WO2010064702A1 - 癌の予後を予測するためのバイオマーカー - Google Patents

癌の予後を予測するためのバイオマーカー Download PDF

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WO2010064702A1
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典子 後藤
悟 宮野
清哉 井元
麻衣 山内
類 山口
隆志 河野
淳 横田
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国立大学法人 東京大学
財団法人ヒューマンサイエンス振興財団
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • Non-Patent Document 1 Lung cancer has been the most common and most fatal cancer in the world since 1985 (Non-Patent Document 1).
  • the overall 5-year survival rate is very low, and it has not improved even though its analysis efforts are being made.
  • Patients at an early stage of lung cancer are encouraged to undergo surgery, but the prognosis of patients after surgery appears to vary from recovery to death of metastatic recurrence.
  • Non-Patent Document 3 The report identified a link between previously undescribed tumor virulence and embryonic stem cell status.
  • Non-patent Document 4 Overexpression of epidermal growth factor receptor (EGFR) has been reported in many types of cancer including non-small cell lung cancer (NSCLC) (Non-patent Document 4). In recent studies, it has also been reported that the MAPK pathway including EGFR is most significantly mutated in lung adenocarcinoma (Non-patent Document 5).
  • NSCLC non-small cell lung cancer
  • a genetic test method for predicting recurrence risk is known as a diagnostic tool for prognosis of breast cancer (Patent Documents 1 and 2), and is sold as a genetic test “Mammaprint”.
  • An object of the present invention is to provide a gene signature useful for diagnosis of cancer, particularly lung cancer, and to provide a cancer diagnostic tool using such signature. Another object of the present invention is to identify novel prognostic markers for the early stage of lung cancer, particularly stage I.
  • the present inventors cultured normal primary lung epithelial cells (SAEC: primary small airway epithelial cells), and epithelial growth factor (EGF) or epidermal growth factor receptor ( The gene expression profiles of cells treated with EGFR) inhibitors or untreated cells were compared with each other, and the fluctuating gene group was narrowed down using a state space model.
  • SAEC primary small airway epithelial cells
  • EGF epithelial growth factor
  • the gene expression profiles of cells treated with EGFR) inhibitors or untreated cells were compared with each other, and the fluctuating gene group was narrowed down using a state space model.
  • the present inventors have succeeded in predicting the prognosis of lung cancer, in particular, early stage lung cancer, and completed the present invention.
  • a test method for predicting the prognosis of cancer comprising the step of measuring the expression level of a prognosis-related gene in a biological sample collected from a cancer patient for the transcription product or translation product of the gene, The method, wherein the gene is 2 to 277 genes selected from the following prognostic gene signature (1).
  • Prognostic gene signature (2) ADAM10; ADAM19 (includes EG: 8728); ADAM8; ADCY6; ADRBK2; ALOX15B; ARID3B; ATF2; BCAR3; BPGM; CASP4; CAT; CD3EAP; CDC42; CDKN1A; CENPF; CHODL; CHST2; CLEC2B; CSNK1D; CTGF; CXCL1; CXCR7; CYP2U1; DDEFL1; DDX21; DHCR7; DSCAM; DUSP1; DUSP4; EIF2AK2; ENC1; ETS2; EWSR1; FER1L4 (includes EG: 80307); FZD10; GAD1; GNB1; GRB10; HADH; HBEGF; HGS; HIST3H3; HMGCR; HMGCS1; HNRPM; HSD11B1; HSPA1A; HSPA5; HSPA
  • Prognostic gene signature (3) ADAM10; ADAM19 (includes EG: 8728); ADAM8; ADCY6; ADRBK2; ALOX15B; ATF2; BPGM; CASP4; CD3EAP; CDC42; CDC42EP2; CDKN1A; CENPF; CHST2; CLEC2B; COTL1; CNK1D; CXCR7; CYP1A1; CYR61; DDEFL1; DDX21; DUSP1; DUSP4; DUSP5; ETS2; FER1L4 (includes EG: 80307); FOSL1; FZD10; GAD1; GAPDH; GDNF; GNB1; GNG11; GNG4; HMGCR; HMGCS
  • a diagnostic agent for predicting the prognosis of cancer comprising a reagent for detecting the expression level of 2 to 277 prognosis-related genes selected from the following prognosis-related gene signature (1).
  • Prognostic gene signature (1) (same as above)
  • Prognostic gene signature (3) (same as above) [11] The diagnostic agent according to any one of [6] to [10], wherein the reagent is selected from a primer, a nucleic acid probe, and an antibody for a transcription product or translation product of a prognosis-related gene. [12] The following prognostic gene signature (1) immobilized on a solid surface: (same as above) An array for prognosis of cancer, comprising a nucleic acid probe that hybridizes to each of 2 to 277 genes selected from [13] The array according to [12], wherein the nucleic acid probe has a length of about 20 to 80 bases.
  • a method for predicting the possibility that a patient diagnosed with lung cancer will survive for a long time without recurrence of lung cancer (A) The expression level of a prognosis-related gene in cancer cells collected from the patient, the expression level of all transcripts or expression products in the cancer cells, or transcription for the transcription product or translation product of the prognosis-related gene Normalizing and determining the expression level of the product or reference set of expression products; (B) the step of subjecting the data obtained in step (a) to statistical analysis; and (c) the long-term survival probability of the patient is high or low based on the analysis result obtained in step (b).
  • Prognostic gene signature (1) (same as above) [15] A method for creating individual genome profiles for lung cancer patients, (A) a step of subjecting RNA extracted from cancer cells collected from the patient to gene invention analysis; (B) Prognostic gene signature (1): (same as above) Measuring the expression level in the cancer cell of 2 to 277 genes selected from the above, normalizing the expression level with respect to the control gene, and optionally comparing it with the amount found in the lung cancer reference tissue set; And (c) a method including a step of creating a report summarizing data obtained by the gene invention analysis.
  • test method and diagnostic agent of the present invention By using the test method and diagnostic agent of the present invention, it is possible to accurately predict the prognosis of cancer, and it is possible to select a treatment method that is more effective and has fewer side effects for cancer patients.
  • a more accurate prognosis can be predicted. It becomes possible.
  • the prediction method and genomic profile creation method of the present invention are expected to contribute to the progress of customized treatment for cancer patients.
  • the present invention contributes not only to the improvement of QOL of cancer patients and contribution to the medical economy, but also to the advancement of development of new therapeutic agents or treatment methods for cancer by selecting cancer patients corresponding to the treatment target in advance. Is expected to do.
  • FIG. 2 is a Kaplan-Meier curve showing that the prognosis of all stages of lung cancer patients can be predicted using the expression profile of all genes of the prognosis-related gene signature (2). It is a Kaplan-Meier curve which shows that the prognosis of a stage I lung cancer patient can be estimated using the expression profile of all the genes of a prognosis related gene signature (3).
  • FIG. 7 is a Kaplan-Meier curve showing that the prognosis-related gene signature (2) combined expression profile of all genes and patient clinical information can be used to predict the prognosis of all stages of lung cancer patients.
  • prognosis of cancer refers to a medical outlook on the course of cancer.
  • prognosis prediction refers to the possibility that a patient responds fragilely or unfavorably to a drug, the extent of such a reaction, removal of primary cancer by surgery and / or without recurrence for a certain period after chemotherapy. Mean any of the chances of survival.
  • the test method and prediction method of the present invention can be used clinically to determine a treatment method by selecting the most appropriate treatment method for a particular patient.
  • the test and prediction methods of the present invention may allow a patient to respond positively to a treatment plan such as surgical intervention, chemotherapy with a given drug or combination of drugs, or radiation therapy Or a useful tool for predicting whether a patient may survive for a long time after completion of surgery or chemotherapy, or other treatment.
  • a treatment plan such as surgical intervention, chemotherapy with a given drug or combination of drugs, or radiation therapy Or a useful tool for predicting whether a patient may survive for a long time after completion of surgery or chemotherapy, or other treatment.
  • the prognosis time for the prognosis of cancer may be before, during or after the treatment of cancer.
  • long-term survival means survival for 3 years or more after surgery or other treatment, preferably 5 years or more, more preferably 8 years or more, and most preferably 10 years or more.
  • the cancer in the present invention includes all cancers that occur in humans, but cancer caused by overexpressed EGFR family molecules or mutated cancer cells is desirable.
  • cancer caused by overexpression or mutation of EGFR family molecules include, but are not limited to, stomach cancer, lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, and colon cancer.
  • the present invention can provide more useful information for lung cancer, which occupies the top cancer mortality and has a low 5-year survival rate.
  • Lung cancer is divided into small cell lung cancer and non-small cell lung cancer, and is classified into four stages, stage I, II, III and IV, respectively.
  • stage I means that cancer is localized in the lung and there is no metastasis to lymph nodes
  • stage II means that cancer is localized in the lung and metastasis only to lymph nodes in the lung.
  • stage III has not spread to other organs, but has advanced beyond stage II
  • stage IV has other organs Defined as metastasized.
  • stages I, II and III are classified into stages IA and IB, stages IIA and IIB, and stages IIIA and IIIB, respectively.
  • stage diagnosis of lung cancer see, for example, TNM classification: Lung Cancer Handling Rules, 5th edition, edited by the Japan Lung Cancer Society, Kanehara Publishing, 1999, pages 25-32.
  • the present invention is excellent in non-small cell lung cancer, particularly in stage I prognosis diagnosis and in all stage I-IV prognosis diagnosis.
  • the biological sample to be measured by the present invention is not particularly limited as long as it is derived from a cancer patient, but cancer tissue (including cancer cells), blood, lymph, lymph nodes (lymph where cancer has metastasized). Including clauses). Preferred are cancerous tissue (primary and metastatic) and lymph nodes suspected of having metastasized cancer.
  • polynucleotide means polyribonucleotides or polydeoxyribonucleotides, unmodified RNA or DNA or modified RNA or DNA .
  • a polynucleotide as defined herein includes single stranded and double stranded DNA, single stranded and double stranded DNA, single stranded and double stranded RNA, Such as RNA containing single-stranded and double-stranded regions, single-stranded or double-stranded, or hybrid molecules containing DNA and RNA containing single-stranded and double-stranded regions. It is not limited to.
  • polynucleotide in the present invention encompasses RNA or DNA, or a triplex region comprising both RNA and DNA.
  • the chains in such regions may be derived from the same molecule or different molecules.
  • the region may include all of one or more of the molecules, but more generally includes only one region of some molecules.
  • One of the molecules in the triplex region is often an oligonucleotide.
  • the term “polynucleotide” also specifically includes cDNA.
  • DNAs or RNAs having exceptional bases such as inosine or modified bases such as tritiated bases are also included within the scope of “polynucleotide”.
  • polynucleotide encompasses all chemically, enzymatically and / or metabolically modified forms of unmodified polynucleotides and is characterized by viruses and cells such as single and multicellular. Also encompassed are chemical forms of DNA and RNA.
  • differentially expressed gene means a gene whose expression is activated to a higher or lower level compared to that in a normal or control subject.
  • the term also encompasses genes whose expression is activated to higher or lower levels at different stages of the same disease.
  • differentially expressed genes may be activated or repressed at the nucleic acid level or protein level, or may undergo alternative splicing that results in different polypeptide products. Such differences can be evidenced, for example, by changes in polypeptide mRNA levels, surface expression, secretion or other partitioning.
  • Differential gene expression compares expression between two or more genes or their gene products, or compares expression ratios between two or more genes or their gene products, or Two products of the same gene that are processed differently, differing between normal subjects and specifically those suffering from the disease of cancer, or different at different stages of the same disease Comparing the products can be included.
  • Differential expression is, for example, temporal or intracellular expression of a gene or its expression product between normal and diseased cells, or between cells that have developed different diseases or are in different disease stages. Includes quantitative and qualitative differences in patterns.
  • expression of a gene is about 2-fold or more, preferably about 4-fold or more, more preferably about “Differential gene expression” is considered to be present when there is a difference of 6-fold or more, most preferably about 10-fold or more.
  • RNA transcripts are transcription determined by normalizing to the level of reference mRNA that may be all of the RNA determined in the specimen or a specific set of reference mRNAs. Used to mean product level.
  • gene amplification refers to the process of forming multiple copies of a gene or gene fragment in a specific cell or cell line.
  • the replication region (amplified strand of DNA) is often referred to as the “amplicon”.
  • the amount of mRNA produced that is, the level of gene expression, also increases in proportion to the copy number of the expressed gene.
  • the present invention provides a test method for predicting the prognosis of cancer.
  • the test method of the present invention includes a step of measuring the expression level of a prognosis-related gene in a biological sample collected from a cancer patient with respect to a transcription product or translation product of the gene.
  • the prognostic-related gene used as an index of the present invention is composed of 2 to 277 genes selected from the following prognostic-related gene signature (hereinafter sometimes simply referred to as “gene signature”) (1).
  • the prognosis-related gene is preferably composed of 3 or more, 5 or more, 10 or more, 15 or more, 20 or more, or 25 or more genes.
  • the individual genes constituting the gene signature (1) are known, and their base sequences and amino acid sequences are also known. A list of these 277 genes is shown in Tables 1-1 to 1-5.
  • the index should be 2 to 146 genes selected from the following prognostic gene signature (2) selected from the above gene signature (1) Is preferred.
  • the prognosis-related gene is more preferably composed of 3 or more, 5 or more, 10 or more, 15 or more, 20 or more, or 25 or more genes.
  • Prognostic gene signature (2) ADAM10; ADAM19 (includes EG: 8728); ADAM8; ADCY6; ADRBK2; ALOX15B; ARID3B; ATF2; BCAR3; BPGM; CASP4; CAT; CD3EAP; CDC42; CDKN1A; CENPF; CHODL; CHST2; CLEC2B; CSNK1D; CTGF; CXCL1; CXCR7; CYP2U1; DDEFL1; DDX21; DHCR7; DSCAM; DUSP1; DUSP4; EIF2AK2; ENC1; ETS2; EWSR1; FER1L4 (includes EG: 80307); FZD10; GAD1; GNB1; GRB10; HADH; HBEGF; HGS; HIST3H3; HMGCR; HMGCS1; HNRPM; HSD11B1; HSPA1A; HSPA5; HSPA
  • the test method of the present invention targets stage I lung cancer
  • the prognosis-related gene is more preferably composed of 3 or more, 5 or more, 10 or more, 15 or more, 20 or more, or 25 or more genes. Since specimens of stage I lung cancer are relatively homogeneous from the viewpoint of gene expression, it is said that it is generally difficult to predict the prognosis based on the difference in gene expression, but the gene signature (3) of the present invention is used. By using the index, prognosis can be easily predicted.
  • Prognostic gene signature (3) ADAM10; ADAM19 (includes EG: 8728); ADAM8; ADCY6; ADRBK2; ALOX15B; ATF2; BPGM; CASP4; CD3EAP; CDC42; CDC42EP2; CDKN1A; CENPF; CHST2; CLEC2B; COTL1; CNK1D; CXCR7; CYP1A1; CYR61; DDEFL1; DDX21; DUSP1; DUSP4; DUSP5; ETS2; FER1L4 (includes EG: 80307); FOSL1; FZD10; GAD1; GAPDH; GDNF; GNB1; GNG11; GNG4; HMGCR; HMGCS1; HNRPM; HOPX; HSPA1A; HSPA5; HSPA8; HSPB1; ID1; IER3; IGFBP2; IGFBP3; IGFBP6; IL1
  • the expression level of a prognosis-related gene can be measured by a method known per se using a diagnostic agent for predicting the prognosis of cancer of the present invention described below.
  • a method for measuring the expression level of the prognosis-related gene will be described later.
  • the diagnostic agent of the present invention contains a reagent for detecting the expression level of 2 to 277 prognostic genes selected from the gene signature (1).
  • the reagent may be any substance or means that can detect the expression level of a prognosis-related gene, and preferably comprises a primer, a nucleic acid probe, and an antibody for a transcription product or translation product of a prognosis-related gene. You can choose from a group.
  • the primer contained in the diagnostic agent of the present invention is not particularly limited as long as amplification and detection of a prognostic gene can be performed.
  • the primer size is at least about 12 bases in length, preferably about 15-100 bases in length, more preferably about 16-50 bases in length, and even more preferably about 18-35 bases in length.
  • the number of primers contained in the diagnostic agent of the present invention is not particularly limited, but the diagnostic agent of the present invention is classified into one type of prognosis-related gene.
  • two or more primers may be included. Two or more primers may be mixed in advance or may not be mixed. Such a primer can be prepared by a method known per se. The primer design method will be described later.
  • the nucleic acid probe contained in the diagnostic agent of the present invention is not particularly limited as long as it enables detection of a transcription product of a prognostic gene.
  • the nucleic acid probe can be DNA, RNA, modified nucleic acid, or a chimeric molecule thereof, but DNA is preferable in consideration of stability, convenience and the like. Nucleic acid probes can also be either single-stranded or double-stranded.
  • the size of the nucleic acid probe is not particularly limited as long as it can specifically hybridize to a transcript of a prognosis-related gene. For example, the length is about 15 or 16 bases or more, preferably about 15 to 1000 bases, more preferably about 20 to It is 500 bases long, more preferably about 20-80 bases long.
  • the nucleic acid probe may be provided in a form immobilized on a substrate like a nucleic acid array. Such a nucleic acid probe can be prepared by a method known per se.
  • the antibody contained in the diagnostic agent of the present invention is not particularly limited as long as it is an antibody that can specifically bind to a translation product of a prognosis-related gene.
  • the antibody against the translation product may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • the antibody may also be a fragment of an antibody (eg, Fab, F (ab ′) 2 ), a recombinant antibody (eg, scFv).
  • the antibody may be provided in a form immobilized on a substrate such as a plate.
  • the antibody can be prepared by a method known per se.
  • a polyclonal antibody has a translation product of a prognostic gene or a partial peptide thereof (if necessary, a complex cross-linked to a carrier protein such as bovine serum albumin, KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin)) as an antigen.
  • a commercially available adjuvant eg, complete or incomplete Freund's adjuvant
  • the antibody titer of a partially collected serum is determined by a known antigen-antibody reaction
  • the increase can be confirmed by collecting the whole blood about 3 to about 10 days after the final immunization and purifying the antiserum.
  • animals to which the antigen is administered include mammals such as rats, mice, rabbits, goats, guinea pigs, and hamsters.
  • Monoclonal antibodies can be obtained by cell fusion methods (eg, Takeshi Watanabe, principles of cell fusion methods and preparation of monoclonal antibodies, Akira Taniuchi, Toshitada Takahashi, “Monoclonal Antibodies and Cancer: Basic and Clinical”, 2-14). Page, Science Forum Publishing, 1985).
  • a translation product of a prognostic gene or the like is administered to a mouse subcutaneously or intraperitoneally 2-4 times together with a commercially available adjuvant, and the spleen or lymph node is collected about 3 days after the final administration, and white blood cells are collected.
  • the leukocytes and myeloma cells are fused to obtain a hybridoma that produces a monoclonal antibody against the translation product.
  • Cell fusion may be PEG method [J. Immunol. Methods, 81 (2): 223-228 (1985)] or voltage pulse method [Hybridoma, 7 (6): 627-633 (1988)].
  • a hybridoma producing a desired monoclonal antibody can be selected by detecting an antibody that specifically binds to an antigen from the culture supernatant using a well-known EIA or RIA method.
  • the culture of the hybridoma producing the monoclonal antibody can be performed in vitro or in vivo such as mouse or rat, preferably mouse ascites, and the antibody can be obtained from the culture supernatant of the hybridoma and the ascites of the animal, respectively.
  • the diagnostic agent of the present invention may be provided in the form of a kit including means for measuring a complex of a transcription product or translation product of a prognostic gene and a reagent in addition to the reagent.
  • the reagent and the measurement means included in the kit may be provided in a form isolated from each other, for example, stored in different containers.
  • the measuring means may be a detection substance labeled with a labeling substance according to the type of reagent.
  • the labeling substance examples include fluorescent substances such as FITC and FAM, luminescent substances such as luminol, luciferin, and lucigenin, radioisotopes such as 3 H, 14 C, 32 P, 35 S, and 123 I, biotin, streptavidin, and the like. And the like.
  • the diagnostic agent of the present invention may be provided in the form of a kit containing further components in addition to the reagent and the measurement means. More specifically, when the diagnostic agent of the present invention is provided in the form of a kit, it may contain additional components depending on the type of reagent and measuring means.
  • the kit may further comprise a reverse transcriptase, a nucleic acid extract or a nucleic acid extraction device.
  • the kit may further include a nucleic acid extract or a nucleic acid extraction device.
  • the measurement means is an antibody
  • the kit may further include a protein extract or a protein extractor.
  • the diagnostic agent of the present invention when provided in the form of a kit, it may further include means for collecting a biological sample from a cancer patient.
  • Such collection means is not particularly limited, and examples thereof include biopsy instruments such as biopsy needles and blood collection instruments.
  • the diagnostic agent of the present invention is preferably provided in the form of an array, and examples include nucleic acid arrays (synonymous with microarrays) and antibody arrays.
  • a preferred nucleic acid array is a cancer prognosis array comprising nucleic acid probes each of which is immobilized on a solid surface and hybridizes to 2 to 277 genes selected from prognosis-related gene signature (1).
  • the solid that becomes the support of the nucleic acid array is not particularly limited as long as it is a support that is usually used in the art, and examples thereof include membranes (for example, nylon film), glass, plastics, metals, and the like.
  • a form of the nucleic acid array in the present invention a form well known in the art can be used. For example, an array in which nucleic acids are directly synthesized on a support (so-called affiliometric method), or a nucleic acid is immobilized on the support. Array (so-called Stanford method), fiber type array, electrochemical array (ECA), etc. (for example, see JP-A-2005-102694).
  • the present invention provides a method for predicting the possibility that a patient diagnosed with lung cancer will survive for a long time without recurrence of lung cancer by applying the test method and diagnostic agent of the present invention.
  • the prediction method of the present invention includes the following steps: (A) The expression level of a prognosis-related gene in cancer cells collected from the patient, the expression level of all transcripts or expression products in the cancer cells, or transcription for the transcription product or translation product of the prognosis-related gene Normalizing and determining the expression level of the product or reference set of expression products; (B) the step of subjecting the data obtained in step (a) to statistical analysis; and (c) the long-term survival probability of the patient is high or low based on the analysis result obtained in step (b). A step of determining whether or not.
  • the prognostic genes used in the prediction method of the present invention are as described above.
  • the prediction method of the present invention allows not only long-term viability but also clinical stage classification (IA, IB, IIA, IIB, IIIA, IIIB, IV).
  • the present invention also provides a method for creating individual genomic profiles for lung cancer patients by applying the test methods and diagnostic agents of the present invention.
  • the method for creating a genome profile of the present invention comprises the following steps: (A) a step of subjecting RNA extracted from cancer cells collected from the patient to gene invention analysis; (B) The expression level in cancer cells of two or more genes selected from the prognosis-related gene signature (1) is measured, the expression levels are normalized with respect to the control gene, and if necessary, the tissue set for lung cancer reference And (c) generating a report summarizing the data obtained by the gene invention analysis.
  • prognostic genes used in the genome profiling of the present invention are as described above.
  • Gene expression profiling methods include methods based on polynucleotide analysis, methods based on polynucleotide sequencing, and methods based on proteomics.
  • the most commonly used method known in the art for quantifying mRNA expression in a sample includes Northern blotting and in situ hybridization ((Parker & Barnes, Methods in Molecular Biology 106: 247).
  • RT-PCR Gene expression profiling by PCR
  • RT-PCR is the most sensitive and most flexible quantification method, comparing mRNA levels in different sample populations, normal and cancerous tissues, with or without drug treatment, It can be used to characterize expression patterns, to distinguish closely related mRNAs, and to analyze RNA structures.
  • the first step is to isolate RNA from the biological sample.
  • the starting material is generally total RNA isolated from human cancers or cancer cell lines and corresponding normal tissues or cell lines, respectively.
  • RNA can be expressed in a variety of primary cancers, metastatic cancers or cancer cell lines, including breast, lung, colon, prostate, brain, liver, kidney, pancreas, spleen, thymus, testis, ovary, uterus, and other cancers. Or from a biological sample taken from a healthy donor. If RNA is derived from primary cancer or metastatic cancer, RNA can be extracted from frozen or stored paraffin-embedded and fixed (formalin-fixed) tissue samples.
  • RNA isolation can be performed according to the manufacturer's instructions using a purification kit, buffer set, and protease obtained from a manufacturer such as Qiagen.
  • a purification kit for example, total RNA of cultured cells can be isolated using Qiagen's RNeasy mini column.
  • Other commercially available RNA isolation kits include the registered trademark MasterPure total DNA and RNA purification kit (registered trademark EPICENTRE, Madison, WI), and a paraffin block RNA isolation kit (Ambion, Inc.). is there.
  • Total RNA from tissue samples can be isolated using RNA Stat-60 (Tel-Test).
  • RNA prepared from cancer may be purified by, for example, cesium chloride concentration gradient centrifugation.
  • RNA cannot be used as a template for PCR
  • the first step in gene expression profiling by RT-PCR is to reverse-transcribe the RNA template into cDNA and then amplify it exponentially in a PCR reaction.
  • the two most widely used reverse transcriptases are avian myeloblastosis virus reverse transcriptase (AMV-RT) and Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (MMLV-RT).
  • AMV-RT avian myeloblastosis virus reverse transcriptase
  • MMLV-RT Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase
  • the reverse transcription process is generally initiated with specific primers, random hexamers, or oligo-dT primers, depending on the environment and the purpose of expression profiling.
  • the extracted RNA can be reverse transcribed using the GeneAmp RNA PCR kit (Perkin Elmer, CA, USA) according to the manufacturer's instructions.
  • the obtained cDNA can be used as a template in the
  • thermostable DNA-dependent DNA polymerases are used in the PCR process, but generally have 5′-3 ′ nuclease activity but no 3′-5 ′ proofreading exonuclease activity.
  • Taq DNA polymerase is used. That is, the registered trademark TaqMan® PCR generally uses the 5 ′ nuclease activity of Taq polymerase or Tth polymerase to hydrolyze the hybridization probe bound to its target amplicon, but the same 5 'An enzyme having nuclease activity can also be used.
  • Two oligonucleotide primers are used to generate an amplicon unique to the PCR reaction.
  • a probe In order to detect the base sequence existing between the two primers, another oligonucleotide, ie, a probe is designed.
  • This probe cannot be extended by Taq DNA polymerase enzyme, and is labeled with a fluorescent dye for reporter and a fluorescent dye for quencher.
  • a fluorescent dye for reporter When these two types of dyes are on the probe and close to each other, the light generated by the laser from the reporter dye is quenched by the quencher dye.
  • the Taq DNA polymerase enzyme cleaves the probe in a template-dependent manner. The resulting probe fragment dissociates into solution, releasing the signal from the released reporter dye from the quenching action of the second fluorophore. Since one molecule of the reporter dye is released each time a new molecule is synthesized, the data can be interpreted quantitatively based on the detection of the reporter dye that is not quenched.
  • the registered trademark TaqMan® RT-PCR is, for example, the registered trademark ABI® PRISM® 7700 Sequence Detection Kit (Perkin-Elmer-Applied® Biosystems, ® Foster® City, CA, USA) or Lightcycler (Roche® Molecular Chemistry's commercially available device). Can be used.
  • the 5 'nuclease method is performed on a real-time quantitative PCR device such as the registered trademark ABI® PRISM® 7700 sequence detection kit.
  • This device consists of a thermocycler, laser, charge coupled device (CCD) camera and computer. This apparatus amplifies samples that are in a 96-well format on a thermocycler. During the amplification process, the fluorescence signal generated by the laser is collected in real time through a fiber optic cable for all 96 wells and detected by CCD.
  • the device includes software for operating the instrument and for analyzing the data.
  • the 5 'nuclease assay data is first expressed as Ct or threshold cycle.
  • Ct critical cycle
  • ⁇ RT-PCR is usually performed using an internal standard to minimize error and sample-to-sample variation effects.
  • An ideal internal standard is one that is expressed at a constant level in various tissues and is not affected by experimental processing.
  • the most frequently used RNAs to normalize gene expression patterns are the housekeeping genes glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) and ⁇ -actin mRNA.
  • a newer variation of the RT-PCR technique is real-time quantitative PCR, which determines PCR product accumulation with a dual-labeled fluorogenic probe (eg, registered trademark Taqman probe).
  • Real-time PCR is quantitative using the normalization gene contained in the sample or the housekeeping gene for RT-PCR in quantitative competitive PCR used to normalize internal competitor molecules for each target sequence. Also suitable for comparative PCR. For further details see, for example, Held et al. Genome Research 6: 986-994 (1996).
  • the PCR product of the competitor molecule and cDNA is subjected to primer extension treatment to generate different mass signals for the PCR product derived from the competitor molecule and cDNA.
  • primer extension treatment to generate different mass signals for the PCR product derived from the competitor molecule and cDNA.
  • these products are purified, they are dispensed into a chip array that is preloaded with components necessary for analysis by matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS).
  • MALDI-TOF MS matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry
  • the cDNA present in the reaction solution is quantified by analyzing the ratio of the peak region of the created mass spectrum. For further details see, for example, Ding and Cantor, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 3059-3064 (2003).
  • Additional PCR techniques include, for example, the differential display method (Liang and Pardee, Science 257: 967-971 (1992)); amplified fragment length polymorphism (iAFLP) (Kawamoto et al., Genome Res. 12: 1305- 1312 (1999)); registered bead array technology (Illumina, San Diego, CA; Olifant et al., Discovery of Markers for Disease (Supplement to Biotechniques, 18 et al., Et al., Et al. )); Lum available in the market for rapid gene expression assays a bead array for gene expression (BADGE) (Yang et al., Genome Res.
  • iAFLP amplified fragment length polymorphism
  • BADGE bead array for gene expression
  • RNA Differential gene expression can also be identified or confirmed using microarray technology. That is, the expression profile of prognostic genes can be determined using microarray technology in either fresh cancer tissue or paraffin-embedded cancer tissue.
  • the polynucleotide sequence of interest (such as cDNA and oligonucleotide) is plated or aligned on a microchip substrate. The aligned sequence is then hybridized with a specific DNA probe derived from the target cell or tissue.
  • the source of RNA is cancer or a cancer cell line and total RNA isolated from the corresponding normal tissue or cell line.
  • RNA is derived from primary cancer, RNA can be extracted from frozen or stored paraffin-embedded and fixed (formalin-fixed) tissue samples. It can be prepared and stored very commonly.
  • PCR amplified insert sequences of cDNA clones are loaded onto a substrate at high density.
  • a fluorescently labeled cDNA can be prepared by incorporating a fluorescent label by reverse transcription of RNA extracted from the target tissue. Labeled cDNA applied to the chip hybridizes with specificity to DNA spots on the array. After high stringency washing to remove non-specific binding, the chip is scanned by another detection method such as a confocal laser microscope or a CCD camera. Quantifying the hybridization of the components on each array makes it possible to estimate the abundance of the corresponding mRNA. Two-color fluorescence methods are used to hybridize pairs of pairs of cDNAs made from two RNA sources and labeled separately.
  • the relative abundance of transcripts corresponding to each specific gene from these two sources is determined simultaneously.
  • simple and rapid evaluation of the expression patterns of many genes becomes available.
  • Such methods have been shown to have the sensitivity required to detect rare transcripts that are expressed only a few copies per cell, and reproducibly detect differences in expression levels of at least about twice. (Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (2): 106-149 (1996).
  • it can also be detected by a one-color fluorescence method.
  • Microarray analysis methods can be performed by commercially available equipment, such as using Affymetrix GeneChip technology, Agilent Technologies microarray technology or Incyte microarray technology, according to the manufacturer's instructions.
  • the gene expression continuous analysis method is a method capable of simultaneously and quantitatively analyzing a large number of gene transcripts without the need to prepare a hybridization probe for each transcript. First, if a short sequence tag (approximately 10-14 base pairs) is obtained from a unique position within each transcript, a tag is generated that contains sufficient information to identify each transcript individually. Multiple transcripts can then be ligated together to form long, continuous molecules that can be sequenced and reveal the identity of multiple tags simultaneously. The expression pattern of a population of transcripts can be assessed quantitatively by determining the amount of each tag and identifying the gene corresponding to each tag. For further details see, for example, Velculescu et al. , Science 270: 484-487 (1995); and Velculescu et al. , Cell 88: 243-51 (1997).
  • Immunohistochemistry is also suitable for detecting the expression level of the prognostic genes of the present invention. That is, expression is detected using an antibody specific for each prognostic gene product. These antibodies can be detected by directly labeling the antibodies themselves with, for example, radioactive labels, fluorescent labels, biotin, or hapten labels such as horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. Alternatively, an unlabeled primary antibody is used with a labeled secondary antibody, including antisera, polyclonal antisera, or monoclonal antibodies specific for the primary antibody. Immunohistochemistry protocols and kits are well known in the art and are commercially available.
  • proteomics is defined as all of the proteins present in a sample (eg, tissue, organism, or cell culture) at a given time.
  • proteomics involves examining the overall change in protein expression in a sample (also referred to as “expression proteomics”).
  • Proteomics generally includes the following steps: (1) separation of each protein in a sample by 2-D gel electrophoresis (2-D PAGE), (2) identification of each protein recovered from this gel, For example, mass spectrometry or N-terminal sequencing and (3) data analysis using bioinformatics.
  • the proteomic method is a useful adjunct to other gene expression profiling methods and can be used alone or in combination with other methods to detect the products of the prognostic genes of the present invention.
  • the gene expression data is analyzed to determine the best treatment options available to the patient, based on the characteristic gene expression patterns identified in the examined cancer samples, depending on the predicted likelihood of cancer prognosis. Identify.
  • An important aspect of the present invention is to provide prognostic information using measured expression of certain genes by lung cancer tissue.
  • this assay generally measures and incorporates the expression of certain normalized genes, such as well-known housekeeping genes such as GAPDH and Cyp1.
  • normalization can be based on the mean or median (Ct) of signals of all measured genes, or a large subset thereof. The measured and normalized amount of patient cancer mRNA is compared for each gene with the amount found in the lung cancer tissue reference set.
  • N the number of lung cancer tissues (N) in this reference set is large enough, it is certain that another reference set (as a whole) will behave essentially the same. If this condition is met, the identity of each lung cancer tissue in a specific set should not have a significant effect on the relative amount of genes measured.
  • PCR primers and probes are designed based on intron sequences present in the gene to be amplified.
  • the first step in primer / probe design is to reveal intron sequences within the gene. This is described in Kent, W. et al. J. et al. Genome Res. 12 (4): 656-64 (2000), and can be performed by published software such as DNA BLAST, or by BLAST software including variations thereof.
  • PCR primer design The most important factors considered in PCR primer design are primer length, melting temperature (Tm), and G / C content, specificity, complementary primer sequence, and 3'-end sequence, etc. .
  • optimal PCR primers are usually 17-30 bases in length and contain about 20-80% G + C bases, eg, about 50-60%.
  • Tm is between 50 and 80 ° C, for example about 50 to 70 ° C is generally preferred.
  • EGF epidermal growth factor
  • SAECs Cell Culture Normal human peripheral airway epithelial cells
  • SAGM medium CAMBREX
  • A549, PC9 and PC13 in RPMI 1640 medium supplemented with (Nakarai tesque) 10% fetal calf serum (FBS) (JRH Biosciences), 100 U / ml penicillin (Nakarai tesque) and 100 ⁇ g / ml streptomycin (Nakarai tesque) Grow.
  • the cells were cultured under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • Antibody Anti-human EGFR antibody was purchased from Medical & Biological Laboratories co.
  • Anti-c-ErbB2 / c-Neu (Ab-3) antibody was purchased from Calbiochem.
  • Anti-erbB-3 / HER-3 (clone2F12) antibody was purchased from upstate.
  • MAPK mitogen activated protein kinase
  • HRP horseradish peroxidase conjugated anti-mouse / rat / rabbit immunoglobulin G (IgG) antibody
  • IgG immunoglobulin G
  • HRP conjugated anti-goat IgG Ab Santa Cruz Biotechnology
  • Cell Proliferation Assay Cells are seeded on 96-well collagen-coated plates with medium containing the substance to be tested (EGF (100 ng / ml) or EGFR inhibitor (0.5 ⁇ M)) and the cells are incubated at 37 ° C. for 24 hours or Incubated for 72 hours. RNA was recovered after cell number was determined using CellTiter 96 (registered trademark, Promega) according to the manufacturer's instructions.
  • EGF 100 ng / ml
  • EGFR inhibitor 0.5 ⁇ M
  • RNA isolation Total RNA was isolated from each sample using TRIzol® reagent (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions. The quality and integrity of total RNA was evaluated with 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). RNA samples with a complete RNA number (RIN) greater than 8 were used for further analysis.
  • RNA samples were labeled using an Agilent low RNA input linear amplification kit (Agilent Technologies) according to the manufacturer's instructions. Briefly, 500 ng of total RNA was amplified and labeled using Cyanine 3-CTP. Hybridization was performed using gene expression hybridization kit (Agilent Technologies) according to the manufacturer's instructions. That is, 1.65 ⁇ g of sample cRNA was subjected to fragmentation (30 minutes, 60 ° C.), then in a rotary oven (10 rpm, 65 ° C., 17 hours), 44K Agilent Whole Human Genome Oligo Microarray (G41112F) (Agilent Technologies) Hybridization was performed above. Slides were disassembled and washed with Agilent Gene Expression Wash Buffers 1 and 2 (Agilent Technologies) according to the manufacturer's instructions.
  • Agilent Gene Expression Wash Buffers 1 and 2 Agilent Gene Expression Wash Buffers 1 and 2 (Agilent Technologies) according to the manufacturer's instructions.
  • Microarray data acquisition and processing Microarrays were scanned with a dynamic autofocus microarray scanner (Agilent Technologies) using parameters provided by Agilent (Green PMT set to 100%, scan resolution set to 5 ⁇ m).
  • Feature Extraction Software v7 (Agilent Technologies) was used to obtain raw signal values and qualitative flags (present, bound, absent).
  • Median shift normalization was applied to the signal from each microarray. That is, the median of the processed signal on the microarray is 1. Normalized signals after log transformation with base were used.
  • FIGS. 1 and 2 show the relationship between prognosis-related gene signatures (1), (2) and (3) obtained using microarray data and state space model analysis processed as described above.
  • the prognosis-related gene signature (2) corresponds to SetD_sub2 in FIG. 1
  • the prognosis-related gene signatures (1) and (3) correspond to Set Ip04 and Set Ip04s01 in FIG. 2, respectively.
  • 3-5 are Kaplan-Meier curves that predicted prognosis of lung cancer using prognosis-related gene signatures (2) and (3). From this result, it was found that signature (2) is effective for all stages of lung cancer and signature (3) is effective for stage I lung cancer.
  • the cancer prognosis diagnosis method advances, and it becomes possible to select a treatment method that is more effective and has fewer side effects for cancer patients.
  • the present invention is expected to contribute to the improvement of QOL of cancer patients and the medical economy.

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Abstract

　癌、特に肺癌の診断に有用な遺伝子シグネチャーを提供し、かかるシグネチャーを利用した癌の診断方法を提供する。癌の予後を予測するための試験方法であって、癌患者から採取した生体試料における予後関連遺伝子の発現レベルを、当該遺伝子の転写産物または翻訳産物を対象として測定する工程を含み、当該遺伝子が２７７の遺伝子群を有する予後関連遺伝子シグネチャー（１）（予後関連遺伝子シグネチャー（１）は明細書中で定義した通りである）から選ばれる方法、および当該予後関連遺伝子の発現レベルを検出するための試薬を含む、癌の予後を予測するための診断薬。

Description

癌の予後を予測するためのバイオマーカー
　肺癌は、１９８５年以来、世界中で最も共通する最も致命的な癌となっている(非特許文献１)。全体的な５年生存率は非常に低く、その解析の取り組みがなされているにも係らず、改善されるに至っていない。肺癌の初期ステージの患者は、手術を受けることを勧められるが、手術後の患者の予後は回復から転移性再発の死に至るまで多様であるように見受けられる。そこで、患者にとって治療の最大の恩恵を得る助けとなるために、信頼性のあるマーカーが早急に求められている。
　マイクロアレイを用いた遺伝子発現プロファイリングを利用して、多くの有望なバイオマーカーがすでに提案されている。しかしながら、これらのバイオマーカーの大多数は、解析に用いた被験者の数の少なさにより議論の余地がある。この問題に取り組むため、Sheddenらは、複数施設における442の肺腺癌の病理学的および臨床的注釈を付けた大規模なマイクロアレイデータの最大のセットを提供した(非特許文献２)。しかし、遺伝子クラスタリング等のいくつかの方法を用いることによって、ステージIサンプルの結果を予測することは困難であることがわかった。さらに、最近の報告では、低度に分化した悪性ヒト腫瘍が胚性幹細胞様遺伝子発現シグネチャーを明らかにしたことが示された(非特許文献３)。前記報告は、以前には記述されていなかった腫瘍の病原性と胚性幹細胞の状態とのリンクを同定した。
　非小細胞肺癌(NSCLC)を含む多くのタイプの癌において上皮増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)の過剰発現が報告されている(非特許文献４)。また、最近の研究では、ＥＧＦＲを含むＭＡＰＫ経路が肺腺癌において最も有意に変異していることも報告されている(非特許文献５)。
　一例として、乳癌の予後の診断ツールとして、再発リスクを予測する遺伝子検査法が知られており（特許文献１、２）、遺伝子テスト「マンマプリント」として販売されている。
特表２００５－５１９６２４号公報 特表２００７－５２１００５号公報
Parkin, DM. et al., CA A Cancer Journal for Clinicians vol. 55 p74-108, 2005 Shedden, D. et al., Nature Medicine vol.14, pp.822-827, 2008 Ben-Porath, I. et al., Nature Genetics vol.40 p499- p507, 2008 Perez-Soler, R. et al., The Oncologist vol.9 p58-67, 2004 Ding, L. et al., Nature vol.455 p1069- 1075, 2008
　前記したように、乳癌の予後の診断方法は比較的良く確立されつつあり、乳癌患者のＱＯＬを高めることが期待されている。しかし、肺癌の予後を的確に診断するツールの開発は遅れており、肺癌患者のＱＯＬを向上させることが望まれている。本発明の目的は、癌、特に肺癌の診断に有用な遺伝子シグネチャーを提供し、かかるシグネチャーを利用した癌の診断ツールを提供することにある。また、本発明の目的は、肺癌の初期ステージ、特にステージＩの新規予後マーカーを同定することにある。
　そこで、本発明者らは、腫瘍の多様性により単に多数の腫瘍を比較するだけでは有効な予測因子に到達することが困難であるので、正常な肺細胞から共通のシグネチャーを見出しうるとの仮説を立てた。さらに、本発明者らは、非小細胞肺癌(NSCLC)を含む多くのタイプの癌においてＥＧＦＲの過剰発現が報告されているので(Perez-Soler, R. et al.)、ＥＧＦＲに焦点を当てた。また、最近の研究では、ＥＧＦＲを含むＭＡＰＫ経路が肺腺癌において最も有意に変異していることも報告されている(Ding, L. et al.)。総合的に判断して、本発明者らは、ＥＧＦで刺激した正常肺細胞が包括的に肺腺癌において高められるシグナルを模倣するという仮説を提案した。
　本発明者らは、上記の目的を達成すべく鋭意検討した結果、正常な初代肺上皮細胞（SAEC: primary small airway epithelial cells）を培養し、上皮増殖因子（ＥＧＦ）もしくは上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤で処理した細胞または無処理細胞の遺伝子発現プロファイルを相互に比較し、状態空間モデルを用いて変動する遺伝子群を絞り込んだ。本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、肺癌、特に初期ステージの肺癌の予後を予測することに成功し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
〔１〕　癌の予後を予測するための試験方法であって、癌患者から採取した生体試料における予後関連遺伝子の発現レベルを、当該遺伝子の転写産物または翻訳産物を対象として測定する工程を含み、当該遺伝子が下記予後関連遺伝子シグネチャー（１）から選ばれる２～２７７の遺伝子である、方法。
予後関連遺伝子シグネチャー（１）：
ACTA2 (includes EG:59)；ACTB；ACTC1；ADAM10；ADAM12；ADAM17；ADAM19 (includes EG:8728)；ADAM8；ADCY6；ADORA2B；ADRBK2；ALOX15B；AREG；ARID3B；ATF2；ATP2C2 (includes EG:9914)；BCAR3；BMPR2；BPGM；CALML5；CASP1；CASP4；CAT；CCNA1；CCNB2；CCND1；CCND2；CD3EAP；CDC42；CDC42EP2；CDH3；CDKN1A；CENPF；CHAC1；CHODL；CHST11；CHST2；CLDN5；CLEC2B；COL13A1；COTL1；CREB1；CREB5；CRYAB；CSNK1D；CTGF；CTNNB1；CTSF；CXCL1；CXCR7；CYP1A1；CYP1B1；CYP27B1；CYP2U1；CYR61；DDEF1IT1；DDEFL1；DDIT3；DDX21；DHCR7；DSCAM；DUSP1；DUSP4；DUSP5；DYRK1A；E2F4；EFEMP1；EIF2AK2；ENC1；EPHA2；ETS2；EWSR1；FER1L4 (includes EG:80307)；FERMT1；FGF5；FOSL1；FZD10；GAD1；GAL；GAPDH；GBP2；GDNF；GLRX；GNB1；GNE；GNG11；GNG4；GOT2；GPNMB；GPX1；GPX3；GRB10；GRK6；GRN；GSTZ1；HADH；HBEGF；HES1；HGS；HIST1H4C；HIST3H3；HMGA2；HMGCR；HMGCS1；HMOX1；HNRPM；HOPX；HS3ST2；HSD11B1；HSD17B2；HSPA1A；HSPA5；HSPA8；HSPB1；HSPC159；ID1；IDI1；IER3；IGFBP2；IGFBP3；IGFBP6；IL1A；IL1F5；IL1RN；IL6；INHBA；INPP5D；INPPL1；IRF1；ISG20；ISG20L1；ITGB4；ITGB7；ITGB8；ITPR1；JAG1；JAK3；JUND；KCNJ5；KCTD5；KIAA1199；KLK8；KRT14 (includes EG:3861)；KRT34；KRT5；KRT75；LDLR；LGALS7；LIF；LIMK2；LPXN；MAFF；MAP2K1；MAP2K3；MAP3K3；MAP3K6；MAPK11；MERTK；MLPH；MMP1 (includes EG:4312)；MMP12；MMP3；MRAS；MSN；MT1G；MTHFD2；MTSS1；MVK；MYC；MYL7；MYL9 (includes EG:10398)；MYLK；NAV2 (includes EG:89797)；NCOR2；NDRG1；NFATC4；NFIL3；NFIX；NFKBIA；NMU；NNMT；NP (includes EG:4860)；NUPR1；NXT1；ODC1；PAK2；PALM；PCK2；PDE2A；PDGFB；PDIA3；PDIA4；PDK1；PFKFB3；PH-4；PHLDA2；PIK3C2B；PIK3CD；PKM2；PLA2G3；PLAT；PLCB3；PLCD1；PLCH2；PLD1；PLK1；PLK3；PNPLA3；PODXL；PPAP2A；PPP1R12B；PPP2R5B；PPRC1；PRKCDBP；PRKCI；PSAT1；PTGS1；PTRF；PYGB；PYGL；RAC2；RBP1；RDH16 (includes EG:8608)；RPL35；RPS14；S100A2；SAA4；SALL2；SCG5；SEH1L；SEPW1；SERPINB5；SESN1；SGCA；SH2D2A；SIGLEC15；SLC25A37；SLC29A1；SMAD1；SMO；SMOX；SOD3；SOX2；SOX9；SPDEF；SPRY2；SPRY4；SRC；STX12；STYK1；TAF9；TCF4；TGFB2；THBS1；THRA；TIMP3；TK2；TMSB10；TNF；TPM1；TRAF1；TSC22D1；TUBA1A；TUBA1B；UBD；UBE2C；UBE2D1；UST；VANGL1；VAV3；VCP；VEGFA；WNT4；WNT5B；YWHAQ (includes EG:10971)；ZBED2およびZNF750.
〔２〕　癌がＥＧＦＲファミリー分子の過剰発現または変異した癌細胞に起因するものである、前記〔１〕記載の方法。
〔３〕　肺癌の予後を予測するものである、前記〔１〕または〔２〕記載の方法。
〔４〕　肺癌がステージＩ～ＩＶのいずれかのステージにあり、予後関連遺伝子が下記予後関連遺伝子シグネチャー（２）から選ばれる２～１４６の遺伝子である、前記〔３〕記載の方法。
予後関連遺伝子シグネチャー（２）：
ACTC1；ADAM10；ADAM19 (includes EG:8728)；ADAM8；ADCY6；ADRBK2；ALOX15B；ARID3B；ATF2；BCAR3；BPGM；CASP4；CAT；CD3EAP；CDC42；CDKN1A；CENPF；CHODL；CHST2；CLEC2B；COL13A1；CREB1；CSNK1D；CTGF；CXCL1；CXCR7；CYP2U1；DDEFL1；DDX21；DHCR7；DSCAM；DUSP1；DUSP4；EIF2AK2；ENC1；ETS2；EWSR1；FER1L4 (includes EG:80307)；FZD10；GAD1；GNB1；GNG11；GNG4；GPNMB；GRB10；HADH；HBEGF；HGS；HIST3H3；HMGCR；HMGCS1；HNRPM；HSD11B1；HSPA1A；HSPA5；HSPA8；HSPB1；ID1；IER3；IGFBP2；IGFBP6；IL1F5；IL1RN；INHBA；INPP5D；ISG20；ITGB8；ITPR1；KCNJ5；KIAA1199；KRT34；KRT5；LDLR；LGALS7；LIF；MAP3K6；MAPK11；MLPH；MRAS；MTHFD2；MTSS1；MVK；MYL7；MYL9 (includes EG:10398)；NCOR2；NDRG1；NFATC4；NMU；NP (includes EG:4860)；NUPR1；ODC1；PAK2；PDGFB；PDK1；PFKFB3；PHLDA2；PIK3CD；PLA2G3；PLD1；PNPLA3；PPAP2A；PPP1R12B；PPRC1；PRKCI；PTRF；PYGL；RAC2；RDH16 (includes EG:8608)；RPS14；S100A2；SALL2；SCG5；SEH1L；SEPW1；SGCA；SH2D2A；SIGLEC15；SLC29A1；SMOX；SOD3；SOX2；SOX9；SPDEF；SPRY2；SPRY4；SRC；TAF9；TGFB2；THRA；TIMP3；TK2；TMSB10；TPM1；TRAF1；TSC22D1；TUBA1A；TUBA1B；UBD；UST；VANGL1；VCP；VEGFA；WNT4；YWHAQ (includes EG:10971)；ZBED2およびZNF750.
〔５〕　肺癌がステージＩにあり、予後関連遺伝子が下記予後関連遺伝子シグネチャー（３）から選ばれる２～１３９の遺伝子である、前記〔３〕記載の方法。
予後関連遺伝子シグネチャー（３）：
ACTC1；ADAM10；ADAM19 (includes EG:8728)；ADAM8；ADCY6；ADRBK2；ALOX15B；ATF2；BPGM；CASP4；CD3EAP；CDC42；CDC42EP2；CDKN1A；CENPF；CHST2；CLEC2B；COTL1；CRYAB；CSNK1D；CTGF；CXCL1；CXCR7；CYP1A1；CYR61；DDEFL1；DDX21；DUSP1；DUSP4；DUSP5；ETS2；FER1L4 (includes EG:80307)；FOSL1；FZD10；GAD1；GAPDH；GDNF；GNB1；GNG11；GNG4；GPNMB；GRB10；HBEGF；HGS；HMGA2；HMGCR；HMGCS1；HNRPM；HOPX；HSPA1A；HSPA5；HSPA8；HSPB1；ID1；IER3；IGFBP2；IGFBP3；IGFBP6；IL1A；IL1F5；IL1RN；INHBA；ISG20；ISG20L1；ITGB7；ITGB8；ITPR1；JUND；KCNJ5；KIAA1199；KRT14 (includes EG:3861)；KRT5；LDLR；LGALS7；LIF；LPXN；MLPH；MMP1 (includes EG:4312)；MMP12；MMP3；MRAS；MTHFD2；MTSS1；MVK；MYL9 (includes EG:10398)；MYLK；NCOR2；NDRG1；NFATC4；NFIL3；NMU；NP (includes EG:4860)；NUPR1；ODC1；PAK2；PALM；PCK2；PDGFB；PDIA4；PFKFB3；PHLDA2；PIK3CD；PLAT；PPAP2A；PPRC1；PTRF；RAC2；RDH16 (includes EG:8608)；RPS14；S100A2；SALL2；SEH1L；SEPW1；SERPINB5；SESN1；SH2D2A；SLC25A37；SLC29A1；SMOX；SOX2；SOX9；SPDEF；SPRY2；SPRY4；TAF9；TGFB2；THRA；TIMP3；TMSB10；TSC22D1；TUBA1A；UBD；UBE2C；UST；VCP；VEGFA；YWHAQ (includes EG:10971)；ZBED2およびZNF750.
〔６〕　癌の予後を予測するための診断薬であって、下記予後関連遺伝子シグネチャー（１）から選ばれる２～２７７の予後関連遺伝子の発現レベルを検出するための試薬を含有する診断薬。
予後関連遺伝子シグネチャー（１）：（上記と同義である）
〔７〕　癌がＥＧＦＲファミリー分子の過剰発現または変異した癌細胞に起因するものである、前記〔６〕記載の診断薬。
〔８〕　肺癌の予後を予測するものである、前記〔６〕または〔７〕記載の診断薬。
〔９〕　肺癌がステージＩ～ＩＶのいずれかのステージにあり、予後関連遺伝子が下記予後関連遺伝子シグネチャー（２）から選ばれる２～１４６の遺伝子である、前記〔８〕記載の診断薬。
予後関連遺伝子シグネチャー（２）：（上記と同義である）
〔１０〕　肺癌がステージＩにあり、予後関連遺伝子が下記予後関連遺伝子シグネチャー（３）から選ばれる２～１３９の遺伝子である、前記〔８〕記載の診断薬。
予後関連遺伝子シグネチャー（３）：（上記と同義である）
〔１１〕　試薬が予後関連遺伝子の転写産物または翻訳産物に対する、プライマー、核酸プローブおよび抗体から選ばれる、前記〔６〕～〔１０〕のいずれかに記載の診断薬。
〔１２〕　固体表面に固定された、以下の予後関連遺伝子シグネチャー（１）：（上記と同義である）
から選ばれる２～２７７の遺伝子にそれぞれハイブリダイズする核酸プローブを含む、癌の予後診断用アレイ。
〔１３〕　前記核酸プローブが約２０から８０塩基長である、前記〔１２〕記載のアレイ。
〔１４〕　肺癌と診断された患者が肺癌を再発せずに長期間生存する可能性を予測する方法であって、
（ａ）当該患者から採取した癌細胞における予後関連遺伝子の発現レベルを、当該予後関連遺伝子の転写産物または翻訳産物を対象として、当該癌細胞におけるすべての転写産物もしくは発現産物の発現レベル、または転写産物もしくは発現産物の参照用セットの発現レベルに対して正規化して決定する工程；
（ｂ）工程（ａ）で得られたデータを統計解析に供する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）で得られた解析結果に基づいて、当該患者の長期間生存可能性が高いかまたは低いかを決定する工程
を含み、当該予後関連遺伝子が下記予後関連遺伝子シグネチャー（１）から選ばれる２～２７７の遺伝子である方法。
予後関連遺伝子シグネチャー（１）：（上記と同義である）
〔１５〕　肺癌患者に対して個別のゲノムプロファイルを作成する方法であって、
（ａ）当該患者から採取した癌細胞から抽出されたＲＮＡを遺伝子発明解析に供する工程；
（ｂ）予後関連遺伝子シグネチャー（１）：（上記と同義である）
から選ばれる２～２７７遺伝子の当該癌細胞における発現レベルを測定し、当該発現レベルを、コントロール遺伝子に対して正規化し、必要に応じて、肺癌参照用組織セットに見られる量と比較する工程；ならびに
（ｃ）当該遺伝子発明解析によって得られるデータをまとめた報告を作成する工程
を含む方法。
　本発明の試験方法および診断薬を用いることにより、癌の予後を精度良く予測することができ、癌患者に対してより効果的でより副作用の少ない治療方法を選択することが可能となる。本発明の試験方法および診断薬により得られた個々の患者の遺伝子発現プロファイルと当該患者の臨床的情報（性別、年齢、臨床ステージ等）とを組合せることにより、さらに精度の高い予後の予測が可能となる。本発明の予測方法およびゲノムプロファイルの作成方法は、癌患者のオーダーメード治療の進展に寄与することが期待される。本発明は、癌患者のＱＯＬの向上および医療経済への貢献のみならず、治療標的に対応した癌患者を事前に選別することによって、癌の新規治療薬または治療方法の開発の進展にも寄与することが期待される。
予後関連遺伝子シグネチャー（２）を含むサブセットと他のサブセットとの関係を示す図である。 予後関連遺伝子シグネチャー（１）と（３）とを選別した基準を示すグラフである。 予後関連遺伝子シグネチャー（２）の全遺伝子の発現プロファイルを用いて、すべてのステージの肺癌患者の予後を予測可能であることを示すＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ曲線である。 予後関連遺伝子シグネチャー（３）の全遺伝子の発現プロファイルを用いて、ステージＩ肺癌患者の予後を予測可能であることを示すＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ曲線である。 予後関連遺伝子シグネチャー（２）の全遺伝子の発現プロファイルと患者の臨床的情報を組合せて、すべてのステージの肺癌患者の予後を予測可能であることを示すＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ曲線である。
（Ａ．定義）
　本発明において「癌の予後」とは、癌のたどる経過についての医学上の見通しをいう。本発明において「予後の予測」とは、患者が薬剤に芳しくまたは芳しくなく反応する可能性、そのような反応の程度、原発性癌の手術による除去および／または化学療法の後一定期間再発なしに生存する可能性のいずれかを意味する。本発明の試験方法および予測方法を臨床的に利用して、特定の患者に対して最も適切な治療法を選択することによって治療法を決定することができる。本発明の試験方法および予測方法は、ある患者が、外科的介入、所定の薬剤もしくは薬剤の併用による化学療法、または放射線療法などの治療計画に対して良好な反応を示す可能性があるか否か、または、手術もしくは化学療法の終了、またはその他の治療法の後に長期間生存する可能性があるか否かを予測するのに有益な手段である。癌の予後の予測時期は、癌の治療前、治療中、治療後のいずれであってもよい。
　本発明において「長期生存」とは、手術またはその他の治療の後３年以上、好ましくは５年以上、より好ましくは８年以上、最も好ましくは１０年以上生存することを意味する。
　本発明における癌は、ヒトに発生するあらゆる癌を包含するが、ＥＧＦＲファミリー分子の過剰発現または変異した癌細胞に起因する癌が望ましい。ＥＧＦＲファミリー分子の過剰発現または変異に起因する癌としては、胃癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、大腸癌などがあげられるが、これらに限定されるものではない。本発明は、癌の死亡率の上位を占め５年生存率が低い肺癌に対して、より有用な情報を提供することができる。
　肺癌は、小細胞肺癌と非小細胞肺癌に分けられ、それぞれ、ステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶの４つの病期に分類される。ここで、ステージＩとは肺内に癌が限局しておりリンパ節に転移がないこと、ステージＩＩとは肺内に癌が限局し肺内のリンパ節にのみ転移があるか、リンパ節に転移がないが癌が直接肺外の切除できる周囲に拡がっていること、ステージＩＩＩとは他の臓器に転移はしていないが、ステージＩＩより進んだ状態、およびステージＩＶとは他の臓器に転移していることと定義される。さらに、ステージＩ、ＩＩおよびＩＩＩは、それぞれステージＩＡとＩＢ、ステージＩＩＡとＩＩＢ、ステージＩＩＩＡとＩＩＩＢに分類される。肺癌の病期診断については、例えば、ＴＮＭ分類：肺癌取扱い規約、第５版、日本肺癌学会編、金原出版、１９９９、25-32頁を参照のこと。本発明は、非小細胞肺癌、中でも、ステージＩの予後の診断およびステージＩ～ＩＶのすべてのステージの予後の診断に優れる。
　本発明が測定対象とする生体試料は、癌患者に由来するものであれば特に限定されるものではないが、癌組織（癌細胞を含む）、血液、リンパ液、リンパ節（癌が転移したリンパ節を含む）などがあげられる。好ましくは、癌組織（原発性および転移性）および癌の転移が疑われるリンパ節である。
　「ポリヌクレオチド」という用語は、単数形で用いられても複数形で用いられても、ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドであって、未修飾のＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡを意味する。したがって、例えば、本明細書で定義されているポリヌクレオチドには、１本鎖および２本鎖のＤＮＡ、１本鎖および２本鎖の領域を含むＤＮＡ、１本鎖および２本鎖のＲＮＡ、１本鎖および２本鎖の領域を含むＲＮＡ、１本鎖もしくは２本鎖であるか、または、１本鎖および２本鎖の領域を含むＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子などがあるが、これらに限定されるものではない。さらに、本発明において「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡまたはＤＮＡ、またはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三重鎖領域をも包含する。このような領域にある鎖は、同一の分子または異なった分子に由来するものでもよい。該領域は、１つ以上の該分子のすべてを含んでいてもよいが、より一般的には、いくつかの分子の一領域のみを含む。三重鎖領域の分子の１つは、しばしばオリゴヌクレオチドである。「ポリヌクレオチド」という用語は、具体的にはｃＤＮＡをも含む。さらに、イノシンなどの例外的塩基、または、トリチウム化された塩基などの修飾塩基を有するＤＮＡまたはＲＮＡも、「ポリヌクレオチド」の範囲に含まれる。一般的に、「ポリヌクレオチド」という用語は、未修飾ポリヌクレオチドの化学的、酵素的および／または代謝的に修飾された形態のすべてを包含するとともに、ウイルスならびに単細胞および多細胞などの細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学形態も包含する。
　「示差的に発現される遺伝子」、「示差的遺伝子発現」ならびに、単に「発現遺伝子」および「遺伝子発現」という用語は、互換的に使用され、癌、具体的には肺癌などの病気を患う被験者において、その発現が、正常または対照となる被験者における発現と比較して、より高いレベルかより低いレベルに活性化される遺伝子を意味する。この用語は、同じ病気の異なる段階で、その発現がより高いレベルまたはより低いレベルに活性化される遺伝子も包含する。また、示差的に発現される遺伝子は、核酸レベルまたは蛋白質レベルで活性化または抑制されてもよく、あるいは、異なったポリペプチド産物をもたらす選択的スプライシングを受けることもあると理解される。このような違いは、例えば、ポリペプチドのｍＲＮＡレベル、表面発現、分泌またはその他の分配における変化によって証明することができる。示差的遺伝子発現は、２つ以上の遺伝子またはそれらの遺伝子産物の間で発現を比較すること、または、２つ以上の遺伝子またはそれらの遺伝子産物の間における発現比率を比較すること、または、さらに、同じ遺伝子が異なってプロセッシングされた２つの産物であって、正常な被験者と、具体的には癌という病気を患う被験者の間で異なっているか、または、同じ病気のさまざまな段階で異なっている産物を比較することを包含しうる。示差的発現は、例えば、正常および病気の細胞間における、または、異なった病気が発症したか、異なった病気の段階にある細胞間における、遺伝子またはその発現産物の時間的または細胞内での発現パターンの定量的、および定性的な違いを含む。本発明の目的にとって、正常な被験者と癌に罹患した被験者において、または、被験者の癌発症の様々な段階において、ある遺伝子の発現に約２倍以上、好ましくは約４倍以上、より好ましくは約６倍以上、最も好ましくは約１０倍以上の違いがあるときに、「示差的遺伝子発現」が存在するとみなされる。
　ＲＮＡ転写産物について「過剰発現」という用語は、標本中で決定されたＲＮＡのすべてまたは特定の参照用ｍＲＮＡセットであるかもしれない参照用ｍＲＮＡのレベルに対して正規化することによって決定された転写産物のレベルを意味するために用いられる。
　「遺伝子増幅」という用語は、特定の細胞または細胞株において遺伝子または遺伝子断片の複数コピーを形成させる処理を意味する。複製領域（増幅されたＤＮＡの鎖）は、しばしば「単位複製配列（アンプリコン）」と呼ばれる。通常、産生するｍＲＮＡの量、すなわち遺伝子発現のレベルも、発現遺伝子のコピー数に比例して増加する。
（Ｂ．詳細な説明）
　本発明を実施するに当たって、別途記載がない限り、分子生物学（組換え技術など）、微生物学、細胞生物学、および生化学の常法を用いるが、それらは、当技術分野の範囲内である。そのような技術は、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版（（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）；「Ｏｌｉｇｏｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．， １９８４）；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」，第４版（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ＆ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，ＢｌａｃｋＷｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．，１９８７）；「ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ」（Ｆ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ＆ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７）；および「ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ」，（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）などの文献で十分に説明されている。
　本発明は、癌の予後を予測するための試験方法を提供する。本発明の試験方法は、癌患者から採取した生体試料における予後関連遺伝子の発現レベルを、当該遺伝子の転写産物または翻訳産物を対象として測定する工程を含むことを特徴とする。
　本発明が指標とする予後関連遺伝子は、下記予後関連遺伝子シグネチャー（以下、単に「遺伝子シグネチャー」と省略する場合がある）（１）から選ばれる２～２７７の遺伝子から構成される。予後関連遺伝子は、好ましくは３以上、５以上、１０以上、１５以上、２０以上または２５以上の遺伝子から構成される。
　予後関連遺伝子シグネチャー（１）：
ACTA2 (includes EG:59)；ACTB；ACTC1；ADAM10；ADAM12；ADAM17；ADAM19 (includes EG:8728)；ADAM8；ADCY6；ADORA2B；ADRBK2；ALOX15B；AREG；ARID3B；ATF2；ATP2C2 (includes EG:9914)；BCAR3；BMPR2；BPGM；CALML5；CASP1；CASP4；CAT；CCNA1；CCNB2；CCND1；CCND2；CD3EAP；CDC42；CDC42EP2；CDH3；CDKN1A；CENPF；CHAC1；CHODL；CHST11；CHST2；CLDN5；CLEC2B；COL13A1；COTL1；CREB1；CREB5；CRYAB；CSNK1D；CTGF；CTNNB1；CTSF；CXCL1；CXCR7；CYP1A1；CYP1B1；CYP27B1；CYP2U1；CYR61；DDEF1IT1；DDEFL1；DDIT3；DDX21；DHCR7；DSCAM；DUSP1；DUSP4；DUSP5；DYRK1A；E2F4；EFEMP1；EIF2AK2；ENC1；EPHA2；ETS2；EWSR1；FER1L4 (includes EG:80307)；FERMT1；FGF5；FOSL1；FZD10；GAD1；GAL；GAPDH；GBP2；GDNF；GLRX；GNB1；GNE；GNG11；GNG4；GOT2；GPNMB；GPX1；GPX3；GRB10；GRK6；GRN；GSTZ1；HADH；HBEGF；HES1；HGS；HIST1H4C；HIST3H3；HMGA2；HMGCR；HMGCS1；HMOX1；HNRPM；HOPX；HS3ST2；HSD11B1；HSD17B2；HSPA1A；HSPA5；HSPA8；HSPB1；HSPC159；ID1；IDI1；IER3；IGFBP2；IGFBP3；IGFBP6；IL1A；IL1F5；IL1RN；IL6；INHBA；INPP5D；INPPL1；IRF1；ISG20；ISG20L1；ITGB4；ITGB7；ITGB8；ITPR1；JAG1；JAK3；JUND；KCNJ5；KCTD5；KIAA1199；KLK8；KRT14 (includes EG:3861)；KRT34；KRT5；KRT75；LDLR；LGALS7；LIF；LIMK2；LPXN；MAFF；MAP2K1；MAP2K3；MAP3K3；MAP3K6；MAPK11；MERTK；MLPH；MMP1 (includes EG:4312)；MMP12；MMP3；MRAS；MSN；MT1G；MTHFD2；MTSS1；MVK；MYC；MYL7；MYL9 (includes EG:10398)；MYLK；NAV2 (includes EG:89797)；NCOR2；NDRG1；NFATC4；NFIL3；NFIX；NFKBIA；NMU；NNMT；NP (includes EG:4860)；NUPR1；NXT1；ODC1；PAK2；PALM；PCK2；PDE2A；PDGFB；PDIA3；PDIA4；PDK1；PFKFB3；PH-4；PHLDA2；PIK3C2B；PIK3CD；PKM2；PLA2G3；PLAT；PLCB3；PLCD1；PLCH2；PLD1；PLK1；PLK3；PNPLA3；PODXL；PPAP2A；PPP1R12B；PPP2R5B；PPRC1；PRKCDBP；PRKCI；PSAT1；PTGS1；PTRF；PYGB；PYGL；RAC2；RBP1；RDH16 (includes EG:8608)；RPL35；RPS14；S100A2；SAA4；SALL2；SCG5；SEH1L；SEPW1；SERPINB5；SESN1；SGCA；SH2D2A；SIGLEC15；SLC25A37；SLC29A1；SMAD1；SMO；SMOX；SOD3；SOX2；SOX9；SPDEF；SPRY2；SPRY4；SRC；STX12；STYK1；TAF9；TCF4；TGFB2；THBS1；THRA；TIMP3；TK2；TMSB10；TNF；TPM1；TRAF1；TSC22D1；TUBA1A；TUBA1B；UBD；UBE2C；UBE2D1；UST；VANGL1；VAV3；VCP；VEGFA；WNT4；WNT5B；YWHAQ (includes EG:10971)；ZBED2およびZNF750.
　前記遺伝子シグネチャー（１）を構成する個々の遺伝子は公知であり、その塩基配列およびアミノ酸配列も既知である。これら２７７遺伝子のリストを表１－１～１－５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　本発明の試験方法がステージＩ～ＩＶの肺癌を対象とする場合、上記遺伝子シグネチャー（１）の中から選別した下記予後関連遺伝子シグネチャー（２）から選ばれる２～１４６の遺伝子を指標とすることが好ましい。この実施態様において、予後関連遺伝子は、より好ましくは３以上、５以上、１０以上、１５以上、２０以上または２５以上の遺伝子から構成される。
　予後関連遺伝子シグネチャー（２）：
ACTC1；ADAM10；ADAM19 (includes EG:8728)；ADAM8；ADCY6；ADRBK2；ALOX15B；ARID3B；ATF2；BCAR3；BPGM；CASP4；CAT；CD3EAP；CDC42；CDKN1A；CENPF；CHODL；CHST2；CLEC2B；COL13A1；CREB1；CSNK1D；CTGF；CXCL1；CXCR7；CYP2U1；DDEFL1；DDX21；DHCR7；DSCAM；DUSP1；DUSP4；EIF2AK2；ENC1；ETS2；EWSR1；FER1L4 (includes EG:80307)；FZD10；GAD1；GNB1；GNG11；GNG4；GPNMB；GRB10；HADH；HBEGF；HGS；HIST3H3；HMGCR；HMGCS1；HNRPM；HSD11B1；HSPA1A；HSPA5；HSPA8；HSPB1；ID1；IER3；IGFBP2；IGFBP6；IL1F5；IL1RN；INHBA；INPP5D；ISG20；ITGB8；ITPR1；KCNJ5；KIAA1199；KRT34；KRT5；LDLR；LGALS7；LIF；MAP3K6；MAPK11；MLPH；MRAS；MTHFD2；MTSS1；MVK；MYL7；MYL9 (includes EG:10398)；NCOR2；NDRG1；NFATC4；NMU；NP (includes EG:4860)；NUPR1；ODC1；PAK2；PDGFB；PDK1；PFKFB3；PHLDA2；PIK3CD；PLA2G3；PLD1；PNPLA3；PPAP2A；PPP1R12B；PPRC1；PRKCI；PTRF；PYGL；RAC2；RDH16 (includes EG:8608)；RPS14；S100A2；SALL2；SCG5；SEH1L；SEPW1；SGCA；SH2D2A；SIGLEC15；SLC29A1；SMOX；SOD3；SOX2；SOX9；SPDEF；SPRY2；SPRY4；SRC；TAF9；TGFB2；THRA；TIMP3；TK2；TMSB10；TPM1；TRAF1；TSC22D1；TUBA1A；TUBA1B；UBD；UST；VANGL1；VCP；VEGFA；WNT4；YWHAQ (includes EG:10971)；ZBED2およびZNF750.
　本発明の試験方法がステージＩの肺癌を対象とする場合、前記遺伝子シグネチャー（１）の中から選別した下記予後関連遺伝子シグネチャー（３）から選ばれる２～１３９の遺伝子を指標とすることが好ましい。この実施態様において、予後関連遺伝子は、より好ましくは３以上、５以上、１０以上、１５以上、２０以上または２５以上の遺伝子から構成される。ステージＩの肺癌の検体は、遺伝子発現の観点から相対的に均質であるので、遺伝子発現の相違に基づく予後の予想は一般に困難であるといわれているが、本発明の遺伝子シグネチャー（３）を指標とすることにより、予後の予測が容易となる。
　予後関連遺伝子シグネチャー（３）：
ACTC1；ADAM10；ADAM19 (includes EG:8728)；ADAM8；ADCY6；ADRBK2；ALOX15B；ATF2；BPGM；CASP4；CD3EAP；CDC42；CDC42EP2；CDKN1A；CENPF；CHST2；CLEC2B；COTL1；CRYAB；CSNK1D；CTGF；CXCL1；CXCR7；CYP1A1；CYR61；DDEFL1；DDX21；DUSP1；DUSP4；DUSP5；ETS2；FER1L4 (includes EG:80307)；FOSL1；FZD10；GAD1；GAPDH；GDNF；GNB1；GNG11；GNG4；GPNMB；GRB10；HBEGF；HGS；HMGA2；HMGCR；HMGCS1；HNRPM；HOPX；HSPA1A；HSPA5；HSPA8；HSPB1；ID1；IER3；IGFBP2；IGFBP3；IGFBP6；IL1A；IL1F5；IL1RN；INHBA；ISG20；ISG20L1；ITGB7；ITGB8；ITPR1；JUND；KCNJ5；KIAA1199；KRT14 (includes EG:3861)；KRT5；LDLR；LGALS7；LIF；LPXN；MLPH；MMP1 (includes EG:4312)；MMP12；MMP3；MRAS；MTHFD2；MTSS1；MVK；MYL9 (includes EG:10398)；MYLK；NCOR2；NDRG1；NFATC4；NFIL3；NMU；NP (includes EG:4860)；NUPR1；ODC1；PAK2；PALM；PCK2；PDGFB；PDIA4；PFKFB3；PHLDA2；PIK3CD；PLAT；PPAP2A；PPRC1；PTRF；RAC2；RDH16 (includes EG:8608)；RPS14；S100A2；SALL2；SEH1L；SEPW1；SERPINB5；SESN1；SH2D2A；SLC25A37；SLC29A1；SMOX；SOX2；SOX9；SPDEF；SPRY2；SPRY4；TAF9；TGFB2；THRA；TIMP3；TMSB10；TSC22D1；TUBA1A；UBD；UBE2C；UST；VCP；VEGFA；YWHAQ (includes EG:10971)；ZBED2およびZNF750.
　本発明の試験方法において、予後関連遺伝子の発現レベルは、下記本発明の癌の予後を予測するための診断薬を用いて、自体公知の方法により測定することができる。予後関連遺伝子の発現レベルの測定方法は、後述する。
　本発明の診断薬は、前記遺伝子シグネチャー（１）から選ばれる２～２７７の予後関連遺伝子の発現レベルを検出するための試薬を含有する。
　前記試薬は、予後関連遺伝子の発現レベルを検出可能な物質または手段であればいずれを選んでもよいが、好適には、予後関連遺伝子の転写産物または翻訳産物に対する、プライマー、核酸プローブおよび抗体からなる群より選ぶことができる。
　本発明の診断薬に含まれるプライマーは、予後関連遺伝子の増幅及び検出を可能とする限り特に限定されない。例えば、プライマーのサイズは、少なくとも約１２塩基長以上、好ましくは約１５～１００塩基長、より好ましくは約１６～５０塩基長、さらにより好ましくは約１８～３５塩基長である。また、遺伝子増幅法の種類に応じて必要とされるプライマー数が異なるため、本発明の診断薬に含まれるプライマー数は特に限定されないが、本発明の診断薬は、１種類の予後関連遺伝子に対して２以上のプライマーを含んでもよい。２以上のプライマーは、予め混合されていても、混合されていなくてもよい。このようなプライマーは、自体公知の方法により作製することができる。プライマーの設計方法については後述する。
　本発明の診断薬に含まれる核酸プローブは、予後関連遺伝子の転写産物の検出を可能とする限り特に限定されない。核酸プローブはＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾核酸またはそれらのキメラ分子などであり得るが、安定性、簡便性等を考慮するとＤＮＡが好ましい。核酸プローブはまた、１本鎖または２本鎖のいずれでもよい。核酸プローブのサイズは、予後関連遺伝子の転写産物に特異的にハイブリダイズし得る限り特に限定されないが、例えば約１５または１６塩基長以上、好ましくは約１５～１０００塩基長、より好ましくは約２０～５００塩基長、さらにより好ましくは約２０～８０塩基長である。核酸プローブは、核酸アレイのように基板上に固定された形態で提供されてもよい。このような核酸プローブは、自体公知の方法により作製することができる。
　本発明の診断薬に含まれる抗体は、予後関連遺伝子の翻訳産物に特異的に結合し得る抗体である限り特に限定されない。例えば、翻訳産物に対する抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよい。抗体はまた、抗体のフラグメント（例、Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ’)２）、組換え抗体（例、ｓｃＦｖ）であってもよい。抗体は、プレート等の基板上に固定された形態で提供されてもよい。抗体は、自体公知の方法により作製することができる。
　例えば、ポリクローナル抗体は、予後関連遺伝子の翻訳産物あるいはその部分ペプチド（必要に応じて、ウシ血清アルブミン、ＫＬＨ（Keyhole Limpet Hemocyanin）等のキャリアタンパク質に架橋した複合体とすることもできる）を抗原として、市販のアジュバント（例、完全または不完全フロイントアジュバント）とともに、動物の皮下あるいは腹腔内に２～３週間おきに２～４回程度投与し（部分採血した血清の抗体価を公知の抗原抗体反応により測定し、その上昇を確認しておく）、最終免疫から約３～約１０日後に全血を採取して抗血清を精製することにより取得できる。抗原を投与する動物としては、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ハムスターなどの哺乳動物があげられる。
　また、モノクローナル抗体は、細胞融合法（例、渡邊武、細胞融合法の原理とモノクローナル抗体の作成、谷内昭、高橋利忠編、「モノクローナル抗体とがん―基礎と臨床―」、第2-14頁、サイエンスフォーラム出版、1985年）により作製することができる。例えば、マウスに予後関連遺伝子の翻訳産物等を市販のアジュバントと共に２～４回皮下あるいは腹腔内に投与し、最終投与の約３日後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、白血球を採取する。この白血球と骨髄腫細胞（例、NS-1, P3X63Ag8など）を細胞融合して前記翻訳産物に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。細胞融合はＰＥＧ法［J. Immunol. Methods,81(2): 223-228 (1985)］でも電圧パルス法［Hybridoma, 7(6): 627-633 (1988)］であってもよい。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、周知のＥＩＡまたはＲＩＡ法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、培養上清中から検出することにより選択することができる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養は、インビトロ、またはマウスもしくはラット、好ましくはマウス腹水中等のインビボで行うことができ、抗体はそれぞれハイブリドーマの培養上清及び動物の腹水から取得することができる。
　本発明の診断薬は、前記試薬に加え、予後関連遺伝子の転写産物または翻訳産物と試薬との複合体を測定する手段を含む、キットの形態で提供されていてもよい。この場合、キットに含まれる試薬および測定手段は、互いに隔離された形態、例えば、異なる容器に格納された形態で提供され得る。測定用手段は、試薬の種類に応じて、標識用物質で標識された検出物質であってもよい。標識用物質としては、例えば、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ等の蛍光物質、ルミノール、ルシフェリン、ルシゲニン等の発光物質、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２３Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、ストレプトアビジン等の親和性物質などがあげられる。
　本発明の診断薬は、試薬および測定用手段に加え、さらなる構成要素を含むキットの形態で提供されてもよい。より詳細には、本発明の診断薬がキットの形態で提供される場合、試薬および測定用手段の種類に応じたさらなる構成要素を含み得る。例えば、試薬がプライマーである場合、キットは、逆転写酵素、核酸抽出液または核酸抽出装置をさらに含み得る。試薬が核酸プローブである場合、キットは、核酸抽出液または核酸抽出装置をさらに含んでいてもよい。測定用手段が抗体である場合、キットは、蛋白質抽出液または蛋白質抽出装置をさらに含んでいてもよい。
　また、本発明の診断薬がキットの形態で提供される場合、癌患者から生体試料を採取し得る手段をさらに含み得る。かかる採取手段は、特に限定されないが、例えば、生検針等の生検器具、採血器具があげられる。
　本発明の診断薬は、アレイの形態で提供されることが好ましく、核酸アレイ（マイクロアレイと同義）、抗体アレイが例示される。
　好ましい核酸アレイは、固体表面に固定された、予後関連遺伝子シグネチャー（１）から選ばれる２～２７７の遺伝子にそれぞれハイブリダイズする核酸プローブを含む、癌の予後診断用アレイである。
　核酸アレイの支持体となる固体としては、当該分野で通常用いられている支持体であれば特に限定されず、例えば、メンブレン（例えば、ナイロン膜）、ガラス、プラスチック、金属などがあげられる。本発明における核酸アレイの形態としては、当該分野で周知の形態を用いることができ、例えば、支持体上で核酸が直接合成されるアレイ（いわゆるアフィメトリクス方式）、支持体上に核酸が固定化されるアレイ（いわゆるスタンフォード方式）、繊維型アレイ、電気化学的アレイ（ＥＣＡ）等があげられる（例、特開２００５－１０２６９４参照）。
　本発明は、本発明の試験方法および診断薬を適用することにより、肺癌と診断された患者が肺癌を再発せずに長期間生存する可能性を予測する方法を提供する。本発明の予測方法は、下記工程：
（ａ）当該患者から採取した癌細胞における予後関連遺伝子の発現レベルを、当該予後関連遺伝子の転写産物または翻訳産物を対象として、当該癌細胞におけるすべての転写産物もしくは発現産物の発現レベル、または転写産物もしくは発現産物の参照用セットの発現レベルに対して正規化して決定する工程；
（ｂ）工程（ａ）で得られたデータを統計解析に供する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）で得られた解析結果に基づいて、当該患者の長期間生存可能性が高いかまたは低いかを決定する工程
を含むことを特徴とする。
　本発明の予測方法で用いられる予後関連遺伝子は、上述した通りである。本発明の予測方法により、長期間の生存可能性ばかりではなく、臨床的ステージ分類(ＩＡ、ＩＢ、ＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ、ＩＶ)も可能となる。
　また、本発明は、本発明の試験方法および診断薬を適用することにより、肺癌患者に対して個別のゲノムプロファイルを作成する方法を提供する。本発明のゲノムプロファイルの作成方法は、下記工程：
（ａ）当該患者から採取した癌細胞から抽出されたＲＮＡを遺伝子発明解析に供する工程；
（ｂ）予後関連遺伝子シグネチャー（１）から選ばれる２以上の遺伝子の癌細胞における発現レベルを測定し、当該発現レベルを、コントロール遺伝子に対して正規化し、必要に応じて、肺癌参照用組織セットに見られる量と比較する工程；ならびに
（ｃ）該遺伝子発明解析によって得られるデータをまとめた報告を作成する工程
を含むことを特徴とする。
　本発明のゲノムプロファイリングで用いられる予後関連遺伝子は、上述した通りである。
　本発明の方法に適用可能な、遺伝子発現解析方法を以下に説明する。
（１．遺伝子発現プロファイリング）
　遺伝子発現プロファイリングの方法には、ポリヌクレオチド解析に基づく方法、ポリヌクレオチドの配列決定に基づく方法、およびプロテオミクスによる方法などがある。最も一般的に用いられる方法で、サンプル中のｍＲＮＡ発現を定量するために当技術分野において知られている方法には、ノーザンブロッティングおよびインサイチュハイブリダイゼーション（（Ｐａｒｋｅｒ ＆ Ｂａｒｎｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０６：２４７－２８３（１９９９））；ＲＮａｓｅプロテクション・アッセイ法（Ｈｏｄ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：８５２－８５４（１９９２））；および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ－ＰＣＲ）などのＰＣＲ法（Ｗｅｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８：２６３－２６４（１９９２））などがある。あるいは、ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖、およびＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドの二重鎖またはＤＮＡ－蛋白質二重鎖などの特定の二重鎖を識別できる抗体を用いることもできる。配列決定による遺伝子発現解析法の代表的な方法には、遺伝子発現連続解析法（ＳＡＧＥ）、および大規模並列シグネチャー配列決定法（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ＭＰＳＳ）による遺伝子発現解析法などがある。
（２．ＰＣＲによる遺伝子発現プロファイリング法）
（ａ 逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ））
　上記技術の中で、最も感度が高く、最も融通がきく定量法はＲＴ－ＰＣＲであって、異なったサンプル集団、正常組織と癌組織、薬物治療の有無などにおけるｍＲＮＡレベルを比較したり、遺伝子発現のパターンの特徴を調べたり、密接に関係したｍＲＮＡを区別したり、また、ＲＮＡの構造を解析するために利用できる。
　最初の工程は、生体試料からＲＮＡを単離することである。出発物質は、一般的には、ヒトの癌または癌細胞株、およびそれぞれに対応する正常な組織または細胞株から単離された全ＲＮＡである。このように、ＲＮＡは、乳房、肺、結腸、前立腺、脳、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、精巣、卵巣、子宮などの癌など、さまざまな原発性癌、転移性癌または癌細胞株から、あるいは、健康なドナーから採取した生体試料から単離することができる。ＲＮＡが原発性癌または転移性癌に由来するものであれば、凍結されたか、または保管されているパラフィン包埋され固定（ホルマリン固定）された組織サンプルからＲＮＡを抽出することができる。
　ＲＮＡを抽出するための一般的な方法が、当技術分野において周知されており、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ （１９９７）など、分子生物学の標準的な教科書に開示されている。具体的には、Ｑｉａｇｅｎなどの製造業者から入手した精製キット、緩衝液セット、およびプロテアーゼを用いて、製造業者の指示に従ってＲＮＡ単離を行うことができる。例えば、培養されている細胞の全ＲＮＡは、ＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙミニカラムを用いて単離することができる。これ以外の市販されているＲＮＡ単離用キットには、登録商標ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ全ＤＮＡおよびＲＮＡ精製キット（登録商標ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、およびパラフィンブロックＲＮＡ単離用キット（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）などがある。組織サンプルからの全ＲＮＡは、ＲＮＡ Ｓｔａｔ－６０（Ｔｅｌ－Ｔｅｓｔ）を用いて単離することができる。癌から調製されたＲＮＡは、例えば、塩化セシウム濃度勾配遠心法によって精製してもよい。
　ＲＮＡは、ＰＣＲの鋳型としては利用できないため、ＲＴ－ＰＣＲによる遺伝子発現プロファイリングの第一の工程は、ＲＮＡ鋳型を逆転写させてｃＤＮＡとした後、ＰＣＲ反応でそれを指数的に増幅させることである。２つの最も広く使用されている逆転写酵素は、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ－ＲＴ）およびモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ－ＲＴ）である。逆転写工程は、一般的には、環境および発現プロファイリングの目的に応じて、特異的プライマー、ランダムなヘキサマー、またはオリゴ－ｄＴプライマーを用いて開始される。例えば、ＧｅｎｅＡｍｐ ＲＮＡ ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて製造業者の指示に従って、抽出されたＲＮＡを逆転写することができる。そして、得られたｃＤＮＡを、次のＰＣＲ反応における鋳型として用いることができる。
　ＰＣＲの工程では、さまざまな熱安定的ＤＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼを使用するが、一般的には、５’－３’ヌクレアーゼ活性をもつが、３’－５’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性をもたないＴａｑＤＮＡポリメラーゼが用いられる。すなわち、登録商標ＴａｑＭａｎ ＰＣＲは、一般的には、ＴａｑポリメラーゼまたはＴｔｈポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性を利用して、その標的単位複製配列に結合しているハイブリダイゼーション用プローブを加水分解するが、同じ５’ヌクレアーゼ活性をもつ酵素を使用することもできる。２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲ反応に特有の単位複製配列を生成させる。この２つのプライマーの間に存在する塩基配列を検出するために別のオリゴヌクレオチド、すなわちプローブを設計する。このプローブは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ酵素によって伸長することはできず、レポーター用の蛍光色素およびクエンチャー用の蛍光色素で標識されている。これら２種類の色素がプローブ上にあって互いに近くにあるときには、レポーター用色素からレーザーによって発生する光は、クエンチャー用の色素で消光されている。増幅反応の過程で、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ酵素が、鋳型依存的にプローブを切断する。その結果得られたプローブ断片は溶液中に解離して、放出されたレポーター用色素からのシグナルが、第２のフルオロフォアの消光作用から解放される。レポーター用色素の一分子は、新しい分子が合成される度に放出されるため、消光されないレポーター用色素の検出に基づいて、データを定量的に解釈することが可能となる。
　登録商標ＴａｑＭａｎ ＲＴ－ＰＣＲは、例えば、登録商標ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００配列検出キット（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ－Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）、またはＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）など市販の装置を用いて行うことができる。好適な実施態様において、５’ヌクレアーゼ法は、登録商標ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００配列検出キットなどのリアルタイム定量用ＰＣＲ装置上で行う。この装置は、サーモサイクラー、レーザー、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラおよびコンピュータからなる。この装置は、サーモサイクラー上の９６ウェルのフォーマットの中にあるサンプルを増幅する。増幅過程で、レーザーによって発生させた蛍光シグナルを、９６ウェルすべてについて、光ファイバーケーブルを通じてリアルタイムで集めて、ＣＣＤで検出する。この装置は、器具を作動させるため、およびデータを解析するためのソフトウエアを含む。
　５’ヌクレアーゼアッセイのデータは、まず、Ｃｔすなわち限界サイクル（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ）として表現される。上記したように、蛍光値は、サイクル毎に記録され、増幅反応のその時点までに増幅された産物の量を示す。蛍光シグナルが統計的に有意であると最初に記録された時点が限界サイクル（Ｃｔ）である。
　誤差とサンプル対サンプルにおける変動作用を最小にするために、通常、内部標準を用いてＲＴ－ＰＣＲを実施する。理想的な内部標準は、さまざまな組織の中で一定のレベルで発現され、実験処理によって影響されないものである。遺伝子発現のパターンを正規化するためにもっとも頻繁に使用されるＲＮＡは、ハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）およびβ－アクチンのｍＲＮＡである。
　ＲＴ－ＰＣＲ技術のより新しい変法は、リアルタイム定量的ＰＣＲであって、二重標識された蛍光発生プローブ（例、登録商標Ｔａｑｍａｎプローブ）によってＰＣＲ産物の蓄積を決定する。リアルタイムＰＣＲは、各標的配列に対する内部競合分子を正規化するために利用する定量的な競合ＰＣＲにも、サンプル中に含まれる正規化用遺伝子、またはＲＴ－ＰＣＲ用のハウスキーピング遺伝子を用いる定量的な比較ＰＣＲにも適合する。更なる詳細については、例えば、Ｈｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：９８６－９９４（１９９６）を参照されたい。
（ｂ．マスアレイ装置）
　Ｓｅｑｕｅｎｏｍ Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって開発されたマスアレイによる遺伝子発現プロファイリング法において、ＲＮＡを単離し逆転写した後、得られたｃＤＮＡを、一塩基を除くすべての位置で標的となるｃＤＮＡ領域に一致する合成ＤＮＡ分子（競合分子）で固定して、内部標準として使用する。このｃＤＮＡ／競合分子の混合液をＰＣＲで増幅してから、エビ由来アルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）酵素によるＰＣＲ後処理を行ない、その結果、残ったヌクレオチドを脱リン酸化する。アルカリホスファターゼを不活性化させた後、競合分子およびｃＤＮＡのＰＣＲ産物にプライマー伸長処理を行って、競合分子およびｃＤＮＡに由来するＰＣＲ産物に対し異なった質量シグナルを生じさせる。これらの生成物は、精製された後、マトリクス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ）による解析に必要な成分を予め搭載しているチップアレイに分注される。そして、作成された質量スペクトルのピーク領域の比率を解析することによって反応液中に存在するｃＤＮＡを定量する。更なる詳細については、例えば、Ｄｉｎｇ ａｎｄ Ｃａｎｔｏｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：３０５９－３０６４（２００３）を参照されたい。
（ｃ．その他のＰＣＲ法）
　さらなるＰＣＲによる技術には、例えば、ディファレンシャルディスプレイ法（Ｌｉａｎｇ ａｎｄ Ｐａｒｄｅｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：９６７－９７１（１９９２））；増幅断片長多型法（ｉＡＦＬＰ）（Ｋａｗａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１２：１３０５－１３１２（１９９９））；登録商標ビーズアレイ技術（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｏｌｉｐｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ Ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｔｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ），Ｊｕｎｅ ２００２；Ｆｅｒｇｕｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７２：５６１８（２０００））；遺伝子発現の迅速アッセイ法において、市販されているＬｕｍｉｎｅｘ１００ＬａｂＭＡＰ装置と複数に色分けされたミクロスフェア（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を用いた遺伝子発現検出用ビーズアレイ（ＢＡＤＧＥ）（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ．１１：１８８８－１８９８（２００１））；および高カバー率遺伝子発現プロフィール（ＨｉＣＥＰ）解析法（Ｆｕｋｕｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．３１（１６）ｅ９４（２００３））などがある。
（３．マイクロアレイ）
　示差的遺伝子発現は、マイクロアレイ技術を用いても同定または確認することができる。すなわち、新鮮な癌組織またはパラフィン包埋された癌組織のいずれにおいても、マイクロアレイ技術を用いて、予後関連遺伝子の発現プロファイルを決定することができる。この方法においては、目的とするポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドなど）をマイクロチップ基板上にプレートするか、整列させる。そして、整列させた配列を、目的とする細胞または組織由来の特異的ＤＮＡプローブとハイブリダイズさせる。ＲＴ－ＰＣＲと同様に、ＲＮＡの由来源は、癌または癌細胞株、および対応する正常組織または細胞株から単離した全ＲＮＡである。ＲＮＡの由来源が原発性癌の場合には、凍結されたか、または保管されているパラフィン包埋され固定（ホルマリン固定）された組織サンプルからＲＮＡを抽出することができ、日常の医療業務において、ごく普通に調製して保存することができる。
　マイクロアレイ技術の具体的な実施態様において、ｃＤＮＡクローンのＰＣＲ増幅された挿入配列を高密度で基板に乗せる。目的とする組織から抽出されたＲＮＡの逆転写によって蛍光標識を取り込むことにより、蛍光標識されたｃＤＮＡを作製することができる。チップに適用された標識ｃＤＮＡは、アレイ上のＤＮＡスポットに特異性をもってハイブリダイズする。非特異的結合を除去するための高厳密性洗浄の後、共焦点レーザー顕微鏡、またはＣＣＤカメラなど、別の検出法によってチップを走査する。各アレイ上成分のハイブリダイゼーションを定量すると、対応するｍＲＮＡの豊富さを見積もることが可能になる。二色蛍光法によって、２種類のＲＮＡ由来源から作成され、別々に標識されたｃＤＮＡを対毎にアレイにハイブリダイズさせる。こうして、これら２種類の由来源からの各特定遺伝子に対応する転写産物の相対的な豊富さが同時に決定される。ハイブリダイゼーションを小規模化させたことによって、多数の遺伝子の発現パターンの簡便で迅速な評価が利用可能になる。このような方法は、細胞当り数コピーしか発現されない希少な転写産物を検出するのに必要とされる感度をもつことが示されており、少なくとも約２倍の発現レベルの違いを再現性をもって検出することが示されている（Ｓｃｈｅｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３（２）：１０６－１４９（１９９６）。また、本発明においては、一色蛍光法によって検出することも可能である。マイクロアレイ解析法は、製造業者の指示に従って、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ技術、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのマイクロアレイ技術またはＩｎｃｙｔｅのマイクロアレイ技術を用いるなどして、市販されている装置によって実施することができる。
（４．遺伝子発現連続解析法（ＳＡＧＥ））
　遺伝子発現連続解析法（ＳＡＧＥ）は、各転写産物に対するハイブリダイゼーション・プローブを用意する必要なしに、多数の遺伝子転写産物を同時かつ定量的に解析できる方法である。まず、短い配列タグ（約１０～１４塩基対）を各転写産物内部のユニークな位置から得る場合には、各転写産物を個別に同定するのに十分な情報を含むタグを作成する。そして、多数の転写産物を一緒に連結させて、長い連続した分子を形成させると、配列決定することができ、多数のタグの同一性を同時に明らかにすることができる。転写産物の集団の発現パターンを、各タグの量を決定し、各タグに対応する遺伝子を同定することによって定量的に評価することができる。さらなる詳細については、例えば、Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４８４－４８７ （１９９５）；およびＶｅｌｃｕｌｅｓｃｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ８８：２４３－５１（１９９７）を参照されたい。
（５．大規模並列シグネチャー配列決定法（ＭＰＳＳ））
　この方法は、Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：６３０－６３４（２０００）に記載されているが、ゲルによらないシグネチャー配列決定法を、個別の直径５μｍのマイクロビーズ上の何百万もの鋳型のインビトロにおけるクローニングと組み合わせる配列決定法である。まず、インビトロ・クローニングによって、ＤＮＡ鋳型のマイクロビーズライブラリーを構築する。その後、フロー・セルにおいて高密度（一般的には３×１０６マイクロビーズ／ｃｍ２よりも大きい）で、鋳型を含むマイクロビーズの平らなアレイを組み立てる。各マイクロビーズ上のクローニングされた鋳型の遊離末端を、ＤＮＡ断片の分離を必要としない蛍光によるシグネチャー配列決定法を用いて同時に解析する。
（６．免疫組織化学法）
　免疫組織化学法も、本発明の予後関連遺伝子の発現レベルを検出するのに適している。すなわち、各予後関連遺伝子産物に対して特異的な抗体を用いて発現を検出する。これらの抗体は、例えば、放射性標識、蛍光標識、ビオチン、またはホースラディッシュ・ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼなどのハプテン標識によって抗体そのものを直接標識して検出することができる。あるいは、非標識一次抗体を、抗血清、ポリクローナル抗血清、または一次抗体に特異的なモノクローナル抗体を含む、標識された二次抗体とともに用いる。免疫組織化学法のプロトコールおよびキットは、当技術分野において周知されていて市販されている。
（７．プロテオミクス）
　「プロテオミクス」という用語は、一定の時点でサンプル（例、組織、生物、または細胞培養物）の中に存在する蛋白質の全部と定義されている。とりわけ、プロテオミクスは、あるサンプルにおける蛋白質発現の全体的な変化を調べること（「発現プロテオミクス」とも呼ばれる）を含む。プロテオミクスは、一般的に以下の工程を含む：（１）２－Ｄゲル電気泳動（２－Ｄ ＰＡＧＥ）によるサンプル中の各蛋白質の分離、（２）このゲルから回収された各蛋白質の同定、例えば、質量分析またはＮ－末端配列決定法、および（３）バイオインフォマティクスを用いたデータ解析。プロテオミクス法は、他の遺伝子発現プロファイリング法の有用な補助法であり、本発明の予後関連遺伝子の産物を検出するために単独または他の方法と組み合わせて使用することができる。
　最後に、遺伝子発現データを解析して、調べた癌サンプルで同定された特徴的な遺伝子発現パターンに基づき、癌の予後の予測された可能性に応じて、患者に利用できる最良の治療選択肢を同定する。
（肺癌遺伝子セット、アッセイされた遺伝子の結果、および遺伝子発現データの臨床への応用）
　本発明の重要な態様は、肺癌組織による一定の遺伝子の測定された発現を用いて、予後情報を提供することである。そのためには、測定されたＲＮＡの量の差異と、用いたＲＮＡの品質のばらつきの両方を補正（正規化）する必要がある。そのため、このアッセイ法は、一般的には、ＧＡＰＤＨおよびＣｙｐ１のような周知のハウスキーピング遺伝子など、一定の正規化遺伝子の発現を測定して取り込む。あるいは、正規化は、測定した遺伝子のすべて、またはそれらの大きなサブセットのシグナルの平均値または中央値（Ｃｔ）に基づくことも可能である。患者の癌ｍＲＮＡの測定・正規化された量を、肺癌組織の参照用セットで見られる量と遺伝子毎に比較する。この参照用セットにおける肺癌組織の数（Ｎ）は十分に大きいので、別の参照用セットが（全体として）、本質的には同一の挙動をとることは確実である。この条件に合えば、具体的なセットにおける各肺癌組織の同一性は、測定される遺伝子の相対量に対して有意な影響を与えないはずである。
（イントロンに基づくＰＣＲ用のプライマーおよびプローブの設計）
　本発明の一つの態様によれば、ＰＣＲ用のプライマーおよびプローブは、増幅する遺伝子に存在するイントロン配列に基づいて設計される。したがって、プライマー／プローブ設計における最初の工程は、該遺伝子内のイントロン配列を明らかにすることである。これは、Ｋｅｎｔ，Ｗ．Ｊ．，Ｇｅｎｍｏｍｅ Ｒｅｓ．１２（４）：６５６－６４（２０００）によって開発されたＤＮＡ ＢＬＡＳＴのような公開されているソフトウエアによって、または、その変法を含むＢＬＡＳＴソフトウエアによって行うことができる。
　ＰＣＲプライマーの設計において考慮される最も重要な要素は、プライマーの長さ、融解温度（Ｔｍ）、およびＧ／Ｃ含有量、特異性、相補的プライマー配列、および３’－末端の配列などである。一般的に、最適なＰＣＲプライマーは、通常１７～３０塩基の長さであって、例えば、約５０～６０％など、約２０～８０％のＧ＋Ｃ塩基を含む。Ｔｍは、５０から８０℃の間であり、例えば約５０から７０℃が一般的には好適である。
　ＰＣＲ用のプライマーおよびプローブの設計に関するさらなる手引きについては、例えば、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ， Ｃ．Ｗ． ｅｔ ａｌ．，「Ｇｅｎｅｒａｌ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｆｏｒ ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ Ｄｅｓｉｇｎ．」 ｉｎ： ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９５，ｐｐ．１３３－１５５；Ｉｎｎｉｓ ａｎｄ Ｇｅｌｆａｎｄ，「Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲｓ」 ｉｎ：ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９９４，ｐｐ．５－１１；およびＰｌａｓｔｅｒｅｒ，Ｔ．Ｎ．Ｐｒｉｍｅｒｓｅｌｅｃｔ：Ｐｒｉｍｅｒ ａｎｄ ｐｒｏｂｅ ｄｅｓｉｇｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．７０：５２０－５２７（１９９７）などを参照されたい。
　以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
材料
　組換えヒト上皮増殖因子（EGF）は、CHEMICON Internationalから購入した。組換えヒトNeuregulin1-β1/Heregulin1-β1 EGFドメインは、R&D systemsから購入した。Gefitinibは、購入したIressa（登録商標、AstraZeneca)の錠剤から抽出した。
細胞培養
　正常ヒト末梢気道上皮細胞(SAECs)をLonza Walkersvilleから購入し、SAGM培地(CAMBREX)中で生育させた。A549、PC9およびPC13を、RPMI1640培地((Nakarai tesque)10%ウシ胎仔血清(FBS)(JRH Biosciences)、100 U/mlペニシリン(Nakarai tesque)および100μg/mlストレプトマイシン(Nakarai tesque)を補足)中で生育させた。細胞は、37℃、5%CO2条件下で培養した。
ウエスタンブロッティング
　細胞を溶解緩衝液(50mM HEPES、150mM NaCl、1% Triton X-100、10% glycerol、1mM EGTA、1mM PMSF、100 U/ml aprotininおよび1mM Na3VO4)、またはSDS-サンプル緩衝液(100mM Tris-HCl、pH6.8、200mM DTT、4% SDS、0.2% BPBおよび20% glycerol)で溶解させた。タンパク質をSDS-PAGEにより分離し、PVDFメンブラン(Immobilon-P; Millipore Corp.)上に移した。前記メンブランを特定の抗体でブロットし、化学発光物質(PerkinElmer Life ScienceまたはMillipore Corp.)で可視化した。
抗体
　抗ヒトEGFR抗体は、Medical & Biological Laboratories co.から購入した。抗c-ErbB2/c-Neu(Ab-3)抗体は、Calbiochemから購入した。抗-erbB-3/HER-3(clone2F12)抗体は、upstateから購入した。抗HER4/ErbB4(111B2)抗体、抗ホスホp44/42マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)(Thr202/Tyr204)抗体、抗p44/42 MAPK抗体、抗ホスホAkt(Ser473)抗体、抗Akt抗体、抗ホスホEGFR(Tyr845)抗体、抗ホスホEGFR(Tyr992)抗体、抗ホスホEGFR(Tyr1045)抗体、抗ホスホEGFR Tyr(1068)抗体、抗ホスホHER2/ErbB2(Tyr1248)抗体、抗ホスホHER3/ErbB3(Tyr1289)(21D3)抗体および抗ホスホStat3(Tyr705)(D3A7)抗体は、CellSignaling Technologyから購入した。西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲート抗マウス/ラット/ウサギイムノグロブリンG (IgG)抗体(Amersham Biosciences Co.)、HRPコンジュゲート抗ヤギIgG Ab(Santa Cruz Biotechnology)も使用した。
細胞増殖アッセイ
　細胞を、試験対象の物質（EGF(100ng/ml)またはEGFR阻害剤(0.5μM)）を含む培地とともに96ウェルのコラーゲン被覆プレート上に播種し、当該細胞を37℃で24時間または72時間インキュベートした。CellTiter 96（登録商標、Promega)を用いて、製造業者の指示書に従って細胞数を決定した後、RNAを回収した。
RNAの単離
　全RNAは、TRIzol（登録商標）試薬(Invitrogen)を用いて製造業者の指示書に従って、各試料から単離した。全RNAの品質および完全性を、2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies)で評価した。8を超えるRNA完全数(RIN)を有するRNA試料をさらなる解析に用いた。
マイクロアレイ解析
　Agilent low RNA input linear amplification kit (Agilent Technologies)を用いて、製造業者の指示書に従ってRNA試料を標識した。簡潔に記載すると、Cyanine 3-CTPを用いて、500ngの全RNAの増幅および標識を行った。ハイブリダイゼーションは、gene expression hybridization kit(Agilent Technologies)を用いて製造業者の指示書に従って行った。すなわち、1.65μgのサンプルcRNAを断片化に供し(30分、60℃)、次いで、ロータリーオーブン(10rpm、65℃、17時間)中で、44K Agilent Whole Human Genome Oligo Microarray(G41112F)(Agilent Technologies)上でハイブリダイゼーションを行った。スライドを分解（disassembled）し、製造業者の指示書に従って、Agilent Gene Expression Wash Buffer 1および2(Agilent Technologies)で洗浄した。
マイクロアレイデータの取得および処理
　マイクロアレイを、Agilent社が提供するパラメーター(Green PMTを100%で設定、スキャン解像度を5μmに設定)を用いてダイナミックオートフォーカスマイクロアレイスキャナー(Agilent Technologies)でスキャンした。Feature Extraction Software v7 (Agilent Technologies)を用いて、生のシグナル値および定性flag (存在、境界、非存在)を得た。メジアンシフト正規化を各マイクロアレイ由来のシグナルに適用した。すなわち、マイクロアレイ上の処理したシグナルのメジアンが1である。ベースとともに対数変換した後の正規化したシグナルを用いた。
状態空間モデル解析
　既報(Yamaguchi, R. et al., Genome Informatics Vol. 21, p.101-113, 2008)に従い、状態空間モデルを用いて、時系列発現データを解析した。
生存解析
　すべての生存データは、原刊行物(Beer, DG. et al., Nature Medicine vol.14, pp.822-827, 2008)から抽出した。原刊行物では、６つの医療機関で回収したサンプルを、４つの研究室に分配して、各研究室でマイクロアレイ解析を行い、４つのデータセットを得た。このデータセットをUM、HLM、MSKおよびCAN/DFと名付けた。原刊行物ではこれらのデータセットのうち、トレーニングセットとして、UMおよびHLM由来の結合データを用い、その結果を他の２研究室由来の独立したデータセットを使用して検証しているため、本発明においても同様に行った。すなわち、UMおよびHLMと類似であるが外的な検証セットとしてMSKを使用し、前記３セットとは体系的に異なる検証セットとしてCAN/DFデータを使用した。評価を行うため、原刊行物に従って、Coxの比例ハザードモデルの単変量解析における共変量として、それぞれ予測されたリスクスコアを使用した。グラフ表示には、Kaplan-Meier法による生存曲線をプロットした。
　結果を図１～図５に示す。図１および図２は、上記のように処理したマイクロアレイデータおよび状態空間モデル解析を用いて得られた、予後関連遺伝子シグネチャー（１）、（２）および（３）の関係を示す。予後関連遺伝子シグネチャー（２）は、図１におけるＳｅｔＤ＿ｓｕｂ２に相当し、予後関連遺伝子シグネチャー（１）および（３）は、それぞれ、図２におけるＳｅｔ　Ｉｐ０４およびＳｅｔ　Ｉｐ０４ｓ０１に相当する。図３～図５は、予後関連遺伝子シグネチャー（２）および（３）を用いて肺癌の予後を予測したＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ曲線である。この結果から、シグネチャー（２）は全てのステージの肺癌について、シグネチャー（３）はステージＩの肺癌について、有効であることが分かった。
　癌は多様であるから、多数の癌を比較して、標的を診断し治療するための重要な制御因子を発見することは困難である。本発明者らは、初代の正常細胞を用いて癌の共通の特性を明確にするという、新しいコンセプトを提供した。また、マイクロアレイを用いた遺伝子発現プロファイリングと状態空間モデルを用いて変動する遺伝子群を絞り込むことによって、重要となる制御システムを抽出することに成功した。本研究結果により、EGFで刺激した正常肺細胞に由来する遺伝子セットが肺腺癌のすべてのステージおよびステージＩの患者の再発を有意に予測することが示され、これらの予後関連遺伝子を予後診断ツールとして使用できることが明らかとなった。
　本発明の試験方法および診断薬を用いることにより、癌の予後の診断方法が進歩し、癌患者に対してより効果的でより副作用の少ない治療方法を選択することが可能となる。本発明は、癌患者のＱＯＬの向上および医療経済にも寄与することが期待される。
　本出願は、日本国で出願された特願２００８－３１１４８１(出願日：２００８年１２月５日)を基礎としており、そこに開示される内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (15)

  1. 　癌の予後を予測するための試験方法であって、癌患者から採取した生体試料における予後関連遺伝子の発現レベルを、当該遺伝子の転写産物または翻訳産物を対象として測定する工程を含み、当該遺伝子が下記予後関連遺伝子シグネチャー（１）から選ばれる２～２７７の遺伝子である、方法。
    予後関連遺伝子シグネチャー（１）：
    ACTA2 (includes EG:59)；ACTB；ACTC1；ADAM10；ADAM12；ADAM17；ADAM19 (includes EG:8728)；ADAM8；ADCY6；ADORA2B；ADRBK2；ALOX15B；AREG；ARID3B；ATF2；ATP2C2 (includes EG:9914)；BCAR3；BMPR2；BPGM；CALML5；CASP1；CASP4；CAT；CCNA1；CCNB2；CCND1；CCND2；CD3EAP；CDC42；CDC42EP2；CDH3；CDKN1A；CENPF；CHAC1；CHODL；CHST11；CHST2；CLDN5；CLEC2B；COL13A1；COTL1；CREB1；CREB5；CRYAB；CSNK1D；CTGF；CTNNB1；CTSF；CXCL1；CXCR7；CYP1A1；CYP1B1；CYP27B1；CYP2U1；CYR61；DDEF1IT1；DDEFL1；DDIT3；DDX21；DHCR7；DSCAM；DUSP1；DUSP4；DUSP5；DYRK1A；E2F4；EFEMP1；EIF2AK2；ENC1；EPHA2；ETS2；EWSR1；FER1L4 (includes EG:80307)；FERMT1；FGF5；FOSL1；FZD10；GAD1；GAL；GAPDH；GBP2；GDNF；GLRX；GNB1；GNE；GNG11；GNG4；GOT2；GPNMB；GPX1；GPX3；GRB10；GRK6；GRN；GSTZ1；HADH；HBEGF；HES1；HGS；HIST1H4C；HIST3H3；HMGA2；HMGCR；HMGCS1；HMOX1；HNRPM；HOPX；HS3ST2；HSD11B1；HSD17B2；HSPA1A；HSPA5；HSPA8；HSPB1；HSPC159；ID1；IDI1；IER3；IGFBP2；IGFBP3；IGFBP6；IL1A；IL1F5；IL1RN；IL6；INHBA；INPP5D；INPPL1；IRF1；ISG20；ISG20L1；ITGB4；ITGB7；ITGB8；ITPR1；JAG1；JAK3；JUND；KCNJ5；KCTD5；KIAA1199；KLK8；KRT14 (includes EG:3861)；KRT34；KRT5；KRT75；LDLR；LGALS7；LIF；LIMK2；LPXN；MAFF；MAP2K1；MAP2K3；MAP3K3；MAP3K6；MAPK11；MERTK；MLPH；MMP1 (includes EG:4312)；MMP12；MMP3；MRAS；MSN；MT1G；MTHFD2；MTSS1；MVK；MYC；MYL7；MYL9 (includes EG:10398)；MYLK；NAV2 (includes EG:89797)；NCOR2；NDRG1；NFATC4；NFIL3；NFIX；NFKBIA；NMU；NNMT；NP (includes EG:4860)；NUPR1；NXT1；ODC1；PAK2；PALM；PCK2；PDE2A；PDGFB；PDIA3；PDIA4；PDK1；PFKFB3；PH-4；PHLDA2；PIK3C2B；PIK3CD；PKM2；PLA2G3；PLAT；PLCB3；PLCD1；PLCH2；PLD1；PLK1；PLK3；PNPLA3；PODXL；PPAP2A；PPP1R12B；PPP2R5B；PPRC1；PRKCDBP；PRKCI；PSAT1；PTGS1；PTRF；PYGB；PYGL；RAC2；RBP1；RDH16 (includes EG:8608)；RPL35；RPS14；S100A2；SAA4；SALL2；SCG5；SEH1L；SEPW1；SERPINB5；SESN1；SGCA；SH2D2A；SIGLEC15；SLC25A37；SLC29A1；SMAD1；SMO；SMOX；SOD3；SOX2；SOX9；SPDEF；SPRY2；SPRY4；SRC；STX12；STYK1；TAF9；TCF4；TGFB2；THBS1；THRA；TIMP3；TK2；TMSB10；TNF；TPM1；TRAF1；TSC22D1；TUBA1A；TUBA1B；UBD；UBE2C；UBE2D1；UST；VANGL1；VAV3；VCP；VEGFA；WNT4；WNT5B；YWHAQ (includes EG:10971)；ZBED2およびZNF750.
  2. 　癌がＥＧＦＲファミリー分子の過剰発現または変異した癌細胞に起因するものである、請求項１記載の方法。
  3. 　肺癌の予後を予測するものである、請求項１または２記載の方法。
  4. 　肺癌がステージＩ～ＩＶのいずれかのステージにあり、予後関連遺伝子が下記予後関連遺伝子シグネチャー（２）から選ばれる２～１４６の遺伝子である、請求項３記載の方法。
    予後関連遺伝子シグネチャー（２）：
    ACTC1；ADAM10；ADAM19 (includes EG:8728)；ADAM8；ADCY6；ADRBK2；ALOX15B；ARID3B；ATF2；BCAR3；BPGM；CASP4；CAT；CD3EAP；CDC42；CDKN1A；CENPF；CHODL；CHST2；CLEC2B；COL13A1；CREB1；CSNK1D；CTGF；CXCL1；CXCR7；CYP2U1；DDEFL1；DDX21；DHCR7；DSCAM；DUSP1；DUSP4；EIF2AK2；ENC1；ETS2；EWSR1；FER1L4 (includes EG:80307)；FZD10；GAD1；GNB1；GNG11；GNG4；GPNMB；GRB10；HADH；HBEGF；HGS；HIST3H3；HMGCR；HMGCS1；HNRPM；HSD11B1；HSPA1A；HSPA5；HSPA8；HSPB1；ID1；IER3；IGFBP2；IGFBP6；IL1F5；IL1RN；INHBA；INPP5D；ISG20；ITGB8；ITPR1；KCNJ5；KIAA1199；KRT34；KRT5；LDLR；LGALS7；LIF；MAP3K6；MAPK11；MLPH；MRAS；MTHFD2；MTSS1；MVK；MYL7；MYL9 (includes EG:10398)；NCOR2；NDRG1；NFATC4；NMU；NP (includes EG:4860)；NUPR1；ODC1；PAK2；PDGFB；PDK1；PFKFB3；PHLDA2；PIK3CD；PLA2G3；PLD1；PNPLA3；PPAP2A；PPP1R12B；PPRC1；PRKCI；PTRF；PYGL；RAC2；RDH16 (includes EG:8608)；RPS14；S100A2；SALL2；SCG5；SEH1L；SEPW1；SGCA；SH2D2A；SIGLEC15；SLC29A1；SMOX；SOD3；SOX2；SOX9；SPDEF；SPRY2；SPRY4；SRC；TAF9；TGFB2；THRA；TIMP3；TK2；TMSB10；TPM1；TRAF1；TSC22D1；TUBA1A；TUBA1B；UBD；UST；VANGL1；VCP；VEGFA；WNT4；YWHAQ (includes EG:10971)；ZBED2およびZNF750.
  5. 　肺癌がステージＩにあり、予後関連遺伝子が下記予後関連遺伝子シグネチャー（３）から選ばれる２～１３９の遺伝子である、請求項３記載の方法。
    予後関連遺伝子シグネチャー（３）：
    ACTC1；ADAM10；ADAM19 (includes EG:8728)；ADAM8；ADCY6；ADRBK2；ALOX15B；ATF2；BPGM；CASP4；CD3EAP；CDC42；CDC42EP2；CDKN1A；CENPF；CHST2；CLEC2B；COTL1；CRYAB；CSNK1D；CTGF；CXCL1；CXCR7；CYP1A1；CYR61；DDEFL1；DDX21；DUSP1；DUSP4；DUSP5；ETS2；FER1L4 (includes EG:80307)；FOSL1；FZD10；GAD1；GAPDH；GDNF；GNB1；GNG11；GNG4；GPNMB；GRB10；HBEGF；HGS；HMGA2；HMGCR；HMGCS1；HNRPM；HOPX；HSPA1A；HSPA5；HSPA8；HSPB1；ID1；IER3；IGFBP2；IGFBP3；IGFBP6；IL1A；IL1F5；IL1RN；INHBA；ISG20；ISG20L1；ITGB7；ITGB8；ITPR1；JUND；KCNJ5；KIAA1199；KRT14 (includes EG:3861)；KRT5；LDLR；LGALS7；LIF；LPXN；MLPH；MMP1 (includes EG:4312)；MMP12；MMP3；MRAS；MTHFD2；MTSS1；MVK；MYL9 (includes EG:10398)；MYLK；NCOR2；NDRG1；NFATC4；NFIL3；NMU；NP (includes EG:4860)；NUPR1；ODC1；PAK2；PALM；PCK2；PDGFB；PDIA4；PFKFB3；PHLDA2；PIK3CD；PLAT；PPAP2A；PPRC1；PTRF；RAC2；RDH16 (includes EG:8608)；RPS14；S100A2；SALL2；SEH1L；SEPW1；SERPINB5；SESN1；SH2D2A；SLC25A37；SLC29A1；SMOX；SOX2；SOX9；SPDEF；SPRY2；SPRY4；TAF9；TGFB2；THRA；TIMP3；TMSB10；TSC22D1；TUBA1A；UBD；UBE2C；UST；VCP；VEGFA；YWHAQ (includes EG:10971)；ZBED2およびZNF750.
  6. 　癌の予後を予測するための診断薬であって、下記予後関連遺伝子シグネチャー（１）から選ばれる２～２７７の予後関連遺伝子の発現レベルを検出するための試薬を含有する診断薬。
    予後関連遺伝子シグネチャー（１）：
    ACTA2 (includes EG:59)；ACTB；ACTC1；ADAM10；ADAM12；ADAM17；ADAM19 (includes EG:8728)；ADAM8；ADCY6；ADORA2B；ADRBK2；ALOX15B；AREG；ARID3B；ATF2；ATP2C2 (includes EG:9914)；BCAR3；BMPR2；BPGM；CALML5；CASP1；CASP4；CAT；CCNA1；CCNB2；CCND1；CCND2；CD3EAP；CDC42；CDC42EP2；CDH3；CDKN1A；CENPF；CHAC1；CHODL；CHST11；CHST2；CLDN5；CLEC2B；COL13A1；COTL1；CREB1；CREB5；CRYAB；CSNK1D；CTGF；CTNNB1；CTSF；CXCL1；CXCR7；CYP1A1；CYP1B1；CYP27B1；CYP2U1；CYR61；DDEF1IT1；DDEFL1；DDIT3；DDX21；DHCR7；DSCAM；DUSP1；DUSP4；DUSP5；DYRK1A；E2F4；EFEMP1；EIF2AK2；ENC1；EPHA2；ETS2；EWSR1；FER1L4 (includes EG:80307)；FERMT1；FGF5；FOSL1；FZD10；GAD1；GAL；GAPDH；GBP2；GDNF；GLRX；GNB1；GNE；GNG11；GNG4；GOT2；GPNMB；GPX1；GPX3；GRB10；GRK6；GRN；GSTZ1；HADH；HBEGF；HES1；HGS；HIST1H4C；HIST3H3；HMGA2；HMGCR；HMGCS1；HMOX1；HNRPM；HOPX；HS3ST2；HSD11B1；HSD17B2；HSPA1A；HSPA5；HSPA8；HSPB1；HSPC159；ID1；IDI1；IER3；IGFBP2；IGFBP3；IGFBP6；IL1A；IL1F5；IL1RN；IL6；INHBA；INPP5D；INPPL1；IRF1；ISG20；ISG20L1；ITGB4；ITGB7；ITGB8；ITPR1；JAG1；JAK3；JUND；KCNJ5；KCTD5；KIAA1199；KLK8；KRT14 (includes EG:3861)；KRT34；KRT5；KRT75；LDLR；LGALS7；LIF；LIMK2；LPXN；MAFF；MAP2K1；MAP2K3；MAP3K3；MAP3K6；MAPK11；MERTK；MLPH；MMP1 (includes EG:4312)；MMP12；MMP3；MRAS；MSN；MT1G；MTHFD2；MTSS1；MVK；MYC；MYL7；MYL9 (includes EG:10398)；MYLK；NAV2 (includes EG:89797)；NCOR2；NDRG1；NFATC4；NFIL3；NFIX；NFKBIA；NMU；NNMT；NP (includes EG:4860)；NUPR1；NXT1；ODC1；PAK2；PALM；PCK2；PDE2A；PDGFB；PDIA3；PDIA4；PDK1；PFKFB3；PH-4；PHLDA2；PIK3C2B；PIK3CD；PKM2；PLA2G3；PLAT；PLCB3；PLCD1；PLCH2；PLD1；PLK1；PLK3；PNPLA3；PODXL；PPAP2A；PPP1R12B；PPP2R5B；PPRC1；PRKCDBP；PRKCI；PSAT1；PTGS1；PTRF；PYGB；PYGL；RAC2；RBP1；RDH16 (includes EG:8608)；RPL35；RPS14；S100A2；SAA4；SALL2；SCG5；SEH1L；SEPW1；SERPINB5；SESN1；SGCA；SH2D2A；SIGLEC15；SLC25A37；SLC29A1；SMAD1；SMO；SMOX；SOD3；SOX2；SOX9；SPDEF；SPRY2；SPRY4；SRC；STX12；STYK1；TAF9；TCF4；TGFB2；THBS1；THRA；TIMP3；TK2；TMSB10；TNF；TPM1；TRAF1；TSC22D1；TUBA1A；TUBA1B；UBD；UBE2C；UBE2D1；UST；VANGL1；VAV3；VCP；VEGFA；WNT4；WNT5B；YWHAQ (includes EG:10971)；ZBED2およびZNF750.
  7. 　癌がＥＧＦＲファミリー分子の過剰発現または変異した癌細胞に起因するものである、請求項６記載の診断薬。
  8. 　肺癌の予後を予測するものである、請求項６または７記載の診断薬。
  9. 　肺癌がステージＩ～ＩＶのいずれかのステージにあり、予後関連遺伝子が下記予後関連遺伝子シグネチャー（２）から選ばれる２～１４６の遺伝子である、請求項８記載の診断薬。
    予後関連遺伝子シグネチャー（２）：
    ACTC1；ADAM10；ADAM19 (includes EG:8728)；ADAM8；ADCY6；ADRBK2；ALOX15B；ARID3B；ATF2；BCAR3；BPGM；CASP4；CAT；CD3EAP；CDC42；CDKN1A；CENPF；CHODL；CHST2；CLEC2B；COL13A1；CREB1；CSNK1D；CTGF；CXCL1；CXCR7；CYP2U1；DDEFL1；DDX21；DHCR7；DSCAM；DUSP1；DUSP4；EIF2AK2；ENC1；ETS2；EWSR1；FER1L4 (includes EG:80307)；FZD10；GAD1；GNB1；GNG11；GNG4；GPNMB；GRB10；HADH；HBEGF；HGS；HIST3H3；HMGCR；HMGCS1；HNRPM；HSD11B1；HSPA1A；HSPA5；HSPA8；HSPB1；ID1；IER3；IGFBP2；IGFBP6；IL1F5；IL1RN；INHBA；INPP5D；ISG20；ITGB8；ITPR1；KCNJ5；KIAA1199；KRT34；KRT5；LDLR；LGALS7；LIF；MAP3K6；MAPK11；MLPH；MRAS；MTHFD2；MTSS1；MVK；MYL7；MYL9 (includes EG:10398)；NCOR2；NDRG1；NFATC4；NMU；NP (includes EG:4860)；NUPR1；ODC1；PAK2；PDGFB；PDK1；PFKFB3；PHLDA2；PIK3CD；PLA2G3；PLD1；PNPLA3；PPAP2A；PPP1R12B；PPRC1；PRKCI；PTRF；PYGL；RAC2；RDH16 (includes EG:8608)；RPS14；S100A2；SALL2；SCG5；SEH1L；SEPW1；SGCA；SH2D2A；SIGLEC15；SLC29A1；SMOX；SOD3；SOX2；SOX9；SPDEF；SPRY2；SPRY4；SRC；TAF9；TGFB2；THRA；TIMP3；TK2；TMSB10；TPM1；TRAF1；TSC22D1；TUBA1A；TUBA1B；UBD；UST；VANGL1；VCP；VEGFA；WNT4；YWHAQ (includes EG:10971)；ZBED2およびZNF750.
  10. 　肺癌がステージＩにあり、予後関連遺伝子が下記予後関連遺伝子シグネチャー（３）から選ばれる２～１３９の遺伝子である、請求項８記載の診断薬。
    予後関連遺伝子シグネチャー（３）：
    ACTC1；ADAM10；ADAM19 (includes EG:8728)；ADAM8；ADCY6；ADRBK2；ALOX15B；ATF2；BPGM；CASP4；CD3EAP；CDC42；CDC42EP2；CDKN1A；CENPF；CHST2；CLEC2B；COTL1；CRYAB；CSNK1D；CTGF；CXCL1；CXCR7；CYP1A1；CYR61；DDEFL1；DDX21；DUSP1；DUSP4；DUSP5；ETS2；FER1L4 (includes EG:80307)；FOSL1；FZD10；GAD1；GAPDH；GDNF；GNB1；GNG11；GNG4；GPNMB；GRB10；HBEGF；HGS；HMGA2；HMGCR；HMGCS1；HNRPM；HOPX；HSPA1A；HSPA5；HSPA8；HSPB1；ID1；IER3；IGFBP2；IGFBP3；IGFBP6；IL1A；IL1F5；IL1RN；INHBA；ISG20；ISG20L1；ITGB7；ITGB8；ITPR1；JUND；KCNJ5；KIAA1199；KRT14 (includes EG:3861)；KRT5；LDLR；LGALS7；LIF；LPXN；MLPH；MMP1 (includes EG:4312)；MMP12；MMP3；MRAS；MTHFD2；MTSS1；MVK；MYL9 (includes EG:10398)；MYLK；NCOR2；NDRG1；NFATC4；NFIL3；NMU；NP (includes EG:4860)；NUPR1；ODC1；PAK2；PALM；PCK2；PDGFB；PDIA4；PFKFB3；PHLDA2；PIK3CD；PLAT；PPAP2A；PPRC1；PTRF；RAC2；RDH16 (includes EG:8608)；RPS14；S100A2；SALL2；SEH1L；SEPW1；SERPINB5；SESN1；SH2D2A；SLC25A37；SLC29A1；SMOX；SOX2；SOX9；SPDEF；SPRY2；SPRY4；TAF9；TGFB2；THRA；TIMP3；TMSB10；TSC22D1；TUBA1A；UBD；UBE2C；UST；VCP；VEGFA；YWHAQ (includes EG:10971)；ZBED2およびZNF750.
  11. 　試薬が予後関連遺伝子の転写産物または翻訳産物に対する、プライマー、核酸プローブおよび抗体から選ばれる、請求項６～１０のいずれか１項に記載の診断薬。
  12. 　固体表面に固定された、以下の予後関連遺伝子シグネチャー（１）：
    ACTA2 (includes EG:59)；ACTB；ACTC1；ADAM10；ADAM12；ADAM17；ADAM19 (includes EG:8728)；ADAM8；ADCY6；ADORA2B；ADRBK2；ALOX15B；AREG；ARID3B；ATF2；ATP2C2 (includes EG:9914)；BCAR3；BMPR2；BPGM；CALML5；CASP1；CASP4；CAT；CCNA1；CCNB2；CCND1；CCND2；CD3EAP；CDC42；CDC42EP2；CDH3；CDKN1A；CENPF；CHAC1；CHODL；CHST11；CHST2；CLDN5；CLEC2B；COL13A1；COTL1；CREB1；CREB5；CRYAB；CSNK1D；CTGF；CTNNB1；CTSF；CXCL1；CXCR7；CYP1A1；CYP1B1；CYP27B1；CYP2U1；CYR61；DDEF1IT1；DDEFL1；DDIT3；DDX21；DHCR7；DSCAM；DUSP1；DUSP4；DUSP5；DYRK1A；E2F4；EFEMP1；EIF2AK2；ENC1；EPHA2；ETS2；EWSR1；FER1L4 (includes EG:80307)；FERMT1；FGF5；FOSL1；FZD10；GAD1；GAL；GAPDH；GBP2；GDNF；GLRX；GNB1；GNE；GNG11；GNG4；GOT2；GPNMB；GPX1；GPX3；GRB10；GRK6；GRN；GSTZ1；HADH；HBEGF；HES1；HGS；HIST1H4C；HIST3H3；HMGA2；HMGCR；HMGCS1；HMOX1；HNRPM；HOPX；HS3ST2；HSD11B1；HSD17B2；HSPA1A；HSPA5；HSPA8；HSPB1；HSPC159；ID1；IDI1；IER3；IGFBP2；IGFBP3；IGFBP6；IL1A；IL1F5；IL1RN；IL6；INHBA；INPP5D；INPPL1；IRF1；ISG20；ISG20L1；ITGB4；ITGB7；ITGB8；ITPR1；JAG1；JAK3；JUND；KCNJ5；KCTD5；KIAA1199；KLK8；KRT14 (includes EG:3861)；KRT34；KRT5；KRT75；LDLR；LGALS7；LIF；LIMK2；LPXN；MAFF；MAP2K1；MAP2K3；MAP3K3；MAP3K6；MAPK11；MERTK；MLPH；MMP1 (includes EG:4312)；MMP12；MMP3；MRAS；MSN；MT1G；MTHFD2；MTSS1；MVK；MYC；MYL7；MYL9 (includes EG:10398)；MYLK；NAV2 (includes EG:89797)；NCOR2；NDRG1；NFATC4；NFIL3；NFIX；NFKBIA；NMU；NNMT；NP (includes EG:4860)；NUPR1；NXT1；ODC1；PAK2；PALM；PCK2；PDE2A；PDGFB；PDIA3；PDIA4；PDK1；PFKFB3；PH-4；PHLDA2；PIK3C2B；PIK3CD；PKM2；PLA2G3；PLAT；PLCB3；PLCD1；PLCH2；PLD1；PLK1；PLK3；PNPLA3；PODXL；PPAP2A；PPP1R12B；PPP2R5B；PPRC1；PRKCDBP；PRKCI；PSAT1；PTGS1；PTRF；PYGB；PYGL；RAC2；RBP1；RDH16 (includes EG:8608)；RPL35；RPS14；S100A2；SAA4；SALL2；SCG5；SEH1L；SEPW1；SERPINB5；SESN1；SGCA；SH2D2A；SIGLEC15；SLC25A37；SLC29A1；SMAD1；SMO；SMOX；SOD3；SOX2；SOX9；SPDEF；SPRY2；SPRY4；SRC；STX12；STYK1；TAF9；TCF4；TGFB2；THBS1；THRA；TIMP3；TK2；TMSB10；TNF；TPM1；TRAF1；TSC22D1；TUBA1A；TUBA1B；UBD；UBE2C；UBE2D1；UST；VANGL1；VAV3；VCP；VEGFA；WNT4；WNT5B；YWHAQ (includes EG:10971)；ZBED2およびZNF750
    から選ばれる２～２７７の遺伝子にそれぞれハイブリダイズする核酸プローブを含む、癌の予後診断用アレイ。
  13. 　前記核酸プローブが約２０から８０塩基長である、請求項１２記載のアレイ。
  14. 　肺癌と診断された患者が肺癌を再発せずに長期間生存する可能性を予測する方法であって、
    （ａ）当該患者から採取した癌細胞における予後関連遺伝子の発現レベルを、当該予後関連遺伝子の転写産物または翻訳産物を対象として、当該癌細胞におけるすべての転写産物もしくは発現産物の発現レベル、または転写産物もしくは発現産物の参照用セットの発現レベルに対して正規化して決定する工程；
    （ｂ）工程（ａ）で得られたデータを統計解析に供する工程；および
    （ｃ）工程（ｂ）で得られた解析結果に基づいて、当該患者の長期間生存可能性が高いかまたは低いかを決定する工程
    を含み、当該予後関連遺伝子が下記予後関連遺伝子シグネチャー（１）から選ばれる２～２７７の遺伝子である方法。
    予後関連遺伝子シグネチャー（１）：
    ACTA2 (includes EG:59)；ACTB；ACTC1；ADAM10；ADAM12；ADAM17；ADAM19 (includes EG:8728)；ADAM8；ADCY6；ADORA2B；ADRBK2；ALOX15B；AREG；ARID3B；ATF2；ATP2C2 (includes EG:9914)；BCAR3；BMPR2；BPGM；CALML5；CASP1；CASP4；CAT；CCNA1；CCNB2；CCND1；CCND2；CD3EAP；CDC42；CDC42EP2；CDH3；CDKN1A；CENPF；CHAC1；CHODL；CHST11；CHST2；CLDN5；CLEC2B；COL13A1；COTL1；CREB1；CREB5；CRYAB；CSNK1D；CTGF；CTNNB1；CTSF；CXCL1；CXCR7；CYP1A1；CYP1B1；CYP27B1；CYP2U1；CYR61；DDEF1IT1；DDEFL1；DDIT3；DDX21；DHCR7；DSCAM；DUSP1；DUSP4；DUSP5；DYRK1A；E2F4；EFEMP1；EIF2AK2；ENC1；EPHA2；ETS2；EWSR1；FER1L4 (includes EG:80307)；FERMT1；FGF5；FOSL1；FZD10；GAD1；GAL；GAPDH；GBP2；GDNF；GLRX；GNB1；GNE；GNG11；GNG4；GOT2；GPNMB；GPX1；GPX3；GRB10；GRK6；GRN；GSTZ1；HADH；HBEGF；HES1；HGS；HIST1H4C；HIST3H3；HMGA2；HMGCR；HMGCS1；HMOX1；HNRPM；HOPX；HS3ST2；HSD11B1；HSD17B2；HSPA1A；HSPA5；HSPA8；HSPB1；HSPC159；ID1；IDI1；IER3；IGFBP2；IGFBP3；IGFBP6；IL1A；IL1F5；IL1RN；IL6；INHBA；INPP5D；INPPL1；IRF1；ISG20；ISG20L1；ITGB4；ITGB7；ITGB8；ITPR1；JAG1；JAK3；JUND；KCNJ5；KCTD5；KIAA1199；KLK8；KRT14 (includes EG:3861)；KRT34；KRT5；KRT75；LDLR；LGALS7；LIF；LIMK2；LPXN；MAFF；MAP2K1；MAP2K3；MAP3K3；MAP3K6；MAPK11；MERTK；MLPH；MMP1 (includes EG:4312)；MMP12；MMP3；MRAS；MSN；MT1G；MTHFD2；MTSS1；MVK；MYC；MYL7；MYL9 (includes EG:10398)；MYLK；NAV2 (includes EG:89797)；NCOR2；NDRG1；NFATC4；NFIL3；NFIX；NFKBIA；NMU；NNMT；NP (includes EG:4860)；NUPR1；NXT1；ODC1；PAK2；PALM；PCK2；PDE2A；PDGFB；PDIA3；PDIA4；PDK1；PFKFB3；PH-4；PHLDA2；PIK3C2B；PIK3CD；PKM2；PLA2G3；PLAT；PLCB3；PLCD1；PLCH2；PLD1；PLK1；PLK3；PNPLA3；PODXL；PPAP2A；PPP1R12B；PPP2R5B；PPRC1；PRKCDBP；PRKCI；PSAT1；PTGS1；PTRF；PYGB；PYGL；RAC2；RBP1；RDH16 (includes EG:8608)；RPL35；RPS14；S100A2；SAA4；SALL2；SCG5；SEH1L；SEPW1；SERPINB5；SESN1；SGCA；SH2D2A；SIGLEC15；SLC25A37；SLC29A1；SMAD1；SMO；SMOX；SOD3；SOX2；SOX9；SPDEF；SPRY2；SPRY4；SRC；STX12；STYK1；TAF9；TCF4；TGFB2；THBS1；THRA；TIMP3；TK2；TMSB10；TNF；TPM1；TRAF1；TSC22D1；TUBA1A；TUBA1B；UBD；UBE2C；UBE2D1；UST；VANGL1；VAV3；VCP；VEGFA；WNT4；WNT5B；YWHAQ (includes EG:10971)；ZBED2およびZNF750.
  15. 　肺癌患者に対して個別のゲノムプロファイルを作成する方法であって、
    （ａ）当該患者から採取した癌細胞から抽出されたＲＮＡを遺伝子発明解析に供する工程；
    （ｂ）予後関連遺伝子シグネチャー（１）：
    ACTA2 (includes EG:59)；ACTB；ACTC1；ADAM10；ADAM12；ADAM17；ADAM19 (includes EG:8728)；ADAM8；ADCY6；ADORA2B；ADRBK2；ALOX15B；AREG；ARID3B；ATF2；ATP2C2 (includes EG:9914)；BCAR3；BMPR2；BPGM；CALML5；CASP1；CASP4；CAT；CCNA1；CCNB2；CCND1；CCND2；CD3EAP；CDC42；CDC42EP2；CDH3；CDKN1A；CENPF；CHAC1；CHODL；CHST11；CHST2；CLDN5；CLEC2B；COL13A1；COTL1；CREB1；CREB5；CRYAB；CSNK1D；CTGF；CTNNB1；CTSF；CXCL1；CXCR7；CYP1A1；CYP1B1；CYP27B1；CYP2U1；CYR61；DDEF1IT1；DDEFL1；DDIT3；DDX21；DHCR7；DSCAM；DUSP1；DUSP4；DUSP5；DYRK1A；E2F4；EFEMP1；EIF2AK2；ENC1；EPHA2；ETS2；EWSR1；FER1L4 (includes EG:80307)；FERMT1；FGF5；FOSL1；FZD10；GAD1；GAL；GAPDH；GBP2；GDNF；GLRX；GNB1；GNE；GNG11；GNG4；GOT2；GPNMB；GPX1；GPX3；GRB10；GRK6；GRN；GSTZ1；HADH；HBEGF；HES1；HGS；HIST1H4C；HIST3H3；HMGA2；HMGCR；HMGCS1；HMOX1；HNRPM；HOPX；HS3ST2；HSD11B1；HSD17B2；HSPA1A；HSPA5；HSPA8；HSPB1；HSPC159；ID1；IDI1；IER3；IGFBP2；IGFBP3；IGFBP6；IL1A；IL1F5；IL1RN；IL6；INHBA；INPP5D；INPPL1；IRF1；ISG20；ISG20L1；ITGB4；ITGB7；ITGB8；ITPR1；JAG1；JAK3；JUND；KCNJ5；KCTD5；KIAA1199；KLK8；KRT14 (includes EG:3861)；KRT34；KRT5；KRT75；LDLR；LGALS7；LIF；LIMK2；LPXN；MAFF；MAP2K1；MAP2K3；MAP3K3；MAP3K6；MAPK11；MERTK；MLPH；MMP1 (includes EG:4312)；MMP12；MMP3；MRAS；MSN；MT1G；MTHFD2；MTSS1；MVK；MYC；MYL7；MYL9 (includes EG:10398)；MYLK；NAV2 (includes EG:89797)；NCOR2；NDRG1；NFATC4；NFIL3；NFIX；NFKBIA；NMU；NNMT；NP (includes EG:4860)；NUPR1；NXT1；ODC1；PAK2；PALM；PCK2；PDE2A；PDGFB；PDIA3；PDIA4；PDK1；PFKFB3；PH-4；PHLDA2；PIK3C2B；PIK3CD；PKM2；PLA2G3；PLAT；PLCB3；PLCD1；PLCH2；PLD1；PLK1；PLK3；PNPLA3；PODXL；PPAP2A；PPP1R12B；PPP2R5B；PPRC1；PRKCDBP；PRKCI；PSAT1；PTGS1；PTRF；PYGB；PYGL；RAC2；RBP1；RDH16 (includes EG:8608)；RPL35；RPS14；S100A2；SAA4；SALL2；SCG5；SEH1L；SEPW1；SERPINB5；SESN1；SGCA；SH2D2A；SIGLEC15；SLC25A37；SLC29A1；SMAD1；SMO；SMOX；SOD3；SOX2；SOX9；SPDEF；SPRY2；SPRY4；SRC；STX12；STYK1；TAF9；TCF4；TGFB2；THBS1；THRA；TIMP3；TK2；TMSB10；TNF；TPM1；TRAF1；TSC22D1；TUBA1A；TUBA1B；UBD；UBE2C；UBE2D1；UST；VANGL1；VAV3；VCP；VEGFA；WNT4；WNT5B；YWHAQ (includes EG:10971)；ZBED2およびZNF750
    から選ばれる２～２７７遺伝子の当該癌細胞における発現レベルを測定し、当該発現レベルを、コントロール遺伝子に対して正規化し、必要に応じて、肺癌参照用組織セットに見られる量と比較する工程；ならびに
    （ｃ）当該遺伝子発明解析によって得られるデータをまとめた報告を作成する工程
    を含む方法。
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Cited By (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012157239A1 (en) * 2011-05-16 2012-11-22 Oncotherapy Science, Inc. Chodl as tumor marker and therapeutic target for cancer
WO2013031757A1 (ja) * 2011-08-29 2013-03-07 東レ株式会社 膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌の検出用マーカー及び検査方法
WO2013102680A1 (en) * 2012-01-05 2013-07-11 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Signature for the diagnosis of lung cancer aggressiveness and genetic instability
WO2013159099A2 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Gene expression profiles associated with metastatic breast cancer
KR101333207B1 (ko) * 2011-07-13 2013-11-26 부산대학교 산학협력단 자궁내막증과 연관된 유전자 마커 및 이의 용도
CN103667284A (zh) * 2012-08-30 2014-03-26 北京蛋白质组研究中心 一种特异抑制COTL1基因表达的siRNA及其应用
KR101507540B1 (ko) 2012-10-22 2015-04-07 사회복지법인 삼성생명공익재단 뇌전이암 진단용 조성물
JP2015070803A (ja) * 2013-10-02 2015-04-16 コニカミノルタ株式会社 Ｃｘｃｌ１の発現量に基づく肺癌患者の予後判定方法およびキット
WO2015125098A2 (en) 2014-02-24 2015-08-27 Immunepharma S.R.L. Lung cancer's biomarkers and their methods and diagnostic kit
KR101560799B1 (ko) 2013-10-07 2015-10-16 광주과학기술원 척수성 근위축증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물
WO2016003231A1 (ko) * 2014-07-04 2016-01-07 연세대학교 산학협력단 Kiaa1199를 이용한 췌장암의 진단 또는 치료용 조성물
KR101622454B1 (ko) 2014-03-04 2016-05-18 연세대학교 산학협력단 Egfr 티로신 키나아제 억제제에 대한 항암 치료 반응 예측 마커
KR20160141218A (ko) 2015-05-29 2016-12-08 아주대학교산학협력단 미토콘드리아 기능 저하된 암 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 암 진단 방법
WO2017002943A1 (ja) * 2015-07-01 2017-01-05 学校法人慶應義塾 癌組織の不均一性マーカー及びその使用
WO2017022634A1 (ja) * 2015-07-31 2017-02-09 北海道公立大学法人札幌医科大学 グリオーマの予後、遠隔部再発リスク及び浸潤を判定する方法及びキット並びにグリオーマを処置するための医薬組成物
WO2017042253A1 (en) * 2015-09-09 2017-03-16 Fresenius Medical Care Deutschland Gmbh Method and kit for diagnosing epithelial-to-mesenchymal transition (emt) of the peritoneum
JP2017519523A (ja) * 2014-06-05 2017-07-20 トランスゲニオン−インターナショナル インスティテュート フォー リジェネレイティヴ トランスレイショナル メディシン ゲーエムベーハー 新規分子バイオマーカーを使用して慢性閉塞性肺疾患（ｃｏｐｄ）を診断する方法
KR101764970B1 (ko) 2015-06-10 2017-08-04 아주대학교산학협력단 Nupr1을 포함하는 미토콘드리아 기능 저하된 암 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 암 진단 방법
KR20180001515A (ko) * 2016-06-27 2018-01-04 주식회사 옵티팜 뇌종양의 진단 및 치료에서의 nupr1의 용도
WO2018004240A1 (ko) * 2016-06-27 2018-01-04 주식회사 옵티팜 뇌종양의 진단 및 치료에서의 nupr1의 용도
US10508307B2 (en) 2014-06-05 2019-12-17 Transgenion—International Institute for Regenerative Translational Medicine GmbH Methods of diagnosing chronic obstructive pulmonary disease (COPD) using novel molecular biomarkers
US10526656B2 (en) 2014-06-05 2020-01-07 Transgenion—International Institute for Regenerative Translational Medicine GmbH Methods of diagnosing chronic obstructive pulmonary disease (COPD) using novel molecular biomarkers
CN111187833A (zh) * 2018-11-14 2020-05-22 上海生物芯片有限公司 Plk1和bub1b基因联合作为肺癌生物标志物的用途
KR20210092356A (ko) * 2020-01-15 2021-07-26 주식회사 베르티스 암의 진단용 조성물
KR20210108160A (ko) * 2020-02-25 2021-09-02 지니너스 주식회사 신장암 환자의 예후 예측을 위한 limk2의 용도
EP3728630A4 (en) * 2017-12-19 2021-11-17 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology COMPOSITIONS AND METHODS OF DIAGNOSING LUNG CANCER USING GENE EXPRESSION PROFILES
JP2022088607A (ja) * 2011-02-11 2022-06-14 ザ ロックフェラー ユニヴァーシティ 血管新生障害の処置
US11479802B2 (en) 2017-04-11 2022-10-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Assays for screening activity of modulators of members of the hydroxy steroid (17-beta) dehydrogenase (HSD17B) family
US11485958B2 (en) 2017-01-23 2022-11-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. HSD17B13 variants and uses thereof
WO2022231386A1 (ko) * 2021-04-29 2022-11-03 연세대학교 산학협력단 위암의 예후 예측 방법
CN115572769A (zh) * 2022-12-07 2023-01-06 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 用于肝癌患者良性预后预测的基因标志物组合
US11702700B2 (en) 2017-10-11 2023-07-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Inhibition of HSD17B13 in the treatment of liver disease in patients expressing the PNPLA3 I148M variation

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101504817B1 (ko) * 2013-04-05 2015-03-24 연세대학교 산학협력단 국소 진행형 위암에 대한 예후 예측 시스템
CN115019880B (zh) * 2022-05-05 2024-01-09 中山大学附属第一医院 一种肝癌预后模型及其构建方法和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006521793A (ja) * 2003-02-06 2006-09-28 ゲノミック ヘルス， インコーポレイテッド Ｅｇｆｒインヒビター薬物に応答性の遺伝子発現マーカー
JP2007506442A (ja) * 2003-05-30 2007-03-22 ゲノミック ヘルス， インコーポレイテッド Ｅｇｆｒ阻害薬への応答に関する遺伝子発現マーカー

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL1641914T3 (pl) * 2003-06-27 2017-01-31 DePuy Synthes Products, Inc. Komórki pochodzące z poporodowej tkanki łożyska oraz sposoby uzyskiwania i zastosowania tych komórek

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006521793A (ja) * 2003-02-06 2006-09-28 ゲノミック ヘルス， インコーポレイテッド Ｅｇｆｒインヒビター薬物に応答性の遺伝子発現マーカー
JP2007506442A (ja) * 2003-05-30 2007-03-22 ゲノミック ヘルス， インコーポレイテッド Ｅｇｆｒ阻害薬への応答に関する遺伝子発現マーカー

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BASELGA, J. ET AL.: "Strategies to optimise anti-EGF receptor therapies", EUROPEAN JOURNAL OF CANCER, vol. 38, 2002, pages S4, 6 *
HITOSHI ZENBUTSU ET AL.: "Nude Mice Xenograft o Mochiita EGFR Sogaizai ni Taisuru Kanjusei Shiken to cDNA Maico Array ni yoru Keijiteki Idenshi Hatsugen Profile no Kaiseki", NIHON GAN GAKKAI GAKUJUTSU SOKAI KIJI, vol. 61, 2002, pages 166, 1057 *

Cited By (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2022088607A (ja) * 2011-02-11 2022-06-14 ザ ロックフェラー ユニヴァーシティ 血管新生障害の処置
WO2012157239A1 (en) * 2011-05-16 2012-11-22 Oncotherapy Science, Inc. Chodl as tumor marker and therapeutic target for cancer
KR101333207B1 (ko) * 2011-07-13 2013-11-26 부산대학교 산학협력단 자궁내막증과 연관된 유전자 마커 및 이의 용도
WO2013031757A1 (ja) * 2011-08-29 2013-03-07 東レ株式会社 膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌の検出用マーカー及び検査方法
US9790556B2 (en) 2012-01-05 2017-10-17 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Signature for the diagnosis of lung cancer aggressiveness and genetic instability
WO2013102680A1 (en) * 2012-01-05 2013-07-11 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Signature for the diagnosis of lung cancer aggressiveness and genetic instability
CN104662166A (zh) * 2012-04-20 2015-05-27 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 与转移性乳腺癌相关的基因表达图谱
WO2013159099A2 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Gene expression profiles associated with metastatic breast cancer
WO2013159099A3 (en) * 2012-04-20 2013-12-27 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Gene expression profiles associated with metastatic breast cancer
EP2839034A4 (en) * 2012-04-20 2016-01-06 Sloan Kettering Inst Cancer GENE EXPRESSION PROFILES ASSOCIATED WITH METASTASIC BREAST CANCER
CN103667284B (zh) * 2012-08-30 2016-03-02 北京蛋白质组研究中心 一种特异抑制COTL1基因表达的siRNA及其应用
CN103667284A (zh) * 2012-08-30 2014-03-26 北京蛋白质组研究中心 一种特异抑制COTL1基因表达的siRNA及其应用
KR101507540B1 (ko) 2012-10-22 2015-04-07 사회복지법인 삼성생명공익재단 뇌전이암 진단용 조성물
JP2015070803A (ja) * 2013-10-02 2015-04-16 コニカミノルタ株式会社 Ｃｘｃｌ１の発現量に基づく肺癌患者の予後判定方法およびキット
KR101560799B1 (ko) 2013-10-07 2015-10-16 광주과학기술원 척수성 근위축증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물
JP2017508987A (ja) * 2014-02-24 2017-03-30 イミューンファルマ エッセ．エッレ．エッレ． 肺癌のためのバイオマーカー、その診断方法、およびキット
CN106030308A (zh) * 2014-02-24 2016-10-12 免疫制药股份责任有限公司 用于肺癌的生物标记物、相关的方法和试剂盒
WO2015125098A2 (en) 2014-02-24 2015-08-27 Immunepharma S.R.L. Lung cancer's biomarkers and their methods and diagnostic kit
US10976318B2 (en) 2014-02-24 2021-04-13 Immunepharma S.R.L. Method of treating cancer using a caspase-4 inhibitor
WO2015125098A3 (en) * 2014-02-24 2015-11-19 Immunepharma S.R.L. Biomarkers for lung cancer, associated methods, and kits
US20170067898A1 (en) * 2014-02-24 2017-03-09 Immunepharma S.R.L. Lung cancer's biomarkers and their methods and diagnostic kit
KR101622454B1 (ko) 2014-03-04 2016-05-18 연세대학교 산학협력단 Egfr 티로신 키나아제 억제제에 대한 항암 치료 반응 예측 마커
US10604806B2 (en) 2014-06-05 2020-03-31 Transgenion—International Institute for Regenerative Translational Medicine GmbH Methods of diagnosing chronic obstructive pulmonary disease (COPD) using novel molecular biomarkers
US10526656B2 (en) 2014-06-05 2020-01-07 Transgenion—International Institute for Regenerative Translational Medicine GmbH Methods of diagnosing chronic obstructive pulmonary disease (COPD) using novel molecular biomarkers
JP2017519523A (ja) * 2014-06-05 2017-07-20 トランスゲニオン−インターナショナル インスティテュート フォー リジェネレイティヴ トランスレイショナル メディシン ゲーエムベーハー 新規分子バイオマーカーを使用して慢性閉塞性肺疾患（ｃｏｐｄ）を診断する方法
US10508307B2 (en) 2014-06-05 2019-12-17 Transgenion—International Institute for Regenerative Translational Medicine GmbH Methods of diagnosing chronic obstructive pulmonary disease (COPD) using novel molecular biomarkers
US11124835B2 (en) 2014-06-05 2021-09-21 Transgenion—International Institute for Regenerative Translational Medicine GmbH Methods of diagnosing chronic obstructive pulmonary disease (COPD) using novel molecular biomarkers
WO2016003231A1 (ko) * 2014-07-04 2016-01-07 연세대학교 산학협력단 Kiaa1199를 이용한 췌장암의 진단 또는 치료용 조성물
KR20160141218A (ko) 2015-05-29 2016-12-08 아주대학교산학협력단 미토콘드리아 기능 저하된 암 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 암 진단 방법
KR101764970B1 (ko) 2015-06-10 2017-08-04 아주대학교산학협력단 Nupr1을 포함하는 미토콘드리아 기능 저하된 암 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 암 진단 방법
JPWO2017002943A1 (ja) * 2015-07-01 2017-06-29 学校法人慶應義塾 癌組織の不均一性マーカー及びその使用
WO2017002943A1 (ja) * 2015-07-01 2017-01-05 学校法人慶應義塾 癌組織の不均一性マーカー及びその使用
JPWO2017022634A1 (ja) * 2015-07-31 2018-07-05 北海道公立大学法人 札幌医科大学 グリオーマの予後、遠隔部再発リスク及び浸潤を判定する方法及びキット並びにグリオーマを処置するための医薬組成物
JP7122016B2 (ja) 2015-07-31 2022-08-19 北海道公立大学法人 札幌医科大学 グリオーマの予後、遠隔部再発リスク及び浸潤を判定する方法及びキット並びにグリオーマを処置するための医薬組成物
WO2017022634A1 (ja) * 2015-07-31 2017-02-09 北海道公立大学法人札幌医科大学 グリオーマの予後、遠隔部再発リスク及び浸潤を判定する方法及びキット並びにグリオーマを処置するための医薬組成物
JP2021038270A (ja) * 2015-07-31 2021-03-11 北海道公立大学法人 札幌医科大学 グリオーマの予後、遠隔部再発リスク及び浸潤を判定する方法及びキット並びにグリオーマを処置するための医薬組成物
CN108449998A (zh) * 2015-09-09 2018-08-24 费森尤斯医疗护理德国有限责任公司 用于诊断腹膜的上皮向间充质转化(emt)的方法和试剂盒
CN108449998B (zh) * 2015-09-09 2021-07-06 费森尤斯医疗护理德国有限责任公司 用于诊断腹膜的上皮向间充质转化(emt)的方法和试剂盒
WO2017042253A1 (en) * 2015-09-09 2017-03-16 Fresenius Medical Care Deutschland Gmbh Method and kit for diagnosing epithelial-to-mesenchymal transition (emt) of the peritoneum
KR20180001515A (ko) * 2016-06-27 2018-01-04 주식회사 옵티팜 뇌종양의 진단 및 치료에서의 nupr1의 용도
WO2018004240A1 (ko) * 2016-06-27 2018-01-04 주식회사 옵티팜 뇌종양의 진단 및 치료에서의 nupr1의 용도
KR101973027B1 (ko) 2016-06-27 2019-04-26 주식회사 옵티팜 뇌종양의 진단 및 치료에서의 nupr1의 용도
US11845963B2 (en) 2017-01-23 2023-12-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. HSD17B13 variants and uses thereof
US11753628B2 (en) 2017-01-23 2023-09-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. HSD17B13 variants and uses thereof
US11485958B2 (en) 2017-01-23 2022-11-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. HSD17B13 variants and uses thereof
US11479802B2 (en) 2017-04-11 2022-10-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Assays for screening activity of modulators of members of the hydroxy steroid (17-beta) dehydrogenase (HSD17B) family
US11702700B2 (en) 2017-10-11 2023-07-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Inhibition of HSD17B13 in the treatment of liver disease in patients expressing the PNPLA3 I148M variation
EP3728630A4 (en) * 2017-12-19 2021-11-17 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology COMPOSITIONS AND METHODS OF DIAGNOSING LUNG CANCER USING GENE EXPRESSION PROFILES
CN111187833A (zh) * 2018-11-14 2020-05-22 上海生物芯片有限公司 Plk1和bub1b基因联合作为肺癌生物标志物的用途
KR20210092356A (ko) * 2020-01-15 2021-07-26 주식회사 베르티스 암의 진단용 조성물
KR102325742B1 (ko) 2020-01-15 2021-11-15 주식회사 베르티스 암의 진단용 조성물
KR102337947B1 (ko) * 2020-02-25 2021-12-10 지니너스 주식회사 신장암 환자의 예후 예측을 위한 limk2의 용도
KR20210108160A (ko) * 2020-02-25 2021-09-02 지니너스 주식회사 신장암 환자의 예후 예측을 위한 limk2의 용도
WO2022231386A1 (ko) * 2021-04-29 2022-11-03 연세대학교 산학협력단 위암의 예후 예측 방법
CN115572769A (zh) * 2022-12-07 2023-01-06 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 用于肝癌患者良性预后预测的基因标志物组合
CN115572769B (zh) * 2022-12-07 2023-03-14 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 用于肝癌患者良性预后预测的基因标志物组合

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2010064702A1 (ja) 2012-05-10

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