WO2010078730A1

WO2010078730A1 - 人参皂苷-Rd丙二醇水溶液制备及其抗炎、免疫抑制与抗器官移植排斥的新用途

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Publication number: WO2010078730A1
Application number: PCT/CN2009/070419
Authority: WO
Inventors: 范富林; 徐晓非
Original assignee: 广东泰禾医药科技有限公司
Priority date: 2008-12-29
Filing date: 2009-02-13
Publication date: 2010-07-15
Also published as: WO2010078730A9; CN101766640A; CN101766640B

Description

人参皂苷 -Rd丙二醇水溶液制备及其抗炎、免疫抑制与抗器官移植排斥的新用途技术领域

本发明涉及药物制剂技术领域，更具体而言，涉及具有高溶解性和稳定性的人参皂苷 -Rd丙二醇水溶液、其制剂及制备方法和应用。背景技术

人参皂苷 -Rd，是从中药五加科植物三七中经多步分离而得的一种单体化合物，属原人参二醇型皂苷。它的中文化学名为 20-(S)-原人参二醇 -3[0- β -D-吡喃葡萄糖 (1→2)- β -D-吡喃葡萄糖苷 ]-20-Ο-β-ϋ-吡喃葡萄糖苷，英文化学名为 20(S)-Protopanaxadiol 3-O-[P-D-glucopyranosyl(l→2)- -D-glucopyranosyl]-20-O-p -glucopyranoside, 化学结构如下：

C₄₈H₈₂O_ls'3 0; 1001.20

人参皂苷 -Rd外观为白色至微黄色粉末，无臭，易溶于甲醇、乙醇、丙二醇、正丁醇及热水；溶于丙酮、氯仿及水。主要理化常数为：熔点 209~214 °C，比旋度 [a]D22+21.16 (C=4.98 , MeOH), 在甲醇介质中紫外吸收 λ _max=201 nm。常用浓度为 10 mg/ml的人参皂苷 -Rd的 20体积％丙二醇溶液，其 pH为 7.6~7.72。

人参皂苷 -Rd具有特异性阻断受体依赖性钙离子通道的作用，已知可用于治疗急性缺血性脑卒中病，例如其规格为 10 mg/ml含丙二醇的注射液拟用于治疗急性缺血性脑卒中病。该药为国家一类新药，目前已完成临床前硏究，经国家食品药品监督管理局批准后已进入临床试验阶段。

然而，在应用中发现，原有的以 20体积％的丙二醇水溶液作为溶剂的人参皂苷 -Rd 注射液 (人参皂苷 -Rd含量 10 mg/ml)在低温下保存易析出沉淀。过去认为是保存温度太低以至人参皂苷 -Rd在 20体积％的丙二醇水溶液中溶解度降低。但在生产过程中发现，人参皂苷 -Rd在 20体积％的丙二醇水溶液并不能形成真溶液 (有乳光存在)。由于形成的颗粒极小又少，肉眼不易察觉，其按药典法检测澄明度是合格的 (因是稀释后测定的)。然而，该溶液的丁达尔现象阳性，说明存在 1-100 nm的颗粒。这种大小的颗粒，可形成乳光，在室温下 ώ于布朗运动，可稳定悬浮，不会形成沉淀。由于该人参皂苷 -Rd 替换页（细则第 26条) 注射液中存在的这部分颗粒在低温下布朗运动减弱，使得小颗粒易聚集成团，质量增加从而形成沉淀。又由于对此种隐含颗粒在制剂加工过程中不做检测，使不同批次的

Rd注射液，随机形成许多溶解度不同的制剂。这就可能使得制剂的溶解度失控。

由此可见，现有的人参皂苷 -Rd注射液在温度较低的环境下放置后析出沉淀会影响到本品制剂质量控制与评价，而且使本品在使用中存在一定的风险。

因此，如何提高药物组合物中活性物质的溶解度和稳定性是本领域亟待解决的问题。而对于人参皂苷 -Rd溶液而言，其溶解度、稳定性的提高更是促进人参皂苷 -Rd 成为临床可用药品中迫切需要解决的问题。

此外，由于原有人参皂苷 -Rd注射液中人参皂苷 -Rd含量较低，其应用目前仅限于治疗急性缺血性脑卒中病。进一步提高制剂中人参皂苷 -Rd的含量和制剂的稳定性，并开发新制剂的新用途，是本领域中促进人参皂苷 -Rd成为临床可用药品中另一迫切需要解决的问题。发明内容

本发明的目的之一在于提供一种具有高溶解度和稳定性的人参皂苷 -Rd溶液及其制备方法。本发明的另一目的在于提供人参皂苷 -Rd或本发明人参皂苷 -Rd溶液在抗炎、免疫抑制或抗器官移植排斥中的作用及它们在制备相关药物中的用途。

在本发明的第一方面，提供了一种人参皂苷 -Rd溶液，所述溶液是人参皂苷 -Rd在所含丙二醇为 50-100体积％的丙二醇水溶液中形成的溶液，所述人参皂苷 -Rd的含量为 1〜 100mg/ml溶液，其中，丙二醇的体积百分比以丙二醇水溶液的总体积为基准计。

在一个优选例中，所述溶液是人参皂苷 -Rd在 55〜100体积％的丙二醇水溶液中形成的溶液，优选 55〜80体积％的丙二醇水溶液，更优选 55〜75体积％的丙二醇水溶液。

在本发明的一个实施方式中，所述溶液为真溶液。

在一个优选例中，所述人参皂苷 -Rd溶液在室温、冷藏和冷冻放置 5天后，丁达尔现象呈阴性。优选将所述人参皂苷 -Rd溶液在室温和 2〜6°C条件下保存 5-50天、优选 36 天后、在 -20°C条件下保存 48小时后、或在 -20°C条件下保存 36天后在室温下放置片刻或过夜后，所述人参皂苷 -Rd溶液的丁达尔现象呈阴性。

在本发明的一个实施方式中，所述溶液中人参皂苷 -Rd的含量为 5〜75mg/ml。

在一个优选例中，所述溶液中人参皂苷 -Rd的含量为 10〜75mg/ml，优选 20〜75 mg/ml, 更优选 50〜75 mg/ml。

在另一优选例中，所述人参皂苷 -Rd的纯度为 90-100 wt%，优选纯度为 95-99.99 wt % , 更优选纯度为 95-99.8 wt%。

在本发明的一个实施方式中，所述人参皂苷 -Rd溶液选自下组：大于 25mg/ml〜75 mg/ml的人参皂苷 -Rd在 60-80体积％，优选 75体积％的丙二醇水溶液中的溶液；大于 10mg/ml〜25 mg/ml的人参皂苷 -Rd在 55-75体积％，优选 60体积％的丙二醇水溶液中的溶液；或 5〜10 mg/ml的人参皂苷 -Rd在 55-75体积％，优选 55体积％的丙二醇水溶液中的溶液。

在一个优选例中，所述人参皂苷 -Rd溶液为 5-25 mg/ml人参皂苷 -Rd在 60体积％丙二醇水溶液形成的溶液。

在另一优选例中，所述溶液为 5mg/ml人参皂苷 -Rd在 55〜75体积％丙二醇水溶液中形成的溶液，或 5〜75mg/ml人参皂苷 -Rd在 75体积％丙二醇水溶液中形成的溶液。

在另一优选例中，所述人参皂苷 -Rd溶液为外用、内服、或注射用制剂形式，优选静脉内注射液、肌肉内注射液、口服溶液、喷剂形式。

在本发明的第二方面中，提供了一种制备本发明人参皂苷 -Rd溶液的方法，所述方法包括：（a)用所含丙二醇 50体积％的丙二醇水溶液溶解人参皂苷 -Rd; (b)任选地稀释步骤 (a)所得溶液，以获得人参皂苷 -Rd的含量为 l〜100mg/ml溶液的溶液。

在一个优选例中，步骤 (b)中所用的稀释剂为水或丙二醇浓度低于步骤 (a)中所用丙二醇水溶液的丙二醇水溶液。

在本发明的一个实施方式中，所述方法包括：用 100体积％的丙二醇水溶液溶解人参皂苷 -Rd后，再对所得溶液进行稀释。

在本发明的第三方面中，提供了一种药物组合物，其包含：本发明的人参皂苷 -Rd 溶液和药学上可接受的载体。

在一个优选例中，所述药物组合物中包含 0.01〜100 wt %本发明的人参皂苷 -Rd 溶液，优选 0.1〜99.9 wt%，更优选 1-99 wt%。

在另一优选例中，所述药物组合物中包含 0.5-7.5 wt %的本发明的人参皂苷 -Rd溶液，更优选 0.5-2.5 wt%。

在另一优选例中，所述药物组合物为外用、内服、或注射用制剂形式，优选静脉内注射液、肌肉内注射液、口服溶液、喷剂形式，更优选所述注射用制剂形式为静脉内注射用或肌肉内注射用制剂形式，再优选静脉内注射用制剂形式。

在另一优选例中，所述药物组合物还包含其它活性物质，所述其它活性物质选自：抗炎药、免疫抑制剂、急性缺血性脑卒中治疗剂、或抗器官移植排斥剂。

在本发明的第四方面中，提供了一种制备含有人参皂苷 -Rd的药物组合物的方法，所述方法包括：将本发明的人参皂苷 -Rd溶液与药学上可接受的载体混合。

在一个优选例中，所述方法包括按本发明的方法制备人参皂苷 -Rd溶液，并将所得溶液与药学上可接受的载体混合。

在另一优选例中，所述方法还包括用稀释剂稀释本发明的人参皂苷 -Rd溶液，优选稀释 1-10倍，更优选稀释 1-5倍，最优选稀释 1-2倍。所述稀释剂为：注射用生理盐水、葡萄糖溶液、或葡萄糖生理盐水。在另一优选例中，所述药物组合物为外用、内服、或注射用制剂形式，优选静脉内注射液、肌肉内注射液、口服溶液、喷剂，更优选所述注射用制剂形式为静脉内注射用或肌肉内注射用制剂形式，再优选静脉内注射用制剂形式。在另一优选例中，所述药学上可接受的载体为注射用溶剂，优选：注射用生理盐水、葡萄糖溶液、或葡萄糖生理盐水、或其它临床上常用的缓冲注射溶液。

在本发明的第五方面，提供了人参皂苷 -Rd或本发明的人参皂苷 -Rd溶液在制备用于抗炎、免疫抑制和 /或抗器官移植排斥的药物中的用途。

在本发明的一个实施方式中，所述用于抗炎的药物用于治疗选自下组的炎性疾病：风湿性、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、风湿性心瓣膜炎、结核性脑膜炎、胸膜炎或心包炎；所述用于免疫抑制的药物用于治疗或辅助治疗选自下组的免疫相关疾病：自身免疫性疾病、器官移植术后的免疫排斥反应、 IV型变态反应参予的皮肤炎性疾病。

在一个优选例中，所述自身免疫性疾病选自：风湿性及类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、重症肌无力、自身免疫性溶血性贫血、或肾病综合征或溃疡性结肠炎。附图说明

图 1说明了人参皂苷 -Rd溶液对大鼠同种异体皮肤移植的影响，所示为手术后第 12天移植皮片的照片。其中，各照片所示分别为：

图 1A: 正常对照组（自体移植；)；

图 1B : 模型对照组 (55体积％丙二醇水溶液， im， 0.2 ml/100 g体重；)；

图 1C : 阳性对照组 (环孢菌素 A注射液， 5 mg/kg体重， im， 0.2 ml/100 g体重)；图 ID : Rd低剂量组（12.5 mg Rd/kg体重， im， 0.2 ml/100 g体重，人参皂苷 -Rd含量 6.25 mg/ml) ;

图 IE: Rd中剂量组 (25 mg Rd/kg体重， im， 0.2 ml/100 g体重，人参皂苷 -Rd含量 12.5 mg/ml);

图 IF : Rd高剂量组 (50 mg Rd/kg体重， im， 0.2 ml/100 g体重，人参皂苷 -Rd含量

25 mg/ml)。具体实施方式

目前的人参皂苷 -Rd注射液采用 20体积％丙二醇为溶剂，在温度较低环境下，活性药物溶解度降低，易析出沉淀，影响使用和安全性。并且，现有人参皂苷 -Rd的临床应用也仅限于治疗急性缺血性脑卒中病等。

为了解决这些问题，本发明人进行了深入的研究，并出乎意料地发现可通过调整丙二醇的浓度使得人参皂苷 -Rd完全溶解，从而获得人参皂苷 -Rd真溶液，提高其溶解性和稳定性。发明人还进一步研究了人参皂苷 -Rd的用途，并发现了人参皂苷 -Rd (尤其是本发明的人参皂苷 -Rd真溶液)具有优良的抗炎和免疫抑制作用，因而可用于临床治疗炎性疾病和免疫相关疾病。在此基础上，发明人完成了本发明。人参皂苷 -Rd和丙二醇水溶液

本发明中，术语 "人参皂苷 -Rd" 、 "本发明的活性物质"和 "活性药物"可互换使用，均指具有背景技术部分所示结构式的化合物。

本发明所用的人参皂苷 -Rd，可自中药五加科植物 (例如三七)中经多步分离而得至 |J，也可通过化学合成的方法合成。在本发明中，优选使用纯度为 90以上的人参皂苷 -Rd, 优选纯度为 95-99.99 wt %，更优选纯度为 95-99 wt %。

本发明中，术语 "丙二醇"是指 1,2-丙二醇， "丙二醇水溶液"是指由丙二醇和水组成的复合溶剂，例如 " 55体积％的丙二醇水溶液"或 " 55体积％的丙二醇水溶液"均是指以丙二醇水溶液的总体积为基准计，所含丙二醇为 55体积％的丙二醇水溶液。在本发明中， " 100体积％的丙二醇水溶液"是指纯丙二醇，其中不含水。人参皂苷 -Rd真溶液及其制备方法

在本发明中，术语 "真溶液 " 是指一种均相分散系统，溶质以分子大小均匀地分布于溶剂中且两者之间无界面存在。真溶液的主要特征表现为透明、不能发生光的散射、扩散速度快、溶质与溶剂均可通过半透膜。在一定条件下，真溶液的溶质与溶剂不会自动地分离成两相，为热力学稳定系统。

在本发明中，术语 "人参皂苷 -Rd溶液"、 "本发明的人参皂苷 -Rd溶液"、 "人参皂苷 -Rd真溶液" 或 "本发明的溶液" 可互换使用。在本发明中，如果所得溶液澄清透明，无丁达尔现象，且在室温、冷藏和冷冻放置后 5天具有热力学稳定性，则判定为 "真溶液" 。

现有的以 20体积％的丙二醇水溶液作为溶剂的人参皂苷 -Rd注射液 (人参皂苷 -Rd 含量 10 mg/ml)并非真溶液，其有乳光存在。虽然该溶液按药典法检测澄明度是合格的，但其丁达尔现象阳性，说明存在 1-100 nm的颗粒。低温下，这部分颗粒布朗运动减弱，使得小颗粒易聚集成团，质量增加从而形成沉淀，从而使得制剂的溶解度失控。

本发明通过提高丙二醇水溶液的浓度获得人参皂苷 -Rd的真溶液，从而使得所述溶液在室温、冷藏和冷冻放置后均具有优良的热力学稳定性，且采用本发明的溶剂体系可使得人参皂苷 -Rd在溶液中的浓度得到提高，从而适于多种新用途。

具体而言，本发明的人参皂苷 -Rd溶液中所用溶剂为所含丙二醇 50体积％的丙二醇水溶液，优选 55〜100体积％的丙二醇水溶液，更优选 55〜80体积％的丙二醇水溶液，最优选 55〜75体积％的丙二醇水溶液。如要用该溶液制备注射液，丙二醇的浓度不宜过高，例如可为 55〜60体积％，优选 60体积％。

在本发明的人参皂苷 -Rd溶液中人参皂苷 -Rd的含量可为 1〜100 mg/ml, 优选 5〜 75 mg/ml, 更优选 10〜75 mg/ml, 20〜75 mg/ml或 50〜75 mg/ml„ 在要获得较高人参皂苷 -Rd含量 (例如 20〜75 mg/ml)的情况下，优选采用高浓度的丙二醇水溶液为溶剂，例如 60〜 75体积％的丙二醇水溶液。

在本发明中优选所述人参皂苷 -Rd溶液为 5mg/ml人参皂苷 -Rd在 55〜75体积％丙二醇水溶液中形成的溶液， 5〜75mg/ml人参皂苷 -Rd在 75体积％丙二醇水溶液中形成的溶液，或更优选 5〜25mg/ml人参皂苷 -Rd在 60体积％丙二醇水溶液中形成的溶液。

本发明的人参皂苷 -Rd真溶液中，不论人参皂苷 -Rd的含量高于还是低于现有的以 20体积％的丙二醇水溶液作为溶剂的人参皂苷 -Rd注射液（人参皂苷 -Rd含量 10 mg/ml), 其稳定性均优于现有的注射液。

本发明的人参皂苷 -Rd溶液在室温和冷藏 (2〜6°C )条件下保存较长时间（例如 12 天、 14天或 50天；)、以及在冷冻 (-20°C)条件下保存较短时间 (例如 24h， 48h)后均不会出现沉淀析出或有乳光产生，且所述溶液在冷冻条件下保存较长时间（例如 36或 60天) 后，在室温下放置片刻后振摇或振摇后室温放置一定时间后溶液恢复澄清且无乳光。

本发明人参皂苷 -Rd溶液可采用如下方法制备：方法 A.用不同浓度的丙二醇水溶液直接溶解人参皂苷 -Rd粉末，以获得所需人参皂苷 -Rd浓度；或方法 B.先将人参皂苷 -Rd溶解在纯丙二醇（即 100 %丙二醇水溶液）中，再进行稀释以使得人参皂苷 -Rd的含量达到 l〜100mg/ml溶液，并使得丙二醇水溶液达到所需的浓度。优选方法 B，稀释中所用稀释剂为水或丙二醇稀溶液 (即丙二醇浓度低于所需丙二醇终浓度)。药物组合物

在本发明中提供了一种药物组合物，其含有本发明的人参皂苷 -Rd溶液和药学上可接受的载体。本发明中，术语 "含有"表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语 "主要由...组成" 和 "由 .. 且成" 包含在术语 "含有" 中。本发明中，术语 "药学上可接受的" 成分是指适用于人和 /或动物而无过度不良副反应 (如毒性、剌激和变态反应)，即有合理的效益 /风险比的物质。

本发明中，术语 "药学上可接受的载体" 指用于治疗剂给药的载体，其本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后或给予保健品后没有过分的毒性。在《雷明顿药物科学》（Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Pub. Co. , N.J. 1991年；)中可找到关于药学上可接受的载体的充分讨论。

在本发明的一个实施方式中，以所述药物组合物的总重量为基准计，所述药物组合物中包含 0.01〜100 wt%本发明的人参皂苷 -Rd溶液，优选 0.1〜99.9 wt%，更优选 1-99 wt%。（此处 wt%指人参皂苷 -Rd溶液在药物组合物中所占的重量百分比,重量单位为克）。在本发明的一个实施方式中，所述药物组合物中包含 0.5-7.5g%(W/V)的本发明的人参皂苷 -Rd溶液，优选 0.5-7.5g % CW/V),更优选 0.5-2.5 g%CW/V)。（其中的单位 (W/V)是指每 100 ml药物组合物中含有的人参皂苷 -Rd溶液的克数)。在本发明的另一实施方式中，以药物组合物总体积为基准计，所述药物组合物中所含人参皂苷 -Rd的量为 5-100mg/ml, 更优选 5-75 mg/ml, 最优选 5-25 mg/ml。

本发明的药物组合物可为外用、内服、或注射用制剂形式，优选静脉内注射液、肌肉内注射液、口服溶液、喷剂，更优选所述注射用制剂形式为静脉内注射用或肌肉内注射用制剂形式，再优选静脉内注射用制剂形式。

在制备本发明的液体形式的药物组合物 (即人参皂苷 -Rd溶液剂)时，可采用如下方法：制备本发明的人参皂苷 -Rd溶液；然后用注射用水将人参皂苷 -Rd溶液稀释 0-10 倍，优选 0-5倍，更优选 0-3倍，最优选 0-2倍，并将所得稀释液与溶液剂用溶剂混合。所述溶液剂可为注射剂、外用剂或内服剂。在本发明的一个实施方式中，所述溶液用溶剂为注射用溶剂，其优选为注射用生理盐水、葡萄糖溶液、或葡萄糖生理盐水。

在本发明的另一实施方式中，所述药物组合物还包含其它活性物质或可与这些活性物质联用，所述其它活性物质选自：抗炎药、免疫抑制剂、急性缺血性脑卒中治疗剂、或抗器官移植排斥剂。抗炎作用

炎症是具有血管系统的活体组织对损伤因子所发生的防御反应，是许多疾病的症状或并发症，由于致病因子不同和身体机能差异，炎症对组织和机体的损害不尽相同，严重的炎症反应甚至威胁生命。抗炎药作为临床用药的第二大类药物，用量仅次于抗感染药，常用的化学合成抗炎药主要有肾上腺皮质激素类与非体类抗炎药，在长期应用中人们发现此类抗炎药存在许多不良反应，这使化学合成抗炎药的临床应用受到限制，人们愈来愈重视从中药中开发毒副作用较小的抗炎药物。

近年来发现三七总皂苷对多种急性渗出性炎症模型具有明显的对抗作用，人参皂苷 -Rd是从三七总皂苷中分离提取出来的活性单体，研究其抗炎活性旨在为发掘有效抗炎药提供理论依据。本实验采用了大鼠和小鼠角叉菜胶性足肿模型对本发明人参皂苷 -Rd溶液的抗炎性能进行了研究。

本文研究结果表明， iv和 im人参皂苷 -Rd对大鼠及小鼠角叉菜胶性足肿有显著抑制作用，提示该药物对急性炎症渗出过程有明显的抑制作用，说明 Rd具有良好的抗炎作用。 Rd的抗炎作用机制可能与抑制炎症介质及炎性细胞因子的释放有关，关于 Rd 的抗炎作用机制，有待进一步深入研究。

参考本实验结果，人参皂苷 -Rd抗炎生物活性明确，随着其药理作用及其作用机制的深入研究，人参皂苷 -Rd可作为抗炎药在临床上试用于风湿性、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、风湿性心瓣膜炎、结核性脑膜炎、胸膜炎、心包炎等多种炎症性疾病的治疗。免疫抑制作用

迟发型超敏反应是一种依赖 T细胞的细胞免疫反应，其主要特征是致敏机体在抗原攻击部位出现迟发型炎症性病理损伤。本发明中采用了 2,4-二硝基氯苯 (DNCB)诱发使小鼠的局部产生迟发型变态反应，即将化学低分子半抗原 DNCB稀释后涂抹于小鼠腹壁皮肤，与皮肤蛋白结合成完全抗原，由此剌激 T淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞， 4 天后将 DNCB涂抹于小鼠耳部进行攻击，使局部产生迟发型变态反应。

为研究人参皂苷 -Rd溶液的免疫抑制作用，发明人在实验中采取了多种给药方案，其中以 IV型变态反应的诱导相 (致敏相；)为主的全程给药和抗原攻击后迟发型超敏反应的效应相 (激发相)给药两种给药方案，均证实人参皂苷 -Rd对 DNCB所致小鼠迟发型超敏反应有显著抑制作用，而激发前单次给予 Rd对小鼠迟发型超敏反应没有影响。由于诱导相以免疫反应为主，效应相以炎症反应为主，人参皂苷 -Rd于此二相给药均能明显抑制 IV型变态反应，提示该药可能具有免疫抑制及抗炎的双重作用，而我们已有实验证实人参皂苷 -Rd有显著的抗炎作用，与本实验结果一致。

临床上特应性皮炎、接触性或过敏性皮炎、湿疹等皮肤过敏性疾病其发病除有 I 型变态反应参与外，还常与 IV型变态反应有关，而 IV型变态反应的表现常为急慢性炎症。实验结果表明，人参皂苷 -Rd有显著的抗炎和抗 IV型变态反应的作用，能抑制迟发型超敏反应的产生和发展,并能较迅速地改善皮肤炎性症状，这可能为其在临床上治疗有 IV型变态反应参予的皮肤炎性疾病提供理论依据。

器官移植是脏器功能衰竭终末期挽救病人生命的有效且必须的治疗手段，术后患者需终身服用免疫抑制药，目前以环孢素 A和他克莫斯 (FK506)为代表的免疫抑制剂特异性差、毒性高，能引起肿瘤、严重感染以及肝、肾等脏器的毒副作用，研究高效低毒的免疫抑制剂是当今医学研究的重点。为研究人参皂苷 -Rd的免疫抑制作用，我们研究了人参皂苷 -Rd对人 T淋巴细胞增殖的影响，发现可以明显抑制 ConA引起的人 T 淋巴细胞增殖，且呈浓度依赖性。本实验还采用了大鼠同种异体皮肤移植模型，此为器官移植经典模型，通过观察人参皂苷 -Rd对移植皮片平均存活时间的影响来考察人参皂苷 -Rd的抗免疫排斥作用，结果表明人参皂苷 -Rd能有效延长移植皮片的存活时间，具有免疫抑制作用。

由此，发明人证明了人参皂苷 -Rd在临床上可作为免疫抑制剂用于多种自身免疫性疾病，如风湿性及类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、重症肌无力、自身免疫性溶血性贫血、肾病综合征、溃疡性结肠炎等，还可用于临床上器官移植术后的免疫排斥反应，但其免疫抑制作用弱于 CsA，提示其在临床上主要作为其它免疫抑制剂的辅助用药，合用后通过减少其它免疫抑制剂的用量来降低不良反应。本发明的优点

1. 通过调整溶剂丙二醇水溶液的浓度使得人参皂苷 -Rd完全溶解，从而获得人参皂苷 -Rd的真溶液，提高其溶解性和稳定性；

2. 可提高注射液中活性物质含量或减小注射用药体积； 3. 发现了人参皂苷 -Rd的新用途，即人参皂苷 -Rd用于抗炎、免疫抑制和抗器官移植排除的新用途，因而可用于临床治疗炎性疾病和免疫相关疾病。

本领域普通技术人员还可通过本发明的描述体会到本发明的其它优点，例如成本低、制备方便等。实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例 1. 丙二醇助溶的低浓度人参皂苷 -Rd溶液的配方研究

目的：调整丙二醇浓度使得人参皂苷 -Rd能够完全溶解，以期获得真溶液，从而保证临床用药安全。

方法：选用不同体积比 (20体积％、 30体积％、 40体积％、 50体积％、 55体积％、 60体积％、 75体积％和100体积％)丙二醇水溶液作为溶剂，以 10 mg/ml和 5 mg/ml的含量添加人参皂苷 -Rd，确定能使人参皂苷 -Rd充分溶解的丙二醇浓度。获得真溶液后，在冷冻或冷藏条件下考察药液的溶解状态。对可用制剂用注射用水稀释后加入 250 ml 生理盐水中混匀或直接用生理盐水稀释，考察药物稀释过程中的溶解状态。

一、对能完全溶解人参皂苷 -Rd、并获得真溶液的丙二醇浓度的选择

1. 材料

人参皂苷 -Rd固体粉末 (由广东泰禾生物药业有限公司提供，批号： 050815); 丙二醇 (1,2-丙二醇，分析纯，北京化工厂生产）。

2. 方法

分别取人参皂苷 -Rd固体粉末，以 10 mg/ml溶解在不同浓度的丙二醇水溶液中。丙二醇浓度为 20体积％、 30体积％、 40体积％、 50体积％、 60体积％、 75体积％或100体积％。样品的配制方法有 2种： A法：用不同浓度的丙二醇水溶液直接溶解人参皂苷 -Rd 固体粉末； B法：先将人参皂苷 -Rd固体粉末溶解在纯丙二醇中，再加水定量，使丙二醇达到所需浓度。将所得溶液置于低温下冷藏 (2-6°C)保存，观察溶液状态，检测其丁达尔现象，即将样品置于暗室中，用一强光束照射液体时，可形成光亮 "通路" 的为胶体。这种形成光亮通路的现象叫丁达尔现象，真溶液没有丁达尔现象。丁达尔现象阴性则认为溶解性良好，可判断其为真溶液。结果见表 1-1 : 丙二醇浓度（v/v体积比）的选择

编号人参皂苷丙二醇低温保存 (2°C〜6°C )时丁达尔现象

-Rd 浓度 12 h I d 2 d 9 d 14 d

1 10 mg 100% - -

2* 10 mg 75% - -

3* 10 mg 50% - -

4* 10 mg 40% — + + + + (瓶底有白色颗粒）

5* 10 mg 30% + + + + + (瓶底有沉淀）

6* 10 mg 20% + + + + + (瓶底有沉淀）

7# 10 mg 75% - -

8# 10 mg 50% + + (瓶底有白色颗粒）

9# 10 mg 40% — + + + + (瓶底有白色颗粒）

10# 10 mg 30% + + + + + (瓶底有沉淀）

11# 10 mg 20% + + + + + (瓶底有沉淀）

* 表示样品用 B法配制， # 表示样品用 A法配制

3. 结果与分析：

所有样品放在低温 (2°C〜6°C)下保存。 12 h后，丙二醇浓度为 20体积％和30体积 %的样品均有沉淀析出。放置 1天时，丙二醇浓度为 40体积％的样品也有沉淀生成。可初步推断丙二醇浓度 40体积％时，不能完全溶解人参皂苷 -Rd。在第 9天时， A法配置的样品 8号 (丙二醇浓度为 50体积％有微弱乳光，丁达尔现象阳性。在低温放置 14 天时，所有出现丁达尔现象的样品都有沉淀或白色颗粒析出。

而同时间点，用 B法配制的丙二醇和人参皂苷 -Rd浓度相同的 3号样品，溶解度较好。可以看出，当样品的丙二醇浓度 50体积％时，可以较好的溶解人参皂苷 -Rd(10 mg/ml) , 获得真溶液。说明人参皂苷 -Rd的溶解度与丙二醇浓度有关。因此，调整溶剂丙二醇的浓度是使人参皂苷 -Rd充分溶解至关重要的一步。

同时，在配制过程中，先用纯丙二醇溶解 Rd后再添加定量的水 (B法)制备的样品可能要优于直接用不同浓度的丙二醇水溶液溶解人参皂苷 -Rd(A法)所得样品。由此推断， B法配制时丙二醇溶液对人参皂苷 -Rd的溶解度增加。二、人参皂苷 -Rd真溶液冷藏 (2°C〜6°C)或冷冻 (-20°C)条件下的溶液状态考察

如上所述，在室温下获得人参皂苷 -Rd真溶液，在低温 (2°C〜6°C和 -20°C)条件下保存，观察其溶液状态，并检测丁达尔现象。取人参皂苷 -Rd固体粉末，以 10 mg/ml 和 5 mg/ml溶解在浓度 50体积％的丙二醇中 (B法配制）。制得的样品在室温下溶液澄清，丁达尔现象均呈阴性。分别将样品放置在 2°C〜6°C和 -20°C的环境下保存。观察其溶液状态，检测其丁达尔现象。结果见表 1-2、 1-3：

表 1-2. 人 _参皂苷 -Rd的丙二醇真溶液在冷藏条件下溶液状态考察结果 " (mg/ml) (放于冰箱前）

12 ΪΪ 2 d Ϊ2 d 50 d 2 %

3 '%

4 %

'% +

6 %

'%

8 % 表 1-3. 人参皂苷 -Rd的丙二醇真溶液在冷冻条件下溶液状态考察结果一人参阜苷 ?4 hi-7 () VA rii-7 () VA

澄澄澄澄澄澄澄

表 1-4. 冷冻条件下保存 36d，样品在室温放置片刻及过夜后溶液状态考察结果

人参皂苷清清清清清清清清样品丙二醇室温放置片刻，振摇振摇后室温放置过夜

-Rd含量

号浓度 (mg/ml) 溶液状态达尔现象溶液状态丁达尔现象

1 50% 5 澄清

2 55% 5 澄清

3 60% 5 澄清

4 75% 5 澄清

5 50% 10 有少许沉淀

6 55% 10 有少许沉淀

7 60% 10 澄清

8 75% 10 澄清结果与分析

用 B法配制的样品，在室温下，当丙二醇浓度在 50〜75体积％之间时，人参皂苷 -Rd以 5 mg/ml和 10 mg/ml含量加入，溶液澄清，丁达尔现象阴性。

用 B法配制的样品，冷藏时考察结果 (表 1-2)，所有样品在 2 °C保存时，人参皂苷 -Rd的含量为 5 mg/ml和 10 mg/ml的样品在 2d内都不会有沉淀析出，且丁达尔现象阴性。而在 2°C放置 12 d， 5号样品 (丙二醇浓度 =50体积％，人参皂苷 -R d的含量为 10 mg/ ml)可见微弱乳光。 2°C放置更久 (50 d)时， 5号样品有白色颗粒析出。

用 B法配制的样品，在冷冻条件下考察 (表 1-3)，结果当所有样品放置在 -20 °C环境下 24 h，人参皂苷 -Rd含量为 10 mg/ml、丙二醇浓度为 50〜60体积％的样品丁达尔现象阳性，丙二醇浓度为 75体积％的样品澄清且无乳光。而 1号样品 (丙二醇浓度为 50体积％，人参皂苷 -R d含量为 5 mg/ml)也可见微弱乳光。其余样品溶液澄清，丁达尔现象阴性。但放置若干天 (36 d)，丙二醇浓度 60体积％，人参皂苷 -Rd含量为 10 mg/ml 或 5 mg/ ml的样品有沉淀析出或产生浑浊。而丙二醇浓度为 75体积％，人参皂苷 -Rd 含量为 10 mg/ml或 5 mg/ml的样品仍然澄清且无乳光。冷冻条件下保存了 36天的样品在室温 (18 °C )下放置片刻，人参皂苷 -Rd 为 5 mg/ml的样品 (丙二醇浓度为 50〜60体积 %和人参皂苷 -Rd 为 10 mg/ml的样品 (；丙二醇浓度为 60体积％沉淀可通过振摇迅速溶解，重新溶解后的样品溶液澄清且无乳光。而丙二醇浓度为 50体积％和55体积％，人参皂苷 -Rd 为 10 mg/ml的样品振摇后并不能即刻溶解，需过夜放置才能澄清且无乳光 (表 1-4)。

结果表明，人参皂苷 -Rd的含量为 5 mg/ml、丙二醇浓度 55体积％时，不论在室温、冷藏 (2〜6 °C )或冷冻 (-20 °C )条件下保存较短时间，不会出现沉淀析出或乳光 (丁达尔现象阳性)等情况，但冷冻 (-20 °C )条件下保存时间较长时 (36天)，丙二醇浓度为 55 体积％和60体积％的样品出现乳光或浑浊，室温放置后振摇可使溶液重新澄清且无乳光。可以判断这两种含人参皂苷 -Rd为 5 mg/ml的样品为临床可用制剂。

而丙二醇浓度为 55体积％、人参皂苷 -Rd的含量为 10 mg/ ml的样品虽然在室温和冷藏 (2〜6°C )环境下溶液状态稳定，但冷冻 (-20°C )条件下保存 36天时产生的浑浊需室温放置过夜才能恢复澄清。因此，此类溶液可在冷藏条件下保存，但不建议在冷冻条件下保存。

另外需要注意的是，注射液中可加的丙二醇浓度一般为 20〜60体积％，更适合生产工艺的要求。丙二醇浓度为 75体积％，人参皂苷 -Rd的含量为 5 mg/ml和 10 mg/ml的样品在室温、冷藏或冷冻条件下都为真溶液，但由于丙二醇浓度过高时液体粘度增大，生产工艺难度增大，可通过添加降低粘度的物质来制成注射液，根据本领域常识对降低粘度的物质进行选择。三、稀释试验

1. 稀释方法的影响

一步法稀释：将人参皂苷 -Rd溶液不加水而直接注入 250 ml生理盐水中；二步法稀释：取样品 1 ml(含人参皂苷 -Rd 10 mg/ml)或 2 ml(含人参皂苷 5 mg/ml) 与等体积的水混合，再注入 250 ml生理盐水中。

观察溶液状态，比较二步法稀释或一步法稀释配制人参皂苷 -Rd注射液的方法的优劣性，结果见表 1-5 :

表 1-5. —步法稀释或二步法稀释的比较

溶液状态

二步法稀释一步法稀释 1 50% 5 2 ml 有少许浑荡

2 55% 5 2 ml 清

3 60% 5 2 ml

4 75% 5 2 ml

5 50% 10 1 ml 许浑浊，振荡

6 55% 10 1 ml 许浑浊，振荡

7 60% 10 1 ml 许浑浊，振荡

8 75% 10 1 ml 许浑振荡

丙二醇浓度为 50〜75体积％、人参皂苷溶度为 5-10 mg/ml时，各制剂与注射用水等体积混合后不会出现浑浊。人参皂苷 -Rd含量在 10 mg/mK 丙二醇浓度在 50〜75体积％的样品直接注入 250 ml生理盐水可出现浑浊。人参皂苷 -Rd含量在 5 mg/ml，丙二醇浓度在 55〜75体积％的样品直接注入 250 ml生理盐水也不会浑浊。而选用注射用水二步稀释法不会使药物在 250 ml生理盐水中形成混浊，重复性较好，因此更适合于临床应用。

2. 稀释加水量对中间样本溶解状态的影响

二步法稀释人参皂苷 -Rd丙二醇溶液时，如加水量过多，有可能由于丙二醇浓度降低而导致药物析出。因而临床稀释药物时，对加水清清清清清清清清量应有个控制范围。本实验用二步法稀释样品，改变加水量，考察样品与水混合出现浑浊时的最小用水量。结果见表 1-6：

有有有有

表 1-6. 加水量对中间样本溶解状态的影响

—J 口，

样品号丙二醇浓度人参皂苷 -Rd含 j

溶液变浑浊时的最小用水

11 5500%% 55 mmgg// mmll 22 mmll 1133 mmll--1133..55 mm清清ll

2 55% 5 mg/ ml 2 ml 15 ml 左右

3 60% 5 mg/ ml 2 ml 17 ml- 18 ml

4 75% 5 mg/ ml 2 ml 24 ml-25 ml

5 50% 10 mg/ ml 1 ml 2.5 ml -3.5 ml

6 55% 10 mg/ ml 1 ml 4 ml 左右

7 60% 10 mg/ ml 1 ml 5 ml-6 ml

8 75% 10 mg/ ml 1 ml 7 ml-8 ml

二步法稀释人参皂苷 -Rd丙二醇溶液时，加水量过多时，可引起溶液中药物析出，而使得中间样品中出现严重浑浊。而且，注射剂中药物含量增加时，可加水量愈小。参考表 1-6结果判定，采用人参皂苷 -Rd丙二醇溶液加水对倍稀释的办法，可保证药物稀释时的加水量远离引起混浊的加水量，而不会由于临床操作不准造成药物稀释后混浊。因此，在二步稀释法中，控制注射用水的用量是稀释过程中最关键的一步。四、关于实施例 1的讨论

原有人参皂苷 -Rd注射液选用 20体积％丙二醇作为溶剂不能很好的使人参皂苷

-Rd固体粉末充分溶解 (参见背景技术部分)。室温下溶液澄清，但丁达尔现象阳性。发明人通过实验出乎意料地发现通过调整丙二醇浓度可获得真溶液。当丙二醇浓度 50体积％时，人参皂苷 -Rd含量为 5 mg/ml的样品在室温、冷藏 (2~6 °C )及冷冻 (-20 °C )条件下保存较短时间都可以保持稳定的溶解状态，不会出现沉淀析出或有乳光而导致制剂不合格的现象。用对倍注射用水稀释再注入 250 ml生理盐水中，也不会出现浑浊，可供临床应用。虽然该样品在冷冻 (-20°C )条件下保存时间较长时 (36 d)，会出现浑浊或析出沉淀，但将其置于室温下 (18 °C )片刻，通过振摇可快速使其重新溶解，重新溶解后的样品溶液澄清且无乳光。因此，可选用丙二醇浓度为 55体积％、人参皂苷 -Rd含量为 5 mg/ml的样品作为药用。这些样品在室温和冷藏条件下溶液溶解状态良好且无乳光。在冷冻 (-20°C )条件下保存时间较长时可出现沉淀，但置于室温下片刻、振摇后可快速溶解，重新溶解后液体澄清且无乳光，仍为真溶液，可作为临床用制剂。

选用较高浓度的丙二醇溶液作为溶剂，可解决人参皂苷 -Rd充分溶解最终获得真溶液的问题。若同时减少单位体积人参皂苷 -Rd的含量到 5 mg/ml，则还可确保样品在 -20°C条件下也不会析出沉淀或出现乳光。

考察进一步发现：用纯丙二醇溶解人参皂苷 -Rd配制药液，优于用丙二醇水溶液溶解人参皂苷 -Rd的方法。但在溶解药物时，务使药物完全溶解形成真溶液，应加测乳光。

在稀释时，选用了注射用水而非药厂原来使用的专用稀释液。在一定程度上减少了丙二醇的浓度和用量，也降低了再次注入 250 ml生理盐水中出现浑浊的可能，大大增加了临床用药的方便和安全性。优选采用二步稀释法进行稀释，且加入的注射用水量不宜过多。

通过丙二醇的浓度的调整，解决了人参皂苷 -Rd溶解性的问题。常温下当丙二醇的浓度 50体积％时，单位体积溶解 5 mg或 10 mg人参皂苷 -Rd可获得真溶液，无乳光，过滤、分装都很方便。冷藏 (2〜6 °C )或冷冻 (-20 °C )较短时间，人参皂苷 -Rd含量在 5 mg/ml、丙二醇的浓度 55〜 75体积％的样品不会有沉淀析出。

推荐临床应用样品：人参皂苷 -Rd 5 mg/ml,每支 2 ml,丙二醇浓度 55%〜75体积％。但在丙二醇浓度为 55体积％2 ml药液中所含丙二醇正好为 1.1 ml, 与原临床试验时给人所给的丙二醇量相等，不存在重新评价安全性的问题。实施例 2. 高浓度丙二醇对高浓度人参皂苷 -Rd溶解性的影响

目的：增加丙二醇的浓度，依次增加人参皂苷 -Rd的含量，考察丙二醇的浓度对人参皂苷 -Rd溶解性的影响。

方法：选用浓度 50体积％的丙二醇，分别以不同含量 (20 mg/ml、 25 mg/ml、 50 mg/ml、75 mg/ml)添加人参皂苷 -Rd [先用纯丙二醇溶解人参皂苷 -Rd粉末后再添加定量的水 (B法 )]。在室温下放置若干天，将溶液状态良好的样品置于冰箱冷藏或冷冻保存，观察溶液状态，检测其丁达尔现象。 1. 材料 (同实施例 1)

样号品

2. 方法

选用浓度 50体积％的丙二醇，分别以不同含量 (20 mg/mK 50 mg/ml和 75 mg/ml) 添加并溶解人参皂苷 -Rd。将样品在室温放置，观察溶液状态，检测丁达尔现象。结果见表 2-1。再将丙二醇浓度为 60体积％和75体积％的样品置于冰箱冷藏或 -20 °C冷冻若干小时后取出室温保存，观察溶液状态，检测丁达尔现象。结果见表 2-2、表 2-3。表 2-1. 室 i ^ ^ ^ ^ i温下丙二醇浓度对人参皂苷 -Rd溶解性的影响

丙二醇清清清清清清 12 h 2 d

Rd*含量

浓度 (mg/ml) Γ达尔 Γ达尔 Γ达尔 (%) 溶液状态溶液状态溶液状态

现象现象现象

1 50 20 未完全溶解 + 未完全溶解 +

50 未完全溶解 + 未完全溶解 +

i ^ ^ ^ ^ i

析^^ ^ ^ ^ i

50 未完全溶解 + 有白清清清清清清色清清清清清清出颗粒 +

4 60** 20

5 60** 25

6 60 50 i ^ ^ ^ ^ i

7 75 20 清清清清清清

8 75 50 大颗大颗白

9 75 75 色析粒粒^^ ^ ^ ^ ¾量量

颗析析凊凊凊凊凊凊出白白

*人参皂苷 -Rd. 室温 **60%丙二醇，人参皂苷 -Rd含量为 20 mg/ml和 2粒色色出出5 mg/ml的样品在室温下保存 60天，溶液澄清无乳光表、、、塞、§、工避、、歷、 ί、±§ί ^^^

样品丙二醇人参皂苷 -Rd含量室^下冰箱冷藏 (2°C )25 d 号浓度(％) (mg/ml) 溶液状态溶液状态丁达尔现象

4

*60%丙二醇，人参皂苷 -Rd含量为 20 mg/ml和 25 mg/ml的样品冷藏下保存 60天，溶浦清无乳光

号浓度 ( -Rd含量保存 5 h左右

3 h 1 d 6 d 8 d

(mg/ml) 溶液状态

4

"表示溶液澄清无乳光 *60%丙二醇，人参皂苷 -Rd含量为 20 mg/ml和 25 mg/ml 的样品冷冻下保存 60天后溶液浑浊，但重置室温下 10 mm后溶液澄清无乳光

3. 结果与分析

在室温放置，浓度为 50体积％的丙二醇不能溶解 20 75 mg/ml的人参皂苷 -Rd 浓度为 60体积％和75体积％的丙二醇凊凊冰冰池溶液可以溶解较大量的人参皂苷 -Rd，且溶液澄清无乳光 (表 2-1)。

样品在 -20 °C冷冻若干小时后浑浊或结冰，取出室温放置，溶液澄清无乳光 (表 2-3)。这与之前实验中所配制的样品（丙二醇浓度为 75体积％，人参皂苷 -Rd含量 10 mg/ml)在冰箱 -20°C冷冻 36天溶液澄清无乳光的结果是一致的。可见 75体积％的丙二醇能较好溶解少量人参皂苷 -Rd，在低温保存溶液状态稳定无乳光。而当 75体积％的丙二醇溶解较多量人参皂苷 -Rd，在冰箱 -20 °C冷冻保存，人参皂苷 -Rd含量越高，越易结冰。在 75体积％的丙二醇中溶解 75 mg/ml人参皂苷 -Rd放于冰箱 -20 °C冷冻保存一个月以上，重新置于室温下片刻即可恢复澄清且无乳光，可以推断浓度为 75%的丙二醇是溶解人参皂苷 -Rd较好的溶剂。以此来配制的人参皂苷 -Rd液体制剂性质稳定。

另外对丙二醇浓度为 60体积％、人参皂苷 -Rd含量为 20 mg/ml和 25 mg/ml的样品分别置于室温、冷藏、冷冻条件下保存 60天，发现其在室温和冷藏环境下溶液均澄清且无乳光，而冷冻保存的样品虽然发生浑浊但置于室温下放置 lOmin后可溶解且无乳光，可以临床应用。

4. 讨论

通过实施例 1的实验已认识到：丙二醇浓度 55体积％，人参皂苷 -Rd含量在 5 mg/ml的样品在冷藏或冷冻条件下保存，溶液状态良好且无乳光。为了考察丙二醇浓度对人参皂苷 -Rd溶解性的影响，我们进行了实施例 2的实验。

在本实验中，增大丙二醇浓度并增加人参皂苷 -Rd的含量，在室温下放置观察溶液状态。当丙二醇浓度 55体积％，优选浓度为 60体积％和75体积％时，可以溶解较大量的人参皂苷 -Rd，且溶液澄清无乳光。丙二醇浓度为 75体积％的样品溶液澄清且无乳光。将样品置于冰箱 -20 °C冷冻若干小时浑浊或结冰后，取出室温放置，溶液澄清且无乳光。对丙二醇浓度为 75体积％、人参皂苷 -Rd含量为 75 mg/ml的样品冷冻保存时间较长时间，样品结冰。置于室温下片刻即可溶解且无乳光。而丙二醇浓度为 75 体积％、人参皂苷 -Rd含量为 10 mg/ml的样品在 -20°C冷冻保存一个月以上溶液状态依然良好无乳光。对丙二醇浓度为 60体积％、人参皂苷 -Rd含量为 20 mg/ml和 25 mg/ml 的样品分别置于室温、冷藏、冷冻条件下保存 60天，发现其在室温和冷藏环境下溶液均澄清且无乳光，而冷冻保存的样品虽然发生浑浊但置于室温下放置 lOmin后可溶解且无乳光，可以临床应用。由此判断：浓度为 60 75体积％的丙二醇可以较好的增大人参皂苷 -Rd的溶解度，获得在常温和低温 (-2°C)冷藏保存都很稳定的溶液。该样品在冷冻条件下保存若干天，在室温下放置即刻恢复澄清且无乳光。

由上述实验结果得出的结论是：增加丙二醇浓度可以较好的增大人参皂苷 -Rd的溶解度。通过增加丙二醇浓度就可获得所需真溶液且增大了人参皂苷 -Rd的溶解度，所得样品在常温或低温冷冻保存性质稳定。实施例 3. 人参皂苷 -Rd对炎症的影响

本实验采用角叉菜胶作为急性炎症诱导剂，将其注射于小鼠及大鼠足跖皮下诱发大鼠及小鼠足肿模型观察人参皂苷 -Rd对炎症的影响。

1. 动物

昆明种小鼠 120只，雌雄各半，清洁级，体重 18〜22g，购自兰州大学实验动物中心，许可证号： SCXK (甘) 20050007; Wistar大鼠 96只，雌雄各半， SPF级，体重 180〜 220g, 购自甘肃中医学院科研实验中心，许可证号： SCXK (；甘 )20040006。

2. 药品

2.1 人参皂苷 -Rd: 由广东泰禾生物药业有限公司提供，产品批号： 980303，临用前一天用 55%丙二醇溶解配制成相应浓度的溶液。

2.2 地塞米松磷酸钠注射液：天津药业焦作有限公司生产，产品批号： 08020111，临用前用生理盐水稀释成相应浓度。

2.3 角叉菜胶：和光纯药工业株式会社生产，产品批号： 037-09692，临用前 24h 用生理盐水配制成浓度为 1%(W/V)的溶液， 4°C冰箱保存。

2.4 0.9%氯化钠注射液：甘肃扶正药业科技股份有限公司生产，产品批号： 200709100102。

3. 仪器

电子天平，型号： FA1604S , 由上海天平仪器厂制造；

足趾容积测量仪，型号： YLS-7B , 由山东省医学科学院设备站制造。

4. 方法

4.1 静脉注射 (iv)不同剂量人参皂苷 -Rd对角叉菜胶致小鼠足肿的影响

昆明种小鼠 60只，雌雄各半，体重 18〜22g，随机分为 6组，每组 10只，分组及给药情况如下：第一组：模型对照组， 55体积％丙二醇， iv， 0.1ml/10g体重；第二组：阳性对照组，地塞米松磷酸钠， iv， 2mg地塞米松磷酸钠 /kg体重， 0.1ml注射液 /10g 体重；第三组： Rd低剂量组， iv， 4mg Rd/kg体重， 0.1ml Rd 注射液 /10g体重；第四组： Rd中剂量组， iv， 20mg Rd/kg体重， 0.1ml Rd 注射液 /10g体重；第五组： Rd高剂量组， iv， lOOmg Rd/kg体重， 0.1 ml Rd 注射液 /10g体重；第六组： im Rd高剂量组， 100mg Rd/kg体重， 0.1ml Rd 注射液 /10g体重。

各组给相应药物后 lh，分别在每组每鼠左后肢足跖皮下注射 1%(W/V)角叉菜胶致炎， 50μ1/只。致炎后 4h沿足踝关节剪下左右后足，精确称重。采用以下公式计算各组的肿胀度和肿胀抑制率：

肿胀度 =左足重一右足重，

m m ^(» -模型对照组平均肿胀度-给药组平均肿胀度 ^ _00%

肿胀抑制 ( /。)- 模型对照组平均肿胀度 ^{x l 00 /o}

统计学处理，使用 Excel-2003进行统计，各组数据均为计量资料，以. f±s表示，组间差异的显著性用 t检验。

4.2 肌肉注射 (im)不同剂量 Rd对角叉菜胶致小鼠足肿的影响

昆明种小鼠 60只，雌雄各半，体重 18〜22g，随机分为 6组，每组 10只，分组及给药情况如下：第一组：模型对照组， 55体积％丙二醇， im， 0.1 ml/10g体重；第二组：阳性对照组，地塞米松磷酸钠， im， 2mg地塞米松磷酸钠 /kg体重， 0.1ml注射液 /10g 体重；第三组： Rd 12.5mg/kg体重组， im， 0.1ml Rd 注射液 /10g体重；第四组： Rd 25mg/kg体重组， im， 0.1ml Rd 注射液 /10g体重；第五组： Rd 50mg/kg体重组， im， 0.1ml Rd 注射液 /10g体重；第六组： Rd 100mg/kg体重组， im， 0.1ml Rd 注射液 /10g 体重。

各组 im相应药物后 lh，分别在每组每鼠右后肢足跖皮下注射 1%(W/V)角叉菜胶致炎， 50μ1/只。致炎后 4h沿足踝关节剪下左右后足，精确称重。采用 4. 1中的公式计算各组的肿胀度和肿胀抑制率，并如 4.1中进行统计学处理。

4.3 肌肉注射 (im)不同剂量 Rd对角叉菜胶致大鼠足肿的影响

Wistar大鼠 96只， 180〜220g，雌雄各半，随机分为 6组，每组 16只，分组及给药情况如下：第一组：正常对照组；第二组：模型对照组， 55体积％丙二醇， im， 0.2ml /100g体重；第三组：阳性对照组，地塞米松磷酸钠， l mg/kg体重， 0.2ml注射液 /100g 体重， im; 第四组： Rd低剂量组， im， 12.5mg Rd/kg体重， 0.2ml Rd 注射液 /100g体重；第五组： Rd中剂量组， im， 25mg Rd/kg体重， 0.2ml Rd 注射液 /100g体重；第六组： Rd高剂量组， im， 50mg Rd/kg体重， 0.2ml Rd 注射液 /100g体重。

给药前在大鼠左后肢踝关节处用记号笔作一标记线，并测定左足正常足跖容积 (标记线以下)，连续两次，求其平均值作为基础容积。各组 im相应药物后 lh，分别在各鼠左后肢足跖皮下注射 1%角叉菜胶致炎， 0.1ml/只，正常对照组皮下注射生理盐水，分别测量致炎后 lh， 2h， 4h， 6h左足足跖容积 (按给药前标记线测量)，计算出肿胀度和肿胀抑制率。

肿胀度 =致炎后足跖容积一致炎前足跖容积

m m ^ . -模型对照组平均肿胀度-给药组平均肿胀度 ^ _00%

肿胀抑制 ( /。)- 模型对照组平均肿胀度 ^{x l 00 /o}

统计学处理，使用 Excel-2003进行统计，各组数据均为计量资料，以 ±s表示，组间差异的显著性用 t检验。

5. 结果

5.1 静脉注射不同剂量人参皂苷 -Rd对角叉菜胶致小鼠足肿的影响

静脉注射人参皂苷 -Rd对角叉菜胶致小鼠足肿有显著抑制作用，且有量效关系，能明显减轻角叉菜胶所致小鼠后足的红、肿等症状，与模型对照组足肿胀度相比较，地塞米松 2 mg/kg体重 iv时，？<0.01(肿胀抑制率为43.09%)，人参皂苷 -Rd 4 mg/kg体重 iv时， P>0.05(肿胀抑制率为 18.26 %)，人参皂苷 -Rd 20 mg/kg体重 iv时， P<0.05(肿胀抑制率为 19.10 %); 人参皂苷 -Rd 100 mg/kg体重 iv时，？<0.01(肿胀抑制率为43.76 %)，人参皂苷 -Rd 100 mg/kg体重 im时， P<0.01(肿胀抑制率为 49.40 %)，抗炎效果显著，实验结果如表 3-1所示。

表 3-1 静脉注射不同剂量人参皂苷 -Rd对角叉菜胶致小鼠足肿的影响 (. ±s，n=10)

组别药物剂量 (mg/kg体重）肿胀度 (mg) 肿胀抑制率模型对照组 55%丙二醇 - 51.45±7.77 - 阳性对照组地塞米松 2 29.28±10.76 43.09

Rd 4 42.06±10.57 18.26

Rd iv组 Rd 20 41.62±7.00* 19.10

Rd 100 28.94±10.31** 43.76

Rd im组 Rd 100 26.03±6.80** 49.40

注：与模型对照组比较， <0.05， **P<0.

5.2 肌肉注射不同剂量人参皂苷 -Rd对角叉菜胶致小鼠足肿的影响

与模型对照组比较，肌肉注射人参皂苷 -Rd能明显减轻角叉菜胶所致小鼠后足的红、肿等症状，能够显著抑制角叉菜胶所致的小鼠足肿，且有量效关系，与模型对照组足肿胀度相比较，地塞米松 2 mg/kg体重 im时， P<0.01(肿胀抑制率为 35.43 %)，人参皂苷 -Rd为 12.5 mg/kg 体重 im时， P>0.05(肿胀抑制率为 15.80 %)，人参皂苷 -Rd为 25、 50、 100 mg/kg 体重 im时，卩均<0.01(肿胀抑制率分别为 44.47 %、 53.80 %、 58.33 %), 抗炎效果显著，实验结果如表 3-2所示。

表 3-2 肌肉注射不同剂量人参皂苷 -Rd对角叉菜胶致小鼠足肿的影响 (. ±s，n=10)

组另 IJ 药物剂量 (mg/kg体重）肿胀度 (mg) 肿胀抑制率(％) 模型对照组 55%丙二醇 - 43.05±11.50 - 阳性对照组地塞米松 2 27.80±11.40** 35.43

Rd 12.5 36.25±9.11 15.80

Rd组 Rd 25 23.91±8.86** 44.47

Rd 50 19.89±8.34** 53.80

Rd 100 17.94±4.77** 58.33

注：与模型对照组比较， **P<0.01

5.3 肌肉注射不同剂量人参皂苷 -Rd对角叉菜胶致大鼠足肿的影响

人参皂苷 -Rd对角叉菜胶致大鼠足肿有显著抑制作用，且有剂量依赖性。模型对照组与正常对照组比较，致炎后各时间点 !^均<0.01，表明造模成功；与模型对照组足肿胀度相比较，地塞米松在致炎后各时间点 !^均<0.01，足肿抑制率在各时间点分别为 59.30 %、 62.82 %、 65.63 %及78.70 %；各给药组除人参皂苷 -Rd低剂量组在致炎后 4h P<0.05外，其余各组在各时间点？均<0.01，人参皂苷 -Rd 12.5 mg/kg体重组足肿抑制率在各时间点分别为 62.79 %、 42.3 1 %、 40.63 %及 47.22 %，人参皂苷 -Rd 25 mg/kg体重组足肿抑制率在各时间点分别为 67.44 %、 46. 15 %、 40.63 %及 74.07 %，人参皂苷 -Rd 50 mg/kg体重组足肿抑制率在各时间点分别为 68.60 %、 58.97 %、 46.88 %及75.00 %，抗炎效果显著，实验结果如表 3-3、表 3-4所示：

表 3-3 im不同剂量人参皂苷 -Rd对角叉菜胶致炎后不同时间点

大鼠足肿胀度的影响（~¾±s，n=16)

组别药物剂量肿胀度 (ml)

(mg/kg体重） lh 2h 4h 6h 正常对照 - - 0.26±0.22 0.26 ±0.23 0.32±0.23 0.30± 0.28 模型对照 55%丙二醇 - 0.86±0.49** 0.78±0.22** 0.64±0.27 1.08±0.28** 阳性对照地塞米松 1 0.35±0.28^{A A} 0.29±0.18^{A A} 0.22±0.16^{A A} 0.23±0.17^{A A}

Rd低剂量 Rd 12.5 0.32±0.21 ^{A A} 0.45±0.20^{A A} 0.38±0.28^A 0.57±0.27^{A A}

Rd中剂量 Rd 25 0.28±0.18^{A A} 0.42±0.25 ^{A A} 0.38±0.20^{A A} 0.28±0.25 ^{A A}

Rd高剂量 Rd 50 0.27±0.17^{A A} 0.32±0.18^{A A} 0.34±0.18^{A A} 0.27±0.24^{A A} 注：与正常对照组比较， **P<0.01 ; 与模型对照组比较， ^AP<0.05, "P<0.01 表 3-4 mi不同剂量人参皂苷 -Rd在角叉菜胶致炎后不同时间点的足肿抑制率组别药物

足肿抑制率 (

(mg/kg体重） lh 2h 4h 6h 正常对照 - - - - - - 模型对照 55%丙二醇 - - - - - 阳性对照地塞米松 1 59.30 62.82 65.63 78.70

Rd低剂量 Rd 12.5 62.79 42.31 40.63 47.22

Rd中剂量 Rd 25 67.44 46.15 40.63 74.07

Rd高剂量 Rd 50 68.60 58.97 46.88 75.00 结果显示静脉和肌肉注射人参皂苷 -Rd均能显著抑制角叉菜胶引起的大鼠及小鼠足肿，使足肿胀度明显下降，且有量效关系，而肿胀抑制率也呈明显的剂量依赖性。与模型对照组足肿胀度相比较，小鼠在 iv (静脉内注射;)地塞米松 2mg/kg体重时， ?<0.01(肿胀抑制率为43.09 %)， iv人参皂苷 -Rd 4 mg/kg体重时， P>0.05(肿胀抑制率为 18.26 %) , iv人参皂苷 -Rd 20 mg/kg体重时， P<0.05(肿胀抑制率为 19. 10 %) ; iv人参皂苷 -Rd 100 mg/kg体重时， P<0.01 (肿胀抑制率为 43.76 %；); 小鼠在 im地塞米松 2 mg/kg 体重时， P<0.01 (肿胀抑制率为 35.43 %) , im人参皂苷 -Rd 12.5 mg/kg体重时， P>0.05(肿胀抑制率为 15.80 %)， im人参皂苷 -Rd 25、 50、 100 mg/kg体重时，？均<0.01 (肿胀抑制率分别为 44.47 %、 53.80 %、 58.33 %)；大鼠在 im地塞米松 1 mg/kg体重时，在致炎后各时间点 I^ <0.01，足肿抑制率在各时间点分别为 59.30 %、 62.82 %、 65.63 %及 78.70 %， im人参皂苷 -Rd 12.5、 25、 50 mg/kg体重时，除人参皂苷 -Rd 12.5 mg/kg体重剂量组在致炎后 4h P<0.05外，其余各剂量组在各时间点？均<0.01，人参皂苷 -Rd 12.5 mg/kg 体重组足肿抑制率在各时间点分别为 62.79 %、 42.31 %、 40.63 %及 47.22 %，人参皂苷 -Rd 25 mg/kg体重组足肿抑制率在各时间点分别为 67.44 %、 46.15 %、 40.63 %及 74.07 %，人参皂苷 -Rd 50 mg/kg体重组足肿抑制率在各时间点分别为 68.60 %、 58.97 %、 46.88 %及 75.00 %。

6. 结论

人参皂苷 -Rd在静脉和肌肉注射时均有显著的抗炎作用，其强大的抗炎活性提示其可作为抗炎药在临床上具有广泛用途，可试用于风湿性、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、风湿性心瓣膜炎、结核性脑膜炎、胸膜炎、心包炎等多种炎症性疾病的治疗。

本发明的人参皂苷 -Rd溶液与现有技术中的人参皂苷 -Rd溶液相比，具有更高的稳定性和溶解性，可含有更高浓度的人参皂苷 -Rd，因此更适于用于临床抗炎治疗。实施例 4. 人参皂苷 -Rd的免疫抑制作用

本实验通过研究人参皂苷 -Rd对小鼠迟发型超敏反应 (DTH)、 ConA诱导的人 T淋巴细胞增殖及大鼠同种异体皮肤移植后皮片存活时间的影响，观察人参皂苷 -Rd的免疫抑制作用。

一、人参皂苷 -Rd(Rd)对小鼠迟发型超敏反应 (DTH)的影响

1 材料

1.1 动物

昆明种小鼠 202只， SPF级，体重 18〜22g，雌雄各半，购自甘肃中医学院科研实验中心，许可证号： SCXK (甘) 20040006。

1.2 药品

人参皂苷 -Rd，由广东泰禾生物药业有限公司提供，批号： 050815，给药前一日用 55%丙二醇溶解配成相应浓度；地塞米松磷酸钠注射液，天津药业焦作有限公司生产，批号： 080201 1 1，临用前用生理盐水稀释至所需浓度； 2,4-二硝基氯苯 (DNCB), 上海中秦化学试剂有限公司生产，批号： 2008031 1，临用前用丙酮 -麻油 (V薩: V麻油为 1 : 1)配成 l%Clg DNCB/lOOml丙酮-麻油)浓度；硫化钠 CNa₂S；)，成都化学试剂厂生产，批号： 910923-1。

1.3 仪器电子天平，型号： FA1604S , 上海天平仪器厂制造。

2. 方法

2.1 激发前单次给药对小鼠迟发型超敏反应的影响

昆明种小鼠 84只，体重 18〜22g，雌雄各半，按体重随机分成 6组，每组 14只，分组及给药情况如下：第一组：正常对照组；第二组：模型对照组， 55体积％丙二醇溶液， im， 0.1 ml/10g体重；第三组：阳性对照组，地塞米松磷酸钠， 2 mg/kg体重， im， 0.1 ml注射液 /10g体重；第四组： Rd低剂量组， 25 mg Rd/kg体重， im， O. l ml Rd注射液 /10g体重；第五组： Rd中剂量组， 50 mg Rd/kg体重， im， 0.1 ml Rd注射液 /10g体重；第六组： Rd高剂量组， 100 mg Rd/kg体重， im， 0.1ml Rd注射液 /10g体重。

用 10 % Na₂S V/V)将小鼠腹部皮肤去毛约 3 cm²区域，次日在脱毛区域以 50 μΐ/ 只量涂抹 1 % DNCB致敏，隔日以同法再次涂抹进行强化。致敏后第四天各组肌肉注射相应药物，并于给药后 lh在小鼠左耳正反两面均匀涂抹 1%DNCB， 10 μΐ/只进行攻击。 24h后小鼠颈椎脱臼处死，沿耳廓基线剪下两耳，用 8mm钻孔器分别在两耳同一部位打下耳片，精确称重。以左右耳片重量之差作为肿胀度，同时取下小鼠胸腺及脾脏精确称重，分别以每 10g体重的脾重和胸腺重作为脾脏指数和胸腺指数。

2.2 不同时相多次给药对迟发型超敏反应的影响

昆明种小鼠 118只，体重 18〜22g，雌雄各半，按体重随机分成 10组，每组 11-12只，分组及给药情况如下：第一组：正常对照组；第二组：模型对照组， 55体积％丙二醇溶液， im， 0.1 ml/10g体重；第三组：阳性对照全程给药组，地塞米松磷酸钠， 2 mg /kg 体重， im， 0.1 ml注射液 /10g体重；第四组： Rd低剂量全程给药组， 25 mg Rd/kg体重， im， 0.1 ml Rd注射液 /10g体重；第五组： Rd中剂量全程给药组， 50mg Rd/kg体重， im， 0.1 ml Rd注射液 /10g体重；第六组： Rd高剂量全程给药组， lOOmg Rd/kg体重， im， 0.1 ml Rd注射液 /10g体重；第七组：阳性对照激发相给药组，地塞米松磷酸钠， 2 mg /kg体重， im， 0.1 ml注射液 /10g体重；第八组： Rd低剂量激发相给药组， 25 mg Rd/kg 体重， im， 0.1 ml Rd注射液 /10g体重；第九组： Rd中剂量激发相给药组， 50mg Rd/kg 体重， im， 0.1 ml Rd注射液 /10g体重；第十组： Rd高剂量激发相给药组， lOOmg Rd/kg 体重， im， 0. lml Rd注射液 /10g体重。

全程给药组 (第二〜六组；)实验方法如下：小鼠按体重随机分组后肌肉注射给予相应药物，每日一次，连续 7天，给药剂量和方法如上所示。第一次给药后当天用 10%Na₂S 将腹部皮肤去毛约 3cm²区域，次日在给药 1 h后以 1%DNCB 50 μΐ/鼠涂抹于小鼠脱毛区域以致敏，隔日同法再次涂抹进行强化。第 7天给药后 lh，用 l%DNCB 10 l/鼠在小鼠左耳正反两面均匀涂抹进行攻击， 24h后小鼠颈椎脱臼处死，沿耳廓基线剪下两耳，用 8 mm钻孔器分别在两耳相同部位打下耳片，精确称重。以左右耳片重量之差作为肿胀度，同时取下小鼠胸腺及脾脏精确称重，分别以每 10g体重的脾重和胸腺重作为脾脏指数和胸腺指数。其中，第一组不致敏只攻击。

激发相给药组 (第七〜十组)实验方法如下：用 10 %Na₂S将小鼠腹部皮肤去毛约 3 cm²区域，次日在脱毛区域以 50 μΐ/只量涂抹 1 %DNCB以致敏，隔日以同法再次涂抹进行强化。致敏后第四天在小鼠左耳正反两面均匀涂抹 1 %DNCB， 10 μΐ/只进行攻击，并于攻击后立即给药 1次，当日晚 9时再给药一次，次日中午 12时再给药一次后 lh将小鼠颈椎脱白处死，沿耳廓基线剪下两耳，用 8 mm钻孔器分别在两耳同一部位打下耳片，精确称重。以左右耳片重量之差作为肿胀度，同时取下小鼠胸腺及脾脏精确称重，分别以每 10g体重的脾重和胸腺重作为脾脏指数和胸腺指数。统计学处理，使用 Excel-2003进行统计，各组数据均为计量资料，以 ,ϊ±表示，组间差异的显著性用 t检验。

3. 结果

3.1 激发前单次给药对小鼠迟发型超敏反应的影响

模型对照组与正常对照组比较，耳肿胀度！^。.。^ 说明造模成功。阳性对照组与模型对照组比较，耳肿胀度及胸腺指数 P<0.05,脾脏指数1^<0.01，说明地塞米松在激发前单次给药有显著抑制迟发型超敏反应的作用；但 Rd低、中、高剂量组与模型对照组比较，耳肿胀度、脾脏指数、胸腺指数 1^均>0.05，说明 Rd在激发前单次给药对迟发型超敏反应没有影响，实验结果如表 4-1所示。

表 4-1 激发前单次给药对 DNCB致小鼠迟发型超敏反应的影响 ( ±s，n=14) 组别药物剂量 (mg/kg体重）耳肿胀度 (mg) 脾脏指数胸腺指数正常对照 - - 1.70±0.88 46.37±11.16 48.44±10.58 模型对照 55%丙二醇 - 3.09±1.60** 49.51±6.73 46.59±12.53 阳性对照地塞米松 2 1.85±0.68^A 38.65±8.54^{A A} 36.72±5.96^A

Rd低剂量 Rd 25 2.45±1.26 52.31±11.91 46.63±11.13

Rd中剂量 Rd 50 3.65±1.78 46.77±7.78 46.74±10.94

Rd高剂量 Rd 100 3.99±1.18 46.83±7.87 46.91±7.69 注：与正常对照组比较， P<0.01 ; 与模型对照组比较， ^AP<0.05, ^{A A}P<0.01

3.2 在不同时相多次给药对迟发型超敏反应的影响

模型对照组与正常对照组比较，耳肿胀度！^。.。^ 说明造模成功。阳性对照全程给药组与模型对照组比较，耳肿胀度、胸腺指数及脾脏指数 I^ <0.01，肿胀抑制率为 60.86 %，说明地塞米松经过包括诱导相和激发相在内的全程给药可显著抑制小鼠的迟发型超敏反应；与模型对照组比较， Rd低、高剂量组耳肿胀度 !^均<0.05， Rd中剂量组 P<0.01，除 Rd高剂量组胸腺指数 P <0.01外，其余各 Rd组胸腺指数及脾脏指数 P均 >0.05， Rd低、中、高剂量组肿胀抑制率分别为 39.96 %、 52.31 %、 42.98 %，说明在致敏前至激发后全程给药的情况下，各剂量人参皂苷 -Rd对 DNCB所致小鼠迟发型超敏反应均有显著抑制作用，且中剂量 Rd的抑制作用最为显著。

阳性对照激发相给药组与模型对照组比较，耳肿胀度、胸腺指数及脾脏指数 P均

<0.01，肿胀抑制率为 70.19 %，说明地塞米松在激发相 (效应相)多次给药也可显著抑制小鼠的迟发型超敏反应；与模型对照组比较，低剂量 Rd耳肿胀度 P>0.05(胸腺指数 P>0.05，脾脏指数 P<0.05)，中剂量 Rd耳肿胀度 P<0.05(胸腺指数 P>0.05，脾脏指数 P<0.01)，高剂量 Rd耳肿胀度？<0.01(胸腺指数？<0.01，脾脏指数？<0.05)， Rd低、中、高剂量组肿胀抑制率分别为 31.06 %、 47.69 %、 68.38 %，说明在抗原攻击后迟发型超敏反应的激发相 (效应相)多次给药的情况下，中、高剂量的 Rd对 DNCB所致小鼠迟发型超敏反应有明显抑制作用，且有量效关系，实验结果如表 4-2所示。

组别药物 _t 耳肿胀度 (mg) 脾脏指数胸腺指数

正常对照 1.53±0.96 45.60±9.44 53.21±12.98 模型对照 55%' 3.86±1.84* 49.98±22.04 41.18±8.65* 阳性对照全程

地塞米松 2 1.51±0.64^A 17.4±4.52^{A A} 19.03±6.51 ^Α 给药

Rd低剂量全程

Rd 25 2.32±1.48^Α 39.96 49.19±16.85 46.38±9.53 给药

Rd中剂量全程

Rd 50 1.84±0.75 ' 52.31 51.35±9.01 42.87±5.35 给药

Rd高剂量全程

Rd 100 2.20±1.16^Α 42.98 56.98±20.78 22.35±7.8 给药

阳性对照

地塞米松 2 1.15±0.89 70.19 22.45±5.54^{Α Α} 26.94±7.69 激发相给药

Rd低剂量

Rd 25 2.66±1.71 31.06 33.24±6.96^Α 43.29±10.6 激发相给药

Rd中剂量

Rd 50 2.02±1.28^Α 47.69 29.58±4.15 ' 43.14±6.38 激发相给药

Rd高剂量

Rd 100 1.22±0.37 68.38 30.30±6.55 ^Α 31.74±3.56 激发相给药

注：与正常对照组比较， *Ρ<0.05， **Ρ<0.01 ; 与模型对照组比较， ^ΑΡ<0.05, "Ρ<0.01 二、人参皂苷 -Rd对人 Τ淋巴细胞增殖的影响

1. 材料

人参皂苷 -Rd，由广东泰禾生物药业有限公司提供，批号： 980303。 Hank' s液，

NaCl 136 mM, KC1 5.36 mM, KH₂P0₄ 0.44 mM, Na₂HPO₄ 0.37 mM, 葡萄糖 5 mM， NaHC0₃ 4. 16 mM, pH7.2。 PBS缓冲液： NaCl 136 mM, Na₂HP0₄ 9.74 mM, KH₂P0₄ 1.47 mM, KC1 2.68 mM, pH 7.2。

2. 方法

2.1 成人外周血 T淋巴细胞分离

于实验当天无菌取血，肝素抗凝，加入等体积 Hank's液，用吸管吸取稀释血轻置于淋巴细胞分离液层面上，稀释血与淋巴细胞分离液体积比为 4: 3，室温离心 25分钟， 2000转 /分，用毛细吸管吸取白色淋巴细胞层，加入另一离心管中，以 4倍体积 Hank's 液稀释混匀，离心 10分钟， 1200转 /分，弃上清， PBS缓冲液洗两次。以 RPMI 1640培养液悬浮细胞 (细胞数 10⁷个 /ml)，细胞悬液在无菌尼龙毛柱 37 °C孵育 45min，收集洗脱液，以 RPMI 1640培养液悬浮细胞 (细胞数 4χ 10⁸个 /L)，流式细胞仪表荧光分析系统检测 T淋巴细胞数 > 95%。

2.2 T淋巴细胞增殖实验

以 ConA为剌激原， 1H-TdR掺入法测定 T淋巴细胞增殖。预实验结果表明 ConA适中剌激浓度为 5μ_§/ιη1，故本研究采用此浓度 (为反应终浓度，约产生 87 %的增殖效应）。将细胞悬液加于 96孔板内，每孔 Ι ΟΟ μΙ (细胞数为 2 χ 10⁵个 /孔)，分组情况如下：空白对照组： 200 μΐ RPMI 1640 ; 阴性对照组： 100 μΐ细胞悬液 +100 μΐ RPMI 1640 ; ConA对照组： 100 μΐ细胞悬液 +20 μΐ ConA+80 μΐ RPMI 1640； Rd实验组： 100 μΐ细胞悬液 +20 μΐ ConA+20 μΐ药物 +60 μΐ RPMI 1640。

每组设三个复孔，在 37 °C， 5 %C0₂孵箱中孵育 72小时，细胞培养结束后，台盼蓝染色活细胞计数显示活细胞数 98%。细胞收获前 16h加入 ³H-TdRC1.85 x l0⁴Bq/孔)，培养结束后用多头细胞收集仪收集培养物于 9999型玻璃纤维滤膜上， 10 %三氯醋酸固定， 95 %乙醇冲洗后， 60°C烘干，放入闪烁瓶中，加入闪烁液 (；成分： PP0 7g， POPOP 0.5g，二甲苯 1000ml)在液闪仪 (FJ2101型液体闪烁计数器,国营 262厂，仪器计数效率为 55.8%)上计数0 1^脉冲数/分），标准本底<5(^^1^ 药物对 T细胞增殖的抑制作用以抑制率表示：

抑制率 W 阳性对照组药物实验组） _v

^K °' 阳性对照组 -阴性对照组 (_C ） °

3. 结果

我们采用 ConA作为有丝分裂原，能使人 T淋巴细胞产生明显增殖，这一增殖反应需要 Ca²⁺内流参与。实验结果表明，人参皂苷 -Rd能明显抑制 ConA引起的人 T淋巴细胞增殖且呈浓度依赖性，与阳性对照组 cpm相比， Rd在 5 μΜ时 P >0.05(增殖抑制率为 12.4%), 在10 时!） <0.05(增殖抑制率为34.3%)，在 20、 40、 80 μΜ时 Ρ均 <0.01(增殖抑制率分别为 56.4%、 81.9%及 92.7%)。而另一个非电压依赖性 Ca²⁺通道阻滞剂 SK&F96365同样可以显著抑制人 T淋巴细胞增殖，且呈浓度依赖性，与阳性对照组 cpm 相比， SK&F96365在 1 μΜ时 P <0.05(增殖抑制率为 15.6%)，在 3、 10、 30 μΜ时 Ρ均 <0.01(；增殖抑制率分别为 37.4%、 53.1%及 78.6%)，结果见表 4-3。结果提示人参皂苷 -Rd 可明显抑制人 T淋巴细胞增殖。

表 4-3: SK&F96365及人参皂苷 -Rd对 ConA引起的 ³H-TdR

在人 T淋巴细胞惨入的作用 (i^，n=5)

组别药物浓度 (μΜ) η Cpm (脉冲数 /min) 增殖抑制率 /%

阴性对照 5 2368±448 - 阳性对照 5 21784±2145

SK&F

96365 1 5 18479±1911 * 15.6

3 5 37.4

组 14525±2144**

10 5 11475±2177** 53.1

30 5 6526±2215 ** 78.6

阴性对照 5 2679±742 - 阳性对照 5 22175±1974 -

5 5

Rd 19749± 2105 12.4

10 5 15479±3876* 34.3

组

20 5 11187± 2854** 56.4

40 5 6214±1857** 81.9

80 5 4105±684** 92.7

注：与阳性对照组比较， *P<0.05，

三、人参皂苷 -Rd对大鼠同种异体皮肤移植的影响

1. 实验材料 1.1 动物

受体 Wistar大鼠 82只， SPF级，，体重 193〜230g; 供体 SD大鼠 10只， SPF级，，体重 218〜263g。购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号： SCXK (沪） 2007— 0005。

1.2 药品

人参皂苷 -Rd: 由广东泰禾生物药业有限公司提供，批号： 050815，临用前用 55% 丙二醇溶解配制成相应浓度的溶液。环孢菌素 A注射液 (CsA)，瑞士诺华产品，批号： S0016A, 临用前用无菌生理盐水稀释成所需浓度。戊巴比妥钠：佛山市化工实验厂，批号： 860901，临用前用无菌生理盐水稀释，浓度为 0.4%。 80万单位青霉素钠：哈药集团制药总厂生产，批号： A 080502713。临用前用生理盐水稀释为 8万单位 /ml。

1.3 器材

常规手术器械，术前消毒灭菌：止血钳、弯剪、直剪、眼科剪、眼科镊、组织镊、持针器、缝针、缝合线、纱布、胶布、棉棒、培养皿。

2. 方法

2.1 动物分组及给药

受体 Wistar大鼠 82只，，体重 193〜230g，皮肤移植前按体重随机分为 6组，每组 13〜14只，分组及给药情况如下：第一组：正常对照组（自体移植组；)；第二组：模型对照组， 55体积％丙二醇， im， 0.2 ml/100 g体重；第三组：阳性对照组， CsA， 5 mg /kg体重， im， 0.2 ml注射液 /100 g体重；第四组： Rd低剂量组， 12.5 mg Rd/kg体重， im， 0.2 1^ 1 (1注射液/100 §体重；第五组： Rd中剂量组， 25 mg Rd/kg体重， im， 0.2 ml Rd注射液 /100 g体重；第六组： Rd高剂量组， 50 mg Rd/kg体重， im， 0.2 ml Rd注射液 /100 g体重。

各组于术前 3天开始给药 (阳性对照组于术前一天给药)，每日一次，至术后第 15 天，给药量及方法如上所示。

2.2 皮肤移植方法

自体移植组（自体皮片回植)：步骤如下： 1)麻醉： 0.4 %(W/V)戊巴比妥钠溶液， 1 ml/100 g体重腹腔注射。 2)自体皮片移植：自体移植组大鼠背部移植区剪毛，碘伏消毒 3次，酒精脱碘 2次后于脊柱旁右侧 1 cm处剪下一块大小约 1 cm X l cm的皮片，放入盛有无菌生理盐水的培养皿中修剪皮下组织至真皮，生理盐水冲洗干净后回植于创面，用眼科镊将皮片铺平使其紧贴于植床，无菌纱布吸去生理盐水及渗出血液。用缝皮针以无损伤 0号线进行四角缝合，将皮片固定于创面上。 3)包扎：伤口用碘伏消毒后，覆上涂有白凡士林的无菌纱布，胶带环绕加压包扎。设置自体移植组，以排除手术操作失败、术后皮片感染和移动等因素致皮片坏死的可能。术后大鼠分笼饲养，自由摄食、饮水。同时每鼠肌肉注射 8万单位 /ml的青霉素 0.4 ml抗感染，每日一次，连续 5天。异体皮肤移植采用背-背皮肤移植法，步骤如下： 1)麻醉： 0.4 %(W/V)戊巴比妥钠溶液， 1 ml/100 g体重腹腔注射； 2)供皮准备：供体 SD大鼠供皮区剪毛，碘伏消毒 3 次，酒精脱碘 2次后剪下大小约 1 cm X l cm的皮片，放入盛有无菌生理盐水的培养皿中修剪皮下组织至真皮，生理盐水冲洗干净后备用； 3)异体皮片移植：受体 Wistar大鼠背部移植区剪毛消毒后，于脊柱旁右侧 l cm处剪下一块与供皮大小相仿的皮片，将事先修剪好的供皮贴于受体植床上，用眼科镊将皮片铺平使其紧贴于植床，无菌纱布吸去生理盐水及渗出血液。用缝皮针以无损伤 0号线进行四角缝合，将皮片固定于植床上； 4)包扎：伤口用碘伏消毒后，覆上涂有白凡士林的无菌纱布，胶带环绕加压包扎。术后大鼠分笼饲养，自由摄食、饮水。同时每鼠肌肉注射 8万单位 /ml的青霉素 0.4 ml抗感染，每日一次，连续 5天。

术后第 7天开始每日对各组大鼠拆包观察皮片生长情况并拍照，如有皮片移位、堆积或脱落则认为手术失败 (手术失败率不能大于 10%)，不记入实验数据，其余记录皮片存活时间，统计结果用皮片平均存活时间 (mean survival time, MST)表示

移植皮片排斥时间 (存活时间)的确定：若植皮与宿主的背底部愈合，皮片柔软，色泽与周围皮肤一致，炎症和充血不明显则认为皮片存活未发生排斥反应；若皮片发黑、干硬结痂或脱落面积达到 50 %则认为皮片发生了排斥反应。

实验结果统计学处理，使用 Excel-2003进行统计，各组数据均为计量资料，以表示，组间差异的显著性用 t-检验。

3. 结果

模型对照组的皮片平均存活时间为（1 1.67±1.97)d， CsA的皮片平均存活时间为

(22.18±1.17)d , Rd低、中、高剂量组的皮片平均存活时间分别为 C14.17±2.69)d、 (15.60±0.52)d和（15.10±0.99)d。与模型对照组 MST相比， CsA组 P<0.01， Rd低剂量组 P<0.05， Rd中、高剂量组？均<0.01，说明各剂量 Rd均可抑制大鼠同种异体皮肤移植后的免疫排斥反应，延长皮片存活时间，但其免疫抑制作用强度弱于 CsA，结果见表 4-4 和图 1。

表 4-4 : 不同给药组大鼠移植皮片存活时间（ ±s， n=10~12) 组别剂量 (mg/kg体重） n 皮片平均存活时间 (d) 模型对照组 - 12 11.67±1.97

CsA组 5 11 22.18±1.17^{A A}

Rd低剂量组 12.5 12 14.17±2.69^A

Rd中剂量组 25 10 15.60±0.52^{A A}

Rd高剂量组 50 10 15.10±0.99^{A A}

注：与模型对照组比较， ^AP<0.05, ' "P<0.01。形态观察如图 1的手术后第 12天移植皮片照相所示：第一组：正常对照组植皮与植床愈合良好，皮片柔软，色泽与周围皮肤一致，呈粉红色；第二组：模型对照组的植皮发生排斥反应，皮片发黑、干硬、结痂；第三组：阳性对照组的植皮与植床愈合良好，皮片柔软，色泽与周围皮肤一致，呈粉红色，未发生排斥反应；第四组： Rd 低剂量组的植皮与植床愈合良好，皮片柔软，略有发红，有局部炎症，但未发生排斥反应；第五组： Rd中剂量组的植皮与植床愈合良好，皮片柔软，色泽与周围皮肤一致，呈粉红色，未发生排斥反应；第六组： Rd高剂量组的植皮与植床愈合良好，皮片柔软，色泽与周围皮肤一致，呈粉红色，未发生排斥反应。

4. 结论

人参皂苷 -Rd可抑制小鼠迟发型超敏反应、 ConA诱导的人 T淋巴细胞增殖及大鼠同种异体皮肤移植后的免疫排斥反应，说明其有免疫抑制作用，在临床上可能作为免疫抑制剂用于多种自身免疫性疾病，如风湿性及类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、重症肌无力、自身免疫性溶血性贫血、肾病综合征、溃疡性结肠炎等，还可用于临床上器官移植术后的免疫排斥反应，但本实验结果显示各剂量 Rd的免疫抑制作用均弱于 CsA, 提示其在临床上可作为移植排斥的辅助用药，合用后通过减少其它免疫抑制剂的用量来降低不良反应。另外，由于人参皂苷 -Rd有显著的抗炎和抗 IV型变态反应的作用，能抑制迟发型超敏反应的产生和发展，并能较迅速地改善皮肤炎性症状，提示其在临床上可能用于治疗有 IV型变态反应参予的皮肤炎性疾病。

而本发明的人参皂苷 -Rd溶液相对于现有技术中的人参皂苷 -Rd溶液具有更高的稳定性和溶解性，可含有更高浓度的人参皂苷 -Rd，因此更适于用于临床免疫抑制。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

权利要求

1. 一种人参皂苷 -Rd溶液，其特征在于，所述溶液是人参皂苷 -Rd在所含丙二醇为 50-100体积％的丙二醇水溶液中形成的溶液，所述人参皂苷 -Rd的含量为 l〜100mg/ml溶液，其中，丙二醇的体积百分比以丙二醇水溶液的总体积为基准计。

2. 如权利要求 1所述的溶液，其特征在于，所述溶液为真溶液。

3. 如权利要求 1所述的人参皂苷 -Rd溶液，其特征在于，所述溶液中人参皂苷 -Rd的含量为 5〜75mg/ml。

4. 如权利要求 1所述的人参皂苷 -Rd溶液，其特征在于，所述人参皂苷 -Rd溶液选自下组：大于 25mg/ml〜75 mg/ml的人参皂苷 -Rd在 60-80体积％，优选 75体积％的丙二醇水溶液中的溶液；大于 10mg/ml〜25 mg/ml的人参皂苷 -Rd在 55-75体积％，优选 60 体积％的丙二醇水溶液中的溶液；或 5〜10 mg/ml的人参皂苷 -Rd在 55-75体积％，优选 55体积％的丙二醇水溶液中的溶液。

5. 一种制备权利要求 1所述人参皂苷 -Rd溶液的方法，所述方法包括：

(a)用所含丙二醇 50体积％的丙二醇水溶液溶解人参皂苷 -Rd;

(b)任选地稀释步骤 (a)所得溶液，以获得人参皂苷 -Rd的含量为 l〜100mg/ml溶液的溶液。

6. 如权利要求 5所述的方法，其特征在于，所述方法包括：用 100体积％的丙二醇水溶液溶解人参皂苷 -Rd后，再对所得溶液进行稀释。

7. 一种药物组合物，其包含：权利要求 1-4中任一项所述的人参皂苷 -Rd溶液；和药学上可接受的载体。

8. 一种制备含有人参皂苷 -Rd的药物组合物的方法，所述方法包括：将权利要求 1-4 中任一项所述的人参皂苷 -Rd溶液与药学上可接受的载体混合。

9. 人参皂苷 -Rd或权利要求 1所述人参皂苷 -Rd溶液在制备用于抗炎、免疫抑制和 /或抗器官移植排斥的药物中的用途。

10. 如权利要求 9所述的用途，其特征在于，所述用于抗炎的药物用于治疗选自下组的炎性疾病：风湿性关节炎、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、风湿性心瓣膜炎、结核性脑膜炎、胸膜炎或心包炎；所述用于免疫抑制的药物用于治疗或辅助治疗选自下组的免疫相关疾病：自身免疫性疾病、器官移植术后的免疫排斥反应、或 IV型变态反应参予的皮肤炎性疾病。