CN108449998B - 用于诊断腹膜的上皮向间充质转化(emt)的方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及诊断上皮向间充质转化(EMT)(例如间皮向间充质转化(MMT))，尤其腹膜的EMT（其经常在腹膜透析时发生）的领域。本发明提供基于标记的方法和试剂盒，所述标记包括至少一种细胞外基质蛋白，例如胶原蛋白13、胶原蛋白6和/或角蛋白34；至少一种参与细胞外基质的建立和/或重建的蛋白，例如基质金属蛋白酶1；至少一种参与细胞‑细胞和/或细胞‑基质接触的蛋白，例如钙粘着蛋白13或血小板反应蛋白1；至少一种生长因子，例如VEGF；以及任选的至少一种BMP拮抗剂，例如Gremlin 1。

Description

用于诊断腹膜的上皮向间充质转化(EMT)的方法和试剂盒

本发明涉及诊断上皮向间充质转化(EMT)，尤其间皮向间充质转化(MMT)，尤其腹膜的EMT（其经常在腹膜透析时发生）的领域。本发明提供基于标记的方法和试剂盒，所述标记包括至少一种细胞外基质蛋白，例如胶原蛋白13、胶原蛋白6和/或角蛋白34；至少一种参与细胞外基质的建立和/或重建的蛋白，例如基质金属蛋白酶1；至少一种参与细胞-细胞和/或细胞-基质接触的蛋白，例如钙粘着蛋白13或血小板反应蛋白1；至少一种生长因子，例如VEGF；以及任选的至少一种BMP拮抗剂，例如Gremlin 1。

在终末期肾病的治疗中，腹膜透析(PD)是血液透析(HD)的有效且有成本效率的替代方案，其覆盖了大约10-15%的透析群体。在PD期间，腹膜(peritoneal membrane或peritoneum)起半透膜的作用，穿越所述半透膜发生超滤和扩散。但是，长期使用PD仍然受到限制。接近50%的患者被迫在4年或5年的PD治疗期间内换成血液透析，因为长期暴露于生物不相容的PD流体，腹膜炎和腹腔积血发作诱导腹膜组织的退行性变化，这最终导致超滤失败。腹膜的这些进行性功能和形态改变可能由PD流体中的高葡萄糖浓度、低pH和乳酸缓冲液导致，并体现为炎性反应、间皮细胞(MC)单层的逐渐剥露、间皮下纤维化(submesothelial fibrosis)和血管新生(neoangiogenesis)。

在长期PD期间，MC经历上皮特征的逐渐丧失，并获得成肌纤维细胞样表型。这种上皮向间充质转化(EMT)是一个复杂且逐步的过程，其表征为顶端-基底外侧极性(apical-basolateral polarity)的丧失、细胞间连接的破坏以及迁移和侵袭性质的获得(Selgas等人，2006, Nephrol Dial Transplant 21 [Suppl 2]:ii2-ii7；Aroeira等人，2007, J AmSoc Nephrol 18:2004-2013)。经历EMT的MC获得产生细胞外基质组分以及炎性因子、纤维发生因子和血管生成因子的能力。在腹膜的EMT过程期间，经由转化生长因子TGF-β1和血管内皮生长因子(VEGF)的上调来触发腹膜纤维化和血管生成。

然而，迄今为止，PD期间的腹膜变化不可避免，但最优化的治疗，例如使用生物相容的溶液或另一种治疗方案(例如改变填充体积和/或停留时间)可至少延迟这些变化。EMT是可逆的过程，至少在早期是可逆的。此外，可基于患者腹膜的状态来最优化PD治疗的效率。

EMT是生物学过程，其不仅涉及PD期间腹膜的变化，而且其在胚胎发生和伤口愈合中起作用。EMT还可引起器官纤维化并在癌症进展和转移中起作用。EMT还已显示促成各种疾病的发病机制，所述疾病例如癌症或不同的器官(包括肺)中的退行性纤维变性病症（degenerative fibrotic disorders）(WO 2014/139885 A2)。

WO 2014/139885 A2教导了基质金属蛋白酶MMP10、细胞和可溶性纤连蛋白、E-钙粘着蛋白和波形蛋白是用于EMT的标记。在现有技术中， 已鉴定出用于EMT或通常纤维化（其与EMT相关联）的几种其它标记。例如，WO2011/054893 A2显示了TLR-9的表达水平与纤维化之间的关联。WO2012/042091教导了基于测定TAK1来测定纤维化的进展的方法。US2013/0303563 A1公开了骨膜蛋白、 HSPG降解、PDGF、瘦蛋白和CD68+巨噬细胞密度是用于腹膜损伤的标记。US 2013/020940 A1建议BMP9或BMP10的测定有用于评估发展纤维变性病症的风险。Aroeira等人，2007年教导了PD患者的腹膜中E-钙粘着蛋白、细胞角蛋白、密蛋白、闭合蛋白、桥粒斑蛋白、ZO-1、粘蛋白-1、tPA和CD34的表达降低，以及N-钙粘着蛋白、snail、波形蛋白、TGF-β、纤连蛋白、细胞外基质蛋白，尤其胶原蛋白I和III、αSMA、FGF-1和FGF-2、MMP-2和MMP-9、FSP-1、PAI-1、VEGF以及环氧合酶-2的表达增加。

但是，仍需要提供用于EMT的标记，其与经历EMT的组织的功能(例如腹膜在PD中的过滤能力)紧密相关。发明人已解决了提供用于诊断EMT的此类标记、相应的试剂盒和方法的问题。本发明的主题例如由所附权利要求书来描述。

本发明提供了用于诊断上皮向间充质转化(EMT)（尤其MMT，或最优选腹膜的EMT）的方法，其包括检测样品中的多种标记的缺乏和/或量，所述标记包括：

a)细胞外基质蛋白，

b)参与细胞外基质的建立和/或重建的蛋白，

c)参与细胞-细胞和/或细胞-基质接触的蛋白，

d)生长因子，以及，任选地，

e)BMP拮抗剂。

在本发明的上下文中，除非另外明确规定，否则冠词“一（种/个）”理解为表示“一（种/个）或更多（种/个）”。因此，例如，所述标记还可包括两种或三种(或更多种)细胞外标记蛋白或两种或三种参与细胞-细胞和/或细胞-基质接触的蛋白。

本发明还提供了用于诊断上皮向间充质转化(EMT)的相应试剂盒，其包含用于检测样品中的标记的试剂，所述标记包括：

a)细胞外基质蛋白，

b)参与细胞外基质的建立和/或重建的蛋白，

c)参与细胞-细胞和/或细胞-基质接触的蛋白，

d)生长因子，以及，任选地，

e)BMP拮抗剂。

优选地，若标记呈蛋白形式，则用于检测样品中的标记的试剂是抗体或其片段。抗体适合用于检测呈蛋白形式的标记。抗体或其片段可为人、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、山羊、猫、禽类（例如鸡）或嵌合来源。它们可为多克隆的或单克隆的，或通过基因工程产生。抗体片段包括例如Fab片段、Fab₂片段、scFv。

或者，用于检测样品中的标记的试剂可以是核酸，例如RNA或DNA，其适合用于检测呈核酸形式的标记，尤其合适用于检测标记的RNA转录体或由其衍生的cDNA。核酸优选至少部分为单链的，并且能够在严格的条件下与编码所述标记的核酸杂交。

优选地，用于检测样品中的标记的试剂与固相支持体(例如芯片、可能为磁性的不同尺寸的珠等等)连接。优选地，所述试剂盒包含微阵列，特别是抗体微阵列，也称为抗体芯片。可适合于本发明的合适的抗体芯片格式公开于例如Wingren等人，2009, Methods MolBiol. 509:57-84；Chaga等人，2008, methods Mol Biol. 441:129-51中，或可由例如Abnova Corporation、R&D Systems、Full Moon BioSystems、Raybiotech, Inc.、BioSims和其它的公司定制。

发明人分析了健康的间皮细胞(获得自不具有肾衰竭的患者的网膜)、上皮样细胞(即，在间皮细胞的EMT/MMT的第一步中的细胞，其具有与间皮细胞类似的表型，获得自PD患者的流出液)以及EMT晚期中的细胞(即，已改变其表型的细胞，也称为非上皮样)的基因表达。鉴定出数种一旦细胞已获得非上皮样表型就显著且特异性上调的基因。验证了它们的表达，以及与功能的关联，检查了不同的体液(包括血清和流出液)中的各自的蛋白水平。发明人令人惊讶地发现来自数种官能团的标记在EMT中起重要作用。发明人进一步发现这些标记的RNA和蛋白水平均与可得自患者的临床参数相关联，并且其调节允许功能性结论。特别地，本发明的标记还使得有可能区分EMT的早期和晚期。例如，CDH13、COL6A3、COL13A1、THBS1和MMP1的mRNA水平允许辨别EMT的早期和晚期，并且与腹膜水转运/超滤的临床数据相关联。

根据本发明分析的标记中的至少一种（优选两种或三种）是细胞外基质蛋白。其可为选自选自角蛋白34 (KRT34)的角蛋白、和/或选自胶原蛋白13 (COL13A1)和胶原蛋白6(COL6A1)的胶原蛋白。优选地，所述标记包括细胞外基质蛋白角蛋白34、胶原蛋白13和胶原蛋白6。来自细胞外基质蛋白组的另选的或额外的标记包括胶原蛋白1和/或3(Selgas等人，2006；Aroeira等人，2007)。

根据本发明分析的标记中的至少一种是参与细胞外基质的建立和/或重建的蛋白。其可为选自基质金属蛋白酶1 (MMP1)的基质金属蛋白酶。来自参与细胞外基质的建立和/或重建的蛋白组的另选的或额外的标记包括MMP2、MMP9和/或MMP10 (Selgas等人，2006；Aroeira等人，2007, US2013/0303563 A1, WO 2014/139885 A2)。

根据本发明分析的标记中的至少一种（优选两种）是参与细胞-细胞和/或细胞-基质接触的蛋白。其可为选自钙粘着蛋白13 (CDH13)的钙粘着蛋白和/或选自血小板反应蛋白1 (THBS1或TPS1)的血小板反应蛋白。优选地，所述标记包括钙粘着蛋白13和血小板反应蛋白1。

来自参与细胞-细胞和/或细胞-基质接触的蛋白组的另选的或额外的标记是N-钙粘着蛋白、E-钙粘着蛋白(CDH1)、CD44、波形蛋白或纤连蛋白(Selgas等人，2006；Aroeira等人，2007)。

根据本发明分析的标记中的至少一种是生长因子，例如促血管生成的生长因子，其中所述生长因子优选是血管内皮（细胞）生长因子VEGF。Selgas等人，2006和Aroeira等人，2004教导了VEGF在EMT中的作用。来自生长因子组的另选的或额外的标记是TGF-β、FGF-1、FGF-2 (Aroeira等人，2007)。

任选地，还根据本发明分析的标记是BMP拮抗剂，优选是gremlin 1 (也称为DAN家族BMP拮抗剂或GREM)。Lee等人，2007, Investigative Ophthalmology & Visual Science2007年9月，第48卷，4291-4299教导了gremlin 1参与增殖性玻璃体视网膜病变中的EMT。优选地，在可能经历EMT的细胞(尤其来自PD患者的流出液的细胞)的上清液中测定BMP拮抗剂，例如GREM。发明人显示GREM在流出液中的表达不与EMT显著相关联，因此流出液的分析不必需包括BMP拮抗剂(例如GREM)的分析。

任选的其它标记包括组织因子途径抑制剂(TFI2)、血栓调节蛋白(THBD)、水通道蛋白(AQP1)和/或激酶插入结构域受体(KDR)。

在优选实施方案中，所述标记是钙粘着蛋白13、胶原蛋白13、胶原蛋白6、角蛋白34、基质金属蛋白酶1、血小板反应蛋白1、VEGF以及任选的Gremlin 1。

发明人显示增加量的以上讨论的标记指示上皮向间充质转化(EMT)。可将所述标记的量与对照样品相比较，所述对照样品例如获取自健康对象(例如未经历PD的人)的样品，优选地，此类对照样品池包含来自至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个或至少20个健康对象的样品。或者，可使用标准品来测定待分析样品中的标记的量，并将结果与获得自对照样品或其池的结果进行比较。

还有可能在两个或更多个时间点处比较同一对象的标记的量，所述时间点例如在治疗之前(即，在PD之前，若要分析腹膜的状态的话)；在治疗（例如使用PD持续特定时间）之后，例如至少1个月后、至少6个月后、至少1年后、至少2年后、至少3年后、至少4年后、至少5年后、至少6年后、至少7年后、至少8年后、至少9年后、至少10年后、至少11年后、至少12年后、至少13年后、至少14年后、至少15年后或至少20年后。因为EMT可以是可逆的，所以也可在改变治疗方案之后或在改变所使用的PD流体之后进行分析。

优选地，贯穿本发明，上皮向间充质转化是腹膜的上皮向间充质转化，其中优选地，所述样品得自腹膜透析患者，例如具有慢性肾病的PD患者。发明人已令人惊讶地发现，本发明的那套标记显示与腹膜的功能（尤其通过腹膜过滤的功效）紧密相关。

PD可以是例如CAPD (持续非卧床性腹膜透析)，或CCPD (持续性循环PD)、IPD (间歇性PD)或NIPD (夜间间歇性PD)。

还可能感兴趣的是分析参与胚胎发生或伤口愈合的EMT。除了PD之外，EMT的诊断在癌症进展和转移中，特别是在腹部癌症进展和腹膜转移中，或在不同器官中(包括肺)的退行性纤维变性病症中(如WO 2014/139885 A2中所公开的)，或在术后腹膜粘连形成中具有临床相关性。一般而言，EMT可以是腹膜疾病的标志。

所述样品可得自可能经历EMT的任何生物样品。例如，其可为得自经历退行性纤维变性病症的器官或组织的样品。其可为患者的体液（例如腹膜液）、患者的血液、血清或血浆。若样品来自PD患者，则样品优选选自腹膜流出液(即，用过的腹膜透析液)、腹膜液、血清、血浆或腹膜组织，或其可由以上（物质）获得，例如，来自腹膜流出液的培养细胞的上清液。发明人已显示可基于腹膜流出液获得优异的结果。

所述样品还可选自来自可用作EMT模型(例如腹膜透析的模型)的细胞或组织培养物的培养基或细胞裂解物。例如，ARPE-19细胞显示为EMT的有用模型(Lee等人，2007)。另选的模型会是例如小鼠PD模型。

本发明还提供了本发明的试剂盒用于诊断上皮向间充质转化，优选用于诊断腹膜透析患者的腹膜的上皮向间充质转化的用途。可使用本发明的试剂盒和方法来确定EMT的状态，特别是腹膜的状态，其中有可能区分早期和晚期。

本发明还提供用于预测患者的组织(优选腹膜)的上皮向间充质转化的进展的方法，其包括用本发明的试剂盒和/或方法分析患者的组织的状态。所述组织还可为癌症，从而允许预测癌症的进展和/或转移。

本发明还提供用于最优化腹膜透析患者的治疗的方法，其包括用本发明的试剂盒和/或方法分析患者的腹膜的状态，其中所述使治疗适合于患者的腹膜的状态。所述治疗可以允许可能最长时间地使用腹膜透析的方式，和/或以最优化腹膜透析效率的方式来适合。

本发明还提供用于测试PD溶液的方法，其包括：

a)使腹膜或充当腹膜模型的细胞或组织培养物与PD溶液接触，和

b)用本发明的任何试剂盒和/或方法分析腹膜或细胞或组织培养物的状态。

可在体内或体外进行测试PD溶液的方法。发明人显示水通道蛋白1(AQP1)表达与生物不相容的PD流体的使用相关，因此优选包括该标记的分析，用于测试PD溶液。

通过引用将本文所引述的文献全部并入本文。通过以下附图、实施例和示例性实施方式来进一步阐述本发明，所述附图、实施例和示例性实施方式不意欲限制本发明。

附图

图1 显示VEGF在来自已被分类成E(上皮样)和NE(非上皮样)的患者的流出液中的表达，其中用抗体来将蛋白定量。分类基于椭圆因数(Elliptical Factor)。每种细胞培养物拍摄两张照片。随机选择10个细胞，测量细胞的长轴和短轴并计算比率。计算各经培养的（细胞）的平均值，若该平均值等于或大于2(细胞的长是宽的两倍)，则将该培养物归类为非上皮样，否则将其归类为上皮样。上皮样=12.73±12.81 pg/ml (N=20)；非上皮样=43.70±6.181 pg/ml (N=20)

图2 显示GREM1在来自已被如上分类成E(上皮样)和NE(非上皮样)的患者的流出液中的表达，其中用抗体来将蛋白定量。上皮样=0.4405±0.3598 ng/ml (N=20)；非上皮样=0.3555±0.3756 ng/ml (N=20)

图3 显示血小板反应蛋白1在来自已被如上分类成E(上皮样)和NE(非上皮样)的患者的流出液中的表达，其中用抗体来将蛋白定量。上皮样=5.791±7.669 ng/ml (N=20)；非上皮样=66.62±42.18 ng/ml (N=20)

图4 显示血小板反应蛋白1在来自已根据肌酸酐的质量传递系数(Cr-MTC)(即，用于测定穿越腹膜的转运的参数)分类的患者的流出液中的表达，其中用抗体来将蛋白定量。Cr-MTC<11=19.19±26.11 ng/ml (N=26)；Cr-MTC>11=67.81±50.66 ng/ml (N=14)

图5 显示COL13在来自已根据椭圆因数分类的患者的流出液中的表达，其中用抗体来将蛋白定量。上皮样=166.4±120.1 ng/ml, N=33；非上皮样=228.0±132.4 ng/ml, N=43

图6 显示COL13在来自已根据肌酸酐的质量传递系数(Cr-MTC)分类的患者的流出液中的表达，其中用抗体来将蛋白定量。Cr-MTC<11=189.8±132.8 ng/ml, N=51；Cr-MTC>11=243.8±108.6 ng/ml, N=23。

实施例

实施例1

在得自PD患者的流出液的经培养的间皮细胞中进行差别基因表达研究。将得自PD患者的具有上皮样表型的9个样品和具有非上皮样表型的8个样品与对照池(得自4位不同的健康捐助者的网膜的间皮细胞)进行比较。获得不同组的诱导基因或阻遏基因，并通过RT-qPCR验证40种基因。表I中显示了15种基因的子集的结果。另外，根据使用生物相容的(例如BicaVera)和生物较不相容的(“生物不相容的”)PD流体(例如Stay-safe)对结果进行分组（如表II中所示）。表III显示使用生物不相容的PD流体导致比使用生物相容的PD流体更高的EMT速率。表I和表II中的结果显示本发明标记的高功能意义。

CDH13、COL6A3、COL13A1、KRT34、MMP1、THBS1 (也称为TPS1) 、VEGFA和CDH1的mRNA显示上皮样表型与非上皮样表型之间的统计学差异，以及特征性的生物相容的PD流体与生物不相容的PD流体之间的统计学差异。CD44、TFI2、KDR和THBD显示上皮样表型与非上皮样表型之间的显著差异，并且AQP1在生物相容的PD流体与生物不相容的PD流体之间有所不同。

表I：

表II：

表III：

实施例2

通过酶联免疫吸附测定(ELISA)，测定从得自26份PD患者流出液的间皮细胞培养物中获得的上清液中的蛋白，其如此分布：在PD处理开始时获取26个样品、在12个月时获取26个样品、在18个月时获取20个样品以及在24个月时获取11个样品(数据未显示)。在用20%的FBS和50 U/ml青霉素、50 µg/ml链霉素和2%的Biogro-2补充的Earle’s M199培养基中培养间皮细胞。当细胞达到融合（confluency）时，在24小时期间用新鲜的培养基替换培养基。收集上清液并在-80ºC下储存，直至使用。对于上清液的分析，用细胞裂解物中的总蛋白将上清液中的蛋白归一化。用ELISA分析所选的标记。TSP1、VEGF、MMP2、CDH13和GREM1显示上皮样表型与非上皮样表型之间的不同的表达，其中在非上皮样组中的所有这些蛋白均具有较高的量。

实施例3

通过ELISA分析得自PD患者的40份流出液，并在本文中包括蛋白水平上的不同标记的示例性数据。

流出液中的VEGF显示上皮样表型与非上皮样表型之间的显著差异(图1)。这指示了根据间皮细胞的EMT的进展，VEGF增加。肌酸酐(Cr)的质量传递系数(MTC)是指示腹膜转运状态的临床参数。MTC高于11表征了病理学腹膜转运。当通过MTC将流出液中的VEGF的结果分组时，观察到MTC高于或低于11的患者之间的统计学差异，并且在MTC>11组中VEGF更高。因此，流出液中的VEGF可用于确定腹膜的功能状态。流出液中的VEGF在通过生物不相容的PD流体(更具侵袭性的流体)和生物相容的PD流体进行分组时，也显示了这些组之间的显著差异，其中生物不相容的流体中VEGF更多。

流出液中的GREM1未显示上皮样表型与非上皮样表型之间的显著差异(图2)，其中在上皮样组中蛋白的量更高，但是在上清液中差异显著，其中非上皮样表型呈现更高量的蛋白。流出液中的GREM1在其通过MTC分类时呈现统计学差异，其中在MTC<11组中的蛋白的水平更高。GREM1未显示生物相容的PD流体与生物不相容的PD流体之间的显著差异。

流出液中的TSP1显示上皮样表型与非上皮样表型之间的显著差异(图3)，以及MTC<11组或MTC>11组之间的显著差异(图4)。因此，TSP1与间皮细胞的EMT/MMT过程以及腹膜中的转运相关。流出液中的TSP1蛋白未显示生物相容的PD流体与生物不相容的PD流体之间的差异，但是p-值(p=0.16)指示（差异）显著的趋势。

还分析了流出液中的COL13，并且其显示取决于表型和肌酸酐转运的差异。

Claims (13)

1.用于检测样品中的标记的试剂在制备用于诊断腹膜的上皮向间充质转化(EMT)的试剂盒中的用途，所述标记包括：

a)细胞外基质蛋白，其选自角蛋白34、胶原蛋白13和胶原蛋白6，

b)参与细胞外基质的建立和/或重建的蛋白，其选自基质金属蛋白酶1，

c)参与细胞-细胞和/或细胞-基质接触的蛋白，其选自钙粘着蛋白13和血小板反应蛋白1，

d)生长因子，其选自VEGF，和

e)任选的BMP拮抗剂，其选自gremlin 1，

其中所述样品选自：

a)来自患者的样品，其包括腹膜流出液、腹膜液、血清、腹膜组织，和

b)来自可用作腹膜透析模型的细胞或组织培养物的培养基或细胞裂解物。

2.权利要求1所述的用途，其中所述用于检测所述样品中的所述标记的试剂是抗体或其片段。

3.权利要求1或2所述的用途，其中所述用于检测所述样品中的所述标记的试剂与固相支持体连接。

4.权利要求3所述的用途，其中所述试剂盒包含抗体芯片。

5.权利要求1或2所述的用途，其中所述标记包括角蛋白34、胶原蛋白13和胶原蛋白6。

6.权利要求1或2所述的用途，其中所述标记包括钙粘着蛋白13和血小板反应蛋白1。

7.权利要求1或2所述的用途，其中增加量的所述标记指示上皮向间充质转化(EMT)。

8.权利要求1或2所述的用途，其中所述样品得自腹膜透析患者。

9.权利要求1或2所述的用途，其中所述试剂盒用于诊断腹膜透析患者的腹膜的上皮向间充质转化。

10.权利要求1或2所述的用途，其中所述试剂盒用于预测患者的组织的上皮向间充质转化的进展。

11.权利要求10所述的用途，其中所述试剂盒用于预测患者的腹膜的上皮向间充质转化的进展。

12.权利要求1或2所述的用途，其中所述试剂盒用于最优化腹膜透析患者的治疗，所述最优化包括用所述试剂盒分析所述患者的腹膜的状态，其中使所述治疗适合于所述患者的腹膜的状态。

13.权利要求1或2所述的用途，其中所述试剂盒用于测试腹膜透析溶液，所述测试包括：

a)使腹膜或充当腹膜模型的细胞或组织培养物与所述溶液接触，

b)用根据权利要求1或2制备的所述试剂盒分析所述腹膜或所述细胞或组织培养物的状态。

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