DE102009005201A1

DE102009005201A1 - Verwendung von Polyphenol-haltigen Pflanzenextrakten zur Behandlung von Adipositas und Diabetes mellitus Typ 2

Info

Publication number: DE102009005201A1
Application number: DE102009005201A
Authority: DE
Inventors: Ludwig Prof. Dr. Jonas; Peeter Dr. Toomik; Tönu Dr. Püssa
Original assignee: Universitaet Rostock
Current assignee: Universitaet Rostock
Priority date: 2009-01-20
Filing date: 2009-01-20
Publication date: 2010-07-22
Also published as: WO2010083937A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Polyphenol-haltigen Pflanzenextrakten zur Behandlung von Adipositas und Diabetes mellitus Typ 2. Die Extrakte enthalten spezifische Polyphenolverbindungen, insbesondere Procyanidin A3-Isomere. Gegenstand der Erfindung sind auch Verfahren zur Herstellung solcher Extrakte aus Pflanzen, insbesondere aus Blättern und Stengeln. Die Pflanzen sind bevorzugt Ericaceae, z.B. Vaccinium-Arten, insbesondere Preiselbeere (Vaccinium vitis-idea), Heidelbeere (Vaccinium myrtillus), Moosbeere (Vaccinium oxycoccus, Vaccinium macrocarpon (auch engl. als Cranberry bezeichnet), Vaccinium microcarpum, Vaccinium erythrocarpum) und Trunkelbeere (Vaccinium uliginosum). Identische oder ähnliche Verbindungen mit gleicher Wirkung lassen sich aus der Rosskastanie Aesculus hippocastaneum und Aesculus pavia sowie aus der Gewürzlorbeer (Laurus nobilis), und aus Rhododendron-Arten, insbesondere Rhododendron catawbiense gewinnen und mit gleichen Wirkungen einsetzen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Polyphenol-haltige Pflanzenextrakte zur Behandlung und/oder Vorbeugung von Adipositas und Diabetes mellitus Typ 2 und die Verwendung solcher Extrakte zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen bzw. Nahrungsergänzungsmitteln. Die Extrakte enthalten spezifische Polyphenolverbindungen, insbesondere Procyanidin A3-Isomere. Gegenstand der Erfindung sind auch Verfahren zur Herstellung solcher Extrakte aus Pflanzengut, insbesondere aus Früchten, Blättern und Stengeln bzw. Sproßspitzen. Die Pflanzen sind bevorzugt Ericaceae, insbesondere Vaccinium-Arten, wie Preiselbeere (Vaccinium vitis-idea), Heidelbeere (auch als Blaubeere bezeichnet, Vaccinium myrtillus), Moosbeere (z. B. Vaccinium oxycoccus, Vaccinium macrocarpum, Vaccinium microcarpum, Vaccinium erythrocarpum) und/oder Trunkelbeere (Vaccinium uligi nosum) oder Rhododendron-Arten, insbesondere Rhododendron catawbiense. Ähnliche Extrakte mit gleicher Wirkung lassen sich aus Früchten und Blättern der Roßkastanie Aesculus hippocastaneum und Aesculus pavia sowie aus den Blättern von Gewürzlorbeer (Laurus nobilis) gewinnen und mit gleichen Wirkungen einsetzen.
Die Fettsucht (Adipositas) ist heute in den Industrienationen ein weitverbreiteter Risikofaktor für die Ausbildung eines Typ 2 Diabetes (Beller 2004; Kemper et al. 2004; Lobstein und Leach 2004; Plagemann und Harder 2004; Ramchandani 2004; Scheen 2003). Diese Erkrankung wird in den USA und Westeuropa zum Massenphänomen. Ein Viertel der US-Bürger und immer mehr Jugendliche in Deutschland leiden an Übergewicht und Fettsucht.
Die Fettsucht basiert zum größten Teil auf zu hohem Konsum von Kohlenhydraten und Fetten sowie auf Bewegungsarmut.
Die Hauptkohlenhydrate Stärke und Glykogen werden im Darm durch Enzyme, hauptsächlich von Pankreasamylase (α-Amylase), abgebaut. Weiterhin dient Pankreaslipase zur Spaltung von Fetten. Die Pankreas-Amylase und -Lipase werden neben vielen anderen Enzymen des exokrinen Pankreas in den Pankreasazinuszellen synthetisiert, in den Zymogengranula gespeichert und durch hormonelle und nervale Reize in die Drüsenlumina sezerniert, fließen durch die Ausführungsgänge der Bauchspeicheldrüse und werden in den Zwölffingerdarm abgegeben, wo die Substratspaltung (Kohlenhydrate, Lipide) erfolgt und dadurch die Resorbierbarkeit der Nahrungsbestandteile erreicht wird.
Durch oral verabreichte Inhibitoren der Pankreasamylase und -Lipase kann die Verdaulichkeit der Kohlenhydrate und Neutralfette in der Nahrung gestört und damit die Resorbierbarkeit verhindert werden. Das dreidimensionalen Modell der Pankreas amylase zeigt, daß diese Proteinstruktur ein aktives, Ca¹⁺-abhängiges enzymatisches Zentrum sowie drei lektinartige Zuckerbindungsdomänen besitzt (Machius et al., 1996).
Derzeit werden am Markt α-Glykosidasehemmer vertrieben, die den Glukoseanstieg nach einer Mahlzeit verzögern und verringern und damit die resorptionsbedingte Glukoseerhöhung in einen günstigeren zeitlichen Bezug zur beeinträchtigten Insulinsekretion stellen. Das Präparat Acarbose (Glucobay^®, Bayer Leverkusen, Deutschland) ist ein Beispiel solch eines α-Glykosidasehemmers. Acarbose ist ein Oligosaccharid mikrobiellen Ursprungs, das kompetitiv intestinale Disaccharidasen (Maltase, Lactase, Saccharase, Trehalase), die an die Oberfläche der den Dünndarm auskleidenden Epithelzellen gebunden sind, hemmt. Diese Verbindung verzögert in kleinen Dosen die intestinale Resorption von Disacchariden (Caspary, 1978; Jenkins et al., 1981; Clissold und Edwards, 1988). Die niedermolekularen Zucker akkumulieren im Darmlumen und werden vermehrt bakteriell unter Gasbildung metabolisiert. Als sehr häufig bis häufig auftretende Nebenwirkungen von Glucobay^® wurden Blähungen (Flatulenz), Darmgeräusche (Meteorismus), Durchfall und Bauchschmerzen beschrieben. Darüber hinaus kann es gelegentlich zu Übelkeit und in seltenen Fällen zu klinisch relevanten Leberenzymanstiegen kommen.
Acarbose wirkt auch als Inhibitor der Pankreasamylase. Es konnte gezeigt werden, daß der Wirkstoff Acarbose an das aktive Zentrum, jedoch nicht an die drei Zuckerbindungsdomänen bindet (Jonas et al., 2003).
Als Lipasehemmer wird zum Beispiel der Wirkstoff Orlistat (Xenical^®, Roche, Deutschland) eingesetzt. Bei der Behandlung mit Xenical^® kann es zu einer Vielzahl von Nebenwirkungen kommen. Am häufigsten treten gastrointestinale Nebenwirkungen, wie zum Beispiel Bauchschmerzen, Flatulenz oder Stuhlinkontinenz auf. Zusätzlich wurden weitere Nebenwirkungen, wie z. B. Kopfschmerzen, Infekte der oberen und unteren Atemwege, Harnwegsinfekte und Hepatitis beschrieben.
Pflanzliche Präparate aus Zimt wurden für die Behandlung von Diabetes mellitus vorgeschlagen (Anderson et al., 2004; Qin et al., 2003; Khan et al., 2003; JP 9275979 ). Es wurde berichtet, dass Extrakte aus Zimt die Wirkung von Insulin steigern können bzw. Inhibitoren von Amylase enthalten.
Vor diesem Hintergrund liegt die Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, alternative Zusammensetzungen bereitzustellen, die sich für die Vorbeugung und Behandlung von Adipositas und Diabetes mellitus Typ 2 eignen und die im Vergleich zu bereits vorhandenen Verbindungen verringerte Nebenwirkungen aufweisen. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung, insbesondere durch den Gegenstand der Ansprüche, gelöst.
Die Erfindung betrifft insbesondere einen Polyphenol-haltigen Pflanzenextrakt aus Pflanzengut von Ericaceae, Aesculus hippocastaneum, Aesculus pavia und/ oder Laurus nobilis. Dieser ist zur Behandlung und/oder Vorbeugung von Adipositas und/oder Diabetes mellitus Typ 2 geeignet.
Im Rahmen der Untersuchungen zur vorliegenden Erfindung wurde festgestellt, dass die erfindungsgemäßen Pflanzenextrakte besonders wirksam Verdauungsenzyme des Magen-Darm-Traktes inhibieren. Es werden zum Beispiel sowohl die Pankreasamylase als auch die Pankreaslipase gehemmt. Darüber hinaus können andere Pankreasenzyme, insbesondere Verdauungsenzyme, die sich im Darmlumen befinden, gehemmt werden.
Durch die Hemmung der Pankreasamylase wird die hydrolytische Spaltung der 1,4-α-glykosidischen Bindungen in Glukosepolyme ren wie Stärke und Glykogen reduziert. Vor allem die Stärke wird weniger verflüssigt und in Folge dessen werden weniger Oligosaccharide gebildet, so daß im Darm weniger Zuckermoleküle für die Resorption zur Verfügung stehen.
Die Hemmung der Pankreaslipase verhindert die Spaltung von Triacylglycerinen, wodurch die Resorption von Mono- und Diglyceriden, freien Fettsäuren und Glycerin verhindert bzw. vermindert wird. Eine Ausführungsform betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen Pflanzenextrakte zur Inhibierung von Lipasen, insbesondere von Pankreaslipasen.
Die erfindungsgemäßen Extrakte sind also vorzugsweise dazu geeignet, sowohl Pankreasamylase als auch Pankeaslipase zu inhibieren.
Diese Eigenschaften der Pflanzenextrakte führen dazu, dass bei Fettsüchtigen, deren Fettsucht auf übermäßigem Kohlenhydrat- und Fettverzehr basiert, das Körpergewicht reduziert und ein Diabetes mellitus Typ 2 verhindert bzw. bei schon bestehendem Diabetes Typ 2 dieser gemildert werden kann, insbesondere, wenn die Verbindungen vor/mit der Nahrungsaufnahme aufgenommen werden.
Ein erfindungsgemäßer Pflanzenextrakt ist durch ein Verfahren herstellbar, welches Schritte umfasst, bei denen man

a) Pflanzengut zerkleinert, und
b) das Pflanzengut mit einem Lösungsmittel, insbesondere einem organischen Lösungsmittel wie Aceton, Methanol oder Ethanol, extrahiert.

Bevorzugt ist der Extrakt durch ein Verfahren herstellbar, welches Schritte umfasst, bei denen man

a) Pflanzengut zerkleinert, und
b) das Pflanzengut mit Aceton extrahiert,
c) mit Wasser verdünnt,
d) i) mit Toluol extrahiert, wobei man das Toluol verwirft, oder
ii) hydrophobe Komponenten über eine C18 SPE-Patrone entfernt, oder
iii) über eine HPLC Fraktionen isoliert, welche eine Amylase- und Lipaseinhibitoraktivität aufweisen, so dass man
e) einen wässrigen Extrakt erhält.

Mögliche Verfahren werden unten näher erläutert.
Bevorzugt stammt das Pflanzengut von Ericaceae, insbesondere Ericoideae, wobei zu dieser Unterfamilie auch die Rhododendroideae hinzugezählt werden, in einer Ausführungsform aus Ericeae oder in einer anderen aus Rhodoreae. Insbesondere stammt es von einer Vaccinium-Art, z. B. Preiselbeere (Vaccinium vitis-idea), Heidelbeere (Vaccinium myrtillus), Moosbeere (Vaccinium oxycoccus, Vaccinium macrocarpon, Vaccinium microcarpum und/oder Vaccinium erythrocarpum) und/oder Trunkelbeere (Vaccinium uliginosum) oder einer Rhododendron-Art, insbesondere Rhododendron catawbiense. Es wurde gezeigt, dass sich aus der Kastanie, insbesondere der Roßkastanie Aesculus hippocastaneum oder aus Aesculus pavia sowie aus Gewürzlorbeer (Laurus nobilis) ebenfalls ein wirksamer Extrakt gewinnen lässt.
Das verwendete Pflanzengut kann Früchte, Fruchtschalen, Blätter, Sproßspitzen, Blüten, Wurzeln, Rinde und/oder Stängel der Pflanzen umfassen. Bei den Ericaceae und Laurus nobilis werden bevorzugt Blätter, Sproßspitzen oder Stängel verwendet, bei Aesculus insbesondere Früchte, Fruchtschalen oder Blätter. Es kann getrocknetes oder frisches Pflanzengut verwendet werden.
Es hat sich überraschenderweise gezeigt, dass es besonders vorteilhaft ist, wenn das Pflanzengut im Herbst oder Winter (z. B. bei Minusgraden) geerntet wurde. Vor allem bei im Winter geernteten Blättern der Ericaceae, insbesondere der Vaccinia-Arten, geernteten Blättern oder Sproßspitzen wurde besonders große Wirksamkeit festgestellt.
Es wurde gezeigt, dass die erfindungsgemäßen Extrakte Polyphenol Procyanidin A3-Isomere umfassen, insbesondere solche mit einer massenspektrometrisch bestimmten molekularen Masse von 864, wie sie z. B. mit den Verbindungen nach Formel I oder Formel II (siehe Beispiel 2) dargestellt sind. Die Substanz mit dieser Masse wird in der Folge auch als Inhibitor 864 bezeichnet. Dies ist als Leitsubstanz zu verstehen, welche mit der Wirkung assoziiert ist. Bevorzug umfasst der erfindungsgemäße Extrakt jedoch ferner weitere sekundäre Pflanzenstoffe. Diese können zur Wirkung beitragen, aber auch die Verträglichkeit für Patienten erhöhen und/oder die Stabilität verbessern. Der Extrakt kann z. B. weitere Verbindungen enthalten, die in der HPLC mit Inhibitor 864 co-eluieren.
Weitere sekundäre Pflanzenstoffe, die in dem Extrakt enthalten sein können, sind z. B. weitere Polyphenole, Anthocyane und/oder Ascorbinsäure.
In einer Ausführungsform der Erfindung umfassen die erfindungsgemäße Pflanzenextrakte ein zusätzliches Antioxidationsmittel. Im Rahmen der Beschreibung der Erfindung wird „ein” nicht als Zahlwort verwendet, sondern umfasst auch eine Mehrzahl, es können also z. B. auch mehrere Antioxidationsmittel umfasst sein.
Antioxidationsmittel können zugesetzt werden. Dadurch lässt sich die Stabilität der Verbindungen erhöhen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Antioxidationsmittel Ascorbinsäure (Vitamin C). Weitere mögliche Antioxidationsmit tel sind zum Beispiel Ascorbate, Ascorbinsäureester, Tocopherole, Di-, Tri- und Polyphosphate, etc.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst der Pflanzenextrakt, insbesondere der Rohextrakt nach einem Extraktionsschritt oder der Extrakt nach Extraktion mit Aceton und Toluol, jedoch ohne chromatographische Aufreinigung, bereits Antioxidationsmittel, so dass ein weiterer Zusatz möglich, aber nicht notwendig ist.
Der Extrakt kann lyophilisiert sein, was die Lagerfähigkeit verbessert. Bevorzugt ist eine Lyophilisierung, welche nicht zur vollständigen Trocknung führt, sondern einen Rest Flüssigkeit beläßt, z. B. bis zu einer Konzentration von 1 mg/ml. Zur Resuspension kann z. B. Wasser oder PBS (Phosphat-gepufferte Salzlösung) verwendet werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird dem Pflanzenextrakt pharmazeutisch geeignetes Trägermaterial zugesetzt, welches flüssig (z. B. Wasser, PBS, Alkohol, z. B. Ethanol, Öl oder eine Mischung daraus) und/oder fest sein kann.
Im Einklang mit den vorangegangenen Ausführungen wird somit eine Zusammensetzung bereitgestellt, die zusätzlich zu dem erfindungsgemäßen Pflanzenextrakt Antioxidationsmittel, bevorzugt Ascorbinsäure, und/oder pharmazeutisch geeignete(s) Trägermaterial(ien), z. B. Chitosan umfasst, insbesondere in geeigneter Formierung. Eine Kombination mit Chitosan weist den zusätzlichen Vorteil auf, dass dadurch eine Bindung von Blutfetten stattfinden kann. Chitosan adsorbiert die Wirkstoffe des Pflanzenextrakts sehr gut und gibt sie langsam wieder ab.
Die Zusammensetzung kann in einer bevorzugten Ausführungsform in Form einer Flüssigkeit, einer Tablette oder einer Kapsel zur oralen Verabreichung ausgestaltet sein. Teezubereitungen aus dem genannten Pflanzenmaterial können zur Unterstützung des therapeutischen Effektes herangezogen werden.
Es kann sich bei dem erfindungsgemäßen Pflanzenextrakt bzw. der Zusammensetzung um eine pharmazeutische Zusammensetzung, ein Lebensmittel oder ein Nahrungsergänzungsmittel handeln, was sich vor allem nach nationalem Recht richtet. Diese Begriffe werden daher hier austauschbar verwendet.
Der erfindungsgemäße Pflanzenextrakt kann zur Behandlung und/oder Vorbeugung von Adipositas und/oder Diabetes mellitus Typ 2 bzw. zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung bzw. eines Nahrungsergänzungsmittels zur Behandlung und/oder Vorbeugung von Adipositas und/oder Diabetes mellitus Typ 2 verwendet werden. Bevorzugt ist die pharmazeutische Zusammensetzung bzw. das Nahrungsergänzungsmittel zur Verabreichung vor oder mit der Nahrungsaufnahme formuliert.
Eine angemessene Dosis kann von dem behandelnden Arzt in Anbetracht der gewünschten Wirkung und der tatsächlichen Umstände bestimmt werden und ist von vielen Faktoren, wie z. B. Geschlecht, Körpergewicht u. a., abhängig. Eine Dosierung des Extrakts in einer Menge, welche ca. 0,5–5 mg, bevorzugt ca. ca. 3 mg der Leitsubstanz Inhibitor 864 umfasst, ist möglich, wobei der Extrakt für eine Verabreichung in drei Dosen morgens, mittags und abends, z. B. je 1 mg vor oder zu den Mahlzeiten formuliert sein könnte.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung des Pflanzenextrakts, Schritte umfassend, bei denen man

a) Pflanzengut zerkleinert, und
b) das Pflanzengut mit einem Lösungsmittel extrahiert.

Das Lösungsmittel ist insbesondere ein organisches Lösungsmittel, vor allem ein organisches Lösungsmittel, welches mit Wasser mischbar ist. Bevorzugt sind Aceton, Methanol oder Ethanol oder andere Alkohole, optional in Mischung mit Wasser oder untereinander gemischt.
Bevorzugt wird das Pflanzengut mit dem Lösungsmittel in einem Mengenverhältnis von ca. 1:1 bis 1:20, bevorzugt 1:10 (Pflanzengut (Trockenmasse):Lösungsmittel, m:m) extrahiert. Eine wiederholte Extraktion (z. B. 2x, 3x, 4, oder 5x) des Pflanzenmaterials ist möglich und vor allem bei einer Extraktion mit Aceton sinnvoll, um höhere Ausbeuten zu erzielen. Bei einer Extraktion mit Methanol z. B. ist im allgemeinen nur eine Extraktion notwendig. Die Ausbeute einer einzelnen Extraktion von getrockneten Blättern und Stängeln mit der zehnfachen Menge an Methanol führt zu einem Extrakt mit ca. 0,2 mg/g an Inhibitor 864 (wobei dies nach massenspektrometrischer Messung unter Verwendung von Catechin als Standard berechnet wurde). Eine einzelne Extraktion mit Aceton führt ungefähr zu einem Viertel der Ausbeute.
Der erhaltene Rohextrakt kann mit im Stand der Technik bekannten Verfahren eingeengt werden. Auch eine vollständige oder fast vollständige Lyophilisierung ist möglich. Der Extrakt kann z. B. mit Wasser verdünnt werden.
Eine direkte Verwendung des erhaltenen Extrakts ist möglich, aber es können auch weitere Aufreinigungsschritte durchgeführt werden, vor allem, wenn eventuell unerwünschte Begleitsubstanzen entfernt werden sollen. Eine weitere Aufreinigung ist z. B. über eine Extraktion mit Toluol möglich, wobei die Toluol-Phase verworfen wird. Alternativ oder zusätzlich kann eine Aufreinigung über eine C18 SPE-Patrone und/oder HPLC-Chromatographie durchgeführt werden. Es werden Fraktionen isoliert, welche eine Amylase- und Lipaseinhibitoraktivität aufweisen (siehe Beispielteil).
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung des Pflanzenextrakts, Schritte umfassend, bei denen man

Der in Schritt e erhaltene Extrakt kann in einem weiteren Schritt lyophilisiert werden.
Anstelle von Aceton kann auch ein anderes Lösungsmittel, z. B. ein organisches Lösungsmittel, bevorzugt Methanol oder Ethanol verwendet werden.
Der in dem Verfahren erhaltene Extrakt kann als pharmazeutische Zusammensetzung oder Nahrungsergänzungsmittel formuliert werden.
Die Erfindung umfasst damit Verfahren zur Herstellung der Pflanzenextrakte aus Pflanzengut der oben genannten Pflanzen, insbesondere aus Ericaceae, z. B. Blättern, -Sproßspitzen und/oder -stängeln aus Preiselbeere, Heidelbeere, Moosbeere, Rauschbeere oder Rhododendron sowie aus den Früchten, Blättern oder Fruchthüllen der Rosskastanie oder aus Lorbeerblättern. Selbstverständlich kann auch eine Kombination aus diesen Pflanzen bzw. Pflanzenteilen verwendet werden.
Vorzugsweise werden die Blätter der Kulturpreiselbeere und der Kulturheidelbeere als Quelle verwendet, da diese Pflanzen in Plantagen kultiviert werden können und Früchte und Blätter getrennt zu unterschiedlichen Zeiten maschinell gesammelt werden können. Nach der Ernte der Früchte ist die Ernte der Blätter und/oder Sproßspitzen im Herbst oder im Winter, wenn die höchste Konzentration des Wirkstoffes auftreten und daher die größte Ausbeute realisiert werden kann, z. B. mit Kombines möglich.
Die Extraktion wird auf Basis des Pflanzenguts, insbesondere zerkleinerten Pflanzenguts, z. B. Homogenat von Blättern, Stängeln, Sproßspitzen und/oder Früchten, durchgeführt. Die Zerkleinerung des Ausgangsstoffes erhöht die Ausbeute der Extraktion. Es kann getrocknetes oder frisches Pflanzengut verwendet werden, insbesondere in zerkleinerter Form.
Es wurden verschiedene Verfahren zur Extraktion getestet.
Eine vorgeschaltete Extraktion hydrophober Verbindungen (v. a. Fette) mit Hexan wurde getestet, erwies sich jedoch als nicht signifikant für die Wirksamkeit des Extrakts, und wurde daher in der Folge weggelassen.
Eine Extraktion mit Wasser bei erhöhten Temperaturen fand sehr schnell statt. Die Extrakte waren jedoch nicht sehr stabil, so dass sich bei Lagerung Präzipitate bildeten. Eine Extraktion mit Wasser-Ethanol-Mischungen war möglich. Es wurden allerdings wenig stabile Extrakte erhalten.
Eine alkalische oder saure Extraktion kann ebenfalls verwendet werden. Bei der alkalischen Extraktion wurde Pflanzengut (z. B. Blätterhomogenat von Kulturheidelbeeren oder Preiselbeere) in einer wässrigen basischen Lösung (0,05–0,5 N), besonders bevorzugt in Ammoniumhydroxidlösung (z. B. 0,1 mol/l) suspendiert und für einen längeren Zeitraum (z. B. 10 Stunden) bei 0 bis 10°C, vorzugsweise bei +4°0 extrahiert wird. Alternativ wurde auch eine saure Extraktion mit wässriger saurer Lösung (0,05– 0,5 N), z. B. mit Salzsäure (z. B. 0,1 mol/l), durchgeführt. Dem Fachmann werden verschiedene Variationen dieser Bereiche bekannt sein, bei denen das gleiche Extraktionsergebnis erzielt wird. In einem weiteren Verfahrensschritt wird der klare Extrakt nach Zentrifugation ohne Bodensatz mit einer Säure, vorzugsweise Essigsäure, oder im Falle der sauren Extraktion mit einer Base, insbesondere NaOH neutralisiert (pH 7–8), und die sich bildenden Präzipitate werden durch erneute Zentrifugation abgetrennt. Der so gewonnene Extrakt zeigt bereits eine starke Inhibitoraktivität. Bei längerer Lagerung zeigt sich jedoch auch hier eine Instabilität. Der Rohextrakt kann zur besseren Lagerung durch Lyophilisierung konserviert werden.
Die stabilsten Extrakte wurden bei der Extraktion des Pflanzengutes, zum Beispiel der Heidelbeer- oder Preiselbeerblätter, mit organischen Lösungsmitteln, insbesondere Aceton, erzielt. Dazu wird das trockene, zerkleinerte Extraktionsgut mit Aceton (100%) bei 0–10°C, insbesondere bei ca. 4°C, extrahiert, z. B. ca. 12–36 Stunden, insbesondere ca. 24 Stunden. Diese Extraktion ist vollständiger und führt zu geringeren Verunreinigungen der Inhibitorzusammensetzung als andere Extraktionsverfahren. Neutralisations- und Zentrifugationsschritte sind nicht notwendig. Daher wird der erste Extraktionsschritt bevorzugt mit Aceton durchgeführt. Ein so erhaltener Extrakt kann bereits im Sinne der Erfindung verwendet werden.
Zur weiteren Aufreinigung kann eine Auftrennung mit Hilfe der „High Performance Liquid Chromatography” (HPLC) durchgeführt werden, bei der vorzugsweise eine CC 250/3 Nucleosil 100-3 C 18 Säule zur analytischen Präparation und eine EP 250/16 Nucleosil 100-3 C18 Säule zur präparativen Trennung mit einem Wasser-Acetonitril-Gradienten in 0.1% Ameisensäure verwendet wird. Durch die Auftrennung mittels HPLC erhält man ein Spektrum mit mehreren Peaks, welche sich je nach der verwendeten Pflanze unterscheiden können (s. 1, für Heidelbeere). Es werden die Peaks gesammelt und optional vereinigt, welche eine Pankreasamylase und/oder Pankreaslipase hemmen können (s. Beispiel 3 und 4). Dies sind, wie Hemmversuche mit Schweinepankreasamylase und Schweinepankreaslipase gezeigt haben, vor allem Peaks, welche ungefähr zwischen 11 und 16 Minuten, insbesondere um 12, 13, 14 oder 15 Minuten, auftreten. Eine Verbesserung der Ausbeute ergab sich bei erhöhter Durchflußrate der HPLC, diese beträgt bevorzugt mindestens 1,5 ml/min, besser etwa 2,5 ml/min, am meisten bevorzugt mindestens etwa 3.75 ml/min.
Es wurde jedoch ein Verlust der Aktivität bei Fraktionen, beobachtet, welche über HPLC aufgereinigt wurden.
Die über HPLC isolierte Reinstsubstanz 864 in Wasser ist in eingeengter Form (1 mg/ml) über Monate bis zu einem halben Jahr stabil, wie NMR-Untersuchungen gezeigt haben.
Auch eine weitere Aufreinigung des Extrakts mit SPE C18-Patronen (Supelco 595, Bellefonte, PA, USA, Supercosil LC-18-DB, 5 μm, Column Dimensions: 25 cm × 21.2 mm), Verwendung nach den Anweisungen des Herstellers) ist möglich, führte jedoch auch zu Verlusten an Aktivität und Stabilität gegenüber dem Rohextrakt. Eine Aufreinigung über HPLC, auch eine SPE C18-Säule, sollte so schnell wie möglich durchgeführt werde.
Daher ist es bevorzugt, zur Entfernung hydrophober Komponenten zu dem Aceton-Extrakt zunächst Wasser hinzuzufügen, insbesondere ein ungefähr gleiches Volumen, und dann eine weitere Extraktion mit Toluen (z. B. mit ungefähr gleichem Volumen) durchzuführen, gegebenenfalls auch mehrfach (zum Beispiel zwei- oder dreimal), wobei man die Toluen-haltige Fraktion verwirft und einen wässrigen Extrakt erhält. Eine solche Ex traktion mit Toluen kann z. B. für 2–8 Stunden durchgeführt werden, bevorzugt für etwa 4 Stunden. Falls vorhanden, können vor und/oder nach der Extraktion mit Toluol eventuelle Präzipitate durch Zentrifugation (ca. 2000–4000 U/min) abgetrennt werden.
Bevorzugt wird die vollständige Extraktion bei 0–10°C durchgeführt, insbesondere bei ca. 4°C.
Bevorzugt ist der erfindungsgemäße Extrakt über mindestens einen Monat, insbesondere mindestens 2, mindestens 6 oder mindestens 12 Monate stabil, seine Wirkung bei der Inhibition z. B. von Pankreasamylase also weniger als 50%, bevorzugt weniger als 20% oder weniger als 10% oder gar nicht gegenüber der Wirikung von frisch isoliertem Extrakt vermindert.
Das verwendete Extraktionsverfahren kann je nach Pflanzenmaterial ausgewählt oder variiert werden. Selbstverständlich können auch verschiedene Extraktionsverfahren kombiniert werden.
Bei Pflanzen, deren physiologische Verträglichkeit bekannt ist, z. B. die genannten Vaccinium-Arten, wie Heidelbeere, Cranberry oder Preiselbeere, wird bevorzugt eine Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel wie Aceton oder Methanol durchgeführt, optional mit einer darauffolgenden Extraktion mit Toluen. Auf eine weitere Aufreinigung über Chromatographie kann insbesondere bei diesen Pflanzen verzichtet werden. Sofern noch andere Substanzen mit im Zusammenhang mit der gewünschten Verwendung pharmakologisch unerwünschte Wirkungen in einem solchen Extrakt enthalten sind, ist deren Abtrennung, z. B. über eine Aufreinigung mit chromatographischen Verfahren wie HPLC empfehlenswert. Acetonische Extrakte enthalten weniger weitere Substanzen als z. B. methanolische Extrakte. Solche Substanzen können gegebenenfalls auch auf andere Weise abgetrennt werden. Je nach der gewünschten Verwendung möglicher weise unerwünschte Substanzen sind dem Fachmann bekannt. Sie können je nach Zulassungsverfahren auch nach nationalem Recht variieren.
Bevorzugt enthält der erfindungsgemäße Extrakt kein oder wenig Cumarin, insbesondere keine Mengen an Cumarin, welche als gesundheitsschädlich betrachtet werden könnten. Unter anderem dadurch unterscheiden sich die erfindungsgemäßen Extrakte z. B. von Zimtextrakten.
Grundsätzlich kann auch nicht extrahiertes Pflanzengut, z. B. Sproßspitzen, Stängel, Blätter, Beeren oder Früchte der genannten Pflanzen, insbesondere der Vaccinium-Arten für die oben beschriebenen medizinischen Anwendungen verwendet werden. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung von Pflanzengut von Ericaceae, Aesculus hippocastaneum, und/oder Aesculus pavia zur Behandlung und/oder Vorbeugung von Adipositas und/oder Diabetes mellitus Typ 2. So könnten auch Tees aus dem genannten Pflanzengut die Therapie mit Schluckkapseln, Dragees oder Heilsaft ergänzen.
Die folgenden Beispiele beschreiben die Aufreinigung eines erfindungsgemäß zu verwendenden Pflanzenextrakts aus Pflanzengut von Ericaceae, insbesondere von Heidelbeerblättern bzw. Preiselbeerblättern, sowie die Überprüfung seiner Wirksamkeit.
Die Beispiele sollen die Erfindung veranschaulichen, aber nicht beschränken. Die in der Anmeldung genannten Referenzen werden hierin durch Bezugnahme vollständig aufgenommen.
Beschreibung der Figuren:
1 zeigt eine präparative HPLC eines Blaubeerblätter-Extraktes. Obere Linie – Totalionenchromatogramm; untere Linie – extrahierte Fraktion bei 15 Min (v. a. Inhibitor 864).
2 zeigt das Massenspektrum der durch HPLC erhaltenen Fraktionen des Peaks nach 15 Minuten.
3 zeigt Unterschiede der Konzentration an Inhibitor in einer HPLC-Analyse von Extrakt aus Heidelbeerblättern, die im Sommer (untere, graue Linie) und im Winter (obere Linie) gesammelt wurden.
Beispiele
Beispiel 1
Herstellung eines Pflanzenextrakts aus Heidelbeerblättern Heidelbeerblätter, Preiselbeerblätter und -sprossen wurden jeweils in 100% Aceton suspendiert und für 24 Stunden bei 4°C im Kühlschrank extrahiert. Dann wurde der acetonische Extrakt mit einem ca. gleichen Volumen Wasser verdünnt und bei 2000–4000 U/min abzentrifugiert, um eventuelle Präzipitate zu entfernen. Der klare Extrakt wurde mit ca. gleichem Volumen an Toluol für ca. 4 Stunden extrahiert, um hydrophobe Komponenten aus dem Extrakt zu entfernen. Die Toluollösung wird verworfen, und so ein wässriger Extrakt gewonnen.
Dieser Extrakt kann mit Hilfe der HPLC weiter analysiert und/ oder aufgereinigt werden. Mit einer Shimadzu HPLC-Anlage (Pumpen LC-9A, Säulenofen CTO-10 AS VP bei 25°C, Autoinjektor SIL-9A, UV-Detektor SPD-10 AV) und einer CC 250/3 Nucleosil 100-3 C18 Säule der Firma Macherery – Nagel, Düren, Deutschland und Acetonitril als Lösungsmittel wurden 2 Hauptpeaks identifiziert. Für die analytische HPLC wurde eine CC 280/3 Nucleosil 100-3 C18-Säule verwendet, für die präparative HPLC eine EP 250/16 Nucleosil 100-3 C18-Säule. Um die Fraktionen bei laufender Fraktionierung mit Massenspektroskopie (MS) charakterisieren zu können, wurde ein Splitter nach der Passage der Flüssigkeit durch die Säule eingeschaltet, so dass für die Präparation des Inhibitors etwa 90% der Fraktion 864 mit einem Fraktionssammler aufgefangen werden konnte.
Die so erhaltenen Fraktionen können mit Hilfe enzymatischer Tests auf ihre Inhibitorwirkung auf Verdauungsenzyme, insbesondere Pankeasamylase und Pankeaslipase getestet werden (s. Beispiele 3 und 4). Wirksame Fraktionen können vereinigt werden.
Beispiel 2
Aufklärung der Struktur einer Leitsubstanz
Mit der Massenspektroskopie wurden in Peaks in Chromatogrammen der Extrakte reproduzierbar Moleküle verschiedener Molekülmassen identifiziert, 288, 864 und 1152. Vor allem die Peaks, welche Moleküle mit der Masse 864 umfassen (nicht protonierte Form, in der Folge auch bezeichnet als Inhibitor 864 oder Fraktion 864), weisen eine Wirkung in den Enzymtests auf. Der Verbindung mit der Molekülmasse 864 kann die Struktur der Formel I oder II zugeordnet werden:
Daher umfasst der erfindungsgemäße Pflanzenextrakt vorzugsweise ein Molekül mit einer Masse von 864, insbesondere das Polyphenol nach Formel I und/oder Formel II. Solche Substanzen werden im Rahmen der Erfindung als Procyanidin A3-Isomere bezeichnet.
Ohne an die Hypothese gebunden sein zu wollen, wird angenommen, dass diese Verbindungen zumindest für einen Teil der Wirkung des Pflanzenextrakts verantwortlich sind. Andere Isomere, Derivate, Zerfalls- und/oder Synthese-Zwischenprodukte können jedoch zur Wirksamkeit und/oder Stabilität des Extrakts beitragen oder diese bewirken, genau wie gegebenenfalls gemeinsam mit dieser Verbindung extrahierte sekundäre Pflanzenstoffe (z. B. Polyphenole), insbesondere als Antioxidationsmittel.
Überraschenderweise wiesen Extrakte aus im Herbst und insbesondere Winter gesammelten Pflanzen besonders viel Inhibitor 864 auf (vgl. 3) und waren besonders aktiv.
Beispiel 3
Wirkung des isolierten Inhibitors auf α-Amylase
Um die Inhibitoraktivität der verschiedenen Fraktionen des Extrakts, die nach der HPLC-Aufreinigung erhalten wurden, zu bestimmen, wurde das „INFINITY^TM AMYLASE LIQUID STABLE REAGENT” der Firma ThermoDMA, Louisville, CO, USA verwendet (Katalog-Nr. 1174-200H) und der Enzymtest nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.
Bei diesem Test wird das Substrat Ethyliden-pNP-G7 (Ethyliden-p-Nitrophenol-maltoheptaose) durch α-Amylase umgesetzt. Nachdem das Substrat von α-Amylase gespalten wurde, werden die kleineren Fragmente durch α-Glucosidasen weiter gespalten, so daß pNP (p-Nitrophenol) gebildet wird. Die Bildungsrate des pNP ist proportional zur α-Amylase-Aktivität in der Probe und kann durch einen Anstieg der Absorption bei 410/520 nm gemessen werden.
Vorliegend wurde α-Amylase aus Schweinepankreas eingesetzt. 1 mg/ml α-Amylase in PBS („phosphate buffered saline”) wurde mit PBS 1:4 verdünnt und von dieser Lösung wurden 2,5 μl pro Ansatz eingesetzt.
Ansatz:
1,5 ml Substratlösung und gegebenenfalls 20 μl Inhibitorlösung (aus verschiedenen Fraktionen der HPLC Aufreinigung oder verschiedenen Pflanzen) wurden für 5 min bei 37°C vorinkubiert, danach wurden 2,5 der Test-α-Amylase-Lösung zugegeben und die Absorption (Abs) bei 405 nm nach 60 Sekunden gemessen.
Die Aktivität der α-Amylase läßt sich dann mit Hilfe der folgenden Formel berechnen: Aktivität in U/l = ΔAbs/min × Faktorwobei der Faktor berechnet wird durch:
mit

TV: = Gesamtvolumen (1,5 ml) + 25 μl Amylase + 20 μl Inhibitor = 1,5225 ml
SV: = Probenvolumen in ml (0,0025 ml)
E: = Extinktionskoeffizient von pNP bei 405 nm: 10,13
P: = Küvettenlänge (1)

Für die Berechnung der Enzymaktivität, die in Tabelle 1 beispielhaft für die Fraktion 864 isoliert aus Heidelbeerblättern dargestellt ist, wurden die Ergebnisse von jeweils drei Absorptionsmessungen verwendet.

Sowohl der Rohextrakt als auch die Peaks aus der HPLC-Extraktion, welche die Verbindung mit der Molekülmasse 864 umfassen, stellen effiziente Inhibitoren dar. Tabelle 1: Ergebnisse des α-Amylase-Aktivitätstests unter Einsatz von Pflanzenextrakt aus Heidelbeere (Inhibitor 864), Probenentnahme nach 60 sec

Ansatz	Messung 1 Abs	Messung 2 Abs	Messung 3 Abs	Enzymaktivität in U/l	Aktivität (%)
1: ohne Pflanzenextrakt	0,318	0,357	0,314	19880 ± 1625	100

2: 20 μl Pflanzenextrakt	0,056	0,055	0,058	3268 ± 42	16,4

Die Ergebnisse des α-Amylase-Aktivitätstests zeigen deutlich, daß die Inhibitorlösung aus Heidelbeere die Aktivität der α-Amylase signifikant hemmt. Die Hemmung betrug 83,6%, die Aktivität wurde von 100% auf 16,4% reduziert.
Beispiel 4
Wirkung des isolierten Inhibitors auf Pankreaslipase
Lipase (ICN Biochemicals Inc. USA) (1 mg/ml) wurde 1:4 mit 0,9%iger NaCl-Lösung verdünnt, und es wurden 15 μl pro Ansatz eingesetzt.
Die Lipaseaktivitätsmessungen wurden mit dem Lipase-PS TM Kit der Firma Sigma Diagnostics, Sigma Deisenhofen (Catalog-No. 805-A) ausgeführt.
Ansatz:
0,9 ml Substratlösung wurden für 2 Minuten bei 37°C in der Küvette inkubiert. Anschließend wurden 15 μl destilliertes H₂O, 15 μl Standardlösung oder 15 μl Lipase (1:4 verdünnt) zugegeben und für weitere 5 Minuten inkubiert. Danach wurden je Ansatz 300 μl Aktivatorlösung und gegebenenfalls 20 μl Inhibitorlösung (Extrakte aus verschiedenen Pflanzen, gezeigt für Heidelbeere) zugegeben und die Absorption (A) bei 550 nm nach 3 Minuten (INITIAL A) und nach 5 Minuten (FINAL A) gemessen.
Berechnung der Lipaseaktivität:

ΔA-Leerwert = FINAL A-Leerwert – INITIAL A-Leerwert
0,021 = 0,150 – 0,129
ΔA-Standard = FINAL A-Standard – INITIAL A-Standard
0,124 = 0,363 – 0,239
ΔA-Probe = FINAL A-Probe – INITIAL A-Probe

Ungehemmte Probe:

I: 0,380 = 0,945 – 0,565
II: 0,403 = 0,994 – 0,591
III: 0,402 = 0,951 – 0,549

Gehemmte Probe (20 μl Substanz 865 – Lösung Heidelbeere)

ΔA-Probe = FINAL A-Probe – INITIAL A-Probe
I: 0,122 = 0,388 – 0,266
II: 0,132 = 0,417 – 0,285
III: = ,128 = 0,402 – 0,273
Lipaseaktivität (U/l) = ΔA-Probe – ΔA-Leerwert/ ΔA-Standard – ΔA-Leerwert X 248

Die Lipaseaktivität des Standards wurde vom Hersteller mit 248 U/l angegeben.
Lipase-Aktivität der ungehemmten Probe

Lipaseaktivität (U/l) = 0,38 – 0,021/0,124 – 0,021 × 248
I: 864 U/l
II: 919 U/l
III: 917 U/l
Mittelwert und Streuung ungehemmte Probe: 891 ± 38 U/l (100%)

Lipaseaktivität mit Inhibitor (20 μl Fraktion 865, Heidelbeere)

I: 243 U/l
II: 267 U/l
III: 260 U/l
Mittelwert und Streuung gehemmte Probe: 257 ± 12 U/l (28%)

Durch Zugabe der Inhibitorlösung (Fraktion 864) wurde die Aktivität von 891 (100%) auf 257 (28%) U/l reduziert, es ergab sich also eine Hemmung von 72%.
Literatur:

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Broadhurst CL. Nutrition and non-insulin dependent diabetes mellitus from an anthropological perspective. Alternative Medicine Review 1997; 2: 378–399.
Caspary W. Sucrose malabsorption in man after ingestion of α-glucosidehydrolase inhibitor. Lancet 1978; 1231–1233.
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Lobstein T, Leach R. Diabetes may be undetected in many children in the UK. BMJ 2004; 328: 1261 1262.
Machius M, Vertery L, Huber R, Wiegand G. Carbohydrate and protein-based inhibitors of porcine pancreatic alpha-amylase: Structure analysis and comparison of their binding characteristics. J. Med. Biol. 1996; 260: 409–421.
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Scheen AJ. Pathophysiology of type 2 diabetes. Acta Clin Belg 2003 58: 335–341.
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JP 9275979

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

- JP 9275979 [0009]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

- Beller 2004 [0002]
- Kemper et al. 2004 [0002]
- Lobstein und Leach 2004 [0002]
- Plagemann und Harder 2004 [0002]
- Ramchandani 2004 [0002]
- Scheen 2003 [0002]
- Machius et al., 1996 [0005]
- Caspary, 1978 [0006]
- Jenkins et al., 1981 [0006]
- Clissold und Edwards, 1988 [0006]
- Jonas et al., 2003 [0007]
- Anderson et al., 2004 [0009]
- Qin et al., 2003 [0009]
- Khan et al., 2003 [0009]

Claims

Polyphenol-haltiger Pflanzenextrakt aus Pflanzengut von Ericaceae, Aesculus hippocastaneum, Aesculus pavia und/oder Laurus nobilis zur Behandlung und/oder Vorbeugung von Adipositas und/oder Diabetes mellitus Typ 2.
Pflanzenextrakt nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er durch ein Verfahren herstellbar ist, welches Schritte umfasst, bei denen man a) Pflanzengut zerkleinert, und b) das Pflanzengut mit einem organischen Lösungsmittel, insbesondere Methanol oder Aceton, extrahiert.
Pflanzenextrakt nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass er durch ein Verfahren herstellbar ist, welches Schritte umfasst, bei denen man a) Pflanzengut zerkleinert, und b) das Pflanzengut mit Aceton extrahiert, c) mit Wasser verdünnt, d) i) mit Toluol extrahiert, wobei man das Toluol verwirft, oder ii) hydrophobe Komponenten über eine C18 SPE-Patrone entfernt, oder iii) über eine HPLC Fraktionen isoliert, welche eine Amylase- und Lipaseinhibitoraktivität aufweisen, so dass man e) einen wässrigen Extrakt erhält.
Pflanzenextrakt nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Ericaceae eine Vaccinium-Art, insbesondere Preiselbeere (Vaccinium vitis-idea), Heidelbeere (Vaccinium myrtillus), Moosbeere (Vaccinium oxycoccus, Vaccinium macrocarpon, Vaccinium microcarpum und/oder Vaccinium erythrocarpum) und/oder Trunkelbeere (Vaccinium uliginosum) oder Rhododendron, insbesondere Rhododendron catawbiense, ist.
Pflanzenextrakt nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Pflanzengut Früchte, Blätter, Sproßspitzen und/oder Stängel der Pflanzen umfasst.
Pflanzenextrakt nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Pflanzengut im Herbst oder Winter geerntet wurde.
Pflanzenextrakt nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyphenol Procyanidin A3-Isomere umfasst.
Pflanzenextrakt nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass er ferner weitere sekundäre Pflanzenstoffe umfasst.
Pflanzenextrakt nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass er Antioxidationsmittel und/oder einen pharmazeutisch geeigneten Träger umfasst.
Verwendung des Pflanzenextrakts nach einem der vorherigen Ansprüche zur Behandlung und/oder Vorbeugung von Adipositas und/oder Diabetes mellitus Typ 2.
Verfahren zur Herstellung des Pflanzenextrakts nach einem der Ansprüche 1–9, Schritte umfassend bei denen man a) Pflanzengut zerkleinert, und b) das Pflanzengut mit einem organischen Lösungsmittel, insbesondere Methanol oder Aceton, extrahiert.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass man a) Pflanzengut zerkleinert, und b) das Pflanzengut mit Aceton extrahiert, c) mit Wasser verdünnt, d) i) mit Toluol extrahiert, wobei man das Toluol verwirft, oder ii) hydrophobe Komponenten über eine C18 SPE-Patrone entfernt, oder iii) über eine HPLC Fraktionen isoliert, welche eine Amylase- und Lipaseinhibitoraktivität aufweisen, so dass man e) einen wässrigen Extrakt erhält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass man den erhaltenen Extrakt als pharmazeutische Zusammensetzung oder als Nahrungsergänzungsmittel formuliert.
Verwendung von Pflanzengut von Ericaceae, Aesculus hippocastaneum und/oder Aesculus pavia zur Behandlung und/oder Vorbeugung von Adipositas und/oder Diabetes mellitus Typ 2.