WO2010076865A1 - 核酸の定量方法 - Google Patents

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WO2010076865A1
WO2010076865A1 PCT/JP2009/070491 JP2009070491W WO2010076865A1 WO 2010076865 A1 WO2010076865 A1 WO 2010076865A1 JP 2009070491 W JP2009070491 W JP 2009070491W WO 2010076865 A1 WO2010076865 A1 WO 2010076865A1
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nucleic acid
reduction
amplification
molecule
reaction
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PCT/JP2009/070491
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純 岡田
信弘 源間
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株式会社 東芝
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Definitions

  • the present invention relates to a method for quantifying the concentration of nucleic acid using an electrochemical technique.
  • Electrophoresis and absorbance measurement methods exist as old techniques used for nucleic acid quantification. However, none of these methods have low sensitivity and cannot be used for gene expression diagnosis that requires quantitative analysis of low-concentration nucleic acids. Furthermore, the electrophoresis method has low accuracy, the absorbance measurement method requires an absorptiometer, and cannot be quantified in real time during the amplification process.
  • Patent Document 1 PCR-merase chain reaction
  • Patent Document 2 a technique for quantifying nucleic acid using an electrochemical technique in which the concentration of pyrophosphate produced in the nucleic acid amplification process is measured using a pyrophosphate sensor
  • An object of the present invention is a nucleic acid quantification method capable of solving these problems, that is, a highly sensitive and highly accurate nucleic acid quantification method, which does not require expensive reagents or dedicated equipment,
  • the object is to provide a simple and inexpensive method for quantifying nucleic acids.
  • the present inventor has focused on a new chemical species and found that the amount of amplified nucleic acid in solution or the initial amount of nucleic acid before amplification can be calculated by measuring the reduction current of this chemical species.
  • the present invention includes a step of adding a sample nucleic acid to a nucleic acid amplification buffer containing a reducing agent molecule, a redox molecule, and a magnesium ion and performing an amplification reaction, and the amplification reaction of the sample nucleic acid proceeds in the buffer.
  • the reducing agent is produced under the condition that the concentration of the magnesium ion in the buffer is reduced by the formation of the magnesium ion and magnesium pyrophosphate by the pyrophosphate ion generated along with the amplification of the sample nucleic acid.
  • a step of measuring a reduction current generated by a reduction reaction between a molecule and the redox molecule, and calculating an amount of amplified nucleic acid in the buffer or calculating an amount of the sample nucleic acid added from the measured reduction current value A nucleic acid quantification method comprising the steps of:
  • the nucleic acid quantification method of the present invention is a quantification method using an electrochemical technique, in which a reduction reaction by a reducing agent molecule and a redox molecule normally present in an amplification reagent is measured. Can be realized.
  • the nucleic acid quantification method of the present invention does not require new special expensive reagents or dedicated equipment, simple and inexpensive quantification can be realized.
  • electrochemical detection instead of optical detection detection can be performed without being affected by blood or powder. That is, according to the nucleic acid quantification method of the present invention, nucleic acid can be quantified easily, inexpensively, with high sensitivity and high precision, and excellent gene expression analysis and the like are realized.
  • FIG. 1 is a graph showing a measurement result of a reduction current generated by a reduction reaction between a reducing agent molecule and a redox molecule.
  • FIG. 2 is a graph showing a measurement result of a reduction current generated by a reduction reaction between a reducing agent molecule and a redox molecule when magnesium ions are added.
  • FIG. 3 is a graph showing the measurement results of the reduction current generated by the reduction reaction in the first embodiment.
  • FIG. 4 is a table showing a series of chemical reaction formulas of the reduction reaction in the first embodiment.
  • FIG. 5 is a graph showing the correlation between the amount of nucleic acid and the reduction current value.
  • FIG. 6 is a graph showing the correlation between the amplification time and the reduction current value.
  • FIG. 1 is a graph showing a measurement result of a reduction current generated by a reduction reaction between a reducing agent molecule and a redox molecule.
  • FIG. 2 is a graph showing a measurement result of a reduction current generated
  • FIG. 7 is a graph showing the results of measuring the reduction current over time for three different types of nucleic acid template nucleic acids (S 1 (100 pg), S 2 (5 ng), and S 3 (10 ng), respectively).
  • FIG. 8 is a graph plotting the relationship between the rise time t of the current calculated in FIG. 7 and the amount of template nucleic acid.
  • FIG. 9 is a diagram schematically showing the first measuring device 20 used in the first embodiment.
  • FIG. 10 is a diagram schematically showing the second measuring device 50 used in the first embodiment.
  • FIG. 11 is a graph plotting peak current values measured every 10 minutes after the start of amplification in Example 2.
  • a nucleic acid amplification buffer is prepared.
  • the buffer is an amplification buffer, and contains a reducing agent molecule, a redox substance, and magnesium ions in addition to a polymerase, a primer, and an NTP substrate.
  • the former three substances are substances for amplifying the nucleic acid
  • the latter three substances are substances for stabilizing the nucleic acid during the amplification reaction.
  • arbitrary components are appropriately included in the buffer.
  • the amplification reaction in the first embodiment is not particularly limited as long as it is an amplification reaction using a polymerase and an NTP substrate.
  • the amplification reaction is selected from the group consisting of PCR, LAMP, ICAN and SMAP.
  • the buffer contains a polymerase that is compatible with the amplification reaction to be performed.
  • a thermostable polymerase is used, and when an amplification reaction is performed by the LAMP method, a strand displacement type polymerase is used.
  • the primer is appropriately designed according to the amplification reaction to be performed and the nucleic acid to be amplified.
  • the reducing agent molecule used in the first embodiment is not particularly limited, but is selected from the group consisting of, for example, dithiothreitol, ⁇ -mercaptoethanol, SO 2 , and H 2 S, preferably dithiothreitol or ⁇ -Mercaptoethanol.
  • These reducing agent molecules have a function of maintaining the activity of the polymerase during the amplification reaction, and are components usually contained in the nucleic acid amplification buffer.
  • the concentration of the reducing agent molecule varies depending on the type of molecule to be added. For example, in the case of dithiothreitol, it is preferably 1 pM to 100 mM, more preferably 5 pM to 10 mM.
  • the redox molecule used in the first embodiment needs to be a molecule that is reduced only in the presence of the reducing agent molecule. This is to ensure the specificity of the reaction.
  • the redox molecule used in the first embodiment needs to be a molecule having an unshared electron pair. This is because electrons can be exchanged with the reducing agent molecule and the reduction reaction proceeds.
  • the redox molecule used in the first embodiment is not particularly limited. For example, a molecule having an ammonium ion, a quinone group, an amide group, a carboxyl group, or a hydroxyl group, a metal complex, and a noncovalent molecule.
  • ammonium ions are used as the redox molecules, the ammonium ions are appropriately added in the form of a salt such as ammonium sulfate, ammonium nitrate, ammonium phosphate, or ammonium halide.
  • a salt such as ammonium sulfate, ammonium nitrate, ammonium phosphate, or ammonium halide.
  • These redox substances have a function of unwinding the double strand during the amplification reaction to improve the stability, and are components usually contained in the nucleic acid amplification buffer.
  • the concentration of the redox molecule varies depending on the type of molecule to be added. For example, in the case of ammonium ions, the concentration is preferably 10 pM to 1 M, more preferably 100 pM to 500 mM.
  • the magnesium ion used in the first embodiment is not particularly limited, but is appropriately added in the form of a salt such as magnesium sulfate, magnesium nitrate, magnesium phosphate, and magnesium halide.
  • Magnesium ions maintain the activity of the enzyme during the amplification reaction and increase the stability of the double strand during the amplification reaction, and are components usually contained in the nucleic acid amplification buffer.
  • the concentration of magnesium ions is preferably 10 pM to 1 M, more preferably 100 pM to 500 mM.
  • sample nucleic acid is added to the prepared amplification buffer to carry out an amplification reaction.
  • the sample nucleic acid is desirably prepared in advance in a form suitable for the amplification reaction.
  • the sample nucleic acid to be examined in the first embodiment is not particularly limited.
  • Performing an amplification reaction means heating the amplification buffer to a predetermined temperature after addition of the sample nucleic acid.
  • the heating control conditions vary depending on the selected amplification reaction, and heating control suitable for each amplification reaction is performed. For example, when an amplification reaction is performed using the PCR method, a heat denaturation temperature (about 98 ° C.) and a chain extension reaction temperature (about 65 ° C.) are alternately repeated, and when an amplification reaction is performed using the LAMP method, about 63 ° C. To keep the temperature constant.
  • pyrophosphate generated as a result of amplification of the sample nucleic acid combines with magnesium ions in the reaction solution to form magnesium pyrophosphate, It is carried out under conditions where the concentration of the magnesium ions in the solution decreases.
  • the above conditions are realized when the amplification reaction uses a polymerase and an NTP substrate, and magnesium ions are contained in the amplification buffer.
  • FIG. FIG. 1 is a graph showing a measurement result of a reduction current generated by a reduction reaction between a reducing agent molecule and a redox molecule.
  • the horizontal axis represents the swept potential amount, and the vertical axis represents the measurement value of the reduction current.
  • the reduction current is measured by adding a buffer A containing a reducing agent molecule and a redox molecule to a container equipped with a gold electrode containing an electrolyte solution (Tris-HCl), and measuring the cyclic voltammetry of the gold electrode. Done.
  • dithiothreitol (DTT) was used as the reducing agent molecule
  • ammonium ion ammonium sulfate
  • the measurement result obtained in FIG. 1 is a result obtained by once sweeping the potential to 1.2 V (above the branched current value in the figure) and then sweeping the potential in the negative direction.
  • the direction in which ammonium ions are reduced to the equilibrium state of the reduction reaction by sweeping the potential in the direction to oxidize the ammonium ion, which is a redox molecule, by sufficiently oxidizing the ammonium ion and then sweeping the potential in the direction to reduce it.
  • a larger reduction current can be obtained. From the graph of FIG. 1, it can be seen that a current of 5.6 ⁇ A is obtained as the peak value P when the potential is swept to around ⁇ 1.3V.
  • FIG. FIG. 2 is a graph showing a measurement result of a reduction current generated by a reduction reaction between a reducing agent molecule and a redox molecule when magnesium ions are added.
  • the bottom axis represents the amount of potential swept, and the vertical axis represents the measurement value of the reduction current.
  • the reduction current was measured by adding buffer B containing magnesium sulfate in addition to a reducing agent molecule and a redox molecule in a container equipped with a gold electrode containing an electrolyte solution (Tris-HCl), and cyclic voltammetry of the gold electrode. This is done by measuring The reducing agent molecules and redox molecules used, and the potential sweeping method were all the same as in the graph of FIG.
  • the peak value Q is 3.6 ⁇ A although the peak value of the current is obtained when the potential is swept to about ⁇ 1.3 V, and is obtained from the graph of FIG. It is remarkably low compared with the peak value P. From this measurement result, it is considered that magnesium sulfate contained in the buffer B was dissolved in the electrolyte solution, and the liberated Mg ions inhibited the reduction reaction. More specifically, Mg ions present as divalent ions in the electrolyte solution inhibit the ionization of ammonium molecules, and the number of free ammonium ions to be reduced in the reduction reaction is reduced. The reduction current generated by the reduction reaction is reduced.
  • FIG. FIG. 3 is a graph showing the measurement results of the reduction current generated by the reduction reaction in the first embodiment. Similar to FIGS. 1 and 2, the bottom axis represents the amount of potential swept, and the vertical axis represents the measured value of the reduction current.
  • the reduction current is measured by adding a sample nucleic acid in a nucleic acid amplification buffer containing a reducing agent molecule, a redox molecule, and magnesium sulfate in a container equipped with a gold electrode containing an electrolyte solution (Tris-HCl). This is done by measuring the cyclic voltammetry.
  • Tris-HCl an electrolyte solution
  • the presence or absence of amplification of the sample nucleic acid is separately confirmed from the presence or absence of a band using electrophoresis.
  • a current of 3.6 ⁇ A is obtained as the peak value R when the potential is swept to around ⁇ 1.3 V (solid line).
  • the peak value S of the current when the potential is swept to around ⁇ 1.3 V is 3.1 ⁇ A (broken line).
  • FIG. FIG. 4 is a table showing a series of chemical reaction formulas of the reduction reaction in the first embodiment.
  • the NTP substrate is successively bound to the corresponding complementary strand by the polymerase.
  • the high-energy phosphate bond contained in the NTP substrate is used, but as the energy is consumed, pyrophosphate ions (P 2 O 7 H 2 2 ⁇ ) are generated as a by-product and released into the reaction solution. (Chemical reaction formula 1).
  • the pyrophosphate ions released into the reaction solution are combined with Mg ions to form magnesium pyrophosphate (P 2 O 7 H 2 Mg), so that the Mg ion concentration in the reaction solution decreases (chemical reaction formula 2) .
  • ammonium sulfate in the reaction solution is in a certain equilibrium state with free ammonium ions (chemical reaction formula 3).
  • the decrease in the Mg ion concentration in the reaction solution shifts the equilibrium state to the free ammonium ion side (right side of the chemical reaction formula 3), and the free ammonium ion concentration in the solution increases.
  • Ammonium ions are reduced by dithiothreitol (C 4 H 6 (OH) 2 (SH) 2 ), a reducing agent molecule in the reaction solution (chemical reaction formula 4), and the reduction current that flows at this time is detected by the electrode. Is done. Since a sufficient amount of dithiothreitol as a reducing agent molecule is present in the reaction solution, the flowing reduction current value increases as the ammonium ion concentration in the reaction solution increases.
  • the presence or absence of the nucleic acid amplification reaction can be determined based on the magnitude of the obtained reduction current.
  • the equilibrium state of the reduction reaction is obtained by sweeping the potential once in the direction in which the ammonium ion that is the redox molecule is oxidized to sufficiently oxidize the ammonium ion and then sweeping the potential in the direction in which the ammonium ion is reduced. Can be shifted to the maximum in the direction in which ammonium ions are reduced, and as a result, a larger reduction current can be obtained.
  • the potential sweep in the reduction direction is preferably ⁇ 2 to 0V.
  • FIG. FIG. 5 is a graph showing the correlation between the amount of nucleic acid and the reduction current value.
  • a reduction current value (peak current value) for each nucleic acid amount was measured using a nucleic acid sample with a known nucleic acid amount (confirmed in advance by electrophoresis), and a calibration curve was created based on the obtained peak current value.
  • a calibration curve is created by selecting a band with a target chain length or a representative band.
  • the “peak current value” is used synonymously with the reduction current value.
  • the “peak” of the peak current value means a reduction current that appears in a valley shape when the potential is swept in the reduction direction as shown in FIGS.
  • FIG. FIG. 6 is a graph showing the correlation between the amplification time and the reduction current value.
  • An amplification reaction is performed using a template nucleic acid (sample nucleic acid) whose nucleic acid amount is known. Amplification is performed using the PCR method or the LAMP method. When amplification is performed using the PCR method, the amplification time on the horizontal axis can be converted as the number of cycles. Template nucleic acids 1 to 4 (10 2 , 10 3 , 10 4 , and 10 5 copies, respectively) having four different nucleic acid amounts were prepared, the amplification reaction was performed, and the reduction current value was measured over time.
  • each of the template nucleic acids 1 to 4 exhibited “rise of reduction current” at different times.
  • “rise of the reduction current” means that the current value that was below the measurement effective threshold until time t rises greatly with time t as a boundary.
  • the “measurement effective threshold value” means the lowest peak current value at which a significant correlation is recognized between the measured reduction current value and the amount of amplified nucleic acid, and the nucleic acid is amplified below the measurement effective threshold value.
  • the reduction current hardly changes, and the amount of nucleic acid cannot be calculated from the reduction current value.
  • FIG. FIG. 7 is a graph showing the results of measuring the reduction current over time for three different types of nucleic acid template nucleic acids (S 1 (100 pg), S 2 (5 ng), and S 3 (10 ng), respectively).
  • the graph of FIG. 7 and FIG. 8 described below reinforces the result obtained in FIG.
  • the reduction current was measured every 5 minutes 20 minutes after the start of the amplification reaction.
  • the measurement effective threshold is 1.8 ⁇ A
  • the rise time t 1 of the current of S 1 (100 pg) is 45 minutes later
  • the rise time t 2 of S 2 (5 ng) is 40 minutes later
  • S 3 (10 ng rising time t 3 of) is after 30 minutes.
  • FIG. FIG. 8 is a graph plotting the relationship between the rise time t 1-3 of the current calculated in FIG. 7 and the amount of template nucleic acid. As is apparent from FIG. 8, it can be seen that as the amount of template nucleic acid increases, the rise time of the current becomes faster. From the results shown in FIGS. 7 and 8, the conclusion shown in FIG. 6, that is, by measuring the reduction current of the sample nucleic acid over time and specifying the time of rise of the current, the amount of the initial sample nucleic acid before amplification is determined. It has been demonstrated more clearly that it is possible to quantify.
  • the electrochemical measurement in the first embodiment can be performed using a potentiostat.
  • electrochemical measurement methods include pulse methods such as CV, LSV, and DPV, CC, CA, and impedance measurement.
  • pulse methods such as CV, LSV, and DPV, CC, CA, and impedance measurement.
  • electrochemical measurement is possible in these methods, there is no particular limitation on the arrangement of the measurement apparatus, the container for performing the measurement, and the electrode.
  • an example of the measuring apparatus used in the first embodiment will be shown. In fact, all measuring devices including these various modifications and improvements can be used in the method of the present invention.
  • FIG. FIG. 9 is a diagram schematically showing the first measuring device 20 used in the first embodiment.
  • the first measuring device 20 is characterized in that the amplification reaction of the sample nucleic acid and the measurement of the reduction current by the reduction reaction are performed in the same container (amplification reaction tube 10) equipped with electrodes. Since the amplification reaction and the reduction current can be measured in the same container, the apparatus configuration is simple, and simple detection can be realized.
  • the electrode 11 is embedded in the wall surface of the amplification reaction tube 10, and the reduction current of the solution in the tube can be measured.
  • the electrode is represented as a three-electrode type electrode 11.
  • each of the three-electrode type electrodes 11 comes into contact with each terminal 12 built in the amplification device 15, so that the current of the solution in the tube 10 can be measured. it can.
  • Each terminal 12 is connected to a reduction current measuring device via a lead wire 13.
  • the electrode 11 is preferably a three-electrode type, but may be a two-electrode type or a four-electrode type. Since the method according to the first embodiment measures a weak reduction current, the electrode material is not particularly limited, and any material having high conductivity, for example, gold, platinum, silver, copper, aluminum, nickel, iron, carbon Etc. can be used. In particular, gold electrodes can stably supply a large amount of highly reliable materials, and are suitable for clinical trials and medical use. Further, the sensitivity can be improved by applying molecular modification to the electrode surface.
  • molecular modification examples include, for example, mercaptan such as mercaptoethanol, mercaptohexanol, mercaptoheptanol, mercaptoethylene glycol, mercapto oligoethylene glycol, mercapto polyethylene glycol, alkanethiol having a carbon chain of 30 to 50, stearylamine, etc. Lipids, surfactants, albumin, nucleic acids and the like.
  • a nucleic acid amplification buffer is injected into the amplification reaction vessel 10 and a sample nucleic acid is added.
  • the container 10 is set in the amplification apparatus 20.
  • the solution in the container 10 is heated by the amplification device 20.
  • the heating operation is appropriately changed according to the amplification method and reaction conditions. After starting the heating operation, the reduction current of the solution in the container 10 is measured.
  • FIG. FIG. 10 is a diagram schematically showing the second measuring device 50 used in the first embodiment.
  • the second measuring device 50 simultaneously performs amplification reactions of the plurality of sample nucleic acids on a microtiter plate, and the plurality of samples are measured by a measurement substrate having a plurality of measurement electrodes corresponding to each well of the microtiter plate. It is characterized by simultaneously measuring the reduction current of the nucleic acid. Since the second measuring apparatus 50 can detect a plurality of specimens simultaneously by using a microtiter plate type amplification reaction container and a corresponding measurement substrate, it is extremely useful in clinical trials and medical sites.
  • FIG. 10 schematically shows a cross section of an arbitrary lane of the microtiter plate 30.
  • a sample nucleic acid and a nucleic acid amplification buffer are injected into each well 35 of the microtiter plate 30, and a test is started.
  • the reduction current of the solution in each well 35 is measured.
  • the reduction current is measured using a measurement substrate 40 provided with measurement electrodes 45 corresponding to the respective wells 35 of the microtiter plate 30.
  • the measurement electrode 45 provided on the measurement substrate 40 is immersed in the solution in each well 35 of the microtiter plate 30.
  • the measurement electrode 45 may be fixed in the vicinity of the tip of the small-diameter electrode support 46 so as to be surely immersed in the solution in each well 35.
  • the measurement electrode 45 is shown as a three-electrode type, but as described above, the measurement electrode 45 is not limited to this.
  • the measurement substrate 40 is connected to a reduction current measuring device and can simultaneously measure the reduction currents of the solutions in the wells 35. As a result, the presence or absence of amplification of a plurality of sample nucleic acids can be simultaneously determined.
  • nucleic acid quantification As is apparent from FIG. 5, there is a significant correlation between the amount of nucleic acid and the reduction current value, and the amplified nucleic acid can be quantified from the reduction current value. . Therefore, a calibration curve is prepared in advance, and nucleic acid is quantified by comparing with the calibration curve. More specifically, a plurality of different standard sample nucleic acids whose nucleic acid amounts are known in advance are prepared. Then, a reduction current is measured using the standard sample nucleic acid, and a calibration curve is created by plotting the peak current value obtained for each nucleic acid amount.
  • the “standard sample nucleic acid” means a sample nucleic acid whose nucleic acid amount is known, and is used exclusively for preparing a calibration curve. Then, by comparing with the prepared calibration curve, the amount of nucleic acid indicated by the value of the reduction current measured in the sample nucleic acid to be detected is calculated.
  • the standard sample nucleic acid has the same or similar base sequence as the sample nucleic acid to be detected.
  • a highly accurate quantitative result can be obtained by creating a calibration curve using a standard sample nucleic acid having the same or similar base sequence.
  • the amplification reaction conditions of the sample nucleic acid to be detected are the same as or approximate to those at the time of preparing the calibration curve.
  • Amplification methods and various amplification reaction conditions, such as primer sequences, added reagents and amounts added, temperature conditions, amplification time, etc., are made the same or approximate as when creating a calibration curve, enabling even more accurate quantification Is done.
  • the calibration curve is preferably prepared in advance with the nucleic acid for quantification in the form as shown in FIG. 5, but if an approximate amount of nucleic acid is to be calculated, the current value is calculated regardless of the nucleic acid sequence.
  • a calculation formula for obtaining the amount of nucleic acid can also be set.
  • the sample nucleic acid is added to the nucleic acid amplification buffer, and the amplification reaction is performed based on the method described above. After completion of the amplification reaction, electrochemical measurement is performed, and the reduction current of the nucleic acid amplification buffer containing the amplification product is measured. By comparing the measured peak current value with the calibration curve prepared in advance, the nucleic acid amount of the amplification product can be calculated.
  • the reduction current is measured at least twice or more at intervals of time, or the reduction current is measured at least twice or more in units of amplification cycles. For example, when a sample nucleic acid is amplified using an isothermal amplification method such as the LAMP method, every 20 minutes to 10 seconds from the start of the amplification reaction to the end of the amplification reaction, more specifically, every 20 minutes.
  • the reduction current is continuously measured every second, every 15 seconds, or every 10 seconds.
  • every 10 to 1 cycle more specifically, every 10 cycles, every 9 cycles
  • the reduction current is continuously measured every 8 cycles, 7 cycles, 6 cycles, 5 cycles, 4 cycles, 3 cycles, 2 cycles, or 1 cycle.
  • the measurement time interval is not necessarily constant, and the measurement may be performed at different time intervals as appropriate. For example, more accurate detection is realized by performing measurement at short time intervals in the vicinity of the time when the peak current rise is predicted. Further, the reduction current measurement may be stopped after the rise of the peak current value is specified.
  • the reduction current value in this state is referred to as “measurement effective threshold value or less”.
  • the amount of amplified nucleic acid exceeds a certain amount, a sudden increase in current value is observed (rise of reduction current (peak current value)).
  • a measurement effective threshold is set in advance, and the time during which the reduction current exceeding the threshold is measured is defined as “rise of peak current value”. For example, in FIG. 7, when the measurement effective threshold is “1.8 ⁇ A”, the time when the peak current value exceeds 1.8 ⁇ A for the first time in continuous measurement every 5 minutes is specified as “rising of the peak current value”.
  • the reduction current value is continuously measured every 5 minutes.
  • the template nucleic acid S 3 (10 ng) with the largest amount of nucleic acid has a current value that exceeds the effective threshold for the first time in the measurement 30 minutes after the start of amplification, so the peak current value rises in the template nucleic acid S 3 (10 ng). Can be “after 30 minutes”.
  • the rise of the peak current values of the template nucleic acids S 2 (5 ng) and S 1 (100 pg) can be “after 40 minutes” and “after 45 minutes”, respectively.
  • the “rise time of the peak current value” has a correlation with the amount of nucleic acid of the initial sample nucleic acid added to the nucleic acid amplification buffer before the amplification reaction, and therefore, after the start of the amplification reaction, Measure the reduction current with, and measure the time when the current value exceeding the measurement effective threshold is measured as the ⁇ rise time of peak current value '', and compare this rise time of the peak current value with a calibration curve prepared in advance. It is possible to calculate the initial nucleic acid amount before amplification of the target sample nucleic acid.
  • the initial calculation of the amount of nucleic acid is an indirect estimated amount using the reduction current value, but there is a significant correlation between the amount of nucleic acid and the rise time of the current. Calculation is possible. In addition, if the current measurement interval is shortened, the accuracy becomes higher.
  • the calibration curve prepared in advance can be prepared using a plurality of “standard sample nucleic acids” having different nucleic acid amounts, as in the case of quantifying the amplification product after the amplification reaction of the sample nucleic acid.
  • the reduction current in the nucleic acid amplification buffer to which one standard sample nucleic acid is added is continuously measured from the start of the amplification reaction, and the “rise time (or number of cycles) of peak current value” is specified.
  • the “peak current rise time (or cycle number)” is specified for each of the other standard sample nucleic acids having different nucleic acid amounts, as described above.
  • a calibration curve showing the relationship between “the amount of nucleic acid” and “the rise time (or the number of cycles) of the peak current value” is created.
  • a dilution series is prepared using a standard nucleic acid with a known concentration, and at the same time, a sample nucleic acid for quantitative purposes is amplified.
  • the sample nucleic acid can be quantified by comparing the reduction current value obtained with the sample nucleic acid for the purpose of quantification with the reduction current value obtained with the dilution series.
  • a dilution series is prepared at the same time and compared with this, so various amplification reaction conditions such as primer sequences, added reagents and their added amounts, temperature conditions, amplification time, etc. are aligned. It becomes easy to carry out at the same time, and as a result, extremely accurate quantification can be realized.
  • Example 1 Materials Used (1) Nucleic Acid Amplification Buffer For the nucleic acid amplification buffer, the following primer set for model gene A amplification, enzyme for LAMP amplification, and buffer were used. As a template, sample nucleic acid 1 having the sequence of model gene A and having an unknown nucleic acid amount was used.
  • Model gene A mouse 2C39 -Primer set for model gene A amplification TCAAAACGATCCTGGAAAATAATGGACATTCATTCTGAGCTGTGC GGAAAAACTAAATGAGAATGTCAAGGAGAAAAAACATTCTTGACTTC TTCAGGCTCACCTTGTGA CTGTGGCAATAAAGCACC AGCAGATGACATTGCATGGA
  • Electrode As an electrode for electrochemical measurement, a working electrode, a counter electrode, and a reference electrode were gold electrodes.
  • Electrochemical measurement was performed after amplification. Cyclic voltammetry was used as the measurement method. Sweep from 0V to 1.2V and then to -1.6V. The sweep speed is 0.3V / sec.
  • Example 2 Materials Used (1) Nucleic Acid Amplification Buffer For the nucleic acid amplification buffer, the following primer set for model gene B amplification, LAMP amplification enzyme, and buffer were used. A sample nucleic acid 2 having a model gene B sequence and an unknown nucleic acid amount was used as a template.
  • Model gene B mouse 481 ⁇ Primer set for model gene B amplification ATTTGGAACATACTGCTCTCTTCTGCTGCCATCTTCCTTTTGACA AACTCAGACCTCCTTGAAAAGAACACAAAATCCTCGATAACTCGG ATCTGGGAAGGATCAGCC TGTCTGAAGATAGCTATTCACA
  • Electrode As an electrode for electrochemical measurement, a working electrode, a counter electrode, and a reference electrode were gold electrodes.
  • Electrochemical measurement was performed every 10 minutes after the start of amplification. Cyclic voltammetry was used as the measurement method. Sweep from 0V to 1.2V and then to -1.6V. The sweep speed is 0.3V / sec.
  • FIG. 11 is a graph plotting peak current values measured every 10 minutes after the start of amplification.
  • the measurement effective threshold is 1.8 ⁇ A based on the results of FIGS. 7 and 8, the peak current value exceeding the threshold was measured 40 minutes after the start of amplification (that is, the current rise time in this example was “40 minutes later”). ").
  • the nucleic acid amount of the initial sample nucleic acid 2 before amplification was about 5000 pg (5 ng).
  • DESCRIPTION OF SYMBOLS 10 ... Container for amplification reaction, 11 ... Electrode, 12 ... Terminal, 13 ... Lead wire, 14 ... Cover, 15 ... Amplifying device, 20 ... 1st measuring device , 30 ... microtiter plate, 35 ... well, 40 ... measurement substrate, 45 ... measurement electrode, 46 ... electrode support, 50 ... second measurement device.

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Abstract

　本発明は、還元剤分子、酸化還元分子、およびマグネシウムイオンを含む核酸増幅用バッファ中に試料核酸を添加し、増幅反応を行う工程と、前記試料核酸の増幅反応が前記バッファ中において進行した場合、前記試料核酸の増幅に伴い生成されるピロリン酸イオンが、前記マグネシウムイオンとピロリン酸マグネシウムを形成することにより、前記マグネシウムイオンの前記バッファ中における濃度が低下する条件下において、前記還元剤分子と前記酸化還元分子による還元反応によって生じる還元電流を測定する工程と、前記測定された還元電流の値から、前記バッファ中の増幅核酸量、または前記添加した試料核酸量を算出する工程と、を含む、核酸の定量方法を提供する。

Description

核酸の定量方法
　本発明は、核酸の濃度を電気化学的手法を用いて定量する方法に関する。
　近年の分子生物学分野の発展に伴い、多くの疾患遺伝子が同定され、遺伝子診断による疾患の特定が可能となっている。また、遺伝子診断の結果に基づいて各患者に最適な治療を提供するテーラーメイド医療も実現化しつつある。また、感染症の診断にもウィルスの遺伝子を検出する手法が開発されている。さらに、医療分野以外にも食検査や個人認証など、遺伝子検査の必要性が高まっている。
　遺伝子検査では、感染症診断やSNPs診断のような「定性解析」については様々な簡便で精度の高い手法が確立しているが、遺伝子発現診断のような「定量解析」についてはまだ確立した手法が存在しないのが現状である。
　核酸の定量に用いられる古くからの手法として、電気泳動法と吸光度測定法が存在する。しかしながら、いずれの手法も感度が低く、低濃度の核酸の定量解析が必要な遺伝子発現診断には用いることができない。さらに、電気泳動法は精度が低い、吸光度測定法は吸光度計が必要、増幅工程中にリアルタイムに定量することができない、といった問題点がある。
　近年、核酸の定量解析における高感度な新たな手法が多く考案されている。代表的な手法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を継続的に監視しながら行うリアルタイムPCR法が存在する（特許文献１）。また、核酸増幅過程において生成されるピロリン酸の濃度をピロリン酸センサーを用いて測定する、電気化学的な手法を用いて核酸を定量する手法が報告されている（特許文献２）。
特許3589638号 特開2007-295811
　しかしながら、特許文献１に記載された方法では、蛍光色素を用いた解析になるため試薬が高価であること、加熱処理を行いながら１分毎に蛍光強度を測定することが必要であるため、サーマルサイクラーと光学系を組合せた専用の高価な装置が必要であることなどの問題がある。また、サンプルに血液や粉体などの不純物が混入する場合、光学的な検出に影響を与えるという問題がある。
　また、特許文献２に記載された方法では、電極表面にピロリン酸検知物質をコーティングする必要があること、感度向上のために電極表面積を大きくする必要があることなどから、センサー作製が煩雑になり、かつコストが増大するなどの問題がある。
　本発明の目的は、これらの課題を解決することができる核酸の定量方法、すなわち、高感度かつ高精度な核酸の定量方法であって、高価な試薬類や専用の機器類を必要としない、簡便かつ安価な核酸の定量方法を提供することにある。
　本発明者は、鋭意研究の結果、新たな化学種に着目し、この化学種の還元電流を測定することによって溶液中の増幅核酸量または増幅前の当初核酸量を算出できることを見出した。
　すなわち、本発明は、還元剤分子、酸化還元分子、およびマグネシウムイオンを含む核酸増幅用バッファ中に試料核酸を添加し、増幅反応を行う工程と、前記試料核酸の増幅反応が前記バッファ中において進行した場合、前記試料核酸の増幅に伴い生成されるピロリン酸イオンが、前記マグネシウムイオンとピロリン酸マグネシウムを形成することにより、前記マグネシウムイオンの前記バッファ中における濃度が低下する条件下において、前記還元剤分子と前記酸化還元分子による還元反応によって生じる還元電流を測定する工程と、前記測定された還元電流の値から、前記バッファ中の増幅核酸量を算出する、または前記添加した試料核酸量を算出する工程と、を含む、核酸の定量方法を提供する。
　本発明の核酸の定量方法は、電気化学的手法を用いた定量方法において、増幅試薬中に通常存在する還元剤分子と酸化還元分子による還元反応を測定するため、高感度かつ高精度な定量を実現することができる。また、本発明の核酸の定量方法は、新たに特別な高価な試薬類や専用の機器類を必要としないので、簡易かつ安価な定量を実現することができる。また、光学的な検出ではなく電気化学的な検出では、血液や粉体等の影響を受けずに検出することができる。すなわち、本発明の核酸の定量方法によって、簡便、安価で、高感度かつ高精度な核酸の定量が可能になり、優れた遺伝子発現解析などが実現される。
図１は、還元剤分子と酸化還元分子による還元反応によって生じる還元電流の測定結果を示すグラフである。 図２は、マグネシウムイオンを加えた場合の還元剤分子と酸化還元分子による還元反応によって生じる還元電流の測定結果を示すグラフである。 図３は、第１の実施態様における還元反応によって生じる還元電流の測定結果を示すグラフである。 図４は、第１の実施態様における還元反応の一連の化学反応式を示した表である。 図５は、核酸量と還元電流値との相関関係を示すグラフである。 図６は、増幅時間と還元電流値との相関関係を示すグラフである。 図７は、３つの異なる核酸量の鋳型核酸（それぞれS1(100pg)、S2(5ng)、S3(10ng)）について経時的に還元電流を測定した結果を示すグラフである。 図８は、図７で算出した電流の立ち上がり時間ｔと鋳型核酸量との関係をプロットしたグラフである。 図９は、第１の実施態様において使用する第１の測定装置２０を模式的に示した図である。 図１０は、第１の実施態様において使用する第２の測定装置５０を模式的に示した図である。 図１１は、実施例２において、増幅開始後10分毎に測定されたピーク電流値をプロットしたグラフである。
　以下、本発明の実施態様について説明する。なお、以下に示す実施態様は、本発明の構成を詳細に説明するために例示的に示したものに過ぎない。従って、本発明は、以下の実施態様に記載された説明に基づいて限定解釈されるべきではない。本発明の範囲には、特許請求の範囲に記載された発明の範囲内にある限り、以下の実施態様の種々の変形、改良形態を含む全ての実施態様が含まれる。
　＜第１の実施態様＞
　（１）核酸増幅用バッファの調製
　先ず、核酸増幅用バッファを調製する。前記バッファは増幅用バッファであり、前記バッファ中にポリメラーゼ、プライマーおよびＮＴＰ基質の他、還元剤分子、酸化還元物質、およびマグネシウムイオンが含まれる。前三物質は核酸を増幅するための物質であり、後三物質は増幅反応中の核酸を安定化させるための物質である。その他、任意の成分が前記バッファ中に適宜含まれる。
　第１の実施態様における増幅反応は、ポリメラーゼおよびＮＴＰ基質を用いた増幅反応であれば特に限定されることなく、例えば、ＰＣＲ、ＬＡＭＰ、ＩＣＡＮおよびＳＭＡＰ法からなる群から選択される。したがって、前記バッファ中には、実行する増幅反応に適合したポリメラーゼが含まれる。例えば、ＰＣＲ法により増幅反応を行う場合は、耐熱性ポリメラーゼを使用し、ＬＡＭＰ法により増幅反応を行う場合は、鎖置換型ポリメラーゼを使用する。また、プライマーは、実行する増幅反応および増幅対象となる核酸に応じて適宜設計される。
　第１の実施態様において使用される還元剤分子は、特に限定されないが、例えばジチオスレイトール、β-メルカプトエタノール、SO2、およびH2Sからなる群から選択され、好ましくはジチオスレイトールまたはβ-メルカプトエタノールである。これらの還元剤分子には、増幅反応中のポリメラーゼの活性を維持する働きがあり、核酸増幅用バッファ中に通常含まれる成分である。還元剤分子の濃度は、添加する分子の種類によって異なるが、例えば、ジチオスレイトールの場合、好ましくは1pM～100mM、さらに好ましくは5pM～10mMである。
　第１の実施態様において使用される酸化還元分子は、その性質として前記還元剤分子の存在下のみで還元される分子である必要がある。これは反応の特異性を確保するためである。また、第１の実施態様において使用される酸化還元分子は、非共有電子対をもつ分子である必要がある。これは前記還元剤分子との電子の授受を可能にし、還元反応を進行させるためである。より具体的には、第１の実施態様において使用される酸化還元分子は、特に限定されないが、例えばアンモニウムイオン、キノン基、アミド基、カルボキシル基またはヒドロキシル基をもつ分子、金属錯体、および非共有電子対をもつ分子からなる群から選択され、好ましくはアンモニウムイオンである。酸化還元分子としてアンモニウムイオンを使用する場合、アンモニウムイオンは、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、ハロゲン化アンモニウムなどの塩の形態で適宜添加される。これらの酸化還元物質には、増幅反応中の二本鎖をほどいて安定性を高める働きがあり、核酸増幅用バッファ中に通常含まれる成分である。酸化還元分子の濃度は、添加する分子の種類によって異なるが、例えば、アンモニウムイオンの場合、好ましくは10pM～1M、さらに好ましくは100pM～500mMである。
　第１の実施態様において使用されるマグネシウムイオンは、特に限定されないが、例えば硫酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、リン酸マグネシウム、ハロゲン化マグネシウムなどの塩の形態で適宜添加される。マグネシウムイオンは、増幅反応中の酵素の活性を維持し、かつ増幅反応中の二本鎖の安定性を高める働きがあり、核酸増幅バッファ中に通常含まれる成分である。マグネシウムイオンの濃度は、好ましくは10pM～1M、さらに好ましくは100pM～500mMである。
　（２）試料核酸の増幅
　次に、調製した増幅用バッファ中に試料核酸を添加し、増幅反応を行う。試料核酸は増幅反応に適合した形態に予め調製されていることが望ましい。
　第１の実施態様において検査対象となる試料核酸は、特に限定されないが、例えば、血液、血清、白血球、尿、便、精液、唾液、組織、培養細胞、喀痰、食品、土壌、排水、廃水、空気などの試料から抽出したものが対象となる。
　「増幅反応を行う」とは、試料核酸の添加後に増幅用バッファを所定の温度に加熱することを意味する。加熱制御の条件は、選択された増幅反応によって異なり、各増幅反応に適合した加熱制御を行う。例えば、ＰＣＲ法を用いて増幅反応を行う場合、熱変性温度（約９８℃）と鎖伸長反応温度（約６５℃）を交互に繰り返し、ＬＡＭＰ法を用いて増幅反応を行う場合、約６３℃で温度を一定に維持する。
　第１の実施態様における増幅反応は、前記増幅反応が進行した場合、試料核酸の増幅に伴い生成されるピロリン酸が、反応溶液中のマグネシウムイオンと結合してピロリン酸マグネシウムを形成することにより、前記マグネシウムイオンの前記溶液中における濃度が低下する条件下において行われる。前記条件は、増幅反応がポリメラーゼおよびＮＴＰ基質を用いたものであり、かつ増幅バッファ中にマグネシウムイオンが含まれることによって実現される。
　（３）還元電流の測定
　（３－１）還元電流の測定原理
　続いて、前記還元剤分子と前記酸化還元分子による還元反応によって生じる還元電流を測定する。
　図１
　図１は、還元剤分子と酸化還元分子による還元反応によって生じる還元電流の測定結果を示すグラフである。横軸は掃引した電位量を表わし、縦軸は還元電流の測定値を表わす。還元電流の測定は、電解質溶液（Tris-HCl）が入った金電極を備える容器内に還元剤分子と酸化還元分子とを含むバッファＡを添加し、金電極のサイクリックボルタンメトリーを測定することにより行われる。ここで、還元剤分子としてはジチオスレイトール（ＤＴＴ）を使用し、酸化還元分子としてはアンモニウムイオン（硫酸アンモニウム）を使用した。図１で得られた測定結果は、電位をいったん１．２Ｖまで掃引した後（図中の分岐した電流値の上側）、電位をマイナス方向に掃引して得た結果である。酸化還元分子であるアンモニウムイオンが酸化する方向に電位を掃引してアンモニウムイオンを十分に酸化させた後に還元する方向に電位を掃引することによって、還元反応の平衡状態をアンモニウムイオンが還元される方向に最大限にシフトさせることができ、その結果としてより大きな還元電流を得ることができる。図１のグラフをみると、電位を－１．３Ｖ付近まで掃引したときに５．６μＡの電流がピーク値Ｐとして得られているのが分かる。
　図２
　図２は、マグネシウムイオンを加えた場合の還元剤分子と酸化還元分子による還元反応によって生じる還元電流の測定結果を示すグラフである。図１のグラフと同様、底軸は掃引した電位量を表わし、縦軸は還元電流の測定値を表わす。還元電流の測定は、電解質溶液（Tris-HCl）が入った金電極を備える容器内に、還元剤分子および酸化還元分子に加えて硫酸マグネシウムを含むバッファＢを添加し、金電極のサイクリックボルタンメトリーを測定することにより行われる。使用した還元剤分子および酸化還元分子、ならびに電位の掃引方法はいずれも図１のグラフと同じ条件とした。図２のグラフをみると、同じく電位を－１．３Ｖ付近まで掃引したときに電流のピーク値が得られているものの、そのピーク値Ｑは３．６μＡであり、図１のグラフで得られたピーク値Ｐと比較して著しく低い。この測定結果は、バッファＢ中に含まれる硫酸マグネシウムが電解質溶液中で溶解し、遊離したＭｇイオンが前記還元反応を阻害したものと考えられる。より具体的には、電解質溶液中で２価のイオンとして存在するＭｇイオンが、アンモニウム分子のイオン化を阻害し、前記還元反応において還元対象である遊離アンモニウムイオンの分子数が減少し、その結果として前記還元反応によって生じる還元電流が小さくなる。
　図３
　図３は、第１の実施態様における還元反応によって生じる還元電流の測定結果を示すグラフである。図１および２と同様、底軸は掃引した電位量を表わし、縦軸は還元電流の測定値を表わす。還元電流の測定は、電解質溶液（Tris-HCl）が入った金電極を備える容器内に、還元剤分子、酸化還元分子、および硫酸マグネシウムを含む核酸増幅バッファ中に試料核酸を添加し、金電極のサイクリックボルタンメトリーを測定することにより行われる。使用した還元剤分子および酸化還元分子、ならびに電位の掃引方法はいずれも図１および２のグラフと同じ条件とした。なお、試料核酸の増幅の有無については、電気泳動法を用いて、バンドの有無から別途確認している。図３のグラフをみると、試料核酸の増幅反応が行われた場合、電位を－１．３Ｖ付近まで掃引したときに３．６μＡの電流がピーク値Ｒとして得られている（実線）。一方、試料核酸の増幅反応が行われていない場合、電位を－１．３Ｖ付近まで掃引したときの電流のピーク値Ｓは３．１μＡである（破線）。この測定結果は、試料核酸の増幅反応が進行することによって、前記還元反応において還元対象である遊離アンモニウムイオンの分子数が増加したことを意味する。これは、試料核酸の増幅反応の進行とともに生成されるピロリン酸イオンが溶液中のＭｇイオンを消費するためである。
　図４
　図４は、第１の実施態様における還元反応の一連の化学反応式を示した表である。
　核酸の増幅反応では、ポリメラーゼによってＮＴＰ基質が対応する相補鎖に次々と結合される。このとき、ＮＴＰ基質が内包する高エネルギーリン酸結合が利用されるが、エネルギーの消費とともに副生成物としてピロリン酸イオン（P2O7H2 2-）が生成され、反応溶液中に放出される（化学反応式１）。反応溶液中に放出されたピロリン酸イオンはＭｇイオンと結合してピロリン酸マグネシウム（P2O7H2Mg）を生成するため、反応溶液中のＭｇイオン濃度が低下する（化学反応式２）。一方、反応溶液中の硫酸アンモニウムは遊離アンモニウムイオンとの間で一定の平衡状態にある（化学反応式３）。反応溶液中のＭｇイオン濃度の低下は、前記平衡状態を遊離アンモニウムイオン側にシフトさせ（化学反応式３の右側）、溶液中の遊離アンモニウムイオン濃度が増加する。アンモニウムイオンは、反応溶液中の還元剤分子であるジチオスレイトール（C4H6(OH)2(SH)2）によって還元され（化学反応式４）、このとき流れた還元電流が電極によって検出される。還元剤分子であるジチオスレイトールは反応溶液中に十分量存在しているので、反応溶液中のアンモニウムイオン濃度が増加すればするほど、流れる還元電流値は大きくなる。
　すなわち、核酸増幅反応が起こる前は、反応溶液中に高濃度で存在するＭｇイオンがアンモニア分子のイオン化を阻害するため、得られる還元電流は小さいが、核酸増幅反応が進行すると、反応溶液中のＭｇイオン濃度が減少し、アンモニア分子のイオン化が促進されるため、得られる還元電流は大きくなる。したがって、得られた還元電流の大きさに基づいて、核酸増幅反応の有無を判定することができる。
　なお、上述したように、酸化還元分子であるアンモニウムイオンが酸化する方向に電位をいったん掃引してアンモニウムイオンを十分に酸化させた後に還元する方向に電位を掃引することによって、還元反応の平衡状態をアンモニウムイオンが還元される方向に最大限にシフトさせることができ、その結果としてより大きな還元電流を得ることができる。このとき、前記還元する方向への電位の掃印は、好ましくは－２～０Ｖである。
　図５
　図５は、核酸量と還元電流値との相関関係を示すグラフである。核酸量が既知（電気泳動により事前に確認）の核酸サンプルを用いて各核酸量に対する還元電流値（ピーク電流値）を測定し、得られたピーク電流値に基づいて検量線を作成した。LAMP増幅産物如く、複数種類の鎖長の増幅産物が得られる場合、検量線は目的鎖長のバンド、もしくは代表的なバンドを選んで作成する。グラフから明らかなように、核酸量と還元電流値との間には有意な相関関係が存在し、核酸量が増加するにしたがって還元電流値が増加しているのが分かる。図５の結果から、増幅した核酸を還元電流の値から定量することが可能となる。なお、本明細書中において「ピーク電流値」とは、還元電流値と同義的に使用される。ピーク電流値の「ピーク」とは、図１～図３に示したような、還元する方向に電位を掃引したときに谷状に表われる還元電流を意味している。
　図６
　図６は、増幅時間と還元電流値との相関関係を示すグラフである。核酸量が既知の鋳型核酸（試料核酸）を用いて増幅反応を行う。増幅はＰＣＲ法またはＬＡＭＰ法を用いて行う。ＰＣＲ法を用いて増幅を行う場合、横軸の増幅時間はサイクル数として換算することもできる。４つの異なる核酸量の鋳型核酸１～４（それぞれ10２、10３、10４、105コピー数）を用意し、それぞれ増幅反応を行い、経時的に還元電流値を測定した。その結果、増幅開始後、一定の時間が経過すると、各鋳型核酸１～４はそれぞれ異なる時間で「還元電流の立ち上がり」を示した。ここで、「還元電流の立ち上がり」とは、時間ｔまで測定有効閾値以下にあった電流値が時間ｔを境界として大きく立ち上がることをいう。ここで、「測定有効閾値」とは、測定される還元電流値と増幅核酸量との間に有意な相関関係が認められる最低ピーク電流値を意味し、測定有効閾値以下では、核酸が増幅しても還元電流はほとんど変化せず、還元電流値から核酸量を算出することはできない。一方、増幅反応が進行し、核酸量がある一定量を超えると、還元電流値と増幅核酸量との間に有意な相関関係が生じ、還元電流値は急激に上昇する（還元電流の立ち上がり）。
　各コピー数の鋳型核酸１～４の立ち上がりの時間ｔ（それぞれ10２（ｔ1）、10３（ｔ２）、10４（ｔ３）、105（ｔ４））をみると、鋳型核酸のコピー数が多くなればなるほど立ち上がりの時間ｔが早くなることが分かる。図６の結果から、試料核酸の還元電流を経時的に測定し、電流の立ち上がりの時間を特定することによって、増幅前の当初の試料核酸量を定量することが可能となる。
　図７
　図７は、３つの異なる核酸量の鋳型核酸（それぞれS1(100pg)、S2(5ng)、S3(10ng)）について経時的に還元電流を測定した結果を示すグラフである。図７および以下に説明する図８のグラフは、図６で得られた結果を補強するものである。還元電流の測定は、増幅反応開始20分後、5分毎に行った。測定有効閾値を1.8μAとした場合、S1(100pg)の電流の立ち上がり時間ｔ１は45分後であり、S2(5ng)の立ち上がり時間ｔ２は40分後であり、S3(10ng) の立ち上がり時間ｔ３は30分後である。
　図８
　図８は、図７で算出した電流の立ち上がり時間ｔ１－３と鋳型核酸量との関係をプロットしたグラフである。図８から明らかなように、鋳型核酸量が多くなればなるほど、電流の立ち上がり時間が早くなることが分かる。図７および図８の結果から、図６において示された結論、すなわち、試料核酸の還元電流を経時的に測定し、電流の立ち上がりの時間を特定することによって、増幅前の当初の試料核酸量を定量することが可能となる、ということがより明確に実証された。
　（３－２）還元電流の測定装置
　第１の実施態様における電気化学的な測定は、ポテンシオスタットを用いて行うことができる。電気化学的な測定法には、例えば、ＣＶ、ＬＳＶ、ＤＰＶなどのパルス手法、ＣＣ、ＣＡ、インピーダンス測定などがある。これらの手法において電気化学的な測定が可能であれば、測定装置、測定を行う容器および電極の配置などに特に制限はない。以下、第１の実施態様において使用される測定装置の例を示す。実際には、これらの種々の変形、改良形態を含む全ての測定装置が、本発明の方法において使用可能である。
　図９
　図９は、第１の実施態様において使用する第１の測定装置２０を模式的に示した図である。第１の測定装置２０は、試料核酸の増幅反応と、還元反応による還元電流の測定とを、電極を具備する同一の容器（増幅反応用チューブ１０）内において行うことを特徴とする。増幅反応と還元電流の測定とを同一容器内で行うことができるので、装置構成が単純であり、簡易な検出を実現することができる。
　増幅反応用チューブ１０には、その壁面に電極１１が埋め込まれており、チューブ内の溶液の還元電流を測定することができる。図９では電極を３電極式の電極１１として表わした。増幅反応用チューブ１０が増幅装置１５にセッティングされたとき、３電極式の各電極１１が増幅装置１５に内蔵された各端子１２と接触するので、チューブ１０内の溶液の電流を測定することができる。各端子１２はそれぞれリード線１３を介して還元電流の測定装置に接続されている。
　なお、電極１１は３電極式が好ましいが、２電極式、４電極式でもよい。第１の実施態様に係る方法は微弱な還元電流を測定するため、電極材質に特に制限はなく、導電性の高い任意の材質、例えば金、白金、銀、銅、アルミ、ニッケル、鉄、カーボンなどを使用することができる。特に、金電極は安定的に信頼性の高いものを大量に供給することができ、臨床試験および医療現場における使用に適している。また、電極表面に分子修飾を施すことによってより感度を向上させることができる。前記分子修飾の具体例としては、例えば、メルカプトエタノール、メルカプトヘキサノール、メルカプトヘプタノール、メルカプトエチレングリコール、メルカプトオリゴエチレングリコール、メルカプトポリエチレングリコール、炭素鎖が30～50のアルカンチオールなどのメルカプタン、ステアリルアミンなどの脂質、界面活性剤、アルブミン、核酸などがある。
　測定の手順として、先ず、増幅反応用容器１０内に核酸増幅用バッファを注入し、試料核酸を添加する。核酸増幅用バッファおよび試料核酸の入った増幅反応用容器１０の蓋１４を閉じて密閉した後、容器１０を増幅装置２０にセッティングする。続いて、増幅装置２０によって容器１０内の溶液の加熱操作を行う。加熱操作は増幅方法および反応条件等に応じて適宜変更する。加熱操作開始後、容器１０内の溶液の還元電流を測定する。
　図１０
　図１０は、第１の実施態様において使用する第２の測定装置５０を模式的に示した図である。第２の測定装置５０は、複数の前記試料核酸の増幅反応を、マイクロタイタープレートにおいて同時に行い、前記マイクロタイタープレートの各ウェルに対応した複数の測定用電極を備えた測定基板によって前記複数の試料核酸の還元電流を同時に測定することを特徴とする。第２の測定装置５０は、マイクロタイタープレート型の増幅反応容器およびこれに対応する測定基板を用いることによって複数の検体を同時に検出できるので、臨床試験および医療現場において極めて有用である。
　図１０は、マイクロタイタープレート３０の任意の１レーンの断面を模式的に示している。マイクロタイタープレート３０の各ウェル３５に試料核酸および核酸増幅用バッファを注入し、検査を開始する。増幅反応開始後、各ウェル３５内の溶液の還元電流を測定する。還元電流の測定は、マイクロタイタープレート３０の各ウェル３５に対応した測定用電極４５を備えた測定基板４０を用いて行われる。測定基板４０をマイクロタイタープレート３０の上に載せることによって、測定基板４０に備えつけられた測定用電極４５が、マイクロタイタープレート３０の各ウェル３５内の溶液に浸漬される。測定用電極４５は、各ウェル３５内の溶液に確実に浸漬されるよう、細径の電極支持体４６の先端部付近に固定するとよい。図中では、測定用電極４５を３電極式のものとして表わしたが、上述したようにこれに限定されない。測定基板４０は、還元電流の測定装置に接続され、各ウェル３５内の溶液の還元電流を同時に測定することができ、その結果、複数の試料核酸の増幅の有無を同時に判定することができる。
　（４）核酸の定量
　図５から明らかなように、核酸量と還元電流値との間には有意な相関関係が存在し、還元電流の値から、増幅した核酸を定量することが可能となる。したがって、予め検量線を作成しておき、この検量線と比較することにより核酸の定量を行う。より具体的には、あらかじめ核酸量が既知である異なる複数の標準試料核酸を用意する。そして、前記標準試料核酸を用いて還元電流を測定し、各核酸量に対して得られたピーク電流値をプロットすることによって検量線を作成する。ここで、「標準試料核酸」とは、核酸量が既知である試料核酸を意味し、もっぱら検量線作成のために使用する。そして、前記作成された検量線と比較することによって、検出対象である試料核酸において測定された還元電流の値が示す核酸量を算出する。
　標準試料核酸は、検出対象である試料核酸と同一または類似の塩基配列を有する。同一または類似の塩基配列を有する標準試料核酸を使用して検量線を作成することによって、高精度の定量結果を得ることができる。好ましくは、検出対象である試料核酸の増幅反応条件は、検量線作成時と同一または近似させる。増幅方法をはじめ、種々の増幅反応条件、例えば、プライマー配列、添加試薬およびその添加量、温度条件、増幅時間などを検量線作成時と同一または近似させることによって、よりいっそう高精度な定量が実現される。
　なお、検量線は、図５に示すような形で定量目的の核酸で予め作成しておくことが望ましいが、おおよその核酸量を算出する場合であれば、核酸の配列に関わらず電流値から核酸量を求める計算式を設定することもできる。
　試料核酸の増幅反応後に増幅産物の定量を行う場合、試料核酸を核酸増幅用バッファ中に添加し、上述した方法に基づいて増幅反応を行う。増幅反応終了後、電気化学測定を行い、増幅産物を含む核酸増幅用バッファの還元電流を測定する。測定されたピーク電流値を前記予め作成された検量線と比較することによって、増幅産物の核酸量を算出することができる。
　増幅反応を行う前の、核酸増幅用バッファ中に添加した当初の試料核酸の核酸量を算出する場合、還元電流を増幅反応の開始時点から連続的に測定し、ピーク電流値の立ち上がりを特定する。ここで、「連続的に測定」とは、少なくとも２回以上、時間間隔を空けて還元電流を測定すること、あるいは増幅サイクルを単位として少なくとも２回以上、還元電流を測定することを意味する。例えば、ＬＡＭＰ法などの等温増幅法を用いて試料核酸の増幅を行う場合、増幅反応の開始時点から増幅反応の終了時点まで、２０分毎～１０秒毎、より具体的には、２０分毎、１５分毎、１０分毎、９分毎、８分毎、７分毎、６分毎、５分毎、４分毎、３分毎、２分毎、１分毎、４５秒毎、３０秒毎、１５秒毎、または１０秒毎に還元電流を連続的に測定する。一方、ＰＣＲ法を用いて試料核酸の増幅を行う場合、増幅反応の開始時点から増幅反応の終了時点まで、１０サイクル毎～１サイクル毎、より具体的には、１０サイクル毎、９サイクル毎、８サイクル毎、７サイクル毎、６サイクル毎、５サイクル毎、４サイクル毎、３サイクル毎、２サイクル毎、または１サイクル毎に還元電流を連続的に測定する。
　なお、測定の時間間隔は必ずしも一定である必要はなく、適宜異なる時間間隔で測定を行ってもよい。例えば、ピーク電流の立ち上がりが予測される時間付近で短い時間間隔で測定を行うことによって、より精度の高い検出が実現される。また、ピーク電流値の立ち上がりの特定後に還元電流の測定を中止してもよい。
　図６から明らかなように、測定開始から一定時間ｔ１経過まで、還元電流値に有意な変化は認められない。これは、増幅反応が進行し、増幅核酸量がある一定量以上に達するまでは還元電流と核酸量との間に相関関係がないことを意味する。したがって、この状態にある還元電流値を「測定有効閾値以下」という。増幅核酸量がある一定量を超えた時点で、電流値の急激に上昇が観察される（還元電流（ピーク電流値）の立ち上がり）。測定有効閾値を予め設定しておき、この閾値を越える還元電流が測定された時間を「ピーク電流値の立ち上がり」とする。例えば、図７において、測定有効閾値を「1.8μA」とした場合、５分毎の連続的測定において、ピーク電流値が1.8μAを初めて超えた時間を「ピーク電流値の立ち上がり」と特定する。
　例えば、図７では５分毎に還元電流値が連続的に測定されている。最も核酸量が多い鋳型核酸S3(10ng)は、増幅開始30分後の測定において初めて測定有効閾値を越える電流値が測定されているので、鋳型核酸S3(10ng)におけるピーク電流値の立ち上がりは「30分後」とすることができる。同様に、鋳型核酸S2(5ng)およびS1(100pg)のピーク電流値の立ち上がりは、それぞれ「40分後」および「45分後」とすることができる。図８の説明部にあるように、鋳型核酸の量と「ピーク電流値の立ち上がり時間」との間には有意な相関関係がある。すなわち、「ピーク電流値の立ち上がり時間」は、増幅反応を行う前の、核酸増幅用バッファ中に添加した当初の試料核酸の核酸量と相関関係を有するので、増幅反応開始後、一定の時間間隔で還元電流を測定し、測定有効閾値を越える電流値が測定された時間を「ピーク電流値の立ち上がり時間」とし、このピーク電流値の立ち上がり時間を予め作成した検量線と比較することによって、検出対象である試料核酸の増幅前の当初の核酸量を算出することができる。当初核酸量の算出は、還元電流値を利用した間接的な推定量であるが、上記核酸量と電流の立ち上がり時間との間には有意な相関関係が存在するので、精度の高い核酸量の算出が可能となる。また、電流の測定間隔を短くすれば、その精度はいっそう高くなる。
　予め作成される検量線は、試料核酸の増幅反応後に増幅産物の定量を行う場合と同様、核酸量が既知である異なる複数の「標準試料核酸」を使用して作成することができる。先ず、１つの標準試料核酸を添加した核酸増幅用バッファ中の還元電流を増幅反応開始時点から連続的に測定し、「ピーク電流値の立ち上がり時間（またはサイクル数）」を特定する。続いて、その他の複数の異なる核酸量の標準試料核酸について、上記と同様、それぞれ「ピーク電流値の立ち上がり時間（またはサイクル数）」を特定する。最後に、これらの値をグラフ上にプロットすることによって、「核酸量」と「ピーク電流値の立ち上がり時間（またはサイクル数）」との関係が示された検量線が作成される。
　なお、電流値が時間経過に伴って増加する速度をパラメータに加えることにより、さらに正確な定量が実現される。
　また、検量線を用いないで検出することもできる。検量線を用いない場合、濃度既知の標準核酸を用いて希釈系列を作製し、同時に定量目的の試料核酸の増幅を行う。定量目的の試料核酸で得られた還元電流値を、前記希釈系列で得られた還元電流値と比較することによって、試料核酸の定量を行うことができる。予め検量線を作成するのではなく、希釈系列を同時に作製し、これと比較するので、種々の増幅反応条件、例えば、プライマー配列、添加試薬およびその添加量、温度条件、増幅時間などを揃えて同時に行うことが容易になり、その結果、極めて高精度な定量が実現可能となる。
　その他、リアルタイムＰＣＲ法で報告されている種々の鋳型核酸量の算出方法を用いることができる
　実施例１
　１．使用材料等
　（１）核酸増幅用バッファ
　核酸増幅用バッファには、以下に示すモデル遺伝子A増幅用のプライマーセット、LAMP増幅用の酵素、バッファを用いた。鋳型にはモデル遺伝子Aの配列をもち、核酸量の不明なサンプル核酸１を用いた。
　・モデル遺伝子A：マウス2C39
　・モデル遺伝子A増幅用プライマーセット
　　　TCAAAACGATCCTGGAAAATAATGGACATTCATTCTGAGCTGTGC
　　　GGAAAAACTAAATGAGAATGTCAAGGAGAAAAAACATTCTTGACTTC
　　　TTCAGGCTCACCTTGTGA
　　　CTGTGGCAATAAAGCACC
　　　AGCAGATGACATTGCATGGA
　（２）電極
　電気化学測定用電極として、作用極、対極、参照極ともに金電極を用いた。
　２．実験手順
　先ず、増幅反応液の調製を行った。モデル遺伝子A増幅用のプライマーセットとLAMP増幅用の酵素、バッファを混合し、鋳型としてサンプル核酸１を添加した。
　次に、増幅温度63℃で60分間、ＬＡＭＰ法による増幅反応を行った。
　増幅後に電気化学測定を行った。測定法にはサイクリックボルタンメトリー法を用いた。0Vから1.2Vまで掃引し、その後-1.6Vまで掃引した。掃引速度は0.3V/secである。
　３．実験結果
　増幅後に得られた還元電流のピーク電流値は、1.72μＡであった。このピーク電流値を図５の検量線に照合させると、増幅産物の核酸量は約44.3ｎｇと算出された。
　実施例２
　１．使用材料等
　（１）核酸増幅用バッファ
　核酸増幅用バッファには、以下に示すモデル遺伝子B増幅用のプライマーセット、LAMP増幅用の酵素、バッファを用いた。鋳型にはモデル遺伝子Bの配列をもち、核酸量の不明なサンプル核酸２を用いた。
　・モデル遺伝子B：マウス481
　・モデル遺伝子B増幅用プライマーセット
　　　ATTTGGAACATACTGCTCTCTTCTGCTGCCATCTTCCTTTTGACA
　　　AACTCAGACCTCCTTGAAAAGAACACAAAATCCTCGATAACTCGG
　　　ATCTGGGAAGGATCAGCC
　　　TGTCTGAAGATAGCTATTCACA
　（２）電極
　電気化学測定用電極として、作用極、対極、参照極ともに金電極を用いた。
　２．実験手順
　先ず、増幅反応液の調製を行った。モデル遺伝子B増幅用のプライマーセットとLAMP増幅用の酵素、バッファを混合し、鋳型としてサンプル核酸２を添加した。
　次に、増幅温度63℃で60分間、ＬＡＭＰ法による増幅反応を行った。
　増幅開始後から10分毎に、電気化学測定を行った。測定法にはサイクリックボルタンメトリー法を用いた。0Vから1.2Vまで掃引し、その後-1.6Vまで掃引した。掃引速度は0.3V/secである。
　３．実験結果
　図１１は、増幅開始後10分毎に測定されたピーク電流値をプロットしたグラフである。図７および図８の結果に基づいて測定有効閾値を1.8μAとすると、増幅開始40分後に閾値を上回るピーク電流値が測定された（すなわち、本実施例の電流の立ち上がり時間は「40分後」となる）。電流の立ち上がり時間「40分」を図８の検量線と照合させることによって、増幅前の当初のサンプル核酸２の核酸量が約5000pg（5ng）であることがわかった。
１０・・・増幅反応用容器、１１・・・電極、１２・・・端子、１３・・・リード線、１４・・・蓋、１５・・・増幅装置、２０・・・第１の測定装置、３０・・・マイクロタイタープレート、３５・・・ウェル、４０・・・測定基板、４５・・・測定電極、４６・・・電極支持体、５０・・・第２の測定装置。

Claims (13)

  1. 　還元剤分子、酸化還元分子、およびマグネシウムイオンを含む核酸増幅用バッファ中に試料核酸を添加し、増幅反応を行う工程と、
    　前記試料核酸の増幅反応が前記バッファ中において進行した場合、前記試料核酸の増幅に伴い生成されるピロリン酸イオンが、前記マグネシウムイオンとピロリン酸マグネシウムを形成することにより、前記マグネシウムイオンの前記バッファ中における濃度が低下する条件下において、前記還元剤分子と前記酸化還元分子による還元反応によって生じる還元電流を測定する工程と、
    　前記測定された還元電流の値から、前記バッファ中の増幅核酸量、または前記添加した試料核酸量のいずれかの検出核酸量を算出する工程と、
    を含む、核酸の定量方法。
  2. 　前記検出核酸量を算出する工程が、
    　核酸量が既知である異なる複数の標準試料核酸を用意する工程と、
    　前記標準試料核酸を用いて還元電流を測定し、各核酸量に対して得られたピーク電流値をプロットすることによって検量線を作成する工程と、
    　前記作成された検量線と比較することによって、検出対象である試料核酸において測定された還元電流の値が示す核酸量を算出する工程と、
    を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記還元電流を、前記増幅反応の終了時点において測定し、ピーク電流値を得ることによって前記バッファ中の増幅核酸量を算出することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  4. 　前記還元電流を、前記増幅反応の開始時点から連続的に測定し、ピーク電流値の立ち上がりを特定することによって、前記添加した試料核酸量を算出することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  5. 　前記還元電流を測定する工程が、前記還元剤分子と前記酸化還元分子による還元反応が誘導されるように、前記酸化還元分子が酸化する方向に電位を掃印後、還元する方向に電位を掃印する工程と、前記還元する方向に電位を掃引したときに発生する前記還元反応による還元電流を測定する工程と、を含む、請求項１に記載の方法。
  6. 　前記酸化還元分子が、前記還元剤分子の存在下のみで還元される分子であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  7. 　前記酸化還元分子が、非共有電子対をもつ分子であることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
  8. 　前記酸化還元分子が、アンモニウムイオンであることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
  9. 　前記還元剤分子が、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはβ-メルカプトエタノールであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  10. 　前記還元剤分子がジチオスレイトール（ＤＴＴ）であり、かつ前記酸化還元分子がアンモニウムイオンであることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
  11. 　前記試料核酸の増幅反応が、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法、およびＳＭＡＰ法からなる群から選択される増幅反応であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  12. 　前記還元反応の還元電位が、－２～０Ｖであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  13. 　前記試料核酸の増幅反応と、前記還元反応による還元電流の測定とを、電極を具備する同一容器内において行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
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