WO2010072219A1 - Clostridium sporosphaeroides zur behandlung von biomasse - Google Patents

Clostridium sporosphaeroides zur behandlung von biomasse Download PDF

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WO2010072219A1
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microorganism
biomass
culture
clostridium sporosphaeroides
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Monika Reuter
Daniel Vater
Vera Duchow
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Schmack Biogas Ag
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    • C12P5/00—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons
    • C12P5/02—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons acyclic
    • C12P5/023—Methane
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
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    • Y02E50/30—Fuel from waste, e.g. synthetic alcohol or diesel

Definitions

  • the invention relates to a method for the treatment of biomass using a microorganism of the species Clostridium sporosphaeroides.
  • Biofuels are mainly obtained by fermentation of plant substrates with the help of yeasts, bacteria or fungi.
  • the produced liquid energy carriers in particular bioethanol, can then be used as fuel in suitable combustion plants or as fuel or additive in motor vehicle engines or motors for power and heat generation.
  • the biomass is thus converted into a liquid and easily transportable energy source with a relatively high energy density, which can then be used universally.
  • Dry matter (oTS) are digested for subsequent recovery.
  • Ethanol or another biofuel is then produced from the liquid biomass substrate by fermentation.
  • the ethanolic fermentation takes place primarily by added yeasts, which convert glucose into ethanol.
  • yeasts which convert glucose into ethanol.
  • a relatively high proportion of sugar is already present (for example in the case of molasses) or higher molecular weight substrates such as starch, cellulose or hemicellulose (for example in the case of
  • Cereals, straw, whole plant use are enzymatically or chemically split, so that the alcoholic fermentation can take place.
  • hydrolytic substrate digestion which also corresponds to liquefaction, are primarily
  • Microorganisms especially bacteria responsible.
  • biogas plants methane is produced by a microbial decomposition process of organic substances.
  • the biogas is produced in a multi-stage process of fermentation or digestion by the activity of anaerobic or microaerophilic microorganisms, ie in the absence of air.
  • the organic material used as fermentation substrate has a high molecular structure from a chemical point of view, which is degraded in the individual process steps of a biogas plant by metabolic activity of microorganisms to low molecular weight building blocks.
  • the populations of microorganisms which are active in the fermentation of the organic fermentation substrate have hitherto been insufficiently characterized.
  • exoenzymes e.g., cellulases, amylases, proteases, lipases
  • exoenzymes e.g., cellulases, amylases, proteases, lipases
  • hydrolysis products eg mono-, disaccharides, di-, oligopeptides, amino acids, glycerol, long chain fatty acids
  • short chain fatty or carboxylic acids such as butter -, propionic and acetic acid
  • short-chain alcohols such as ethanol
  • the short-chain fatty acids and carboxylic acids formed in acidogenesis and the short-chain alcohols are taken up by acetogenic bacteria and excreted again as acetic acid after ⁇ -oxidation.
  • By-products of acetogenesis are CO 2 and molecular hydrogen (H 2 ).
  • the products of acetogenesis such as acetic acid but also other substrates such as methanol and formate are converted by methane-forming organisms in the obligate anaerobic methanogenesis to methane and CO 2 .
  • the resulting here CO 2 and also during the other process steps such as hydrolysis, CO 2 formed in turn can also be converted by microorganisms with the incurred H 2 to methane.
  • the volume loading of a fermenter is the amount of substrate fed to the fermenter, expressed in kilograms of dry organic matter per cubic meter of fermenter volume and per day.
  • the amount of biogas produced depends strongly on the volume load of the fermenter, with increasing space load an increasingly larger amount of biogas is generated.
  • a high volume load makes the process of biogas production so On the other hand, however, it leads to an increasing destabilization of the biological processes of fermentation.
  • Feeding volume in oTS per day increases biogas production.
  • high space loads of more than 6 kgoTS / m 3 d are not yet available.
  • Plant operation is to operate a plant economically. It stands the
  • Substrates for biogas production have dry matter contents in the range of 5% to 90%.
  • substrates with a dry matter content of up to about 35 to at most 40% can be used. Since substrates with a higher dry matter content, in particular a higher proportion of organic dry matter, usually provide a higher energy content, they would preferably be used. In this case, however, there are higher costs due to increased expenditure of energy during pumping and stirring as well as higher ancillary costs due to wear or repair of pumps, agitators or the like with high viscosity or a high dry matter content. If substrate dilution is necessary because of a high dry matter content, additional water and wastewater costs as well as technical equipment for water supply, recovery or wastewater treatment are incurred.
  • biofuel is understood as meaning a liquid or gaseous fuel or energy carrier which comprises Biomass is produced.
  • Biofuels are used for the operation of internal combustion engines for both mobile (eg motor vehicles) and stationary (eg generation of electrical and thermal energy in a combined heat and power plant) applications.
  • Examples of biofuels are biodiesel, bioethanol, biomethanol, biokerosene, biohydrogen or biogas.
  • bioethanol refers to ethanol which has been produced by alcoholic fermentation from biomass as renewable carbon carrier or biodegradable fractions of waste and serves in various concentrations as an additive to mineral oil fuels such as biodiesel or biofuel.
  • biogas is understood to mean the gaseous product of the anaerobic biodegradation of organic substrates, which generally contains about 45-70% of methane, 30-55% of carbon dioxide, and small amounts of nitrogen, hydrogen sulphide and other gases.
  • fermentation or “fermentation” in the context of the present invention include both anaerobic and aerobic metabolic processes which, under the action of microorganisms in a technical process from the supplied substrate to produce a product, e.g. Lead biogas.
  • a differentiation from the term “fermentation” is given in that it is exclusively anaerobic processes.
  • a “fermenter” is understood to mean the container in which the microbiological degradation of the substrate takes place with simultaneous formation of biogas.
  • the terms “reactor”, “fermenter” and “digester” are used interchangeably.
  • fertilization substrate or "substrate” in the context of the present invention means organic and biodegradable material which is added to the fermenter for fermentation.
  • Substrates can be renewable raw materials, farm fertilizers, substrates from the processing agricultural industry, municipal organic residues, slaughter residues or Be green waste.
  • substrates are corn silage, rye silage, sugar beet pulp, molasses, grass silage, cattle or pig manure, cattle, pig, chicken or horse dung, spent grains, apple, fruit or vine pomace, cereal, potato or fruit vat.
  • the terms "fermentation substrate” and “substrate” are used synonymously.
  • fertilization residue or "digestate” is understood to be the residue of biogas production which leaves the fermenter and is frequently stored in its own container.
  • volume load is understood to mean the amount of dry organic matter (oTS) in kg supplied to the fermenter per day and cubic meter (m 3 ) working volume.
  • organic dry substance (oTS) is understood to mean the anhydrous organic fraction of a substance mixture after removal of the inorganic constituents and drying at 105 ° C. As a rule, the dry matter content is stated in% of the substrate.
  • the term “residence time” is understood to mean the average residence time of the substrate in the fermenter.
  • specific biogas yield or “specific methane yield” is used to denote the amount of biogas or methane produced (stated in standard cubic meters of Nm 3 gas) divided by the amount (as a rule per tonne) of organic dry substance used or substrate understood.
  • nucleotide sequence encompasses both the DNA sequence and the corresponding RNA sequence,
  • RNA sequences given in the invention using bases A, U, C, G also refer to the corresponding DNA sequences using bases A, T, C, G and vice versa.
  • nucleotide sequence of a microorganism by means of a standardized process by which the individual nucleotides of the DNA or RNA of the microorganism can be detected with high accuracy.
  • individual positions can repeatedly be present in a sequence for which the determination of the nucleotide present at the respective position was not possible with sufficient accuracy.
  • the letter "N" is indicated in the nucleotide sequence in the context of the present invention. If the letter "N" is subsequently used in a nucleotide sequence, this stands as an abbreviation for every conceivable nucleotide, that is to say for A, U, G or C. in the case of a ribonucleic acid or for A, T, G or C in the case of a deoxyribonucleic acid.
  • nucleotide mutation means a change in the starting nucleotide sequence, whereby individual nucleotides or several, directly following one another or interrupted by unmodified nucleotides
  • insertion or “addition” as used herein means the addition of 1, 2 or more nucleotides to the respective starting sequence.
  • substitution means the replacement of a nucleotide present at a particular position by another.
  • microorganism is understood to mean microscopically small organisms, which as a rule are single-celled organisms but may also be multicellular organisms Examples of microorganisms are bacteria, microscopic algae, fungi or protozoa.
  • the term "genus” of microorganisms, "type” of microorganisms and “strain” of microorganisms is understood to mean the corresponding basic category of biological taxonomy, in particular the phylogenetic classification Among a particular genus, species or strain, not only are microorganisms having a particular RNA sequence but also, to a certain extent, their genetic variants, with genetic variance in the strain, species, genus increases.
  • culture refers to an accumulation of microorganisms under established conditions which ensure the growth or at least the survival of the microorganisms, for example enrichment cultures or pure cultures, liquid cultures as well as cultures on solid media such as nutrient media also permanent crops such as frozen glycerin cultures, immobilized cultures such as gel cultures or highly concentrated cultures such as cell pellets.
  • pure culture of a microorganism is understood to mean the progeny of a single cell, which is isolated by a multi-step process from a mixture of different microorganisms.
  • the multi-step process involves the separation of a single cell from a cell population and requires that also from the cell
  • pure cultures of microorganisms can be selectively recovered
  • serial dilution of the suspension in the nutrient solution it can finally be achieved that in the last dilution stage there is only one cell left then the basis for a pure culture.
  • mixed culture is understood to mean a mixture of different microorganisms, but natural populations of microorganisms are usually mixed cultures, but mixed cultures can also be produced artificially, for example by combining several pure cultures.
  • the object of the invention is to provide a method for the treatment of biomass, which allows a higher yield of usable biofuels than the prior art.
  • the present invention provides a method of treating biomass.
  • the biomass is added to a microorganism of the species Clostridium sporosphaeroides.
  • the method for treating biomass is preferably a method for liquefying biomass.
  • the use or the occurrence of microorganisms of the species Clostridium sporosphaeroides in the treatment of biomass or the production of biogas has not been known. Surprisingly, however, it has been shown that the viscosity of the substrate can be greatly reduced by the addition of microorganisms of the species Clostridium sporosphaeroides to a biomass substrate.
  • the use of microorganisms of the species Clostridium sporosphaeroides leads to a significant increase in the liquefaction of the biomass and, as a result, to a significant improvement in the efficiency and efficiency of plants for the production of biofuels.
  • the method for the treatment of biomass is a method for producing biogas from biomass.
  • both the volume load of the fermenter can be increased and the amount of biogas formed is significantly increased.
  • the addition of a microorganism of the species Clostridium sporosphaeroides increases the volume of a fermenter up to more than 50%, without any instability of the fermentation process. Parallel to the increased space load, the amount of biogas produced is significantly increased.
  • the specific yield of biogas increases, since significantly more of the organic dry matter is degraded than in the absence of addition of microorganisms of the species Clostridium sporosphaeroides. Due to the increased degree of degradation can be a significantly increased specific gas yield at an improved Substrate utilization can be achieved.
  • the residence time of the fermentation substrate in the fermenter can be significantly reduced with constant gas yield, whereby the increase in the space load is possible. The use of microorganisms of the species Clostridium sporosphaeroides therefore leads to a dramatic improvement in the efficiency and efficiency of biogas plants.
  • Clostridium sporosphaeroides lies in a hydrolysis rate increased by their metabolic activity, so that as a result of the metabolic activity a part of the present hardly degradable organic substances (eg cellulose, hemicellulose) changes into soluble acids and CO 2 .
  • cellulose e.g cellulose, hemicellulose
  • Cellulose is insoluble in water and aqueous solutions, therefore degradation of the cellulose in the fermentation process leads to liquefaction.
  • the stirring and pumpability of the material is maintained because the dry matter content does not increase further. This allows a constant mixing of the material and the gas can be better removed from the process.
  • Clostridium sporosphaeroides therefore provides a process which ensures increased stability of the fermentation process and in which liquefaction of the fermentation substrate takes place.
  • the liquefaction of substrate by the decomposition of insoluble constituents can also be used for the production of biofuel from biomass.
  • a microorganism of the species Clostridium sporosphaeroides in the form of a culture of Microorganisms added, which consists predominantly of a microorganism of the species Clostridium sporosphaeroides.
  • microorganisms of the species Clostridium could sporosphaeroides only in small traces of less than 10 "4% share of the total number of present microorganisms are detected.
  • Clostridium sporosphaeroides can be carried out in the form of a culture suspension, in the form of dry, freeze-dried or moist cell pellets or also in the form of spore suspensions, spore preparations or dry, freeze-dried or moist spore pellets.
  • Microorganisms of the species Clostridium sartagoformum and Paenibacillus macerans have similar properties to the treatment of biomass as microorganisms of the species Clostridium sporosphaeroides and are therefore predestined for use in the treatment of biomass. Microorganisms of the species Clostridium sartagoformum and Paenibacillus macerans can therefore also be used in the methods and applications described herein for the treatment of biomass.
  • Microorganisms of the species Clostridium sporosphaeroides are preferably added to the fermentation substrate in the form of cultures of microorganisms, the cultures of microorganisms consisting predominantly of microorganisms of the species Clostridium sporosphaeroides. If, in addition to the determination of the number of microorganisms of the species Clostridium sporosphaeroides, the total number of microorganisms is also determined, then the proportion of microorganisms of the species Clostridium sporosphaeroides in the culture can be stated as a percentage. Microorganisms of the species Clostridium sporosphaeroides are in a mixed culture then the predominant species of microorganisms, when they have the highest percentage of the various species of microorganisms present in the mixed culture.
  • composition of the microbial populations in the various fermentation substrates as well as the development of the organism composition during the fermentation process is largely unknown, but very variable and subject to a complicated dynamic process, which is also influenced by the respective process conditions.
  • various methods are known to those skilled in the art, for example, in the review article by Amann et al. (Microbiol. Review., 59, 143-169, 1995).
  • a preferred method for determining the microorganism composition independently of a previous cultivation of the microorganisms is, for example, the preparation of a rDNA clone library (eg based on 16S rRNA) after nucleic acid extraction and PCR, which can then be sequenced.
  • a rDNA clone library eg based on 16S rRNA
  • the composition of the microbial population in the fermentation substrate can be determined, for example, by in situ hybridization with specific fluorescence-labeled oligonucleotide probes.
  • Suitable rRNA-based oligonucleotide probes are known from the review mentioned above or may be prepared, for example, by probeBase (Loy et al., 2003, Nucleic Acids Res.
  • a quantitative determination of the proportion of individual microorganisms in the total population can be carried out in a suitable manner with the methods of quantitative dot blot, in situ hybridization or whole cell hybridization.
  • the microorganism Clostridium sporosphaeroides accounts for at least 10.sup.- 4 % of the total number of microorganisms present in the culture added to the fermentation substrate. More preferably, the microorganism Clostridium sporosphaeroides accounts for at least 10.sup.- 2 % of the total number present in the culture
  • Microorganisms of, and particularly preferred, the microorganism Clostridium sporosphaeroides makes up at least 1% of the total number of microorganisms present in the culture.
  • the microorganism Clostridium sporosphaeroides accounts for at least 10% of the total number of microorganisms present in the culture, more preferably the microorganism Clostridium sporosphaeroides constitutes at least 50% of the total number of microorganisms present in the culture, and more preferably the microorganism makes Clostridium sporosphaeroides at least 90% of the total number of microorganisms present in the culture.
  • a pure culture of a microorganism of the species Clostridium sporosphaeroides is added.
  • the pure culture is biochemically characterized by specific metabolic processes and activities, as well as by special growth conditions. Due to the specific metabolic processes and activities, the addition of a pure culture of a fermentative microorganism can especially contribute to an improved control of the complex biogas production process.
  • a microorganism of the species Clostridium sporosphaeroides is added as a component of at least one immobilized culture of microorganisms.
  • this type of microorganism should be present in the added immobilized culture in an amount enriched in comparison to the natural occurrence.
  • immobilized mixed cultures of any composition can be used for the addition. The only requirement is that microorganisms of the species Clostridium sporosphaeroides are present in an amount that exceeds their natural occurrence.
  • the microorganism of the species Clostridium sporosphaeroides at least 10% of ⁇
  • the total number of microorganisms present in the immobilized culture and more preferably, the microorganism of the species Clostridium sporosphaeroides makes up at least 1% of the total number of microorganisms present in the immobilized culture.
  • the microorganism of the species Clostridium sporosphaeroides accounts for at least 10% of the total number of microorganisms present in the immobilized culture, more preferably the microorganism of the species Clostridium sporosphaeroides constitutes at least 50% of the total number of microorganisms present in the immobilized culture, and is particularly preferred makes the microorganism of the species Clostridium sporosphaeroides at least 90% of the total number of microorganisms present in the immobilized culture.
  • At least one immobilized pure culture of a microorganism of the species Clostridium sporosphaeroides is added.
  • suitable polymers are polyaniline, polypyrrole, polyvinylpyrrolidone, polystyrene, polyvinyl chloride, polyvinyl alcohol, polyethylene, polypropylene, epoxy resins, polyethyleneimines, polysaccharides such as agarose, alginate or cellulose, ethylcellulose, methylcellulose, carboxymethylethylcellulose, cellulose acetates, alkali cellulose sulfate, copolymers of polystyrene and maleic anhydride , Copolymers of styrene and methyl methacrylate, polystyrenesulfonate, polyacrylates and polymethacrylates, polycarbonates, polyesters, silicones, cellulose phthalate, proteins such as gelatin, gum arabic, albumin or fibrinogen, mixtures of gelatin and water glass, gelatin and polyphosphate, gelatin and copolymers of maleic anhydride and methyl vinyl ether, Cellulose acetate butyrate
  • Alginates as Immobilisate prove to be particularly advantageous because they take on the one hand no negative impact on the activity of the microorganism Clostridium sporosphaeroides and there on the other by microorganisms slowly be reduced. Due to the slow degradation of the alginate immobilizates, the trapped microorganisms of the species Clostridium sporosphaeroides are gradually released.
  • the microorganisms are mixed with a polymer gel and then cured in a suitable hardener solution. For this they are first mixed with a gel solution and then dropped into a hardener solution of suitable height.
  • a suitable hardener solution of suitable height.
  • additional biomass is added to the fermentation reactor in a timely manner to the addition of the microorganisms described below.
  • Timely addition of additional biomass may occur within a period of 1 second to 3 days after addition of microorganisms, or it may occur simultaneously with the addition of microorganisms.
  • the space load in the fermentation reactor can be continuously increased or kept approximately constant by the continuous addition of new substrate, wherein the fermentation at all room loads, preferably at a space load of ⁇ 0.5 kg of organic dry matter per m 3 and day [kgoTS / m 3 d] , more preferably at a space load of ⁇ 4.0 kgoTS / m 3 d and particularly preferably at a room load of ⁇ 8.0 kgoTS / m 3 d can be performed, which corresponds to an increase in the space load by more than double compared to the current state of the art ,
  • the fermentation substrate used can in particular also have a high proportion of solid constituents.
  • a hydrolytically active, fermentative microorganism of the species Clostridium sporosphaeroides these solid constituents are at least partially liquefied.
  • Clostridium sporosphaeroides thickening of the fermenter material can be prevented and targeted counteracted.
  • Another liquid entry into the fermentation substrate in the form of water or manure during fermentation can be avoided.
  • Another advantage in conserving the resource Freshwater Another advantage is the thus obtained obtaining the stirring and pumpability of the substrate. As a result, agitators and pumps are spared and significantly less energy is required for the stirring process.
  • Microorganisms of the species Clostridium sporosphaeroides can thus also be used for the liquefaction of biomass in alcoholic fermentation with the aim of producing biofuel.
  • the treatment of biomass takes place with constant mixing of the fermentation substrate. Due to the constant mixing of the fermentation substrate, the cultures of Clostridium sporosphaeroides can be better distributed in the fermentation substrate. In the case of biogas production, moreover, the biogas produced can be better removed from the fermentation process.
  • the constant mixing of the fermentation substrate also leads to a uniform heat distribution in the fermentation reactor.
  • Measurements of the temperature in the fermentation reactor which were carried out at periodic intervals, but also continuously, showed that the fermentation substrate in a temperature range of 20 0 C to 80 0 C, preferably at about 35 0 C to 60 0 C, particularly preferably at 40 0 C is fermented efficiently to 50 0 C. These temperature ranges are therefore preferred in the context of the present invention.
  • the last stage of the fermentation process namely the formation of methane by methanogenic microorganisms, particularly efficient at elevated temperatures.
  • All embodiments of the present invention are not limited to one-step processes for the production of biogas.
  • the use of microorganisms of the species Clostridium sporosphaeroides can also be carried out in two or more stages.
  • microorganisms of the species Clostridium sporosphaeroides are used in processes for the production of liquid biofuels.
  • fermentation substrate and a microorganism of the species Clostridium sporosphaeroides are added continuously.
  • the continuous operation of a fermentation reactor should result in a stable microbial biocenosis to a continuous production of biogas, the exposure of the substrate addition to the fermentation should be reduced as a result of a process disturbance.
  • the microorganism of the species Clostridium sporosphaeroides can be added to the fermentation substrate at regular intervals Addition of the microorganism of the species Clostridium sporosphaeroides at regular intervals leads to an increase in the autismdzelliere and thus to an improved sequence of fermentative processes, such as hydrolysis with a simultaneous improved utilization of the fermentation substrate for fermentation.
  • the microorganism of the species Clostridium sporosphaeroides is added to the fermentation substrate in an amount such that, after addition, the proportion of the microorganism of the species Clostridium sporosphaeroides is between 10 -8 % and 50% of the total number of micro-organisms present in the fermentation substrate.
  • the proportion of the microorganism of the species Clostridium sporosphaeroides is between 10 -8 % and 50% of the total number of micro-organisms present in the fermentation substrate.
  • a microorganism of the species is particularly preferred Clostridium sporosphaeroides in an amount to the fermentation substrate is added that, after addition of the content of the microorganism of the species Clostridium sporosphaeroides between 10 "6% and 25% of the total number of present in the fermentation substrate microorganisms by weight.
  • Particularly preferred is the Microorganism of the species Clostridium sporosphaeroides added in an amount to the fermentation substrate that after addition of the proportion of the microorganism of the species Clostridium sporosphaeroides accounts for between 10 "4 % and 10% of the total number of present in the fermentation substrate microorganisms.
  • the microorganism of the species Clostridium sporosphaeroides is added in an amount to the fermentation substrate such that, after addition, the proportion of the microorganism of the species Clostridium sporosphaeroides is between 10 -3 % and 1% of the total number of microorganisms present in the fermentation substrate.
  • microorganisms of the species Clostridium sporosphaeroides can be carried out at any point in the fermentation process, in particular microorganisms of the species Clostridium sporosphaeroides can also be used for inoculating fermentation substrate during initial startup or restarting a fermenter.
  • Microorganisms of the species Clostridium sporosphaeroides may be added in the form of a culture once or several times at regular or irregular intervals, but preferably weekly or monthly, more preferably daily or twice to five times per week in a suitable concentration and amount. Suitable concentrations of microorganisms and added amounts have already been mentioned or are described in the working examples.
  • Such characteristic parameters are not only the amount of biogas produced and the methane content of the biogas produced but also, for example, the hydrogen content of the biogas produced, the pH of the fermentation substrate, the redox potential of the fermentation substrate, the carboxylic acid content of the fermentation substrate, the proportions of various carboxylic acids in the fermentation substrate, the hydrogen content of the fermentation substrate, the proportion of dry matter in the fermentation substrate, the proportion of the organic dry matter in the fermentation substrate, the viscosity of the fermentation substrate and the volume loading of the fermentation reactor.
  • the present invention also encompasses the use of a microorganism of the species Clostridium sporosphaeroides for the treatment of biomass.
  • the present invention also encompasses the use of a microorganism of the species Clostridium sporosphaeroides for the liquefaction of biomass.
  • the present invention also encompasses the use of a microorganism of the species Clostridium sporosphaeroides for the fermentative production of biogas from biomass.
  • the present invention also encompasses the use of the liquefied biomass for biofuel production obtained by one of the described processes.
  • the liquefied biomass obtained by one of the processes described is preferably used for the production of bioethanol.
  • the present invention comprises the strain of the microorganism Clostridium sporosphaeroides SBG3, as deposited under No. DSM 22577.
  • the microorganism Clostridium sporosphaeroides SBG3 was deposited in a pure culture at the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH in Braunschweig under the Budapest Treaty. The name is Clostridium sporosphaeroides SBG3 with the accession number DSM 22577.
  • the present invention comprises the strain of the microorganism Clostridium sartagoformum SBGIa, as deposited under No. DSM 22578.
  • Clostridium sartagoformum SBGIa was deposited in a pure culture at the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH in Braunschweig under the Budapest Treaty.
  • the name is Clostridium sartagoformum SBGIa with the accession number DSM 22578.
  • Bacteria of the species Clostridium sporosphaeroides can be isolated from the fermentation substrate or fermentation residue of a fermenter with the aid of methods known to those skilled in the art.
  • a suitable substrate is introduced from a fermenter into a selection medium, cultured for a long time and finally isolated individual colonies of microorganisms from the selection medium.
  • microorganisms of the species Clostridium sporosphaeroides can be selected on the basis of the DNA.
  • Bacteria Clostridium sporosphaeroides SBG3 were isolated from the fermentation substrate of a post-fermenter. For this purpose, nitrogen and carbon dioxide were passed through a liquid selection medium, then Na 2 S was added to the selection medium and autoclaved (20 min. At 121 0 C). Then, the biomass obtained from the secondary digester was introduced into the selection medium and cultured for at least one week at a temperature status of at least 30 0 C. A sample obtained from the liquid selection medium was applied to a solid selection medium and subsequently the colonies of microorganisms grown on the solid selection medium were selected. After amplification of the obtained microbial DNA by PCR, a comparison with known DNA sequences could be performed.
  • Clostridium sporosphaeroides SBG3 had been successfully isolated from the fermentation substrate of the postgrader, these microorganisms were subjected to sequence analysis. A partial sequence of the 16S rRNA was determined, which was then transformed into the corresponding DNA sequence. The DNA sequence SEQ ID No. 1 comprises 1409 nucleotides. The next relative was the microorganism Clostridium sp. Clone 1099982248072 identified that derived from a stool sample of a baby and so in no way related to the technical production of biofuels (Genbank Identification number EF434352, length of the sequence 1340 nucleotides). A comparison of the sequences revealed that in the sequence of Clostridium sp.
  • Clone 1099982248072 compared to SEQ ID NO: 1 total of 46 exchanges of nucleotides or gaps templates. For a length of the sequence of Clostridium sp. Clone 1099982248072 of 1340 nucleotides gives an identity of 96, 57%.
  • the present invention also includes microorganisms having a nucleic acid having a nucleotide sequence containing a sequence region having more than 96.57% sequence identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. More preferably, the nucleotide sequence contains a sequence range greater than 96.58% or greater than 96.59% or greater than 96.60% or greater than 96.65% or greater than 96.70% or greater than 96.75%.
  • the nucleotide sequence contains a sequence region which has more than 98.0% sequence identity with the nucleotide sequence SEQ ID No. 1. More preferably, the nucleotide sequence contains a sequence range greater than 98.1% or greater than 98.2% or greater than 98.3% or greater than 98.4% or greater than 98.5% or greater than 98.6%. or more than 98.7% or greater than 98.8% or greater than 98.9% sequence identity with the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1, and more preferably the nucleotide sequence contains a sequence region having greater than 99% sequence identity with the nucleotide sequence SEQ ID No. 1.
  • the microorganism has a nucleotide sequence which contains a sequence region which has more than 99.5% sequence identity with the nucleotide sequence SEQ ID No. 1 and especially Preferably, the nucleotide sequence contains a sequence region having more than 99.8% sequence identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the nucleotide sequence contains a sequence region which corresponds to the nucleotide sequence SEQ ID No. 1.
  • SEQ ID NO: 1 may be compared to the starting nucleotide sequence at one or two positions or at three positions or at four positions or at five positions or at six positions or at seven positions or at eight positions or at nine positions or ten positions or eleven positions or twelve positions or 13 positions or 14 positions or 15 positions or 16 positions or 17 positions or 18 positions or 19 positions or 20 positions or 21 positions or on 22 positions or 23 positions or 24 positions or 25 positions or 26 positions or 27 positions or 28 positions or 29 positions or 30 positions or 31 positions or 32 positions or 33 positions or 34 positions or at 35 positions or 36 positions or 37 positions or 38 positions or 39 position or at 40 positions or at 41 positions or at 42 positions or at 43 positions or at 44 positions or at 45 positions or at 46 positions nucleotide mutations.
  • the meaning of the term "nucleotide mutation" is explained in the "Definitions" section of the present text.
  • the present invention also encompasses a culture of microorganisms suitable for use in a process for treating biomass, in particular a process for liquefying biomass and / or a process for the fermentative production of biogas from biomass, wherein a microorganism is present in the culture of microorganisms which has a nucleotide sequence containing a sequence region having at least 96.57% sequence identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, wherein the microorganism constitutes at least 10 "4 % of the total number of microorganisms present in the culture.
  • the nucleotide sequence contains a sequence range greater than 96.58% or greater than 96.59% or greater than 96.60% or greater than 96.65 or greater than 96.70 or greater than 96.75 or greater than 96.80% or more than 96.90% or more than 97.0% or more than 97.1% or more than 97.2% or more than 97.3% or more than 97.4% or more than 97 , 5% or more than 97.6% or more than 97.7% or more than 97.8% or more than 97.9% sequence identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1
  • the culture of microorganisms suitable for use in a process for the treatment of biomass contains a microorganism having a nucleotide sequence with a sequence region, which has more than 98% sequence identity with the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1. More preferably, the nucleotide sequence contains a sequence range greater than 98.1% or greater than 98.2% or greater than 98.3% or greater than 98.4% or greater than 98.5% or greater than 98.6%.
  • nucleotide sequence SEQ ID NO: 1 or more than 98.7% or greater than 98.8% or greater than 98.9% sequence identity to the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1, and most preferably, the nucleotide sequence contains a sequence region having greater than 99.0% sequence identity with the nucleotide sequence Nucleotide sequence SEQ ID NO.
  • a microorganism in the culture of microorganisms suitable for use in a process for the treatment of biomass, in particular a process for the liquefaction of biomass and / or a process for the fermentative production of biogas from biomass, a microorganism is present which has a nucleotide sequence with a sequence region which has more than 99.5% sequence identity with the nucleotide sequence SEQ ID NO. 1 has. Most preferably, the nucleotide sequence contains a sequence region which has more than 99.8% sequence identity with the nucleotide sequence SEQ ID No. 1.
  • a microorganism which has a nucleotide sequence is present in the culture of microorganisms suitable for use in a process for the treatment of biomass, in particular a process for liquefying biomass and / or a process for the fermentative production of biogas from biomass containing a sequence region corresponding to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the microorganism Clostridium sporosphaeroides accounts for at least 10.sup.- 2 %, preferably at least 1% of the total number of microorganisms present in the culture.Particularly preferably, the microorganism Clostridium sporosphaeroides accounts for at least 10%, more preferably at least 25% of the total number in the Culture of existing microorganisms.
  • the microorganism Clostridium sporosphaeroides accounts for at least 50%, in particular at least 90%, of the total number of microorganisms present in the culture.
  • Method for the treatment of biomass in particular a method for
  • Clostridium sporosphaeroides SBG3 microorganism as characterized above with respect to its nucleotide sequence.
  • it is an immobilized culture of microorganisms.
  • the present invention also encompasses an immobilized culture of microorganisms suitable for use in a process for treating biomass, in particular a process for liquefying biomass and / or a process for the fermentative production of biogas from biomass, wherein in the immobilized culture of microorganisms a microorganism is present which has a nucleotide sequence containing a sequence region having at least 96.57% sequence identity with the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1 having.
  • a method for the treatment of biomass in particular a method for liquefying biomass and / or a method for the fermentative production of biogas from biomass suitable immobilized culture of microorganisms present a microorganism having a nucleotide sequence with a sequence region, which has more 96.57% sequence identity with the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1.
  • the nucleotide sequence contains a sequence range greater than 96.58% or greater than 96.59% or greater than 96.60% or greater than 96.65 or greater than 96.70 or greater than 96.75 or greater than 96.80% or more than 96.90% or more than 97.0% or more than 97.1% or more than 97.2% or more than 97.3% or more than 97.4% or more than 97 , 5% or more than 97.6% or more than 97.7% or more than 97.8% or more than 97.9% or more than 98.0% or more than 98.1% or more than 98, 2% or more than 98.3% or more than 98.4% or more than 98.5% or more than 98.6% or more than 98.7% or more than 98.8% or more than 98.9 % Sequence identity with the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1. Particularly preferably, the nucleotide sequence contains a sequence region which has more than 99.0%
  • a microorganism which contains a nucleotide sequence is present in the immobilized culture of microorganisms suitable for use in a process for the treatment of biomass, in particular a process for the liquefaction of biomass and / or a process for the fermentative production of biogas from biomass
  • a process for the treatment of biomass in particular a process for the liquefaction of biomass and / or a process for the fermentative production of biogas from biomass
  • the nucleotide sequence contains a sequence region which has more than 99.8% sequence identity with the nucleotide sequence SEQ ID No. 1.
  • a microorganism which contains a nucleotide sequence is present in the immobilized culture of microorganisms suitable for use in a process for the treatment of biomass, in particular a process for the liquefaction of biomass and / or a process for the fermentative production of biogas from biomass having a sequence region corresponding to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the present invention also encompasses the use of microorganisms as characterized above with respect to their nucleotide sequence in a method of treating biomass. These microorganisms are preferably used in one of the methods for the treatment of biomass explained in greater detail above.
  • the present invention also encompasses the use of microorganisms as characterized above with respect to their nucleotide sequence in a process for liquefying biomass. These microorganisms are preferably used in one of the above-explained methods for liquefying biomass.
  • the present invention also encompasses the use of microorganisms as characterized above with respect to their nucleotide sequence in a process for the fermentative production of biogas from biomass. These microorganisms are preferably used in one of the methods explained in more detail above for the fermentative production of biogas from biomass.
  • the present invention also encompasses the use of a culture of microorganisms as characterized above with respect to their nucleotide sequence in a method of treating biomass. These cultures of microorganisms are preferably used in one of the methods for the treatment of biomass explained in more detail above.
  • the present invention also encompasses the use of a culture of microorganisms as characterized above with respect to their nucleotide sequence were in a process for the liquefaction of biomass. These cultures of microorganisms are preferably used in one of the above-explained methods for liquefying biomass.
  • the present invention also encompasses the use of a culture of microorganisms as characterized above with respect to their nucleotide sequence in a process for the fermentative production of biogas from biomass. These cultures of microorganisms are preferably used in one of the methods explained in more detail above for the fermentative production of biogas from biomass.
  • Fig. 1 shows a substrate flow test for investigating the degree of liquefaction of fermentation substrate
  • Fig. 2 Results of a fermentation: Plotted is the gas yield as space-time yield (N l / l) and the space load of the fermenter against time;
  • Fig. 3 results of a further fermentation: Plotted is the gas yield as space-time yield (N l / l) and the space load of the fermenter against time;
  • Fig. 4 results of a further fermentation: Plotted is the gas yield as space-time yield (N l / l) and the space load of the fermenter against time. Ways to carry out the invention
  • Bacteria Clostridium sporosphaeroides SBG3 were successfully isolated from the fermentation substrate of a post-fermenter. The deposit of the organism was carried out in a pure culture at the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) according to the Budapest Treaty (Clostridium sporosphaeroides SBG3 with the accession number DSM 22577).
  • Bacteria Clostridium sartagoformum SBGIa were also successfully isolated from the fermentation substrate of a post-fermenter. The deposit of the organism was carried out in a pure culture at the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) according to the Budapest Treaty (Clostridium sartagoformum SBGIa with the accession number DSM 22578).
  • bacteria of the Clostridium sartagoformum SBGIa strain both in mixed culture and in pure culture, have properties similar to those of bacteria of the strain Clostridium sporosphaeroides SBG3, e.g. an increase in the volume of space, an increase in gas yield and a stabilization of the biogas process as well as the ability to liquefy biomass.
  • Clostridium sporosphaeroides SBG3 Bacteria of the strain Clostridium sporosphaeroides SBG3 were successfully isolated from the fermentation substrate of a post-fermenter. The microorganisms were isolated using a selection medium containing carboxymethylcellulose (CMC) as the sole carbon source. Carboxymethylcellulose is very similar to the cellulose contained in fermentation substrates of biogas plants and also has an improved solubility in the aqueous state by linking the hydroxyl groups with carboxymethyl groups (-CH 2 -COOH-) Medium up.
  • the medium used for the selection of Clostridium sporosphaeroides SBG3 (DSMZ medium 520 plus 1% CMC and 0.2% yeast extract) was gassed with N 2 so that the selection could be carried out under anaerobic conditions. Contained residual oxygen was reduced by means of 0.5 g / l Na 2 S.
  • the selection medium was then inoculated with the supernatant of material from a post fermenter (diluted 1: 2000). After one week of cultivation at 40 ° C., single rods were observed under microscopic analysis. Further selection of liquid cultures and isolation to pure cultures was achieved by smearing on anaerobic carboxymethylcellulose plates.
  • Clostridium sporosphaeroides SBG3 For larger amounts of bacteria of the strain Clostridium sporosphaeroides SBG3 (eg for the addition in the fermenter type 3), the cultivation was carried out under the specified conditions in a 1 m 3 fermenter, which was inoculated with 100 ml preculture. Since growth is quite fast with a doubling time of about 2 h, Clostridium sporosphaeroides SBG3 is particularly suitable for biotechnological application. Smaller amounts of bacteria (eg for addition to fermenter types 1, 2 and 4) were cultured in 500 ml to 1 l scale. Cultivation for the addition to a fermentation process took place over a period of 1 to 2 days. Cell densities in the range of 10 8 to 10 10 cells per ml of culture medium were achieved. The bacterial cells were harvested by centrifugation and taken in the smallest possible volume of fresh medium before they were used in the fermentation process. For interim storage, the cells were frozen.
  • Smaller amounts of bacteria eg
  • Microorganisms of the species Clostridium sartagoformum and Paenibacillus macerans e.g. for the use of mixed cultures with approximately equal proportions of the 3 mentioned microorganisms could be cultured under the same conditions.
  • the cell material of the grown sporadic colonies was used for amplification of the microbial DNA by the Colony PCR method according to a standard program.
  • the gene for the 16S rRNA was amplified from the cell DNA by PCR.
  • the primers with the sequences GRGTTTGATCCTGGCTCAG and ACGGHTACCTTGTTACGACTT were used (indicated in 5 " ⁇ 3 " direction, H is C, T or A).
  • the pieces of DNA obtained as PCR products were then cloned into a cloning vector (ligation with the QIAGEN PCR cloning kit from QIAGEN / Hilden using the vector p-drive), transformed into E.
  • coli (according to QIAGEN PCR cloning - Handbook) and examined by colony PCR.
  • the obtained colony PCR products were subjected to restriction fragment length polymorphism analysis (RFLP) to select suitable clones. From the respective clones, the corresponding plasmid DNA was isolated and sequenced by the chain termination method (Sanger et al., 1977).
  • RFLP restriction fragment length polymorphism analysis
  • the 16S rDNA or its transformation into the corresponding 16S rRNA could be phylogenetically analyzed with the program package ARB (Ludwig et al., Nucleic Acids Research., 2004, 32, 1363-1371) and classified as a microorganism of the species Clostridium sporosphaeroides become.
  • Clostridium sporosphaeroides SBG3 showed that the addition of the highly viscous, viscous carboxymethylcellulose-containing selection medium leads to a successive liquefaction of the medium to a water-like consistency during bacterial growth, which by shaking the culture flask and visual inspection can be clearly observed. Liquefaction of fermentation substrate - Substrate flow test
  • Maintaining a liquid-pulpy consistency in a wet fermentation process is essential to ensure a smooth and cost-effective process of the technical process.
  • continuous fermentation also leads to an increase in the fermenter content, which also has a negative effect on the biogas production process.
  • the effect that the addition of microorganisms has on the consistency of the fermentation substrate was determined by a test in which the flow behavior of substrate samples was measured on an inclined plane (substrate flow test).
  • Starting material for the flow test was material from a biogas plant with a dry matter content of about 8-12%.
  • Each 500 ml of material from a fermenter was filled into 1 I Schott bottles and incubated for 1 day at 40 0 C.
  • each of the bacterial cell mass from a 500 ml preculture (equivalent to approximately 4 x 10 11 cells) of Clostridium sporosphaeroides SBG3, Clostridium sartagoformum SBGI a, Paenibacillus macerans SBG2 or a mixture of the three bacteria in equal proportions resuspended in 1 ml of medium was added and for incubated for a further 5 days at 40 ° C. with shaking.
  • FIG. 1 shows the following traces in FIG. 1: Lane 1: control without addition of microorganisms (comparative example); Lane 2: Clostridium sartagoformum SBGIa (comparative example); Lane 3: Clostridium sporosphaeroides SBG3; Lane 4: Paenibacillus macerans SBG2 (comparative example); Lane 5: Mixture of Clostridium sartagoformum SBGI a, Clostridium sporosphaeroides SBG3 and Paenibacillus macerans SBG2 in equal parts.
  • FIG. 1A shows the traces directly after the application of the samples, FIG. 1B after 2 min. and Figure 1 C after 18 min.
  • Clostridium sporosphaeroides SBG3 was found to significantly decrease the viscosity of the fermenter content, while the addition of the organisms Clostridium sartagoformum SBGI a and Paenibacillus macerans SBG2 also had a marked but less pronounced effect. Also by the addition of the mixture of 3 microorganisms, a significant liquefaction of the substrate could be achieved. In a further experiment it could be shown that the addition of dead cells (dead autoclaving) had practically no effect. A visual inspection of the samples also showed that when adding live cells of the strain Clostridium sporosphaeroides SBG3, the proportion of slimy substances decreased.
  • Clostridium sporosphaeroides SBG3 or Paenibacillus macerans SBG2 or Clostridium sartagoformum SBGI a was determined by whole cell hybridization according to the method described in Amann et al. (1995, Microbiol. Rev. 59, 143 169).
  • a labeled oligonucleotide with the sequence Cy3-CCACAGCTCTCACGCCCG was used for Clostridium sporosphaeroides SBG3, for Paenibacillus macerans SBG2 a labeled oligonucleotide having the sequence Cy3- GCAACCCGAACTGAGACC (indicated in 5 ").
  • Clostridium sartagoformum SBGIa a labeled oligonucleotide with the sequence Cy3 CTTCATGCGAAAATGTAA (indicated in 5 " ⁇ 3 " direction) .
  • the oligonucleotides carried as marker at the 5 " end the dye indocarbocyanine (Cy3).
  • Fermenter type 1 Lying plug fermenter rectangular, volume 150 1, subdivision of the fermenter compartment by retracted wall with small-area passage for the substrate flow, division of the fermenter space in VA directly after substrate addition nozzle and 3 A to pinhole, 2-stage system.
  • Fermenter Type 2 Lying plug fermenter rectangular, volume 150 I as 1st stage plus totally mixed round fermenter, volume 200 I as 2nd stage; Total volume 350 I. 2-stage plant with recirculation between round fermentor and plug-flow fermenter.
  • Fermenter type 3 horizontal cylindrical plug-flow fermenter, volume 30 m 3 , single-stage plant.
  • Fermenter type 4 Lying plug fermenter rectangular, volume 150 l, no structural subdivision in the fermenter room, 1-stage plant. Recirculation optional. Distribution of microorganisms within the fermenter - "Tracer test" Since the mixing of the viscous substrate and thus also other additives in a fermenter takes some time and also depends on the stirring technique used, a test was established with which the period to a uniform In this "tracer test", instead of microorganisms, powdered LiCI was added at a concentration of 10 mg lithium / kg starting substrate (double the amount for fermenter type 2) at the site of substrate addition.
  • gas yield and volume load In addition to gas yield and volume load, a number of other characteristic parameters of the fermentation process such as dry matter content of the fermenter content, pH, acid concentration (eg acetic acid, propionic acid, butyric acid, valeric acid, acetic acid equivalent), temperature, specific gas yield, composition of the biogas, viscosity, conductivity, redox potential and concentration measured on nutrients and trace elements.
  • acid concentration eg acetic acid, propionic acid, butyric acid, valeric acid, acetic acid equivalent
  • FIG. 2 shows measurement results of various characteristic parameters during a fermentation process in a test fermenter with and without the addition of microorganisms of the strain Clostridium sporosphaeroides SBG3.
  • the curve provided with the reference numeral 10 shows the time course of the volume load of the fermenter in kilograms of organic dry matter depending Cubic meters per day (kgoTS / m 3 d) and the curve indicated by the reference numeral 20, the time course of the measured space-time yield, averaged over 5 days (Nl / I).
  • the reference numeral 30 marks the time course of the theoretical gas production in [Nl / I].
  • the system was brought up again within a day to a volume load of 5 kgoTS / m 3 d without microorganisms being added again.
  • the volume load could be increased to a value of 7 kgoTS / m 3 d and remained at constant high values between 7 and 8 kgoTS / m 3 d.
  • Gas production then started high efficiency and remained in the range or above the theoretically expected gas production over the entire observation period.
  • FIG. 3 shows measurement results of various characteristic parameters during a fermentation process in a type 1 fermenter with addition of a mixture of microorganisms or microorganisms of the type 1 Strain Clostridium sporosphaeroides SBG3.
  • the curve provided with the reference numeral 10 shows the time course of the space load of the fermenter in kilograms of organic dry matter per cubic meter per day (kg oTS / m 3 d) and the curve indicated by the reference numeral 20, the time course of the measured space-time yield, averaged over 5 Days (NI / I).
  • the reference numeral 30 marks the time course of the theoretical gas production in [Nl / I].
  • Paenibacillus macerans SBG2 added 2 to 5 times a week.
  • the times of the additions are indicated by the reference numeral 50.
  • about 3 g cell pellet with a cell count of about 10 12 cells were added.
  • the volume load was gradually increased to a value of approx. 6 kgoTS / m 3 d.
  • the gas yield corresponded to the
  • This pilot plant is a large test facility on a pilot plant scale with a volume of 30 m 3 , which is constructed as a horizontal cylindrically shaped plug-flow fermenter. It is operated as a 1-stage system.
  • FIG. 4 shows measurement results of various characteristic parameters during a fermentation process in a type 3 experimental fermenter with addition of microorganisms of the strain Clostridium sartagoformum SBGIa or of microorganisms of the strain Clostridium sporosphaeroides SBG3.
  • the curve provided with the reference numeral 10 shows the time course of the volume load of the fermenter in kilograms of organic dry matter per cubic meter per day (kgoTS / m 3 d) and the curve indicated by the reference numeral 20, the time course of the measured space-time yield.
  • the space-time yield averaged over 5 days (Nl / I) is indicated by the reference numeral 70.
  • the reference numeral 30 marks the time course of the theoretical gas production in [Nl / I].
  • the times of additions of microorganisms of the strain Clostridium sporosphaeroides SBG3 are indicated by the reference numeral 90.
  • the time points of additions of microorganisms of the strain Clostridium sartagoformum SBGIa are designated by the reference numeral 80.
  • the arrow marks the beginning of the "crash" of the fermenter.
  • the biogas plant was operated from the operating day 184 with a volume load in the range of 4 to 5 kgoTS / m 3 d. As can be seen in FIG. 4, the achieved space-time yield of biogas in this experiment was significantly above the theoretically expected.
  • the volume load in fermentations could be increased to a maximum value of about 9 kgoTS / m 3 d.
  • the space load of the plant could be further increased as a result of the addition of Clostridium sporosphaeroides SBG3.
  • the percentage content of dry substance or organic dry matter remained almost constant. This observation suggests that no accumulation of non-fermented organic dry substance occurs during the fermentation of the fermentation substrate.
  • the addition of pure cultures of Clostridium sporosphaeroides SBG3 thus contributes to a continuous conversion of the dry matter contained in the fermentation substrate, which in turn leads to a continuous fermentation by the accumulation of dry matter is reduced.
  • pure cultures of Clostridium sporosphaeroides but also mixed cultures were used with a proportion of Clostridium sporosphaeroides.
  • mixed cultures of two or three kinds of microorganisms selected from the group consisting of Paenibacillus macerans, Clostridium sartagoformum and Clostridium sporosphaeroides can be added.
  • the addition of the hydrolytically active, fermentative microorganism Clostridium sporosphaeroides SBG3 has a positive effect on the hydrolysis of organic dry matter.
  • the volume load of a fermenter can be increased from about 4 to 5 kgoTS / m 3 d to about 6 to 9 kgoTS / m 3 d under otherwise identical conditions without an instability of the fermentation process even would suggest.
  • Parallel to the increased space load the amount of biogas produced is significantly increased.
  • the specific yield of biogas increases, since significantly more of the organic dry matter is degraded than in the absence of addition of microorganisms of the species Clostridium sporosphaeroides.
  • the use of microorganisms of the species Clostridium sporosphaeroides leads to a dramatic improvement in the efficiency and efficiency of biogas plants.

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Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur Behandlung von Biomasse, wobei der Biomasse ein Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zugesetzt wird.

Description

Clostridium sporosphaeroides zur Behandlung von Biomasse
Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung von Biomasse unter Verwendung eines Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides.
Stand der Technik
Biokraftstoffe werden hauptsächlich durch Vergärung von Pflanzensubstraten mit Hilfe von Hefen, Bakterien oder Pilzen gewonnen. Die produzierten flüssigen Energieträger, insbesondere Bioethanol, können anschließend als Brennstoff in geeigneten Feuerungsanlagen oder als Treibstoff oder -zusatz in Kraftfahrzeugmotoren oder Motoren zur Strom- und Wärmeerzeugung eingesetzt werden. Die Biomasse wird somit in einen flüssigen und gut transportierbaren Energieträger mit relativ hoher Energiedichte umgewandelt, der dann weitgehend universell eingesetzt werden kann.
Als Rohstoffe für die Erzeugung von flüssigen Biokraftstoffen kommen meist lokal verfügbare Pflanzen mit einem hohen Gehalt an Zucker oder Stärke zum Einsatz. In Europa sind dies vor allem Mais- und Getreidekörner sowie Zuckerrüben, in Nordamerika Mais und in Lateinamerika Zuckerrohr oder -melasse. In Frage kommen aber auch weitere Energiepflanzen wie Zuckerhirse (Sorghum), Triticale oder Cassava (Maniok). Derzeit werden als Ausgangsmaterial bei der Verflüssigung von Biomasse insbesondere Maiskorn und Getreidekorn eingesetzt. Aufgrund der zunehmenden Rohstoffknappheit, der gestiegenen Rohstoffpreise, einer enstandenen Konkurrenzsituation um Pflanzen, die sowohl der menschlichen und tierischen Nahrung dienen als auch der Energiegewinnung, einer verbesserten CO2- Bilanz sowie der Schonung der Ressourcen wird nun zunehmend versucht, nicht nur die Körner von Mais und Getreide zu verwenden, sondern vielmehr die gesamte Pflanze der Energiegewinnung zuzuführen oder Pflanzen zu verwenden, die keiner intensiven landwirtschaftlichen Bewirtschaftung bedürfen wie Rutenhirse oder Chinaschilf. Bei den aus diesen Rohstoffen hergestellten Biokraftstoffen handelt es sich um sogenannte „second generation"-Kraftstoffe. Daneben wird auch eine vermehrte Nutzung von günstigen pflanzlichen Reststoffen wie Stroh, pflanzlichen Abfällen aus der Holzwirtschaft oder Garten- und Landschaftspflege angestrebt.
Um eine effiziente Vergärung der Biomasse sicher zu stellen, muss das als Rohstoff eingesetzte pflanzliche Material und insbesondere die darin enthaltene organische
Trockensubstanz (oTS) für eine anschließende Verwertung aufgeschlossen werden.
Dies geschieht durch Hydrolyse der organischen Trockensubstanz, was gleichermaßen einer Verflüssigung der organischen Trockensubstanz entspricht.
Aus dem flüssigen Biomasse-Substrat wird dann durch Vergärung Ethanol oder ein anderer Biokraftstoff hergestellt. Mit den vorhandenen Techniken wird aber keine hohe Energieeffizienz erreicht, was insbesondere an der nicht ausreichenden
Verflüssigung und damit Verwertung des Rohmaterials liegt.
Bei der Herstellung von Bioethanol erfolgt die ethanolische Gärung in erster Linie durch zugesetzte Hefen, die Glucose in Ethanol umwandeln. Je nach Substrat ist schon ein relativ hoher Zuckeranteil vorhanden (z.B. bei Melasse) oder es müssen zuerst höhermolekulare Substrate wie Stärke, Cellulose oder Hemicellulose (z.B. bei
Getreide, Stroh, Ganzpflanzeneinsatz) enzymatisch oder chemisch gespalten werden, damit die alkoholische Gärung erfolgen kann. Für diesen hydrolytischen Substrataufschluss, der auch einer Verflüssigung entspricht, sind in erster Linie
Mikroorganismen, insbesondere Bakterien verantwortlich.
Soll die Umwandlung organischer Rohstoffe nicht zu einem flüssigen Biokraftstoff, sondern zu einem gasförmigen Energieträger führen, so kommen Biogasanlagen zum Einsatz. In Biogasanlagen wird Methan durch einen mikrobiellen Abbauprozess organischer Substanzen erzeugt. Das Biogas entsteht dabei in einem mehrstufigen Prozess der Vergärung oder Faulung durch die Aktivität von anaeroben oder mikroaerophilen Mikroorganismen, d.h. unter Ausschluss von Luft. Das als Gärsubstrat verwendete organische Material besitzt aus chemischer Sicht einen hochmolekularen Aufbau, der in den einzelnen Verfahrensschritten einer Biogasanlage durch Stoffwechseltätigkeit der Mikroorganismen zu niedermolekularen Bausteinen abgebaut wird. Die bei der Fermentierung des organischen Gärsubstrats aktiven Populationen von Mikroorganismen sind bislang aber nur unzureichend charakterisiert.
Nach heutigem Kenntnisstand können vier nacheinander, aber auch parallel ablaufende und ineinander greifende biochemische Stoffwechselprozesse unterschieden werden, die den Abbau von organischen Gärsubstraten zu den Endprodukten Methan und Kohlendioxid ermöglichen: Hydrolyse, Acidogenese, Acetogenese und Methanogenese.
In der Hydrolyse werden hochmolekulare, oft partikulär vorliegende, organische Verbindungen durch Exoenzyme (z.B. Cellulasen, Amylasen, Proteasen, Lipasen) fermentativer Bakterien in lösliche Spaltprodukte überführt. Dabei werden beispielsweise Fette in Fettsäuren, Kohlenhydrate, wie z.B. Polysaccharide, in
Oligo- und Monosaccharide sowie Proteine in Oligopeptide beziehungsweise
Aminosäuren zerlegt. Die daneben gebildeten gasförmigen Produkte bestehen überwiegend aus Kohlendioxid.
Fakultativ und obligat anaerob lebende Bakterien, oftmals identisch mit den hydrolysierenden Bakterien, verstoffwechseln in der Acidogenese die Hydrolyseprodukte (z.B. Mono-, Disaccharide, Di-, Oligopeptide, Aminosäuren, Glycerin, langkettige Fettsäuren) intrazellulär zu kurzkettigen Fett- oder Carbonsäuren, wie beispielsweise Butter-, Propion- und Essigsäure, zu kurzkettigen Alkoholen wie zum Beispiel Ethanol und zu den gasförmigen Produkten Wasserstoff und Kohlendioxid.
In der sich anschließenden Acetogenese werden die in der Acidogenese gebildeten kurzkettigen Fett- und Carbonsäuren sowie die kurzkettigen Alkohole von acetogenen Bakterien aufgenommen und nach ß-Oxidation als Essigsäure wieder ausgeschieden. Nebenprodukte der Acetogenese sind CO2 und molekularer Wasserstoff (H2). Die Produkte der Acetogenese wie Essigsäure aber auch andere Substrate wie Methanol und Formiat werden durch Methan-bildende Organismen in der obligat anaerob verlaufenden Methanogenese zu Methan und CO2 umgesetzt. Das hier entstehende CO2 und auch das während der übrigen Prozessschritte, wie z.B. der Hydrolyse, gebildete CO2 kann wiederum durch Mikroorganismen mit dem angefallenen H2 ebenfalls zu Methan umgesetzt werden.
Die Erhöhung der Ausbeute an Endprodukten aus einer gegebenen Menge an Edukten stellt wie bei jeder chemischen Umsetzung auch sowohl im Fall der Verflüssigung von Biomasse wie auch bei der Herstellung von Biogas ein vordringliches Ziel der Prozessführung dar. Aus einer gegebenen Menge an Biomasse soll eine möglichst große Menge an flüssigen organischen Verbindungen bzw. eine möglichst große Menge an Methan gebildet werden.
Die Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe hat im Jahr 2005 Ergebnisse eines Biogas-Messprogramms veröffentlicht („Ergebnisse des Biogas-Messprogramms", 2005, Hrsgb. Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e.V., Gülzow), worin verschiedene Biogasanlagen verglichen wurden. Dieses Messprogramm stellt einen repräsentativen Querschnitt der bestehenden Anlagenvielfalt dar, da Biogasanlagen verschiedener Bauarten, verschiedener Hersteller und mit verschiedenen Einsatzstoffen betriebene Anlagen erfasst wurden. Die gemessenen Gesamtraumbelastungen der untersuchten Biogasanlagen lagen in einem Bereich zwischen 0,45 kgoTS/m3d (mehrstufige Anlagen) und 5,7 kgoTS/m3d (einstufige Anlagen). Sowohl für die meisten ein- als auch mehrstufigen Anlagen lag die Raumbelastung zwischen 1 und 3 kgoTS/m3d.
Unter der Raumbelastung eines Fermenters versteht man die Menge an dem Fermenter zugeführten Substrat, die in Kilogramm organischer Trockensubstanz pro Kubikmeter Fermentervolumen und pro Tag angegeben wird. Die Menge an erzeugtem Biogas hängt stark von der Raumbelastung des Fermenters ab, wobei mit steigender Raumbelastung eine zunehmend größere Menge an Biogas erzeugt wird. Eine hohe Raumbelastung macht den Prozess der Biogaserzeugung also zunehmend ökonomisch rentabler, führt andererseits aber zu einer zunehmenden Destabilisierung der biologischen Prozesse der Fermentierung.
Die Steigerung der Raumbelastung ist eine Möglichkeit, um eine Biogasanlage effizienter zu betreiben. Dabei wird durch eine langsame Steigerung der
Füttermenge in oTS pro Tag die Biogasproduktion erhöht. In der Praxis kommen hohe Raumbelastungen von über 6 kgoTS/m3d bislang nicht vor. Ziel im
Anlagenbetrieb ist es, eine Anlage wirtschaftlich zu betreiben. Dabei steht die
Stabilität des biologischen Prozesses an vorderster Stelle, da ein Anlagenausfall extrem hohe Kosten verursacht.
Um diese Prozessstabilität zu erreichen, werden die bestehenden Anlagen bei niedrigen Raumbelastungen betrieben, was aber ein entsprechend großes Gärvolumen für einen effizienten Betrieb notwendig macht. Dadurch werden die Anfangsinvestitionen durch zusätzliche Baukosten erhöht. Bei hohen Raumbelastungen kommt es aufgrund einer stärkeren Belastung der im Fermenter existierenden Biozönose mit organischem Material vor allem in Form von Feststoffen zu einer kontinuierlichen Eindickung des Fermenterinhalts. Bedingt wird dies durch steigende Trockensubstanzgehalte und einer unvollständigen Umwandlung der Biomasse in Biogas.
Substrate für die Biogasherstellung weisen Trockensubstanzanteile im Bereich von 5 % bis 90 % auf. Für Nassgärverfahren, bei denen pumpfähige Substrate benötigt werden, können hierbei Substrate mit einem Trockensubstanzanteil bis etwa 35 bis höchstens 40 % eingesetzt werden. Da Substrate mit einem höhreren Trockensubstanzanteil, insbesondere einem höheren Anteil an organischer Trockensubstanz, meist einen höheren Energiegehalt liefern, würden diese bevorzugt eingesetzt. Entgegen stehen in diesem Fall jedoch höhere Kosten durch vermehrten Energieaufwand beim Pumpen und Rühren sowie höhere Nebenkosten durch Abnutzung oder Reparatur von Pumpen, Rührwerken o.a. bei hoher Viskosität oder einem hohen Trockensubstanzgehalt. Falls eine Substratverdünnung wegen eines hohen Trockensubstanzgehalts notwendig ist, entstehen zusätzliche Wasser- und Abwasserkosten sowie technische Ausrüstung zur Wasserzufuhr, - rückgewinnung oder Abwasserbehandlung. Ein im kontinuierlichen Betrieb steigender Trockensubstanzanteil führt zunehmend zu Problemen bei der Rühr- und Pumpfähigkeit des Fermenterinhalts. Bei einer weiteren Steigerung der Trockensubstanzgehalte kann diese Eindickung zur Instabilität der Biozönose und damit zum weitgehenden bis vollständigen Erliegen der biologischen Prozesse und damit auch der Gasproduktion führen, was als „Fermenterabsturz" bezeichnet wird. Um eine Eindickung zu verhindern, kann durch Zugabe flüssiger Substanzen, wie zum Beispiel Wasser oder Gülle eine Verflüssigung des Fermenterinhaltes erreicht werden. Die Problematik dabei liegt bei den gesetzlichen Rahmenbedingungen (EEG), die bei Erhalt des Trockenfermentations-Bonus eine Zugabe von Substanzen, die einen geringeren Trockensubstanzanteil als durchschnittlich 30 % aufweisen, nicht gestatten. Eine Verflüssigung des Fermentermaterials durch zusätzliche Flüssigkeitszufuhr kann daher selten angewendet werden.
Bedenkt man zusätzlich zu den oben genannten Erwägungen die Knappheit der Ressource Süßwasser, so scheidet eine Verflüssigung des Fermenterinhalts durch Zugabe von Wasser aus. Gülle als Verflüssigungsstoff ist zum einen wegen des technischen Aufwandes mit hohen Kosten verbunden, zum anderen nicht überall verfügbar und außerdem von wechselnder Qualität und Güte. Außerdem ist beim Einsatz von Gülle länderspezifisch nach dem Fermentationsprozess eine Hygienisierungsstufe aus rechtlichen Gründen erforderlich, bevor der Gärrest wieder auf das Feld ausgebracht werden kann.
Es besteht daher weiterhin ein Bedarf an Verfahren zur Behandlung von Biomasse, insbesondere an effizienteren Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse für die Produktion von Biokraftstoffen sowie an Verfahren zur Erzeugung von Biogas, die eine gegenüber dem Stand der Technik erhöhte Ausbeute an Biogas ermöglichen.
Definitionen
Unter dem Begriff „Biokraftstoff' wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein flüssiger oder gasförmiger Kraftstoff bzw. Energieträger verstanden, der aus Biomasse hergestellt wird. Biokraftstoffe kommen für den Betrieb von Verbrennungsmotoren sowohl für mobile (z.B. Kraftfahrzeuge) als auch stationäre (z.B. Erzeugung von Elektro- und Wärmeengergie in einem Blockheizkraftwerk) Anwendungen zum Einsatz. Beispiele für Biokraftstoffe sind Biodiesel, Bioethanol, Biomethanol, Biokerosin, Biowasserstoff oder Biogas.
Unter dem Begriff „Bioethanol" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung Ethanol verstanden, der durch alkoholische Gärung aus Biomasse als nachwachsendem Kohlenstoffträger oder biologisch abbaubaren Anteilen von Abfällen hergestellt wurde. Er dient in verschiedenen Konzentrationen als Zusatz zu Mineralölkraftstoffen wie Biodiesel oder Biokraftstoff.
Unter dem Begriff „Biogas" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung das gasförmige Produkt des anaeroben biologischen Abbaus organischer Substrate verstanden. Es enthält in der Regel ca. 45-70 % Methan, 30-55 % Kohlendioxid, sowie geringe Mengen an Stickstoff, Schwefelwasserstoff und anderen Gasen.
Die Begriffe „Fermentation" oder „Fermentierung" umfassen im Sinne der vorliegenden Erfindung sowohl anaerobe wie auch aerobe Stoffwechselprozesse, die unter Einwirkung von Mikroorganismen in einem technischen Prozess aus dem zugeführten Substrat zur Erzeugung eines Produktes, z.B. Biogas führen. Eine Abgrenzung zu dem Begriff „Gärung" ist insofern gegeben, dass es sich bei diesem ausschließlich um anaerobe Prozesse handelt.
Unter einem „Fermenter" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung der Behälter verstanden, in dem der mikrobiologische Abbau des Substrates bei gleichzeitiger Biogasbildung stattfindet. Die Begriffe „Reaktor", „Gärbehälter" und „Faulbehälter" werden synonym verwendet.
Unter den Begriffen „Gärsubstrat" oder „Substrat" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung organisches und biologisch abbaubares Material verstanden, das dem Fermenter zur Fermentation zugesetzt wird. Substrate können nachwachsende Rohstoffe, Wirtschaftsdünger, Substrate aus der weiterverarbeitenden Agrarindustrie, kommunale organische Reststoffe, Schlachtrückstände oder Grünschnitt sein. Beispiele für solche Substrate sind Maissilage, Roggensilage, Zuckerrübenschnitzel, Melasse, Grassilage, Rinder- oder Schweinegülle, Rinder-, Schweine-, Hühner- oder Pferdemist, Biertreber, Apfel-, Obst- oder Rebentrester, Getreide-, Kartoffel- oder Obstschlempe. Organischer Abfall aus Biotonne, Speisereste, Marktabfälle, Fett aus Fettabscheidern, Panseninhalt, Schweinemageninhalt. Die Begriffe „Gärsubstrat" und „Substrat" werden synonym verwendet.
Unter dem Begriff „Gärrückstand" oder „Gärgut" wird der Rückstand der Biogasgewinnung verstanden, der den Fermenter verlässt und häufig in einem eigenen Behälter gelagert wird.
Unter „Raumbelastung" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung die pro Tag und Kubikmeter (m3) Arbeitsvolumen dem Fermenter zugeführte Menge an organischer Trockensubstanz (oTS) in kg verstanden.
Unter „organischer Trockensubstanz" (oTS) wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung der wasserfreie organische Anteil eines Stoffgemisches nach Entfernung der anorganischen Anteile und Trocknung bei 105 0C verstanden. In der Regel wird der Trockensubstanzanteil in % des Substrats angegeben.
Unter dem Begriff „Verweilzeit" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung die durchschnittliche Aufenthaltszeit des Substrates im Fermenter verstanden.
Unter dem Begriff „spezifische Biogasausbeute" oder „spezifische Methanausbeute" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Menge an erzeugtem Biogas oder Methan (angegeben in Normkubikmeter Nm3 erzeugtem Gas) dividiert durch die Menge (in der Regel pro Tonne t) an eingesetzter organischer Trockensubstanz oder Substrat verstanden.
Unter dem Begriff „Raumzeitausbeute" wird die erzeugte Menge an Biogas in Normliter (Nl) normiert auf einen Liter Gärvolumen angegeben. Diese Meßgröße dient zur besseren Vergleichbarkeit des Gasertrags verschiedener Anlagen. Von dem Begriff „Nukleotidsequenz" wird sowohl die DNA-Sequenz als auch die korrespondierende RNA-Sequenz umfasst. In der Erfindung angegebene RNA- Sequenzen unter der Verwendung der Basen A, U, C, G beziehen sich beispielsweise ebenso auf die korrespondierenden DNA-Sequenzen unter Verwendung der Basen A, T, C, G und umgekehrt.
Die Bestimmung der Nukleotid-Sequenz eines Mikroorganismus erfolgt mit Hilfe eines standardisierten Prozesses, durch den die einzelnen Nukleotide der DNA oder RNA des Mikroorganismus mit hoher Genauigkeit nachgewiesen werden können. Trotz der hohen Genauigkeit der Sequenzierungsverfahren können in einer Sequenz immer wieder einzelne Positionen vorliegen, für die die Bestimmung des an der jeweiligen Position vorliegenden Nukleotids nicht mit hinreichender Genauigkeit möglich war. In solchen Fällen ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung in der Nukleotidsequenz der Buchstabe „N" angegeben. Wird nachfolgend in einer Nukelotidsequenz der Buchstabe „N" verwendet, so steht dies als Kürzel für jedes denkbare Nukleotid, also für A, U, G oder C im Falle einer Ribonukleinsäure oder für A, T, G oder C im Falle einer Desoxyribonukleinsäure.
Der Begriff „Nukleotidmutation" wie hier verwendet, bedeutet eine Veränderung der Ausgangsnukleotidsequenz. Dabei können einzelne Nukleotide oder mehrere, direkt aufeinander folgende oder durch nicht veränderte Nukleotide unterbrochene
Nukleotidsequenzen entfernt (Deletion), hinzugefügt (Insertion oder Addition) oder durch andere ersetzt (Substitution) werden. Der Begriff schließt auch jede mögliche
Kombination der einzelnen genannten Veränderungen ein.
Der Begriff „Deletion" wie hier verwendet bedeutet das Entfernen von 1 , 2 oder mehr
Nukleotiden aus der jeweiligen Ausgangssequenz.
Der Begriff „Insertion" oder „Addition" wie hier verwendet bedeutet das Hinzufügen von 1 , 2 oder mehr Nukleotiden zu der jeweiligen Ausgangssequenz.
Der Begriff „Substitution" wie hier verwendet bedeutet den Austausch eines an einer bestimmten Position vorhandenen Nukleotids durch einen anderes. Unter dem Begriff „Mikroorganismus" werden mikroskopisch kleine Lebewesen verstanden, die in der Regel Einzeller sind, aber auch Mehrzeller sein können. Beispiele für Mikroorganismen sind Bakterien, mikroskopische Algen, Pilze oder Protozoen.
Unter den Bezeichnungen „Gattung" von Mikroorganismen, „Art" von Mikroorganismen und „Stamm" von Mikroorganismen wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung die entsprechende grundlegende Kategorie der biologischen Taxonomie, insbesondere der phylogenetischen Klassifikation verstanden. Gattungen, Arten und Stämme von Mikroorganismen werden u.a. anhand ihrer RNA-Sequenzen identifiziert und unterschieden. Unter eine bestimmte Gattung, eine bestimmte Art bzw. einen bestimmten Stamm fallen dabei nicht nur Mikroorganismen mit einer ganz bestimmten RNA-Sequenz, sondern auch bis zu einem gewissen Umfang deren genetische Varianten, wobei die genetische Varianz in der Reihe Stamm, Art, Gattung zunimmt.
Die Definition einer „Art" eines Bakteriens befindet sich im wissenschaftlichen Wandel und ist weder abgeschlossen noch sind die verschiedenen Konzepte unumstritten. In der vorliegenden Erfindung wird unter „Art" das Artkonzept verstanden, das sich auf genomische und phylogenetische Analysen bezieht und in dem Review von Staley (Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sei., 2006, 361, 1899- 1909) beschrieben ist. Weitestgehend anerkannt ist, dass zwei bakterielle Spezies, die mehr als 70 % DNA-DNA-Hydridisierung oder mehr als 94 % durchschnittliche Nukleotididentität (ANI, average nucleotide identity) aufweisen, derselben Art angehören bzw. zwei Spezies, die weniger als 97 % Identität der 16S rRNA aufweisen, zwei unterschiedlichen Arten zuzuordnen sind.
Unter dem Begriff „Kultur" versteht sich in diesem Zusammenhang eine Ansammlung von Mikroorganismen unter geschaffenen Bedingungen, die das Wachstum oder zumindest das Überleben der Mikroorganismen gewährleisten. Für Bakterien sind das z.B. Anreicherungskulturen oder Reinkulturen, Flüssigkulturen ebenso wie Kulturen auf festen Medien wie Nährböden, aber auch Dauerkulturen wie tiefgekühlte Glycerinkulturen, immobilisierte Kulturen wie z.B. Gelkulturen oder hochkonzentrierte Kulturen wie Zellpellets. Unter dem Begriff „Reinkultur" eines Mikroorganismus wird die Nachkommenschaft einer einzelnen Zelle verstanden. Diese wird durch einen mehrstufigen Prozess aus einem Gemisch verschiedener Mikroorganismen isoliert. Der mehrstufige Prozess umfasst die Abtrennung einer einzelnen Zelle aus einer Zellpopulation und erfordert, dass auch die aus der Zelle durch Wachstum und Zellteilung hervorgehende Kolonie von anderen Einzelzellen oder Kolonien getrennt bleibt. Durch eine sorgfältige Abtrennung einer Kolonie, erneutes Suspendieren in Flüssigkeit und wiederholtes Ausstreichen können gezielt Reinkulturen von Mikroorganismen gewonnen werden. Die Isolierung einer Reinkultur kann auch in flüssigen Nährmedien erfolgen, sofern der gewünschte Organismus im Ausgangsmaterial zahlenmäßig überwiegt. Durch serienmäßige Verdünnung der Suspension in der Nährlösung lässt es sich schließlich erreichen, dass sich in der letzten Verdünnungsstufe nur noch eine Zelle befindet. Diese Zelle stellt dann die Basis für eine Reinkultur dar. Die Erläuterung des Begriffs „Reinkultur" und Verfahren zur Erzeugung derselben sind in „Allgemeine Mikrobiologie" von Hans G. Schlegel, 7. überarbeitete Auflage, 1992, Georg Thieme Verlag, S. 205 aufgeführt, worauf hiermit vollinhaltlich Bezug genommen wird.
Unter dem Begriff „Mischkultur" wird ein Gemisch verschiedener Mikroorganismen verstanden. Natürliche Populationen von Mikroorganismen sind in der Regel Mischkulturen. Mischkulturen können jedoch auch künstlich hergestellt werden z.B. durch die Vereinigung von mehreren Reinkulturen.
Darstellung der Erfindung
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Behandlung von Biomasse bereitzustellen, das eine gegenüber dem Stand der Technik erhöhte Ausbeute an verwertbaren Biokraftstoffen ermöglicht.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das Verfahren zur Behandlung von Biomasse gemäß Anspruch 1 gelöst. Weitere vorteilhafte Details, Aspekte und Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen, der Beschreibung und den Beispielen.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Behandlung von Biomasse zur Verfügung. Der Biomasse wird ein Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zugesetzt.
Bevorzugt handelt es sich bei dem Verfahren zur Behandlung von Biomasse um ein Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse. Die Verwendung bzw. das Vorkommen von Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides bei der Behandlung von Biomasse oder der Erzeugung von Biogas war bisher nicht bekannt. Überraschenderweise hat sich jedoch gezeigt, dass durch die Zugabe von Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides zu einem Biomasse- Substrat die Viskosität des Substrats stark vermindert werden kann. Der Einsatz von Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides führt zu einer deutlich verstärkten Verflüssigung der Biomasse und in der Folge zu einer deutlichen Verbesserung von Effizienz und Wirkungsgrad von Anlagen zur Herstellung von Biokraftstoffen.
Ebenfalls bevorzugt handelt es sich bei dem Verfahren zur Behandlung von Biomasse um ein Verfahren zur Erzeugung von Biogas aus Biomasse. Überraschenderweise hat sich gezeigt, dass durch die Zugabe von Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides zum Gärsubstrat sowohl die Raumbelastung des Fermenters gesteigert werden kann als auch die Menge an gebildetem Biogas deutlich erhöht wird. Wie in experimentellen Untersuchungen gezeigt werden konnte, bewirkt die Zugabe eines Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides eine Steigerung der Raumbelastung eines Fermenters bis hin zu mehr als 50 %, ohne dass eine Instabilität des Fermentationsprozesses eintreten würde. Parallel zu der erhöhten Raumbelastung wird die Menge an gebildetem Biogas deutlich gesteigert. Zudem steigt die spezifische Ausbeute an Biogas an, da deutlich mehr der organischen Trockensubstanz abgebaut wird als bei fehlender Zugabe von Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides. Durch den erhöhten Abbaugrad kann eine deutlich erhöhte spezifische Gasausbeute bei einer verbesserten Substratausnutzung erzielt werden. Außerdem kann durch die Zugabe von Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides die Verweilzeit des Gärsubstrats im Fermenter bei konstanter Gasausbeute deutlich verkürzt werden, wodurch auch die Erhöhung der Raumbelastung möglich wird. Der Einsatz von Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides führt daher zu einer dramatischen Verbesserung von Effizienz und Wirkungsgrad von Biogasanlagen.
Eine mögliche Erklärung der positiven Eigenschaften der Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides liegt in einer durch deren Stoffwechselaktivität gesteigerten Hydrolyserate, so dass als Ergebnis der Stoffwechselaktivität ein Teil der vorliegenden schwer abbaubaren organischen Substanzen (z.B. Cellulose, Hemicellulose) in lösliche Säuren und CO2 übergeht. Cellulose ist in Wasser und wässrigen Lösungen unlöslich, daher führt ein Abbau der Cellulose im Fermentationsprozess zu einer Verflüssigung. Die Rühr- und Pumpfähigkeit des Materials bleibt erhalten, da der Trockensubstanzgehalt nicht weiter ansteigt. Dadurch wird eine konstante Durchmischung des Materials ermöglicht und das Gas kann aus dem Prozess besser abgeführt werden.
Durch die erhöhte Abbau- bzw. Stoffwechselleistung von Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides in der Hydrolyse-Stufe wird eine Verflüssigung des Fermentermaterials herbeigeführt, ohne dass dabei eine Versäuerung, bzw. eine Verschlechterung des Methangehaltes des entstehenden Biogases zu beobachten ist. Die Raumbelastung wird deutlich erhöht und die Stabilität des Prozesses verbessert.
Durch die erfindungsgemäße Zugabe von Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides wird also ein Verfahren bereitgestellt, das eine erhöhte Stabilität des Fermentationsprozesses gewährleistet und bei dem es zu einer Verflüssigung des Gärsubstrates kommt. Die Verflüssigung von Substrat durch den Abbau unlöslicher Bestandteile kann auch für die Produktion von Biokraftstoff aus Biomasse genutzt werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides in Form einer Kultur von Mikroorganismen zugesetzt, die überwiegend aus einem Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides besteht. In Gärsubstraten von Biogasanlagen konnten Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides nur in geringsten Spuren von weniger als 10"4 % Anteil an der gesamten Anzahl von anwesenden Mikroorganismen nachgewiesen werden. Da für die Zugabe der Mikroorganismen die Menge an aus ihrem natürlichen Vorkommen isolierten Mikroorganismen in der Regel nicht ausreicht, wird üblicherweise eine Vermehrung in Form einer Kultur vorgenommen. In der Praxis zeigt sich, dass die Zugabe der Mikroorganismen zu dem Gärsubstrat eines Fermenters am einfachsten direkt in Form einer Kultur von Mikroorganismen vorgenommen wird.
Die Zugabe der Kultur von Clostridium sporosphaeroides kann in Form einer Kultursuspension, in Form trockener, gefriergetrockneter oder feuchter Zellpellets oder auch in Form von Sporensuspensionen, Sporenpräparaten oder trockener, gefriergetrockneter oder feuchter Sporenpellets vorgenommen werden.
Da die bereits angesprochenen verschiedenen positiven Effekte auf den Gärprozess mit der Mikroorganismenart Clostridium sporosphaeroides verbunden sind, sollte diese Art von Mikroorganismen in der zugegebenen Kultur in einer das natürliche Vorkommen übersteigenden Menge anwesend sein. Selbstverständlich können Mischkulturen in beliebiger Zusammensetzung für die Zugabe verwendet werden. Voraussetzung ist lediglich, dass die Art Clostridium sporosphaeroides in einer gegenüber dem natürlichen Vorkommen angereicherten Menge anwesend ist.
Bevorzugt sind Mischkulturen von Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides mit Mikroorganismen der Arten Clostridium sartagoformum und/oder Paenibacillus macerans. Besonders bevorzugt sind Mischkulturen von Mikroorganismen des Stammes Clostridium sporosphaeroides SBG3 mit Mikroorganismen der Stämme Clostridium sartagoformum SBGI a und/oder Paenibacillus macerans SBG2. Mikroorganismen der Arten Clostridium sartagoformum und Paenibacillus macerans weisen in Bezug auf die Behandlung von Biomasse ähnliche Eigenschaften wie Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides auf, weshalb sie für den Einsatz bei der Behandlung von Biomasse prädestiniert sind. Mikroorganismen der Arten Clostridium sartagoformum und Paenibacillus macerans können daher ebenfalls in den hier beschriebenen Verfahren und Anwendungen zur Behandlung von Biomasse eingesetzt werden.
Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides werden bevorzugt in Form von Kulturen von Mikroorganismen dem Gärsubstrat zugesetzt, wobei die Kulturen von Mikroorganismen überwiegend aus Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides bestehen. Wird neben der Bestimmung der Anzahl an Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides auch die Gesamtzahl an Mikroorganismen bestimmt, so kann der Anteil an Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides in der Kultur in Prozent angegeben werden. Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides sind in einer Mischkultur dann die überwiegend anwesende Art von Mikroorganismen, wenn sie den höchsten prozentualen Anteil der verschiedenen in der Mischkultur anwesenden Arten von Mikroorganismen aufweisen.
Die Zusammensetzung der mikrobiellen Populationen in den verschiedenen Gärsubstraten sowie die Entwicklung der Organismenzusammensetzung während des Fermentationsprozesses ist größtenteils unbekannt, jedoch sehr variabel und unterliegt einem komplizierten dynamischen Prozess, der auch durch die jeweiligen Prozessbedingungen beeinflusst wird. Zur Bestimmung der mikrobiellen Zusammensetzung sowie der Gesamtzahl von Mikroorganismen in einem Gärsubstrat wie auch der Bestimmung der Anteile verschiedener Arten von Mikroorganismen in dem Gärsubstrat sind dem Fachmann verschiedene Methoden bekannt, die beispielsweise in dem Übersichtsartikel von Amann et al. (Microbiol. Review. 59, 143-169, 1995) beschrieben sind.
Eine bevorzugte Methode zur Bestimmung der Mikroorganismenzusammensetzung unabhängig von einer vorherigen Kultivierung der Mikroorganismen ist zum Beispiel die Erstellung einer rDNA Klonbibliothek (z.B. auf der Basis von 16S rRNA) nach Nukleinsäureextraktion und PCR, die anschließend sequenziert werden kann. Mit Hilfe dieser Klonbibliothek kann beispielsweise durch in situ Hybridisierung mit spezifischen Fluoreszenz-markierten Oligonukleotidsonden die Zusammensetzung der mikrobiellen Population im Gärsubstrat ermittelt werden. Geeignete rRNA- basierende Oligonukleotidsonden sind aus dem oben erwähnten Review bekannt oder können beispielsweise mittels probeBase (Loy et al., 2003, Nucleic Acids Res. 31 514-516. Loy et al., 2007. Nucleic Acids Res. 35: D800-D804) oder dem ARB Programmpaket (Ludwig et al., Nucleic Acids Research. 2004, 32, 1363-1371 ) gefunden werden. Eine quantitative Bestimmung des Anteils einzelner Mikroorganismen an der Gesamtpopulation kann in geeigneter Weise mit den Methoden quantitativer Dot Blot, in situ Hybridisierung oder der Hybridisierung von ganzen Zellen (whole cell hybrisization) durchgeführt werden.
Gemäß bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung macht der Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides zumindest 10"4 % der Gesamtzahl an in der zu dem Gärsubstrat zugegebenen Kultur vorhandenen Mikroorganismen aus. Besonders bevorzugt macht der Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides zumindest 10 "2 % der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen
Mikroorganismen aus und insbesondere bevorzugt macht der Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides zumindest 1 % der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen aus.
Gemäß weiteren bevorzugten Ausführungsformen macht der Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides zumindest 10 % der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen aus, besonders bevorzugt macht der Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides zumindest 50 % der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen aus und insbesondere bevorzugt macht der Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides zumindest 90 % der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen aus.
Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsformen wird eine Reinkultur eines Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zugesetzt. Die Reinkultur ist biochemisch durch spezifische Stoffwechselprozesse und -aktivitäten, sowie durch spezielle Wachstumsbedingungen gekennzeichnet. Aufgrund der spezifischen Stoffwechselprozesse und -aktivitäten kann die Zugabe einer Reinkultur eines fermentativen Mikroorganismus in besonderem Maße zu einer verbesserten Kontrolle des komplexen Biogaserzeugungsprozesses beitragen. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides als Bestandteil zumindest einer immobilisierten Kultur von Mikroorganismen zugesetzt. Da für die Zugabe der Mikroorganismen die Menge an aus ihrem natürlichen Vorkommen isolierten Mikroorganismen nicht ausreicht, wird üblicherweise eine Vermehrung in Form einer Kultur vorgenommen. In der Praxis zeigt sich, dass die Zugabe der Mikroorganismen zu dem Gärsubstrat eines Fermenters am einfachsten in Form einer immobilisierten Kultur von Mikroorganismen vorgenommen wird.
Da die bereits angesprochenen verschiedenen positiven Effekte auf den Gärprozess mit der Mikroorganismenart Clostridium sporosphaeroides verbunden sind, sollte diese Art von Mikroorganismen in der zugegebenen immobilisierten Kultur in einer im Vergleich zum natürlichen Vorkommen angereicherten Menge anwesend sein. Selbstverständlich können immobilisierte Mischkulturen in beliebiger Zusammensetzung für die Zugabe verwendet werden. Voraussetzung ist lediglich, dass Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides in einer Menge enthalten sind, die deren natürliches Vorkommen übersteigt.
Gemäß bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung macht der Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zumindest 10 Λ % der
Gesamtzahl an in der zu dem Gärsubstrat zugegebenen immobilisierten Kultur vorhandenen Mikroorganismen aus. Besonders bevorzugt macht der
Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zumindest 10 "2 % der
Gesamtzahl an in der immobilisierten Kultur vorhandenen Mikroorganismen aus und insbesondere bevorzugt macht der Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zumindest 1 % der Gesamtzahl an in der immobilisierten Kultur vorhandenen Mikroorganismen aus.
Gemäß weiteren bevorzugten Ausführungsformen macht der Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zumindest 10 % der Gesamtzahl an in der immobilisierten Kultur vorhandenen Mikroorganismen aus, besonders bevorzugt macht der Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zumindest 50 % der Gesamtzahl an in der immobilisierten Kultur vorhandenen Mikroorganismen aus und insbesondere bevorzugt macht der Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zumindest 90 % der Gesamtzahl an in der immobilisierten Kultur vorhandenen Mikroorganismen aus.
Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsformen wird zumindest eine immobilisierte Reinkultur eines Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zugesetzt.
Als Trägermaterialien, auf denen der Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides immobilisiert wird, können natürliche oder synthetische Polymere eingesetzt werden. Bevorzugt werden gelbildende Polymere verwendet. Diese haben den Vorteil, dass Bakterien innerhalb der Gelstruktur aufgenommen bzw. eingelagert werden können. Bevorzugt werden solche Materialien eingesetzt, die sich in Wasser langsam auflösen bzw. abgebaut werden, so dass die Freisetzung des Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides über einen längeren Zeitraum hinweg erfolgt.
Beispiele für geeignete Polymere sind Polyanillin, Polypyrrol, Polyvinylpyrolidon, Polystyrol, Polyvinylchlorid, Polyvinylalkohol, Polyethylen, Polypropylen, Epoxidharze, Polyethylenimine, Polysaccharide wie Agarose, Alginat oder Cellulose, Ethylcellulose, Methylcellulose, Carboxymethylethylcellulose, Celluloseacetate, Alkali-Cellulosesulfat, Copolymere aus Polystyrol und Maleinsäureanhydrid, Copolymere aus Styrol und Methylmethacrylat, Polystyrolsulfonat, Polyacrylate und Polymethacrylate, Polycarbonate, Polyester, Silikone, Cellulosephthalat, Proteine wie Gelatine, Gummi arabicum, Albumin oder Fibrinogen, Gemische aus Gelatine und Wasserglas, Gelatine und Polyphosphat, Gelatine und Copolymere aus Maleinsäureanhydrid und Methylvinylether, Celluloseacetatbutyrat, Chitosan, Polydialkyldimethylammonium-chlorid, Mischungen aus Polyacrylsäuren und Polydiallyldimethylammoniumchlorid sowie deren Gemische. Das Polymermaterial kann auch mit Hilfe üblicher Vernetzer wie Glutaraldehyd, Harnstoff/Formaldehydharzen oder Tanninverbindungen vernetzt werden.
Alginate als Immobilisate erweisen sich als besonders vorteilhaft, da sie zum einen keinen negativen Einfluss auf die Aktivität des Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides nehmen und da sie zum anderen durch Mikroorganismen langsam abgebaut werden. Durch den langsamen Abbau der Alginat-Immobilisate werden nach und nach die eingeschlossenen Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides freigesetzt.
Für die Immobilisierung werden die Mikroorganismen mit einem Polymergel vermengt und dann in einer geeigneten Härterlösung gehärtet. Dazu werden sie zunächst mit einer Gellösung vermischt und anschließend in eine Härterlösung aus geeigneter Höhe getropft. Die genauen Vorgehensweisen zur Immobilisierung sind dem Fachmann bekannt.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird zeitnah zur Zugabe der nachfolgend beschriebenen Mikroorganismen zusätzliche Biomasse in den Fermentierungsreaktor gegeben. Eine zeitnahe Zugabe von zusätzlicher Biomasse kann innerhalb einer Zeitspanne von 1 Sekunde bis hin zu 3 Tagen nach Zugabe von Mikroorganismen erfolgen oder sie kann gleichzeitig mit der Zugabe von Mikroorganismen erfolgen. Dabei kann die Raumbelastung im Fermentationsreaktor durch kontinuierliche Zugabe von neuem Substrat kontinuierlich gesteigert oder in etwa konstant gehalten werden, wobei die Fermentierung bei allen Raumbelastungen, bevorzugt bei einer Raumbelastung von ≥ 0.5 kg organischer Trockensubstanz pro m3 und Tag [kgoTS/m3d], weiter bevorzugt bei einer Raumbelastung von ≥ 4.0 kgoTS/m3d und besonders bevorzugt bei einer Raumbelastung von ≥ 8.0 kgoTS/m3d durchgeführt werden kann, was im Vergleich zum gegenwärtigen Stand der Technik einer Erhöhung der Raumbelastung um mehr als das Doppelte entspricht.
Das verwendete Gärsubstrat kann insbesondere auch einen hohen Anteil an festen Bestandteilen aufweisen. Durch die Zugabe eines hydrolytisch aktiven, fermentativen Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides werden diese festen Bestandteile zumindest teilweise verflüssigt. Durch die erzielte Verflüssigung des Gärsubstrats aufgrund der Zugabe des Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides kann einem Eindicken des Fermentermaterials vorgebeugt und gezielt entgegengewirkt werden. Ein weiterer Flüssigkeitseintrag in das Gärsubstrat in Form von Wasser oder Gülle während der Fermentierung kann vermieden werden. Somit besteht ein weiterer Vorteil in der Schonung der Ressource Süßwasser. Ebenfalls von Vorteil ist der so erzielte Erhalt der Rühr- und Pumpfähigkeit des Substrats. Dadurch werden Rührwerke und Pumpen geschont und für den Rührvorgang ist deutlich weniger Energie erforderlich.
Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides können also auch zur Verflüssigung von Biomasse in der alkoholischen Gärung mit dem Ziel der Produktion von Biokraftstoff verwendet werden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform erfolgt die Behandlung von Biomasse unter konstanter Durchmischung des Gärsubstrats. Durch die konstante Durchmischung des Gärsubstrats können die Kulturen von Clostridium sporosphaeroides besser im Gärsubstrat verteilt werden. Im Falle der Biogasherstellung kann außerdem das gebildete Biogas besser aus dem Fermentationsprozess abgeführt werden.
Die konstante Durchmischung des Gärsubstrats führt zudem zu einer gleichmäßigen Wärmeverteilung im Fermentationsreaktor. Messungen der Temperatur im Fermentationsreaktor, die in periodischen Abständen, aber auch kontinuierlich durchgeführt wurden, ergaben, dass das Gärsubstrat in einem Temperaturbereich von 20 0C bis 80 0C, bevorzugt bei etwa 35 0C bis 60 0C, besonders bevorzugt bei 40 0C bis 50 0C effizient fermentiert wird. Diese Temperaturbereiche werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung daher bevorzugt. Neben der Hydrolyse erfolgt insbesondere die letzte Stufe des Fermentationsprozesses, nämlich die Bildung von Methan durch methanogene Mikroorganismen, besonders effizient bei erhöhten Temperaturen. Für mehrstufige Biogasanlagen ist es auch sinnvoll, die unterschiedlichen Reaktoren bei unterschiedlichen Temperaturen zu betreiben, z.B. die erste Stufe unter mesophilen Bedingungen und die nachgeordneten Stufen, insbesondere die Methanogenese, bei thermophilen Bedingungen. Geeignete Bedingungen hierfür sind aus dem Stand der Technik bekannt (z.B. DE 10 2005 012367 A1 ).
Sämtliche Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind nicht auf einstufige Verfahren zur Herstellung von Biogas beschränkt. Der Einsatz von Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides kann auch in zwei- oder mehrstufigen Verfahren erfolgen. Ebenso können Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides in Verfahren zur Erzeugung von flüssigen Biokraftstoffen eingesetzt werden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden Gärsubstrat und ein Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides kontinuierlich zugegeben. Der kontinuierliche Betrieb eines Fermentationsreaktors soll bei einer stabilen mikrobiellen Biozönose zu einer kontinuierlichen Produktion von Biogas führen, wobei das Aussetzen der Substratzugabe zur Fermentation infolge einer Prozessstörung vermindert werden soll.
Ebenfalls ist die Ausführung dieses Fermentationsverfahrens und der damit zusammenhängenden Prozesse auch in einem diskontinuierlichen Betrieb, beispielsweise „Batch"-Fermentierung denkbar. So kann dem Gärsubstrat gemäß einer weiteren Ausführungsform während der Fermentierung der Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides beispielsweise in regelmäßigen Abständen zugegeben werden. Die Zugabe des Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides in regelmäßigen Abständen führt zu einer Steigerung der Lebendzellzahl und somit zu einem verbesserten Ablauf der fermentativen Prozesse, beispielsweise der Hydrolyse bei einer gleichzeitig verbesserten Ausnutzung des Gärsubstrats für die Fermentierung.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides in einer Menge zu dem Gärsubstrat zugegeben, so dass nach Zugabe der Anteil des Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zwischen 10"8 % und 50 % der Gesamtzahl an in dem Gärsubstrat anwesenden Mikroorganismen ausmacht. Insbesondere in Abhängigkeit von der Fermentergröße und damit in Abhängigkeit von der Menge an Gärsubstrat kann zur Erzielung der gewünschten Wirkung eine Zugabe von sehr stark unterschiedlichen Mengen an Mikroorganismen notwendig werden.
Sowohl die Bestimmung der Gesamtzahl von Mikroorganismen in dem Gärsubstrat wie auch die Bestimmung der Anteile verschiedener Arten von Mikroorganismen im Gärsubstrat stellt für den Fachmann kein Problem dar. So kann beispielsweise mit Hilfe von Fluoreszenz-markierten Oligosonden spezifisch der Anteil verschiedener Mikroorganismen in dem Gärsubstrat nach dem weiter oben beschriebenen Verfahren identifiziert werden
Besonders bevorzugt wird ein Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides in einer Menge zu dem Gärsubstrat zugegeben, dass nach Zugabe der Anteil des Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zwischen 10"6 % und 25 % der Gesamtzahl an in dem Gärsubstrat anwesenden Mikroorganismen ausmacht. Insbesondere bevorzugt wird der Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides in einer Menge zu dem Gärsubstrat zugegeben, dass nach Zugabe der Anteil des Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zwischen 10"4 % und 10 % der Gesamtzahl an in dem Gärsubstrat anwesenden Mikroorganismen ausmacht. Ganz besonders bevorzugt wird der Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides in einer Menge zu dem Gärsubstrat zugegeben, dass nach Zugabe der Anteil des Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zwischen 10"3 % und 1 % der Gesamtzahl an in dem Gärsubstrat anwesenden Mikroorganismen ausmacht.
Grundsätzlich kann der Zusatz von Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides zu jedem beliebigen Zeitpunkt des Fermentationsprozesses erfolgen kann, insbesondere können Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides auch zum Animpfen von Gärsubstrat bei der erstmaligen Inbetriebnahme oder einer Wiederinbetriebnahme eines Fermenters verwendet werden. Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides können in Form einer Kultur einmalig oder mehrmalig in regelmäßigen oder unregelmäßigen Abständen, bevorzugt jedoch wöchentlich oder monatlich, besonders bevorzugt täglich oder zweimal bis fünf mal pro Woche in einer geeigneten Konzentration und Menge zugegeben werden. Geeignete Konzentrationen an Mikroorganismen und zugegebenen Mengen wurden bereits genannt bzw. werden in den Ausführungsbeispielen beschrieben.
Ebenso ist es möglich Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides bei Störungen des Fermentationsprozesses zur Stabilisierung der Fermentation zuzugeben. Solche Störungen können durch Überwachung bestimmter charakteristischer Parameter der Fermentierung frühzeitig erkannt werden. Charakteristische Parameter geben Auskunft über die Qualität eines ablaufenden Fermentierungsprozesses zur Herstellung von Biogas. Solche charakteristischen Parameter sind nicht nur die Menge an erzeugtem Biogas und der Methangehalt des erzeugten Biogases sondern beispielsweise auch der Wasserstoffgehalt des erzeugten Biogases, der pH-Wert des Gärsubstrats, das Redoxpotential des Gärsubstrats, der Carbonsäuregehalt des Gärsubstrats, die Anteile verschiedener Carbonsäuren im Gärsubstrat, der Wasserstoffgehalt des Gärsubstrats, der Anteil der Trockensubstanz am Gärsubstrat, der Anteil der organischen Trockensubstanz am Gärsubstrat, die Viskosität des Gärsubstrats und die Raumbelastung des Fermentierungsreaktors.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung eines Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zur Behandlung von Biomasse.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung eines Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zur Verflüssigung von Biomasse.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung eines Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung der durch eines der beschriebenen Verfahren erhaltenen verflüssigten Biomasse zur Herstellung von Biokraftstoff. Bevorzugt wird die durch eines der beschriebenen Verfahren erhaltene verflüssigte Biomasse zur Herstellung von Bioethanol eingesetzt.
Ebenso umfasst die vorliegende Erfindung den Stamm des Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides SBG3, wie er unter der Nr. DSM 22577 hinterlegt ist. Der Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides SBG3 wurde in einer Reinkultur bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH in Braunschweig gemäß dem Budapester Vertrag hinterlegt. Die Bezeichnung lautet: Clostridium sporosphaeroides SBG3 mit der Hinterlegungsnummer DSM 22577. Ebenso umfasst die vorliegende Erfindung den Stamm des Mikroorganismus Clostridium sartagoformum SBGIa, wie er unter der Nr. DSM 22578 hinterlegt ist. Der Mikroorganismus Clostridium sartagoformum SBGIa wurde in einer Reinkultur bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH in Braunschweig gemäß dem Budapester Vertrag hinterlegt. Die Bezeichnung lautet: Clostridium sartagoformum SBGIa mit der Hinterlegungsnummer DSM 22578.
Bakterien der Art Clostridium sporosphaeroides können mit Hilfe von dem Fachmann bekannten Methoden aus dem Gärsubstrat oder Gärrest eines Fermenters isoliert werden. Dabei wird ein geeignetes Substrat aus einem Fermenter in ein Selektionsmedium eingebracht, über längere Zeit kultiviert und schließlich einzelne Kolonien von Mikroorganismen aus dem Selektionsmedium isoliert. Nach Vervielfältigung der daraus erhaltenen mikrobiellen DNA mittels PCR können auf der Basis der DNA Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides ausgewählt werden.
Bakterien Clostridium sporosphaeroides SBG3 wurden aus dem Gärsubstrat eines Nachgärers isoliert. Dazu wurde durch ein flüssiges Selektionsmedium Stickstoff und Kohlendioxid durchgeleitet, anschließend Na2S zu dem Selektionsmedium zugegeben und autoklaviert (20 Min. bei 1210C). Dann wurde die aus dem Nachgärer gewonnene Biomasse in das Selektionsmedium eingebracht und für zumindest eine Woche bei einer Temperatur von mindestes 30 0C kultiviert. Eine aus dem flüssigen Selektionsmedium gewonnene Probe wurde auf ein festes Selektionsmedium aufgebracht und nachfolgend die auf dem festen Selektionsmedium gewachsenen Kolonien von Mikororganismen ausgewählt. Nach Vervielfältigung der erhaltenen mikrobiellen DNA mittels PCR konnte ein Vergleich mit bekannten DNA-Sequenzen durchgeführt werden.
Nachdem die Bakterien Clostridium sporosphaeroides SBG3 erfolgreich aus dem Gärsubstrat des Nachgärers isoliert worden waren, wurden diese Mikroorganismen einer Sequenzanalyse unterzogen. Es wurde eine Teilsequenz der 16S rRNA bestimmt, die dann in die entsprechende DNA-Sequenz transformiert wurde. Die DNA-Sequenz SEQ ID Nr. 1 umfasst 1409 Nukleotide. Als nächster Verwandter wurde der Mikroorganismus Clostridium sp. Klon 1099982248072 identifiziert, der aus einer Stuhlprobe eines Babys stammte und so mit der technischen Erzeugung von Biokraftstoffen in keiner Weise zusammenhängt (Genbank Identifikationsnummer EF434352, Länge der Sequenz 1340 Nukleotide). Ein Vergleich der Sequenzen ergab, dass bei der Sequenz von Clostridium sp. Klon 1099982248072 im Vergleich zu SEQ ID Nr. 1 insgesamt 46 Austausche von Nukleotiden oder Lücken vorlagen. Bei einer Länge der Sequenz von Clostridium sp. Klon 1099982248072 von 1340 Nukleotiden errechnet sich eine Identität von 96, 57 %.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Mikroorganismen mit einer Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz aufweist, die einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 96,57 % Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist. Besonders bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 96,58 % oder mehr als 96,59 % oder mehr als 96,60 % oder mehr als 96,65 % oder mehr als 96,70 % oder mehr als 96,75 % oder mehr als 96,80 % oder mehr als 96,90 % oder mehr als 97,0 % oder mehr als 97,1 % oder mehr als 97,2 % oder mehr als 97,3 % oder mehr als 97,4 % oder mehr als 97,5 % oder mehr als 97,6 % oder mehr als 97,7 % oder mehr als 97,8 % oder mehr als 97,9 % Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist.
Besonders bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 98,0 % Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist. Insbesondere bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 98,1 % oder mehr als 98,2 % oder mehr als 98,3 % oder mehr als 98,4 % oder mehr als 98,5 % oder mehr als 98,6 % oder mehr als 98,7 % oder mehr als 98,8 % oder mehr als 98,9 % Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist und insbesondere bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 99 % Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist.
Gemäß weiterer bevorzugter Ausführungsformen weist der Mikroorganismus eine Nukleotidsequenz auf, die einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 99,5 % Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist und besonders bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 99,8 % Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist.
Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 entspricht.
In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können gegenüber der Ausgangsnukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 an einer Position oder an zwei Positionen oder an drei Positionen oder an vier Positionen oder an fünf Positionen oder an sechs Positionen oder an sieben Positionen oder an acht Positionen oder an neun Positionen oder an zehn Positionen oder an elf Positionen oder an zwölf Positionen oder an 13 Positionen oder an 14 Positionen oder an 15 Positionen oder an 16 Positionen oder an 17 Positionen oder an 18 Positionen oder an 19 Positionen oder an 20 Positionen oder an 21 Positionen oder an 22 Positionen oder an 23 Positionen oder an 24 Positionen oder an 25 Positionen oder an 26 Positionen oder an 27 Positionen oder an 28 Positionen oder an 29 Positionen oder an 30 Positionen oder an 31 Positionen oder an 32 Positionen oder an 33 Positionen oder an 34 Positionen oder an 35 Positionen oder an 36 Positionen oder an 37 Positionen oder an 38 Positionen oder an 39 Positionen oder an 40 Positionen oder an 41 Positionen oder an 42 Positionen oder an 43 Positionen oder an 44 Positionen oder an 45 Positionen oder an 46 Positionen Nukleotidmutationen vorliegen. Die Bedeutung des Begriffs „Nukleotidmutation" ist im Abschnitt „Definitionen" des vorliegenden Textes erläutert.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch eine Kultur von Mikroorganismen geeignet zum Einsatz in einem Verfahren zur Behandlung von Biomasse, insbesondere einem Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse und/oder einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse, wobei in der Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend ist, der eine Nukleotidsequenz aufweist, die einen Sequenzbereich enthält, der zumindest 96,57 % Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist, wobei der Mikroorganismus zumindest 10"4 % der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht. Bevorzugt ist in der zum Einsatz in einem Verfahren zur Behandlung von Biomasse, insbesondere einem Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse und/oder einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse geeigneten Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend, der eine Nukleotidsequenz mit einem Sequenzbereich besitzt, der mehr als 96,57 % Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist. Besonders bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 96,58 % oder mehr als 96,59 % oder mehr als 96,60 % oder mehr als 96,65 oder mehr als 96,70 oder mehr als 96,75 oder mehr als 96,80 % oder mehr als 96,90 % oder mehr als 97,0 % oder mehr als 97,1 % oder mehr als 97,2 % oder mehr als 97,3 % oder mehr als 97,4 % oder mehr als 97,5 % oder mehr als 97,6 % oder mehr als 97,7 % oder mehr als 97,8 % oder mehr als 97,9 % Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist
Insbesondere bevorzugt ist in der zum Einsatz in einem Verfahren zur Behandlung von Biomasse, insbesondere einem Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse und/oder einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse geeigneten Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend, der eine Nukleotidsequenz mit einem Sequenzbereich besitzt, der mehr als 98 % Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist. Besonders bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 98,1 % oder mehr als 98,2 % oder mehr als 98,3 % oder mehr als 98,4 % oder mehr als 98,5 % oder mehr als 98,6 % oder mehr als 98,7 % oder mehr als 98,8 % oder mehr als 98,9 % Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist und insbesondere bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 99,0 % Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist.
Gemäß weiteren bevorzugten Ausführungsformen ist in der zum Einsatz in einem Verfahren zur Behandlung von Biomasse, insbesondere einem Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse und/oder einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse geeigneten Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend, der eine Nukleotidsequenz mit einem Sequenzbereich besitzt, der mehr als 99,5 % Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist. Ganz besonders bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 99,8 % Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist.
Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform ist in der zum Einsatz in einem Verfahren zur Behandlung von Biomasse, insbesondere einem Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse und/oder einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse geeigneten Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend, der eine Nukleotidsequenz aufweist, die einen Sequenzbereich enthält, der der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 entspricht.
Gemäß weiterer bevorzugter Ausführungsformen macht der Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides zumindest 10"2 %, bevorzugt zumindest 1 % der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen aus. Besonders bevorzugt macht der Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides zumindest 10 %, insbesondere bevorzugt zumindest 25 % der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
Ganz besonders bevorzugt macht der Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides zumindest 50 %, insbesondere zumindest 90 % der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen aus. Besonders bevorzugt handelt es sich um eine Reinkultur von Mikroorganismen geeignet zum Einsatz in einem
Verfahren zur Behandlung von Biomasse, insbesondere einem Verfahren zur
Verflüssigung von Biomasse und/oder einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse, wobei es sich um eine Reinkultur des
Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides SBG3 wie er oben in Bezug auf seine Nukleotidsequenz charakterisiert wurde, handelt.
Besonders bevorzugt handelt es sich in den oben beschriebenen Fällen um eine immobilisierte Kultur von Mikroorganismen.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch eine immobilisierte Kultur von Mikroorganismen geeignet zum Einsatz in einem Verfahren zur Behandlung von Biomasse, insbesondere einem Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse und/oder einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse, wobei in der immobilisierten Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend ist, der eine Nukleotidsequenz aufweist, die einen Sequenzbereich enthält, der zumindest 96,57 % Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist.
Bevorzugt ist in der zum Einsatz in einem Verfahren zur Behandlung von Biomasse, insbesondere einem Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse und/oder einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse geeigneten immobilisierten Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend, der eine Nukleotidsequenz mit einem Sequenzbereich besitzt, der mehr 96,57 % Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist. Besonders bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 96,58 % oder mehr als 96,59 % oder mehr als 96,60 % oder mehr als 96,65 oder mehr als 96,70 oder mehr als 96,75 oder mehr als 96,80 % oder mehr als 96,90 % oder mehr als 97,0 % oder mehr als 97,1 % oder mehr als 97,2 % oder mehr als 97,3 % oder mehr als 97,4 % oder mehr als 97,5 % oder mehr als 97,6 % oder mehr als 97,7 % oder mehr als 97,8 % oder mehr als 97,9 %oder mehr als 98,0 % oder mehr als 98,1 % oder mehr als 98,2 % oder mehr als 98,3 % oder mehr als 98,4 % oder mehr als 98,5 % oder mehr als 98,6 % oder mehr als 98,7 % oder mehr als 98,8 % oder mehr als 98,9 %Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist. Insbesondere bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 99,0 % Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist.
Gemäß weiteren bevorzugten Ausführungsformen ist in der zum Einsatz in einem Verfahren zur Behandlung von Biomasse, insbesondere einem Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse und/oder einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse geeigneten immobilisierten Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend, der eine Nukleotidsequenz die einen Sequenzbereich besitzt, der mehr als 99,5 % Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist. Ganz besonders bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 99,8 % Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist. Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform ist in der zum Einsatz in einem Verfahren zur Behandlung von Biomasse, insbesondere einem Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse und/oder einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse geeigneten immobilisierten Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend, der eine Nukleotidsequenz aufweist, die einen Sequenzbereich enthält, der der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 entspricht.
Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem die Verwendung von Mikroorganismen wie sie oben mit Bezug auf ihre Nukleotidsequenz charakterisiert wurden in einem Verfahren zur Behandlung von Biomasse. Bevorzugt werden diese Mikroorganismen in einem der oben näher erläuterten Verfahren zur Behandlung von Biomasse verwendet.
Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem die Verwendung von Mikroorganismen wie sie oben mit Bezug auf ihre Nukleotidsequenz charakterisiert wurden in einem Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse. Bevorzugt werden diese Mikroorganismen in einem der oben näher erläuterten Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse verwendet.
Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem die Verwendung von Mikroorganismen wie sie oben mit Bezug auf ihre Nukleotidsequenz charakterisiert wurden in einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse. Bevorzugt werden diese Mikroorganismen in einem der oben näher erläuterten Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse verwendet.
Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem die Verwendung einer Kultur von Mikroorganismen wie sie oben mit Bezug auf ihre Nukleotidsequenz charakterisiert wurden in einem Verfahren zur Behandlung von Biomasse. Bevorzugt werden diese Kulturen von Mikroorganismen in einem der oben näher erläuterten Verfahren zur Behandlung von Biomasse verwendet.
Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem die Verwendung einer Kultur von Mikroorganismen wie sie oben mit Bezug auf ihre Nukleotidsequenz charakterisiert wurden in einem Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse. Bevorzugt werden diese Kulturen von Mikroorganismen in einem der oben näher erläuterten Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse verwendet.
Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem die Verwendung einer Kultur von Mikroorganismen wie sie oben mit Bezug auf ihre Nukleotidsequenz charakterisiert wurden in einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse. Bevorzugt werden diese Kulturen von Mikroorganismen in einem der oben näher erläuterten Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse verwendet.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Zur Illustration der Erfindung und zur Verdeutlichung ihrer Vorzüge werden nachfolgend Ausführungsbeispiele angegeben. Die Ausführungsbeispiele sollen im Zusammenhang mit den Figuren 1 bis 4 näher erläutert werden. Es versteht sich von selbst, dass die im Zusammenhang mit den Ausführungsbeispielen gemachten Angaben die Erfindung nicht beschränken sollen. Es zeigen:
Fig. 1 Einen Substratfließtest zur Untersuchung des Ausmaßes der Verflüssigung von Gärsubstrat;
Fig. 2 Messergebnisse einer Fermentierung: Aufgetragen ist der Gasertrag als Raumzeitausbeute (N l/l ) und die Raumbelastung des Fermenters gegen die Zeit;
Fig. 3 Messergebnisse einer weiteren Fermentierung: Aufgetragen ist der Gasertrag als Raumzeitausbeute (N l/l ) und die Raumbelastung des Fermenters gegen die Zeit;
Fig. 4 Messergebnisse einer weiteren Fermentierung: Aufgetragen ist der Gasertrag als Raumzeitausbeute (N l/l ) und die Raumbelastung des Fermenters gegen die Zeit. Wege zur Ausführung der Erfindung
Bakterien Clostridium sporosphaeroides SBG3 wurden erfolgreich aus dem Gärsubstrat eines Nachgärers isoliert. Die Hinterlegung des Organismus erfolgte in einer Reinkultur bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) gemäß dem Budapester Vertrag (Clostridium sporosphaeroides SBG3 mit der Hinterlegungsnummer DSM 22577).
Bakterien Clostridium sartagoformum SBGIa wurden ebenfalls erfolgreich aus dem Gärsubstrat eines Nachgärers isoliert. Die Hinterlegung des Organismus erfolgte in einer Reinkultur bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) gemäß dem Budapester Vertrag (Clostridium sartagoformum SBGIa mit der Hinterlegungsnummer DSM 22578).
Wie den folgenden Ausführungsbeispielen zu entnehmen ist, weisen Bakterien des Stammes Clostridium sartagoformum SBGIa sowohl in Mischkultur als auch in Reinkultur erfindungsgemäße Eigenschaften ähnlich denen zu Bakterien des Stammes Clostridium sporosphaeroides SBG3 auf, wie z.B. eine Erhöhung der Raumbelastung, eine Erhöhung der Gasausbeute und eine Stabilisierung des Biogasprozesses sowie die Fähigkeit zur Verflüssigung von Biomasse.
Sofern nachfolgend nicht anders angegeben, wurden molekularbiologische Standardmethoden verwendet, wie z.B. von Sambrook et al., 1989, Molecular cloning: A Laboratory Manual 2. Auflage, CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, New York, beschrieben.
Isolierung und Anreicherung der Mikroorganismen
Bakterien des Stammes Clostridium sporosphaeroides SBG3 wurden erfolgreich aus dem Gärsubstrat eines Nachgärers isoliert. Die Isolierung der Mikroorganismen erfolgte mithilfe eines Selektionsmediums, das Carboxymethylcellulose (CMC) als einzige Kohlenstoffquelle enthielt. Carboxymethylcellulose besitzt sehr große Ähnlichkeit mit der in Gärsubstraten von Biogasanlagen enthaltenen Cellulose und weist zudem durch die Verknüpfung der Hydroxylgruppen mit Carboxymethylgruppen (-CH2-COOH-) eine verbesserte Löslichkeit in wässrigem Medium auf. Das zur Selektion von Clostridium sporosphaeroides SBG3 eingesetzte Medium (DSMZ Medium 520 plus 1 % CMC und 0,2 % Hefeextrakt) wurde mit N2 begast, damit die Selektion unter anaeroben Bedingungen erfolgen konnte. Enthaltener Restsauerstoff wurde mit Hilfe von 0,5 g/l Na2S reduziert.
Das Selektionsmedium wurde anschließend mit dem Überstand von Material aus einem Nachgärer (1 :2000 verdünnt) beimpft. Nach einer einwöchigen Kultivierung bei 400C zeigten sich bei mikroskopischer Analyse einzelne Stäbchen. Eine weitere Selektion der Flüssigkulturen und eine Isolierung bis hin zu Reinkulturen erfolgte durch den Ausstrich auf anaeroben Carboxymethylcellulose-Platten.
Für größere Mengen an Bakterien des Stammes Clostridium sporosphaeroides SBG3 (z.B. für die Zugabe in den Fermentertyp 3) erfolgte die Anzucht unter den angegebenen Bedingungen in einem 1 m3 Fermenter, der mit 100 ml Vorkultur beimpft wurde. Da das Wachstum mit einer Verdopplungszeit von etwa 2 h recht schnell erfolgt, erscheint Clostridium sporosphaeroides SBG3 für eine biotechnologische Anwendung besonders geeignet. Kleinere Mengen an Bakterien (z.B. für die Zugabe in den Fermentertypen 1 , 2 und 4) wurden im 500 ml bis 1 I Maßstab kultiviert. Die Kultivierung für den Zusatz zu einem Fermentationsprozess erfolgte über einen Zeitraum von 1 bis 2 Tagen. Es wurden Zelldichten im Bereich von 108 bis 1010 Zellen pro ml Kulturmedium erreicht. Die Bakterienzellen wurden durch Zentrifugation geerntet und in einem möglichst geringen Volumen frischen Mediums aufgenommen bevor sie im Fermentationsprozess verwendet wurden. Zur Zwischenlagerung wurden die Zellen eingefroren.
Mikroorganismen der Arten Clostridium sartagoformum und Paenibacillus macerans , z.B. für die Verwendung von Mischkulturen mit in etwa gleichen Anteilen an den 3 erwähnten Mikroorganismen konnten unter den gleichen Bedingungen kultiviert werden.
DNA-Isolierung und Nukleotidsequenzbestimmunq
Das Zellmaterial der gewachsenen vereinzelten Kolonien diente zur Vervielfältigung der mikrobiellen DNA mittels der Colony-PCR Methode nach einem Standard- Programm. Zur Bestimmung der 16S rRNA Sequenz wurde aus der Zeil-DNA über PCR das Gen für die 16S rRNA amplifiziert. Dafür wurden die Primer mit den Sequenzen GRGTTTGATCCTGGCTCAG und ACGGHTACCTTGTTACGACTT verwendet (angegeben in 5"→ 3"Richtung; H bedeutet C, T oder A). Die als PCR-Produkte erhaltenen DNA-Stücke wurden dann in einen Klonierungsvektor kloniert (Ligation mit dem QIAGEN PCR-Cloning-Kit der Firma QIAGEN/Hilden unter Verwendung des Vektors p-Drive), in E.coli transformiert (gemäß QIAGEN PCR-Cloning- Handbook) und mittels Colony-PCR untersucht. Die erhaltenen Colony-PCR- Produkte wurden einer Restriktionsfragment-Längenpolymorphismen-Analyse (RFLP) zur Auswahl geeigneter Klone unterzogen. Aus den jeweiligen Klonen wurde die entsprechende Plasmid-DNA isoliert und nach der Kettenabbruchmethode (Sanger et al., 1977) sequenziert.
Sequenzanalvse
Nach der Sequenzanalyse der Kolonien konnte die 16S rDNA bzw. ihre Transformation in die korrespondierende 16S rRNA mit dem Programmpaket ARB (Ludwig et al., Nucleic Acids Research. 2004. 32, 1363-1371 ) phylogenetisch analysiert und als Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides klassifiziert werden. Anhand einer Analyse der Monierten 16S rDNA bzw. der korrespondierenden 16S rRNA Sequenz mittels BLAST-Programm (basic local alignment search tool) der Datenbank www.ncbi.nlm.nih.gov wurde der Clostridium sp. Klon 1099982248072 als nächster Verwandter ermittelt.
Verflüssigung von cellulosehaltiqem Medium
Versuche mit einer Reinkultur des hydrolytisch aktiven, fermentativen Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides SBG3 zeigten, dass der Zusatz zum stark zähflüssigen, viskosen Carboxymethylcellulose-haltigen Selektionsmedium zu einer sukzessiven Verflüssigung des Mediums bis hin zu einer wasserähnlichen Konsistenz während des Bakterienwachstums führt, was durch Schütteln des Anzuchtkolbens und visuelle Inspektion deutlich beobachtet werden kann. Verflüssigung von Gärsubstrat - Substratfließtest
Die Verflüssigung eines Gärsubstrates mit hohem Trockensubstanzgehalt bzw. die
Aufrechterhaltung einer flüssig-breiigen Konsistenz in einem Nassgärverfahren ist essentiell, um einen reibungslosen und kostengünstigen Ablauf des technischen Prozesses zu gewährleisten. Teilweise kommt es im kontinuierlichen Betrieb auch zu einer zunehmenden „Verschleimung" des Fermenterinhalts, was sich ebenfalls negativ auf den Prozess der Biogaserzeugung auswirkt. Der Effekt, den die Zugabe von Mikroorganismen auf die Konsistenz des Gärsubstrates machte, wurde mit einem Test bestimmt, in dem das Fließverhalten von Substratproben auf einer schiefen Ebene gemessen wurde (Substratfließtest).
Ausgangsmaterial für den Fließtest war Material aus einer Biogasanlage mit einem Trockensubstanzanteil von ca. 8-12 %. Jeweils 500 ml Material aus einem Fermenter wurde in 1 I Schott-Flaschen abgefüllt und 1 Tag lang bei 40 0C inkubiert. Anschließend wurde jeweils die Bakterienzellmasse aus einer 500 ml Vorkultur (entspricht ungefähr 4 x 1011 Zellen) von Clostridium sporosphaeroides SBG3, Clostridium sartagoformum SBGI a, Paenibacillus macerans SBG2 oder einer Mischung der drei Bakterien zu gleichen Anteilen in 1 ml Medium resuspendiert, zugegeben und für weitere 5 Tage bei 40 0C unter Schütteln inkubiert. Für die Kontrollprobe wurde nur 1 ml Medium zugegeben. Jeweils 1 ,3 g der Proben wurden an den Startpunkt der schiefen Ebene aus Metall gesetzt und auf einer cm-Skala die Fließgeschwindigkeit (zurückgelegte Strecke pro 10 min) der jeweiligen Proben abgelesen, die ein Maß für die Verflüssigung bzw. die Viskosität des Gärsubstrates darstellt. Die Ergebnisse des Fließtests sind in der Figur 1 dargestellt.
In der Figur 1 sind folgende Spuren gezeigt: Spur 1 : Kontrolle ohne Zugabe von Mikroorganismen (Vergleichsbeispiel); Spur 2: Clostridium sartagoformum SBGIa (Vergleichsbeispiel); Spur 3: Clostridium sporosphaeroides SBG3; Spur 4: Paenibacillus macerans SBG2 (Vergleichsbeispiel); Spur 5: Mischung aus Clostridium sartagoformum SBGI a, Clostridium sporosphaeroides SBG3 und Paenibacillus macerans SBG2 zu gleichen Teilen. Figur 1A zeigt die Spuren direkt nach dem Auftrag der Proben, Figur 1 B nach 2 min. und Figur 1 C nach 18 min. Es zeigte sich, dass die Viskosität des Fermenterinhalts durch die Zugabe von lebenden Bakterien des Stammes Clostridium sporosphaeroides SBG3 sehr stark abnahm, während die Zugabe der Organismen Clostridium sartagoformum SBGI a und Paenibacillus macerans SBG2 ebenfalls einen deutlichen, aber weniger ausgeprägten Effekt aufwiesen. Auch durch den Zusatz der Mischung der 3 Mikroorganismen konnte eine signifikante Verflüssigung des Substrates erzielt werden. In einem weiteren Versuch konnte gezeigt werden, dass die Zugabe von toten Zellen (totautoklaviert) praktisch keinen Effekt hatte. Eine visuelle Inspektion der Proben ergab auch, dass bei Zusatz lebender Zellen des Stammes Clostridium sporosphaeroides SBG3 der Anteil schleimiger Substanzen abnahm. Überraschend war, dass die zugesetzten Bakterien auch bei Substrat, das schon einen Fermenter und damit einen durch Mikroorganismen bewirkten Fermentierungsprozess durchlaufen hat, noch eine weitere Verflüssigung bewirkten. Dies bedeutet, dass in einem Fermentierungsprozess ohne externe Zugabe von Mikroorganismen das Substrat nicht vollständig abgebaut wird, sondern zusätzliches energetisches Potential birgt, welches durch den Zusatz der erfindungsgemäßen Mikroorganismen genutzt werden kann.
Bestimmung der Zelldichte Um die Zelldichte in Bezug auf lebende Bakterien zu bestimmen, wurden jeweils 10 μl Bakterienprobe (z.B. Vorkultur, Bakterienzuchtansatz, Überstand von Fermenterprobe) mit 2 μl BacLight™-Farbstoff (Invitrogen) vermischt und bei 1000 facher Vergrößerung mikroskopiert (AXIO Imager A1 , Zeiss, Jena). Unter UV-Licht und Nutzung zweier verschiedener Filter kann mit dem Bacl_ight™-System der Anteil lebender Zellen in der Probe bestimmt werden. Die Gesamtzellzahl wurde in einer Thomazählkammer ausgezählt. Der Anteil lebender Zellen aus den Vorkulturen war in der Regel höher als 90 %.
Bestimmung des Zellanteils von Clostridium sporosphaeroides SBG3 oder Paenibacillus macerans SBG2 oder Clostridium sartaαoformum SBGI a in einer Probe - „Fishing"
Der Anteil von Bakterien der Art Clostridium sporosphaeroides SBG3 oder Paenibacillus macerans SBG2 oder Clostridium sartagoformum SBGI a wurde durch „whole cell hybridization" nach der in Amann et al. (1995, Microbiol. Rev. 59, 143- 169) beschriebenen Methode bestimmt. Als Sonde zum „Fishing" wurde für Clostridium sporosphaeroides SBG3 ein markiertes Oligonukleotid mit der Sequenz Cy3-CCACAGCTCTCACGCCCG (angegeben in 5"→ 3"Richtung) verwendet, für Paenibacillus macerans SBG2 ein markiertes Oligonukleotid mit der Sequenz Cy3- GCAACCCGAACTGAGACC (angegeben in 5"→ 3"Richtung) und für Clostridium sartagoformum SBGIa ein markiertes Oligonukleotid mit der Sequenz Cy3- CTTCATGCGAAAATGTAA (angegeben in 5"→ 3" Richtung). Die Oligonukleotide trugen als Markierung jeweils am 5"-Ende den Farbstoff Indocarbocyanin (Cy3).
Fermentertypen
Es wurden Versuche im Technikumsmaßstab in verschiedenen Fermentertypen durchgeführt. Die Fermenter wurden bei Betriebstemperaturen von ca. 40 0C betrieben. Als Substrat wurde hauptsächlich Maissilage mit einem Anteil organischer Trockensubstanz (oTS) von 30 -35 % verwendet. Um die Versorgung mit Spurenelementen für die an der Fermentation beteiligten stoffwechselaktiven Mikroorganismen sicherzustellen, wurden in der Regel kommerziell erhältliche Spurenelementemischungen zugesetzt (z.B. Novodyn®).
Fermenter Typ 1 : Liegender Pfropfenstromfermenter rechteckig, Volumen 150 1, bautechnische Unterteilung des Fermenterraumes durch eingezogene Wand mit kleinflächigem Durchlass für den Substratstrom, Aufteilung des Fermenterraumes in VA direkt nach Substratzugabestutzen und 3A nach Lochblende, 2-stufige Anlage.
Fermenter Typ 2: Liegender Pfropfenstromfermenter rechteckig, Volumen 150 I als 1. Stufe plus total durchmischter Rundfermenter, Volumen 200 I als 2. Stufe; Gesamtvolumen 350 I. 2-stufige Anlage mit Rezirkulation zwischen Rundfermenter und Pfropfenstromfermenter.
Fermenter Typ 3: Liegender Pfropfenstromfermenter zylindrisch, Volumen 30 m3, 1- stufige Anlage.
Fermenter Typ 4: Liegender Pfropfenstromfermenter rechteckig, Volumen 150 I, keine bautechnische Unterteilung im Fermenterraum, 1 -stufige Anlage. Rezirkulation optional. Verteilung der Mikroorganismen innerhalb des Fermenters - „Tracer-Test" Da die Durchmischung des zähen Substrates und damit auch sonstiger Zusätze in einem Fermenter einige Zeit dauert und außerdem von der eingesetzten Rührtechnik abhängt, wurde ein Test etabliert, mit dem der Zeitraum bis zu einer gleichmäßigen Verteilung von zugesetzten Mikroorganismen im Fermenter bestimmt werden kann. In diesem „Tracer-Test" wurde anstelle von Mikroorganismen pulverförmiges LiCI in einer Konzentration von 10 mg Lithium/kg Ausgangssubstrat (bei Fermenter Typ 2 die doppelte Menge) am Ort der Substratzugabe zugesetzt. Daraufhin werden nach verschiedenen Zeiten (Zugabe erfolgt am Tag 1 ) an verschiedenen Stellen des Fermenters (am Anfang des Fermenters nach Substrateintritt sowie am Ende vor dem Restsubstrataustritt) Substratproben entnommen und diese mit Hilfe von induktiv gekoppelter Plasma-Atom- Emissionsspektroskopie nach den Methoden DIN EN ISO 13346 (S7a) und DIN EN ISO 11885 (E22) auf ihren Li-Gehalt hin analysiert. Nach einer vollständigen Durchmischung des Fermenterinhalts sollte der gemessene Li-Gehalt am vorderen Ende des Fermenters und am hinteren Ende des Fermenters gleich sein und einen Wert von ca. 10 mg/kg Ausgangssubstrat (ca. 20 mg/kg Ausgangssubstrat für Fermenter Typ 2) aufweisen. Die Ergebnisse von derartigen „Tracer-Tests" für 3 verschiedene Fermentertypen sind in Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1 :
Figure imgf000039_0001
Es wurde beobachtet, dass eine vollständige Durchmischung des Fermenterinhalts und damit einhergehend eine gleichmäßige Verteilung des „Tracers" bei den Fermenter Typen 2 und 3 fünf Tage nach Zugabe des „Tracers" erreicht war, beim Fermenter Typ 1 erst nach 8 Tagen. Es ist davon auszugehen, dass der Zeitraum bis zu einer gleichmäßigen Verteilung von zugegebenen Mikroorganismen ebenfalls mehrere Tage beträgt.
Langzeit-Fermentation zur Biogasproduktion mit oder ohne Zugabe von erfindungsgemäßen Mikroorganismen
Im Technikumsmaßstab konnte stabil mindestens eine Verdopplung der aus der Praxis bekannten durchschnittlichen Raumbelastung erreicht werden. Ein stabiler Betrieb wurde bei einer Raumbelastung von 8 kgoTS/m3d durch Zugabe von 2x1013 Zellen pro m3 und Woche erreicht. Dabei wurden an den in der Praxis üblichen Prozessparametern, wie Temperatur (400C) und pH-Wert (6-9), bzw. Pufferkapazität nichts verändert.
Während des Fermentationsprozesses in verschiedenen Versuchsfermentern mit einem Volumen von 150 I bis 30000 I unter realistischen Anlagenbedingungen (T ~ 40 0C, pH 6 - 8, kontinuierliche Beschickung, ständige Durchmischung) wurde über einen Zeitraum von mehreren Monaten der zeitliche Verlauf der Raumbelastung des Fermenters in Kilogramm organischer Trockensubstanz je Kubikmeter je Tag (kgoTS/m3d) und der zeitliche Verlauf des produzierten Biogases bestimmt. Zur besseren Vergleichbarkeit der verschiedenen Versuchsanlagen, wurde für die Gasausbeute statt der spezifischen Biogasausbeute die Raumzeitausbeute (Normliter produziertes Biogas pro Liter Gärvolumen, [Nl/I]) angegeben, bei der die Menge an erzeugtem Biogas auf das jeweilige Gärvolumen normiert wurde. Daneben wurde der zeitliche Verlauf der theoretisch erwarteten Gasproduktion berechnet.
Das Kuratorium für Technik und Bauwesen in der Landwirtschaft e. V. (KTBL) aber auch die Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft und die Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe haben Richtwerte herausgegeben, die in etwa angeben, welche Mengen an Biogas in Abhängigkeit vom eingesetzten Substrat bei einer stabilen Fermentierung zu erwarten sind. Diese theoretischen Richtwerte können somit die Menge an theoretisch erzeugbarem Biogas widerspiegeln. Alternativ können auch von anderen Instituten in anderen Ländern herausgegebene Richtwerte verwendet werden. Für Maissilage, deren Anteile an oTS zwischen 22 % und 40 % lagen, wurden hierbei zu erwartende Gaserträge im Bereich von 533 NI/kgoTS und 650 NI/kgoTS genannt (in „Handreichung Biogasgewinnung und - nutzung", 2006, Hrsgb. Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e.V., Gülzow und KTBL Homepage, www.ktbl.de). Der zeitliche Verlauf der theoretischen Gasproduktion in [Nl/d] wurde nach solchen Richtwerten berechnet, wobei in sämtlichen Versuchen hier bereits der sehr hohe Wert für einen theoretischen Gasertrag von 663 NI/kgoTS angenommen wurde. Die tatsächlich gemessenen Werte für die Anteile an oTS bei der eingesetzten Maissilage bewegten sich je nach Charge zwischen 30 und 40 % oTS.
Neben Gasausbeute und Raumbelastung wurden eine Reihe weiterer charakteristischer Parameter des Fermentationsprozesses wie Trockensubstanzgehalt des Fermenterinhalts, pH, Säurekonzentration (z.B. Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Valeriansäure, Essigsäureäquivalent), Temperatur, spezifische Gasausbeute, Zusammensetzung des Biogases, Viskosität, Leitfähigkeit, Redoxpotential und die Konzentration an Nährstoffen und Spurenelementen gemessen.
Lanqzeitfermentation in einem Fermenter vom Typ 4 unter Zusatz von Mikroorganismen Clostridium sporosphaeroides SBG3
Es handelt sich bei der Technikumsanlage um einen liegenden rechteckigen Pfropfenstromfermenter mit einem Volumen von 150 I. Der Fermenter wurde als 1- stufige Anlage betrieben.
Die Figur 2 zeigt Messergebnisse verschiedener charakteristischer Parameter während eines Fermentationsprozesses in einem Versuchsfermenter mit und ohne Zugabe von Mikroorganismen des Stammes Clostridium sporosphaeroides SBG3. Die mit dem Bezugszeichen 10 versehene Kurve zeigt den zeitlichen Verlauf der Raumbelastung des Fermenters in Kilogramm organischer Trockensubstanz je Kubikmeter je Tag (kgoTS/m3d) und die mit dem Bezugszeichen 20 gekennzeichnete Kurve den zeitlichen Verlauf der gemessenen Raumzeitausbeute, gemittelt jeweils über 5 Tage (Nl/I). Mit dem Bezugszeichen 30 ist der zeitliche Verlauf der theoretischen Gasproduktion in [Nl/I] markiert.
Bis zum Betriebstag 246 wurde die Anlage ohne Zugabe von Mikroorganismen betrieben. Es konnte auf der Anlage in einer stabilen Fermentation eine recht hohe Raumbelastung zwischen 6 und 7 kgoTS/m3d erreicht werden, wobei die tatsächliche Gasausbeute jeweils etwas unterhalb der theoretischen blieb.
Ab dem Tag 232 (Sternsymbol) wurde versucht, die Raumbelastung bis hin zu 10 kgoTS/m3d steigern, was einen sofortigen Einbruch der Biogasproduktion zur Folge hatte. Nachdem die Raumbelastung wieder auf einen Wert von ca. 6 kgoTS/m3d zurückgefahren wurde, wurden ab Tag 246 zweimal pro Woche Kulturen von Mikroorganismen des Stammes Clostridium sporosphaeroides SBG3 zugegeben (zwischen 5 x 1010 und 2 x 1011 Zellen pro Zugabe in einem Volumen von 30 bis 200 ml). Die Zeitpunkte der Zugabe von Clostridium sporosphaeroides SBG3 sind durch Rautensymbole 40 auf der X-Achse gekennzeichnet.
Anschließend stieg die tatsächliche Gasausbeute dauerhaft über den Wert der theoretisch berechneten an. Die Raumbelastung konnte in einem stabilen Fermentationsprozess stetig gesteigert und bis zum Tag 360 bis auf einen Wert von 9 kgoTS/m3d hochgefahren werden. Damit stieg auch die Raumzeitausbeute von anfänglichen 4 Nl/I auf 6 Nl/I an. Nach dem Tag 360 (Pfeil) wurde wegen einer Betriebspause die Substratzufuhr gestoppt und es wurden keine weiteren Mikroorganismen mehr zugegeben. Die Gasproduktion kam vollständig zum Erliegen.
Ab dem Tag 384 wurde die Anlage innerhalb eines Tages wieder auf eine Raumbelastung von 5 kgoTS/m3d hochgefahren ohne dass erneut Mikroorganismen zugegeben wurden. Bis etwa zum Tag 415 konnte die Raumbelastung auf einen Wert von 7 kgoTS/m3d gesteigert werden und blieb auch weiterhin bei konstant hohen Werten zwischen 7 und 8 kgoTS/m3d. Die Gasproduktion setzte daraufhin mit hoher Effizienz wieder ein und blieb über den gesamten Beobachtungszeitraum im Bereich oder über der theoretisch erwarteten Gasproduktion.
Dem Fachmann ist bekannt, dass ein derart problemloses Anfahren einer Anlage nach mehrwöchigem Stillstand sehr außergewöhlich ist. „Fishing"-Experimente nach dem erneuten Hochfahren der Anlage mit einer Oligonukleotidsonde gegen Clostridium sporosphaeroides SBG3 haben gezeigt, dass sich der Organismus im Fermenter etabliert hatte und mit einer Konzentration von etwa 0,5 % der Gesamtzahl an im Fermenterinhalt nachzuweisenden Bakterien vorhanden war. Dies erklärt auch die positiven Effekte der erhöhten Raumbelastung und Gasausbeute sowie der Stabilität des Fermentationsprozesses, die bereits vorher bei regelmäßiger Zugabe des Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides SBG3 zu beobachten waren.
Langzeitfermentation in einem Fermenter vom Typ 1 unter Zusatz von Mikroorganismen Clostridium sporosphaeroides SBG3 sowie einer Mischung von Mikroorganismen der Stämme Clostridium sporosphaeroides SBG3, Clostridium sartaαoformum SBGIa und Paenibacillus macerans SBG2
Es handelt sich bei der Technikumsanlage um einen liegenden rechteckigen Pfropfenstromfermenter mit einem Volumen von 150 I. Der Fermenter wurde als 2- stufige Anlage betrieben, da eine bautechnische Unterteilung des Fermenterraumes durch eine eingezogene Wand mit kleinflächigem Durchlass für den Substratstrom erfolgte. Dabei wurde der Fermenterraum quasi in 2 Reaktionsräume aufgeteilt, die im Volumenverhältnis 1 :3 zueinander stehen, wobei der Raum direkt nach dem Substratzugabestutzen der kleinere ist und der Raum nach der Lochblende der größere. Messungen charakteristischer Fermentationsparameter ergaben, dass sich in den beiden Reaktionsräumen teilweise unterschiedliche Werte einstellten, so dass davon ausgegangen werden kann, dass auch verschiedene Substratumsetzungen bevorzugt in dem einen oder anderen Reaktorraum erfolgten.
Die Figur 3 zeigt Messergebnisse verschiedener charakteristischer Parameter während eines Fermentationsprozesses in einem Versuchsfermenter vom Typ 1 mit Zugabe einer Mischung von Mikroorganismen bzw. von Mikroorganismen des Stammes Clostridium sporosphaeroides SBG3. Die mit dem Bezugszeichen 10 versehene Kurve zeigt den zeitlichen Verlauf der Raumbelastung des Fermenters in Kilogramm organischer Trockensubstanz je Kubikmeter je Tag (kg oTS/m3d) und die mit dem Bezugszeichen 20 gekennzeichnete Kurve den zeitlichen Verlauf der gemessenen Raumzeitausbeute, gemittelt jeweils über 5 Tage (Nl/I). Mit dem Bezugszeichen 30 ist der zeitliche Verlauf der theoretischen Gasproduktion in [Nl/I] markiert.
Die Anlage wurde komplett neu beschickt. Bereits nach einer Woche wurde eine Mischkultur aus in etwa gleichen Anteilen von Mikroorganismen der Stämme
Clostridium sporosphaeroides SBG3, Clostridium sartagoformum SBGI a und
Paenibacillus macerans SBG2 2 bis 5 mal pro Woche zugegeben. Die Zeitpunkte der Zugaben sind mit dem Bezugszeichen 50 gekennzeichnet. Es wurden jeweils ca. 3 g Zellpellet mit einer Zellzahl von etwa 1012 Zellen zugegeben. In einem stabilen Fermentationsprozess konnte die Raumbelastung allmählich auf einen Wert von ca. 6 kgoTS/m3d gesteigert werden. Der erzielte Gasertrag entsprach in der
Regel dem theoretisch erwarteten oder lag leicht darüber.
Ab dem Tag 106 wurde statt der Mischkultur nur noch eine Reinkultur des Stammes Clostridium sporosphaeroides SBG3 5 mal pro Woche zugesetzt (ebenfalls ca. 3 g
Zellpellet mit einer Zellzahl von etwa 1012 Zellen). Die Zeitpunkte der Zugaben sind mit dem Bezugszeichen 60 gekennzeichnet. Die Raumbelastung wurde bis zum
Ende des Beobachtungszeitraumes auf einem hohen Niveau von 6 und 7 kgoTS/m3d konstant gehalten ohne dass die gemessenen Säurekonzentrationen in kritische Bereiche gelangten. Die gemessenen Anteile für die organische
Trockensubstanz im Fermenterinhalt überschritten nie einen Wert von 12 % oTS, so dass auch bei hoher Raumbelastung eine gut rührbare nicht zu viskose Masse im
Fermenter vorhanden war. In Kontrollexperimenten ohne Zusatz von
Mikroorganismen konnte dieser Fermentertyp nie mit einer Raumbelastung von mehr als 5 kgoTS/m3d betrieben werden.
Bei Zugabe einer Reinkultur des Stammes Clostridium sporosphaeroides SBG3 erhöhte sich die tatsächlich gemessene Gasausbeute signifikant im Vergleich zu dem Zeitraum, in dem die Mischkultur zugegeben wurde. Für den Zeitraum, in dem 5 mal pro Woche die Mischkultur zugegeben wurde, wurde ein mittlerer Gasertrag von 4,1 Nl/I gemessen, während nach Zugabe der Reinkultur von Clostridium sporosphaeroides SBG3 ein mittlerer Gasertrag von 4,6 Nl/I bestimmt wurde, was einer Erhöhung um 12 % entspricht und wirtschaftlich durchaus von Bedeutung ist. Dieses Beispiel zeigt auch, dass bei Zugabe einer Reinkultur des Stammes Clostridium sporosphaeroides SBG3 die spezifische Biogasausbeute (Nm3/t) anstieg, da bei gleichbleibender Raumbelastung die Gasausbeute anstieg, das zugegebene Substrat also effizienter verwertet wurde.
Langzeitfermentation in einem Fermenter vom Typ 3 unter Zusatz von Mikroorganismen Clostridium sporosphaeroides SBG3
Bei dieser Versuchsanlage handelt es sich um eine große Versuchsanlage im Technikumsmaßstab mit einem Volumen von 30 m3, die als liegender zylindrisch geformter Pfropfenstromfermenter aufgebaut ist. Sie wird als 1 -stufige Anlage betrieben.
Die Figur 4 zeigt Messergebnisse verschiedener charakteristischer Parameter während eines Fermentationsprozesses in einem Versuchsfermenter vom Typ 3 mit Zugabe von Mikroorganismen des Stammes Clostridium sartagoformum SBGIa bzw. von Mikroorganismen des Stammes Clostridium sporosphaeroides SBG3. Die mit dem Bezugszeichen 10 versehene Kurve zeigt den zeitlichen Verlauf der Raumbelastung des Fermenters in Kilogramm organischer Trockensubstanz je Kubikmeter je Tag (kgoTS/m3d) und die mit dem Bezugszeichen 20 gekennzeichnete Kurve den zeitlichen Verlauf der gemessenen Raumzeitausbeute. Die Raumzeitausbeute gemittelt jeweils über 5 Tage (Nl/I) ist mit dem Bezugszeichen 70 gekennzeichnet. Mit dem Bezugszeichen 30 ist der zeitliche Verlauf der theoretischen Gasproduktion in [Nl/I] markiert.
Die Zeitpunkte der Zugaben von Mikroorganismen des Stammes Clostridium sporosphaeroides SBG3 sind mit dem Bezugszeichen 90 gekennzeichnet. Die Zeitpunkte der Zugaben von Mikroorganismen des Stammes Clostridium sartagoformum SBGIa sind mit dem Bezugszeichen 80 gekennzeichnet. Der Pfeil markiert den Beginn des „Absturzes" des Fermenters. Die Biogasanlage wurde ab dem Betriebstag 184 mit einer Raumbelastung im Bereich von 4 bis 5 kgoTS/m3d betrieben. Wie in Figur 4 zu sehen ist, lag die erzielte Raumzeitausbeute an Biogas in diesem Versuch deutlich über der theoretisch erwarteten. Um den Prozess auf diesem hohen Niveau zu halten, wurde ab dem Tag 207 Reinkulturen von Mikroorganismen des Stammes Clostridium sartagoformum SBGIa zugegeben (4 bis 5 mal pro Woche jeweils ca. 100 g feuchtes Zellpellet aus einer 100 bis 200 I Anzucht, entspricht ca. 4 bis 8 mal 1013 Zellen). Der Prozess konnte so für mehr als 2 Wochen auf diesem hohen Niveau (Raumzeitausbeute im Bereich 3,5 bis 4 N l/l, ca. 15 % bis 30 % über dem theoretisch erwarteten Gasertrag) gehalten werden. Ab dem Tag 227 kam es jedoch zu einem plötzlichen Abfall der Gasbildung einhergehend mit einem rapiden Absinken der Raumbelastung auf einen Wert von nur noch etwas über 1 kgoTS/m3d, was einem „Absturz des Fermenters" gleichkommt. Dass der Fermentationsprozeß aus dem Gleichgewicht geriet, konnte man auch anhand weiterer Meßparameter wie pH-Wert (Absinken des pH-Wertes von ca. 7,7 bis 7,8 auf einen Wert von 6,0 am Tag 229) und den Messwerten für die sich akkumulierenden freien Fettsäuren (drastischer Anstieg der Werte für Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Valeriansäure und Essigsäureäquivalent) beobachten. Um den Fermentationsprozeß wieder zu stabilisieren wurde vom Betriebstag 228 an jeweils eine Reinkultur von Mikroorganismen des Stammes Clostridium sporosphaeroides SBG3 zugegeben (4 bis 5 mal pro Woche, ca. 100 g feuchtes Zellpellet aus einer 100 bis 200 I Anzucht). Während des Absturzes, erreichte die erzielte Gasausbeute nur noch die theoretisch erwarteten (siehe Messreihen mit den Bezugszeichen 20 und 30), aber bereits ab Tag 230, also 2 Tage nach Zugabe der ersten Kultur von Mikroorganismen des Stammes Clostridium sporosphaeroides SBG3 liegen die gemessenen Gaserträge wieder über den theoretisch erwarteten. Eine Steigerung der Raumbelastung einhergehend mit kontinuierlich steigenden Gaserträgen war ab dem Tag 238 möglich. Die Zugabe von Mikroorganismen des Stammes Clostridium sporosphaeroides SBG3 wurde bis zum Tag 257 fortgeführt. Zu diesem Zeitpunkt war eine Raumbelastung von ca. 4 kgoTS/m3d erreicht, und die erzielte Gasausbeute lag stets deutlich über der theoretisch berechneten, aber das Effizienzniveau war immer noch etwas niedriger als vor dem Absturz. Die Zugabe von Mikroorganismen des Stammes Clostridium sporosphaeroides SBG3 wurde daraufhin gestoppt und es wurden ab Tag 260 erneut Mikroorganismen des Stammes Clostridium sartagoformum SBGI a zugegeben (4 bis 5 mal pro Woche jeweils ca. 100 g feuchtes Zellpellet aus einer 100 bis 200 I Anzucht). Es zeigte sich, dass dadurch die Raumausbeute noch mal leicht gesteigert werden konnte auf Werte zwischen 4,5 und 5 kgoTS/m3d und es ließ sich erneut ein Gasmehrertrag beobachten, der das Niveau vor dem Fermenterabsturz erreichte. Die erfindungsgemäße Zugabe von Mikroorganismen des Stammes Clostridium sporosphaeroides SBG3 erwies sich als geeignet, um einen Fermenter während eines Absturzes zu stabilisieren, so dass die Biogasproduktion wieder effizient weitergeführt werden konnte.
Durch die Zugabe der Reinkulturen von Clostridium sporosphaeroides SBG3 konnte bei Fermentationen die Raumbelastung bis auf einen Maximalwert von etwa 9 kgoTS/m3d gesteigert werden.
Parallel zur steigenden Raumbelastung konnte eine Steigerung des Biogasertrages beobachtet werden. Dabei war eine Übereinstimmung der erzeugten Biogasmenge in Normliter/Tag [Nl/d] mit der theoretischen Gasproduktion in Normliter/Tag [Nl/d] oder eine gegenüber der theoretischen Gasproduktion erhöhte Gasproduktion zu beobachten.
Die Raumbelastung der Anlage konnte infolge der Zugabe von Clostridium sporosphaeroides SBG3 weiter gesteigert werden. Dabei blieb der prozentuale Gehalt an Trockensubstanz beziehungsweise organischer Trockensubstanz nahezu konstant. Diese Beobachtung legt nahe, dass während der Fermentierung des Gärsubstrats keine Anhäufung von nicht-fermentierter organischer Trockensubstanz erfolgt. Die Zugabe von Reinkulturen von Clostridium sporosphaeroides SBG3 trägt also zu einer kontinuierlichen Umsetzung der enthaltenen Trockenmasse im Gärsubstrat bei, welche wiederum zu einer kontinuierlichen Fermentierung führt, indem die Anhäufung von Trockensubstanz vermindert wird.
In Phasen, in denen die Biogasanlage bei konstanter Raumbelastung betrieben wird, ist sogar eine Abnahme der Trockensubstanz zu beobachten, was darauf schließen lässt, dass die Mikroorganismen Clostridium sporosphaeroides SBG3 mit ihrer hydrolytischen Stoffwechselaktivität nicht nur die Anhäufung von Trockensubstanz im Fermenter vermindern, sondern auch die hydrolytische Umsetzung dieser Trockensubstanz verbessern.
In den beschriebenen Ausführungsbeispielen wurden Reinkulturen von Clostridium sporosphaeroides aber auch Mischkulturen mit einem Anteil an Clostridium sporosphaeroides verwendet. Insbesondere können Mischkulturen aus zwei oder drei Arten von Mikroorganismen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Paenibacillus macerans, Clostridium sartagoformum und Clostridium sporosphaeroides zugegeben werden.
Die Zugabe des hydrolytisch aktiven, fermentativen Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides SBG3 zeigt einen positiven Effekt auf die Hydrolyse organischer Trockensubstanz. Durch die Zugabe von Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides kann die Raumbelastung eines Fermenters unter ansonsten identischen Bedingungen von etwa 4 bis 5 kgoTS/m3d auf rund 6 bis 9 kgoTS/m3d gesteigert werden, ohne dass sich eine Instabilität des Fermentationsprozesses auch nur andeuten würde. Parallel zu der erhöhten Raumbelastung wird die Menge an gebildetem Biogas deutlich erhöht. Zudem steigt die spezifische Ausbeute an Biogas an, da deutlich mehr der organischen Trockensubstanz abgebaut wird als bei fehlender Zugabe von Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides. Der Einsatz von Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides führt zu einer dramatischen Verbesserung von Effizienz und Wirkungsgrad von Biogasanlagen.
Ausdruck (Original in electromschem Format)
0-1 Formular PCT/RO/134 (SAFE) Angaben zu einem hinterlegten Mikroorganismus und/oder anderem hinterlegten biologischen Material
0-1-1 erstellt mit
0-2 Internationales Aktenzeichen PCT/DE2009/075035
0-3 Aktenzeichen des Anmelders oder Anwalts SCM068WO
1 Die nachstehenden Angaben betreffen den
Mikroorganismus und/oder anderes biologisches Material, der/das in der
Beschreibung genannt ist
1-1 absatz zahl Clostridium sporosphaeroides Seite 1, Zeile 1
1-3 Angaben betr. Hinterlegung
1-3-1 Name der Hinterlegungsstelle DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen GmbH
1-3-2 Anschrift der Hinterlegungsstelle Inhoffenstr. 7B
38124 Braunschweig, Deutschland
1-3-3 Datum der Hinterlegung 15. Mai 2009 (15.05.2009)
1-3-4 Eingangsnummer DSM 22577
1-4 Weitere Angaben
1-5 Bestimmungsstaaten, für die besondere Angaben gemacht werden alle Bestimmungsstaaten
1-6 Gesondert eingereichte Angaben
Diese Angaben werden dem Internationalen
Büro spater übermittelt
VOM ANMELDEAMT AUSZUFÜLLEN
0-4 Dieses Formular ist mit der internationalen Anmeldung eingegangen
(ja oder nein)
0-4-1 Bevollmächtigter Bediensteter
VOM INTERNATIONALEN BÜRO AUSZUFÜLLEN
0-5 Dieses Formular ist an folgendem Datum beim internationalen Büro eingegangen
0-5-1 Bevollmächtigter Bediensteter

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Behandlung von Biomasse, dadurch gekennzeichnet, dass der Biomasse ein Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zugesetzt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse handelt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Verfahren zur Erzeugung von Biogas aus Biomasse handelt.
4. Verfahren nach zumindest einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides in Form einer Kultur von Mikroorganismen zugesetzt wird, wobei der Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zumindest 10" 4 % der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass in der Kultur von Mikroorganismen der Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zumindest 10 % der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass in der Kultur von Mikroorganismen der Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zumindest 50 % der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass in der Kultur von Mikroorganismen der Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zumindest 90 % der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
8. Verfahren nach zumindest einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass eine Reinkultur des Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zugesetzt wird.
9. Verfahren nach zumindest einem der Ansprüche 4 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides der Biomasse als Bestandteil zumindest einer immobilisierten Kultur von Mikroorganismen zugesetzt wird.
10. Verfahren nach zumindest einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass zeitnah zur Zugabe des Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zusätzliche Biomasse in den Fermentierungsreaktor gegeben wird.
1 1. Verfahren nach zumindest einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Raumbelastung im Fermentierungsreaktor durch kontinuierliche Zugabe von Biomasse kontinuierlich gesteigert wird.
12. Verfahren nach zumindest einem der Ansprüche 3 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, dass die Erzeugung von Biogas aus Biomasse bei einer
Raumbelastung von ≥ 0,5 kgoTS/m3d, bevorzugt ≥ 4,0 kgoTS/m3d, besonders bevorzugt ≥ 8,0 kgoTS/m3d, durchgeführt wird.
13. Verfahren nach zumindest einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Zugabe von Substrat und die Zugabe des
Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides kontinuierlich erfolgen.
14. Verfahren nach zumindest einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides in einer Menge zu dem Gärsubstrat zugegeben wird, dass nach Zugabe der Anteil des Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zwischen 10"8 % und 50 % der Gesamtzahl an in dem Gärsubstrat anwesenden Mikroorganismen ausmacht.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides in einer Menge zu dem Gärsubstrat zugegeben wird, dass nach Zugabe der Anteil des Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zwischen 10"3 % und 1 % der Gesamtzahl an in dem Gärsubstrat anwesenden Mikroorganismen ausmacht.
16. Verfahren nach zumindest einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich Mikroorganismen der Art Clostridium sartagoformum zugegeben werden.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Mikroorganismen des Stammes Clostridium sartagoformum SBGI a handelt.
18. Verfahren nach zumindest einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich Mikroorganismen der Art Paenibacillus macerans zugegeben werden.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Mikroorganismen des Stammes Paenibacillus macerans SBG2 handelt.
20. Verfahren nach zumindest einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides um einen Mikroorganismus des Stammes Clostridium sp. Klon 1099982248072 handelt.
21. Verwendung eines Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zur Behandlung von Biomasse.
22. Verwendung eines Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zur Verflüssigung von Biomasse.
23. Verwendung eines Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse.
24. Verwendung nach zumindest einem der Ansprüche 21 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides um einen Mikroorganismus des Stammes Clostridium sp. Klon 1099982248072 handelt.
25. Verwendung der durch ein Verfahren nach zumindest einem der Ansprüche 1 bis 20 erhaltenen verflüssigten Biomasse zur Herstellung von Biokraftstoff.
26. Verwendung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass die verflüssigte Biomasse zur Herstellung von Bioethanol verwendet wird.
27. Stamm des Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides SBG3, der bei der DSMZ unter der Nr. 22577 hinterlegt ist.
28. Stamm des Mikroorganismus Clostridium sartagoformum SBGI a, der bei der DSMZ unter der Nr. 22578 hinterlegt ist.
29. Mikroorganismus mit einer Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 96,57 % Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist.
30. Mikroorganismus nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 97,0 %
Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist.
31. Mikroorganismus nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 98,0 % Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist.
32. Mikroorganismus nach Anspruch 31 , dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 99,0 % Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist.
33. Mikroorganismus nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 99,5 % Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist.
34. Mikroorganismus nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der der Nukleotidsequenz
SEQ ID Nr. 1 entspricht.
35. Kultur von Mikroorganismen geeignet zum Einsatz in einem Verfahren zur Behandlung von Biomasse, dadurch gekennzeichnet, dass in der Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides gemäß den Ansprüchen 29 bis 34 anwesend ist, wobei der Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides zumindest 10"4 % der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
36. Kultur von Mikroorganismen nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides zumindest 1 % der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
37. Kultur von Mikroorganismen nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides zumindest 25 % der
Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
38. Kultur von Mikroorganismen nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides zumindest 50 % der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
39. Kultur von Mikroorganismen nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides zumindest 90 % der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
40. Kultur von Mikroorganismen nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine Reinkultur des Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides handelt.
41. Kultur von Mikroorganismen nach zumindest einem der Ansprüche 35 bis 40, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine immobilisierte Kultur von Mikroorganismen handelt.
42. Verwendung eines Mikroorganismus nach zumindest einem der Ansprüche 27 bis 34 zur Behandlung von Biomasse.
43. Verwendung nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Verfahren zur Behandlung von Biomasse nach zumindest einem der Ansprüche 1 bis 20 handelt.
44. Verwendung eines Mikroorganismus nach zumindest einem der Ansprüche 27 bis 34 zur Verflüssigung von Biomasse.
45. Verwendung nach Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse nach zumindest einem der Ansprüche 2 bis 20 handelt.
46. Verwendung eines Mikroorganismus nach zumindest einem der Ansprüche 27 bis 34 zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse.
47. Verwendung nach Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse nach zumindest einem der Ansprüche 3 bis 20 handelt.
48. Verwendung einer Kultur von Mikroorganismen nach zumindest einem der Ansprüche 35 bis 41 zur Behandlung von Biomasse.
49. Verwendung nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Verfahren zur Behandlung von Biomasse nach zumindest einem der Ansprüche 1 bis 20 handelt.
50. Verwendung einer Kultur von Mikroorganismen nach zumindest einem der Ansprüche 35 bis 41 zur Verflüssigung von Biomasse.
51. Verwendung nach Anspruch 50, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse nach zumindest einem der Ansprüche 2 bis 20 handelt.
52. Verwendung einer Kultur von Mikroorganismen nach zumindest einem der Ansprüche 35 bis 41 zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse.
53. Verwendung nach Anspruch 52, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse nach zumindest einem der Ansprüche 3 bis 20 handelt.
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102013002332A1 (de) * 2012-12-07 2014-06-12 Eads Deutschland Gmbh Nutzung von Biomasse zur Erzeugung von Kraftstoffen
FR3021329B1 (fr) * 2014-05-26 2020-05-29 Roquette Freres Substrat methanogene pour la fabrication de biogaz.
CN106190409A (zh) * 2016-08-24 2016-12-07 太湖县享有新能源有限责任公司 一种易燃、脱硫的秸秆生物质燃烧棒及其制备方法
CN112047575B (zh) * 2020-09-10 2022-06-24 江苏润誉环保设备科技有限公司 一种处理均苯四甲酸二酐生产废水的方法及专用装置
CN112077126B (zh) * 2020-09-17 2023-07-25 杭州楠大环保科技有限公司 一种家用餐厨垃圾相变制水降解处理系统及其处理方法
DE102021101167A1 (de) * 2021-01-20 2022-07-21 WAS Wirtschaftsagentur Martin Schroeder GmbH Verfahren und Vorrichtung zur Verwertung von organischen Materialien
JP2023103781A (ja) * 2022-01-14 2023-07-27 国立研究開発法人国際農林水産業研究センター タンパク質を含むセルロース系繊維物を分解する方法
WO2023159251A1 (en) * 2022-02-21 2023-08-24 Novozymes A/S Method for carring out the combined operation of a bioethanol production unit and a biogas unit
WO2023164436A1 (en) * 2022-02-23 2023-08-31 Novozymes A/S Process for producing fermentation products and biogas from starch-containing materials

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2258254A1 (fr) 1998-12-23 2000-06-23 Andre Balu Usine de traitement industriel des dechets domestiques et des boues organiques par le recyclage des produits valorisables et par la production acceleree de gaz biologique (le biogaz) et d'un amendement organique (le digestat) generes par la fermentation anaerobie mesophile des matieres organiques
WO2006056819A1 (en) 2004-11-26 2006-06-01 University Of Szeged Method for increased production of biogas
WO2006119052A2 (en) 2005-05-03 2006-11-09 Anaerobe Systems Anaerobic production of hydrogen and other chemical products
WO2007052306A2 (en) 2005-09-05 2007-05-10 Gangotree Resource Developers Pvt. Ltd. A three-step biomethanation process

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004113067A (ja) * 2002-09-25 2004-04-15 Ebara Corp セルロース分解能を有する新菌株、その利用方法および増殖促進法
JP4354311B2 (ja) * 2004-03-12 2009-10-28 株式会社荏原製作所 セルロース系有機物を含む処理対象物の嫌気性処理方法および装置
JP3617528B1 (ja) * 2004-06-18 2005-02-09 有限会社エムアイシー バイオマス処理方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2258254A1 (fr) 1998-12-23 2000-06-23 Andre Balu Usine de traitement industriel des dechets domestiques et des boues organiques par le recyclage des produits valorisables et par la production acceleree de gaz biologique (le biogaz) et d'un amendement organique (le digestat) generes par la fermentation anaerobie mesophile des matieres organiques
WO2006056819A1 (en) 2004-11-26 2006-06-01 University Of Szeged Method for increased production of biogas
WO2006119052A2 (en) 2005-05-03 2006-11-09 Anaerobe Systems Anaerobic production of hydrogen and other chemical products
WO2007052306A2 (en) 2005-09-05 2007-05-10 Gangotree Resource Developers Pvt. Ltd. A three-step biomethanation process

Non-Patent Citations (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARCHIVES OF MICROBIOLOGY, vol. 141, no. 1, 1985, pages 85 - 90, ISSN: 0302-8933 *
DATABASE BIOSIS [online] BIOSCIENCES INFORMATION SERVICE, PHILADELPHIA, PA, US; 1985, QUENTMEIER A ET AL: "CHARACTERIZATION OF CITRATE LYASE FROM CLOSTRIDIUM-SPOROSPHAEROIDES", XP002538674, Database accession no. PREV198579108063 *
DATABASE EMBL [online] 21 March 2007 (2007-03-21), "Uncultured Clostridiales bacterium clone 1099982248072 16S ribosomal RNA gene, partial sequence", XP002538673, Database accession no. EF434352 *
HANS G. SCHLEGEL: "Allgemeine Mikrobiologie", vol. 7, 1992, GEORG THIEME VERLAG, pages: 205
HU B ET AL: "Changes in microbial community composition following treatment of methanogenic granules with chloroform", ENVIRONMENTAL PROGRESS & SUSTAINABLE ENERGY, JOHN WILEY & SONS, INC, US, vol. 28, no. 1, 1 April 2009 (2009-04-01), pages 60 - 71, XP002538843, ISSN: 1944-7442, [retrieved on 20090217] *
KRÖBER MAGDALENA ET AL: "Phylogenetic characterization of a biogas plant microbial community integrating clone library 16S-rDNA sequences and metagenome sequence data obtained by 454-pyrosequencing.", JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY, vol. 142, no. 1, 1 June 2009 (2009-06-01), pages 38 - 49, XP002538671, ISSN: 1873-4863 *
LIU W-T ET AL: "Characterization of microbial community in granular sludge treating brewery wastewater", WATER RESEARCH, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 36, no. 7, 1 April 2002 (2002-04-01), pages 1767 - 1775, XP004347949, ISSN: 0043-1354 *
NIELSEN H. B. ET AL., BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, vol. 97, no. 6, 2007, pages 1638 - 1643
NIELSEN HENRIK BANGSO ET AL: "Bioaugmentation of a two-stage thermophilic (68 degrees C/55 degrees C) anaerobic digestion concept for improvement of the methane yield from cattle manure", BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, vol. 97, no. 6, August 2007 (2007-08-01), pages 1638 - 1643, XP002538156, ISSN: 0006-3592 *
RYCKEBOER J ET AL: "Microbiological aspects of biowaste during composting in a monitored compost bin", JOURNAL OF APPLIED MICROBIOLOGY, OXFORD, GB, vol. 94, no. 1, 1 January 2003 (2003-01-01), pages 127 - 137, XP002539294, ISSN: 1364-5072 *
SNEATH P H A ET AL (EDS.): "Bergey's manual of systematic bacteriology, Volume 2, Section 13: Endospore-forming Gram-positive rods and cocci", 1986, WILLIAMS & WILKINS, BALTIMORE, USA, XP002538672 *
SNEATH P H A ET AL: "Bergey's manual of systematic bacteriology, Endospore-forming Gram-positive rods and cocci", BERGEY'S MANUAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY, WILLIAMS & WILKINS, BALTIMORE, USA, vol. 2, 1 January 1986 (1986-01-01), pages 1118,1123 - 1124,1133, XP002539295, ISBN: 978-0-683-07893-0 *
SNEATH P H A ET AL: "Bergey's manual of systematic bacteriology, Endospore-forming Gram-positive rods and cocci", BERGEY'S MANUAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY, WILLIAMS & WILKINS, BALTIMORE, USA, vol. 2, 1 January 1986 (1986-01-01), pages 1154,1187 - 1188, XP002538393, ISBN: 978-0-683-07893-0 *
STENGL S ET AL: "Betriebsstabilität von Biogasanlagen", ETA ENERGIE, no. 3, 2007, Succidia AG, Darmstadt, Deutschland, pages 30 - 33, XP002562310, Retrieved from the Internet <URL:http://www.succidia.de/n_energie.html> [retrieved on 20070107] *
VAN HEERDEN I ET AL: "Microbial, chemical and physical aspects of citrus waste composting", BIORESOURCE TECHNOLOGY, ELSEVIER BV, GB, vol. 81, no. 1, 1 January 2002 (2002-01-01), pages 71 - 76, XP002539293, ISSN: 0960-8524 *
WILDE E ET AL: "Clostridium pascui sp. nov., a new glutamate-fermenting sporeformer from a pasture in Pakistan.", INTERNATIONAL JOURNAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY, vol. 47, no. 1, January 1997 (1997-01-01), pages 164 - 170, XP002538670, ISSN: 0020-7713 *

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