WO2010095270A1 - 抗ヒトα９インテグリン抗体とその用途 - Google Patents

抗ヒトα９インテグリン抗体とその用途 Download PDF

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WO2010095270A1
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human
integrin
antibody
amino acid
integrin antibody
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重之 今
利光 上出
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株式会社ジーンテクノサイエンス
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    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
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    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70546—Integrin superfamily, e.g. VLAs, leuCAM, GPIIb/GPIIIa, LPAM

Definitions

  • the present invention relates to an anti-human ⁇ 9 integrin antibody and its use. More specifically, the present invention relates to a monoclonal antibody, a chimeric antibody, a humanized antibody and a human antibody that specifically recognize human ⁇ 9 integrin, a hybridoma cell that produces the monoclonal antibody, a method for producing the monoclonal antibody, and the hybridoma.
  • the present invention relates to a method for producing cells, a therapeutic agent containing the anti-human ⁇ 9 integrin antibody, a diagnostic agent containing the human ⁇ 9 integrin antibody, a screening method for compounds that inhibit the activity of human ⁇ 9 integrin, and the like.
  • integrin is composed of a 1: 1 heterodimer of ⁇ and ⁇ chains. To date, 18 types of ⁇ chains and 8 types of ⁇ chains have been discovered, and at least 24 types of these combinations have been identified and confirmed. . Each integrin is known to recognize a specific extracellular matrix (ligand).
  • ligand extracellular matrix
  • the role of transmembrane cell adhesion proteins including integrins is not only the adhesion and fixation of cells and extracellular matrix, but also converts information from extracellular matrix into intracellular signals, cell proliferation, movement, cell death, It has been elucidated that it plays a role in the regulation of differentiation.
  • Integrins are classified into subfamilies based on their specificity and function for ligands.
  • RGD receptors that recognize Arg-Gly-Asp (RGD) sequences contained in collagen receptors, laminin receptors, fibronectin, vitronectin, etc., only on leukocytes
  • ⁇ 4 integrin and ⁇ 9 integrin are subfamilies that do not belong to any of these, and are called ⁇ 4 integrin subfamily.
  • osteopontin As ligands that bind to ⁇ 4 and ⁇ 9 integrin, osteopontin (hereinafter abbreviated as OPN), EDA site of fibronectin, propeptide-von Willebrand factoc (pp-vWF), tissue type transglutaminase (tTG), The XIII blood coagulation factor and Vascular Ce11 Adhesion Molecule-1 (VCAM-1) are known. Further, as a ligand specifically recognized by ⁇ 4 integrin, CS-1 domain of fibronectin, MadCAM-1 ( ⁇ 4 ⁇ 7) and the like are known. On the other hand, tenascin C, plasmin and the like are known as ligands specifically recognized by ⁇ 9 integrin.
  • OPN which is a kind of extracellular matrix (ECM)
  • ECM extracellular matrix
  • amino acid sequences of the ⁇ 4 and ⁇ 9 integrin and ⁇ 1 integrin subunits are known and registered in GenBank. These integrins are known to have high amino acid sequence similarity between species.
  • WO 02/081522 discloses therapeutic effects on rheumatoid arthritis and hepatitis by suppressing OPN function using neutralizing antibodies against OPN-deficient mice and OPN.
  • this publication discloses that the SVVYGLR sequence, which is a recognition sequence for ⁇ 4 integrin and ⁇ 9 integrin, is important for the onset of inflammatory diseases, and receptors for OPN are expressed in immunocompetent cells and the like. It is disclosed that WO02 / 081522
  • Hybridoma cells (1K11, 21C5, 24I11, 25B6, and 28S1) were produced (FERM BP-10510, FERM BP-10511, FERM BP-10512, FERM BP-10513, and FERM BP-, respectively).
  • the present invention provides the following anti-human ⁇ 9 integrin antibody, its monoclonal antibody, its production cell, a therapeutic agent containing the antibody, a screening method for a compound that inhibits ⁇ 9 integrin activity, and the like.
  • An anti-human ⁇ 9 integrin antibody comprising any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 12.
  • An anti-human ⁇ 9 integrin antibody containing the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, and 12. (6) The amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 6 as the amino acid sequence in the heavy chain complementarity determining region (CDRH), and the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 7 to 12 as the amino acid sequence in the light chain complementarity determining region (CDRL). An anti-human ⁇ 9 integrin antibody containing any amino acid sequence. (7) The anti-human ⁇ 9 integrin antibody according to any one of the above (1) to (6), which inhibits binding between human ⁇ 9 integrin and a ligand of ⁇ 9 integrin.
  • a therapeutic agent for cancer, inflammatory disease, infectious disease, autoimmune disease or bone disease comprising the anti-human ⁇ 9 integrin antibody according to any one of (1) to (12) as an active ingredient.
  • Cancer, inflammatory disease, infectious disease, autoimmune disease or bone containing both the anti-human ⁇ 9 integrin antibody and anti-human ⁇ 4 integrin antibody according to any of (1) to (12) as active ingredients Therapeutic agent for diseases.
  • the present invention provides a novel anti- ⁇ integrin antibody.
  • the anti- ⁇ 9 integrin antibody of the present invention exhibits an excellent ⁇ 9 integrin function inhibitory action, and includes cancer (eg, proliferation and metastasis of cancer cells), inflammatory diseases (eg, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, hepatitis, bronchial asthma, Cotton fibrosis, diabetes, arteriosclerosis, multiple sclerosis, inflammatory bowel disease (ulcerative colitis, Crohn's disease, etc.), infection (eg, hepatitis), autoimmune disease (eg, systemic lupus erythematosus, multiple It has therapeutic effects on myositis, autoimmune thyroid disease, tubulointerstitial nephritis, myasthenia gravis) and bone disease (for example, osteoporosis).
  • cancer eg, proliferation and metastasis of cancer cells
  • inflammatory diseases eg, rheumatoid arthritis,
  • the pharmaceutical composition containing both the anti- ⁇ 9 integrin antibody and the anti- ⁇ 4 integrin antibody of the present invention has further improved therapeutic effects on cancer, inflammatory diseases and the like. Since the antibody of the present invention can detect the expression of ⁇ 9 integrin in cells and tissues pathologically, it can also be used as a diagnostic agent.
  • Tysabri (natalizumab), an antibody against ⁇ 4 integrin, was launched in November 2004 as a treatment for multiple sclerosis by Biogen Idec Inc. (Massachusetts, USA) and Elan Corporation (Ireland). Approved by the US Food and Drug Administration (FDA). Tysabri (registered trademark) has been clinically developed for diseases such as Crohn's disease and rheumatoid arthritis. An anti-human ⁇ 4 ⁇ 1 integrin monoclonal antibody called P4C2 is used at the laboratory level.
  • an antibody against ⁇ 9 integrin is a monoclonal antibody called Y9A2, which shows specificity for human and guinea pig ⁇ 9 integrin (A. Wang et al, (1996) Am. J. Respir., Ce11 Mol. Biol. 15, 664- 672) is provided for experimental use but is not used clinically.
  • the present invention provides monoclonal antibodies against human ⁇ 9 integrin.
  • the “antibody” refers to an entire antibody molecule or a fragment thereof that specifically binds to an antigen ⁇ 9 integrin or a partial peptide thereof (eg, a fragment such as Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 ) which may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • it means a monoclonal antibody.
  • “antibody” includes chimeric antibodies, humanized antibodies, and human antibodies.
  • an antibody “specifically binds" to a certain protein or fragment thereof means that the antibody is directed against a specific amino acid sequence of these proteins or fragments thereof, rather than its affinity for other amino acid sequences. Binding with substantially high affinity.
  • substantially high affinity means high affinity that allows the specific amino acid sequence to be detected separately from other amino acid sequences by a desired measuring apparatus or method.
  • the coupling constant (K a ) is at least 10 7 M ⁇ 1 , preferably at least 10 8 M ⁇ 1 , more preferably 10 9 M ⁇ 1 , even more preferably 10 10 M ⁇ 1 , It means a binding affinity such as 10 11 M ⁇ 1 , 10 12 M ⁇ 1 or higher, for example up to 10 13 M ⁇ 1 or higher.
  • the “monoclonal antibody” refers to one that is highly specific for an antigen and recognizes a single antigen.
  • antibody fragment refers to a part of a full-length antibody, and is an antigen-binding region or a variable region.
  • antibody fragments include Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , and Fv fragments. These antibody fragments can be prepared by generally known methods such as papain digestion and pepsin digestion of antibodies.
  • chimeric antibody is a human / mouse chimeric antibody obtained by genetically modifying the constant region of the anti-human ⁇ 9 integrin antibody obtained in the present invention so as to have the same constant region as that of a human antibody (European Patent Publication) Gazette EP0125023).
  • “Humanized antibody” means that the primary structure of the anti-human ⁇ 9 integrin antibody obtained in the present invention other than the complementary recognition region (CDR) of the H chain and L chain is genetically engineered to a primary structure corresponding to a human antibody. Refers to a modified antibody.
  • Human antibody means a monoclonal antibody (see European Patent Publication EP0546073) prepared using a transgenic animal into which a gene involved in human antibody production has been introduced.
  • the present invention first provides an anti-human ⁇ 9 integrin antibody different from the anti-human ⁇ 9 integrin antibody produced so far.
  • An antibody according to a preferred embodiment of the invention contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, or 11.
  • Further preferred antibodies include 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, or 6 amino acid sequences selected from the group consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, and 11.
  • Anti-human ⁇ 9 integrin antibody is provided.
  • an antibody according to another aspect of the present invention contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, or 12.
  • Further preferred antibodies are 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, or 6 amino acid sequences selected from the group consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, and 12.
  • Anti-human ⁇ 9 integrin antibody is provided.
  • a particularly preferred antibody in the present invention is an anti-human ⁇ 9 integrin antibody produced by a hybridoma cell indicated by accession number FERM BP-10830 or FERM BP-10831.
  • the ⁇ 9 integrin used as an antigen in the present invention is (1) a protein derived from any cell expressing human or other mammalian ⁇ 9 integrin, or any tissue in which those cells exist, and (2) encoding ⁇ 9 integrin. It may be a recombinant protein in which a genetic DNA, preferably cDNA, is introduced and expressed in a cell line such as a bacterium, yeast or animal cell, or (3) a synthetic protein.
  • the ⁇ 9 integrin of the present invention also includes polypeptides having substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence of ⁇ 9 integrin of various mammals, particularly preferably the amino acid sequence of human ⁇ 9 integrin (SEQ ID NO: 13).
  • polypeptide having substantially the same amino acid sequence means that a natural ⁇ 9 integrin, particularly preferably a human-derived ⁇ 9 integrin, has a biological property substantially equivalent to that in the amino acid sequence.
  • a plurality of amino acids preferably 1 to 10 amino acids, particularly preferably 1 to several (eg, 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2) amino acids are substituted.
  • a plurality of amino acids preferably 1 to 10 Mutation having an amino acid sequence to which one amino acid, particularly preferably 1 to several (for example, 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2) amino acids are added It means Ripepuchido. Further, it may be a mutant polypeptide having a plurality of such substitutions, deletions, modifications, and additions.
  • the ⁇ 9 integrin of the present invention can be obtained by appropriately using a method known in the art such as a chemical synthesis method, a cell culture method, or a modification method thereof, in addition to a gene recombination technique. Can be manufactured.
  • a method for producing a mutant polypeptide for example, a synthetic oligonucleotide site mutation introduction method (gapped duplex method), a method of randomly introducing point mutations by nitrite or sulfite treatment, a deletion mutation by Ba131 enzyme, etc.
  • a method for preparing a body for example, a cassette mutation method, a linker scanning method, a misincorporation method, a mismatch primer method, a DNA segment synthesis method, and the like.
  • the ⁇ 9 integrin of the present invention also includes “a part” of the ⁇ 9 integrin.
  • the “part” refers to a part including a region necessary for binding to an ⁇ 9 integrin ligand such as OPN, tenascin C, VCAM-1.
  • the “part” of the ⁇ 9 integrin can be produced by a gene recombination technique or a chemical synthesis method according to a method known in the technical field described later or a modification method thereof, or has been isolated by a cell culture method. It can be produced by appropriately cleaving ⁇ 9 integrin, particularly preferably human-derived ⁇ 9 integrin, with a proteolytic enzyme or the like.
  • the cell itself overexpressing ⁇ 9 integrin on the cell membrane by a recombinant technique, or a membrane fraction thereof can be used.
  • the ⁇ 9 integrin of the present invention includes a polypeptide having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence of human ⁇ 9 integrin (SEQ ID NO: 13).
  • a cell itself that overexpresses human ⁇ 9 integrin on a cell membrane by a recombinant technique is preferably used. Therefore, a gene encoding human ⁇ 9 integrin (for example, cDNA) as described later is cloned using a known genetic engineering technique, and the cell itself overexpressing human ⁇ 9 integrin on the cell membrane, or a cell membrane fraction thereof, is cloned. It may be prepared as an antigen.
  • the antigen is administered to the animal to be immunized per se, together with a carrier or diluent, at a site where antibody production is possible by administration.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production ability upon administration.
  • the administration is usually performed once every 1 to 6 weeks, about 2 to 10 times in total.
  • Examples of the warm-blooded animal to be used include mice, monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, rats, hamsters, sheep, goats, chickens and the like. In the present invention, mice are preferably used.
  • the subject of treatment is a human and the ⁇ 9 integrin-inhibiting antibody-producing animal is a mouse
  • myeloma cell a cell derived from mouse, rat, human or the like is used. Examples include mouse myeloma P3U1, P3X63-Ag8, P3X63-Ag8-U1, P3NS1-Ag4, SP2 / 0-Ag14, and P3X63-Ag8-653.
  • Antibody-producing cells and myeloma cells are the same species, particularly the same strain. It is preferably derived from an animal.
  • Myeloma cells can be stored frozen or passaged and maintained in a common medium supplemented with horse, rabbit or fetal calf serum. For cell fusion, cells in the logarithmic growth phase are preferably used.
  • P3X63-Ag8-653 is preferably used.
  • Examples of methods for forming hybridomas by fusing antibody-producing cells and myeloma cells include a method using polyethylene glycol (PEG), a method using Sendai virus, and a method using an electrofusion device.
  • PEG polyethylene glycol
  • spleen cells and myeloma cells are placed in an appropriate medium or buffer containing about 30 to 60% PEG (average molecular weight 1000 to 6000) at 1 to 10: 1, preferably 5 to 10: 1.
  • the suspension may be suspended at a mixing ratio and allowed to react for about 30 seconds to 3 minutes under conditions of a temperature of about 25 to 37 ° C. and a pH of 6 to 8. After completion of the reaction, the PEG solution is removed and the suspension is resuspended in a culture medium and seeded in a cell well plate to continue the culture.
  • selection of hybridoma cells Selection of hybridoma cells producing a monoclonal antibody can be performed according to a known or similar method. Usually, it can be performed in a medium for animal cells supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine).
  • HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • any medium can be used as long as it can grow hybridoma cells.
  • RPMI 1640 medium containing 1-20%, preferably 10-20% fetal bovine serum, GIT medium (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) containing 1-10% fetal bovine serum, or serum-free for hybridoma culture A medium (SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) or the like can be used.
  • the culture temperature is usually 20 to 40 ° C., preferably about 37 ° C.
  • the culture time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks. Culturing can usually be performed under
  • the production of the monoclonal antibody of the present invention can be confirmed and screened by using the cell ELISA method described in New Clinical Immunization Experimental Procedure (part 3), Scientific Review, 1997.
  • cells used for immunization are expected to have a high background and a large number of false positives when used for screening, they react with human ⁇ 9 integrin that is overexpressed in cells other than those used for immunization, A clone that does not react with cells overexpressing human ⁇ 4 integrin can be used as an anti-human ⁇ 9 integrin antibody.
  • Monoclonal antibodies can be prepared from such clones by repeating the limiting dilution method 1 to 5 times, preferably 2 to 4 times.
  • the obtained antibody can be purified to homogeneity.
  • separation and purification methods used for ordinary proteins may be used.
  • antibodies can be separated and purified by appropriately selecting and combining chromatography columns such as affinity chromatography, filters, ultrafiltration, salting out, dialysis, SDS polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing etc. (Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988), but is not limited thereto.
  • columns used for affinity chromatography include a protein A column and a protein G column.
  • Hyper D, POROS, Sepharose FF (Amersham Biosciences) etc. are mentioned as a column using a protein A column.
  • the obtained antibody can be variously labeled using a known method or a commercially available kit (for example, biotin label, FITC label, APC label).
  • biotin labeling using Biotin Labeling Kit (Dojindo Laboratories) is preferably used.
  • the monoclonal antibody thus obtained can be purified as necessary and then formulated according to a conventional method, and used as a preventive and / or therapeutic agent for cancer, inflammatory diseases, infectious diseases, autoimmune diseases, bone diseases and the like. it can.
  • These dosage forms as prophylactic and / or therapeutic agents can be parenteral preparations such as injections and infusions, and can be used as oral preparations by ingenuity.
  • carriers, diluents, or additives suitable for the dosage form can be used within the pharmacologically and pharmaceutically acceptable range.
  • integrins The role of integrins is not only the adhesion and fixation of cells and extracellular matrix (ECM), but also converts information from the extracellular matrix into intracellular signals and regulates cell proliferation, movement, cell death, differentiation, etc. It has been elucidated. Therefore, the obtained monoclonal antibody can block the intracellular signal transmission of information from the ECM by inhibiting the binding between the ECM and ⁇ 9 integrin, so that it is possible to treat a disease involving ECM.
  • ECM that binds to ⁇ 9 integrin, and OPN, fibronectin, propeptide-von Willebrand facco (pp-vWF), tissue type transglutaminase (tTG), XIII blood coagulation factor, Vascular Ce11 Adhesion Molecule-1 (VCAM-1), tenascin C, plasmin and the like are known.
  • OPN fibronectin
  • tTG tissue type transglutaminase
  • tTG tissue type transglutaminase
  • XIII blood coagulation factor XIII blood coagulation factor
  • VCAM-1 Vascular Ce11 Adhesion Molecule-1
  • tenascin C plasmin and the like
  • Preparations comprising the antibody of the present invention (particularly, monoclonal antibody) as an active ingredient are cancer (eg, proliferation and metastasis of cancer cells), inflammatory diseases (eg, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, hepatitis, bronchial asthma, cotton fibrosis) , Diabetes, arteriosclerosis, multiple sclerosis, inflammatory bowel disease (ulcerative colitis, Crohn's disease)), infection (eg hepatitis), autoimmune disease (eg systemic lupus erythematosus, polymyositis, autoimmune thyroid) It can be used as a therapeutic agent or prophylactic agent for diseases, tubulointerstitial nephritis, myasthenia gravis) and bone diseases (eg osteoporosis).
  • cancer eg, proliferation and metastasis of cancer cells
  • inflammatory diseases eg, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, hepatitis, bronchi
  • the dose varies depending on the administration subject, target disease, symptom, administration route, etc.
  • the antibody of the present invention is usually used as a single dose.
  • the dose or the number of administrations may be increased according to the symptoms.
  • the antibody of the present invention can be administered per se or as an appropriate pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition used for the administration comprises the antibody or a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient.
  • Such compositions are provided as parenteral or oral dosage forms.
  • injections for example, injections, nasal drops, suppositories and the like are used, and injections are intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, infusions, and the like. Includes dosage forms such as injections.
  • Such an injection is prepared according to a known method, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the above antibody in a sterile aqueous or oily liquid usually used for injection.
  • aqueous solution for injection for example, isotonic solution containing physiological saline, glucose, sucrose, mannitol, and other adjuvants is used, and a suitable solubilizer such as alcohol (eg, ethanol), Polyalcohols (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80, polysorbate 20, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol) additive of hydrogenated castor oil)) and the like may be used in combination.
  • alcohol eg, ethanol
  • Polyalcohols eg, propylene glycol, polyethylene glycol
  • nonionic surfactants eg, polysorbate 80, polysorbate 20, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol) additive of hydrogenated castor oil)
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like may be used in combination as a solubilizing agent
  • the prepared injection solution is usually filled in appropriate ampules, vials, and syringes.
  • a suppository used for rectal administration is prepared by mixing the above-mentioned antibody into a usual nasal base or suppository base.
  • a lyophilized preparation can be prepared by adding an appropriate excipient to the above antibody, and dissolved in water for injection or physiological saline at the time of use to obtain an injection solution.
  • oral administration of a protein such as an antibody is difficult because it is degraded by the digestive tract, but there is a possibility of oral administration depending on the ingenuity of the antibody fragment or modified antibody fragment and the dosage form.
  • the above parenteral pharmaceutical composition is preferably prepared in a dosage unit form suitable for the dose of the active ingredient.
  • dosage form of such a dosage unit include injections (ampoules, vials, prefilled syringes), nasal drops, suppositories, etc., and usually 5 to 500 mg per dosage unit dosage form, especially for injections It is preferable that 5 to 100 mg of the antibody described above is contained in other dosage forms.
  • compositions may contain other active ingredients as long as an undesirable interaction is not caused by blending with the antibody.
  • the pharmaceutical preparation of the present invention can contain an anti-human ⁇ 4 integrin antibody in addition to the above antibody.
  • the mixing ratio is not particularly limited.
  • the ratio of anti-human ⁇ 9 integrin antibody: anti-human ⁇ 4 integrin antibody can be adjusted within a range of 1 to 99:99 to 1.
  • the pharmaceutical composition comprising the monoclonal antibody of the present invention is a diagnostic agent for inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis, hepatitis, bronchial asthma, fibrosis, diabetes, cancer metastasis, arteriosclerosis, multiple sclerosis, granulomas, etc.
  • inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis, hepatitis, bronchial asthma, fibrosis, diabetes, cancer metastasis, arteriosclerosis, multiple sclerosis, granulomas, etc.
  • autoimmune diseases such as suppression of chronic rejection after organ transplantation, systemic autoimmune disease, lupus erythematosus, uveitis, Behcet's disease, polymyositis, filamentous proliferative nephritis, sarcoidosis, etc.
  • the monoclonal antibody of the present invention can specifically recognize ⁇ 9 integrin, it is used for quantification of ⁇ 9 integrin in a test solution, particularly quantification by sandwich immunoassay, competition method, immunometric method, or the like. be able to.
  • sandwich immunoassay particularly quantification by sandwich immunoassay, competition method, immunometric method, or the like.
  • immunometric method or the like.
  • a measurement system may be constructed by adding ordinary technical considerations of those skilled in the art to the usual conditions and operation methods in each method. For details of these general technical means, it is possible to refer to reviews, books and the like.
  • ⁇ 9 integrin can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
  • various diseases associated with ⁇ 9 integrin can be diagnosed by utilizing the in vivo ⁇ 9 integrin quantification method using the antibody of the present invention. For example, when an increase or decrease in the concentration of ⁇ 9 integrin is detected, it can be diagnosed that the disease is likely to be related to ⁇ 9 integrin, for example, an inflammatory disease or likely to be affected in the future.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used for specifically detecting ⁇ 9 integrin present in a subject such as a body fluid or tissue. Moreover, it can be used for preparation of an antibody column used for purifying ⁇ 9 integrin, detection of ⁇ 9 integrin contained in each fraction during purification, analysis of behavior of ⁇ 9 integrin in a test cell, and the like.
  • a compound that inhibits the activity of human ⁇ 9 integrin can be screened using the epitope on human ⁇ 9 integrin recognized by the antibody of the present invention.
  • the present invention uses a peptide containing the amino acid sequence of human ⁇ 9 integrin (hereinafter referred to as “peptide A”), and a method for screening a low molecular weight compound that inhibits the activity of human ⁇ 9 integrin I will provide a.
  • peptide A and a human ⁇ 9 integrin ligand for example, tenascin C, plasmin, etc.
  • a human ⁇ 9 integrin ligand for example, tenascin C, plasmin, etc.
  • the comparison between the steps (i) and (ii) is performed, for example, by measuring the amount of ligand binding to peptide A.
  • the candidate compound obtained by such a method is subjected to an experiment for confirming whether to inhibit the activity of human ⁇ 9 integrin to obtain a compound that inhibits the activity of human ⁇ 9 integrin.
  • polypeptides, proteins, biologically derived non-peptidic compounds, synthetic compounds, microbial cultures, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, etc. can be used as test substances.
  • a known compound may be used.
  • the selected compound can be used as a prophylactic and / or therapeutic agent for cancer, inflammatory diseases, infectious diseases, autoimmune diseases, bone diseases and the like, like the antibody of the present invention.
  • Example 1 [Preparation of antibodies against human ⁇ 9 integrin]
  • human ⁇ 9 integrin-expressing cells human ⁇ 9 / NIH-3T3 cells
  • human ⁇ 9 / NIH-3T3 cells were intraperitoneally administered at 3 ⁇ 10 6 cells / mouse, and one week and two weeks later, human ⁇ 9 / NIH-3T3 cells were treated 3 ⁇ 10 6 cells / mouse were administered intraperitoneally.
  • human ⁇ 9 / NIH-3T3 cells were intravenously administered at 2 ⁇ 10 6 cells / mouse.
  • a clone that reacts with human ⁇ 9 / CHO-K1 cells and a human melanoma cell line (G361 cell) that endogenously expresses human ⁇ 9 integrin and does not react with human ⁇ 4 integrin-expressing CHO-K1 cells was defined as an anti- ⁇ 9 integrin antibody.
  • G361 cell human melanoma cell line
  • 2 hybridoma cell clones (K33N, M35A) producing anti-human ⁇ 9 integrin antibody were established.
  • hybridoma cells K33N and M35A obtained here were deposited on May 29, 2007, 1-1-1 Higashi 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, Chuo No. 6 (zip code 305-8666), National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Deposited at the center as deposit numbers FERM BP-10830 and FERM BP-10831, respectively.
  • Example 2 [Analysis of complementary recognition region (CDR) of anti-human ⁇ 9 integrin antibody] MRNA was extracted from the hybridoma producing the human ⁇ 9 integrin antibody (K33N, M35A), and cDNA was prepared by reverse transcription. Using this cDNA as a template, PCR was performed using primers for ScFv cloning (Light Primer Mix, Heavy Primer Mix; Amersham Biosciences) to extend and amplify the variable regions of the antibody heavy chain and light chain, respectively. Next, the PCR product was incorporated into pCRII TOPO vector based on a conventional method. This was sequenced to determine the amino acid sequence. The above operation was performed three times for each antibody.
  • ScFv cloning Light Primer Mix, Heavy Primer Mix; Amersham Biosciences
  • amino acid sequences of the variable and CDR regions of the heavy and light chains of K33N and M35A were as shown in FIGS. 1A and 1B.
  • amino acid sequence of the CDR region is as follows.
  • K33N SYYMN (SEQ ID NO: 1)
  • M35A SYWIH (SEQ ID NO: 2)
  • K33N WIFPGSGNTKYNEKFKGK (SEQ ID NO: 3)
  • M35A EINPSSGRTNFIENFETK (SEQ ID NO: 4)
  • CDRH3 K33N: SWVSYGERYYFDY (SEQ ID NO: 5)
  • K33N RASENYYSLA (SEQ ID NO: 7)
  • M35A RASETVDSYGNTFMH (SEQ ID NO: 8)
  • K33N NNSLED (SEQ ID NO: 9)
  • M35A LASNLES (SEQ ID NO: 10)
  • K33N KQAYDVPYT (SEQ ID NO: 11)
  • M35A QQNNEDPYT (SEQ ID NO: 12)
  • 1A and 1B also show sequences (JN Bio and Takara) obtained using an analysis method (different sequence analysis software) different from the sequence analysis method (GTS) described above. Details of each method are as follows.
  • Hybridoma cells (K33N) were grown in TIL Media I medium (Immunobiological Laboratories) containing 10% fetal bovine serum (FBS; HyClone) at 7.5% CO 2 and 37 ° C. to proliferate.
  • Total RNA was extracted from about 3 ⁇ 10 6 hybridoma cells using TRIzol reagent (Invitrogen) according to the Invitrogen protocol.
  • the cDNA was prepared by reverse transcription using an oligo dT-primer using GeneRacer Kit (Invitrogen) and following the Invitrogen protocol.
  • variable region cDNA of H chain and L chain uses 3 ′ primer corresponding to mouse constant regions ⁇ 1 and ⁇ , respectively, and GeneRacer 5 ′ primer (5′-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3 ′ (SEQ ID NO: 14)) attached to GeneRacer Kit, Amplification was performed by PCR using Phusion DNA polymerase (New England Biolabs).
  • the 3 ′ primaer for PCR amplification of the heavy chain variable region (VH) is 5′-GCCAGTGGATAGACAGATGG-3 ′ (SEQ ID NO: 15).
  • the 3 ′ primer for PCR amplification of the L chain variable region (VL) is 5′-GATGGATACAGTTGGTGCAGC-3 ′ (SEQ ID NO: 16). Amplified VH and VL cDNAs were subcloned in pCR4Blunt-TOPO vector (Invitrogen) for sequencing. DNA sequence analysis of the variable region was performed at Tocore (Menlo Park).
  • RNA of the cells was extracted by the Acid Guanidine-Phenol-Chloroform method (AGPC method) using RNAiso (Takara Bio Inc.).
  • AGPC method Acid Guanidine-Phenol-Chloroform method
  • the extracted RNA was treated with DNase I by a conventional method, then treated with phenol chloroform to remove DNase I, and purified by ethanol precipitation.
  • the obtained RNA was suspended again in distilled water and used for analysis.
  • reverse transcription reaction was performed with reverse transcriptase M-MLV (RNase H free) using Random Primer (9mer).
  • PCR amplification of the variable region a part of each reverse transcription reaction solution is used as a template, the heavy chain primer Primer 1 and Heavy Primer 2 (Amersham Biosciences), and the light chain primer Light Primer Mix (Amersham Bioscience). Takara TaKaRa LA Taq was used as the PCR enzyme.
  • the DNA fragment obtained by PCR was electrophoresed on an agarose gel, the band was cut out, and the gel was dissolved to purify the DNA.
  • the purified DNA was TA cloned into pMD20-T vector.
  • the gene sequence was determined using the M13-47 primer sequence contained in pMD20-T vector.
  • the sequencing reaction was carried out using ABI 3730 sequencer (Applied Biosystems) according to the protocol of BigDye® Terminators® v3.1 “cyclesequencing” kit (Applied Biosystems).
  • Example 3 Cell adhesion inhibitory effect of anti-human ⁇ 9 integrin antibody
  • ECM extracellular matrix
  • the OPN peptide is an SVVYGLR peptide conjugated with BSA (bovine serum albumin), TN-C fn3 (RAA) is a protein expressed by the third region of human tenascin-C fibrinctin Type III repeat in R. coli (RGD within this region). The sequence was converted to an RAA sequence).
  • BSA bovine serum albumin
  • RAA TN-C fn3
  • the OPN peptide or tenascin-C fragment (TN-C fn3 (RAA)) was left in a 96-well plate at 37 ° C. for 1 hour and then blocked with 0.5% BSA / PBS.
  • Human melanoma cells G361 were adjusted with 0.25% BSA / DMEM medium to 1 ⁇ 10 5 cells / mL, and each concentration of anti-human ⁇ 9 integrin antibody was added.
  • G361 cells to which the antibody had been added were placed in a 96-well plate on which 200 ⁇ L each was solid-phased and reacted at 37 ° C. for 1 hour.
  • FIG. 2 shows the effect of the anti-human ⁇ 9 integrin antibody on the adhesion of G361 cells to the OPN peptide
  • FIG. 3 shows the result with the tenascin C fragment.
  • M35A In the adhesion of G361 cells to the OPN peptide, M35A was less effective in inhibiting cell adhesion, similar to the negative subject 5A1 and the positive subjects 1K11, 25B6, 28S1. On the other hand, K33N inhibited cell adhesion in a small amount as compared with positive subjects 21C5 and 24I11, and showed cell adhesion inhibitory effect equivalent to Y9A2. In the adhesion of G361 cells to the tenascin-C fragment, M35A was less effective in inhibiting cell adhesion, but K33N inhibited cell adhesion in a small amount, and the same effect as that of Y9A2 was observed in positive subjects 21C5 and 24I11. It was clearly stronger than that. Thus, in particular, K33N showed a particularly remarkable cell adhesion inhibitory effect even when compared with other antibodies.
  • Example 4 Comparison in recognition site of anti-human ⁇ 9 integrin antibody
  • the cell adhesion inhibitory effect of the newly prepared anti-human ⁇ 9 integrin antibody K33N showed the same behavior as Y9A2
  • FACS Fluorescence Activated Cell Sorting
  • Streptavidin-labeled APC (0.5 ⁇ g / mL, 100 ⁇ L) was added to the cell solution, reacted at (4 ° C., 20 minutes), washed again with FACS buffer, and then 7-AAD (0.05 mg / mL, 20 ⁇ L) was used to stain dead cells. Thereafter, the cells were washed again with FACS buffer, and the cells were measured by FACS.
  • the anti- ⁇ 9 integrin antibody of the present invention exhibits an excellent ⁇ 9 integrin function inhibitory action, and includes cancer (eg, proliferation and metastasis of cancer cells), inflammatory diseases (eg, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, hepatitis, bronchial asthma, Cotton fibrosis, diabetes, arteriosclerosis, multiple sclerosis, inflammatory bowel disease (ulcerative colitis, Crohn's disease, etc.), infection (eg, hepatitis), autoimmune disease (eg, systemic lupus erythematosus, multiple It has therapeutic effects on myositis, autoimmune thyroid disease, tubulointerstitial nephritis, myasthenia gravis) and bone disease (for example, osteoporosis).
  • cancer eg, proliferation and metastasis of cancer cells
  • inflammatory diseases eg, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, hepatitis, bronchial asthma,
  • the pharmaceutical composition containing both the anti- ⁇ 9 integrin antibody and the anti- ⁇ 4 integrin antibody of the present invention has further improved therapeutic effects on cancer, inflammatory diseases and the like. Since the antibody of the present invention can detect the expression of ⁇ 9 integrin in cells and tissues pathologically, it can also be used as a diagnostic agent.
  • the anti-human ⁇ 9 integrin antibody (2 clones of the present invention (K33N, M35A), 5 other clones (1K11, 21C5, 24I11, 25B6, 28S1), and Y9A2) was compared with the cell adhesion inhibitory effect of human ⁇ 9 integrin-expressing cells (human melanoma) It is a figure which shows the result investigated by (alpha) 9 integrin binding site peptide (SVVYGLR) of cell G361) and OPN. As a negative control, a monoclonal antibody (5A1) against human osteopontin was used.
  • the anti-human ⁇ 9 integrin antibody (2 clones of the present invention (K33N, M35A), 5 other clones (1K11, 21C5, 24I11, 25B6, 28S1), and Y9A2) was compared with the cell adhesion inhibitory effect of human ⁇ 9 integrin-expressing cells (human melanoma) It is a figure which shows the result investigated by (alpha) 9 integrin binding site peptide of the cell G361) and tenascin C fragment. As a negative control, a monoclonal antibody (5A1) against human osteopontin was used. It is a figure which shows the result of having investigated the competitive reaction of the novel anti-human alpha9 integrin antibody (K33N) and Y9A2 with respect to the human alpha9 integrin expression cell.

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Abstract

【課題】 【解決手段】本発明は、抗ヒトα９インテグリン抗体、より具体的には、ヒトα９インテグリンを特異的に認識するモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体ならびにヒト抗体；上記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞；上記モノクローナル抗体の製造方法；上記ハイブリドーマ細胞の製造方法；上記抗ヒトα９インテグリン抗体を含有する治療剤；上記ヒトα９インテグリン抗体を含有する診断剤；ヒトα９インテグリンの活性を阻害する化合物のスクリーニング方法等に関する。

Description

抗ヒトα９インテグリン抗体とその用途
　本発明は、抗ヒトα９インテグリン抗体とその用途に関する。より具体的には、本発明は、ヒトα９インテグリンを特異的に認識するモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体ならびにヒト抗体、上記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞、上記モノクローナル抗体の製造方法、上記ハイブリドーマ細胞の製造方法、上記抗ヒトα９インテグリン抗体を含有する治療剤、上記ヒトα９インテグリン抗体を含有する診断剤、ヒトα９インテグリンの活性を阻害する化合物のスクリーニング方法等に関する。
　細胞と細胞外マトリックスとの接着は、インテグリンに代表される膜貫通細胞接着タンパク質を介して行われる。インテグリンはα鎖とβ鎖の１：１のヘテロ二量体で構成され、現在までにα鎖１８種類、β鎖８種類が発見され、それらの組合せで、少なくとも２４種類が同定確認されている。各インテグリンはそれぞれが特異的な細胞外マトリックス（リガンド）を認識することが知られている。また、インテグリンを含む膜貫通細胞接着タンパク質の役割は、細胞と細胞外マトリックスの接着、固定のみならず、細胞外マトリックスからの情報を細胞内シグナルに変換し、細胞の増殖、運動、細胞死、分化などの調節を担っていることが解明されてきている。
　インテグリンはリガンドに対する特異性や機能からサブファミリーに分類され、コラーゲン受容体、ラミニン受容体、ファイブロネクチン、ビトロネクチンなどに含まれるＡｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列を認識するＲＧＤ受容体、白血球にのみに存在する白血球特異的受容体に区別される。α４インテグリンおよびα９インテグリンは、これらのどれにも属さないサブファミリーでありα４インテグリンサブファミリーと呼ばれている。
　α４およびα９インテグリンに結合するリガンドとして、オステオポンチン（ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ；以下、ＯＰＮと略称する）、ファイブロネクチンのＥＤＡ部位、プロペプチド－フォンビルブラントファククー（ｐｐ－ｖＷＦ）、組織型トランスグルタミナーゼ（ｔＴＧ）、第XIII血液凝固因子そしてVascular Ce11 Adhesion Molecule-1（ＶＣＡＭ－１）などが知られている。また、α４インテグリンが特異的に認識するリガンドとしてファイブロネクチンのＣＳ－１ドメイン、ＭａｄＣＡＭ－１（α４β７）などが知られている。一方、α９インテグリンが特異的に認識するリガンドは、テネイシンＣ、プラスミンなどが知られている。
　細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の一種であるＯＰＮは分子量約４１ｋＤａの分泌型酸性リン酸化糖タンパク質であり、乳汁、尿、腎尿細管、破骨細胞、骨芽細胞、マクロファージ、活性化Ｔ細胞、腫瘍組織などに広く発現が認められている分子である。分子中央部に細胞接着配列ＧＲＧＤＳとヒトＯＰＮではＳＶＶＹＧＬＲ配列、マウスＯＰＮではＳＬＡＹＧＬＲ配列、その直後にはトロンビン切断部位を有しており、ＧＲＧＤＳ配列を介してＲＧＤ受容体のインテグリンと、ＳＶＶＹＧＬＲ配列あるいはＳＬＡＹＧＬＲ配列を介してα４（α４β１）とα９（α９β１）インテグリンと接着する。
　α４β１はトロンビンで切断されていないＯＰＮ（非切断型ＯＰＮ）とトロンビンで切断されたＮ末端フラグメント（切断型ＯＰＮ）の両方に結合し、α９β１は切断型ＯＰＮにのみ結合するという様式の差も見出されている。
　α４とα９インテグリンおよびβ１のインテグリン・サブユニットのアミノ酸配列は公知であり、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている。また、これらのインテグリンは種間でアミノ酸配列の類似性が高いことが知られている。
　ＷＯ０２／０８１５２２には、ＯＰＮ欠損マウスやＯＰＮに対する中和抗体を用いたＯＰＮ機能抑制による、リウマチ様関節炎や肝炎の治療効果について開示されている。また、この公報には、炎症性疾患発症にはα４インテグリン、α９インテグリンの認識配列であるＳＶＶＹＧＬＲ配列が重要であること、ＯＰＮに対する受容体が免疫担当細胞などにおいて発現し、炎症性疾患に開連していることが開示されている。
ＷＯ０２／０８１５２２
　現在、癌、炎症性疾患、感染症、自己免疫疾患および骨疾患の治療薬は種々知られているが、より改善された治療効果を有する癌、炎症性疾患、感染症、自己免疫疾患および骨疾患の予防薬および／または治療薬等を開発することが望まれている。
　現在までに、本発明者らは、インテグリン、特にα９インテグリンに着目し、種々の研究を行った結果、α９インテグリンに対する特異的阻害抗体が癌抑制効果および抗炎症効果を有することを見出し、５種類のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞（１Ｋ１１、２１Ｃ５、２４Ｉ１１、２５Ｂ６、および２８Ｓ１）を作製した（それぞれ、ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０５１０、ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０５１１、ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０５１２、ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０５１３、およびＦＥＲＭ　ＢＰ－１０８３２として、茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６（郵便番号３０５－８５６６）、独立行政法人　産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに（最初の４つは２００６年２月１５日付で、最後の１つは２００７年５月２９日付で）寄託されている）。
　このような状況下、さらに薬効の優れたモノクローナル抗体または代替的なモノクローナル抗体が求められている。
　本発明者らは、前述の５種類のモノクローナル抗体より薬効的に優れた、または代替的なモノクローナル抗体を開発するため、鋭意研究し、新規なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞の作製に成功して、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、以下に記載の抗ヒトα９インテグリン抗体、そのモノクローナル抗体、その産生細胞、上記抗体を含有する治療剤、α９インテグリン活性を阻害する化合物のスクリーニング方法等を提供する。
（１）配列番号１～１２のうちのいずれかのアミノ酸配列を含有する、抗ヒトα９インテグリン抗体。
（２）配列番号１、３、５、７、９、または１１のアミノ酸配列を含有する抗ヒトα９インテグリン抗体。
（３）配列番号１、３、５、７、９、および１１のアミノ酸配列を含有する抗ヒトα９インテグリン抗体。
（４）配列番号２、４、６、８、１０、または１２のアミノ酸配列を含有する抗ヒトα９インテグリン抗体。
（５）配列番号２、４、６、８、１０、および１２のアミノ酸配列を含有する抗ヒトα９インテグリン抗体。
（６）重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲＨ）におけるアミノ酸配列として配列番号１～６のいずれかのアミノ酸配列を、軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲＬ）におけるアミノ酸配列として配列番号７～１２のいずれかのアミノ酸配列を含有する抗ヒトα９インテグリン抗体。
（７）ヒトα９インテグリンと、α９インテグリンのリガンドとの結合を阻害する、上記（１）～（６）のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体。
（８）モノクローナル抗体である、上記（１）～（７）のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体。
（９）キメラ抗体である、上記（１）～（８）のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体。
（１０）ヒト化抗体である、上記（１）～（８）のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体。
（１１）ヒト抗体である、上記（１）～（８）のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体。
（１２）受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０８３０またはＦＥＲＭ　ＢＰ－１０８３１で標示されるハイブリドーマ細胞により産生される抗ヒトα９インテグリン抗体。
（１３）上記（１）～（１２）のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体を有効成分として含む、癌、炎症性疾患、感染症、自己免疫疾患または骨疾患の治療剤。
（１４）上記（１）～（１２）のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体および抗ヒトα４インテグリン抗体の両方を有効成分として含む、癌、炎症性疾患、感染症、自己免疫疾患または骨疾患の治療剤。
（１５）上記（１）～（１２）のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体を有効成分として含む、癌、炎症性疾患、感染症、自己免疫疾患または骨疾患の診断剤。
（１６）上記（１）～（１２）のいずれかに記載の抗ヒトαインテグリン抗体を産生する細胞。
（１７）受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０８３０またはＦＥＲＭ　ＢＰ－１０８３１で標示されるハイブリドーマ細胞。
（１８）α９インテグリンのアミノ酸配列を含有するペプチドを用いることを特徴とする、α９インテグリンの活性を阻害する化合物のスクリーニング方法。
　本発明により、新規な抗αインテグリン抗体が提供される。本発明の抗α９インテグリン抗体は、優れたα９インテグリン機能抑制作用を示し、癌（例えば、癌細胞の増殖、転移）、炎症性疾患（例えば、関節リウマチ、変形性関節症、肝炎、気管支喘息、綿維症、糖尿病、動脈硬化、多発性硬化症、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病等））、感染症（例えば、肝炎）、自己免疫疾患（例えば、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、自己免疫性甲状腺疾患、尿細管間質性腎炎、重症筋無力症）および骨疾患（例えば、骨粗鬆症）等に対する治療効果を奏する。また、本発明の抗α９インテグリン抗体および抗α４インテグリン抗体の両者を含有する医薬組成物は、さらに改善された、癌、炎症性疾患等の治療効果を奏する。本発明の抗体は、細胞や組織におけるα９インテグリンの発現を病理学的に検出できることから、診断薬としても利用できる。
［発明の経緯］
　α４インテグリンに対する抗体であるTysabri（登録商標）（natalizumab）は２００４年１１月にバイオジェン・アイデック（Biogen Idec Inc.、米マサチューセッツ州）とエラン（Elan Corporation、アイルランド）が多発性硬化症治療薬として米食品医薬品局（ＦＤＡ）から承認を受けている。また、Tysabri（登録商標）はクローン病、リウマチ様関節炎等の疾患を対象として臨床開発されている。なお、Ｐ４Ｃ２という抗ヒトα４β１インテグリン・モノクローナル抗体が実験室レベルで用いられている。
　しかし、α９インテグリンに対する抗体はヒトおよびモルモットのα９インテグリンに特異性を示すＹ９Ａ２と呼ばれるモノクローナル抗体（A.Wang et al、，（1996）Am. J. Respir.，Ce11 Mol. Biol. 15、664-672）が実験用として供されているが、臨床的に用いられていない。
　本発明では、以下の点を注意深く進めることにより、より優れた薬効が期待できるヒトα９インテグリンに対する新たな抗体を得ることができた。
（１）ヒトα９インテグリン過剰発現株の作製
　α９インテグリンに対する抗体を作製するために、マウス線維芽細胞であるＮＩＨ－３Ｔ３細胞へ遺伝子導入を行い、ヒトα９インテグリンを過剰発現する細胞株を樹立し、この細胞を抗原としてマウスに免疫した。
（２）ハイブリドーマのスクリーニング
　細胞融合で得られた種々のハイブリドーマからヒトα９インテグリンのみに反応するクローンを効率よく得るために、同じインテグリンファミリーであるヒトα４インテグリンをＣＨＯ－Ｋ１細胞に発現させた細胞を用いて他のインテグリンとは交差反応性を示さず、親細胞（ＣＨＯ－Ｋ１）の細胞表面抗原とは反応しないクローンを選抜することにより、効率的にヒトα９インテグリンに特異的に反応する阻害抗体を得た。
［本発明の抗α９インテグリン抗体］
　本発明は、ヒトα９インテグリンに対するモノクローナル抗体を提供する。本発明において、「抗体」とは、抗原であるα９インテグリンまたはその部分ペプチドに特異的に結合する抗体分子全体またはその断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、などの断片）を意味し、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。好ましくは、本発明においてはモノクローナル抗体を意味する。また、本発明において「抗体」は、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体を包含する。
　本発明において、抗体が、あるタンパク質またはその断片に「特異的に結合する」とは、その抗体が他のアミノ酸配列に対するその親和性よりも、これらのタンパク質またはその断片の特定のアミノ酸配列に対して実質的に高い親和性で結合することを意味する。ここで、「実質的に高い親和性」とは、所望の測定装置または方法によって、その特定のアミノ酸配列を他のアミノ酸配列から区別して検出することが可能な程度に高い親和性を意味し、典型的には、結合定数（Ｋａ）が少なくとも１０７Ｍ－１、好ましくは、少なくとも１０８Ｍ－１、より好ましくは、１０９Ｍ－１、さらにより好ましくは、１０１０Ｍ－１、１０１１Ｍ－１、１０１２Ｍ－１またはそれより高い、例えば、最高で１０１３Ｍ－１またはそれより高いものであるような結合親和性を意味する。
　本発明における「モノクローナル抗体」は、抗原に対して高度に特異的であり、単一の抗原を認識するものをいう。
　本発明において、「抗体断片」とは、全長抗体の一部を指し、抗原結合領域または可変領域のことである。例えば、抗体断片にはＦａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、およびＦｖ断片が含まれる。これらの抗体断片は抗体のパパイン消化、ペプシン消化など一般的に知られている方法で作製することができる。
　上記「キメラ抗体」とは、本発明で得られた抗ヒトα９インテグリン抗体の定常領域をヒトの抗体と同じ定常領域を有するように遺伝子工学的に改変したヒト・マウス・キメラ抗体（欧州特許公開公報ＥＰ０１２５０２３参照）を指す。「ヒト化抗体」とは、本発明で得られた抗ヒトα９インテグリン抗体のＨ鎖とＬ鎖の相補認識領域（ＣＤＲ）以外の一次構造をヒトの抗体に対応する一次構造に遺伝子工学的に改変した抗体を言う。「ヒト抗体」とは、ヒトの抗体産生に関与する遺伝子を導入したトランスゲニック動物を用いて作製したモノクローナル抗体（欧州特許公開公報ＥＰ０５４６０７３参照）を意味する。
　より具体的には、本発明は、まず、これまで作製された抗ヒトα９インテグリン抗体と異なる抗ヒトα９インテグリン抗体を提供する。本発明の好ましい態様による抗体は、配列番号１、３、５、７、９、または１１のアミノ酸配列を含有する。さらに好ましい抗体は、配列番号１、３、５、７、９、および１１のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列のうち、２以上、３以上、４以上、５以上、または６個を有する抗ヒトα９インテグリン抗体である。
　また、本発明の他の態様による抗体は、配列番号２、４、６、８、１０、または１２のアミノ酸配列を含有する。さらに好ましい抗体は、配列番号２、４、６、８、１０、および１２のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列のうち、２以上、３以上、４以上、５以上、または６個を有する抗ヒトα９インテグリン抗体である。
　本発明において特に好ましい抗体は、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０８３０またはＦＥＲＭ　ＢＰ－１０８３１で標示されるハイブリドーマ細胞により産生される抗ヒトα９インテグリン抗体である。
　以下、抗α９インテグリン・モノクローナル抗体の作製について詳述するが、該抗体の作製はこれに限定されることはない。
［α９インテグリン（抗原）］
　本発明において抗原として使用するα９インテグリンは、（１）ヒトやその他の哺乳動物のα９インテグリンを発現するあらゆる細胞、またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織に由来するタンパク質、（２）α９インテグリンをコードする遺伝子ＤＮＡ、好ましくはｃＤＮＡを細菌、酵母、動物細胞等の細胞株に導入、発現させた組換えタンパク質であってもよく、また（３）合成タンパク質であってもよい。
　また、本発明のα９インテグリンには、各種哺乳動物のα９インテグリンのアミノ酸配列、特に好ましくはヒトα９インテグリンのアミノ酸配列（配列番号：１３）と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドも包含される。
　ここで「実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド」とは、天然型のα９インテグリン、特に好ましくはヒト由来のα９インテグリンと実質的に同等の生物学的性質を有する限り、該アミノ酸配列中の複数個のアミノ酸、好ましくは１～１０個のアミノ酸、特に好ましくは１～数個（例えば、１～５個、１～４個、１～３個、１～２個））のアミノ酸が置換、欠失および／または修飾されているアミノ酸配列を有する変異ポリペプチド、ならびに該天然型のα９インテグリン、特に好ましくはヒト由来のα９インテグリンのアミノ酸配列中に、複数個のアミノ酸、好ましくは１～１０個のアミノ酸、特に好ましくは１～数個（例えば、１～５個、１～４個、１～３個、１～２個））のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列を有する変異ポリペプチドを意味する。さらに、そのような置換、欠失、修飾及び付加の複数を有する変異ポリペプチドであってもよい。
　本発明のα９インテグリン、特にはヒト由来のα９インテグリンは、遺伝子組換え技術のほか、化学的合成法、細胞培養方法等のような当該技術分野において公知の方法あるいはその修飾方法を適宜用いることにより製造することができる。
　また、変異ポリペプチドの製造方法としては、例えば、合成オリゴヌクレオチド部位突然変異導入法（gapped duplex法）、亜硝酸あるいは亜硫酸処理によってランダムに点突然変異を導入する方法、Ｂａ１３１酵素等により欠失変異体を作製する方法、カセット変異法、リンカースキャニング法、ミスインコーポレーション法、ミスマッチプライマー法、ＤＮＡセグメント合成法などを挙げることができる。
　また、本発明のα９インテグリンには、該α９インテグリンの「一部」も包含される。ここで「一部」とは、ＯＰＮ、テネイシンＣ、ＶＣＡＭ－１等のα９インテグリンリガンドと結合するために必要な領域を含む部分をいう。該α９インテグリンの「一部」は、後述する当該技術分野において公知の方法あるいはその修飾方法に従って、遺伝子組換え技術または化学的合成法により製造することもできるし、また細胞培養方法により単離したα９インテグリン、特に好ましくはヒト由来のα９インテグリンをタンパク分解酵素等により適切に切断することで製造することができる。
　抗原としてはまた、α９インテグリンを組換え技術により細胞膜上に過剰発現する細胞自体、あるいはその膜画分等を用いることができる。
　本発明のα９インテグリンには、ヒトα９インテグリンのアミノ酸配列（配列番号１３）と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドも包含される。また、特に本発明ではヒトα９インテグリンを組換え技術により細胞膜上に過剰発現する細胞自体が好適に用いられる。したがって、後述するような、ヒトα９インテグリンをコードする遺伝子（例えば、ｃＤＮＡ）を公知の遺伝子工学技術を用いてクローニングし、ヒトα９インテグリンを細胞膜上に過剰発現する細胞自体、またはその細胞膜画分を抗原として調製する場合もある。
［抗体産生細胞の調製］
　抗原は、免疫される動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常１～６週毎に１回ずつ、計２～１０回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、マウス、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、ラット、ハムスター、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ等が挙げられるが、本発明ではマウスが好適に用いられる。
　治療の対象がヒトであり、α９インテグリン阻害抗体産生動物がマウスの場合には、ヒト・マウスのキメラ抗体やヒト化抗体を用いるのが望ましく、さらには、抗体産生に関与するヒト遺伝子を導入したマウス等のトランスジェニック動物を用いてヒト型モノクローナル抗体を作成して用いるのが望ましい。
［抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合］
　ミエローマ細胞としては、マウス、ラット、ヒト等に由来する細胞が用いられる。例えばマウスミエローマＰ３Ｕ１、Ｐ３Ｘ６３－Ａｇ８、Ｐ３Ｘ６３－Ａｇ８－Ｕ１、Ｐ３ＮＳ１－Ａｇ４、ＳＰ２／０－Ａｇ１４、Ｐ３Ｘ６３－Ａｇ８－６５３等があげられるが、抗体産生細胞とミエローマ細胞とは同種動物、特に同系統の動物由来であることが好ましい。ミエローマ細胞は凍結保存するか、ウマ、ウサギまたはウシ胎児血清を添加した一般的な培地で継代して維持することができる。細胞融合には対数増殖期の細胞を用いるのが好ましい。本発明ではＰ３Ｘ６３－Ａｇ８－６５３が好適に用いられる。
　抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを形成させる方法としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる方法、センダイウイルスを用いる方法、電気融合装置を用いる方法などがあげられる。例えばＰＥＧ法の場合、約３０～６０％のＰＥＧ（平均分子量１０００～６０００）を含む適当な培地または緩衝液中に脾細胞とミエローマ細胞を１～１０：１、好ましくは５～１０：１の混合比で懸濁し、温度約２５～３７℃、ｐＨ６～８の条件下で、約３０秒～３分間程度反応させればよい。反応終了後、ＰＥＧ溶液を除いて培地に再懸濁し、セルウェルプレート中に播種して培養を続ける。
［ハイブリドーマ細胞の選別］
　モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマ細胞が生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１～２０％、好ましくは１０～２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ　１６４０培地、１～１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ－１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０～４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常、５日～３週間、好ましくは１週間～２週間である。培養は、通常５％ＣＯ2下で行なうことができる。
　本発明のモノクローナル抗体の産生は、新臨床免疫実験操作法（part 3）、科学評論社、1997に記載される細胞ＥＬＩＳＡ法を用いて確認およびスクリーニングできる。免疫に用いた細胞をスクリーニングに使用するとバックグラウンドが高くなることや偽陽性が多くなることが予想される場合、免疫に用いた細胞とは別の細胞で過剰発現するヒトα９インテグリンに反応し、かつ、ヒトα４インテグリンを過剰発現する細胞に反応しないクローンを抗ヒトα９インテグリン抗体とすることができる。このようなクローンから限界希釈法を１から５回、好適には２から４回繰り返すことによりモノクローナル抗体を調製できる。
［抗体の分離精製］
　得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えばアフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる（Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）が、これらに限定されるものではない。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。例えばプロテインＡカラムを用いたカラムとして、Hyper D, POROS, Sepharose F. F.（Amersham Biosciences）等が挙げられる。
［抗体の標識化］
　得られた抗体を、公知の方法または市販のキットを用いて各種標識化（例えば、ビオチン標識、ＦＩＴＣ標識、ＡＰＣ標識）できる。本発明では、Biotin Labeling Kit（同仁化学）を用いたビオチン標識が好適に用いられる。
　このようにして得られたモノクローナル抗体は、必要により精製した後、常法に従って製剤化し、癌、炎症性疾患、感染症、自己免疫疾患および骨疾患等の予防および／または治療剤として用いることができる。これらの予防および／または治療剤としての剤形は注射剤、点滴用剤などの非経口製剤とすることができ、創意工夫により経口製剤として使用することができる。また、製剤化に当たっては、薬事上および薬学的に許容される範囲内で、剤形に適した担体、希釈剤もしくは添加剤などを使用することができる。
［抗体の薬理学的効果］
　インテグリンの役割は、細胞と細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の接着、固定のみならず、細胞外マトリックスからの情報を細胞内シグナルに変換し、細胞の増殖、運動、細胞死、分化などの調節を担っていることが解明されてきている。従って、得られたモノクローナル抗体は、ＥＣＭとα９インテグリンとの結合を阻害することにより、ＥＣＭからの情報の細胞内シグナル伝達を遮断できることから、ＥＣＭが関与する疾患の治療が可能である。α９インテグリンに結合するＥＣＭ、およびα９リガンドとしてＯＰＮ、ファイブロネクチン、プロペプチド－フォンビルブラントファククー（ｐｐ－ｖＷＦ）、組織型トランスグルタミナーゼ（ｔＴＧ）、第XIII血液凝固因子、Vascular Ce11 Adhesion Molecule-1（ＶＣＡＭ－１）、テネイシンＣ、プラスミンなどが知られている。これらのＥＣＭとα９インテグリンを発現している細胞や癌細胞を用い、得られたモノクローナル抗体の存在下での結合阻害をｉｎ　ｖｉｔｒｏで観察することにより、本発明のモノクローナル抗体の対象疾患を見出すことができる。
［抗体を含有する医薬］
　本発明の抗体（特に、モノクローナル抗体）を有効成分とする製剤は、癌（例えば癌細胞の増殖、転移）、炎症性疾患（例えば関節リウマチ、変形性関節症、肝炎、気管支喘息、綿維症、糖尿病、動脈硬化、多発性硬化症、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病））、感染症（例えば肝炎）、自己免疫疾患（例えば全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、自己免疫性甲状腺疾患、尿細管間質性腎炎、重症筋無力症）および骨疾患（例えば骨粗鬆症）等の治療剤（therapeutic agent）または予防剤（prophylactic agent）として用いることができる。
　投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、癌患者の予防および／または治療のために使用する場合には、本発明の抗体を１回量として、通常０．０１～２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０．１～１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０．１～５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１月１～１０回程度、好ましくは１月１～５回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量または投与回数を増加させてもよい。
　本発明の抗体は、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記抗体またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。このような組成物は、非経口投与または経口に適する剤形として提供される。
　すなわち、非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、点鼻剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などの剤形を包含する。このような注射剤は、公知の方法に従って、例えば、上記抗体を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール、その他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ＨＣＯ－５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ　ｏｆ　ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ　ｃａｓｔｏｒ　ｏｉｌ）〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプル、バイアル、シリンジに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体を通常の点鼻薬用基剤、坐薬用基剤に混合することによって調製される。また、上記抗体を適当な賦形剤を添加することにより、凍結乾燥製剤を調製し、用時、注射用水、生理食塩水などで溶解して注射液とすることもできる。なお、一般的に抗体などのタンパク質の経口投与は消化器により分解されるため、困難とされるが、抗体断片や修飾した抗体断片と剤形の創意工夫により、経口投与の可能性もある。
　上記の非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好適である。このような投薬単位の剤形としては、注射剤（アンプル、バイアル、プレフィルド・シリンジ）、点鼻剤、坐剤などが例示され、それぞれの投薬単位剤形当たり通常５～５００ｍｇ、とりわけ注射剤では５～１００ｍｇ、その他の剤形では１０～２５０ｍｇの上記抗体が含有されていることが好ましい。
　なお前記した各組成物は、上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。例えば、本発明の医薬製剤は、上記抗体に加えて、抗ヒトα４インテグリン抗体を含有させることができる。この場合の混合比は特に限定されないが、例えば、抗ヒトα９インテグリン抗体：抗ヒトα４インテグリン抗体の比率を１～９９：９９～１の比率の範囲内で調整することができる。
［本発明のモノクローナル抗体を含有する診断剤］
　本発明のモノクローナル抗体を含有してなる医薬組成物は、炎症性疾患、例えばリウマチ関節炎、肝炎、気管支喘息、線維症、糖尿病、癌転移、動脈硬化、多発性硬化症、肉芽腫等の診断剤、また臓器移植後の慢性拒絶反応抑制、全身性自己免疫疾患・エリテマトーデス・ぶどう膜炎・ベーチェト病・多発性筋炎・糸状体増殖性腎炎・サルコイドーシス等の自己免疫疾患の診断剤として用いることができる。本発明のモノクローナル抗体は、α９インテグリンを特異的に認識することができるので、被検液中のα９インテグリンの定量、特にサンドイッチ免疫測定法、競合法、あるいはイムノメトリック法などによる定量などに使用することができる。これら個々の免疫学的測定法を本発明の測定方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要としない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
　以上のように、本発明の抗体を用いることによって、α９インテグリンを感度良く定量することができる。さらに、本発明の抗体を用いる、生体内でのα９インテグリンの定量法を利用することにより、α９インテグリンが関連する各種疾患の診断をすることができる。例えば、α９インテグリンの濃度の増減が検出された場合は、α９インテグリンが関連する疾患、例えば炎症性疾患である可能性が高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。また、本発明のモノクローナル抗体は、体液や組織などの被検体中に存在するα９インテグリンを特異的に検出するために使用することができる。また、α９インテグリンを精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画に含まれるα９インテグリンの検出、被検細胞内におけるα９インテグリンの挙動の分析等に使用することができる。
［ヒトα９インテグリンの活性を阻害する化合物のスクリーニング方法］
　本発明の抗体が認識するヒトα９インテグリン上のエピトープを利用して、ヒトα９インテグリンの活性を阻害する化合物をスクリーニングすることができる。具体的には、本発明は、ヒトα９インテグリンのアミノ酸配列を含有するペプチド（以下、「ペプチドＡ」という）を用いることを特徴とする、ヒトα９インテグリンの活性を阻害する低分子化合物のスクリーニング方法を提供する。
　本発明のスクリーニング方法においては、例えば、（ｉ）ペプチドＡと、ヒトα９インテグリンのリガンド（例えば、テネイシンＣ、プラスミンなど）とを接触させた場合と（ii）ペプチドＡと、リガンドおよび試験化合物とを接触させた場合との比較を行なう。工程（ｉ）と（ii）の比較は、例えば、ペプチドＡに対するリガンドの結合量を測定することにより行う。そのような結合量の比較を容易にするために、公知の手法によって標識したリガンドを用いることが好ましい。このような方法によって得られた候補化合物について、ヒトα９インテグリンの活性を阻害するか否かの確認実験を行って、ヒトα９インテグリンの活性を阻害する化合物を得る。
　ここで被験物質としては、ポリペプチド、タンパク質、生体由来の非ペプチド性化合物、合成化合物、微生物培養物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液等を用いることができ、新規化合物であっても、公知の化合物であっても良い。
　選択される化合物は、本発明の抗体同様、癌、炎症性疾患、感染症、自己免疫疾患および骨疾患等の予防および／または治療剤として用いることができる。
　以下に実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、これは本発明の範囲を限定するものではない。
（実施例１）
［ヒトα９インテグリンに対する抗体の作製］
　ヒトα９インテグリンに対する抗体作製は、以下のようにしてBALB/cマウス３匹に対して免疫を行った。まず、ヒトα９インテグリン発現細胞（ヒトα９／ＮＩＨ－３Ｔ３細胞）を３×１０６細胞／匹を腹腔内投与し、さらにその１週間後と２週間後に、ヒトα９／ＮＩＨ－３Ｔ３細胞を３×１０６細胞／匹を腹腔内投与した。さらに一週間後、ヒトα９／ＮＩＨ－３Ｔ３細胞を２×１０６細胞／匹を静脈内投与した。ヒトα９／ＣＨＯ－Ｋ１細胞及びヒトα９インテグリンを内在的に発現するヒトメラノーマ細胞株（Ｇ３６１細胞）に反応し、且つ、ヒトα４インテグリン発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞に反応しないクローンを抗α９インテグリン抗体とした。その結果、抗ヒトα９インテグリン抗体を産生するハイブリドーマ細胞２クローン（Ｋ３３Ｎ、Ｍ３５Ａ）を樹立した。
　ここで得られたハイブリドーマ細胞Ｋ３３ＮおよびＭ３５Ａは、２００７年５月２９日に茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６（郵便番号３０５－８５６６）、独立行政法人　産業技術総合研究所　特許生物寄託センターにそれぞれ受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０８３０およびＦＥＲＭ　ＢＰ－１０８３１として寄託されている。
（実施例２）
［抗ヒトα９インテグリン抗体の相補認識領域（ＣＤＲ）の解析］
　ヒトα９インテグリン抗体（Ｋ３３Ｎ、Ｍ３５Ａ）を産生するハイブリドーマからｍＲＮＡを抽出して、逆転写によってｃＤＮＡを作製した。このｃＤＮＡを鋳型とし、ＳｃＦｖクローニング用プライマー（Light Primer Mix、Heavy Primer Mix；アマシャムバイオサイエンス社）を用いてＰＣＲを行い、抗体の重鎖と軽鎖の可変領域をそれぞれ伸長・増幅した。次に、ＰＣＲ産物を常法に基づいてpCRII TOPO vectorに組み込んだ。これをシークエンスしてアミノ酸配列を決定した。各抗体について３回ずつ上記の操作を行った。
　その結果、Ｋ３３ＮおよびＭ３５Ａの重鎖および軽鎖の可変領域とＣＤＲ領域のアミノ酸配列は図１Ａおよび図１Ｂに示す通りとなった。ＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、具体的には、以下の通りである。
（重鎖）
［ＣＤＲＨ１］
　Ｋ３３Ｎ：　ＳＹＹＭＮ（配列番号１）
　Ｍ３５Ａ：　ＳＹＷＩＨ（配列番号２）
［ＣＤＲＨ２］
　Ｋ３３Ｎ：　ＷＩＦＰＧＳＧＮＴＫＹＮＥＫＦＫＧＫ（配列番号３）
　Ｍ３５Ａ：　ＥＩＮＰＳＳＧＲＴＮＦＩＥＮＦＥＴＫ（配列番号４）
［ＣＤＲＨ３］
　Ｋ３３Ｎ：　ＳＷＶＳＹＥＲＧＹＹＦＤＹ（配列番号５）
　Ｍ３５Ａ：　ＬＡＹＧＮＹＳＷＦＡＹ（配列番号６）
（軽鎖）
［ＣＤＲＬ１］
　Ｋ３３Ｎ：　ＲＡＳＥＮＩＹＹＳＬＡ（配列番号７）
　Ｍ３５Ａ：　ＲＡＳＥＴＶＤＳＹＧＮＴＦＭＨ（配列番号８）
［ＣＤＲＬ２］
　Ｋ３３Ｎ：　ＮＡＮＳＬＥＤ（配列番号９）
　Ｍ３５Ａ：　ＬＡＳＮＬＥＳ（配列番号１０）
［ＣＤＲＬ３］
　Ｋ３３Ｎ：　ＫＱＡＹＤＶＰＹＴ（配列番号１１）
　Ｍ３５Ａ：　ＱＱＮＮＥＤＰＹＴ（配列番号１２）
　なお、図１Ａおよび図１Ｂには、上記の配列解析方法（ＧＴＳ）とは異なる解析方法（異なる配列解析ソフトウェア）を使用して得た配列（ＪＮ　ＢｉｏおよびＴａｋａｒａ）も示している。それぞれの方法の詳細は以下の通りである。
［JN Biosciencesの配列解析法（Ｋ３３Ｎ）］
　ハイブリドーマ細胞（Ｋ３３Ｎ）を10%牛胎児血清（FBS；HyClone）含有TIL Media I培地（免疫生物研究所）で７．５％ＣＯ２、３７℃で培養し、増殖させた。 全RNAは、Invitrogenのプロトコールに従い、TRIzol試薬（Invitrogen）を用い、約３×１０６個のハイブリドーマ細胞から抽出した。 オリゴdT-プライマーを使用した逆転写反応でのcDNAの作製は、GeneRacer Kit（Invitrogen）を用い、Invitrogenのプロトコールに従った。H鎖とL鎖の可変領域cDNAは、マウス定常領域γ1とκにそれぞれ相当する3’ primerおよびGeneRacer Kit 添付のGeneRacer 5’ primer（5’-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3’（配列番号１４））を用い、Phusion DNA polymerase（New England Biolabs）を使用し、PCRで増幅した。 H鎖可変領域（VH）のPCR増幅のための3’ primaerは 5’-GCCAGTGGATAGACAGATGG-3’（配列番号１５）である。L鎖可変領域（VL）のPCR増幅のための3’ primerは、5’-GATGGATACAGTTGGTGCAGC-3’（配列番号１６）である。増幅したVHとVLの cDNAは配列決定のためにpCR4Blunt-TOPO vector（Invitrogen）中でサブクローニングした。可変領域のDNA配列解析はTocore（Menlo Park）で行った。
［Takaraの配列解析法（Ｍ３５Ａ）］
　ハイブリドーマ細胞（Ｍ３５Ａ）を培養、増殖させた後、細胞の全RNAはRNAiso（タカラバイオ社）を用いて、Acid Guanidine-Phenol-Chloroform法（AGPC法）で抽出した。抽出したRNAは常法によりDNase I 処理を行った後、フェノールクロロホルム処理を行い、DNase I を除き、エタノール沈殿で精製した。得られたRNA は再度蒸留水に懸濁して解析に用いた。DNase I 処理後の RNA 約1μg を鋳型に、Random Primer(9mer)を用いて逆転写酵素Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H free）で逆転写反応を行った。可変領域のPCR 増幅には、各逆転写反応液の一部を鋳型とし、H 鎖はプライマーHeavy Primer 1 とHeavy Primer 2（アマシャムバイオサイエンス社）を、L 鎖にプライマーLight Primer Mix（アマシャムバイオサイエンス社）をそれぞれ用い、PCR 酵素にはタカラTaKaRa LA Taq を使用した。
　PCRによって得たDNA断片をアガロースゲルによって電気泳動し、バンドを切り出し、ゲルを溶かし出すことによってDNAの精製を行った。精製したDNAをpMD20-T vectorにTAクローニングした。可変領域のDNA配列解析はpMD20-T vectorに含まれるM13-47 primer配列を用いて遺伝子配列を決定した。シーケンス反応にはBigDye Terminators v3.1 cycle sequencing kit （アプライドバイオシステムズ社）を使用し、同社のプロトコールに従ってABI3730シーケンサー（アプライドバイオシステムズ社）により行った。
　図１Ａおよび図１Ｂから明らかなように、用いる解析方法（または解析ソフトウェア）により、得られる配列に多少の違いがみられるが、ＣＤＲのアミノ酸配列に関しては、解析方法の違いによる差異は見られなかった。
（実施例３）
［抗ヒトα９インテグリン抗体の細胞接着阻害効果］
　細胞接着する際にはα９インテグリンがＯＰＮ、ファイブロネクチン、テネイシンＣ、ＶＣＡＭ－１などの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を含むリガンドと結合することから、得られた新規な抗ヒトα９インテグリン抗体の細胞接着阻害をα９インテグリン発現細胞（ヒトメラノーマ細胞Ｇ３６１）とリガンドの結合阻害で検討した。
　ＯＰＮペプチドはＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を結合したＳＶＶＹＧＬＲペプチド、ＴＮ-Ｃ ｆｎ３ (ＲＡＡ)はヒトテネイシン―ＣのＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ＴｙｐｅIII ｒｅｐｅａｔの三番目の領域を大腸菌にて発現させたタンパク（この領域内のＲＧＤ配列をＲＡＡ配列に変換した。）を用いた。
　ＯＰＮ ペプチドまたはテネイシンＣフラグメント(ＴＮ－Ｃ ｆｎ３(ＲＡＡ)) （５μｇ/ｍＬ）を９６穴プレートに３７℃一時間放置後、０．５％ＢＳＡ/ＰＢＳでブロッキングした。ヒトメラノーマ細胞Ｇ３６１は、１×１０５個／ｍＬになるように０．２５％ ＢＳＡ／ＤＭＥＭ培地で調整し、各濃度の抗ヒトα９インテグリン抗体を添加した。抗体を添加したＧ３６１細胞を２００μＬずつ固相した９６穴プレートに入れ、３７℃１時間反応させた。二回ＰＢＳにて洗浄後、接着細胞を０．５％ クリスタルバイオレッド/２０％メタノールで固定、染色した。３回、蒸留水で洗浄後、２０％酢酸で溶解し、５９０ｎｍにおける吸光度を測定した。なお、陰性対照としてヒト・オステオポンチンに対するモノクローナル抗体（５Ａ１）、陽性対照として先に調製した抗ヒトα９インテグリン抗体５種類（１Ｋ１１、２１Ｃ５、２４Ｉ１１、２５Ｂ６、２８Ｓ１）を用いた。
　ＯＰＮ ペプチドへのＧ３６１細胞の接着に及ぼす抗ヒトα９インテグリン抗体の影響を図２に、テネイシンＣフラグメントでの結果を図３に示す。
　ＯＰＮ ペプチドへのＧ３６１細胞の接着において、Ｍ３５Ａは陰性対象５Ａ１と陽性対象１Ｋ１１、２５Ｂ６、２８Ｓ１と同様に細胞接着阻害の効果が小さかった。一方、Ｋ３３Ｎは陽性対象２１Ｃ５、２４Ｉ１１に比べて少量で細胞接着を阻害し、Ｙ９Ａ２と同等の細胞接着阻害効果を示した。テネイシンＣフラグメントへのＧ３６１細胞の接着では、Ｍ３５Ａは細胞接着阻害の効果が小さかったが、Ｋ３３Ｎは少量で細胞接着を阻害し、Ｙ９Ａ２と同じ程度にその細胞接着阻害効果が陽性対象２１Ｃ５、２４Ｉ１１に比べて明らかに強かった。このように、特にＫ３３Ｎは他の抗体と比較しても格別顕著な細胞接着阻害効果を示した。
（実施例４）
［抗ヒトα９インテグリン抗体の認識部位の差異］
　新規に作製した抗ヒトα９インテグリン抗体Ｋ３３Ｎの細胞接着阻害効果がＹ９Ａ２と同様な挙動を示したので、ヒトα９インテグリン発現細胞（ｈα９／ＣＨＯ）に対する両抗体の競合反応をＦＡＣＳで検出することにより、認識部位の差異を調べた。
　ビオチン標識したＫ３３ＮまたはＹ９Ａ２（５μｇ／ｍＬ、１００μＬ）にその１００倍量のＫ３３Ｎ、Ｙ９Ａ２、陰性対象ＩｇＧ（０．５ｍｇ／ｍＬ、１００μＬ）を加えた後、ヒトα９インテグリン細胞（ｈα９／ＣＨＯ、１×１０７／ｍＬ、１００μＬ）と反応（４℃、３０分）させ、ＦＡＣＳバッファー（０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ）で細胞を洗浄した。ストレプトアビジン標識ＡＰＣ（０．５μｇ／ｍＬ、１００μＬ）を細胞溶液に加え、（４℃、２０分）で反応させ、再度ＦＡＣＳバッファーで細胞を洗浄した後、７－ＡＡＤ（０．０５ｍｇ／ｍＬ、２０μＬ）を用いて死細胞の染色を行った。その後、再度ＦＡＣＳバッファーで洗浄して、細胞をＦＡＣＳで測定した。
　図４に示すように、ヒトα９インテグリン発現細胞に対してビオチン標識Ｙ９Ａ２と無標識Ｙ９Ａ２を競合反応させると蛍光物質が結合した細胞が明らかにバックグランド近辺まで減少しているが、ビオチン標識Ｙ９Ａ２と無標識Ｋ３３Ｎの共存下では蛍光物質が結合した細胞の減少はみられるものの、バックグランド近辺まで減少しなかった。一方、ヒトα９インテグリン発現細胞に対してビオチン標識Ｋ３３Ｎに無標識Ｋ３３Ｎを添加すると競合し、蛍光物質が結合した細胞が明らかに減少したが、無標識Ｙ９Ａ２を添加しても蛍光物質が結合した細胞が無標識Ｋ３３Ｎ添加までは減少しなかった。したがって、Ｙ９Ａ２とＫ３３Ｎが同じエピトープを認識する場合には競合を示すが、完全な競合を呈しなかったことから、Ｙ９Ａ２とＫ３３Ｎは異なるエピトープを認識しており、同一の抗体でないと示唆された。
　本発明の抗α９インテグリン抗体は、優れたα９インテグリン機能抑制作用を示し、癌（例えば、癌細胞の増殖、転移）、炎症性疾患（例えば、関節リウマチ、変形性関節症、肝炎、気管支喘息、綿維症、糖尿病、動脈硬化、多発性硬化症、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病等））、感染症（例えば、肝炎）、自己免疫疾患（例えば、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、自己免疫性甲状腺疾患、尿細管間質性腎炎、重症筋無力症）および骨疾患（例えば、骨粗鬆症）等に対する治療効果を奏する。また、本発明の抗α９インテグリン抗体および抗α４インテグリン抗体の両者を含有する医薬組成物は、さらに改善された癌、炎症性疾患等の治療効果を奏する。本発明の抗体は、細胞や組織におけるα９インテグリンの発現を病理学的に検出できることから、診断薬としても利用できる。
抗ヒトα９インテグリン抗体（Ｋ３３ＮおよびＭ３５Ａ）の重鎖の相補認識領域（ＣＤＲ）を含む可変領域のアミノ酸配列を解析した結果を示す図である。Ｋ３３ＮおよびＭ３５Ａのそれぞれについて、２つの異なる配列解析ソフトウェアを使用した結果を示す。 抗ヒトα９インテグリン抗体（Ｋ３３ＮおよびＭ３５Ａ）の軽鎖の相補認識領域（ＣＤＲ）を含む可変領域のアミノ酸配列を解析した結果を示す図である。Ｋ３３ＮおよびＭ３５Ａのそれぞれについて、２つの異なる配列解析ソフトウェアを使用した結果を示す。 抗ヒトα９インテグリン抗体（本発明の２クローン（Ｋ３３Ｎ、Ｍ３５Ａ）、その他の５クローン（１Ｋ１１、２１Ｃ５、２４Ｉ１１、２５Ｂ６、２８Ｓ１）、およびＹ９Ａ２）の細胞接着阻害効果をヒトα９インテグリン発現細胞（ヒトメラノーマ細胞Ｇ３６１）とＯＰＮのα９インテグリン結合部位ペプチド（ＳＶＶＹＧＬＲ）で調べた結果を示す図である。陰性対照としてヒト・オステオポンチンに対するモノクローナル抗体（５Ａ１）を用いた。 抗ヒトα９インテグリン抗体（本発明の２クローン（Ｋ３３Ｎ、Ｍ３５Ａ）、その他の５クローン（１Ｋ１１、２１Ｃ５、２４Ｉ１１、２５Ｂ６、２８Ｓ１）、およびＹ９Ａ２）の細胞接着阻害効果をヒトα９インテグリン発現細胞（ヒトメラノーマ細胞Ｇ３６１）とテナイシンＣフラグメントのα９インテグリン結合部位ペプチドで調べた結果を示す図である。陰性対照としてヒト・オステオポンチンに対するモノクローナル抗体（５Ａ１）を用いた。 ヒトα９インテグリン発現細胞に対する新規な抗ヒトα９インテグリン抗体（Ｋ３３Ｎ）とＹ９Ａ２との競合反応を調べた結果を示す図である。

Claims (18)

  1. 　配列番号１～１２のうちのいずれかのアミノ酸配列を含有する、抗ヒトα９インテグリン抗体。
  2. 　配列番号１、３、５、７、９、または１１のアミノ酸配列を含有する抗ヒトα９インテグリン抗体。
  3. 　配列番号１、３、５、７、９、および１１のアミノ酸配列を含有する抗ヒトα９インテグリン抗体。
  4. 　配列番号２、４、６、８、１０、または１２のアミノ酸配列を含有する抗ヒトα９インテグリン抗体。
  5. 　配列番号２、４、６、８、１０、および１２のアミノ酸配列を含有する抗ヒトα９インテグリン抗体。
  6. 　重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲＨ）におけるアミノ酸配列として配列番号１～６のいずれかのアミノ酸配列を、軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲＬ）におけるアミノ酸配列として配列番号７～１２のいずれかのアミノ酸配列を含有する抗ヒトα９インテグリン抗体。
  7. 　ヒトα９インテグリンと、α９インテグリンのリガンドとの結合を阻害する、請求項１～６のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体。
  8. 　モノクローナル抗体である、請求項１～７のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体。
  9. 　キメラ抗体である、請求項１～８のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体。
  10. 　ヒト化抗体である、請求項１～８のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体。
  11. 　ヒト抗体である、請求項１～８のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体。
  12. 　受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０８３０またはＦＥＲＭ　ＢＰ－１０８３１で標示されるハイブリドーマ細胞により産生される抗ヒトα９インテグリン抗体。
  13. 　請求項１～１２のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体を有効成分として含む、癌、炎症性疾患、感染症、自己免疫疾患または骨疾患の治療剤。
  14. 　請求項１～１２のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体および抗ヒトα４インテグリン抗体の両方を有効成分として含む、癌、炎症性疾患、感染症、自己免疫疾患または骨疾患の治療剤。
  15. 　請求項１～１２のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体を有効成分として含む、癌、炎症性疾患、感染症、自己免疫疾患または骨疾患の診断剤。
  16. 　請求項１～１２のいずれかに記載の抗ヒトαインテグリン抗体を産生する細胞。
  17. 　受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０８３０またはＦＥＲＭ　ＢＰ－１０８３１で標示されるハイブリドーマ細胞。
  18. 　α９インテグリンのアミノ酸配列を含有するペプチドを用いることを特徴とする、α９インテグリンの活性を阻害する化合物のスクリーニング方法。
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