質（プラスミドの薬剤耐性マーカーに応じ、アンピシリン、カナマイシンなど）の薬剤を適当量培養液に加えて培養する。
　培養中にＲＮａｓｅ　Ｐｏ１遺伝子の発現を誘導する必要がある場合には、用いたプロモーターで常用されている方法で当該遺伝子の発現を誘導する。例えば、ｌａｃプロモーターやｔａｃプロモーターを使用した場合には、培養中期に発現誘導剤であるイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（以下、ＩＰＴＧと略称する）を適当量添加する。
　こうして得られた培養上清から硫安塩析処理、透析処理、エタノールなどの溶媒処理、各種クロマトグラフィー処理などの酵素精製に通常使用されている処理を単独で、又は数種組み合わせて得られる精製物をＲＮａｓｅ　Ｐｏ１として利用することができる。
　ＲＮａｓｅ　Ｐｏ１の等電点は８．７であり細胞内への移行がよい。また、ジスルフィド結合が１組多いことから熱安定性にも優れている。さらに、至適ｐＨが７．５であることから細胞内で酵素活性を最大限に発現できる。
　ＲＮａｓｅ　Ｐｏ１は、種々の腫瘍細胞の増殖を低濃度で抑制し、ヒトを含む哺乳類における悪性腫瘍治療薬として有用である。ＲＮａｓｅ　Ｐｏ１はＴ１タイプのリボヌクレアーゼであるが、同じＴ１タイプに属するヤマブシタケ由来のリボヌクレアーゼや、典型的な真菌由来ＲＮａｓｅ　Ｔ１に比べて特に強い抗腫瘍作用を有する。
　本発明の悪性腫瘍治療薬の対象となる悪性腫瘍には、白血病、リンパ腫などの血液や造血組織の腫瘍及び固形腫瘍が含まれる。固形腫瘍としては、皮膚癌、肺癌、大腸癌、胃癌、乳癌、前立腺癌、甲状腺癌などの上皮細胞癌；及び平滑筋肉腫、骨肉腫などの肉腫が挙げられる。
　本発明の医薬又は医薬組成物は、ＲＮａｓｅ　Ｐｏ１に、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、被覆剤、乳化剤、懸濁化剤、溶剤、安定化剤、吸収補助剤、軟膏基剤等の１以上の薬学的に許容される担体を適宜添加し、常法により経口投与用、注射投与用、直腸内投与用、外用などに適する剤形（医薬組成物）に製剤化することによって得られる。
　経口投与用の製剤としては、顆粒、錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤、液剤、乳剤、懸濁剤等が；注射投与用の製剤としては、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、点滴注射用の製剤などが；直腸内投与用の製剤としては、坐薬、軟カプセル等が好ましい。
　本発明の医薬は上記の如き製剤として、ヒトを含む哺乳動物に投与することができる。
　本発明の医薬は、ＲＮａｓｅ　Ｐｏ１として、１日当り約１～５００ｍｇ／ｋｇを１～４回投与するのが好ましい。
　次に実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
参考例１
　ヒラタケ子実体３ｋｇをきざみ、０．０１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を加えてホモジナイズする。１万ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上清を用いる。９０％飽和硫安を加え、硫安分画後遠心分離し沈殿を緩衝液に溶解し、精製水に対して透析する。Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ５０によるゲル濾過、Ｕｌｔｒｏｇｅｌ　ＡｃＡ５４によるゲル濾過、次いでＳＰ－Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ　６５０Ｍによるイオン交換クロマトを行う。さらにＤＥＡＥ－Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ　６５０Ｍによるイオン交換クロマトを行い、ＴＳＫ　Ｇｅｌ　Ｇ２０００ＳＷカラムを用いたＨＰＬＣによるゲル濾過を行う。以上の操作によりＲＮａｓｅ　Ｐｏ１を得た。
参考例２
（ｒＲＮａｓｅ　Ｐｏ１の精製）
　ｐＥＴ－ｐｅｌＢ－Ｐｏ１を導入した発現用大腸菌（ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓ　Ｓ）を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを添加した液体ＴＢ培地に植菌し、１日後にＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭとなるように添加し、転写誘導をかけたものを２５℃の暗所で７日間、８０ｒｐｍで振とう培養した培養上清約２Ｌを出発原料としてｒＲＮａｓｅ　Ｐｏ１の精製を行った。なお、ｒＲＮａｓｅ　Ｐｏ１のｃＤＮＡ配列より推測した等電点は８．７であった。
　ｒＲＮａｓｅ　Ｐｏ１の精製法のフローチャートを図１に示した。
実施例１
　ＲＮａｓｅ　Ｔ１（真菌由来）及び担子菌由来の２種のＴ１タイプＲＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ　Ｐｏ１、Ｈｅｒｉｃｉｕｍ　ｅｒｉｎａｃｅｕｍ（ヤマブシタケ）のＲＮａｓｅ　Ｈｅ１について、ヒト神経芽腫細胞（ＩＭＲ－３２）を用いて腫瘍細胞の生育に対する影響を検討した。
（方法）
　細胞生育阻害作用：細胞を１０％牛胎仔血清を加えたＲＰＭＩ　１６４０培地で希釈し、５×１０3ｃｅｌｌ／１００μＬ又は３×１０5ｃｅｌｌ／ｍＬとした。この細胞培養液１００μＬ又は２００μＬに終濃度０～１０μＭのＲＮａｓｅをそれぞれ加え、５％ＣＯ2条件下、３７℃、７２時間培養し、ＭＴＴ法により細胞生育阻害率を算出した。
　細胞内取り込み量：１０％牛胎仔血清を加えたＲＰＭＩ　１６４０培地で希釈した３×１０5ｃｅｌｌ／ｍＬの細胞懸濁液２ｍＬに終濃度６μＭの各ＲＮａｓｅを加え、５％ＣＯ2条件下３７℃、３０分培養後、遠心して細胞を回収し、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００を加えて凍結融解し、再度遠心分離し、上清のＲＮａｓｅ活性を指標として求めた。
（結果）
　ヒト神経芽腫細胞の中では、ＩＭＲ－３２細胞において、ＲＮａｓｅ　Ｔ１、ＲＮａｓｅ　Ｐｏ１とも濃度依存的に細胞生育阻害作用を示し、特にＲＮａｓｅ　Ｐｏ１は、３μＭの添加により、生存細胞数は、約１０％以下にまで低下した（図２）。また、Ｐ３８８細胞に対するＲＮａｓｅ　Ｐｏ１の細胞生育阻害作用は、ＲＮａｓｅ　Ｈｅ１よりも強力であった。すなわち、ＲＮａｓｅ　Ｐｏ１は、１０μＭの添加により、生存細胞数を約３０％にまで低下させたのに対し、ＲＮａｓｅ　Ｈｅ１は１０μＭ添加でもほとんど細胞生育阻害を示さなかった。
　また、腫瘍細胞（Ｐ－３８８）内へのＲＮａｓｅの取り込み量は、ＲＮａｓｅ　Ｐｏ１は０．５％、ＲＮａｓｅ　Ｔ１は０．０３％、ＲＮａｓｅ　Ｈｅ１は０．０１％であった。
実施例２
　ＲＮａｓｅ　Ｐｏ１　のヒト白血病ＨＬ－６０細胞に対する生育阻害作用を検討した。
（方法）
　ＨＬ－６０細胞を１０％ウシ胎仔血清を加えたＲＰＭＩ１６４０培地で希釈し、３×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬとしたこの細胞培養液２００μＬに終濃度０～１０μＭのＲＮａｓｅ　Ｐｏ１を加え、５％ＣＯ２条件下、３７℃、７２時間培養し、ＭＴＴ法により細胞生育阻害率を算出した。
　神経芽腫の１つであるＩＭＲ－３２細胞に対する作用も併せて検討した。
　ＨＬ－６０細胞（急性前骨髄性白血病細胞）はヒューマンサイエンス振興財団より分譲された。
（結果）
　ヒト白血病ＨＬ－６０細胞にＲＮａｓｅＰｏ１を作用させたところ、最終濃度１×１０－８Ｍの添加により、生存細胞が約１０％まで減少した。同濃度の神経芽腫ＩＭＲ－３２細胞での生存細胞数が約３０％であったことから、ＲＮａｓｅ　Ｐｏ１は、ＨＬ－６０細胞に対し、ＩＭＲ－３２細胞に対する場合よりも約３倍高い生育阻害作用を有することが明らかになった（図３、図４）。

Claims (8)

  1. 　ヒラタケ由来のＴ１タイプリボヌクレアーゼを含有する悪性腫瘍治療薬。
  2. 　ヒラタケ由来のＴ１タイプリボヌクレアーゼが、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、又は配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつリボヌクレアーゼ活性を有するタンパク質である請求項１記載の悪性腫瘍治療薬。
  3. 　ヒラタケ由来のＴ１タイプリボヌクレアーゼ、及び薬学的に許容される担体を含有する悪性腫瘍治療用医薬組成物。
  4. 　ヒラタケ由来のＴ１タイプリボヌクレアーゼが、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、又は配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつリボヌクレアーゼ活性を有するタンパク質である請求項３記載の医薬組成物。
  5. 　ヒラタケ由来のＴ１タイプリボヌクレアーゼの、悪性腫瘍治療薬製造のための使用。
  6. 　ヒラタケ由来のＴ１タイプリボヌクレアーゼが、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、又は配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつリボヌクレアーゼ活性を有するタンパク質である請求項５記載の使用。
  7. 　ヒラタケ由来のＴ１タイプリボヌクレアーゼの有効量を投与することを特徴とする悪性腫瘍治療方法。
  8. 　ヒラタケ由来のＴ１タイプリボヌクレアーゼが、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、又は配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつリボヌクレアーゼ活性を有するタンパク質である請求項７記載の治療方法。
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Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"129th Annual Meeting of Pharmaceutical Society of Japan Kyoto 2009 Yoshishu 3, 05 March 2009 (05.03.2009)", article YURI KOBAYASHI ET AL.: "Kinoko Yurai Tl Type RNase no Mouse Hakketsubyo Saibo ni Taisuru Seiiku Sogai Sayo", pages: 115 *
ARNOLD, U. ET AL.: "Natural and engineered ribonucleases as potential cancer therapeutics", BIOTECHNOL LETT, vol. 28, no. 20, 2006, pages 1615 - 22 *
DATABASE GENBANK [online] 22 March 2008 (2008-03-22), KAWASUMI, K. ET AL.: "Pleurotus ostreatus RNPo1 mRNA for ribonuclease Tl, partial cds., GenBank", retrieved from http://www. ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/171362782 Database accession no. AB429298.1 *
MAKAROV, A.A. ET AL.: "Binase and other microbial RNases as potential anticancer agents", BIOESSAYS, vol. 30, no. 8, 2008, pages 781 - 90 *
SURI, S. ET AL.: "RNase: a novel enzyme for treatment of cancers", INTERNET JOURNAL OF ONCOLOGY, vol. 5, no. 1, 2008, Retrieved from the Internet <URL:http://www.ispub.com/ostia/index.php?xmlFilePath=journals/ijo/vol5nl/rnase.xml> [retrieved on 20100304] *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106860790A (zh) * 2017-03-22 2017-06-20 郑百战 一种治疗肺癌的中药制剂

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