WO2010083937A1 - Verwendung von polyphenol-haltigen pflanzenextrakten zur behandlung von adipositas und diabetes mellitus typ 2 - Google Patents

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WO2010083937A1
WO2010083937A1 PCT/EP2010/000006 EP2010000006W WO2010083937A1 WO 2010083937 A1 WO2010083937 A1 WO 2010083937A1 EP 2010000006 W EP2010000006 W EP 2010000006W WO 2010083937 A1 WO2010083937 A1 WO 2010083937A1
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vaccinium
plant
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plant extract
extract
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Ludwig Jonas
Peeter Toomik
Tönu PÜSSA
Dirk Michallik
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Universität Rostock
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    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics

Definitions

  • the present invention relates to polyphenol-containing plant extracts for the treatment and / or prevention of obesity and type 2 diabetes mellitus and the use of such extracts for the preparation of pharmaceutical compositions or dietary supplements.
  • the extracts contain specific polyphenol compounds, especially procyanidin A3 isomers.
  • the invention also provides methods for producing such extracts from plant matter, in particular from fruits, leaves and stems or shoot tips.
  • the plants are preferably Ericaceae, in particular Vaccinium species such as cranberry (Vaccinium vitis-idea), blueberry (also referred to as blueberry, Vaccinium myrtillus), cranberry (eg Vaccinium oxycoccus, Vaccinium macrocarpum, Vaccinium microcarpum, Vaccinium erythrocarpum) and / or blackcurrants (Vaccinium uli nosum) or rhododendron species, in particular rhododendron catalawbane.
  • Vaccinium species such as cranberry (Vaccinium vitis-idea), blueberry (also referred to as blueberry, Vaccinium myrtillus), cranberry (eg Vaccinium oxycoccus, Vaccinium macrocarpum, Vaccinium microcarpum, Vaccinium erythrocarpum) and / or blackcurrants (Vaccinium uli nosum) or rhododendron species, in particular r
  • obesity is based on high levels of carbohydrate and fat intake and on sedentary lifestyle.
  • pancreatic amylase ⁇ -amylase
  • pancreatic lipase is used to split fats.
  • the pancreatic amylase and lipase are synthesized in the pancreatic acinar cells along with many other exocrine pancreatic enzymes, stored in the zymogen granules and secreted into the glandular lumina by hormonal and nervous stimuli, flow through the pancreatic ducts and are delivered to the duodenum. where the substrate cleavage (carbohydrates, lipids) occurs and thus the resorbability of the food components is achieved.
  • pancreatic amylase By oral inhibitors of pancreatic amylase and lipase, the digestibility of carbohydrates and neutral fats in the diet can be disturbed and thus absorbability can be prevented.
  • the three-dimensional model of pancreatic amylase shows that this protein structure is an active, Ca 2+ dependent enzymatic center and three lectin-like sugar binding domains (Machius et al., 1996).
  • ⁇ -glycosidase inhibitors which delay and reduce the increase in glucose after a meal and thus place the absorption-induced increase in glucose in a more favorable temporal relation to the impaired insulin secretion, are marketed on the market.
  • the preparation acarbose (Glucobay®, Bayer Leverkusen, Germany) is an example of such an ⁇ -glycoside inhibitor.
  • Acarbose is an oligosaccharide of microbial origin that competitively inhibits intestinal disaccharidases (maltase, lactase, sucrase, trehalase) attached to the surface of epithelial cells lining the small intestine.
  • This compound delays the intestinal absorption of disaccharides in small doses (Caspary, 1978, Jenkins et al., 1981, Clissold and Edwards, 1988).
  • the low molecular weight sugars accumulate in the intestinal lumen and are increasingly metabolized bacterially to form gas.
  • Glucose flatulence
  • bowel sounds metaleorism
  • diarrhea and abdominal pain have been reported to be very common to common side effects with Glucobay®.
  • Acarbose also acts as an inhibitor of pancreatic amylase. It has been shown that the active ingredient binds acarbose to the active site but not to the three sugar binding domains (Jonas et al., 2003).
  • the lipase inhibitor used is, for example, the active substance orlistat (Xenical®, Roche, Germany). Treatment with Xenical® can cause a variety of side effects. The most common gastrointestinal side effects, such as abdominal pain, flatulence or fecal incontinence. In addition, other side effects such as headache, upper and lower respiratory tract infections, urinary tract infections and hepatitis have been reported.
  • Cinnamon herbal preparations have been proposed for the treatment of diabetes mellitus (Anderson et al., 2004, Qin et al., 2003, Khan et al., 2003, JP 9275979). It has been reported that extracts of cinnamon can increase the effect of insulin or contain inhibitors of amylase.
  • the object of the present invention is to provide alternative compositions which are suitable for the prevention and treatment of obesity and diabetes mellitus type 2 and which have reduced side effects in comparison with existing compounds. This object is achieved by the invention, in particular by the subject matter of the claims.
  • the invention relates in particular to a plant extract of plant material from Ericaceae, Aesculus hippocastaneum, Aesculus pavia and / or Laurus nobilis containing polyphenol. This is suitable for the treatment and / or prevention of obesity and / or diabetes mellitus type 2.
  • the plant extracts according to the invention inhibit especially digestive enzymes of the gastrointestinal tract.
  • digestive enzymes of the gastrointestinal tract For example, both pancreatic amylase and pancreatic lipase are inhibited.
  • other pancreatic enzymes, especially digestive enzymes found in the intestinal lumen can be inhibited.
  • pancreatic amylase reduces the hydrolytic cleavage of the 1,4- ⁇ -glycosidic bonds in glucose polymers such as starch and glycogen. Especially the strength is less liquefied and as a result, fewer oligosaccharides are formed, so that less sugar molecules are available for absorption in the intestine.
  • pancreatic lipase prevents the cleavage of triacylglycerols, which prevents or reduces the absorption of mono- and diglycerides, free fatty acids and glycerol.
  • One embodiment relates to the use of the plant extracts according to the invention for inhibiting lipases, in particular pancreatic lipases.
  • the extracts according to the invention are therefore preferably suitable for inhibiting both pancreatic amylase and pancreatic lipase.
  • a plant extract according to the invention can be prepared by a process comprising steps in which a) plant matter is comminuted, and b) the plant matter is extracted with a solvent, in particular an organic solvent such as acetone, methanol or ethanol.
  • the extract can be produced by a process which comprises steps in which a) plant matter is comminuted, and b) the plant matter is extracted with acetone, c) diluted with water, d) i) extracted with toluene to discard the toluene, or ii) hydrophobic components removed via a C18 SPE cartridge, or iii) isolated by HPLC fractions containing a
  • the plant material preferably comes from Ericaceae, in particular Ericoideae, the Rhododendroideae being added to this subfamily, in one embodiment from Ericeae or in another from Rhodoreae.
  • it is derived from a vaccinium species, e.g. Cranberry (Vaccinium vitis-idea), blueberry (Vaccinium myrtillus), cranberry
  • Vaccinium oxycoccus Vaccinium macrocarpon, Vaccinium microcarpum and / or Vaccinium erythrocarpum
  • blackcurrants Vaccinium oxycoccus, Vaccinium macrocarpon, Vaccinium microcarpum and / or Vaccinium erythrocarpum
  • the plant matter used may comprise fruits, fruit skins, leaves, shoot tips, flowers, roots, bark and / or stems of the plants.
  • leaves, shoot tips or stems are preferred, with Aesculus especially fruits, fruit peel or leaves. It can be used dried or fresh plant matter.
  • the extracts of the invention have been shown to comprise polyphenol procyanidin A3 isomers, especially those having a molecular mass of 864 as determined by mass spectrometry, as described, e.g. with the compounds of formula I or formula II (see Example 2) are shown.
  • the substance with this mass is referred to in the following as inhibitor 864.
  • This is to be understood as a lead substance, which is associated with the effect.
  • the extract according to the invention also comprises further phytochemicals. These can contribute to the effect, but also increase patient tolerance and / or improve stability.
  • the extract may e.g. contain further compounds which co-elute in the HPLC with inhibitor 864.
  • phytochemicals which may be included in the extract are e.g. other polyphenols, anthocyanins and / or ascorbic acid.
  • the plant extracts according to the invention comprise an additional antioxidant.
  • a "not” is used as a number word, but also includes a plurality, so it may, for example, also comprise a plurality of antioxidants.
  • antioxidants may be added. This can increase the stability of the connections.
  • the antioxidant is ascorbic acid (vitamin C).
  • Further possible antioxidant include, for example, ascorbates, ascorbic acid esters, tocopherols, di-, tri- and polyphosphates, etc.
  • the plant extract in particular the crude extract after an extraction step or the extract after extraction with acetone and toluene, but without chromatographic purification, already comprises antioxidant, so that a further addition is possible, but not necessary.
  • the extract may be lyophilized, which improves shelf life. Preferred is a lyophilization which does not result in complete drying but leaves a residue of liquid, e.g. up to a concentration of 1 mg / ml.
  • a lyophilization which does not result in complete drying but leaves a residue of liquid, e.g. up to a concentration of 1 mg / ml.
  • For resuspension e.g. Water or PBS (phosphate buffered saline).
  • pharmaceutically acceptable carrier material which may be liquid (e.g., water, PBS, alcohol, e.g., ethanol, oil or a mixture thereof) and / or solid may be added to the plant extract.
  • composition which, in addition to the plant extract of the invention, comprises antioxidant, preferably ascorbic acid, and / or pharmaceutically acceptable carrier material (s), e.g. B.
  • chitosan comprises, in particular in a suitable formation.
  • a combination with chitosan has the added advantage that it can bind blood lipids. Chitosan adsorbs the active ingredients of the plant extract very well and releases them slowly.
  • the composition may be in the form of a liquid, tablet or capsule for oral administration. infusions from said plant material can be used to support the therapeutic effect.
  • the plant extract or the composition according to the invention may be a pharmaceutical composition, a foodstuff or a dietary supplement, which is primarily governed by national law. These terms are therefore used interchangeably herein.
  • the plant extract of the invention can be used for the treatment and / or prevention of obesity and / or diabetes mellitus type 2 or for the preparation of a pharmaceutical composition or a dietary supplement for the treatment and / or prevention of obesity and / or diabetes mellitus type 2.
  • the pharmaceutical composition or dietary supplement is formulated for administration before or with food intake.
  • An appropriate dose may be determined by the attending physician in view of the desired effect and circumstances, and is dependent upon many factors, such as e.g. Gender, body weight, etc., depending. Dosage of the extract in an amount comprising about 0.5-5 mg, preferably about 3 mg of the lead inhibitor 864 is possible, the extract being suitable for administration in three doses in the morning, at noon and in the evening, e.g. 1 mg before or at mealtimes.
  • the invention also provides a process for the preparation of the plant extract, comprising steps of: a) disintegrating plant matter, and b) extracting the plant matter with a solvent.
  • the solvent is in particular an organic solvent, especially an organic solvent which is miscible with water. Preference is given to acetone, methanol or ethanol or other alcohols, optionally mixed with or mixed with water.
  • the plant matter with the solvent in a ratio of about 1: 1 to 1:20, preferably 1:10 (plant matter (dry matter): solvent, m: m) extracted.
  • Repeated extraction e.g., 2x, 3x, 4, or 5x
  • acetone for higher yields.
  • methanol e.g. In general, only one extraction is necessary.
  • the yield of a single extraction of dried leaves and stems with ten times the amount of methanol results in an extract of about 0.2 mg / g of inhibitor 864 (calculated as mass spectrometry using catechol as a standard).
  • a single extraction with acetone leads to about a quarter of the yield.
  • the resulting crude extract can be concentrated by methods known in the art. Complete or almost complete lyophilization is also possible.
  • the extract may e.g. be diluted with water.
  • the invention also provides a process for the preparation of the plant extract, comprising steps of: a) dissecting plant matter, and b) extracting the plant matter with acetone, c) diluting with water, d) i) extracting with toluene, the toluene or ii) removes hydrophobic components via a C18 SPE cartridge, or iii) isolates via an HPLC fractions containing a
  • the extract obtained in step e can be lyophilized in a further step.
  • acetone instead of acetone, another solvent, e.g. an organic solvent, preferably methanol or ethanol may be used.
  • an organic solvent preferably methanol or ethanol
  • the extract obtained in the process may be formulated as a pharmaceutical composition or dietary supplement.
  • the invention thus encompasses processes for the preparation of plant extracts from plant matter of the abovementioned plants, in particular from Ericaceae, e.g. Leaves, sprouts and / or stems of cranberry, bilberry, cranberry, raspberry or rhododendron, and of the fruits, leaves or hoods of horse-chestnut or bay leaves.
  • Ericaceae e.g. Leaves, sprouts and / or stems of cranberry, bilberry, cranberry, raspberry or rhododendron
  • the fruits leaves or hoods of horse-chestnut or bay leaves.
  • a combination of these plants or plant parts can be used.
  • the leaves of the cultivated cranberry and the cultivated blueberry are used as the source, since these plants in Plantations can be cultivated and fruits and leaves can be collected separately at different times by machine. After the harvest of the fruit, the harvest of the leaves and / or shoot tips in the autumn or winter, when the highest concentration of the active ingredient occur and therefore the largest yield can be realized, for example, with Kombines possible.
  • the extraction is based on the plant matter, in particular comminuted plant matter, e.g. Homogenate of leaves, stalks, shoot tips and / or fruits.
  • the comminution of the starting material increases the yield of the extraction. It can be used dried or fresh plant matter, especially in crushed form.
  • An alkaline or acid extraction can also be used.
  • plant matter eg leaf homogenate of cultivated blueberry or cranberry
  • an aqueous basic solution 0.05-0.5 N
  • ammonium hydroxide solution eg 0.1 mol / l
  • an acidic extraction with aqueous acidic solution 0.05- 0.5 N
  • hydrochloric acid eg 0.1 mol / l
  • the clear extract is neutralized after centrifugation without sediment with an acid, preferably acetic acid, or in the case of acid extraction with a base, in particular NaOH (pH 7-8), and the precipitates formed are separated by re-centrifugation.
  • an acid preferably acetic acid, or in the case of acid extraction with a base, in particular NaOH (pH 7-8)
  • the extract thus obtained already shows a strong inhibitory activity. In case of prolonged storage, however, there is also an instability here.
  • the crude extract can be preserved for better storage by lyophilization.
  • the most stable extracts were obtained in the extraction of the plant material, for example the blueberry or cranberry leaves, with organic solvents, in particular acetone.
  • the dry, comminuted extraction material with acetone (100%) at 0-10 0 C, especially at about 4 0 C, extracted, for example, about 12-36 hours, especially about 24 hours.
  • This extraction is more complete and results in less contamination of the inhibitor composition than other extraction methods. Neutralization and centrifugation steps are not necessary. Therefore, the first extraction step is preferably carried out with acetone.
  • An extract thus obtained can already be used within the meaning of the invention.
  • HPLC High Performance Liquid Chromatography
  • the ultrapure substance 864 in water, isolated by HPLC, is stable in concentrated form (1 mg / ml) for months up to half a year, as NMR studies have shown.
  • toluene traction may be carried out for 2-8 hours, preferably for about 4 hours. If available, before and / or after extraction with toluene, any precursors may be separated by centrifugation (about 2000-4000 rpm).
  • the complete extraction is carried out at 0-10 0 C, in particular at about 4 0 C.
  • the extract according to the invention is preferably stable for at least one month, in particular at least 2, at least 6 or at least 12 months, its activity in inhibiting e.g. Thus, less than 50%, preferably less than 20% or less than 10% or less of pancreatic amylase is reduced compared to the action of freshly isolated extract.
  • the extraction method used can be selected or varied depending on the plant material. Of course, different extraction methods can be combined.
  • the extract according to the invention preferably contains no or little coumarin, in particular no amounts of coumarin, which could be considered harmful to health.
  • the extracts according to the invention differ, e.g. of cinnamon extracts.
  • non-extracted plant matter e.g. Sproßspitzen, stems, leaves, berries or fruits of said plants, in particular the vaccinium species for the abovementioned medical applications are used.
  • the invention relates to the use of plant matter of Ericaceae, Aesculus hippocastaneum, and / or Aesculus pavia for the treatment and / or prevention of obesity and / or diabetes mellitus type 2.
  • FIG. 1 shows a preparative HPLC of a blueberry leaf extract. Upper line - total ion chromatogram; lower line - extracted fraction at 15 min (especially inhibitor 864).
  • FIG. 2 shows the mass spectrum of the fractions of the peak obtained by HPLC after 15 minutes.
  • Figure 3 shows differences in the concentration of inhibitor in an HPLC analysis of blueberry leaf extract collected in the summer (lower gray line) and winter (upper line).
  • Bilberry leaves, cranberry leaves and sprouts were each suspended in 100% acetone and extracted for 24 hours at 4 0 C in the refrigerator. Then the acetone extract was diluted with an approximately equal volume of water and centrifuged at 2000-4000 rpm to remove any precipitates. The clear extract was extracted with approximately equal volumes of toluene for approximately 4 hours to remove hydrophobic components from the extract. The toluene solution is discarded to yield an aqueous extract.
  • This extract can be further analyzed and / or purified by means of HPLC.
  • HPLC a Shimadzu HPLC system (pumps LC-9A, column oven CTO-10 AS VP at 25 ° C, auto-injector SIL-9A, UV detector SPD-IO AV) and a CC 250/3 nucleosil 100-3 C 18 Column of the company Macherery - Nagel, Düren, Germany and acetonitrile as solvent were identified as two major peaks.
  • a CC 280/3 Nucleosil 100-3 C18 column was used, for preparative HPLC an EP 250/16 Nucleosil 100-3 C 18 column.
  • MS mass spectroscopy
  • fractions obtained in this way can be tested for their inhibitory action on digestive enzymes, in particular pancreatic amylase and pancreatipase, by enzymatic tests (see Examples 3 and 4). Effective factions can be united.
  • peaks which comprise molecules of mass 864 (non-protonated form, hereinafter also referred to as inhibitor 864 or fraction 864) ), have an effect in the enzyme tests.
  • the compound having molecular weight 864 may be assigned the structure of formula I or II:
  • the plant extract according to the invention preferably comprises a molecule having a mass of 864, in particular the polyphenol according to formula I and / or formula II.
  • Such substances are referred to in the context of the invention as procyanidin A3 isomers.
  • extracts of plants collected in autumn and especially winter had a particularly high level of inhibitor 864 (see Fig. 3) and were particularly active.
  • the substrate ethylidene-pNP-G7 ethylidene-p-nitrophenol-maltoheptaose
  • ⁇ -amylase ethylidene-p-nitrophenol-maltoheptaose
  • the smaller fragments are further cleaved by ⁇ -glucosidases, so that pNP (p-nitrophenol) is formed.
  • the rate of formation of pNP is proportional to the ⁇ -amylase activity in the sample and can be measured by an increase in absorbance at 410/520 nm.
  • porcine pancreatic ⁇ -amylase was used. 1 mg / ml ⁇ -amylase in PBS (phosphate buffered saline) was diluted 1: 4 with PBS and 2.5 ⁇ l per batch of this solution was used.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the activity of the ⁇ -amylase can then be calculated using the following formula:
  • TV total volume (1.5 ml) + 25 ⁇ l amylase + 20 ⁇ l inhibitor logo CNRS logo INIST
  • Table 1 Results of the ⁇ -amylase activity test using plant extract from blueberry (inhibitor 864), sampling after 60 sec
  • Lipase (ICN Biochemicals Inc. USA) (1 mg / ml) was diluted 1: 4 with 0.9% NaCl solution and 15 ⁇ l per batch was used.
  • Lipase activity measurements were carried out with the Lipase-PS TM kit from Sigma Diagnostics, Sigma Deisenhofen (Catalog No. 805-A). Approach:
  • ⁇ A Blank FINAL A Blank - INITIAL A Blank
  • ⁇ A standard FINAL A standard - INITIAL A standard
  • ⁇ A sample FINAL A sample - INITIAL A sample
  • ⁇ A sample FINAL A sample - INITIAL A sample
  • the lipase activity of the standard was stated by the manufacturer to be 248 U / L. Lipase activity of the uninhibited sample
  • Ramchandani N Type 2 diabetes in children. A burgeoning health problem among overweight young Americans. At J Nurs 2004; 104: 65-68.
  • Cinnamon extract traditional herb

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Polyphenol-haltigen Pflanzenextrakten zur Behandlung von Adipositas und Diabetes mellitus Typ 2. Die Extrakte enthalten spezifische Polyphenolverbindungen, insbesondere Procyanidin A3-Isomere. Gegenstand der Erfindung sind auch Verfahren zur Herstellung solcher Extrakte aus Pflanzen, insbesondere aus Blättern und Stengeln. Die Pflanzen sind bevorzugt Ericaceae, z.B. Vaccinium-Arten, insbesondere Preiselbeere (Vaccinium vitisidea), Heidelbeere (Vaccinium myrtillus), Moosbeere (Vaccinium oxycoccus, Vaccinium macrocarpon (auch engl, als Cranberry bezeichnet), Vaccinium microcarpum, Vaccinium erythrocarpum) und Trunkelbeere (Vaccinium uliginosum). Identische oder ähnliche Verbindungen mit gleicher Wirkung lassen sich aus der Roßkastanie Aesculus hippocastaneum und Aesculus pavia sowie aus den Gewürzlorbeer (Laurus nobilis), und aus Rhododendron-Arten, insbesondere Rhododendron catawbiense gewinnen und mit gleichen Wirkungen einsetzen.

Description

Verwendung von Polyphenol-haltigen Pflanzenextrakten zur Behandlung von Adipositas und Diabetes mellitus Typ 2
Die vorliegende Erfindung betrifft Polyphenol-haltige Pflanzenextrakte zur Behandlung und/oder Vorbeugung von Adipositas und Diabetes mellitus Typ 2 und die Verwendung solcher Extrakte zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen bzw. Nahrungsergänzungsmitteln. Die Extrakte enthalten spezifische Polyphenolverbindungen, insbesondere Procyanidin A3-Isomere. Gegenstand der Erfindung sind auch Verfahren zur Herstellung solcher Extrakte aus Pflanzengut, insbesondere aus Früchten, Blättern und Stengeln bzw. Sproßspitzen. Die Pflanzen sind bevorzugt Ericaceae, insbesondere Vaccinium-Arten, wie Preiselbeere (Vaccinium vitis-idea) , Heidelbeere (auch als Blaubeere bezeichnet, Vaccinium myrtillus) , Moosbeere (z.B. Vaccinium oxycoccus, Vaccinium macrocarpum, Vaccinium microcarpum, Vaccinium erythrocarpum) und/oder Trunkelbeere (Vaccinium uligi- nosum) oder Rhododendron-Arten, insbesondere Rhododendron ca- tawbiense. Ähnliche Extrakte mit gleicher Wirkung lassen sich aus Früchten und Blättern der Roßkastanie Aesculus hippocasta- neum und Aesculus pavia sowie aus den Blättern von Gewürzlorbeer (Laurus nobilis) gewinnen und mit gleichen Wirkungen einsetzen.
Die Fettsucht (Adipositas) ist heute in den Industrienationen ein weitverbreiteter Risikofaktor für die Ausbildung eines Typ 2 Diabetes (Beller 2004; Kemper et al. 2004; Lobstein und Le- ach 2004; Plagemann und Härder 2004; Ramchandani 2004; Scheen 2003) . Diese Erkrankung wird in den USA und Westeuropa zum Massenphänomen. Ein Viertel der US-Bürger und immer mehr Jugendliche in Deutschland leiden an Übergewicht und Fettsucht.
Die Fettsucht basiert zum größten Teil auf zu hohem Konsum von Kohlenhydraten und Fetten sowie auf Bewegungsarmut.
Die Hauptkohlenhydrate Stärke und Glykogen werden im Darm durch Enzyme, hauptsächlich von Pankreasamylase (α-Amylase) , abgebaut. Weiterhin dient Pankreaslipase zur Spaltung von Fetten. Die Pankreas-Amylase und -Lipase werden neben vielen anderen Enzymen des exokrinen Pankreas in den Pankreasazinuszel- len synthetisiert, in den Zymogengranula gespeichert und durch hormonelle und nervale Reize in die Drüsenlumina sezerniert, fließen durch die Ausführungsgänge der Bauchspeicheldrüse und werden in den Zwölffingerdarm abgegeben, wo die Substratspaltung (Kohlenhydrate, Lipide) erfolgt und dadurch die Resor- bierbarkeit der Nahrungsbestandteile erreicht wird.
Durch oral verabreichte Inhibitoren der Pankreasamylase und - Lipase kann die Verdaulichkeit der Kohlenhydrate und Neutralfette in der Nahrung gestört und damit die Resorbierbarkeit verhindert werden. Das dreidimensionalen Modell der Pankreasamylase zeigt, daß diese Proteinstruktur ein aktives, Ca2+- abhängiges enzymatisches Zentrum sowie drei lektinartige Zuckerbindungsdomänen besitzt (Machius et al., 1996) .
Derzeit werden am Markt α-Glykosidasehemmer vertrieben, die den Glukoseanstieg nach einer Mahlzeit verzögern und verringern und damit die resorptionsbedingte Glukoseerhöhung in einen günstigeren zeitlichen Bezug zur beeinträchtigten Insulinsekretion stellen. Das Präparat Acarbose (Glucobay®, Bayer Leverkusen, Deutschland) ist ein Beispiel solch eines α-Glykosi- dasehemmers. Acarbose ist ein Oligosaccharid mikrobiellen Ursprungs, das kompetitiv intestinale Disaccharidasen (Maltase, Lactase, Saccharase, Trehalase) , die an die Oberfläche der den Dünndarm auskleidenden Epithelzellen gebunden sind, hemmt. Diese Verbindung verzögert in kleinen Dosen die intestinale Resorption von Disacchariden (Caspary, 1978; Jenkins et al., 1981; Clissold und Edwards, 1988) . Die niedermolekularen Zucker akkumulieren im Darmlumen und werden vermehrt bakteriell unter Gasbildung metabolisiert . Als sehr häufig bis häufig auftretende Nebenwirkungen von Glucobay® wurden Blähungen (Flatulenz) , Darmgeräusche (Meteorismus) , Durchfall und Bauchschmerzen beschrieben. Darüber hinaus kann es gelegentlich zu Übelkeit und in seltenen Fällen zu klinisch relevanten Leberenzymanstiegen kommen.
Acarbose wirkt auch als Inhibitor der Pankreasamylase . Es konnte gezeigt werden, daß der Wirkstoff Acarbose an das aktive Zentrum, jedoch nicht an die drei Zuckerbindungsdomänen bindet (Jonas et al., 2003) .
Als Lipasehemmer wird zum Beispiel der Wirkstoff Orlistat (Xenical®, Roche, Deutschland) eingesetzt. Bei der Behandlung mit Xenical® kann es zu einer Vielzahl von Nebenwirkungen kommen. Am häufigsten treten gastrointestinale Nebenwirkungen, wie zum Beispiel Bauchschmerzen, Flatulenz oder Stuhlinkontinenz auf. Zusätzlich wurden weitere Nebenwirkungen, wie z.B. Kopfschmerzen, Infekte der oberen und unteren Atemwege, Harnwegsinfekte und Hepatitis beschrieben.
Pflanzliche Präparate aus Zimt wurden für die Behandlung von Diabetes mellitus vorgeschlagen (Anderson et al . , 2004; Qin et al., 2003; Khan et al . , 2003; JP 9275979) . Es wurde berichtet, dass Extrakte aus Zimt die Wirkung von Insulin steigern können bzw. Inhibitoren von Amylase enthalten.
Vor diesem Hintergrund liegt die Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, alternative Zusammensetzungen bereitzustellen, die sich für die Vorbeugung und Behandlung von Adipositas und Diabetes mellitus Typ 2 eignen und die im Vergleich zu bereits vorhandenen Verbindungen verringerte Nebenwirkungen aufweisen. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung, insbesondere durch den Gegenstand der Ansprüche, gelöst.
Die Erfindung betrifft insbesondere einen Polyphenol-haltigen Pflanzenextrakt aus Pflanzengut von Ericaceae, Aesculus hippo- castaneum, Aesculus pavia und/ oder Laurus nobilis. Dieser ist zur Behandlung und/oder Vorbeugung von Adipositas und/oder Diabetes mellitus Typ 2 geeignet.
Im Rahmen der Untersuchungen zur vorliegenden Erfindung wurde festgestellt, dass die erfindungsgemäßen Pflanzenextrakte besonders wirksam Verdauungsenzyme des Magen-Darm-Traktes inhibieren. Es werden zum Beispiel sowohl die Pankreasamylase als auch die Pankreaslipase gehemmt. Darüber hinaus können andere Pankreasenzyme, insbesondere Verdauungsenzyme, die sich im Darmlumen befinden, gehemmt werden.
Durch die Hemmung der Pankreasamylase wird die hydrolytische Spaltung der 1, 4-α-glykosidischen Bindungen in Glukosepolymeren wie Stärke und Glykogen reduziert. Vor allem die Stärke wird weniger verflüssigt und in Folge dessen werden weniger Oligosaccharide gebildet, so daß im Darm weniger Zuckermoleküle für die Resorption zur Verfügung stehen.
Die Hemmung der Pankreaslipase verhindert die Spaltung von Triacylglycerinen, wodurch die Resorption von Mono- und Digly- ceriden, freien Fettsäuren und Glycerin verhindert bzw. vermindert wird. Eine Ausführungsform betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen Pflanzenextrakte zur Inhibierung von Lipa- sen, insbesondere von Pankreaslipasen.
Die erfindungsgemäßen Extrakte sind also vorzugsweise dazu geeignet, sowohl Pankreasamylase als auch Pankeaslipase zu inhibieren.
Diese Eigenschaften der Pflanzenextrakte führen dazu, dass bei Fettsüchtigen, deren Fettsucht auf übermäßigem Kohlenhydrat- und Fettverzehr basiert, das Körpergewicht reduziert und ein Diabetes mellitus Typ 2 verhindert bzw. bei schon bestehendem Diabetes Typ 2 dieser gemildert werden kann, insbesondere, wenn die Verbindungen vor/mit der Nahrungsaufnahme aufgenommen werden.
Ein erfindungsgemäßer Pflanzenextrakt ist durch ein Verfahren herstellbar, welches Schritte umfasst, bei denen man a) Pflanzengut zerkleinert, und b) das Pflanzengut mit einem Lösungsmittel, insbesondere einem organischen Lösungsmittel wie Aceton, Methanol oder Ethanol, extrahiert.
Bevorzugt ist der- Extrakt durch ein Verfahren herstellbar, welches Schritte umfasst, bei denen man a) Pflanzengut zerkleinert, und b) das Pflanzengut mit Aceton extrahiert, c) mit Wasser verdünnt, d) i) mit Toluol extrahiert, wobei man das Toluol verwirft, oder ii) hydrophobe Komponenten über eine C18 SPE-Patrone entfernt, oder iii) über eine HPLC Fraktionen isoliert, welche eine
Amylase- und Lipaseinhibitoraktivität aufweisen, so dass man e) einen wässrigen Extrakt erhält.
Mögliche Verfahren werden unten näher erläutert.
Bevorzugt stammt das Pflanzengut von Ericaceae, insbesondere Ericoideae, wobei zu dieser Unterfamilie auch die Rhodo- dendroideae hinzugezählt werden, in einer Ausführungsform aus Ericeae oder in einer anderen aus Rhodoreae. Insbesondere stammt es von einer Vaccinium-Art, z.B. Preiselbeere (Vaccini- um vitis-idea) , Heidelbeere (Vaccinium myrtillus) , Moosbeere
(Vaccinium oxycoccus, Vaccinium macrocarpon, Vaccinium micro- carpum und/oder Vaccinium erythrocarpum) und/oder Trunkelbeere
(Vaccinium uliginosum) oder einer Rhododendron-Art, insbesondere Rhododendron catawbiense. Es wurde gezeigt, dass sich aus der Kastanie, insbesondere der Roßkastanie Aesculus hippo- castaneum oder aus Aesculus pavia sowie aus Gewürzlorbeer
(Laurus nobilis) ebenfalls ein wirksamer Extrakt gewinnen lässt.
Das verwendete Pflanzengut kann Früchte, Fruchtschalen, Blätter, Sproßspitzen, Blüten, Wurzeln, Rinde und/oder Stängel der Pflanzen umfassen. Bei den Ericaceae und Laurus nobilis werden bevorzugt Blätter, Sproßspitzen oder Stängel verwendet, bei Aesculus insbesondere Früchte, Fruchtschalen oder Blätter. Es kann getrocknetes oder frisches Pflanzengut verwendet werden.
Es hat sich überraschenderweise gezeigt, dass es besonders vorteilhaft ist, wenn das Pflanzengut im Herbst oder Winter (z.B. bei Minusgraden) geerntet wurde. Vor allem bei im Winter geernteten Blättern der Ericaceae, insbesondere der Vacci- nia-Arten, geernteten Blättern oder Sproßspitzen wurde besonders große Wirksamkeit festgestellt.
Es wurde gezeigt, dass die erfindungsgemäßen Extrakte Polyphe- nol Procyanidin A3-Isomere umfassen, insbesondere solche mit einer massenspektrometrisch bestimmten molekularen Masse von 864, wie sie z.B. mit den Verbindungen nach Formel I oder Formel II (siehe Beispiel 2) dargestellt sind. Die Substanz mit dieser Masse wird in der Folge auch als Inhibitor 864 bezeichnet. Dies ist als Leitsubstanz zu verstehen, welche mit der Wirkung assoziiert ist. Bevorzug umfasst der erfindungsgemäße Extrakt jedoch ferner weitere sekundäre Pflanzenstoffe. Diese können zur Wirkung beitragen, aber auch die Verträglichkeit für Patienten erhöhen und/oder die Stabilität verbessern. Der Extrakt kann z.B. weitere Verbindungen enthalten, die in der HPLC mit Inhibitor 864 co-eluieren.
Weitere sekundäre Pflanzenstoffe, die in dem Extrakt enthalten sein können, sind z.B. weitere Polyphenole, Anthocyane und/oder Ascorbinsäure .
In einer Ausführungsform der Erfindung umfassen die erfindungsgemäße Pflanzenextrakte ein zusätzliches Antioxidations- mittel. Im Rahmen der Beschreibung der Erfindung wird „ein" nicht 'als Zahlwort verwendet, sondern umfasst auch eine Mehrzahl, es können also z.B. auch mehrere Antioxidationsmittel umfasst sein.
Antioxidationsmittel können zugesetzt werden. Dadurch lässt sich die Stabilität der Verbindungen erhöhen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Antioxidationsmittel Ascorbinsäure (Vitamin C) . Weitere mögliche Antioxidationsmit- tel sind zum Beispiel Ascorbate, Ascorbinsäureester, Tocophe- role, Di-, Tri- und Polyphosphate, etc.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst der Pflanzenextrakt, insbesondere der Rohextrakt nach einem Extraktionsschritt oder der Extrakt nach Extraktion mit Aceton und Toluol, jedoch ohne chromatographische Aufreinigung, bereits Antioxidationsmittel, so dass ein weiterer Zusatz möglich, aber nicht notwendig ist.
Der Extrakt kann lyophilisiert sein, was die Lagerfähigkeit verbessert. Bevorzugt ist eine Lyophilisierung, welche nicht zur vollständigen Trocknung führt, sondern einen Rest Flüssigkeit beläßt, z.B. bis zu einer Konzentration von 1 mg/ml. Zur Resuspension kann z.B. Wasser oder PBS (Phosphat-gepufferte Salzlösung) verwendet werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird dem Pflanzenextrakt pharmazeutisch geeignetes Trägermaterial zugesetzt, welches flüssig (z.B. Wasser, PBS, Alkohol, z.B. Ethanol, Öl oder eine Mischung daraus) und/oder fest sein kann.
Im Einklang mit den vorangegangenen Ausführungen wird somit eine Zusammensetzung bereitgestellt, die zusätzlich zu dem erfindungsgemäßen Pflanzenextrakt Antioxidationsmittel, bevorzugt Ascorbinsäure, und/oder pharmazeutisch geeignete (s) Trägermaterial (ien) , z. B. Chitosan umfasst, insbesondere in geeigneter Formierung. Eine Kombination mit Chitosan weist den zusätzlichen Vorteil auf, dass dadurch eine Bindung von Blutfetten stattfinden kann. Chitosan adsorbiert die Wirkstoffe des Pflanzenextrakts sehr gut und gibt sie langsam wieder ab.
Die Zusammensetzung kann in einer bevorzugten Ausführungsform in Form einer Flüssigkeit, einer Tablette oder einer Kapsel zur oralen Verabreichung ausgestaltet sein. Teezubereitungen aus dem genannten Pflanzenmaterial können zur Unterstützung des therapeutischen Effektes herangezogen werden.
Es kann sich bei dem erfindungsgemäßen Pflanzenextrakt bzw. der Zusammensetzung um eine pharmazeutische Zusammensetzung, ein Lebensmittel oder ein Nahrungsergänzungsmittel handeln, was sich vor allem nach nationalem Recht richtet. Diese Begriffe werden daher hier austauschbar verwendet.
Der erfindungsgemäße Pflanzenextrakt kann zur Behandlung und/oder Vorbeugung von Adipositas und/oder Diabetes mellitus Typ 2 bzw. zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung bzw. eines Nahrungsergänzungsmittels zur Behandlung und/oder Vorbeugung von Adipositas und/oder Diabetes mellitus Typ 2 verwendet werden. Bevorzugt ist die pharmazeutische Zusammensetzung bzw. das Nahrungsergänzungsmittel zur Verabreichung vor oder mit der Nahrungsaufnahme formuliert.
Eine angemessene Dosis kann von dem behandelnden Arzt in Anbetracht der gewünschten Wirkung und der tatsächlichen Umstände bestimmt werden und ist von vielen Faktoren, wie z.B. Geschlecht, Körpergewicht u.a., abhängig. Eine Dosierung des Extrakts in einer Menge, welche ca. 0,5 - 5 mg, bevorzugt ca. ca. 3 mg der Leitsubstanz Inhibitor 864 umfasst, ist möglich, wobei der Extrakt für eine Verabreichung in drei Dosen morgens, mittags und abends, z.B. je 1 mg vor oder zu den Mahlzeiten formuliert sein könnte.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung des Pflanzenextrakts, Schritte umfassend, bei denen man a) Pflanzengut zerkleinert, und b) das Pflanzengut mit einem Lösungsmittel extrahiert.
Das Lösungsmittel ist insbesondere ein organisches Lösungsmittel, vor allem ein organisches Lösungsmittel, welches mit Wasser mischbar ist. Bevorzugt sind Aceton, Methanol oder Ethanol oder andere Alkohole, optional in Mischung mit Wasser oder untereinander gemischt.
Bevorzugt wird das Pflanzengut mit dem Lösungsmittel in einem Mengenverhältnis von ca. 1:1 bis 1:20, bevorzugt 1:10 (Pflanzengut (Trockenmasse) : Lösungsmittel, m:m) extrahiert. Eine wiederholte Extraktion (z.B. 2x, 3x, 4, oder 5x) des Pflanzenmaterials ist möglich und vor allem bei einer Extraktion mit Aceton sinnvoll, um höhere Ausbeuten zu erzielen. Bei einer Extraktion mit Methanol z.B. ist im allgemeinen nur eine Extraktion notwendig. Die Ausbeute einer einzelnen Extraktion von getrockneten Blättern und Stängeln mit der zehnfachen Menge an Methanol führt zu einem Extrakt mit ca. 0,2 mg/g an Inhibitor 864 (wobei dies nach massenspektrometrischer Messung unter Verwendung von Catechin als Standard berechnet wurde) Eine einzelne Extraktion mit Aceton führt ungefähr zu einem Viertel der Ausbeute.
Der erhaltene Rohextrakt kann mit im Stand der Technik bekannten Verfahren eingeengt werden. Auch eine vollständige oder fast vollständige Lyophilisierung ist möglich. Der Extrakt kann z.B. mit Wasser verdünnt werden.
Eine direkte Verwendung des erhaltenen Extrakts ist möglich, aber es können auch weitere Aufreinigungsschritte durchgeführt werden, vor allem, wenn eventuell unerwünschte Begleitsubstanzen entfernt werden sollen. Eine weitere Aufreinigung ist z.B. über eine Extraktion mit Toluol möglich, wobei die Toluol- Phase verworfen wird. Alternativ oder zusätzlich kann eine Aufreinigung über eine C18 SPE-Patrone und/oder HPLC- Chromatographie durchgeführt werden. Es werden Fraktionen isoliert, welche eine Amylase- und Lipaseinhibitoraktivität aufweisen (siehe Beispielteil) . Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung des Pflanzenextrakts, Schritte umfassend, bei denen man a) Pflanzengut zerkleinert, und b) das Pflanzengut mit Aceton extrahiert, c) mit Wasser verdünnt, d) i) mit Toluol extrahiert, wobei man das Toluol verwirft, oder ii) hydrophobe Komponenten über eine C18 SPE-Patrone entfernt, oder iii) über eine HPLC Fraktionen isoliert, welche eine
Amylase- und Lipaseinhibitoraktivität aufweisen, so dass man e) einen wässrigen Extrakt erhält.
Der in Schritt e erhaltene Extrakt kann in einem weiteren Schritt lyophilisiert werden.
Anstelle von Aceton kann auch ein anderes Lösungsmittel, z.B. ein organisches Lösungsmittel, bevorzugt Methanol oder Ethanol verwendet werden.
Der in dem Verfahren erhaltene Extrakt kann als pharmazeutische Zusammensetzung oder Nahrungsergänzungsmittel formuliert werden.
Die Erfindung umfasst damit Verfahren zur Herstellung der Pflanzenextrakte aus Pflanzengut der oben genannten Pflanzen, insbesondere aus Ericaceae, z.B. Blättern, -Sproßspitzen und/oder -stängeln aus Preiselbeere, Heidelbeere, Moosbeere, Rauschbeere oder Rhododendron sowie aus den Früchten, Blättern oder Fruchthüllen der Rosskastanie oder aus Lorbeerblättern. Selbstverständlich kann auch eine Kombination aus diesen Pflanzen bzw. Pflanzenteilen verwendet werden.
Vorzugsweise werden die Blätter der Kulturpreiselbeere und der Kulturheidelbeere als Quelle verwendet, da diese Pflanzen in Plantagen kultiviert werden können und Früchte und Blätter getrennt zu unterschiedlichen Zeiten maschinell gesammelt werden können. Nach der Ernte der Früchte ist die Ernte der Blätter und/oder Sproßspitzen im Herbst oder im Winter, wenn die höchste Konzentration des Wirkstoffes auftreten und daher die größte Ausbeute realisiert werden kann, z.B. mit Kombines möglich.
Die Extraktion wird auf Basis des Pflanzenguts, insbesondere zerkleinerten Pflanzenguts, z.B. Homogenat von Blättern, Stän- geln, Sproßspitzen und/oder Früchten, durchgeführt. Die Zerkleinerung des Ausgangsstoffes erhöht die Ausbeute der Extraktion. Es kann getrocknetes oder frisches Pflanzengut verwendet werden, insbesondere in zerkleinerter Form.
Es wurden verschiedene Verfahren zur Extraktion getestet.
Eine vorgeschaltete Extraktion hydrophober Verbindungen (v.a. Fette) mit Hexan wurde getestet, erwies sich jedoch als nicht signifikant für die Wirksamkeit des Extrakts, und wurde daher in der Folge weggelassen.
Eine Extraktion mit Wasser bei erhöhten Temperaturen fand sehr schnell statt. Die Extrakte waren jedoch nicht sehr stabil, so dass sich bei Lagerung Präzipitate bildeten. Eine Extraktion mit Wasser-Ethanol-Mischungen war möglich. Es wurden allerdings wenig stabile Extrakte erhalten.
Eine alkalische oder saure Extraktion kann ebenfalls verwendet werden. Bei der alkalischen Extraktion wurde Pflanzengut (z.B. Blätterhomogenat von Kulturheidelbeeren oder Preiselbeere) in einer wässrigen basischen Lösung (0,05-0,5 N), besonders bevorzugt in Ammoniumhydroxidlösung (z.B. 0,1 mol/1) suspendiert und für einen längeren Zeitraum (z.B. 10 Stunden) bei 0 bis 10 0C, vorzugsweise bei +4 0C extrahiert wird. Alternativ wurde auch eine saure Extraktion mit wässriger saurer Lösung (0,05- 0,5 N), z.B. mit Salzsäure (z.B. 0,1 mol/1) , durchgeführt. Dem Fachmann werden verschiedene Variationen dieser Bereiche bekannt sein, bei denen das gleiche Extraktionsergebnis erzielt wird. In einem weiteren Verfahrensschritt wird der klare Extrakt nach Zentrifugation ohne Bodensatz mit einer Säure, vorzugsweise Essigsäure, oder im Falle der sauren Extraktion mit einer Base, insbesondere NaOH neutralisiert (pH 7-8), und die sich bildenden Präzipitate werden durch erneute Zentrifugation abgetrennt. Der so gewonnene Extrakt zeigt bereits eine starke Inhibitoraktivität. Bei längerer Lagerung zeigt sich jedoch auch hier eine Instabilität. Der Rohextrakt kann zur besseren Lagerung durch Lyophilisierung konserviert werden.
Die stabilsten Extrakte wurden bei der Extraktion des Pflanzengutes, zum Beispiel der Heidelbeer- oder Preiselbeerblätter, mit organischen Lösungsmitteln, insbesondere Aceton, erzielt. Dazu wird das trockene, zerkleinerte Extraktionsgut mit Aceton (100 %) bei 0-10 0C, insbesondere bei ca. 4 0C, extrahiert, z.B. ca. 12-36 Stunden, insbesondere ca. 24 Stunden. Diese Extraktion ist vollständiger und führt zu geringeren Verunreinigungen der Inhibitorzusammensetzung als andere Extraktionsverfahren. Neutralisations- und Zentrifugations- schritte sind nicht notwendig. Daher wird der erste Extraktionsschritt bevorzugt mit Aceton durchgeführt. Ein so erhaltener Extrakt kann bereits im Sinne der Erfindung verwendet werden.
Zur weiteren Aufreinigung kann eine Auftrennung mit Hilfe der „High Performance Liquid Chromatography" (HPLC) durchgeführt werden, bei der vorzugsweise eine CC 250/3 Nucleosil 100-3 C 18 Säule zur analytischen Präparation und eine EP 250/16 Nucleosil 100-3 C 18 Säule zur präparativen Trennung mit einem Wasser - Acetonitril - Gradienten in 0.1% Ameisensäure verwendet wird. Durch die Auftrennung mittels HPLC erhält man ein Spektrum mit mehreren Peaks, welche sich je nach der verwendeten Pflanze unterscheiden können (s. Figur 1, für Heidelbeere) . Es werden die Peaks gesammelt und optional vereinigt, welche eine Pankreasamylase und/oder Pankreaslipase hemmen können (s. Beispiel 3 und 4) . Dies sind, wie Hemmversuche mit Schweinepankreasamylase und Schweinepankreaslipase gezeigt haben, vor allem Peaks, welche ungefähr zwischen 11 und 16 Minuten, insbesondere um 12, 13, 14 oder 15 Minuten, auftreten. Eine Verbesserung der Ausbeute ergab sich bei erhöhter Durchflußrate der HPLC, diese beträgt bevorzugt mindestens 1,5 ml/min, besser etwa 2,5 ml/min, am meisten bevorzugt mindestens etwa 3.75 ml/min.
Es wurde jedoch ein Verlust der Aktivität bei Fraktionen beobachtet, welche über HPLC aufgereinigt wurden.
Die über HPLC isolierte Reinstsubstanz 864 in Wasser ist in eingeengter Form (1 mg/ml) über Monate bis zu einem halben Jahr stabil, wie NMR-Untersuchungen gezeigt haben.
Auch eine weitere Aufreinigung des Extrakts mit SPE C18- Patronen (Supelco 595, Bellefonte, PA, USA, Supercosil LC-18- DB, 5μm, Column Dimensions: 25 cm x 21.2 mm), Verwendung nach den Anweisungen des Herstellers) ist möglich, führte jedoch auch zu Verlusten an Aktivität und Stabilität gegenüber dem Rohextrakt. Eine Aufreinigung über HPLC, auch eine SPE C18- Säule, sollte so schnell wie möglich durchgeführt werde.
Daher ist es bevorzugt, zur Entfernung hydrophober Komponenten zu dem Aceton-Extrakt zunächst Wasser hinzuzufügen, insbesondere ein ungefähr gleiches Volumen, und dann eine weitere Extraktion mit Toluen (z.B. mit ungefähr gleichem Volumen) durchzuführen, gegebenenfalls auch mehrfach (zum Beispiel zwei- oder dreimal) , wobei man die Toluen-haltige Fraktion verwirft und einen wässrigen Extrakt erhält. Eine solche Ex- traktion mit Toluen kann z.B. für 2-8 Stunden durchgeführt werden, bevorzugt für etwa 4 Stunden. Falls vorhanden, können vor und/oder nach der Extraktion mit Toluol eventuelle Präzi- pitate durch Zentrifugation (ca. 2000 - 4000 U/min) abgetrennt werden.
Bevorzugt wird die vollständige Extraktion bei 0-10 0C durchgeführt, insbesondere bei ca. 4 0C.
Bevorzugt ist der erfindungsgemäße Extrakt über mindestens einen Monat, insbesondere mindestens 2, mindestens 6 oder mindestens 12 Monate stabil, seine Wirkung bei der Inhibition z.B. von Pankreasamylase also weniger als 50%, bevorzugt weniger als 20% oder weniger als 10% oder gar nicht gegenüber der Wirikung von frisch isoliertem Extrakt vermindert.
Das verwendete Extraktionsverfahren kann je nach Pflanzenmaterial ausgewählt oder variiert werden. Selbstverständlich können auch verschiedene Extraktionsverfahren kombiniert werden.
Bei Pflanzen, deren physiologische Verträglichkeit bekannt ist, z.B. die genannten Vaccinium-Arten, wie Heidelbeere, Cranberry oder Preiselbeere, wird bevorzugt eine Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel wie Aceton oder Methanol durchgeführt, optional mit einer darauffolgenden Extraktion mit Toluen. Auf eine weitere Aufreinigung über Chromatographie kann insbesondere bei diesen Pflanzen verzichtet werden. Sofern noch andere Substanzen mit im Zusammenhang mit der gewünschten Verwendung pharmakologisch unerwünschte Wirkungen in einem solchen Extrakt enthalten sind, ist deren Abtrennung, z.B. über eine Aufreinigung mit chromatographischen Verfahren wie HPLC empfehlenswert. Acetonische Extrakte enthalten weniger weitere Substanzen als z.B. methanolische Extrakte. Solche Substanzen können gegebenenfalls auch auf andere Weise abgetrennt werden. Je nach der gewünschten Verwendung möglicher- weise unerwünschte Substanzen sind dem Fachmann bekannt. Sie können je nach Zulassungsverfahren auch nach nationalem Recht variieren.
Bevorzugt enthält der erfindungsgemäße Extrakt kein oder wenig Cumarin, insbesondere keine Mengen an Cumarin, welche als gesundheitsschädlich betrachtet werden könnten. Unter anderem dadurch unterscheiden sich die erfindungsgemäßen Extrakte z.B. von Zimtextrakten.
Grundsätzlich kann auch nicht extrahiertes Pflanzengut, z.B. Sproßspitzen, Stängel, Blätter, Beeren oder Früchte der genannten Pflanzen, insbesondere der Vaccinium-Arten für die o- ben beschriebenen medizinischen Anwendungen verwendet werden. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung von Pflanzengut von Ericaceae, Aesculus hippocastaneum, und/oder Aesculus pavia zur Behandlung und/oder Vorbeugung von Adipositas und/oder Diabetes mellitus Typ 2. So könnten auch Tees aus dem genannten Pflanzengut die Therapie mit Schluckkapseln, Dragees oder Heilsaft ergänzen.
Die folgenden Beispiele beschreiben die Aufreinigung eines erfindungsgemäß zu verwendenden Pflanzenextrakts aus Pflanzengut von Ericaceae, insbesondere von Heidelbeerblättern bzw. Preiselbeerblättern, sowie die Überprüfung seiner Wirksamkeit.
Die Beispiele sollen die Erfindung veranschaulichen, aber nicht beschränken. Die in der Anmeldung genannten Referenzen werden hierin durch Bezugnahme vollständig aufgenommen.
Beschreibung der Figuren:
Figur 1 zeigt eine präparative HPLC eines Blaubeerblätter- Extraktes. Obere Linie - Totalionenchromatogramm; untere Linie - extrahierteFraktion bei 15 Min (v.a. Inhibitor 864) . Figur 2 zeigt das Massenspektrum der durch HPLC erhaltenen Fraktionen des Peaks nach 15 Minuten.
Figur 3 zeigt Unterschiede der Konzentration an Inhibitor in einer HPLC-Analyse von Extrakt aus Heidelbeerblättern, die im Sommer (untere, graue Linie) und im Winter (obere Linie) gesammelt wurden.
Beispiele
Beispiel 1
Herstellung eines Pflanzenextrakts aus Heidelbeerblättern
Heidelbeerblätter, Preiselbeerblätter und -sprossen wurden jeweils in 100% Aceton suspendiert und für 24 Stunden bei 4 0C im Kühlschrank extrahiert. Dann wurde der acetonische Extrakt mit einem ca. gleichen Volumen Wasser verdünnt und bei 2000 - 4000 U/min abzentrifugiert , um eventuelle Präzipitate zu entfernen. Der klare Extrakt wurde mit ca. gleichem Volumen an Toluol für ca. 4 Stunden extrahiert, um hydrophobe Komponenten aus dem Extrakt zu entfernen. Die Toluollösung wird verworfen, und so ein wässriger Extrakt gewonnen.
Dieser Extrakt kann mit Hilfe der HPLC weiter analysiert und/ oder aufgereinigt werden. Mit einer Shimadzu HPLC - Anlage (Pumpen LC-9A, Säulenofen CTO-10 AS VP bei 25° C, Autoinjektor SIL-9A, UV-Detektor SPD-IO AV) und einer CC 250/3 Nucleo- sil 100-3 C 18 Säule der Firma Macherery - Nagel, Düren, Deutschland und Acetonitril als Lösungsmittel wurden 2 Haupt- peaks identifiziert. Für die analytische HPLC wurde eine CC 280/3 Nucleosil 100-3 C18 - Säule verwendet, für die präpara- tive HPLC eine EP 250/16 Nucleosil 100-3 C 18- Säule. Um die Fraktionen bei laufender Fraktionierung mit Massenspektroskopie (MS) charakterisieren zu können, wurde ein Splitter nach der Passage der Flüssigkeit durch die Säule eingeschaltet, so dass für die Präparation des Inhibitors etwa 90% der Fraktion 864 mit einem Fraktionssammler aufgefangen werden konnte.
Die so erhaltenen Fraktionen können mit Hilfe enzymatischer Tests auf ihre Inhibitorwirkung auf Verdauungsenzyme, insbesondere Pankeasamylase und Pankeaslipase getestet werden (s. Beispiele 3 und 4) . Wirksame Fraktionen können vereinigt werden.
Beispiel 2 Aufklärung der Struktur einer Leitsubstanz
Mit der Massenspektroskopie wurden in Peaks in Chromatogrammen der Extrakte reproduzierbar Moleküle verschiedener Molekülmassen identifiziert, 288, 864 und 1152. Vor allem die Peaks, welche Moleküle mit der Masse 864 umfassen (nicht protonierte Form, in der Folge auch bezeichnet als Inhibitor 864 oder Fraktion 864), weisen eine Wirkung in den Enzymtests auf. Der Verbindung mit der Molekülmasse 864 kann die Struktur der Formel I oder II zugeordnet werden:
Formel I Formel II
Figure imgf000020_0001
Daher umfasst der erfindungsgemäße Pflanzenextrakt vorzugsweise ein Molekül mit einer Masse von 864, insbesondere das PoIy- phenol nach Formel I und/oder Formel II. Solche Substanzen werden im Rahmen der Erfindung als Procyanidin A3-Isomere bezeichnet .
Ohne an die Hypothese gebunden sein zu wollen, wird angenommen, dass diese Verbindungen zumindest für einen Teil der Wirkung des Pflanzenextrakts verantwortlich sind. Andere Isomere, Derivate, Zerfalls- und/oder Synthese-Zwischenprodukte können jedoch zur Wirksamkeit und/oder Stabilität des Extrakts beitragen oder diese bewirken, genau wie gegebenenfalls gemeinsam mit dieser Verbindung extrahierte sekundäre Pflanzenstoffe (z.B. Polyphenole) , insbesondere als Antioxidationsmittel .
Überraschenderweise wiesen Extrakte aus im Herbst und insbesondere Winter gesammelten Pflanzen besonders viel Inhibitor 864 auf (vgl. Fig. 3) und waren besonders aktiv.
Beispiel 3 Wirkung des isolierten Inhibitors auf α-Amylase
Um die Inhibitoraktivität der verschiedenen Fraktionen des Extrakts, die nach der HPLC-Aufreinigung erhalten wurden, zu bestimmen, wurde das „INFINITY™ AMYLASE LIQUID STABLE REAGENT" der Firma ThermoDMA, Louisville, CO, USA verwendet (Katalog- Nr. 1174-200H) und der Enzymtest nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.
Bei diesem Test wird das Substrat Ethyliden-pNP-G7 (Ethyliden- p-Nitrophenol-maltoheptaose) durch α-Amylase umgesetzt. Nachdem das Substrat von α-Amylase gespalten wurde, werden die kleineren Fragmente durch α-Glucosidasen weiter gespalten, so daß pNP (p-Nitrophenol) gebildet wird. Die Bildungsrate des pNP ist proportional zur α-Amylase-Aktivität in der Probe und kann durch einen Anstieg der Absorption bei 410/520 nm gemessen werden.
Vorliegend wurde α-Amylase aus Schweinepankreas eingesetzt. 1 mg/ml α-Amylase in PBS („phosphate buffered saline") wurde mit PBS 1:4 verdünnt und von dieser Lösung wurden 2,5 μl pro Ansatz eingesetzt.
Ansatz :
1,5 ml Substratlösung und gegebenenfalls 20 μl Inhibitorlösung (aus verschiedenen Fraktionen der HPLC Aufreinigung oder verschiedenen Pflanzen) wurden für 5 min bei 37 0C vorinkubiert, danach wurden 2,5 der Test-α-Amylase-Lösung zugegeben und die Absorption (Abs) bei 405 nm nach 60 Sekunden gemessen.
Die Aktivität der α-Amylase läßt sich dann mit Hilfe der folgenden Formel berechnen:
Aktivität in U/l = ΔAbs/min x Faktor
wobei der Faktor berechnet wird durch:
TVxX 000x1,27 Faktor = —
SVxExP mit
TV = Gesamtvolumen (1,5 ml)+ 25μl Amylase + 20 μl Inhibitor =
1,5225 ml
SV = Probenvolumen in ml (0,0025 ml)
E = Extinktionskoeffizient von pNP bei 405 nm: 10,13
P = Küvettenlänge (1)
Für die Berechnung der Enzymaktivität, die in Tabelle 1 beispielhaft für die Fraktion 864 isoliert aus Heidelbeerblättern dargestellt ist, wurden die Ergebnisse von jeweils drei Absorptionsmessungen verwendet.
Sowohl der Rohextrakt als auch die Peaks aus der HPLC- Extraktion, welche die Verbindung mit der Molekülmasse 864 umfassen, stellen effiziente Inhibitoren dar.
Tabelle 1: Ergebnisse des α-Amylase-Aktivitätstests unter Einsatz von Pflanzenextrakt aus Heidelbeere (Inhibitor 864), Probenentnahme nach 60 sec
Figure imgf000023_0001
Die Ergebnisse des α-Amylase-Aktivitätstests zeigen deutlich, daß die Inhibitorlösung aus Heidelbeere die Aktivität der α- Amylase signifikant hemmt. Die Hemmung betrug 83,6 %, die Aktivität wurde von 100% auf 16,4% reduziert.
Beispiel 4 Wirkung des isolierten Inhibitors auf Pankreaslipase
Lipase (ICN Biochemicals Inc. USA) (1 mg/ml) wurde 1:4 mit 0,9 %iger NaCl-Lösung verdünnt, und es wurden 15 μl pro Ansatz eingesetzt .
Die Lipaseaktivitätsmessungen wurden mit dem Lipase-PS TM Kit der Firma Sigma Diagnostics, Sigma Deisenhofen (Catalog- No.805-A) ausgeführt. Ansatz :
0,9 ml Substratlösung wurden für 2 Minuten bei 37 0C in der Ku- vette inkubiert. Anschließend wurden 15 μl destilliertes H2O, 15 μl Standardlösung oder 15 μl Lipase (1:4 verdünnt) zugegeben und für weitere 5 Minuten inkubiert. Danach wurden je Ansatz 300 μl Aktivatorlösung und gegebenenfalls 20 μl Inhibitorlösung (Extrakte aus verschiedenen Pflanzen, gezeigt für Heidelbeere) zugegeben und die Absorption (A) bei 550 nm nach 3 Minuten (INITIAL A) und nach 5 Minuten (FINAL A) gemessen.
Berechnung der Lipaseaktivität :
ΔA-Leerwert = FINAL A-Leerwert - INITIAL A-Leerwert
0, 021 = 0, 150 - 0, 129
ΔA-Standard = FINAL A-Standard - INITIAL A- Standard
0,124 = 0,363 - 0,239
ΔA-Probe = FINAL A-Probe - INITIAL A-Probe
Ungehemmte Probe:
I: 0,380 = 0,945 - 0,565
II: 0,403 = 0,994 - 0,591
III: 0,402 = 0,951 - 0,549
Gehemmte Probe (20 μl Substanz 865 - Lösung Heidelbeere)
ΔA-Probe = FINAL A-Probe - INITIAL A-Probe
I: o, 122 = 0, 388 - 0, 266
II: 0, 132 = 0, 417 - 0,285
III : =, 128 = 0, 402 - 0, 273
Lipaseaktivität (U/l) = ΔA-Probe - ΔA-Leerwert/ ΔA-Standard - ΔA-Leerwert X 248
Die Lipaseaktivität des Standards wurde vom Hersteller mit 248 U/l angegeben. Lipase-Aktivität der ungehemmten Probe
Lipaseaktivität (U/l) = 0,38 - 0,021/ 0,124 - 0,021 X 248
I: 864 U/l
II: 919 U/l
III: 917 U/l
Mittelwert und Streuung ungehemmte Probe: 891 + 38 U/l (100%)
Lipaseaktivität mit Inhibitor (20 μl Fraktion 865, Heidelbeere)
I: 243 U/l
II: 267 U/l
III: 260 U/l
Mittelwert und Streuung gehemmte Probe: 257 ± 12 U/l (28%)
Durch Zugabe der Inhibitorlösung (Fraktion 864) wurde die Aktivität von 891 (100%) auf 257 (28%) U/l reduziert, es ergab sich also eine Hemmung von 72%.
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Claims

Patentansprüche
1. Polyphenol-haltiger Pflanzenextrakt aus Pflanzengut von Ericaceae, Aesculus hippocastaneum, Aesculus pavia und/ oder Laurus nobilis zur Behandlung und/oder Vorbeugung von Adipositas und/oder Diabetes mellitus Typ 2.
2. Pflanzenextrakt nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er durch ein Verfahren herstellbar ist, welches Schritte umfasst, bei denen man a) Pflanzengut zerkleinert, und b) das Pflanzengut mit einem organischen Lösungsmittel, insbesondere Methanol oder Aceton, extrahiert.
3. Pflanzenextrakt nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass er durch ein Verfahren herstellbar ist, welches Schritte umfasst, bei denen man a) Pflanzengut zerkleinert, und b) das Pflanzengut mit Aceton extrahiert, c) mit Wasser verdünnt, d) i) mit Toluol extrahiert, wobei man das Toluol verwirft, oder ii) hydrophobe Komponenten über eine C18 SPE-Patrone entfernt, oder iii) über eine HPLC Fraktionen isoliert, welche eine
Amylase- und Lipaseinhibitoraktivität aufweisen, so dass man e) einen wässrigen Extrakt erhält.
4. Pflanzenextrakt nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Ericaceae eine Vaccinium- Art, insbesondere Preiselbeere (Vaccinium vitis-idea) , Heidelbeere (Vaccinium myrtillus) , Moosbeere (Vaccinium oxycoccus, Vaccinium macrocarpon, Vaccinium microcarpum und/oder Vaccinium erythrocarpum) und/oder Trunkelbeere (Vaccinium uliginosum) oder Rhododendron, insbesondere Rhododendron catawbiense, ist.
5. Pflanzenextrakt nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Pflanzengut Früchte, Blätter, Sproßspitzen und/oder Stängel der Pflanzen umfasst.
6. Pflanzenextrakt nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Pflanzengut im Herbst oder Winter geerntet wurde.
7. Pflanzenextrakt nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyphenol Procyanidin A3- Isomere umfasst.
8. Pflanzenextrakt nach einem der vorherigen Ansprüche, da¬ durch gekennzeichnet, dass er ferner weitere sekundäre Pflanzenstoffe umfasst.
9. Pflanzenextrakt nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass er Antioxidationsmittel und/oder einen pharmazeutisch geeigneten Träger umfasst.
10. Verwendung des Pflanzenextrakts nach einem der vorherigen Ansprüche zur Behandlung und/oder Vorbeugung von Adiposi- tas und/oder Diabetes mellitus Typ 2.
11. Verfahren zur Herstellung des Pflanzenextrakts nach einem der Ansprüche 1 - 9, Schritte umfassendbei denen man a) Pflanzengut zerkleinert, und b) das Pflanzengut mit einem organischen Lösungsmittel, insbesondere Methanol oder Aceton, extrahiert.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass man a) Pflanzengut zerkleinert, und b) das Pflanzengut mit Aceton extrahiert, c) mit Wasser verdünnt, d) i) mit Toluol extrahiert, wobei man das Toluol verwirft, oder ii) hydrophobe Komponenten über eine C18 SPE-Patrone entfernt, oder iii) über eine HPLC Fraktionen isoliert, welche eine
Amylase- und Lipaseinhibitoraktivität aufweisen, so dass man e) einen wässrigen Extrakt erhält.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass man den erhaltenen Extrakt als pharmazeutische Zusammensetzung oder als Nahrungsergänzungs- mittel formuliert.
14. Verwendung von Pflanzengut von Ericaceae, Aesculus hippo- castaneum und/oder Aesculus pavia zur Behandlung und/oder Vorbeugung von Adipositas und/oder Diabetes mellitus Typ 2.
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