WO2010093036A1 - カチオン性のポリ(アミノ酸)およびその使用 - Google Patents
カチオン性のポリ(アミノ酸)およびその使用 Download PDFInfo
- Publication number
- WO2010093036A1 WO2010093036A1 PCT/JP2010/052176 JP2010052176W WO2010093036A1 WO 2010093036 A1 WO2010093036 A1 WO 2010093036A1 JP 2010052176 W JP2010052176 W JP 2010052176W WO 2010093036 A1 WO2010093036 A1 WO 2010093036A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- group
- carbon atoms
- poly
- groups
- sirna
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
- A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
- A61K48/0041—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being polymeric
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
- A61K47/645—Polycationic or polyanionic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. polylysine, polyarginine, polyglutamic acid or peptide TAT
- A61K47/6455—Polycationic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. for complexing nucleic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
- A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
- A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
- A61K9/5192—Processes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
- C07K14/003—Peptide-nucleic acids (PNAs)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
- C08G69/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carboxylic amide link in the main chain of the macromolecule
- C08G69/02—Polyamides derived from amino-carboxylic acids or from polyamines and polycarboxylic acids
- C08G69/08—Polyamides derived from amino-carboxylic acids or from polyamines and polycarboxylic acids derived from amino-carboxylic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
- C08G69/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carboxylic amide link in the main chain of the macromolecule
- C08G69/02—Polyamides derived from amino-carboxylic acids or from polyamines and polycarboxylic acids
- C08G69/08—Polyamides derived from amino-carboxylic acids or from polyamines and polycarboxylic acids derived from amino-carboxylic acids
- C08G69/10—Alpha-amino-carboxylic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
- C08G69/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carboxylic amide link in the main chain of the macromolecule
- C08G69/48—Polymers modified by chemical after-treatment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
- C12N2310/318—Chemical structure of the backbone where the PO2 is completely replaced, e.g. MMI or formacetal
- C12N2310/3181—Peptide nucleic acid, PNA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/35—Nature of the modification
- C12N2310/351—Conjugate
- C12N2310/3513—Protein; Peptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/30—Special therapeutic applications
- C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
Definitions
- the present invention relates to a cationic poly (amino acid) in which a hydrophobic group is introduced into a part of a side chain. More specifically, the present invention relates to a cationic poly (amino acid) having a side chain having a plurality of different amine functional groups in a portion containing a cationic group, and having a hydrophobic group introduced into a part of the side chain. And a polyion complex (PIC) of the poly (amino acid) and an oligo or polynucleotide.
- PIC polyion complex
- SiRNA can knock down target mRNA specifically and effectively, and therefore its expectation for its medical application is increasing.
- development of an effective delivery system is indispensable for applying siRNA to medical treatment.
- CNV age-related macular degeneration
- TLR-3 Toll-like receptor-3 on the cell surface
- Poly (L-lysine) and polyethyleneimine which have been known as cationic polymers that form DNA and polyion complex (PIC) to introduce genes into eukaryotic cells and express the genes, have gene expression efficiency.
- PIC polyion complex
- a wide variety of cationic polymers are provided.
- a poly (L-lysine) derivative having a hydrophilic group (for example, polyethylene glycol) and a hydrophobic group (for example, palmitoyl) introduced through the ⁇ -amino group of poly (L-lysine) can be used in an aqueous medium.
- Patent Document 1 Is known to form vesicles in the presence of cholesterol and to aggregate the plasmid DNA into which the gene is incorporated to form a stable complex (Patent Document 1). Also, a copolymer of poly (L-lysine) -poly (ethylene glycol), wherein the cationic charge and disulfide crosslinking density are controlled by thiolating the ⁇ -amino group of poly (L-lysine), and a plasmid PIC of DNA is known to exhibit high stability in extracellular media and effective release of the DNA in intracellular compartments (Non-patented, part of our inventors Reference 1).
- the PAsp (DET) and the block copolymer thereof disclosed in Patent Documents 2 and 3 show low toxicity and high gene transfer efficiency for target cells to which a nucleic acid molecule is to be delivered
- the object of the present invention is to exhibit higher stability under physiological conditions with small molecule nucleic acids such as siRNA and lower toxicity and higher gene transfer efficiency for target cells to which the nucleic acid molecule is to be delivered. It is to provide a synthetic polymer material that can be the carrier shown.
- a cationic poly (amino acid) having a side chain having a plurality of different amine functional groups in a portion containing a cationic group and having a hydrophobic group introduced in a part of the side chain is a nucleic acid molecule. It has been found that stable PICs can also be formed with small molecule nucleic acids such as siRNA with little or no toxicity to the target cells to be delivered. Furthermore, the PIC thus formed forms a relatively monodispersed stable aggregate having an average diameter of several hundred nm in an aqueous medium under a certain condition, and is taken up into a target cell with high efficiency, and siRNA is absorbed. It has also been found that the effects inherently possessed.
- the said subject is solved by providing the poly (amino acid) derivative represented by following formula (1) and Formula (2).
- R 1 represents a hydroxyl group, an unsubstituted or substituted linear or branched alkyloxy group having 1 to 12 carbon atoms, an unsubstituted or substituted linear or branched alkenyl group having 2 to 12 carbon atoms.
- R 2 represents a hydrogen atom, an unsubstituted or substituted linear or branched alkyl group having 1 to 12 carbon atoms, or an unsubstituted or substituted linear or branched alkylcarbonyl group having 1 to 24 carbon atoms.
- R 3a and R 3b each independently represent a methylene group or an ethylene group
- R 4a and R 4b are, independently of one another, the following groups: —NH— (CH 2 ) p1 — [NH— (CH 2 ) q1 —] r1 NH 2 (i); —NH— (CH 2 ) p2 —N [— (CH 2 ) q2 —NH 2 ] 2 (ii); —NH— (CH 2 ) p3 —N ⁇ [— (CH 2 ) q3 —NH 2 ] [— (CH 2 ) q4 —NH] r2 H ⁇ (Iii); and —NH— (CH 2 ) p4 —N ⁇ — (CH 2 ) q5 —N [— (CH 2 ) q6 —NH 2 ] 2 ⁇ 2 (iv) Selected from the same or different groups of groups consisting of: Here, p1 to p4,
- n is an integer of 30 to 5,000
- y is an integer of 0 to 5,000
- R 3a and R 3b are methylene groups
- y is an integer smaller than n.
- R 2 , R 3a , R 3b , R 4a , R 4b , n and y are as defined for the above formula (1)
- L 1 is —SS— or a valence bond
- L 2 is —NH—, —O—, —O (CH 2 ) p1 —NH—, or —L 2a — (CH 2 ) q1 —L 2b —, wherein p1 and q1 are independent of each other
- L 2a is OCO, OCONH, NHCO, NHCOO, NHCONH, CONH or COO
- L 2b is NH or O
- R 5 is a hydrogen atom or an unsubstituted or substituted linear or branched alkyl group having 1 to 12 carbon atoms
- m represents an integer of 30 to 20,000.
- FIG. 3 is a diagram showing the structural formulas of PAsp (DET) (left figure) and PAsp (DET) -ST produced by the method according to Example 1 (1). It is a photograph replacing a figure showing the result of the electrophoresis of polyacrylamide gel performed about PAPIC (DET) -ST19% formed by the method concerning Example 1 (2), and PIC of siRNA. It is the figure which displayed the result of having evaluated the particle size and polydispersity of the said PIC of Example 1 (2) by dynamic light scattering on the graph.
- the cationic poly (amino acid) of the present invention has pKa in multiple stages by having side chains having a plurality of different amine functional groups in the portion containing the cationic group, and physiological conditions At pH 7.4, a plurality of amine functional groups are partially protonated and can interact with nucleic acids to form a polyion complex (PIC).
- PIC polyion complex
- the PIC formed in this way is taken into endosomes (pH 5.5) and the protonation of the cationic polyamino acid further proceeds when the pH is lowered, and promotes endosome escape by the buffer effect (or proton sponge effect). This can be understood as reducing damage to cells.
- the cationic poly (amino acid) as described above according to the present invention has the above-described characteristics possessed by the cationic poly (amino acid) itself by making it a block copolymer with a PEG segment as in Patent Document 3. It is possible to form polymer micelles that exhibit good retention in circulating blood while retaining at least.
- alkyl moiety such as a linear or branched alkyl group having 1 to 12 carbon atoms or an alkyl-substituted imino group referred to in the definitions of R 1 and R 2 in formula (1) and formula (2) include: Examples thereof include a methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, n-butyl group, sec-butyl group, tert-butyl group, n-hexyl group, decyl group, and undecyl group.
- alkynyl moiety include those having a double bond or a triple bond in the above-exemplified alkyl group having 2 or more carbon atoms.
- the substituents when “substituted” include, but are not limited to, C 1-6 alkoxy groups, aryloxy groups, aryl C 1-3 oxy groups, cyano groups, carboxyls A group, amino group, C 1-6 alkoxycarbonyl group, C 2-7 acylamide group, tri-C 1-6 alkylsiloxy group, siloxy group, silylamino group, or acetalized formyl group, formyl group, halogen, Mention may be made of chlorine or fluorine.
- a display such as C 1-6 means 1 to 6 carbon atoms, and the same meaning is used hereinafter.
- the unsubstituted or substituted linear or branched alkylcarbonyl group having 1 to 12 carbon atoms in the unsubstituted or substituted linear or branched alkylcarbonyl group having 1 to 24 carbon atoms is as described above.
- Examples of the alkyl moiety having 13 or more carbon atoms include a tridecyl group, a tetradecyl group, a pentadecyl group, a nonadecyl group, a docosanyl group, and a tetracosyl group.
- a methylene group or an ethylene group in the definition of R 3a and R 3b are, in the case where a methylene group both of R 3a and R 3b, the repeating units with such a definition, poly (aspartic acid) derived units And the units each having these groups are understood to be present randomly.
- the repeating unit with such a definition represents a unit derived from poly (glutamic acid), where y is the integer 0, or This means a polymer in which ny is the integer 0.
- the former represents, for example, units derived from poly- ⁇ -glutamic acid obtained by polymerization of N-carboxylic acid anhydride of glutamic acid ⁇ -benzyl ester, while the latter represents, for example, bacterial Bacillus including Bacillus natto.
- This represents a unit derived from poly- ⁇ -glutamic acid produced by a genus strain.
- R 4a and R 4b NH— (CH 2 ) p1 — [NH— (CH 2 ) q1 —] r1 NH 2 (i); —NH— (CH 2 ) p2 —N [— (CH 2 ) q2 —NH 2 ] 2 (ii); —NH— (CH 2 ) p3 —N ⁇ [— (CH 2 ) q3 —NH 2 ] [— (CH 2 ) q4 —NH] r2 H ⁇ (Iii); and —NH— (CH 2 ) p4 —N ⁇ — (CH 2 ) q5 —N [— (CH 2 ) q6 —NH 2 ] 2 ⁇ 2 (iv)
- the groups selected from the group consisting of these groups are preferably the same group, and p1 to p4 and q1 to 6 are each independently preferably 2 or 3, but more preferably 2. On the other hand, it is preferable that r1 and
- the groups of R 4a and R 4b have 5 to 40%, preferably 10 to 30%, more preferably 15 to 25% of the total number, n or y, wherein at least one amino group hydrogen atom has 6 carbon atoms.
- the aliphatic hydrocarbon residue is saturated, it is equivalent to an alkyl group having 6 to 27 carbon atoms, and examples thereof include a pentacosyl group, a hexacosyl group, and a heptacosyl group in addition to the above alkyl group.
- the unsaturated aliphatic hydrocarbon residue corresponds to a group in which 1 to 5 carbon-carbon single bonds in the chain of the alkyl group are carbon-carbon double bonds.
- the acyl group (RCO-) having such a residue (R) include, but are not limited to, lauric acid (or dodecanoic acid), myristic acid (or tetradecanoic acid), palmitic acid (or hexadecanoic acid) ), Palmitooleic acid (or 9-hexadecenoic acid), stearic acid (or octadecanoic acid), oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, eleostearic acid (or 9,11,13-octadecatrienoic acid), arachidine Examples include acid, arachidonic acid, behenic acid, lignoceric acid, nervonic acid, serotic acid, and montanic acid.
- the sterol referred to in the present invention means a natural, semi-synthetic or synthetic compound based on a cyclopentanone hydrophenanthrene ring (C 17 H 28 ), and a derivative thereof.
- a natural sterol examples include, but are not limited to, cholesterol, cholestanol, dihydrocholesterol, cholic acid, campesterol, cystosterol, and the like.
- Semi-synthetic or synthetic compounds include, for example, synthetic precursors (for example, synthetic precursors ( If necessary, if present, certain functional groups, compounds wherein some or all of the hydroxy groups are protected by hydroxy protecting groups known in the art, or the carboxyl groups are protected by carboxyl protection Included).
- the sterol derivative means that a C 1-12 alkyl group and a halogen atom such as chlorine, bromine, and fluorine are introduced into the cyclopentanone hydrophenanthrene ring within a range that does not adversely affect the object of the present invention. It means that the ring system can be saturated, partially unsaturated, and the like.
- the residue of the sterol derivative is preferably a group in which the hydrogen atom of the 3-position hydroxy group of cholesterol, cholestanol or dihydroxycholesterol is removed. More preferably, it is a group from which the hydrogen atom of the hydroxyl group at the 3-position of cholesterol has been removed.
- the sterol of the steroloxycarbonyl group include those derived from animal and vegetable oils such as cholesterol, cholestanol, dihydrocholesterol, cholic acid, campesterol, and cystosterol.
- N which represents the number of amino acid repeating units, can be 30 to 5,000, but is 30 to 300, preferably 60 to 150, more preferably 60 to 100 in consideration of the convenience of synthesis. be able to.
- y can be 0 to 5,000, but considering the convenience of synthesis, it can be 30 to 300, preferably 60 to 150, and more preferably 60 to 100.
- a block copolymer represented by the formula (2) can also be provided.
- R 2 , R 3a , R 3b , R 4a , R 4b , n and y are defined for the formula (1) and have the same meaning as described above.
- L 1 is —SS— or a valence bond.
- L 2 is —NH—, —O—, —O (CH 2 ) p1 —NH—, or —L 2a — (CH 2 ) q1 —L 2b —, where p1 and q1 are Each independently represents an integer of 1 to 5, L 2a is OCO, OCONH, NHCO, NHCOO, NHCONH, CONH or COO, and L 2b is NH or O.
- L 1 and L 2 need to be combined so that they can be combined into one linking group.
- L 1 is not —SS— but a valence bond.
- Preferred for -L 1 -L 2- is that which forms a linking group when L 1 is -SS-.
- R 5 is a hydrogen atom or an unsubstituted or substituted linear or branched alkyl group having 1 to 12 carbon atoms, and the examples described for R 1 are applied to these examples.
- M representing the number of repeating units of ethylene glycol (or oxyethylene) represents an integer of 30 to 20,000, preferably 200 to 2000, more preferably 500 to 1000.
- the poly (amino acid) represented by the formula (1) is, for example, a polyamino acid ester produced by polymerization of an N-carboxylic acid anhydride derived from an aspartic acid ester or glutamic acid ester known per se, represented by R 4a and R 4b .
- a polyamine residue is introduced into the side chain of the poly (amino acid) by aminolysis using a polyamine corresponding to the polyamine residue of the group, and the amino group of the polyamine moiety thus introduced and the aliphatic hydrocarbon residue After activating the carboxyl group of the carboxylic acid corresponding to the acyl group it has if necessary, it can be produced by reacting an appropriate amount of such activated carboxylic acid with the amino group.
- the block copolymer of the formula (2) is produced according to the poly (amino acid) produced as described above and a polyethylene segment linking method known per se, or according to the method described in Non-Patent Document 3, It can be produced by producing a block copolymer having no hydrophobic group introduced therein and then reacting with an activated carboxylic acid. Introduction of a hydrophobic group other than the acyl group can also be carried out by reacting an amino group known in the art with an activated carbonic acid ester bearing the hydrophobic group.
- the polymers of the formula (1) and the formula (2) that can be provided as described above exhibit the above-described multi-stage pKa, and can form a polyion complex (PIC) with an anionically chargeable compound under physiological conditions.
- the anionically chargeable compound can be a protein, lipid, peptide, or nucleic acid, but conveniently forms a PIC with the nucleic acid. Therefore, for the purpose of simplifying the description, the nucleic acid and the cationic poly (amino acid) of the present invention will be described below. ) Or PIC with the block copolymer will be described.
- the cationic poly (amino acid) of the present invention has a vesicle or aggregate that is stable under physiological conditions even if it is PIC with a small molecular weight nucleic acid by having a hydrophobic group in the side chain.
- the nucleic acid capable of providing PIC according to the present invention using the cationic poly (amino acid) of the above formula (1) or the block copolymer of the formula (2) is based on a nucleotide consisting of a purine or pyrimidine base, a pentose, and a phosphate.
- Poly or oligonucleotide means oligo or poly double stranded RNA, oligo or poly double stranded DNA, oligo or poly single stranded DNA and oligo or poly single stranded RNA, and the same strand Also included are oligo or poly double stranded nucleic acids in which RNA and DNA are mixed, oligo or poly single stranded nucleic acids.
- the nucleotide contained in the nucleic acid may be a natural type or a non-natural type that has been chemically modified, or a molecule to which an amino group, a thiol group, a fluorescent compound, or the like is added. Also good.
- the nucleic acid may comprise 4 to 20,000 bases, preferably 10 to 10,000 bases, and more preferably 18 to 30 bases.
- plasmid DNA, siRNA, micro RNA, shRNA, antisense nucleic acid, decoy nucleic acid, aptamer, and ribozyme can be exemplified.
- siRNA can be any gene designed by a known method for a target gene or polynucleotide.
- the siRNA chain length is preferably 15 to 50 bases, more preferably 18 to 30 bases in the length of the portion constituting the duplex.
- Compounds known in the art, and similar All nucleotides having a specific action or function are included.
- the specific example of siRNA can be designed with reference to the gene which can be the target of gene therapy.
- Such genes include, but are not limited to, PKC ⁇ related to non-small cell lung cancer, BCL-2 related to malignant melanoma, etc., ICAM-1 related to Crohn's disease, hepatitis C HCV related to rheumatoid arthritis or psoriasis, adenosine AI receptor related to asthma, c-raf Kinase related to ovarian cancer, H-ras related to pancreatic cancer, coronary artery C-myc related to disease, PKA Ria related to colorectal cancer, HIV related to AIDS, DNA methyltransferase related to solid cancer, VEGF receptor related to cancer, related to kidney cancer Ribonucleotide reductase, CMV IE2 related to CMV retinitis, MMP-9 related to prostate cancer, related to malignant glioma TGF ⁇ 2, CD49d related to multiple sclerosis, PTP-1B related to diabetes, c-myb related to cancer, EGFR related to
- a PIC of a nucleic acid as described above and a compound represented by formula (1) or formula (2) there is provided a PIC of a nucleic acid as described above and a compound represented by formula (1) or formula (2).
- Such compounds of formula (1) or formula (2) and, for example, PICs of siRNA can generally be stable under physiological conditions when the N / P ratio is 2-60.
- N / P ratio [total number of amino groups and substituted amino groups in the polycation portion of the side chain] / [total number of phosphate groups in nucleic acid].
- the optimum N / P ratio varies depending on the proportion of hydrophobic groups in the total amino groups, but it cannot be specified. Generally, the N / P ratio is 5 or more, preferably 7 or more.
- a PIC can be prepared by mixing the compound of formula (1) and siRNA in the buffered aqueous solution as necessary so as to achieve the above N / P ratio.
- N-succinimidyl octadecanoate The synthesis of N-succinimidyl octadecanoate is described in the following paper [N. M.M. Howart, W.C. E. Lindsell, E .; Murray, P.M. N. Preson, Tetrahedron 61 (2005) 8875-8877. ] Was carried out.
- PAsp (DET) -ST stearoyl group-introduced PAsp (DET)
- BLA-NCA ⁇ -benzyl-L-aspartate-N-carboxylic acid anhydride
- PBLA poly ( ⁇ -benzyl-L-aspartate) (degree of polymerization 110) was synthesized.
- PBLA 513 mg was freeze-dried with benzene, dissolved in 25 mL of N-methyl-2-pyrrolidone (NMP), and 50 times equivalent of diethylenetriamine (DET) with 13.5 mL of NMP with respect to the PBLA side chain.
- NMP N-methyl-2-pyrrolidone
- DET diethylenetriamine
- the DET solution was added to the PBLA solution at 10 ° C. under argon and allowed to react for 1 hour.
- the cooled 0.01N HCl aqueous solution it dialyzed twice against 0.01N HCl, dialyzed against water at 4 ° C., and then recovered by lyophilization.
- PAsp (DET) synthesized in this way (left in FIG.
- Non-Patent Document 2 PAsp (DET) (100 mg, 0.366 mmol as the number of moles of Asp (DET) units) and DIPEA (638 ml, 3.66 mmol) were dissolved in 6 mL of methanol, and N-succin dissolved in 6 mL of DCM. Reaction with imidyl octadecanoate (27.8 mg, 0.073 mmol) at 4 ° C. for 24 hours.
- PAsp (DET) 100 mg, 0.366 mmol as the number of moles of Asp (DET) units
- DIPEA 638 ml, 3.66 mmol
- PAsp (DET) -ST having a stearoyl group introduction rate of 0, 12, 19% was added to 10 mM HEPES buffer (pH 7.3) or 50% ethanol solution (ethanol / 10 mM Hepes buffer, 1: 1 v / v) and mixed with siRNA (20 ⁇ M, 10 mM HEPES buffer (pH 7.3)) at different N / P ratios.
- the formation of the complex was confirmed by polyacrylamide electrophoresis (FIG. 2 shows the result of electrophoresis of the complex of PAsp (DET) -ST 19% and siRNA).
- N / P ratio in the case of PAsp (DET) is 1.4-2.5, and N / P ratio is 2.0-3 in the case of PAsp (DET) -ST. 5
- large aggregates of 200 nm or more are formed, and relatively monodisperse aggregates of 150-170 nm are formed only in the case of PAsp (DET) -ST when the N / P ratio is 3.5-4.0 or more. Been formed.
- PAsp (DET) the intensity of scattered light was weak and formation of aggregates was not confirmed.
- cDNA was prepared using TAKARA PrimeScript RT reagent kit, and mRNA amounts of Bcl-2 and GADPH (housekeeping gene as an internal standard) were compared with Real time PCR (ABI7500) using QuantTect SYBR Green PCR kit (Qiagen). Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
- siRNA targeting Bcl-2 (5′-CAG GAC CUC GCC GCU GCA GAC-3 ′; 3′-CGG UCC UGG AGC GGC GAC GUC UG-5 ′) ( Reference 1).
- PAsp (DET) -ST12% had an N / P ratio of 7.5 or more, and PAsp (DET) -ST19% was an endogenous gene at any N / P ratio, and apoptosis-inhibiting Bcl-2 mRNA. It was revealed that can be knocked down (FIG. 4).
- the non-specific cytotoxicity against Panc-1 cells associated with the above siRNA transfection was evaluated using Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Japan). No cytotoxicity was observed even at the N / P ratio (FIG. 5).
- VEGF vascular endothelial growth factor
- PAsp (DET) -ST 19% significantly knocked down the expression of VEGF at any N / P ratio, and its activity was comparable to that of Lipofectamine 2000 used as a positive control (FIG. 6).
- PEI ExGen
- FIG. 6 To evaluate the expression level of the protein level of VEGF ELISA (sandwich immunoassay kit (DVE00 , Quantkine (R) human VEGF, R & D Systems, Minneapolis, MN)) by.
- DVE00 Quantkine (R) human VEGF, R & D Systems, Minneapolis, MN)
- a stearoyl group was introduced into the side chain of PEG-SS-PAsp (DET) to the PAsp (DET) side chain.
- the stearoyl group introduction reaction was carried out by reacting N-succinimidyl octadecanoate in the same manner as in Example 1.
- N-succinimidyl octadecanoate corresponding to 20% of the side chain primary amino group was reacted with PEG-SS-PAsp (DET) having a degree of polymerization of PAsp (DET) of 59 and 98.
- HeLa cells (100,000 cells / well) were cultured on 6-well multiplates and cultured with PAsp (DET) -ST / siRNA and PEG-SS-PAsp (DET) -ST / siRNA complex for 3 hours. Thereafter, trypsinization was performed, and the average fluorescence intensity of Cy3 incorporated into the cells was evaluated by flow cytometry (BD TM LSR II flow cytometer). The results are shown in Table 1.
- siRNA transfection with PEG-SS-PAsp (DET) -ST / siRNA complex Human hepatoma Huh-7 cells were seeded in a 24 microwell plate (20,000 cells / well) and cultured overnight. Plasmid DNA expressing Firefly luciferase and Renilla luciferase was introduced using Lipofectamine 2000 (Invitrogen). 4 hours later, from PAsp (DET) -ST19%, PEG-SS-PAsp (DET) (59) -ST17% and PEG-SS-PAsp (DET) (98) -ST19% loaded with siRNA against Firefly luciferase Each siRNA complex formed was added to the medium and cultured for 48 hours.
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Polyamides (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本発明によれば、核酸の効果的なデリバリー系が提供される。具体的には、本発明は、カチオン性基を含む部分に異なる複数のアミン官能基を有する側鎖を有し、かつ該側鎖の一部に疎水性基が導入されたカチオン性ポリ(アミノ酸)、ならびに該ポリ(アミノ酸)とオリゴもしくはポリヌクレオチドとのポリイオンコンプレックス(PIC)を提供する。
Description
本発明は、側鎖の一部に疎水性基が導入されたカチオン性ポリ(アミノ酸)に関する。より具体的には、本発明はカチオン性基を含む部分に異なる複数のアミン官能基を有する側鎖を有し、かつ該側鎖の一部に疎水性基が導入されたカチオン性ポリ(アミノ酸)および該ポリ(アミノ酸)とオリゴもしくはポリヌクレオチドとのポリイオンコンプレックス(PIC)に関する。
siRNAは、標的mRNAを特異的かつ効果的にノックダウンできることから、その医療応用に対する期待が高まっているが、siRNAを医療に応用するには効果的なデリバリーシステムの開発が必要不可欠である。近年、臨床治験中であるnaked siRNAの眼球内投与による加齢黄斑変性(CNV)の治療効果が、siRNAによる配列特異的な遺伝子ノックダウン効果によるものではなく、細胞表面のToll様受容体-3(TLR-3)による認識を介した配列非特異的な効果によることが明らかにされ、いかなるsiRNAのin vivo応用においても、細胞外では安定であるが細胞内に的確にsiRNAを送達できるキャリヤーの開発が重要であると考えられている。
DNAとポリイオンコンプレックス(PIC)を形成して真核細胞に遺伝子を導入し、該遺伝子を発現するカチオン性ポリマーとして早くから知られていたポリ(L-リシン)やポリエチレンイミンは、遺伝子の発現効率があまり高くないか、また、細胞に対する毒性が高い等の問題があった。このような問題点を解決すべく多種多様のカチオン性ポリマーが提供されている。例えば、ポリ(L-リシン)のε-アミノ基を介して親水性基(例えば、ポリエチレングリコール)と疎水性基(例えば、パルミトイル)が導入されたポリ(L-リシン)誘導体は、水性媒体中においてコレステロールの存在下でベシクルを形成し、該ベシクルは遺伝子の組み込まれたプラスミドDNAを凝集し、安定な複合体を形成することが知られている(特許文献1)。また、ポリ(L-リシン)-ポリ(エチレングリコール)のコポリマーであって、ポリ(L-リシン)のε-アミノ基をチオレート化することによりカチオン荷電とジスルフィド架橋密度を調節したコポリマー誘導体とプラスミドDNAのPICは細胞外媒体中での高い安定性と細胞内コンパートメント内での効果的な該DNAの放出を示すことが知られている(本発明者らの一部を共著者とする非特許文献1)。また、本発明者等はこのような研究の一環として、側鎖にエチレンジアミン構造を有するポリ(N-[N-(2-アミノエチル)-2-アミノエチル]アスパルタミド(PAsp(DET))および該PAsp(DET)をブロックコポリマーの一ブロック成分として含むコポリマーを製造したところ、このようなポリマーは、低い細胞毒性を示し、しかも、プラスミドDNAを高効率で細胞内に導入し、該DNA中に組み込まれた遺伝子を効率よく発現することを確認した(非特許文献2、特許文献2、特許文献3参照)。
K.Mihata et al.,J.Am.Chem.Soc. 2004,126,2355-2361
K.Miyata et al.,J.Am.Chem.Soc. 2008,130,16287-16294
上記特許文献2および3に開示されたPAsp(DET)およびそのブロックコポリマーは、核酸分子を送達しようとする標的細胞に対して低い毒性と高い遺伝子導入効率を示すものの、上述したように、医療応用に対する期待が高まっているsiRNAのような小分子核酸と生理的条件下で必ずしも高い安定性を有するPICを形成できない場合がある。したがって、本発明の目的は、siRNAのような小分子核酸と生理的条件下でより高い安定性を示し、かつ、核酸分子を送達しようとする標的細胞に対して低い毒性と高い遺伝子導入効率を示すキャリヤーとなりうる合成ポリマー材料を提供することにある。
今ここに、カチオン性基を含む部分に異なる複数のアミン官能基を有する側鎖を有し、かつ該側鎖の一部に疎水性基が導入されたカチオン性ポリ(アミノ酸)は、核酸分子を送達しようとする標的細胞に対して全く毒性を示さないかまたは殆ど毒性を示すことなく、siRNAのような小分子核酸とも安定なPICを形成することができることが見出された。さらに、こうして形成するPICは、一定条件下、水性媒体中で平均直径百数nmの比較的単分散の安定な会合体を形成し、しかも、標的細胞に高効率で取り込まれ、かつ、siRNAが本来有している効果を奏することも見出された。
したがって、本発明によれば、下記式(1)および式(2)で表されるポリ(アミノ酸)誘導体を提供することにより、上記課題が解決される。
式中、
R1は、ヒドロキシル基、炭素数1~12の未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝状のアルキルオキシ基、炭素数2~12の未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝状のアルケニルオキシ基、炭素数1~12の未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝状のアルキニルオキシ基または炭素数1~12の未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝状のアルキル置換イミノ基を表し、
R2は、水素原子、炭素数1~12の未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝状のアルキル基または炭素数1~24の未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝状のアルキルカルボニル基を表し、
R3aおよびR3bは、相互に独立して、メチレン基またはエチレン基を表し、
R4aおよびR4bは、相互に独立して、下記の基:
-NH-(CH2)p1-〔NH-(CH2)q1-〕r1NH2 (i);
-NH-(CH2)p2-N〔-(CH2)q2-NH2〕2 (ii);
-NH-(CH2)p3-N{〔-(CH2)q3-NH2〕〔-(CH2)q4-NH〕r2H} (iii);および
-NH-(CH2)p4-N{-(CH2)q5-N〔-(CH2)q6-NH2〕2}2 (iv)
よりなる群の同一もしくは異なる基から選ばれ、
ここで、p1~p4、q1~6、およびr1~2は、それぞれ相互に独立して、1~5の整数であり、
R4aおよびR4bの基は、その総数の5~40%の少なくとも1つのアミノ基の水素原子が、炭素数6~27の飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分枝状の脂肪族炭化水素残基を有するアシル基、またはステロールオキシカルボニル基により置換されており、
nは、30~5、000の整数であり、
yは、0~5,000の整数であり、
但し、R3aおよびR3bがメチレン基の場合には、yはnより小さい整数である。
式中、R2、R3a、R3b、R4a、R4b、nおよびyは、上記式(1)について定義したのと同義であり、
L1は-S-S-または原子価結合であり、
L2は-NH-、-O-、-O(CH2)p1-NH-、または-L2a-(CH2)q1-L2b-であり、ここで、p1およびq1は、相互に独立して、1~5の整数であり、L2aはOCO、OCONH、NHCO、NHCOO、NHCONH、CONHまたはCOOであり、L2bはNHまたはOであり、
R5は、水素原子、または未置換もしくは置換された炭素数1~12の直鎖もしくは分枝状のアルキル基であり、そして
mは、30~20,000の整数を表す。
R1は、ヒドロキシル基、炭素数1~12の未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝状のアルキルオキシ基、炭素数2~12の未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝状のアルケニルオキシ基、炭素数1~12の未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝状のアルキニルオキシ基または炭素数1~12の未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝状のアルキル置換イミノ基を表し、
R2は、水素原子、炭素数1~12の未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝状のアルキル基または炭素数1~24の未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝状のアルキルカルボニル基を表し、
R3aおよびR3bは、相互に独立して、メチレン基またはエチレン基を表し、
R4aおよびR4bは、相互に独立して、下記の基:
-NH-(CH2)p1-〔NH-(CH2)q1-〕r1NH2 (i);
-NH-(CH2)p2-N〔-(CH2)q2-NH2〕2 (ii);
-NH-(CH2)p3-N{〔-(CH2)q3-NH2〕〔-(CH2)q4-NH〕r2H} (iii);および
-NH-(CH2)p4-N{-(CH2)q5-N〔-(CH2)q6-NH2〕2}2 (iv)
よりなる群の同一もしくは異なる基から選ばれ、
ここで、p1~p4、q1~6、およびr1~2は、それぞれ相互に独立して、1~5の整数であり、
R4aおよびR4bの基は、その総数の5~40%の少なくとも1つのアミノ基の水素原子が、炭素数6~27の飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分枝状の脂肪族炭化水素残基を有するアシル基、またはステロールオキシカルボニル基により置換されており、
nは、30~5、000の整数であり、
yは、0~5,000の整数であり、
但し、R3aおよびR3bがメチレン基の場合には、yはnより小さい整数である。
L1は-S-S-または原子価結合であり、
L2は-NH-、-O-、-O(CH2)p1-NH-、または-L2a-(CH2)q1-L2b-であり、ここで、p1およびq1は、相互に独立して、1~5の整数であり、L2aはOCO、OCONH、NHCO、NHCOO、NHCONH、CONHまたはCOOであり、L2bはNHまたはOであり、
R5は、水素原子、または未置換もしくは置換された炭素数1~12の直鎖もしくは分枝状のアルキル基であり、そして
mは、30~20,000の整数を表す。
上記式(1)および式(2)中の基もしくは部分、またはそれらについて定義する基は、特記しない限り、記載された方向性において共有結合されているものと理解されねばならない。ただし、上記式(1)および式(2)中の繰り返し数がn-yである反復単位および繰り返し数がyである反復単位の並び方は任意であり、ブロック、ランダム、交互等の任意の構造であり得る。
以下、本発明をより具体的に説明する。
理論により拘束されるものでないが、本発明のカチオン性ポリ(アミノ酸)は、カチオン性基を含む部分に異なる複数のアミン官能基を有する側鎖を有することによりpKaが複数段階を示し、生理条件であるpH7.4においては複数のアミン官能基は部分的にプロトン化状態にあり核酸と相互作用することによりポリイオンコンプレックス(PIC)を形成することができる。また、こうして形成されたPICはエンドソーム内(pH5.5)へ取り込まれてpHが下がるとカチオン性ポリアミノ酸のプロトン化がさらに進行し、バッファー効果(またはプロトンスポンジ効果)によりエンドソームエスケープを促進させることにより細胞に対するダメージを軽減するものと理解できる。一方で、カチオン性基を含む部分に一定の割合で疎水性基を導入すると、その導入が上記バッファー効果(またはプロトンスポンジ効果)に悪影響を及ぼすことなく、PICが疎水性相互作用によって安定化され、こうして平均直径百数nmの比較的単分散の安定な会合体を形成するものと理解される。また、本発明に従う、上記のようなカチオン性ポリ(アミノ酸)は、特許文献3のものと同様にPEGセグメントとのブロックコポリマーとすることにより該カチオン性ポリ(アミノ酸)それ自体が有する上記の特性を少なくとも保持したまま、循環血液中における良好な滞留性を示すポリマーミセルを形成できる。
式(1)および式(2)におけるR1およびR2の定義で称する、炭素数1~12の直鎖もしくは分枝状のアルキル基またはアルキル置換イミノ基等の該アルキル部分としては、例えば、メチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、n-ヘキシル基、デシル基、およびウンデシル基等を挙げることができる。炭素数2~12の未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝状のアルケニルオキシ基等または炭素数1~12の未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝状のアルキニルオキシ基等における、アルケニルまたはアルキニル部分は、炭素数が2以上の上記に例示したアルキル基中に二重結合または三重結合を含むものを挙げることができる。
このような基または部分について、「置換された」場合の置換基としては、限定されるものでないが、C1-6アルコキシ基、アリールオキシ基、アリールC1-3オキシ基、シアノ基、カルボキシル基、アミノ基、C1-6アルコキシカルボニル基、C2-7アシルアミド基、トリ-C1-6アルキルシロキシ基、シロキシ基、シリルアミノ基を示すか、またはアセタール化ホルミル基、ホルミル基、ハロゲン、塩素もしくはフッ素を挙げることができる。ここで、例えば、C1-6のごとき表示は、炭素数1~6を意味し、以下同様な意味を表すものとして使用する。さらに、炭素数1~24の未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝状のアルキルカルボニル基の内の炭素数1~12の未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝状のアルキル部分は上述した例示を参考にでき、炭素数13以上のアルキル部分は、例えば、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ノナデシル基、ドコサニル基およびテトラコシル基等を挙げることができる。
R3aおよびR3bの定義におけるメチレン基またはエチレン基が、R3aおよびR3bの両者ともメチレン基を表す場合には、このような定義を伴う反復単位は、ポリ(アスパラギン酸)由来の単位を表し、これらの基をそれぞれ有する単位はランダムに存在するものと理解されている。一方、R3aおよびR3bの両者がエチレン基を表す場合には、このような定義を伴う反復単位は、ポリ(グルタミン酸)由来の単位を表し、ここでは、yが整数0であるか、またはn-yが整数0であるポリマーを表すことになる。前者は、例えば、グルタミン酸γ-ベンジルエステルのN-カルボン酸無水物の重合により得られるポリ-α-グルタミン酸由来の単位を表し、一方後者は、例えば、納豆菌をはじめとする細菌バチルス(Bacillus)属の菌株が生産するポリ-γ-グルタミン酸由来の単位を表す。
R4aおよびR4bの基について定義する、
-NH-(CH2)p1-〔NH-(CH2)q1-〕r1NH2 (i);
-NH-(CH2)p2-N〔-(CH2)q2-NH2〕2 (ii);
-NH-(CH2)p3-N{〔-(CH2)q3-NH2〕〔-(CH2)q4-NH〕r2H} (iii);および
-NH-(CH2)p4-N{-(CH2)q5-N〔-(CH2)q6-NH2〕2}2 (iv)
よりなる群から選ばれる基は同一の基であることが好ましく、また、p1~p4およびq1~6はそれぞれ相互に独立して2または3であることが好ましいが、より好ましくは2である。一方、r1およびr2は、それぞれ相互に独立して、1~3の整数であることが好ましい。
-NH-(CH2)p1-〔NH-(CH2)q1-〕r1NH2 (i);
-NH-(CH2)p2-N〔-(CH2)q2-NH2〕2 (ii);
-NH-(CH2)p3-N{〔-(CH2)q3-NH2〕〔-(CH2)q4-NH〕r2H} (iii);および
-NH-(CH2)p4-N{-(CH2)q5-N〔-(CH2)q6-NH2〕2}2 (iv)
よりなる群から選ばれる基は同一の基であることが好ましく、また、p1~p4およびq1~6はそれぞれ相互に独立して2または3であることが好ましいが、より好ましくは2である。一方、r1およびr2は、それぞれ相互に独立して、1~3の整数であることが好ましい。
R4aおよびR4bの基は、その総数、nまたはyの5~40%、好ましくは10~30%、より好ましくは15~25%の基の少なくとも1のアミノ基の水素原子が炭素数6~27の飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分枝状の脂肪族炭化水素残基を有するアシル基またはステロールオキシカルボニル基により置換されている。脂肪族炭化水素残基が飽和である場合は、炭素数6~27のアルキル基に等価であり、上記アルキル基に加えてペンタコシル基、ヘキサコシル基、へプタコシル基等が例示される。不飽和の脂肪族炭化水素残基は、該アルキル基の鎖中の炭素-炭素単結合の1~5個が炭素-炭素二重結合となっている基に該当する。このような残基(R)を有するアシル基(RCO-)の例としては、限定されるものでないが、ラウリン酸(またはドデカン酸)、ミリスチン酸(またはテトラデカン酸)、パルミチン酸(またはヘキサデカン酸)、パルミトオレイン酸(または9-ヘキサデセン酸)、ステアリン酸(またはオクタデカン酸)、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、エレオステアリン酸(または9,11,13-オクタデカトリエン酸)、アラキジン酸、アラキドン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、ネルボン酸、セロチン酸、モンタン酸等を挙げることができる。
本発明にいう、ステロールとは、シクロペンタノンヒドロフェナントレン環(C17H28)をベースとする天然、半合成または合成の化合物、さらにはそれらの誘導体を意味し、例えば、天然のステロールとしては、限定されるものではないが、コレステロール、コレスタノール、ジヒドロコレステロール、コール酸、カンペステロール、シストステロール等が挙げられ、その半合成または合成の化合物としては、これら天然物の例えば、合成前駆体(必要により、存在する場合には、一定の官能基、ヒドロキシ基の一部もしくは全部が当該技術分野で既知のヒドロキシ保護基により保護されているか、またはカルボキシル基がカルボキシル保護により保護されている化合物を包含する)であることができる。また、ステロール誘導体とは、本発明の目的に悪影響を及ぼさない範囲内で、シクロペンタノンヒドロフェナントレン環にC1-12アルキル基、ハロゲン原子、例えば、塩素、臭素、フッ素、が導入されていてもよく、該環系は飽和、部分不飽和、であることができること等を意味する。ステロール誘導体の残基は、好ましくは、コレステロール、コレスタノール、ジヒドロキシコレステロールの3位ヒドロキシ基の水素原子が除去された基である。さらに好ましくは、コレステロール3位ヒドロキシ基の水素原子が除去された基である。ステロールオキシカルボニル基のステロールとしては、コレステロール、コレスタノール、ジヒドロコレステロール、コール酸、カンペステロール、シストステロール等の動植物油起源のものが挙げられる。
アミノ酸の反復単位の個数を表す、nは、30~5,000であることができるが、合成上の便宜を考慮すると、30~300、好ましくは60~150、さらに好ましくは60~100であることができる。また、yは、0~5,000であることができるが、合成上の便宜を考慮すると、30~300、好ましくは60~150、さらに好ましくは60~100であることができる。
本発明によれば、さらに式(2)で表されるブロックコポリマーも提供できる。式(2)において、式中、R2、R3a、R3b、R4a、R4b、nおよびyは、上記式(1)について定義し、上述したのと同義である。
L1は-S-S-または原子価結合である。一方、L2は-NH-、-O-、-O(CH2)p1-NH-、または-L2a-(CH2)q1-L2b-であり、ここで、p1およびq1は、相互に独立して、1~5の整数であり、L2aはOCO、OCONH、NHCO、NHCOO、NHCONH、CONHまたはCOOであり、L2bはNHまたはOである。上記定義において、L1およびL2は、一緒になって一つの連結基となり得るように組み合わされる必要がある。例えば、L2が-NH-である場合、L1は-S-S-でなく、原子価結合である。-L1-L2-で好ましいのは、L1は-S-S-である場合の連結基を形成するものである。
R5は、水素原子、または未置換もしくは置換された炭素数1~12の直鎖もしくは分枝状のアルキル基であり、これらの例示は、上記R1について説明したものが適用される。エチレングリコール(またはオキシエチレン)の反復単位の数を表すmは、30~20,000、好ましくは200~2000、より好ましくは、500~1000の整数を表す。
式(1)で表されるポリ(アミノ酸)は、例えば、それ自体公知のアスパラギン酸エステルまたはグルタミン酸エステル由来のN-カルボン酸無水物の重合により製造したポリアミノ酸エステルを、R4aおよびR4bの基のポリアミン残基に対応するポリアミンを用いてアミノリシスを行うことによりポリ(アミノ酸)の側鎖にポリアミン残基を導入し、こうして導入したポリアミン部分のアミノ基と、上記脂肪族炭化水素残基を有するアシル基に対応するカルボン酸のカルボキシル基を必要により活性化した後、上記アミノ基に対してかような活性化カルボン酸の適量を反応させることにより、製造することができる。式(2)のブロックコポリマーは、上記のように製造したポリ(アミノ酸)と、それ自体公知のポリエチレンセグメントの連結方法に従い製造するか、または非特許文献3に記載の方法に従い、上記ポリアミン残基に疎水性基が導入されていないブロックコポリマーを製造した後、活性化カルボン酸の反応を行うことにより製造できる。上記アシル基以外の疎水性基の導入も、当該技術分野に公知のアミノ基と該疎水性基を担持する活性炭酸エステル化物を反応させることにより、実施できる。
以上のようにして提供できる式(1)および式(2)のポリマーは、上述した複数段階のpKaを示すので、生理的条件下で、アニオン荷電性化合物とポリイオンコンプレックス(PIC)を形成できる。アニオン荷電性化合物はタンパク質、脂質、ペプチド、核酸であることができるが、核酸と都合よくPICを形成するので、以下、説明を簡略化する目的で、核酸と本発明のカチオン性のポリ(アミノ酸)またはそのブロックコポリマーとのPICについて説明する。
上述したとおり、本発明のカチオン性のポリ(アミノ酸)は、側鎖に疎水性基を有することにより、小分子量の核酸とのPICであっても生理的条件下で安定なベシクルまたは会合体を提供できる。上記式(1)のカチオン性のポリ(アミノ酸)または式(2)のブロックコポリマーを用いる本発明に従いPICを提供できる核酸は、プリンまたはピリミジン塩基、ペントース、リン酸からなるヌクレオチドを基本単位とするポリもしくはオリゴヌクレオチドを意味し、オリゴもしくはポリ二本鎖RNA、オリゴもしくはポリ二本鎖DNA、オリゴもしくはポリ一本鎖DNAおよびオリゴもしくはポリ一本鎖RNAを挙げることができ、また同一の鎖にRNAとDNAが混在したオリゴもしくはポリ2本鎖核酸、オリゴもしくはポリ1本鎖核酸も含まれる。また核酸に含有されるヌクレオチドは天然型であっても、化学修飾された非天然型のものであっても良く、またアミノ基、チオール基、蛍光化合物などの分子が付加されたものであっても良い。限定されるものでないが、該核酸は、4~20,000塩基、好ましくは10~10,000塩基、さらに好ましくは18~30塩基からなるものであることができる。また、機能もしくは作用を考慮すると、プラスミドDNA、siRNA、micro RNA、shRNA、アンチセンス核酸、デコイ核酸、アプタマーおよびリボザイムを挙げることができる。
例えば、siRNAは標的とする遺伝子またはポリヌクレオチドに対し、公知の方法で設計されたすべてのものを用いることができる。siRNAの鎖長は、二重鎖を構成する部分の長さが好ましくは15~50塩基、より好ましくは18~30塩基であることができ、当該技術分野で公知の化合物、また、それらと同様な作用または機能を有するすべてのヌクレオチドを包含する。限定されるものでないが、siRNAの具体例は、遺伝子療法の対象となりうる遺伝子を参照して設計することができる。このような遺伝子としては、限定されるものでないが、非小細胞肺癌等に関係のあるPKCα、悪性黒色腫等に関係のあるBCL-2、クローン病に関係のあるICAM-1、C型肝炎に関係のあるHCV、関節リュウマチもしくは乾癬に関係のあるTNFα、喘息に関係のあるアデノシンAI受容体、卵巣癌等に関係のあるc-raf kinase、膵臓癌等に関係のあるH-ras、冠動脈疾患に関係のあるc-myc、大腸癌に関係のあるPKA Ria、エイズに関係のあるHIV、固形癌に関係のあるDNAメチルトランスフェラーゼ、癌に関係のあるVEGF受容体、腎臓癌に関係のあるリボヌクレオチド還元酵素、CMV性網膜炎に関係のあるCMV IE2、前立腺癌に関係のあるMMP-9、悪性グリオーマに関係のあるTGFβ2、多発性硬化症に関係のあるCD49d、糖尿病に関係のあるPTP-1B、癌に関係のあるc-myb、乳癌等に関係のあるEGFR、癌に関係のあるmdr1、autotaxin及びGLUT-1の遺伝子を挙げることができる。アンチセンス核酸も当該術分野で公知ものまたはそれらと同様の機能または作用を有するすべてのものを本発明に従いPICを形成する対象とすることができる。
したがって、別の態様の本発明として、上記のような核酸と式(1)または式(2)で表される化合物のPICが提供される。このような式(1)または式(2)の化合物と、例えば、siRNAのPICは、N/P比が2~60であるとき一般に、生理的条件下で安定であることができる。
なお、N/P比=〔側鎖のポリカチオン部分のアミノ基と置換アミノ基の総数〕/〔核酸中のリン酸基の総数〕と定義できる。
式(1)の化合物においては、総アミノ基中に占める疎水性基の割合に至適のN/P比が変動するので特定できないが、一般に、N/P比が5以上、好ましくは7以上になるようにsiRNAとのPICを形成すると、循環血液中等の生理的条件下で平均粒径サイズが約百数十nmにある安定な会合体が提供できる。このようなPICは必要により緩衝化された水溶液中で式(1)の化合物とsiRNAを上記のN/P比となるように混合することにより調製できる。式(2)のブロックコポリマーを用い、特に、疎水性基の割合いが高くなると、かようなコポリマーのみでも水溶液中で自立的に会合して高分子ミセルを形成する傾向があるので、式(1)の化合物を用いる場合より、より広範なN/P比の下で安定なPICを形成できる。
以下、具体例を挙げて本発明をさらに説明するが、これらは例示の目的のためにのみ提供する。
N-スクシイミジルオクタデカノエートの合成
N-スクシンイミジルオクタデカノエートの合成は、以下の論文[N.M.Howarth,W.E.Lindsell,E.Murray,P.N.Preson,Tetrahedron 61(2005)8875-8887.]に従って行った。ステアリン酸(1.87g,6.56mmol)とN-ヒドロキシスクシンイミド(0.76g,6.56mmol)を80mLのジクロロメタン(DCM)に溶解し、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸(WSC)(1.25g,6.56mmol)と48時間反応させた。その後、水で洗浄し、DCMで2回抽出、MgSO2で乾燥することによって白色の粉末を得た(収量1.4g,収率56%)。ステアリン酸のカルボキシル基の転換率は、1H-NMRによって算出したところ96%であった。
N-スクシンイミジルオクタデカノエートの合成は、以下の論文[N.M.Howarth,W.E.Lindsell,E.Murray,P.N.Preson,Tetrahedron 61(2005)8875-8887.]に従って行った。ステアリン酸(1.87g,6.56mmol)とN-ヒドロキシスクシンイミド(0.76g,6.56mmol)を80mLのジクロロメタン(DCM)に溶解し、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸(WSC)(1.25g,6.56mmol)と48時間反応させた。その後、水で洗浄し、DCMで2回抽出、MgSO2で乾燥することによって白色の粉末を得た(収量1.4g,収率56%)。ステアリン酸のカルボキシル基の転換率は、1H-NMRによって算出したところ96%であった。
(1)ステアロイル基導入PAsp(DET)(PAsp(DET)-ST)の合成
n-ブチルアミンを開始剤として、β-ベンジル-L-アスパルテート-N-カルボン酸無水物(BLA-NCA)を開裂重合することによって、ポリ(β-ベンジル-L-アスパルテート)(PBLA)(重合度110)を合成した。次に、PBLA(513mg)をベンゼン凍結乾燥後、25mLのN-メチル-2-ピロリドン(NMP)に溶解し、PBLA側鎖に対して50倍当量のジエチレントリアミン(DET)を13.5mLのNMPと混合した後、10℃、アルゴン下で、DET溶液をPBLA溶液に加え、1時間反応させた。その後、冷却した0.01N HCl水溶液に加え、0.01N HClに対して2回透析を行い、4℃で水に対して透析を行った後、凍結乾燥によって回収した。このようにして合成されたPAsp(DET)(図1左)は、高いバッファー能を有する一方で、低pH環境に応答した細胞膜傷害活性を有しており、プラスミドDNAを効率的に細胞質内に輸送できることが確認されている(非特許文献2参照)。次に、PAsp(DET)(100mg,Asp(DET)ユニットのモル数として0.366mmol)とDIPEA(638ml,3.66mmol)を6mLのメタノールに溶解し、6mLのDCMに溶解したN-スクシンイミジルオクタデカノエート(27.8mg,0.073mmol)と4℃で24時間反応させた。反応後、ジエチルエテール中で再沈し、濾過したサンプルをメタノール/水(1:1 v/v)に溶解した後、4℃で0.01M HCl水溶液に対して3回、蒸留水に対して1回透析を行った。その後、凍結乾燥によって回収することによって、側鎖にステアロイル基が導入されたPAsp(DET)-STを合成した(図1右)。ポリマーの収率は90%以上であった。
n-ブチルアミンを開始剤として、β-ベンジル-L-アスパルテート-N-カルボン酸無水物(BLA-NCA)を開裂重合することによって、ポリ(β-ベンジル-L-アスパルテート)(PBLA)(重合度110)を合成した。次に、PBLA(513mg)をベンゼン凍結乾燥後、25mLのN-メチル-2-ピロリドン(NMP)に溶解し、PBLA側鎖に対して50倍当量のジエチレントリアミン(DET)を13.5mLのNMPと混合した後、10℃、アルゴン下で、DET溶液をPBLA溶液に加え、1時間反応させた。その後、冷却した0.01N HCl水溶液に加え、0.01N HClに対して2回透析を行い、4℃で水に対して透析を行った後、凍結乾燥によって回収した。このようにして合成されたPAsp(DET)(図1左)は、高いバッファー能を有する一方で、低pH環境に応答した細胞膜傷害活性を有しており、プラスミドDNAを効率的に細胞質内に輸送できることが確認されている(非特許文献2参照)。次に、PAsp(DET)(100mg,Asp(DET)ユニットのモル数として0.366mmol)とDIPEA(638ml,3.66mmol)を6mLのメタノールに溶解し、6mLのDCMに溶解したN-スクシンイミジルオクタデカノエート(27.8mg,0.073mmol)と4℃で24時間反応させた。反応後、ジエチルエテール中で再沈し、濾過したサンプルをメタノール/水(1:1 v/v)に溶解した後、4℃で0.01M HCl水溶液に対して3回、蒸留水に対して1回透析を行った。その後、凍結乾燥によって回収することによって、側鎖にステアロイル基が導入されたPAsp(DET)-STを合成した(図1右)。ポリマーの収率は90%以上であった。
(2)PAsp(DET)-STとsiRNAのコンプレックス形成
ステアロイル基の導入率が0,12,19%のPAsp(DET)-STを10mM HEPES緩衝液(pH7.3)もしくは50%エタノール溶液(エタノール/10mM Hepes緩衝液,1:1 v/v)に溶解し、異なるN/P比でsiRNA(20μM,10mM HEPES buffer(pH7.3))と混合した。コンプレックスの形成の確認は、ポリアクリルアミド電気泳動によって行った(図2にPAsp(DET)-ST19%とsiRNAのコンプレックスの電気泳動の結果を示す)。その結果、どのポリマーを用いた場合にも一定のN/P比以上(PAsp(DET)-ST19%の場合は、N/P比が2.5以上)でフリーのsiRNAのバンドが観察されなくなり、PAsp(DET)もしくはPAsp(DET)-STによるsiRNAのコンプレックス化が起こっていることが示唆された。次に、PAsp(DET)-ST/siRNAの粒径および多分散度(polydispersity index,PDI)を動的光散乱(Dynamic light scattering Zetasizer(Malvern Instruments,Worcestershire,U.K.))によって評価した(図3)。その結果、比較的低いN/P比(PAsp(DET)の場合はN/P比が1.4-2.5、PAsp(DET)-STの場合はN/P比が2.0-3.5)では200nm以上の大きな凝集体が形成され、N/P比が3.5-4.0以上ではPAsp(DET)-STの場合においてのみ150-170nmの比較的単分散な会合体が形成された。一方、PAsp(DET)の場合には、散乱光強度が弱く会合体の形成が確認されなかった。
ステアロイル基の導入率が0,12,19%のPAsp(DET)-STを10mM HEPES緩衝液(pH7.3)もしくは50%エタノール溶液(エタノール/10mM Hepes緩衝液,1:1 v/v)に溶解し、異なるN/P比でsiRNA(20μM,10mM HEPES buffer(pH7.3))と混合した。コンプレックスの形成の確認は、ポリアクリルアミド電気泳動によって行った(図2にPAsp(DET)-ST19%とsiRNAのコンプレックスの電気泳動の結果を示す)。その結果、どのポリマーを用いた場合にも一定のN/P比以上(PAsp(DET)-ST19%の場合は、N/P比が2.5以上)でフリーのsiRNAのバンドが観察されなくなり、PAsp(DET)もしくはPAsp(DET)-STによるsiRNAのコンプレックス化が起こっていることが示唆された。次に、PAsp(DET)-ST/siRNAの粒径および多分散度(polydispersity index,PDI)を動的光散乱(Dynamic light scattering Zetasizer(Malvern Instruments,Worcestershire,U.K.))によって評価した(図3)。その結果、比較的低いN/P比(PAsp(DET)の場合はN/P比が1.4-2.5、PAsp(DET)-STの場合はN/P比が2.0-3.5)では200nm以上の大きな凝集体が形成され、N/P比が3.5-4.0以上ではPAsp(DET)-STの場合においてのみ150-170nmの比較的単分散な会合体が形成された。一方、PAsp(DET)の場合には、散乱光強度が弱く会合体の形成が確認されなかった。
以上の結果より、PAsp(DET)の側鎖に疎水性基としてステアロイル基を導入することによって、コンプレックスが疎水性相互作用によって安定化され、ナノ粒子が形成されたものと考えられる。
(1)PAsp(DET)-ST/siRNAコンプレックスによる内在性遺伝子Bcl-2のノックダウン
ヒト膵がんPanc-1細胞を6ウェルプレートに播種した(100,000cells/well)。1晩培養した後、Bcl-2を標的とするsiRNAを上述のようにPAsp(DET)およびPAsp(DET)-STとコンプレックス化し、細胞と48時間培養した(siRNA濃度:100nM)。その後、細胞をトリプシン処理によって回収し、Rneasy Mini kit(Qiagen)を用いて全RNAを回収した。次に、TAKARA PrimeScript RT reagent kitを用いてcDNAを調製し、Bcl-2およびGADPH(内部標準としてのハウスキーピング遺伝子)のmRNA量をQuantiTect SYBR Green PCR kit(Qiagen)を用いたReal time PCR(ABI7500 Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA))によって評価した。ここで、Bcl-2を標的とするsiRNAとして、以下の配列を使用した(5’-CAG GAC CUC GCC GCU GCA GAC-3’;3’-CGG UCC UGG AGC GGC GAC GUC UG-5’)(参考文献1)。その結果、PAsp(DET)-ST12%はN/P比が7.5以上、PAsp(DET)-ST19%はどのN/P比においても内在性遺伝子でありアポトーシス抑制性のBcl-2のmRNAをノックダウンできることが明らかとなった(図4)。また、上記のsiRNAトランスフェクション(40時間培養)に伴うPanc-1細胞に対する非特異的な細胞毒性をCell Counting Kit-8(Dojindo,Japan)を用いて評価したところ、いずれのステアロイル基の導入率、N/P比においても細胞毒性が認められなかった(図5)。
ヒト膵がんPanc-1細胞を6ウェルプレートに播種した(100,000cells/well)。1晩培養した後、Bcl-2を標的とするsiRNAを上述のようにPAsp(DET)およびPAsp(DET)-STとコンプレックス化し、細胞と48時間培養した(siRNA濃度:100nM)。その後、細胞をトリプシン処理によって回収し、Rneasy Mini kit(Qiagen)を用いて全RNAを回収した。次に、TAKARA PrimeScript RT reagent kitを用いてcDNAを調製し、Bcl-2およびGADPH(内部標準としてのハウスキーピング遺伝子)のmRNA量をQuantiTect SYBR Green PCR kit(Qiagen)を用いたReal time PCR(ABI7500 Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA))によって評価した。ここで、Bcl-2を標的とするsiRNAとして、以下の配列を使用した(5’-CAG GAC CUC GCC GCU GCA GAC-3’;3’-CGG UCC UGG AGC GGC GAC GUC UG-5’)(参考文献1)。その結果、PAsp(DET)-ST12%はN/P比が7.5以上、PAsp(DET)-ST19%はどのN/P比においても内在性遺伝子でありアポトーシス抑制性のBcl-2のmRNAをノックダウンできることが明らかとなった(図4)。また、上記のsiRNAトランスフェクション(40時間培養)に伴うPanc-1細胞に対する非特異的な細胞毒性をCell Counting Kit-8(Dojindo,Japan)を用いて評価したところ、いずれのステアロイル基の導入率、N/P比においても細胞毒性が認められなかった(図5)。
(2)PAsp(DET)-ST/siRNAコンプレックスによる内在性遺伝子VEGFのノックダウン
PAsp(DET)-ST19%とsiRNAを異なるN/P比で混合し、調製したコンプレックスをヒト子宮頸がんHeLa細胞と48時間培養し、上記と同様に、Real time PCRによって血管内皮細胞増殖因子(VEGF)のmRNA量を定量した(内部標準としてはActinを使用)(図6)。ここで、使用したVEGF標的siRNAの配列は以下の通りである(GGA GUA CCC UGA UGA GAU CdTdT;GAU CUC AUC AGG GUA CUC CdTdT)。その結果、PAsp(DET)-ST19%はどのN/P比においてもVEGFの発現を有意にノックダウンし、その活性はポジティブコントロールとして使用したLipofectamine2000と同程度であった(図6)。一方、PEI(ExGen)では有意な遺伝子ノックダウン効果は得られなかった(図6)。次に、VEGFのタンパク質レベルでの発現量をELISA(sandwich immunoassay kit(DVE00,Quantkine(R) human VEGF,R&D Systems,Minneapolis,MN))によって評価した。その結果、PAsp(DET)-ST19%は、タンパク質レベルでも配列特異的にVEGFの発現量を抑制することが明らかとなった(図7)。
PAsp(DET)-ST19%とsiRNAを異なるN/P比で混合し、調製したコンプレックスをヒト子宮頸がんHeLa細胞と48時間培養し、上記と同様に、Real time PCRによって血管内皮細胞増殖因子(VEGF)のmRNA量を定量した(内部標準としてはActinを使用)(図6)。ここで、使用したVEGF標的siRNAの配列は以下の通りである(GGA GUA CCC UGA UGA GAU CdTdT;GAU CUC AUC AGG GUA CUC CdTdT)。その結果、PAsp(DET)-ST19%はどのN/P比においてもVEGFの発現を有意にノックダウンし、その活性はポジティブコントロールとして使用したLipofectamine2000と同程度であった(図6)。一方、PEI(ExGen)では有意な遺伝子ノックダウン効果は得られなかった(図6)。次に、VEGFのタンパク質レベルでの発現量をELISA(sandwich immunoassay kit(DVE00,Quantkine(R) human VEGF,R&D Systems,Minneapolis,MN))によって評価した。その結果、PAsp(DET)-ST19%は、タンパク質レベルでも配列特異的にVEGFの発現量を抑制することが明らかとなった(図7)。
(1)PEG-SS-PAsp(DET)-STの合成
参考文献2に従って、生体内で開裂するジスルフィド(SS)結合でポリエリレングリコール(PEG)とPAsp(DET)が連結されたPEG-SS-PAsp(DET)を合成した。具体的には、PEG-SS-NH2を開始剤として、塩化メチレン中でBLA-NCAを開環重合することによって、PBLAの重合度が59および98のPEG-SS-PBLAを得た。次に、PEG-SS-PBLAをNMPに溶解し、5℃でDETと40分間反応させた。その後、反応物は25%の酢酸水溶液で中和し、0.01NのHClに対して4℃で透析、さらに凍結乾燥を行うことによって0.27g.のPEG-SS-PAsp(DET)を合成した。
参考文献2に従って、生体内で開裂するジスルフィド(SS)結合でポリエリレングリコール(PEG)とPAsp(DET)が連結されたPEG-SS-PAsp(DET)を合成した。具体的には、PEG-SS-NH2を開始剤として、塩化メチレン中でBLA-NCAを開環重合することによって、PBLAの重合度が59および98のPEG-SS-PBLAを得た。次に、PEG-SS-PBLAをNMPに溶解し、5℃でDETと40分間反応させた。その後、反応物は25%の酢酸水溶液で中和し、0.01NのHClに対して4℃で透析、さらに凍結乾燥を行うことによって0.27g.のPEG-SS-PAsp(DET)を合成した。
次に、PEG-SS-PAsp(DET)のPAsp(DET)側鎖へのステアロイル基の導入反応を行った。ステアロイル基の導入反応は、実施例1と同様にN-スクシンイミジルオクタデカノエートを反応させることによって行った。ここでは、PAsp(DET)の重合度が59および98のPEG-SS-PAsp(DET)について側鎖1級アミノ基に対する20%に相当するN-スクシンイミジルオクタデカノエートを反応させたところ、それぞれ17%および19%の側鎖にステアロイル基が導入されたPEG-SS-PAsp(DET)-STが合成された。これらのポリマーは、10mM HEPES緩衝液(pH7.3)に溶解し、N/P=5.0になるようにsiRNAと混合することによってコンプレックスを形成させた。このようにして形成されたコンプレックスは、PAsp(DET)-ST/siRNAのコンプレックスが生体適合性のPEGの外殻で覆われたポリマーミセル構造をとるものと考えられ、さらに生体内ではPEGが徐々に脱離することによって、全身投与によるsiRNAデリバリーにおいて血中での高い安定性と標的組織での効率的なsiRNAの導入が両立できるものと考えられる(図8)。
(2)PEG-SS-PAsp(DET)-ST/siRNAコンプレックスの細胞内取り込みの評価
PEG-SS-PAsp(DET)-ST/siRNAコンプレックス(N/P=5.0)は、表面がPEGの外殻で覆われた二層構造を有するものと考えられ、カチオン性の表面を有するPAsp(DET)-ST/siRNAコンプレックスとは異なる細胞内取り込みを示す可能性がある。そこで、蛍光色素Cy5で標識されたsiRNAを用いてコンプレックスを形成し、その細胞内取り込み量を評価した。HeLa細胞(100,000cells/well)を6ウェルマルチプレート上で培養し、PAsp(DET)-ST/siRNAおよびPEG-SS-PAsp(DET)-ST/siRNAコンプレックスと3時間培養した。その後、トリプシン処理を行い、細胞に取り込まれたCy3の平均の蛍光強度をフローサイトメトリー(BDTM LSR II flow cytometer)により評価した。結果を表1に示す。
PEG-SS-PAsp(DET)-ST/siRNAコンプレックス(N/P=5.0)は、表面がPEGの外殻で覆われた二層構造を有するものと考えられ、カチオン性の表面を有するPAsp(DET)-ST/siRNAコンプレックスとは異なる細胞内取り込みを示す可能性がある。そこで、蛍光色素Cy5で標識されたsiRNAを用いてコンプレックスを形成し、その細胞内取り込み量を評価した。HeLa細胞(100,000cells/well)を6ウェルマルチプレート上で培養し、PAsp(DET)-ST/siRNAおよびPEG-SS-PAsp(DET)-ST/siRNAコンプレックスと3時間培養した。その後、トリプシン処理を行い、細胞に取り込まれたCy3の平均の蛍光強度をフローサイトメトリー(BDTM LSR II flow cytometer)により評価した。結果を表1に示す。
その結果、siRNA濃度が100nMの場合には、PEG-SS-PAsp(DET)-ST/siRNAコンプレックスの細胞内取り込み量は、PAsp(DET)-ST/siRNAのそれよりも低かったが、コンプレックスの濃度を高めることによってPEG-SS-PAsp(DET)-ST/siRNAコンプレックスは、PAsp(DET)-ST/siRNAと同程度まで細胞内に取り込まれることが明らかとなった。
(3)PEG-SS-PAsp(DET)-ST/siRNAコンプレックスによるsiRNAトランスフェクション
ヒト肝がんHuh-7細胞を24マイクロウェルプレートに播種し(20,000cells/well)、1晩培養した後、Firefly luciferaseとRenilla luciferaseを発現するプラスミドDNAをLipofectamine 2000(Invitrogen)を用いて遺伝子導入した。その4時間後、Firefly luciferase に対するsiRNAを搭載したPAsp(DET)-ST19%、PEG-SS-PAsp(DET)(59)-ST17%およびPEG-SS-PAsp(DET)(98)-ST19%より形成されたsiRNAコンプレックスをそれぞれ培地中に加え、48時間培養した。その後、siRNAによる遺伝子ノックダウン効率は、Dual-Luciferase Reporter Assasy Kit(Promega)を用いて、Renilla luciferaseに対するFirefly luciferaseの発現量より算出した。その結果、100nM siRNAでは、PEG-SS-PAsp(DET)-ST/siRNAコンプレックスは、有意な遺伝子ノックダウン効果を示さなかったが、300および500nM siRNAではコンプレックス濃度依存的な遺伝子ノックダウン活性を示した(図9)。この結果は、表1の細胞内取り込みの結果によく対応しており、ポリマーミセル構造を有するコンプレックスは細胞内に取り込まれた後、効率的にエンドソームから脱出し、細胞質内で効率的にsiRNAを機能発現させることができるものと考えられる。
ヒト肝がんHuh-7細胞を24マイクロウェルプレートに播種し(20,000cells/well)、1晩培養した後、Firefly luciferaseとRenilla luciferaseを発現するプラスミドDNAをLipofectamine 2000(Invitrogen)を用いて遺伝子導入した。その4時間後、Firefly luciferase に対するsiRNAを搭載したPAsp(DET)-ST19%、PEG-SS-PAsp(DET)(59)-ST17%およびPEG-SS-PAsp(DET)(98)-ST19%より形成されたsiRNAコンプレックスをそれぞれ培地中に加え、48時間培養した。その後、siRNAによる遺伝子ノックダウン効率は、Dual-Luciferase Reporter Assasy Kit(Promega)を用いて、Renilla luciferaseに対するFirefly luciferaseの発現量より算出した。その結果、100nM siRNAでは、PEG-SS-PAsp(DET)-ST/siRNAコンプレックスは、有意な遺伝子ノックダウン効果を示さなかったが、300および500nM siRNAではコンプレックス濃度依存的な遺伝子ノックダウン活性を示した(図9)。この結果は、表1の細胞内取り込みの結果によく対応しており、ポリマーミセル構造を有するコンプレックスは細胞内に取り込まれた後、効率的にエンドソームから脱出し、細胞質内で効率的にsiRNAを機能発現させることができるものと考えられる。
(参考文献1)
M.Ocker,D.Neureiter,M.Lueders,S.Zopf,M.Ganslmayer,E.G.Hahn,C.Herold,D.Schuppan,Gut 54:1298-1308(2005)
(参考文献2)
S.Takae,Y.Akiyama,Y.Yamasaki,Y.Nagasaki,K.Kataoka,Colloidal Au replacement assay for highly sensitive quantification of low molecular weight analytes by surface plasmon resonance.Bioconjugate Chem.18(4):1241-1245(2007)
M.Ocker,D.Neureiter,M.Lueders,S.Zopf,M.Ganslmayer,E.G.Hahn,C.Herold,D.Schuppan,Gut 54:1298-1308(2005)
(参考文献2)
S.Takae,Y.Akiyama,Y.Yamasaki,Y.Nagasaki,K.Kataoka,Colloidal Au replacement assay for highly sensitive quantification of low molecular weight analytes by surface plasmon resonance.Bioconjugate Chem.18(4):1241-1245(2007)
Claims (10)
- 下記式(1)で表されるカチオン性のポリ(アミノ酸):
R1は、ヒドロキシル基、炭素数1~12の未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝状のアルキルオキシ基、炭素数2~12の未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝状のアルケニルオキシ基、炭素数1~12の未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝状のアルキニルオキシ基または炭素数1~12の未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝状のアルキル置換イミノ基を表し、
R2は、水素原子、炭素数1~12の未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝状のアルキル基または炭素数1~24の未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝状のアルキルカルボニル基を表し、
R3aおよびR3bは、相互に独立して、メチレン基またはエチレン基を表し、
R4aおよびR4bは、相互に独立して、下記の基:
-NH-(CH2)p1-〔NH-(CH2)q1-〕r1NH2(i);
-NH-(CH2)p2-N〔-(CH2)q2-NH2〕2 (ii);
-NH-(CH2)p3-N{〔-(CH2)q3-NH2〕〔-(CH2)q4-NH〕r2H} (iii);および
-NH-(CH2)p4-N{-(CH2)q5-N〔-(CH2)q6-NH2〕2}2 (iv)
よりなる群の同一もしくは異なる基から選ばれ、
ここで、p1~p4、q1~6、およびr1~2は、それぞれ相互に独立して、1~5の整数であり、
R4aおよびR4bの基は、その総数の5~40%の少なくとも1つのアミノ基の水素原子が、炭素数6~27の飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分枝状の脂肪族炭化水素残基を有するアシル基またはステロールオキシカルボニル基により置換されており、
nは、30~5、000の整数であり、
yは、0~5,000の整数であり、
但し、R3aおよびR3bがメチレン基の場合には、yはnより小さい整数である。 - 請求項1記載のカチオン性のポリ(アミノ酸)であって、式(1)における、R3aおよびR3bは、相互に独立して、メチレン基を表す、上記のポリ(アミノ酸)。
- 請求項1記載のカチオン性のポリ(アミノ酸)であって、式(1)における、R3aがエチレン基を表し、かつ、yが0である、上記のポリ(アミノ酸)。
- 請求項1または2に記載のカチオン性のポリ(アミノ酸)であって、R4aおよびR4bが、相互に独立して、下記の基:
-NH-(CH2)p1-〔NH-(CH2)q1-〕r1NH2 (i);
を表し、ここで、p1およびq1が相互に独立して2または3であり、そしてr1が1~3の整数であり、
R4aおよびR4bの基は、その総数の10~30%のアミノ基の水素原子が、炭素数6~27の飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分枝状の脂肪族炭化水素残基を有するアシル基により置換されている、上記のポリ(アミノ酸)。 - 請求項3に記載のカチオン性のポリ(アミノ酸)であって、R4aが下記の基:
-NH-(CH2)p1-〔NH-(CH2)q1-〕r1NH2 (i);
を表し、ここで、p1およびq1が相互に独立して2または3であり、そしてr1が1~3の整数であり、
R4aの基は、その総数の10~30%のアミノ基の水素原子が、炭素数6~27の飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分枝状の脂肪族炭化水素残基を有するアシル基により置換されている、上記のポリ(アミノ酸)。 - 下記式(2)で表されるブロックコポリマー:
について定義したのと同義であり、
L1は-S-S-または原子価結合であり、
L2は-NH-、-O-、-O(CH2)p1-NH-、または-L2a-(CH2)q1-L2b-であり、ここで、p1およびq1は、相互に独立して、1~5の整数であり、L2aはOCO、OCONH、NHCO、NHCOO、NHCONH、CONHまたはCOOであり、L2bはNHまたはOであり、
R5は、水素原子、または未置換もしくは置換された炭素数1~12の直鎖もしくは分枝状のアルキル基であり、そして
mは、30~20,000の整数を表す。 - 請求項1~5のいずれかの1に記載のポリ(アミノ酸)と核酸のポリイオンコンプレックス。
- 請求項6に記載ブロックコポリマーと核酸のポリイオンコンプレックス。
- 核酸が、プラスミドDNA、siRNA、micro RNA、アンチセンス核酸、デコイ核酸、アプタマーおよびリボザイムよりなる群から選ばれる、請求項7記載のポリイオンコンプレックス。
- 核酸が、プラスミドDNA、siRNA、micro RNA、アンチセンス核酸、デコイ核酸、アプタマーおよびリボザイムよりなる群から選ばれる、請求項8記載のポリイオンコンプレックス。
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
ES10741313.0T ES2477416T3 (es) | 2009-02-13 | 2010-02-15 | Poliamino�cidos cati�nicos y usos de los mismos |
JP2010524300A JP4582821B2 (ja) | 2009-02-13 | 2010-02-15 | カチオン性のポリ(アミノ酸)およびその使用 |
EP10741313.0A EP2399948B1 (en) | 2009-02-13 | 2010-02-15 | Cationic poly-amino acids and uses thereof |
US13/147,319 US8546487B2 (en) | 2009-02-13 | 2010-02-15 | Cationic poly (amino acids) and uses thereof |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2009031799 | 2009-02-13 | ||
JP2009-031799 | 2009-02-13 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
WO2010093036A1 true WO2010093036A1 (ja) | 2010-08-19 |
Family
ID=42561877
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PCT/JP2010/052176 WO2010093036A1 (ja) | 2009-02-13 | 2010-02-15 | カチオン性のポリ(アミノ酸)およびその使用 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8546487B2 (ja) |
EP (1) | EP2399948B1 (ja) |
JP (1) | JP4582821B2 (ja) |
ES (1) | ES2477416T3 (ja) |
WO (1) | WO2010093036A1 (ja) |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2018110366A1 (ja) * | 2016-12-15 | 2018-06-21 | 国立大学法人東京工業大学 | pH応答性ポリマー及び薬物送達システム |
CN109161019A (zh) * | 2018-08-24 | 2019-01-08 | 兰州交通大学 | 一种β-二羰基化合物改性聚天冬氨酸的制备方法 |
WO2020116635A1 (ja) | 2018-12-07 | 2020-06-11 | 国立大学法人 東京大学 | 輸送担体を用いた環状化合物の送達 |
US11020418B2 (en) | 2012-04-27 | 2021-06-01 | Nanocarrier Co., Ltd. | Unit structure-type pharmaceutical composition for nucleic acid delivery |
US11066665B2 (en) | 2015-11-19 | 2021-07-20 | Public University Corporation Nagoya City University | Antitumor drug delivery formulation |
JP2021522385A (ja) * | 2018-04-27 | 2021-08-30 | ジーンエディット インコーポレイテッド | カチオン性ポリマーおよびその生体分子送達のための使用 |
US11324835B2 (en) | 2017-08-31 | 2022-05-10 | Kawasaki Institute Of Industrial Promotion | Nucleic acid-loaded unit polyion complex |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP4655298B1 (ja) | 2010-02-23 | 2011-03-23 | ナノキャリア株式会社 | 短鎖のカチオン性ポリアミノ酸およびその使用 |
CA2804815C (en) * | 2010-07-09 | 2016-06-07 | The University Of Tokyo | Nucleic acid delivery composition and carrier composition, pharmaceutical composition using the same, and method for nucleic acid delivery |
WO2014078399A1 (en) | 2012-11-13 | 2014-05-22 | Baylor College Of Medicine | Multi-arm biodegradable polymers for nucleic acid delivery |
EP3106177B1 (en) * | 2014-02-12 | 2022-07-27 | NanoCarrier Co., Ltd. | Polyion complex comprising mrna for therapy |
US10993960B1 (en) | 2014-05-08 | 2021-05-04 | Kawasaki Institute Of Industrial Promotion | Pharmaceutical composition |
EP3870628B1 (en) * | 2018-10-24 | 2024-04-03 | Genedit Inc. | Cationic polymer with alkyl side chains and use for biomolecule delivery |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH03287545A (ja) * | 1990-03-31 | 1991-12-18 | Res Dev Corp Of Japan | 標的指向性高分子医薬化合物及びその中間体 |
WO1999061512A1 (en) | 1998-05-23 | 1999-12-02 | University Of Strathclyde | Polyamino acid vesicles |
WO2004099287A1 (ja) * | 2003-05-08 | 2004-11-18 | Japan Science And Technology Agency | ポリエチレングリコール−ポリカチオンブロック共重合体 |
WO2005078084A1 (ja) * | 2004-02-13 | 2005-08-25 | Toudai Tlo, Ltd. | 2本鎖オリゴ核酸を担持したポリイオンコンプレックスおよびその製造法とそれを含む医薬組成物 |
WO2006085664A1 (ja) | 2005-02-10 | 2006-08-17 | The University Of Tokyo | ポリカチオン荷電性ポリマー及び核酸のキャリヤーとしての使用 |
WO2007099660A1 (ja) | 2006-03-01 | 2007-09-07 | The University Of Tokyo | 核酸内包高分子ミセル複合体 |
WO2008010341A1 (fr) * | 2006-07-18 | 2008-01-24 | Nanocarrier Co., Ltd. | Polypeptide physiologiquement actif, micelle de polymère ayant une protéine enfermée dans celle-ci, et procédé d'obtention de la micelle de polymère |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP3287545B2 (ja) | 1997-10-08 | 2002-06-04 | 矢崎総業株式会社 | 電気接続箱におけるコネクタの接続固定構造 |
US20040063618A1 (en) | 2002-09-30 | 2004-04-01 | Muthiah Manoharan | Peptide nucleic acids having improved uptake and tissue distribution |
FR2843117B1 (fr) * | 2002-07-30 | 2004-10-15 | Flamel Tech Sa | Polyaminoacides fonctionnalises par au moins un groupement hydrophobe et leurs applications notamment therapeutiques |
-
2010
- 2010-02-15 ES ES10741313.0T patent/ES2477416T3/es active Active
- 2010-02-15 EP EP10741313.0A patent/EP2399948B1/en not_active Not-in-force
- 2010-02-15 WO PCT/JP2010/052176 patent/WO2010093036A1/ja active Application Filing
- 2010-02-15 JP JP2010524300A patent/JP4582821B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2010-02-15 US US13/147,319 patent/US8546487B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH03287545A (ja) * | 1990-03-31 | 1991-12-18 | Res Dev Corp Of Japan | 標的指向性高分子医薬化合物及びその中間体 |
WO1999061512A1 (en) | 1998-05-23 | 1999-12-02 | University Of Strathclyde | Polyamino acid vesicles |
WO2004099287A1 (ja) * | 2003-05-08 | 2004-11-18 | Japan Science And Technology Agency | ポリエチレングリコール−ポリカチオンブロック共重合体 |
JP2004352972A (ja) * | 2003-05-08 | 2004-12-16 | Japan Science & Technology Agency | ポリエチレングリコール−ポリカチオンブロック共重合体 |
WO2005078084A1 (ja) * | 2004-02-13 | 2005-08-25 | Toudai Tlo, Ltd. | 2本鎖オリゴ核酸を担持したポリイオンコンプレックスおよびその製造法とそれを含む医薬組成物 |
WO2006085664A1 (ja) | 2005-02-10 | 2006-08-17 | The University Of Tokyo | ポリカチオン荷電性ポリマー及び核酸のキャリヤーとしての使用 |
WO2007099660A1 (ja) | 2006-03-01 | 2007-09-07 | The University Of Tokyo | 核酸内包高分子ミセル複合体 |
WO2008010341A1 (fr) * | 2006-07-18 | 2008-01-24 | Nanocarrier Co., Ltd. | Polypeptide physiologiquement actif, micelle de polymère ayant une protéine enfermée dans celle-ci, et procédé d'obtention de la micelle de polymère |
Non-Patent Citations (6)
Title |
---|
K. MIHATA ET AL., J. AM. CHEM. SOC., vol. 126, 2004, pages 2355 - 2361 |
K. MIYATA ET AL., J. AM. CHEM. SOC., vol. 130, 2008, pages 16287 - 16294 |
M. OCKER, D. NEUREITER, M. LUEDERS, S. ZOPF, M. GANSLMAYER, E. G. HAHN, C. HEROLD, D. SCHUPPAN, GUT, vol. 54, 2005, pages 1298 - 1308 |
N. M. HOWARTH, W. E. LINDSELL, E. MURRAY, P. N. PRESON, TETRAHEDRON, vol. 61, 2005, pages 8875 - 8887 |
S. TAKAE, Y. AKIYAMA, Y. YAMASAKI, Y. NAGASAKI, K. KATAOKA: "Colloidal Au replacement assay for highly sensitive quantification of low molecular weight analytes by surfaceplasmon resonance", BIOCONJ UGATE CHEM., vol. 18, no. 4, 2007, pages 1241 - 1245 |
See also references of EP2399948A4 * |
Cited By (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11020418B2 (en) | 2012-04-27 | 2021-06-01 | Nanocarrier Co., Ltd. | Unit structure-type pharmaceutical composition for nucleic acid delivery |
US11066665B2 (en) | 2015-11-19 | 2021-07-20 | Public University Corporation Nagoya City University | Antitumor drug delivery formulation |
WO2018110366A1 (ja) * | 2016-12-15 | 2018-06-21 | 国立大学法人東京工業大学 | pH応答性ポリマー及び薬物送達システム |
US11890347B2 (en) | 2016-12-15 | 2024-02-06 | Tokyo Institute Of Technology | PH-responsive polymer and drug delivery system |
US11324835B2 (en) | 2017-08-31 | 2022-05-10 | Kawasaki Institute Of Industrial Promotion | Nucleic acid-loaded unit polyion complex |
JP2021522385A (ja) * | 2018-04-27 | 2021-08-30 | ジーンエディット インコーポレイテッド | カチオン性ポリマーおよびその生体分子送達のための使用 |
CN109161019A (zh) * | 2018-08-24 | 2019-01-08 | 兰州交通大学 | 一种β-二羰基化合物改性聚天冬氨酸的制备方法 |
CN109161019B (zh) * | 2018-08-24 | 2021-02-05 | 兰州交通大学 | 一种β-二羰基化合物改性聚天冬氨酸的制备方法 |
WO2020116635A1 (ja) | 2018-12-07 | 2020-06-11 | 国立大学法人 東京大学 | 輸送担体を用いた環状化合物の送達 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP4582821B2 (ja) | 2010-11-17 |
EP2399948A4 (en) | 2012-10-24 |
EP2399948A1 (en) | 2011-12-28 |
US20120053295A1 (en) | 2012-03-01 |
JPWO2010093036A1 (ja) | 2012-08-16 |
ES2477416T3 (es) | 2014-07-16 |
EP2399948B1 (en) | 2014-04-09 |
US8546487B2 (en) | 2013-10-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4582821B2 (ja) | カチオン性のポリ(アミノ酸)およびその使用 | |
Sun et al. | Self-assembled biodegradable micellar nanoparticles of amphiphilic and cationic block copolymer for siRNA delivery | |
Kargaard et al. | Polymeric siRNA gene delivery–transfection efficiency versus cytotoxicity | |
JP4655298B1 (ja) | 短鎖のカチオン性ポリアミノ酸およびその使用 | |
JP5481614B2 (ja) | フェニルボロン酸基が導入されたブロックコポリマーおよびその使用 | |
Tamura et al. | Smart siRNA delivery systems based on polymeric nanoassemblies and nanoparticles | |
Takemoto et al. | Polyion complex stability and gene silencing efficiency with a siRNA-grafted polymer delivery system | |
CA2718003C (en) | Copolymer including uncharged hydrophilic block and cationic polyamino acid block having hydrophobic group in part of side chains, and use thereof | |
Felber et al. | siRNA nanocarriers based on methacrylic acid copolymers | |
US20090068743A1 (en) | Cationic alpha-amino acid-containing biodegradable polymer gene transfer compositions | |
Salakhieva et al. | Structure–biocompatibility and transfection activity relationships of cationic polyaspartamides with (dialkylamino) alkyl and alkyl or hydroxyalkyl side groups | |
JP5661626B2 (ja) | アニオン性ポリマー、該アニオン性ポリマーを用いたポリイオンコンプレックスおよび三元系ポリマー複合体、ならびに薬学組成物 | |
Chen et al. | Polyethyleneimine-grafted poly (N-3-hydroxypropyl) aspartamide as a biodegradable gene vector for efficient gene transfection | |
KR100466254B1 (ko) | 세포내 전달을 위한 올리고뉴클레오티드와 친수성 고분자로 구성되는 유전자 전달용 접합체, 고분자 전해질 복합 미셀 및 그의 제조방법 | |
WO2020067142A1 (en) | Amphiphilic poly(amino acid), block copolymer using the amphiphilic poly(amino acid), and complex including the amphiphilic poly(amino acid) or the block copolymer and nucleic acid | |
Prasad | Design and Development of Redox-responsive Nanocarriers for Therapeutic Delivery | |
WO2024059309A1 (en) | Polyion complexes for biomolecular delivery | |
EB et al. | MULTIFUNCTIONAL NANOGELS FOR THERAPEUTIC SIRNA DELIVERY |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
WWE | Wipo information: entry into national phase |
Ref document number: 2010524300 Country of ref document: JP |
|
121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 10741313 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
WWE | Wipo information: entry into national phase |
Ref document number: 13147319 Country of ref document: US |
|
WWE | Wipo information: entry into national phase |
Ref document number: 2010741313 Country of ref document: EP |
|
NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |