WO2012042091A2 - Uso de inhibidores de tak1 en la prevención y tratamiento del fracaso de la membrana peritoneal - Google Patents

Uso de inhibidores de tak1 en la prevención y tratamiento del fracaso de la membrana peritoneal Download PDF

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WO2012042091A2
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Miguel Ángel DEL POZO BARRIUSO
Manuel LÓPEZ CABRERA
Raffaele Strippoli
Ignacio BENEDICTO ESPAÑOL
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Centro Nacional De Investigaciones Cardiovasculares (Cnic)
Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic)
CENTRO DE INVESTIGACIÓN BIOMÉDICA EN RED: ENFERMEDADES HEPÁTICAS Y DIGESTIVAS (CIBERehd)
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to the use of TAK1 inhibitors for the preparation of a medicament for the prevention and treatment of peritoneal membrane failure.
  • Such use prevents and reverses the mesenchymal epithelial transition suffered by the mesothelial cells of the peritoneum during peritoneal dialysis treatment.
  • This use allows to treat and reverse the fibrotic process that occurs in the peritoneal membrane during peritoneal dialysis and, therefore, is useful for the prevention of peritoneal membrane failure in patients with renal insufficiency.
  • Peritoneal dialysis is an alternative to hemodialysis for the treatment of end-stage renal failure that is usually applied on an outpatient basis.
  • Peritoneal dialysis is based on the ability of perotoneal mesothelial cells to act as a permeability barrier. These mesothelial cells form a monolayer that possesses epithelial cell characteristics and that in addition to its filtering barrier capacity, secretes various substances involved in homeostasis and in the local immune defense.
  • the epithelial-mesenchymal transition (or transdifferentiation, TEM) is a complex and generally reversible process characterized by the loss of epithelial characteristics (loss of adhesion molecules, cytoskeleton reorganization) and transformation into fibroblast cells (acquiring mesenchymal markers) with Migratory, invasive and fibrogenic characteristics that occur in response to induction with TGF-beta (transforming growth factor-beta) (Thiery et al. 2006. Nature Rev 7: 131-142; Xu et al. 2009. Cell Res 19: 156 -172).
  • TGF-beta transforming growth factor-beta
  • TEM has been described as a fundamental process in tumor progression, in the pathology in various organs such as lung, liver and kidney; and in the peritoneum of patients undergoing peritoneal dialysis (Selgas et al. 2004. Nephrology 24: 34-39). It has been demonstrated both in vivo and ex vivo (with mesothelial cells from patient effluent) that the mesothelial cells of patients undergoing PD undergo epithelial-mesenchymal transition (Ya ⁇ ez-Mó et al. 2003. N Engl J Med 348: 403-413 ).
  • BMP-7 bone morphogenic protein-7
  • FGF fibroblast growth factor
  • TGF-beta activated kinase 1 is a kinase involved in the signaling pathway of TGF-beta (via p38 MAPK) and IL-1 (interleukin-1).
  • TAK1 has been suggested for various diseases (US20040198750) and in the case of fibrosis its use has been suggested, but without providing experimental data, for the treatment and prevention of processes in which TGF are involved -beta and IL-1, specifically in the case of inhibitors that are resorcyclic lactones of fungal origin (Zearalenones) that have hydroxyl groups at positions 8 and 9 (JP2004-292315; Ono et al. 2003. Biochem Biophys Res Commun 307: 332-337).
  • 5Z-7-oxozeaenol prevents inflammation (via IL-1) (Ninomiya-Tsuji et al. 2003. J Biol chem 278: 18485-18490) and that another inhibitor NP-009245 (9-epimer-1 1, 12-dihydro (5Z) -7- oxozeaenol, 600nM, Analiticon Discovery) is a selective inhibitor of TAK1 in the pathway of IL-1 signaling in fibroblasts mouse embryonic and human embryonic kidney cells (Yao et al. 2007. J Biol Chem 282: 6075-6089).
  • peritoneal dialysis ceases to be effective and the patient it requires a change of treatment towards more invasive treatments, for example, renal transplantation.
  • the invention describes how the use of TAK1 inhibitors for the preparation of a medicament for the prevention and reversal of TEM suffered by mesothelial cells of the peritoneum during PD treatments is an effective tool for treating peritoneal membrane dysfunction that It happens due to fibrosis of the peritoneal membrane. When this dysfunction occurs, it marks the end of the period of effectiveness of peritoneal dialysis, requiring alternative methods for the treatment of the patient, such as renal transplantation. This new application is an alternative to improve the effectiveness of peritoneal dialysis treatments, much less invasive and traumatic for patients.
  • TAK1 inhibitors useful for the preparation of a medicament for prevention and treatment of peritoneal membrane failure that occurs due to peritoneal fibrosis during PD
  • several in vitro and ex vivo have been analyzed of these inhibitors.
  • epithelial and mesothelial markers Its action in morphological reversal and also in changes in the expression of epithelial and mesothelial markers has been compared both in human primary mesothelial cells in which epithelial-mesenchymal transdifferentiation has been induced, as in effluent cells of patients who have undergone dialysis peritoneal
  • the markers used in the invention have been the expression of cadherin-E as an epithelial marker as well as that of the SnaiM transcription regulator; and the expression of fibronectin and alpha-SMA (smooth muscle alpha-actin) in the case of mesothelial markers.
  • a first aspect of the invention relates to the use of a composition, hereafter referred to as the composition of the invention, which comprises an agent that inhibits the activity of TAK1 for the preparation of a medicament for the treatment of peritoneal fibrosis.
  • TGF-beta activated kinase 1 refers to an enzyme kinase that participates in the signaling cascades of TGF-beta and IL-1 among others.
  • the amino acid sequence SEQ ID NO: 1 refers to the amino acid sequence of the TAK1 protein in Homo sapiens isoform A (accession number NP_003179.1).
  • Proteins (amino acid sequences) with at least 80% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 are isoforms or amino acid sequences homologous to SEQ ID NO: 1 in Homo sapiens as well as in different animals.
  • the method of the present invention can be used for veterinary purposes in organisms, for example, but not limited to, Equus caballus, Bos taurus, Felis catus or Canis lupus familiaris.
  • the percentage of identity has been chosen according to the Blast program of the "National Center for Biotechnology Information" (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) (see Tables 1 and 2).
  • Table 1 Percent identity of isoforms of TAK1 protein in Homo sapiens. Compared to SEQ ID NO: 1.
  • Table 2 Percentage of identity of the TAK1 protein in different animal species, according to SEQ ID NO: 1.
  • Bos taurus NP_001075064.1 100 Mus musculus NP_766276.1 100
  • % identity between two amino acid sequences, as understood in the present invention, refers to the number of amino acid positions over the total length of the sequence being compared, where all amino acids in that position are identical.
  • protein of the invention refers to a protein with at least 80% identity to the amino acid sequence SEQ ID NO: 1, or to any of its fragments.
  • TAK1 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence for the TAK1 protein, and which would comprise various variants from:
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1,
  • nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a) are nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a),
  • nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 1; wherein the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of the TAK1 protein.
  • nucleic acid molecules encoding the isoforms or amino acid sequences homologous to SEQ ID NO: 1 with at least 80% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the term "inhibitor,” as used herein, primarily refers to the compound inhibiting (decreasing) the level of activity of the TAK1 enzyme in a cell.
  • the activity of TAK1 can be modulated by the modification of the levels and / or the activity of TAK1, or by the modification of the levels at which the genes encoding TAK1 are transcribed such that the levels of activity of the TAK1 protein in The cell is modulated.
  • the inhibitory agents may also be agonists (substances that are capable of binding to a receptor and eliciting a response in the cell, preferably a decrease in the activity of TAK1), as antagonists (substances that not only do not activate the receptor, but in actually blocks its activation by agonists).
  • treatment refers to any substance used for prevention, diagnosis, relief, treatment or cure of diseases in man and animals. In the context of the present invention, it refers to inhibitors of the invention that are capable of inhibiting the activity of TAK1.
  • Treatment refers to both therapeutic and prophylactic treatment or preventive measures. Those necessary for treatment include those already associated with alterations as well as those in which the alteration is prevented. An “alteration” is any condition that would benefit from treatment with the composition of the invention, as described herein.
  • peritoneal fibrosis is defined as the replacement of the peritoneum with fibrous tissue. It is characteristic in patients in peritoneal dialysis programs that show loss of dialysate efficacy of the peritoneum and repeat peritonitis.
  • a preferred embodiment refers to the use of a TAK1 activity inhibitor for the preparation of a medicament for the treatment of peritoneal fibrosis where the inhibitor is a chemical inhibitor.
  • chemical inhibitor refers to but is not limited to a compound that is an organic molecule, a cyclic ester of hydroxycarboxylic acids (lactone) or a resorcinol phenol; or that the molecule is of biological origin, that it is a toxin or that it is a mycotoxin; and that it is an acidic resorcyclic lactone (zearalenone).
  • organic molecules that can specifically bind to TAK1 without binding to other polypeptides or proteins.
  • the organic molecules will preferably have a weight of 100 to 20,000 daltons, more preferably 500 to 15,000 daltons, and more preferably 1000 to 10,000 daltons. Bookstores of organic molecules are commercially available.
  • the route of administration may be, without limitation, intraperitoneal, intrathecal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraventricular, oral, enteral, parenteral, intranasal, dermal or dialysis.
  • organic molecules modulating the activity of TAK1 are, but not limited to, the inhibitors of TAK1 NP-009245 (Analitycon Discovery) and LYTAKI inh (Eli Lilly).
  • another preferred embodiment of the invention relates to the use of the composition of the invention for the preparation of a medicament for the treatment of peritoneal fibrosis, wherein the inhibiting agent is selected from the list comprising: NP-009245 and LYTAKI inh. More preferably, the inhibitory agent is NP-009245 or any of its pharmaceutically acceptable salts.
  • the inhibitor of the composition of the invention that is used for the preparation of a medicament for the treatment of peritoneal fibrosis is an antisense oligonucleotide.
  • antisense oligonucleotides are understood ribonucleotide or deoxyribonucleotide chains that can inhibit TAK1 by one of these three mechanisms:
  • TAK1 Interfering transcription by hybridizing in the structural gene or in a regulatory region of the gene coding for TAK1. Since transcription or expression is effectively blocked by hybridization of the antisense oligonucleotide with DNA, the production of TAK1 decreases.
  • the TAK1 messenger RNA refers to a sequence encoded by the complementary DNA (cDNA) of the SEQ. ID. NO: 2 in the present invention.
  • Antisense oligonucleotides capable of modulating the activity of TAK1 are known in the state of the art. For example, and without limiting our, it could be a sequence of ribonucleotides or RNA that belongs to the so-called siRNA (small interfering RNA), small interfering RNA or silencing RNA, capable of inhibiting the genetic expression of the TAK1 protein.
  • siRNA small interfering RNA
  • small interfering RNA small interfering RNA
  • silencing RNA small interfering RNA
  • siRNA small interfering RNA or small interfering RNA
  • siRNA small interfering RNA or small interfering RNA
  • TAK1 this specific gene is TAK1.
  • the present invention includes by way of illustration, but not limited to, the known siRNAs of TAK1 published in Takaesu et al. 2003. J Mol Biol 326: 105-1 15 (corresponding to the sequence SEQ ID NO: 3), in Morioka et al. Oncogene 2009.
  • the present invention also relates to the siRNAs described in the sequences SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18 or any of the combinations between the different siRNAs.
  • the inhibiting agent is an antisense oligonucleotide.
  • the antisense oligonucleotide is a small interfering RNA (siRNA).
  • the modulating agent is an antisense oligonucleotide that is selected from the list comprising: the sequence SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 or any combination thereof.
  • siRNAs are SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18.
  • siRNA capable of hybridizing with a nucleic acid molecule encoding the human TAK1 protein of the invention. They could also be an RNA construct that contains at least any one of the possible nucleotide sequences of siRNA capable of inhibiting the expression of TAK1, and notwithstanding that any of the RNA sequences and constructs of RNA of additionally form part of the present invention. the invention described above that are subject to modifications, preferably chemical, that lead to greater stability against the action of ribonucleases and thereby greater efficiency.
  • RISC complex RNA-induced silencing complex
  • activating it and manifesting a helicase activity that separates the two strands leaving only the antisense strand associated with the complex.
  • the resulting ribonucleoproteic complex binds to the target mRNA (TAK1 messenger RNA, which is collected in SEQ ID NO: 2).
  • TAK1 messenger RNA which is collected in SEQ ID NO: 2.
  • RISC is associated with the messenger and the translation is attenuated. But if it is perfect, RISC acts as RNasa, cutting the messenger and being free to repeat the process.
  • siRNA sequences of the invention or of the RNA constructs of the invention would be evident to one skilled in the art, and could be carried out by chemical synthesis, which also allows the incorporation of chemical modifications both in the different nucleotides of the product such as the incorporation of other chemical compounds at any of the ends.
  • the synthesis could also be performed enzymatically using any of the available RNA polymerases. Enzymatic synthesis also allows some chemical modification of inhibitor products or RNAs.
  • the design of the nucleotide sequences of the siRNA of the invention would also be apparent to one skilled in the art using routine procedures without implying undue experimentation.
  • a genetic DNA construct could also be part of the composition of the invention, which would direct the in vitro or intracellular transcription of the siRNA sequence or RNA construct of the invention, and comprising at least one of the following types of sequences: a) DNA nucleotide sequence, preferably double stranded, comprising at least the sequence encoding the siRNA of the invention or the RNA construct of the invention for transcription, or, b) nucleotide sequence of DNA, preferably double stranded, corresponding to a gene expression system or vector comprising the sequence coding for the RNA sequence of the invention operably linked with at least one promoter that directs the transcription of said sequence of nucleotides of interest, and with other sequences necessary or appropriate for transcription and their appropriate regulation in time and place, for example, start and end signals, cut sites, polyadenylation signal, origin of replication, transcriptional activators (enhancers), Transcriptional silencers ⁇ silencers), etc., for use in those pathological contexts in which TAK1 is contributing to
  • compositions of the present invention allow the transfection of the siRNA of the invention into a cell, in vivo or in vitro. Transfection could be carried out, but not limited to, direct transfection or vectors that facilitate the access of siRNA into the cell.
  • vectors are, without limitation, retroviruses, lentiviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, Herpes simplex viruses, non-viral DNA plasmids, cationic liposomes and molecular conjugates.
  • the siRNAs of the present invention, as well as RNA or DNA precursors of these siRNAs can be conjugated with release peptides or other compounds to favor the transport of these siRNAs into the cell.
  • composition of the invention further comprises at least one excipient and / or at least one pharmacologically acceptable carrier.
  • Another preferred embodiment refers to said medicament which further comprises at least one other active ingredient.
  • excipient refers to a substance that aids in the absorption of the medicament of the invention comprising the TAK1 inhibitor, stabilizes said compounds or aids in the preparation of the pharmaceutical composition in the sense of giving it consistency or providing flavors. Make it more enjoyable.
  • the excipients could have the function of keeping the ingredients together such as starches, sugars or cellulose, sweetening function, dye function, drug protection function such as to isolate it from air and / or moisture, function filling a tablet, capsule or any other form of presentation such as dibasic calcium phosphate, a disintegrating function to facilitate the dissolution of the components and their absorption in the intestine, without excluding other types of excipients not mentioned in this paragraph.
  • a “pharmacologically acceptable vehicle” refers to those substances, or combination of substances, known in the pharmaceutical sector, used in the preparation of pharmaceutical forms of administration and includes, but are not limited to, solids, liquids, solvents or surfactants.
  • the carrier can be an inert substance or action analogous to any of the compounds of the present invention.
  • the function of the vehicle is to facilitate the incorporation of the expression product of the invention as well as other compounds, to allow a better dosage and administration or to give consistency and form to the pharmaceutical composition.
  • the presentation form is liquid, the vehicle is the diluent.
  • pharmaceutically acceptable refers to the compound referred to being allowed and evaluated so as not to cause damage to the organisms to which it is administered.
  • composition provided by this invention can be facilitated by any route of administration including administration in the dialysis liquid, for which said composition will be formulated in the pharmaceutical form appropriate to the route of administration chosen.
  • the agents inhibiting the activity of TAK1 of said compositions are in a therapeutically effective amount.
  • therapeutically effective amount refers to the amount of modulating agents calculated to produce the desired effect and, in general, will be determined, among other causes, by the characteristics of said agents (and constructions) and the therapeutic effect to be achieved.
  • the Pharmaceutically acceptable adjuvants and vehicles that can be used in said compositions are the vehicles known to those skilled in the art.
  • Another preferred embodiment of the present invention relates to the use of at least one product of the expression of TAK1, or any of its fragments, or of its activity as a biomarker for the determination of peritoneal fibrosis, or to determine the progression of peritoneal fibrosis in a biological sample isolated from a mammal.
  • RNA such as, but not limited to, messenger RNA (mRNA) (sequence encoded by SEQ ID NO: 2), or any of its fragments; as well as any protein or any of its fragments resulting from the expression of SEQ ID NO: 1 of the present invention or having a homology with the RNA, protein or fragments thereof of at least 50%.
  • mRNA messenger RNA
  • biomarker in the present invention refers to a molecule that has a direct connection with the risk of suffering from peritoneal fibrosis and serves to determine the disease status as well as to predict the progression of the disease.
  • the biological sample isolated from an organism may be a biological fluid or any cellular tissue of said organisms.
  • TAK1 diseases in which the alteration of the activity of TAK1 can be diagnostic, and in particular peritoneal fibrosis, can be detected by measuring the amount of nucleic acids (DNA and / or RNA and / or mRNA) that code for TAK1, or amount of TAK1 protein that is expressed, compared to normal cells (normal cells in the present invention are peritoneum cells that retain epithelial characteristics), or comparing the activity of TAK1 of the biological sample under study and normal cells.
  • nucleic acids DNA and / or RNA and / or mRNA
  • normal cells normal cells in the present invention are peritoneum cells that retain epithelial characteristics
  • oligonucleotides can be done by methods well known in the state of the art (such as, but not limited to, probes with labeled nucleotides, DNA-DNA or DNA-RNA hybridization, PCR amplification using labeled nucleotides, RT- PCR).
  • Methods for detecting TAK1 protein expression are also well known in the state of the art, such as poly or monoclonal antibodies, ELISA, radioimmunoassay (RIA), and FACS (fluorescence activated cell sorting).
  • TAK1 this can be performed by methods known in the state of the art such as the detection of phosphorylated TAK1 with a specific antibody (Kim et al. 2008.
  • a method for the diagnosis and / or prognosis of peritoneal fibrosis comprising,
  • step (a) obtain an isolated biological sample from a mammal and (b) detect and / or quantify in the sample obtained in step (a) at least one product of the expression of TAK1, any of its fragments, or its activity. That is, a method for collecting or obtaining useful data for the diagnosis and / or prognosis of peritoneal fibrosis.
  • Another preferred embodiment refers to a method of obtaining useful data for the diagnosis and / or prognosis of peritoneal fibrosis, where it also comprises comparing the data obtained in step (b) with data obtained from control samples to look for any deviation significant.
  • control samples refers, for example, but not limited to a sample obtained from an individual who has not developed peritoneal damage (healthy individual). This type of control sample is a negative control or negative control sample for peritoneal damage.
  • the term "significant deviation" as understood in the present invention refers, to the presence of the protein in the isolated sample, a higher concentration of the protein of the invention or variation of the activity thereof in the isolated sample with respect to of an isolated sample from a healthy individual, as well as the presence of a statistically significant difference between the presence or activity of the TAK1 protein between them.
  • the selection of the healthy individual is carried out by measuring the level of one or more common markers of peritoneal damage.
  • the common marker is selected from the list known to the person skilled in the art that comprises, but is not limited to, markers of structural damage such as fibrosis, angiogenesis, mesenchymal epithelial transition (by means of epithelial and mesothelial markers), inflammatory infiltration, accumulation of advanced glycosolation products (AGEs); as well as markers of functional damage obtained by peritoneal ultrafiltration test or peritoneal transport test for creatinine and urea.
  • markers of structural damage such as fibrosis, angiogenesis, mesenchymal epithelial transition (by means of epithelial and mesothelial markers), inflammatory infiltration, accumulation of advanced glycosolation products (AGEs); as well as markers of functional damage obtained by peritoneal ultrafiltration test or peritoneal transport test for creatinine and urea.
  • statically significant difference refers to the fact that there is statistical difference between the values compared, the statistical probability being at least greater than or less than 0.05 (p> 0.05 op> 0.05) and this being obtained according to the test statistic applicable to each case.
  • Another even more preferred embodiment comprises a method for determining the progression of peritoneal fibrosis comprising,
  • step (a) determining a first concentration or activity of at least one product of the expression of TAK1, or any of its fragments in a biological sample isolated from a mammal; (b) determine a second concentration or activity of said expression product of step (a) in an isolated biological sample of a mammal, and (c) comparing the second concentration or activity obtained in step (b) with the first concentration or activity obtained in step (a) to look for a significant deviation.
  • kits comprising the sequence that codes for TAK1 or a fragment thereof or the protein for which it codes for the diagnosis of peritoneal fibrosis.
  • a system for measuring the enzymatic kinase activity of TAK1 for the diagnosis of peritoneal fibrosis could also be part of the present invention, preferably by phosphorylated anti-TAK1 antibodies or by immunoprecipitation and subsequent detection of kinase activity by a TAK1 substrate , for example MKK6.
  • system for measuring activity refers to a kit comprising probes or antibodies capable of detecting the expression and / or activity of proteins that participate in the TAK1 signaling cascade and are activated or repressed by it or the components necessary to perform a TAK1 kinase activity assay.
  • polynucleotide and nucleic acid are used interchangeably herein, referring to polymeric forms of nucleotides of any length, both ribonucleotides and deoxyribonucleotides.
  • peptide refers to a polymeric form of amino acids of any length, which may be coding or non-coding, chemically or biochemically modified.
  • FIG. 1 It shows that the inhibition of TAK1 prevents TEM in primary mesothelial cells by morphological studies.
  • Assays with the TAK1 inhibitor NP-009245 (9-Epimer-1 1, 12-dihydro- (5Z) -7- Oxozeanol; 600nM, Analyticon Discovery) were performed in human primary mesothelial cells in which epithelial-mesenchymal transdifferentiation was induced by inhibition of p38 MAPK (SB203580, SB; or BIRB796 BIRB) or by TGF-beta combined with IL-1 (T / l). TAK1 inhibition was prior to transdifferentiation (one hour before).
  • the controls were cells in which TEM (NT) was not induced and cells in which the inhibitor was not used but the DMSO solvent used (DMSO) was used.
  • A confocal microscopy images of the cells in which morphology is appreciated.
  • B confocal microscopy images showing cell morphology and cytoskeleton by actin fluorescence (F-actin) and cell nuclei.
  • C the cells analyzed with the MetaMorph software.
  • D analysis of the cell morphology in which the elliptical factor (length / width) of the analyzed cells is compared.
  • FIG. 2 It shows that the inhibition of TAK1 prevents TEM in primary mesothelial cells by expression studies of the epithelial marker E-cadherin. Assays were performed with TAK1 inhibitors in human primary mesothelial cells in which epithelial-mesenchymal transdifferentiation was induced by inhibition of p38 MAPK (SB, BIRB) or by TGF-beta combined with IL-1 (T / l). Inhibition of TAK1 with NP-009245 and with a dominant negative (TAK1 D175A) was prior to transdifferentiation (TEM).
  • SB p38 MAPK
  • TGF-beta TGF-beta combined with IL-1
  • the controls were in the case of NP-009245, untreated cells with the inhibitor, but with the DMSO solvent used (DMSO); and in the case of the dominant negative, cells infected with a vector empty retroviral (empty).
  • A Western blot in which the expression of E-cadherin can be seen in the cells analyzed after inhibition of TAK1 with NP-009245 and induction of TEM with T / l.
  • B RT-PCR that shows the levels of E-cadherin messenger RNA (mRNA) expression in the cells analyzed after TAK1 inhibition with NP-009245 and TEM induction with p38 MAPK inhibitors (SB, BIRB).
  • C Western blot showing the expression of E-cadherin and TAK1 in cells infected with the dominant negative TAK1 D175A.
  • D DMSO control; S, SB and B, BIRB. Tubulin was used as load control.
  • FIG. 3 It shows that the inhibition of TAK1 prevents TEM in primary mesothelial cells by TEM performed with TGF-beta combined with IL-1 (T / l).
  • Assays were carried out with the NP-009245 inhibitor of TAK1 (TAK1 inh) in human primary mesothelial cells in which epithelial-mesenchymal transdifferentiation was subsequently induced by TGF-beta combined with IL-1 (T / l or TI).
  • the controls were untreated cells with the inhibitor, but with the DMSO solvent used (DMSO) and for the control of treatment with T / l, untreated cells (NT).
  • A RT-PCR showing the levels of E-cadherin messenger RNA (mDNA) expression (ECD) in the analyzed cells.
  • B RT-PCR showing the levels of SnaiM messenger RNA (mRNA) expression in the analyzed cells.
  • C RT-PCR showing the expression levels of messenger RNA (mRNA) of fibronectin (FN) in the analyzed cells.
  • D RT-PCR that shows the levels of messenger RNA (mRNA) expression of collagen I (Col I) in the analyzed cells.
  • E Western blot showing the expression of plasminogen activator inhibitor 1 (PAI-1) in the cells analyzed at different times; m, minutes; h, hours
  • Figure 4 Shows the phenotypic changes of the inhibition of TAK1 or MEK1 in patient effluent cells. Effluent cells from patients who have undergone peritoneal dialysis were treated with different substances and cell morphology was observed by phase contrast microscopy. A, morphology analysis of cells treated with DMSO as control negative. B, morphology analysis of cells treated with the MEK1 inhibitor CI-1040. C, analysis of the morphology of cells treated with the TAK1 inhibitor NP-009245 (TAK1 inhibitor).
  • Figure 5. Shows the expression of fibronectin, E-cadherin and vimentin after inhibition of TAK1 or MEK1 in patient effluent cells.
  • E-cadherin and fibronectin expression was analyzed in effluent cells of patients who have undergone peritoneal dialysis treated for 48 hours with 600nM of the TAK1 inhibitor NP-009245 (TAK1, TAK1 inh), or with the MEK1 CI inhibitor -1040 (MEK1) (2 micromolar) or without inhibitors but with the DMSO solvent used (DMSO, NT).
  • A Western blot analysis of the expression of the analyzed proteins, tubulin was used as load control.
  • B RT-PCR showing the expression of E-cadherin mRNA (ECD) in cells treated with the TAK1 inhibitor (TAK inh) and untreated (NT). The mean and standard deviation of samples from 4 patients are shown.
  • C Western blot analysis of the expression of N-cadherin and E-cadherin proteins.
  • D DMSO; T, TAK1 inhibitor NP-009245; Cl, MEK1 CI-1040 inhibitor; T + CI, both inhibitors.
  • Tubulin was used as load control.
  • D RT-PCR showing the expression of N-cadherin mRNA.
  • E Western blot analysis of the expression of the analyzed proteins, tubulin was used as load control.
  • FIG. 6 Shows the increase in cytokeratin expression after inhibition of TAK1 in patient effluent cells. Confocal immunofluorescence analysis of the expression and localization of the pan-cytokeratin epithelial marker in peritoneal effluent cells of patients receiving peritoneal dialysis treatment, treated and untreated with the TAK1 inhibitor NP-009245 (600nM, for 48 hours) Cells were treated with the inhibitor or with the DMSO solvent as a control (DMSO) and expression was observed by pan-cytokeratin immunofluorescence. The fluorescence of the cell nuclei is shown for the visualization of the analyzed cells (nuclei).
  • Figure 7. Shows the decrease in alpha-SMA expression after inhibition of TAK1 in patient effluent cells.
  • Figure 8 Shows the decrease in fibronectin expression after inhibition of TAK1 in patient effluent cells. Confocal immunofluorescence analysis of the expression and location of the fibronectin mesenchymal marker in peritoneal effluent cells of patients receiving peritoneal dialysis treatment, treated and untreated with the TAK1 inhibitor NP-009245 (600nM, for 48 hours). Cells were treated with the inhibitor or with the DMSO solvent as a control (DMSO) and expression was observed by fibronectin immunofluorescence. The fluorescence of the cell nuclei is shown for the visualization of the analyzed cells (nuclei).
  • Figure 9 Shows the increase in ZO-1 membrane after inhibition of TAK1 in patient effluent cells. Confocal immunofluorescence analysis of the expression and localization of the ZO-1 marker in peritoneal effluent cells of patients receiving peritoneal dialysis treatment, treated and untreated with the TAK1 inhibitor NP-009245 (600nM, for 48 hours) The cells were treated with the inhibitor or with the DMSO solvent as a control (DMSO) and expression was observed by immunofluorescence of ZO-1. The fluorescence of the cell nuclei is shown for the visualization of the analyzed cells (nuclei).
  • Figure 10 Shows the expression of fibronectin and E-cadherin after inhibition of TAK1 with specific siRNA in patient effluent cells.
  • E-cadherin and fibronectin in effluent cells from patients who have undergone peritoneal dialysis treated for 48 hours with specific siRNA for TAK1 or "scramble" siRNA was analyzed.
  • A Western blot analysis of the expression of the analyzed protein, tubulin was used as load control.
  • B RT-PCR showing the expression of E-cadherin mRNA in cells treated with siRNA specific for TAK1 or siRNA "scramble". The mean and standard deviation of samples from 4 patients are shown.
  • FIG. 11 It shows that the inhibition of TAK1 reduces the invasion of effluent cells from patients in type I collagen gels.
  • the invasion of pretreated cells was analyzed with the NP-009245 (600 nanomolar) inhibitor (TAK1-I), with the MEK1 inhibitor (Cl 1040) (2 micromolar), with the two inhibitors together (T + C) or with DMSO by an invasion test on type I collagen.
  • TAK1-I 600 nanomolar
  • MEK1 inhibitor Cl 1040
  • EXAMPLE 1 Inhibition of TAK1 prevents TEM in primary mesothelial cells.
  • human primary mesothelial cells derived from the omentum were used from patients who underwent abdominal surgery previously treated with TAK1 inhibitors and in whom transdifferentiation (TEM) was subsequently induced.
  • the TAK1 inhibitors used were NP-009245 and a dominant negative TAK1 D175A.
  • TAKD175A comprises the fragment of the TAK1 SEQ NO: 1 protein that comprises amino acids from 2 to 549 but with a D175A mutation that inactivates the TAK1 kinase activity by replacing the position aspartic amino acid 175 for alanine.
  • the dominant negative TAK1 D175A used in the invention also contains markers for the selection of the recombinants and markers for the detection of the recombinant protein (myc) and was introduced into the cells by infection with a retrovirus.
  • Transdifferentiation was induced by 24-hour treatment with p38 MAPK inhibitors (SB203580 10 micromolar, SB; or BIRB796 250 nanomolar, BIRB) or with TGF-beta combined with IL-1 (T / l) (TGF-beta 0.5 ng / ml and IL-1 2 ng / ml).
  • TAK1 inhibitors prevents TEM in said cells both at the morphological level (Fig. 1) and at the level of messenger and protein RNA expression (Fig. 2 and 3).
  • fibrosis is characterized by the production of collagen and fibronectin fibers
  • the expression of both mRNA in omento mesothelial cells was evaluated after T / l stimulation and it was observed that inhibition of TAK1 with NP-009245 prior to TEM prevents the expression of collagen I and fibronectin mRNA in said cells (Fig. 3C and 3D).
  • PAI-1 plasminogen activator inhibitor 1
  • plasminogen activator inhibitor-1 plasminogen activator inhibitor 1
  • the results show that TAK1 inhibition prevents the expression of PAI-1 in primary mesothelial cells stimulated with TGF-beta combined with IL-1 (Fig. 3E).
  • EXAMPLE 2 Comparison of the inhibition of TAK1 and MEK1 in patient effluent cells.
  • TAK1 inhibitors for the treatment and prevention of peritoneal fibrosis, the inhibition of TAK1 was compared with the inhibition of another molecule involved in peritoneal fibrosis already known MEK1 in effluent cells of patients who had suffered peritoneal dialysis.
  • the inhibition of TAK1 (with NP-009245) produces a stronger reversal than the inhibition of MEK1 (with CI-1040).
  • This reversal has been demonstrated in effluent cells of patients who have undergone peritoneal dialysis through morphological studies in which it is observed that the inhibition of TAK1 causes a greater reversal towards an epithelial phenotype by generating less long and wider cells than in those have treated with the MEK1 inhibitor (Fig. 4).
  • EXAMPLE 3 Expression and localization of epithelial and mesenchymal markers after inhibition of TAK1 in patient effluent cells.
  • confocal microscopy was used in treated and untreated cells with the TAK1 inhibitor NP-009245. After a 48-hour treatment with this inhibitor an increase in the pan-cytokeratin epithelial marker was observed (Fig. 6), a decrease in smooth muscle actin alpha (alpha smooth S actin) alpha-SMA mesenchymal markers (Fig. 7) and fibronectin (Fig. 8) in these cells, as well as increased expression membrane marker "zone ocludens 1"("tight junction protein 1", ZO-1) (Fig. 9).
  • EXAMPLE 4 Inhibition of TAK1 by siRNA in effluent cells of patients.
  • TAK1 causes the increase and relocation of epithelial markers (E-cadherin, cytokeratin, ZO-1) and the decrease in mesenchymal markers associated with TEM and fibrosis in mesothelial cells (N-cadherin, fibronectin, collagen, vimentin, PAI-1).
  • the inhibition of TAK1 can be carried out both with the use of chemical inhibitors and with the use of siRNA.
  • EXAMPLE 5 Invasion test. In order to analyze whether the inhibition of TAK1 can control functional events related to TEM and fibrosis, the invasion of mesothelial cells through type I collagen gels was analyzed. It has been demonstrated that during cells peritoneal dialysis Mesothelial can invade the submesothelial stroma and may have a role in the establishment of peritoneal fibrosis. The action of inhibition of TA 1 and MEK1 was compared separately and together. As seen in Figure 1 1, the invasion of the cells was reduced in cells pre-treated with the NP-009245 inhibitor, as well as in cells treated with the MEK1 inhibitor.
  • the cells were cultured in the same way and after 10-15 days the cultures reached confluence after which a passage was made at a 1: 2 ratio.
  • the morphological characteristics of the cells in confluent cultures were compared and remained stable for two or three passages.
  • the purity of the omentum and mesothelial cells derived from effluent from patients was determined using the expression of standard mesothelial markers, the adhesion molecule ICAM-1 intercellular and cytokeratins.
  • Mesothelial cells expressed high levels of ICAM-1 and low levels of specific S100 fibroblast marker, thus allowing them to be easily distinguished from peritoneal fibroblasts.
  • Mesothelial cell cultures were also negative for the CD31 endothelial marker and the CD45 macrophage marker.
  • highly purified cell populations were generally obtained with only less than 5% of contaminating cells after determination with FACS analysis. Samples that had more than 5% of contaminating cells were discarded.
  • the cells were treated with the NP-009245 inhibitor (600nM) or with a retroviral vector encoding a negative dominant of TAK1 (TAK1 D175A) or with the siRNA.
  • TAK1 D175A a negative dominant of TAK1
  • siRNA siRNA
  • p38 SB203580 10 ⁇
  • BIRB 796 250 nM
  • MEK1 2 micromolar was used for 48 hours.
  • DMSO or infection with an empty retroviral vector was used. Infection with the dominant negative TAK1 D175A.
  • TAKD175A comprises the fragment of the TAK1 SEQ NO: 1 protein comprising amino acids 2 to 549, but with a D175A mutation that inactivates the TAK1 kinase activity by replacing the aspartic amino acid of position 175 with an alanine
  • the plasmid containing TAK1 D175A used in the invention is pCMV5 containing markers for the selection of recombinants and markers for the detection of recombinant protein (myc). Infection with the retrovirus containing the negative dominant was performed in the same manner as described in Strippoli et al. 2008. Dis Mod Mech 1: 264-274 for the retrovirus pRV-IRES-CopGreen (Genetrix).
  • omento mesothelial primary cells are seeded 24 hours before infection in 6-well plates (2x10 5 cells per well).
  • the supernatant (previously filtered) of the retrovirus producing cells (293T cells) was added to the mesothelial cells to which the supernatant had previously been removed. This process was repeated twice in 24-hour intervals. 24 hours after the last exposure to retroviruses, the infection efficiency was monitored by fluorescence microscopy (Cari Zeiss Symphony Gottingen) or FACs analysis (Becton Dickinson Laboratories). Inhibition of TAK1 with siRNA.
  • TAK1 was silenced using the "on target plus smart pool kit, Human MAP3K7" (L-003790-00-0005) (Dharmacon, Lafayette, CO). Briefly, 120000 cells were transfected with said "on target plus smart pool siRNA” (100 nanomolar). Transfections were performed by incubation for 16 hours with a mixture of siRNA and Dharmafect 1 (Dharmacon, Lafayette, CO) in antibiotic-free medium, according to the manufacturer's procedures. The treatment was repeated again after 48 hours, incubating with siRNA for 8 hours. The cells were analyzed 72 hours after the second transfection.
  • the siRNAs used in the example of the invention are SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18.
  • Epithelial-mesenchymal transdifferentiation of human mesothelial cells Human primary mesothelial cells were treated with p38 MAPK inhibitors, SB203580 (10 ⁇ ) or BIRB 796 (250 nM) and / or with TGF-beta (0.5 ng / ml) in combination with IL-1-beta (2 ng / ml) (T / l) for 24 hours. Before induction of the epithelial-mesenchymal transition, human primary mesothelial cells were treated with TAK1 inhibitors or with DMSO for 1 hour before treatment with p38 and / or T / l inhibitors.
  • Morphological analysis of cells in culture After the treatment of the cells, they were observed under phase contrast microscopy to determine their morphology.
  • the statistical analysis of the epithelial phenotype was performed using MetaMorph software in which the variation of the elliptical factor (elongation / width) of the cells is quantified. Western blot analysis.
  • mesothelial cell monolayers were lysed in a modified RIPA buffer whose composition was: 50mM Tris-HCI; pH 7.4; 1% NP-40; 0.1% SDS; 0.25% Nadeoxycolato; 150mM NaCI; 1 mM EDTA; 1 mM EGTA; 1 mM PMSF; 1 g / ml aprotinin, leupeptin and pepstatin; and 25mM of NaF (All the listed compounds of the SIGMA house). Similar amounts of protein lysate were resolved with SDS-PAGE.
  • the proteins were transferred to nitrocellulose membranes (Amersham Life Sciences, Little Chalfont, UK) and incubated with antibodies, following the supplier's instructions. Antibodies adhered to the nitrocellulose membrane were revealed with chemiluminescence by using ECL using the antibodies described below (Enhanced ChemiLuminescence) (Amersham Life Sciences, Little Chalfont, UK).
  • the antibodies used were the following: anti-cadherin-E (1: 1000, mouse monoclonal Becton-Dickinson Laboratories), anti-fibronectin (1: 500, polyclonal rabbit Sigma) and anti-TAK1 (1: 1000, polyclonal rabbit Cell Signaling), anti-PAI-1 (1: 500, mouse monoclonal Santa Cruz ), anti-N-cadherin (1: 1000 from Zymed) and anti-vimentin (1: 2000, mouse monoclonal from Sigma).
  • Tubulin detection was used as a load control (1: 2500, Sigma mouse monoclonal).
  • RT-PCR Polymerase chain reaction in real time
  • mRNA expression was determined by amplifying from the total RNA by means of quantitative RT-PCR according to the method known in the state of the art. Briefly, the total RNA was extracted with the RNeasy Kit (Qiagen GmbH), and the cDNA was obtained from 500ng of total RNA using the Omniscript RT Kit (Qiagen).
  • Quantitative PCR was performed with the LightCycler® system (Roche Diagnostics GmbH) using the SYBR Green Kit (Roche Diagnostics GmbH) using the specific primers collected in the following sequences: SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7 for E-cadherin ; SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9 for SnaiM; SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 1 1 for Collagen I; SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13 for Fibronecitna; SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15 for histone H3, used as a control and SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20 for N-cadherin.
  • the banding temperature for the amplification of E-cadherin and histone H3 was 62 ° C, while it was 64 ° C and 66 ° C for the amplification of collagen I and fibronectin respectively. Fluorescence was measured at the end of each elongation cycle. For SnaiM amplification, the annealing temperature was 55 ° C and the fluorescence was measured at 88 ° C for all cases except for fibronectin that was at 72 ° C after each elongation cycle. All experiments were executed in duplicate. The PCR products were contrasted with an analysis of the melting curve and an electrophoresis gel.
  • Immuno-fluorescence and confocal microscopy was performed according to the method known in the state of the art and following the instructions of the manufacturers of the corresponding antibodies and fluorophores.
  • the expression of alpha-SMA, fibronectin and pan-cytokeratin (cytokeratin) was visualized in the effluent cells of patients treated with the NP-009245 inhibitor for 48 hours by immunocytochemistry.
  • the following antibodies were used: anti-alpha-SMA (1: 100 obtained in mouse, Sigma); and anti-fibronectin (1: 100, obtained in rabbit, Sigma), pan-cytokeratin (1: 100 obtained in mouse, Sigma) and anti-ZO-1 (1: 100, rabbit polyclonal from Zymed) .
  • the invasion test was performed with polycarbonate inserts with pores 8 ⁇ in size (Costar, Cambridge, MA).
  • the inserts were precoated with 40 ⁇ solution type I collagen (300 .mu.g ml) (PureCol, Inamed, Fremont, Canada) and incubated overnight at 37 0 C to allow gel formation.
  • the mesothelial cells were pre-treated with DMSO, NP-009 245 (600 nm) or CI-1040 (2 ⁇ M) for 24 hours in 10% fetal bovine serum (FBS) in M 199 medium. 5x10 4 mesothelial cells in 100 ⁇ of assay medium (M-199 0% FBS) was added to the upper chamber.
  • the invasion stimulus (10% FBS) was introduced into the lower chamber in 600 ⁇ I of 199 medium.
  • Mesothelial cells invaded the gel for 24 hours.
  • the inserts were fixed with 4% paraformaldehyde and the cells that did not invade on the upper face of the membrane were removed with a cotton swab, the filters were cut and the nuclei of the invading cells were stained with Hoechst 33342.
  • the invading cells they were counted in ten fields per sample using a fluorescence microscope (40x magnification). Each experiment was carried out in two copies, and at least 5 experiments were performed.

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Abstract

La presente invención se refiere al uso de inhibidores de TAK1 para la preparación de un medicamento para la prevención y tratamiento del fracaso de la membrana peritoneal. Donde dicho uso previene y revierte la transición epitelio mesénquima que sufren las células mesoteliales del peritoneo durante el tratamiento de diálisis peritoneal. También, al uso de un producto de expresión de TAK1 o de su actividad como biomarcador para la determinación de fibrosis peritoneal. Al método de obtención de datos útiles en el diagnóstico y/o pronóstico de la fibrosis peritoneal; un método para predecir la progresión de la fibrosis peritoneal. Así como el uso de un kit que comprende la secuencia que codifica para TAK1 o la proteína para el diagnóstico de la fibrosis peritoneal.

Description

USO DE INHIBIDORES DE TAK1 EN LA PREVENCIÓN Y TRATAMIENTO DEL FRACASO DE LA MEMBRANA PERITONEAL.
La presente invención se refiere al uso de inhibidores de TAK1 para la preparación de un medicamento para la prevención y tratamiento del fracaso de la membrana peritoneal. Dicho uso previene y revierte la transición epitelio mesénquima que sufren las células mesoteliales del peritoneo durante el tratamiento de diálisis peritoneal. Este uso permite tratar y revertir el proceso fibrótico que sucede en la membrana peritoneal durante la diálisis peritoneal y, por tanto, es útil para la prevención del fracaso de la membrana peritoneal en pacientes con insuficiencia renal.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR La diálisis peritoneal (DP) es una alternativa a la hemodiálisis para el tratamiento de la insuficiencia renal en estadio terminal que se suele aplicar de forma ambulatoria. La diálisis peritoneal se basa en la capacidad de las células mesoteliales del peritoneo de actuar como barrera de permeabilidad. Estas células mesoteliales forman una monocapa que posee características de células epiteliales y que además de su capacidad de barrera filtrante, secretan diversas sustancias implicadas en la homeostasis y en la defensa inmune local. La exposición reiterada a las soluciones de diálisis que son ácidas, hiperosmóticas e hiperglicémicas, produce una inflamación crónica de bajo grado y un daño al peritoneo que se traduce en una progresiva denudación de las células mesoteliales y que degenera en fibrosis (opacificación peritoneal, síndrome del peritoneo bronceado, fibrosis mural y síndrome de peritonitis esclerosante) y vascularización tisular. Se ha descubierto que las células mesoteliales sufren transición epitelio-mesénquima durante el curso de la DP, perdiendo expresión de marcadores epiteliales como cadherina-E y participando activamente en la fibrosis tisular. Estos cambios parecen ser la causa principal del fracaso de ultrafiltración de la membrana peritoneal que afecta al 20% de los pacientes en diálisis peritoneal (Selgas et al. 2004. Nefrología 24:34-39).
La transición epitelio-mesénquima (o transdiferenciación, TEM) es un proceso complejo y generalmente reversible que se caracteriza por la pérdida de las características epiteliales (pérdida de moléculas de adhesión, reorganización del citoesqueleto) y transformación en células fibroblásticas (adquiriendo marcadores mesenquimales) con características migratorias, invasivas y fibrogénicas que sucede en respuesta a inducción con TGF-beta (factor de crecimiento transformante-beta) (Thiery et al. 2006. Nature Rev 7: 131 -142; Xu et al. 2009. Cell Res 19: 156-172). La TEM se ha descrito como proceso fundamental en la progresión tumoral, en la patología en diversos órganos como pulmón, hígado y riñon; y en el peritoneo de pacientes sometidos a diálisis peritoneal (Selgas et al. 2004. Nefrología 24:34-39). Se ha demostrado tanto in vivo como ex vivo (con células mesoteliales de efluente de pacientes) que las células mesoteliales de pacientes sometidos a DP sufren transición epitelio-mesénquima (Yañez-Mó et al. 2003. N Engl J Med 348:403-413). Para la regulación y detención de la TEM en pacientes sometidos a DP, se ha sugerido la utilización de proteína morfogénica ósea-7 (BMP-7) (Wang et al. 2003. Kidney Int 63:2037-2049), un anticuerpo bloqueante del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) (Amari et al. 2002. Med Electron Microsc 35:225-233) y mediante inhibición de MEK1/2 (Strippoli et al. 2008. Dis Mol Mech 1 :264-274), pero en la actualidad no existe ningún tratamiento del fracaso de la fibrosis peritoneal.
La quinasa 1 activada por TGF-beta (TAK1 ) es una quinasa involucrada en la ruta de señalización de TGF-beta (vía p38 MAPK) y de IL-1 (interleuquina-1 ). (Delaney et al. 2006. Cell Cycle 5:2852-2855; Ono et al. 2003. Biochem Biophys Res Commun 307:332-337; Yao et al. 2007. J Biol Chem 282:6075- 6089). En relación a fibrosis, en líneas celulares de fibrosarcoma humano y células mesangiales de glomérulo de riñon de ratón, se ha visto que la inhibición competitiva con un dominante negativo de TAK1 (utilizando el dominio de unión a la proteína 1 de unión a TAK1 , TAB1 ) induce una disminución de las respuestas fibróticas al disminuir la producción y acumulación de matriz extracelular en estas células (Ono et al. 2003. Biochem Biophys Res Commun 307:332-337). En relación a otros inhibidores, la inhibición de TAK1 se ha sugerido para diversas enfermedades (US20040198750) y en el caso de fibrosis se ha sugerido su uso, pero sin aportar datos experimentales, para el tratamiento y prevención de procesos en los que están involucrados TGF-beta e IL-1 , concretamente en el caso de inhibidores que son lactonas resorcíclicas de origen fúngico (Zearalenonas) que tienen grupos hidroxilo en las posiciones 8 y 9 (JP2004-292315; Ono et al. 2003. Biochem Biophys Res Commun 307:332-337). Además, se ha visto que el uso de uno de estos inhibidores en concreto, el 5Z-7-oxozeaenol, previene la inflamación (vía IL-1 ) (Ninomiya-Tsuji et al. 2003. J Biol chem 278:18485- 18490) y que otro inhibidor el NP-009245 (9-epimer-1 1 ,12-dihydro(5Z)-7- oxozeaenol, 600nM, Analiticon Discovery) es un inhibidor selectivo de TAK1 en el camino de señalización de la IL-1 en fibroblastos embrionarios de ratón y células embrionarias humanas de riñon (Yao et al. 2007. J Biol Chem 282:6075-6089). Dado que en la actualidad no existe ningún tratamiento del fracaso de la membrana peritoneal por fibrosis peritoneal basado en la reversión y tratamiento de la TEM, una vez que la disfunción de la membrana peritoneal se produce, la diálisis peritoneal deja de ser efectiva y el paciente requiere un cambio de tratamiento hacia tratamientos más invasivos, por ejemplo, el transplante renal.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
La invención describe cómo el uso de inhibidores de TAK1 para la elaboración de un medicamento para la prevención y reversión de la TEM que sufren las células mesoteliales del peritoneo durante tratamientos de DP es una herramienta eficaz para tratar la disfunción de la membrana peritoneal que sucede por fibrosis de la membrana peritoneal. Cuando esta disfunción se produce, marca el final del periodo de efectividad de la diálisis peritoneal, requiriéndose métodos alternativos para el tratamiento del paciente, tales como el transplante renal. Esta nueva aplicación es una alternativa para mejorar la efectividad de los tratamientos de diálisis peritoneal, mucho menos invasivos y traumáticos para los pacientes.
Con el fin de investigar cuales son los inhibidores de TAK1 útiles para la elaboración de un medicamento para prevención y tratamiento del fracaso de la membrana peritoneal que sucede por fibrosis peritoneal durante la DP, en la presente invención se han analizado in vitro y ex vivo varios de estos inhibidores. Se ha comparado su acción en la reversión morfológica y también en los cambios en la expresión de marcadores epiteliales y mesoteliales tanto en células mesoteliales primarias humanas en las que se ha inducido transdiferenciación epitelio-mesénquima, como en células de efluente de pacientes que han sufrido diálisis peritoneal. Los marcadores utilizados en la invención han sido la expresión de cadherina-E como marcador epitelial así como la del regulador de su transcripción SnaiM ; y la expresión de fibronectina y alfa-SMA (alfa-actina de músculo liso) en el caso de los marcadores mesoteliales. Además, en la presente invención se ha comparado la inhibición de TAK1 con la inhibición de otra proteína implicada en TEM y fibrosis, MEK1 (MAP kinasa kinasa 1) demostrándose una mayor reversión de la TEM en el caso de la inhibición de TAK1 con respecto a la inhibición de MEK1 . Así, un primer aspecto de la invención se refiere al uso de una composición, de ahora en adelante composición de la invención, que comprende un agente inhibidor de la actividad de TAK1 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de la fibrosis peritoneal. El término "TAK1 ", también llamado en la literatura "TGF-beta activated kinase 1", "transforming growth factor-beta-activated kinase 1 ", "TGF-beta-activated kinase 1 "; "MAP3K7"; "mitogen-activated protein kinase kinase kinase 7"; "MEKK7"; "EC 2.7.1 1 .25; OTTHUMP00000016870; OTTHUMP00000016871 ; OTTHUMP00000016872; OTTHUMP00000016873, se refiere a una enzima quinasa que participa en las cascadas de señalización de TGF-beta e IL-1 entre otras. La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 se refiere a la secuencia de aminoácidos de la proteína TAK1 en Homo sapiens isoforma A (número de acceso NP_003179.1 ).
Las proteínas (secuencias de aminoácidos) con al menos un 80% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 son isoformas o secuencias de aminoácidos homologas a la SEQ ID NO: 1 en Homo sapiens así como en diferentes animales. El método de la presente invención puede ser utilizado con fines veterinarios en organismos, por ejemplo, pero sin limitarse a, Equus caballus, Bos taurus, Felis catus or Canis lupus familiaris. El porcentaje de identidad se ha elegido de acuerdo con el programa Blast del "National Center for Biotechnology Information" (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) (ver Tablas 1 y 2).
Tabla 1 . Porcentaje de identidad de isoformas de la proteína TAK1 en Homo sapiens. Comparadas con SEQ ID NO: 1 .
Figure imgf000006_0001
Tabla 2. Porcentaje de identidad de la proteína TAK1 en diferentes especies animales especio a la SEQ ID NO: 1 .
Especie N° Acceso % Identidad
Sus scrofa ABY81296.1 100
Bos taurus NP_001075064.1 100 Mus musculus NP_766276.1 100
Rattus norvegicus NP_001101390.2 97
Xenopus laevi NP_001084359.1 98
Pongo abelii NP_001124617.1 97
Darío rerío AAT07829.1 98
Salmo salmar ACN10470.1 97
Saccoglossus kowalevskii NP_001161668 96
El término "% de identidad" entre dos secuencias de aminoácidos, tal como se entiende en la presente invención, se refiere al número de posiciones aminoacídicas sobre la longitud total de la secuencia que se compara, donde todos los aminoácidos en esa posición son idénticos.
Por lo tanto, en la presente invención el término "proteína de la invención" se refiere a una proteína con al menos el 80% de identidad a la secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 1 , o a cualquiera de sus fragmentos.
En el contexto de la presente invención, TAK1 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótidos, que constituye la secuencia codificante de la proteína TAK1 , y que comprendería diversas variantes procedentes de:
a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 1 ,
b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a),
c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,
d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 1 ; en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína TAK1 . e) moléculas de ácido nucleico que codifican para las isoformas o secuencias de aminoácidos homologas a la SEQ ID NO: 1 con al menos un 80% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 . El término "inhibidor", como se usa aquí, se refiere principalmente a que el compuesto inhibe (disminuye) el nivel de actividad de la enzima TAK1 en una célula. La actividad de TAK1 puede ser modulada por la modificación de los niveles y/o de la actividad de TAK1 , o por la modificación de los niveles a los que se transcriben los genes que codifican TAK1 tal que los niveles de actividad de la proteína TAK1 en la célula es modulada. Los agentes inhibidores pueden ser también agonistas (sustancias que son capaces de unirse a un receptor y provocar una respuesta en la célula, preferiblemente una disminución de la actividad de TAK1 ), como antagonistas (sustancias que no solamente no activan el receptor, sino que en realidad bloquea su activación por los agonistas).
El término "medicamento", tal y como se usa en esta memoria, hace referencia a cualquier sustancia usada para prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de enfermedades en el hombre y los animales. En el contexto de la presente invención se refiere, a los inhibidores de la invención que son capaces de inhibir la actividad de TAK1 .
"Tratamiento" se refiere a tanto el tratamiento terapéutico como el profiláctico o medidas preventivas. Aquellas necesarias de tratamiento incluyen las ya asociadas con alteraciones así como en aquellas en las que se previene la alteración. Una "alteración" es cualquier condición que se beneficiaría del tratamiento con la composición de la invención, tal y como se describe en el presente documento. En esta memoria se define como "fibrosis peritoneal" a la sustitución del peritoneo por tejido fibroso. Es característico en pacientes en programas de diálisis peritoneal que presentan pérdida de la eficacia dializante del peritoneo y peritonitis de repetición. Tiene un carácter progresivo y se distinguen cuatro síndromes: 1 ) opacificación y pérdida del brillo; 2) peritoneo bronceado con ausencia de mesotelio y presencia de colágeno hialinizado; 3) fibrosis mural con manifestaciones clínicas; 4) peritonitis esclerosante encapsulante, con intensa fibrosis periintestinal que impide su normal funcionamiento.
Una realización preferida se refiere al uso de un agente inhibidor de la actividad de TAK1 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de la fibrosis peritoneal donde el inhibidor es un inhibidor químico.
El término "inhibidor químico" se refiere pero no se limita a un compuesto que sea una molécula orgánica, un éster cíclico de ácidos hidroxicarboxílicos (lactona) o un fenol resorcinol; o bien que la molécula sea de origen biológico, que sea una toxina o que sea una micotoxina; y que sea una lactona resorcíclica ácida (zearalenona).
Un experto en la materia podría preparar inhibidores a partir de moléculas orgánicas que pueden unirse específicamente a la TAK1 sin unirse a otros polipéptidos o proteínas. Las moléculas orgánicas tendrán preferiblemente un peso de 100 a 20.000 daltons, más preferiblemente 500 a 15.000 daltons, y más preferiblemente 1000 a 10.000 daltons. Librerías de moléculas orgánicas se encuentran disponibles comercialmente. La vía de administración puede ser, sin limitarse a éstas, intraperitoneal, intratecal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraventricular, oral, enteral, parenteral, intranasal, dérmica o por diálisis. Entre las moléculas orgánicas moduladoras de la actividad de TAK1 se encuentran, pero sin limitarnos, los inhibidores de TAK1 NP-009245 (Analitycon Discovery) y LYTAKI inh (Eli Lilly). Por tanto, otra realización preferida de la invención se refiere al uso de la composición de la invención para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de la fibrosis peritoneal, donde el agente inhibidor se selecciona de la lista que comprende: NP-009245 y LYTAKI inh. Más preferiblemente, el agente inhibidor es NP-009245 o cualquiera de sus sales farmacéuticamente aceptables. En otra realización preferida el inhibidor de la composición de la invención que se usa para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de la fibrosis peritoneal es un oligonucleótido antisentido. Por "oligonucleótidos antisentido" se entienden cadenas de ribonucleótidos o desoxirribonucleóitidos que pueden inhibir TAK1 por uno de estos tres mecanismos:
1 - Interfiriendo la transcripción, al hibridar en el gen estructural o en una región regulatoria del gen que codifica para TAK1 . Puesto que la transcripción o expresión es bloqueada de manera efectiva por la hibridación del oligonucleótido antisentido con el ADN, disminuye la producción de TAK1 .
2- La unión del oligonucleótido antisentido en el citoplasma con el mRNA, interfiriendo con la formación de la construcción de traducción propiamente dicha, inhibiendo la traducción de RNA mensajero (mRNA) a la proteína.
3- La formación de un mRNA - antisentido dúplex que permite una rápida degradación del mRNA dúplex por ARNasas (como ARNasa H). Esto da lugar a una menor producción de TAK1 .
El RNA mensajero de TAK1 se refiere a una secuencia codificada por el DNA complementario (cDNA) de la SEQ. ID. NO: 2 en la presente invención.
Oligonucleótidos antisentido capaces de modular la actividad de TAK1 son conocidas en el estado de la técnica. Por ejemplo, y sin limitarnos, podría ser una secuencia de ribonucleótidos o ARN que pertenece al denominado siRNA (small interfering RNA), ARN pequeño de interferencia o ARN de silenciamiento, capaz de inhibir la expresión genética de la proteína TAK1 . En el contexto de la presente memoria se entiende como "siRNA" (small interfering RNA o ARN pequeño de interferencia) una clase de ARN de doble cadena de 18 a 25 nucleótidos de largo, y más preferentemente entre 18 y 23 nucleótidos, que está involucrado en la ruta de la interferencia de ARN, donde el siRNA interfiere la expresión de un gen específico. En la presente invención, este gen específico es el TAK1 . Así, la presente invención incluye a título ilustrativo, pero sin limitarse, los siRNA conocidos de TAK1 publicados en Takaesu et al. 2003. J Mol Biol 326: 105-1 15 (que corresponden a la secuencia SEQ ID NO: 3), en Morioka et al. Oncogene 2009. 28:2257-65 (que corresponden a la secuencia SEQ ID NO: 4) y en Blonska et al. J Biol Chem 2005. 280:43056-63 (que corresponden a la secuencia SEQ ID NO: 5). La presente invención también se refiere a los siRNA que se describen en las secuencias SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 o cualquiera de las combinaciones entre los distintos siRNA.
Por tanto, en otra realización preferida del primer aspecto de la invención el agente inhibidor es un oligonucleótido antisentido. Una realización más preferida se refiere al uso donde el oligonucleótido antisentido es un ARN pequeño de interferencia (siRNA). Por tanto, en otra realización preferida el agente modulador es un oligonucleótido antisentido que se selecciona de la lista que comprende: la secuencia SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 o cualquiera de sus combinaciones. Una realización aún más preferida la invención se refiere al uso donde los siRNA son SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18.
También podría ser cualquier siRNA capaz de hibridar con una molécula de ácido nucleico que codifique para la proteína TAK1 humana de la invención. También podrían ser una construcción de ARN que al menos contenga una cualquiera de las secuencias de nucleótidos posibles de siRNA capaces de inhibir la expresión de TAK1 , y sin perjuicio de que adicionalmente formen parte de la presente invención cualquiera de las secuencias y construcciones de RNA de la invención anteriormente descritas que sean objeto de modificaciones, preferentemente químicas, que conduzcan a una mayor estabilidad frente a la acción de ribonucleasas y con ello a una mayor eficiencia. Sin que dichas modificaciones supongan la alteración de su mecanismo de acción, que es la unión específica al complejo RISC (RNA- induced silencing complex), activándolo y manifestando una actividad helicasa que separa las dos hebras dejando solo la hebra antisentido asociada al complejo. El complejo ribonucleoprotéico resultante se une al mRNA diana (ARN mensajero de TAK1 , que se recoge en las SEQ ID NO: 2). Si la complementariedad no es perfecta, RISC queda asociado al mensajero y se atenúa la traducción. Pero si es perfecta, RISC actúa como RNasa, cortando al mensajero y quedando libre para repetir el proceso. Recientemente, con el desarrollo de la tecnología antisentido, secuencias de nucleótidos específicamente complementarios a una determinada secuencia de ADN o ARN, podrían formar complejos y bloquear la transcripción o traducción. Así, con el progreso del silenciamiento génico post-transcripcional, y en particular del ARN de interferencia (RNA interferente o RNAi), se han desarrollado herramientas que permiten la inhibición específica de la expresión de un gen. La inhibición de la expresión de las proteínas TAK1 constituiría por ende la inhibición de su actividad biológica, y en concreto, de la actividad que está contribuyendo a la fibrosis peritoneal que se produce como consecuencia de la diálisis peritoneal.
Adicionalmente resulta evidente para un experto en la materia que una gran cantidad de polinucleótidos de mRNA pueden traducirse a TAK1 como consecuencia, por ejemplo, de que el código genético es degenerado. Cualquier siRNA capaz de inhibir la traducción de estos mRNA también forman parte de la invención.
La preparación de las secuencias de siRNA de la invención o de las construcciones de RNA de la invención sería evidente para un experto en la materia, y se podría llevar a cabo por síntesis química, lo cual permite además la incorporación de modificaciones químicas tanto en los distintos nucleótidos del producto como la incorporación de otros compuestos químicos en cualquiera de los extremos. Por otro lado, la síntesis también podría realizarse enzimáticamente utilizando cualquiera de las RNA polimerasas disponibles. La síntesis enzimática también permite alguna modificación química de los productos o RNAs inhibidores. El diseño de las secuencias de nucleótidos del siRNA de la invención también sería evidente para un experto en la materia usando procedimientos rutinarios sin que ello suponga experimentación indebida. Es claro para un experto en la materia que si éste está en disposición de la secuencia de la proteína particular (TAK1 ), también puede estar en posesión de cualquier siRNA del mismo. Así, se podría realizar mediante un diseño aleatorio en el que se seleccionen 18-25 bases del mRNA diana sin tener en cuenta la secuencia o la información posicional que tiene en el transcrito. Otra alternativa no limitativa de la presente invención sería el diseño convencional mediante parámetros simples desarrollados por los pioneros de la técnica (Calipel et al. 2003. J Biol Chem. 278:42409-42418) completados con un análisis BLAST de nucleótidos. Otra posibilidad podría ser un diseño racional, en el que se emplee un procedimiento informático dirigido a identificar las dianas óptimas de siRNA en un mRNA. Las secuencias diana se analizan en grupos de 18 nucleótidos a la vez y se identifican las que tienen mejores características en función de un algoritmo que incorpora un gran número de parámetros termodinámicos y de secuencia.
También podría formar parte de la composición de la invención una construcción genética de ADN, la cual dirigiría la transcripción in vitro o intracelular de la secuencia siRNA o construcción de ARN de la invención, y que comprende, al menos, uno de los siguientes tipos de secuencias: a) secuencia de nucleótidos de ADN, preferentemente de doble cadena, que comprende, al menos, la secuencia codificante del siRNA de la invención o de la construcción de ARN de la invención para su transcripción, o, b) secuencia de nucleótidos de ADN, preferentemente de doble cadena, correspondiente a un sistema o vector de expresión génica que comprende la secuencia codificante de la secuencia de ARN de la invención operativamente enlazada con, al menos, un promotor que dirija la transcripción de dicha secuencia de nucleótidos de interés, y con otras secuencias necesarias o apropiadas para la transcripción y su regulación adecuada en tiempo y lugar, por ejemplo, señales de inicio y terminación, sitios de corte, señal de poliadenilación, origen de replicación, activadores transcripcionales (enhancers), silenciadores transcripcionales {silencers), etc, para su uso en aquellos contextos patológicos en los que TAK1 está contribuyendo a la fibrosis peritoneal (opacificación peritoneal, síndrome del peritoneo bronceado, fibrosis mural y síndrome de peritonitis esclerosante), angiogénesis y vasculopatía hialinizante que se produce como consecuencia de la diálisis peritoneal. Múltiples de estas construcciones, sistemas o vectores de expresión pueden ser obtenidos por métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia.
Las composiciones de la presente invención permiten la transfección del siRNA de la invención al interior de una célula, in vivo o in vitro. La transfección se podría llevar a cabo, pero sin limitarnos a, transfección directa o vectores que faciliten el acceso del siRNA al interior de la célula. Así, ejemplos de estos vectores son, sin limitarse a, retrovirus, lentivirus, adenovirus, virus adeno- asociados, virus del Herpes simplex, plásmidos de DNA no virales, liposomas catiónicos y conjugados moleculares. Así, por ejemplo, los siRNA de la presente invención, así como ARN o ADN precursores de estos siRNA, pueden conjugarse con péptidos de liberación u otros compuestos para favorecer el transporte de estos siRNA al interior de la célula.
En una realización preferida la composición de la invención además comprende, al menos, un excipiente y/o al menos, un vehículo farmacológicamente aceptables. Otra realización preferida se refiere a dicho medicamento que además comprende al menos otro principio activo
El término "excipiente" hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorción del medicamento de la invención que comprende el inhibidor de TAK1 , estabiliza dichos compuestos o ayuda a la preparación de la composición farmacéutica en el sentido de darle consistencia o aportar sabores que lo hagan más agradable. Así pues, los excipientes podrían tener la función de mantener los ingredientes unidos como por ejemplo almidones, azúcares o celulosas, función de endulzar, función de colorante, función de protección del medicamento como por ejemplo para aislarlo del aire y/o la humedad, función de relleno de una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentación como por ejemplo el fosfato de calcio dibásico, función desintegradora para facilitar la disolución de los componentes y su absorción en el intestino, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo. Un "vehículo farmacológicamente aceptable" se refiere a aquellas sustancias, o combinación de sustancias, conocidas en el sector farmacéutico, utilizadas en la elaboración de formas farmacéuticas de administración e incluye, pero sin limitarse, sólidos, líquidos, disolventes o tensioactivos. El vehículo puede ser una sustancia inerte o de acción análoga a cualquiera de los compuestos de la presente invención. La función del vehículo es facilitar la incorporación del producto de expresión de la invención así como también de otros compuestos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición farmacéutica. Cuando la forma de presentación es líquida, el vehículo es el diluyente. El término "farmacológicamente aceptable" se refiere a que el compuesto al que hace referencia esté permitido y evaluado de modo que no cause daño a los organismos a los que se administra.
La composición proporcionada por esta invención puede ser facilitada por cualquier vía de administración incluida la administración en el líquido de diálisis, para lo cual dicha composición se formulará en la forma farmacéutica adecuada a la vía de administración elegida. Los agentes inhibidores de la actividad de TAK1 de dichas composiciones se encuentran en una cantidad terapéuticamente efectiva. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de agentes moduladores calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de dichos agentes (y construcciones) y el efecto terapéutico a conseguir. Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los vehículos conocidos por los técnicos en la materia. Otra realización preferida de la presente invención se refiere al uso de al menos un producto de la expresión de TAK1 , o cualquiera de sus fragmentos, o de su actividad como biomarcador para la determinación de fibrosis peritoneal, o para determinar la progresión de fibrosis peritoneal en una muestra biológica aislada de un mamífero.
El término "producto de expresión" se refiere a cualquier ARN como por ejemplo, pero sin limitarse, ARN mensajero (ARNm) (secuencia codificada por la SEQ ID NO: 2), o cualquiera de sus fragmentos; así como la cualquier proteína o cualquiera de sus fragmentos que resulte de la expresión de la SEQ ID NO: 1 de la presente invención o posea una homología con el ARN, proteína o fragmentos de los mismos de al menos un 50%.
El término "biomarcador" en la presente invención se refiere a una molécula que tiene una conexión directa con el riesgo de padecer fibrosis peritoneal y sirve para determinar el estado de la enfermedad así como para predecir la progresión de la misma.
La muestra biológica aislada de un organismo, como por ejemplo, pero sin limitarse, un humano u otro animal, puede ser un fluido biológico o cualquier tejido celular de dichos organismos.
Las enfermedades en las que la alteración de la actividad de TAK1 puede ser diagnóstica, y en concreto la fibrosis peritoneal, pueden ser detectadas midiendo la cantidad de ácidos nucleicos (ADN y/o ARN y/o mRNA) que codifican para TAK1 , o la cantidad de proteína TAK1 que se expresa, en comparación con células normales (células normales en la presente invención son las células del peritoneo que conservan características epiteliales), o comparando la actividad de TAK1 de la muestra biológica en estudio y las células normales. La detección de los oligonucleótidos puede hacerse por métodos bien conocidos en el estado de la técnica (como por ejemplo, pero sin limitarse, sondas con nucleótidos marcados, hibridación ADN-ADN ó ADN- ARN, amplificación por PCR empleando nucleótidos marcados, la RT-PCR). Procedimientos para detectar la expresión de la proteína TAK1 también son bien conocidos en el estado de la técnica, como por ejemplo anticuerpos poli o monoclonales, ELISA, radioinmunoensayo (RIA), y FACS (fluorescence activated cell sorting). En el caso de la detección de la actividad de TAK1 ésta se puede realizar mediante métodos conocidos en el estado de la técnica tales como la detección de TAK1 fosforilada con un anticuerpo específico (Kim et al. 2008. J Biol Chem 283: 10753-10763) o mediante inmunoprecipitación de TAK1 con un anticuerpo y posterior ensayo quinásico con un substrato específico de TAK1 , por ejemplo MKK6 (Zhang et al. 2000. Nat Med 6:556-563).
Por tanto, en otro aspecto de la invención se describe un método para el diagnóstico y/o pronóstico de la fibrosis peritoneal que comprende,
(a) obtener una muestra biológica aislada de un mamífero y (b) detectar y/o cuantificar en la muestra obtenida en el paso (a) al menos un producto de la expresión de TAK1 , cualquiera de sus fragmentos, o su actividad. Es decir, un método para la recolección u obtención de datos útiles para el diagnóstico y/o pronóstico de la fibrosis peritoneal.
Otra realización preferida se refiere a un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico y/o pronóstico de la fibrosis peritoneal, donde además comprende la comparación de los datos obtenidos en el paso (b) con datos obtenidos de muestras control para buscar alguna desviación significativa.
Otra realización más preferida además comprende atribuir la desviación significativa al desarrollo de fibrosis peritoneal en dicho mamífero. El término "muestras control" tal como se entiende en la presente invención se refiere, por ejemplo, pero sin limitarse, a una muestra obtenida de un individuo que no ha desarrollado un daño peritoneal (individuo sano). Este tipo de muestra control, es un muestra control negativa o control negativo para un daño peritoneal
El término "desviación significativa" tal como se entiende en la presente invención se refiere, a la presencia de la proteína en la muestra aislada, una mayor concentración de la proteína de la invención o variación de la actividad de la misma en la muestra aislada respecto de una muestra aislada procedente de un individuo sano, así como a la presencia de una diferencia estadísticamente significativa entre la presencia o actividad de la proteína TAK1 entre ambas. La selección del individuo sano se lleva a cabo por medio de la medida del nivel de uno o más marcadores comunes de un daño peritoneal. El marcador común se selecciona de la lista conocida por el experto en la materia que comprende, pero sin limitarse, marcadores de daños estructurales tales como fibrosis, angiogénesis, transición epitelio mesénquima (mediante mareaje de marcadores epiteliales y mesoteliales), infiltración inflamatoria, acumulación de productos de glicosolación avanzados (AGEs); así como marcadores de daños funcionales obtenidos mediante ensayo de ultrafiltración peritoneal o ensayo de transporte peritoneal de creatinina y urea.
En la presente invención "diferencia estadísticamente significativa" se refiere a que existen diferencia estadísticas entre los valores comparados, siendo la probabilidad estadística al menos mayor o menor que 0,05 (p>0,05 o p>0.05) y obteniéndose ésta según el test estadístico aplicable a cada caso.
Otra realización aún más preferida comprende un método para determinar la progresión de fibrosis peritoneal que comprende,
(a) determinar una primera concentración o actividad de al menos un producto de la expresión de TAK1 , o cualquiera de sus fragmentos en una muestra biológica aislada de un mamífero; (b) determinar una segunda concentración o actividad de dicho producto de expresión del paso (a) en una muestra biológica aislada de un mamífero, y (c) comparar la segunda concentración o actividad obtenida en el paso (b) con la primera concentración o actividad obtenida en el paso (a) para buscar una desviación significativa.
Otra realización preferida se refiere al uso de un kit que comprende la secuencia que codifica para TAK1 o un fragmento de la misma o la proteína para la que codifica para el diagnóstico de la fibrosis peritoneal. Además, también podría formar parte de la presente invención un sistema para medir la actividad enzimática quinasa de TAK1 para el diagnóstico de la fibrosis peritoneal, preferiblemente mediante anticuerpos anti-TAK1 fosforilada o mediante inmunoprecipitación y posterior detección de la actividad quinasa mediante un substrato de TAK1 , por ejemplo MKK6. El término "sistema para medir la actividad" se refiere a un kit que comprenda sondas o anticuerpos capaces de detectar la expresión y/o la actividad de proteínas que participen en la cascada de señalización de TAK1 y sean activadas o reprimidas por ésta o los componentes necesarios para realizar un ensayo de la actividad quinasa de TAK1 . Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico" se usan aquí de manera intercambiable, refiriéndose a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, tanto ribonucleótidos como desoxirribonucleótidos.
Los términos "péptido", "oligopéptido", "polipéptido" y "proteína" se usan aquí de manera intercambiable, y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que pueden ser codificantes o no codificantes, química o bioquímicamente modificados.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
Figura 1. Muestra que la inhibición de TAK1 previene la TEM en células mesoteliales primarias mediante estudios morfológicos. Se realizaron ensayos con el inhibidor de TAK1 NP-009245 (9-Epimer-1 1 , 12-dihydro-(5Z)-7- Oxozeanol; 600nM, Analyticon Discovery) en células mesoteliales primarias humanas en las que se indujo transdiferenciación epitelio-mesénquima por inhibición de p38 MAPK (SB203580, SB; o BIRB796 BIRB) o por TGF-beta combinado con IL-1 (T/l). La inhibición de TAK1 fue previa a la transdiferenciación (una hora antes). Los controles fueron células en las que no se indujo la TEM (NT) y células en las que no se utilizó el inhibidor pero sí el disolvente DMSO utilizado (DMSO). A, imágenes de microscopía confocal de las células en las que se aprecia la morfología. B, imágenes de microscopía confocal en la que se aprecia la morfología celular y el citoesqueleto mediante fluorescencia de la actina (F-actina) y los núcleos celulares. C, las células analizadas con el software MetaMorph. D, análisis de la morfología celular en el que se compara el factor elíptico (longitud/anchura) de las células analizadas.
Figura 2. Muestra que la inhibición de TAK1 previene la TEM en células mesoteliales primarias mediante estudios de expresión del marcador epitelial E-cadherina. Se realizaron ensayos con inhibidores de TAK1 en células mesoteliales primarias humanas en las que se indujo transdiferenciación epitelio-mesénquima por inhibición de p38 MAPK (SB, BIRB) o por TGF-beta combinado con IL-1 (T/l). La inhibición de TAK1 con el NP-009245 y con un dominante negativo (TAK1 D175A) fue previa a la transdiferenciación (TEM). Los controles fueron en el caso del NP-009245, células sin tratar con el inhibidor, pero sí con el disolvente DMSO utilizado (DMSO); y en el caso del dominante negativo, células infectadas con un vector retroviral vacío (vacío). A, Western blot en el que se aprecia la expresión de E- cadherina en las células analizadas tras inhibición de TAK1 con NP-009245 e inducción de la TEM con T/l . B, RT-PCR que muestra los niveles de expresión de RNA mensajero (mRNA) de E-cadherina en las células analizadas tras inhibición de TAK1 con NP-009245 e inducción de la TEM con inhibidores de MAPK p38 (SB, BIRB). C, Western blot que muestra la expresión de E- cadherina y TAK1 en las células infectadas con el dominante negativo TAK1 D175A. D, control de DMSO; S, SB y B, BIRB. Se utilizó tubulina como control de carga.
Figura 3. Muestra que la inhibición de TAK1 previene la TEM en células mesoteliales primarias por TEM realizada con TGF-beta combinado con IL-1 (T/l). Se realizaron ensayos con el inhibidor NP-009245 de TAK1 (TAK1 inh) en células mesoteliales primarias humanas en las que posteriormente se indujo transdiferenciación epitelio-mesénquima por TGF-beta combinado con IL-1 (T/l o TI). Los controles fueron células sin tratar con el inhibidor, pero sí con el disolvente DMSO utilizado (DMSO) y para el control del tratamiento con T/l, células no tratadas (NT). A, RT-PCR que muestra los niveles de expresión de RNA mensajero (mRNA) de E-cadherina (ECD) en las células analizadas. B, RT-PCR que muestra los niveles de expresión de RNA mensajero (mRNA) de SnaiM en las células analizadas. C, RT-PCR que muestra los niveles de expresión de RNA mensajero (mRNA) de fibronectina (FN) en las células analizadas. D, RT-PCR que muestra los niveles de expresión de RNA mensajero (mRNA) de colágeno I (Col I) en las células analizadas. E, Western blot que muestra la expresión del inhibidor 1 del activador del plasminógeno (PAI-1 ) en las células analizadas a distintos tiempos; m, minutos; h, horas.
Figura 4. Muestra los cambios fenotípicos de la inhibición de TAK1 o MEK1 en células de efluente de pacientes. Células de efluente de pacientes que han sufrido la diálisis peritoneal fueron tratadas con diferentes sustancias y se observó mediante microscopía de contraste de fases la morfología celular. A, análisis de la morfología de las células tratadas con DMSO como control negativo. B, análisis de la morfología de las células tratadas con el inhibidor de MEK1 CI-1040. C, .análisis de la morfología de las células tratadas con el inhibidor de TAK1 NP-009245 (TAK1 inhibidor). Figura 5. Muestra la expresión de fibronectina, E-cadherina y vimentina tras la inhibición de TAK1 o MEK1 en células de efluente de pacientes. Se analizó la expresión de E-cadherina y de fibronectina en células de efluente de pacientes que han sufrido la diálisis peritoneal tratadas durante 48 horas con 600nM del inhibidor de TAK1 NP-009245 (TAK1 , TAK1 inh), o con el inhibidor de MEK1 CI-1040 (MEK1 ) (2 micromolar) o sin inhibidores pero con el disolvente DMSO utilizado (DMSO, NT). A, Análisis por western blot de la expresión de las proteínas analizadas, se utilizó tubulina como control de carga. B, RT-PCR que muestra la expresión del mRNA de E-cadherina (ECD) en células tratadas con el inhibidor de TAK1 (TAK inh) y sin tratar (NT). Se muestra la media y la desviación standard de muestras procedientes de 4 pacientes. C, análisis por western blot de la expresión de las proteínas N- cadherina y E-cadherina. D, DMSO; T, inhibidor de TAK1 NP-009245; Cl, inhibidor de MEK1 CI-1040; T+CI, ambos inhibidores. Se utilizó tubulina como control de carga. D, RT-PCR que muestra la expresión del mRNA de N- cadherina. E, Análisis por western blot de la expresión de las proteínas analizadas, se utilizó tubulina como control de carga.
Figura 6. Muestra el incremento de la expresión de citoqueratina tras la inhibición de TAK1 en células de efluente de pacientes. Análisis por inmunofluorescencia confocal de la expresión y localización del marcador epitelial pan-citoqueratina en células de efluente peritoneal de pacientes que recibían tratamiento de diálisis peritoneal, tratadas y sin tratar con el inhibidor de TAK1 NP-009245 (600nM, durante 48 horas) Las células fueron tratadas con el inhibidor o con el disolvente DMSO como control (DMSO) y se observó la expresión por inmunofluorescencia de pan-citoqueratina. Se muestra la fluorescencia de los núcleos celulares para la visualización de las células analizadas (núcleos). Figura 7. Muestra el decremento de la expresión de alfa-SMA tras la inhibición de TAK1 en células de efluente de pacientes. Análisis por inmunofluorescencia confocal de la expresión y localización del marcador mesenquimal alfa-SMA (apha-smooth muscle actin) en células de efluente peritoneal de pacientes que recibían tratamiento de diálisis peritoneal, tratadas y sin tratar con el inhibidor de TAK1 NP-009245 (600nM, durante 48 horas). Las células fueron tratadas con el inhibidor o con el disolvente DMSO como control (DMSO) y se observó la expresión por inmunofluorescencia de alfa- SMA. Se muestra la fluorescencia de los núcleos celulares para la visualización de las células analizadas (núcleos).
Figura 8. Muestra el decremento de la expresión de fibronectina tras la inhibición de TAK1 en células de efluente de pacientes. Análisis por inmunofluorescencia confocal de la expresión y localización del marcador mesenquimal fibronectina en células de efluente peritoneal de pacientes que recibían tratamiento de diálisis peritoneal, tratadas y sin tratar con el inhibidor de TAK1 NP-009245 (600nM, durante 48 horas). Las células fueron tratadas con el inhibidor o con el disolvente DMSO como control (DMSO) y se observó la expresión por inmunofluorescencia de fibronectina. Se muestra la fluorescencia de los núcleos celulares para la visualización de las células analizadas (núcleos).
Figura 9. Muestra el incremento en membrana de ZO-1 tras la inhibición de TAK1 en células de efluente de pacientes. Análisis por inmunofluorescencia confocal de la expresión y localización del marcador ZO-1 en células de efluente peritoneal de pacientes que recibían tratamiento de diálisis peritoneal, tratadas y sin tratar con el inhibidor de TAK1 NP-009245 (600nM, durante 48 horas) Las células fueron tratadas con el inhibidor o con el disolvente DMSO como control (DMSO) y se observó la expresión por inmunofluorescencia de ZO-1 . Se muestra la fluorescencia de los núcleos celulares para la visualización de las células analizadas (núcleos). Figura 10. Muestra la expresión de fibronectina y de E-cadherina tras la inhibición de TAK1 con siRNA específico en células de efluente de pacientes. Se analizó la expresión de E-cadherina y de fibronectina en células de efluente de pacientes que han sufrido diálisis peritoneal tratadas durante 48 horas con siRNA especifico para TAK1 o siRNA "scramble". A, análisis por western blot de la expresión de las proteína analizada, se utilizó tubulina como control de carga. B, RT-PCR que muestra la expresión del ARNm de E- cadherina en células tratadas con siRNA especifico para TAK1 o siRNA "scramble". Se muestra la media y la desviación estándar de muestras procedentes de 4 pacientes
Figura 11. Muestra que la inhibición de TAK1 reduce la invasión de células de efluente de pacientes en geles de colágeno tipo I. Se analizó la invasión de células pretratadas con el inhibidor NP-009245 (600 nanomolar) (TAK1 -I), con el inhibidor de MEK1 (Cl 1040) (2 micromolar), con los dos inhibidores juntos (T+C) o con DMSO mediante un ensayo de invasión sobre colágeno tipo I . EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.
EJEMPLO 1. La inhibición de TAK1 previene la TEM en células mesoteliales primarias. Para comprobar el uso de inhibidores de TAK1 en la prevención de la TEM, se utilizaron células mesoteliales primarias humanas derivadas del omento de pacientes que sufrieron cirugía abdominal previamente tratadas con inhibidores de TAK1 y en las que posteriormente se indujo transdiferenciación (TEM). Los inhibidores de TAK1 utilizados fueron NP-009245 y un dominante negativo TAK1 D175A. El dominante negativo utilizado como control de inhibición en la invención TAKD175A comprende el fragmento de la proteína TAK1 SEQ NO: 1 que comprende los aminoácidos de 2 a 549 pero con una mutación D175A que inactiva la actividad quinasa TAK1 al sustituir el aminoácido aspártico de la posición 175 por una alanina. El dominante negativo TAK1 D175A utilizado en la invención además contiene marcadores para la selección de los recombinantes y marcadores para la detección de la proteína recombinante (myc) y se introdujo en las células mediante infección con un retrovirus. La transdiferenciación se indujo por tratamiento durante 24 horas con inhibidores de p38 MAPK (SB203580 10 micromolar, SB; o BIRB796 250 nanomolar, BIRB) o con TGF-beta combinado con IL-1 (T/l) (TGF-beta 0.5 ng/ml e IL-1 2 ng/ml). De este modo se observó que el pretratamiento con inhibidores de TAK1 previene la TEM en dichas células tanto a nivel morfológico (Fig.1 ) como a nivel de expresión de RNA mensajero y protéica (Fig.2 y 3). Se observó mediante microscopía confocal y mediante análisis con el software MetaMorph que la inhibición de TAK1 con el inhibidor NP-009245 previene la transformación morfológica a fenotipo fibroblástico en células mesenquimales transdiferenciadas (Fig.lA y 1 B). Se observa que la inhibición de TAK1 en células mesoteliales transdiferenciadas provoca que el factor elíptico de las células transdiferenciadas decrezca por aumento de la anchura de la célula y disminución de la longitud, lo que le lleva a adquirir una morfología de tipo "cobblestone" (empedrada) típica del fenotipo epitelial (Fig.l C y 1 D). Por otra parte, se realizó un estudio de la expresión del marcador epitelial E-cadherina en células tratadas y sin tratar con los inhibidores de TAK1 y se observó que la inhibición de TAK1 previene la represión de este marcador producida por la TEM al aumentar la expresión de la proteína, tanto con el NP-009245 (Fig. 2A) como con el con el dominante negativo (Fig. 2C), así como del RNA mensajero (mRNA) con NP-009245 (Fig. 2B y Fig. 3A), de este marcador epitelial en las células mesoteliales transdiferenciadas. Además, se observó que la inhibición de TAK1 con NP-009245 reprime la expresión de mRNA del factor de transcripción Snail conocido por bloquear la transcipición de E-cadherina. (Fig. 3B). Dado que la fibrosis se caracteriza por producción de fibras de colágeno y fibronectina, se evaluó la expresión del mRNA de ambas en células mesoteliales de omento tras estimulación con T/l y se observó que la inhibición de TAK1 con NP-009245 previa a la TEM previene la expresión del mRNA de colágeno I y de fibronectina en dichas células (Fig. 3C y 3D).
Además también se analizó la expresión del inhibidor 1 del activador de plasminógeno (PAI-1 , "plasminogen activator inhibitor-1 ") tras tratamiento con el inhibidor NP-009245 de TAK1 en células mesoteliales primarias humanas tratadas con TGF-beta combinado con IL-1 beta a distintos tiempos. El PAI-1 se ha relacionado con fibrosis e invasión. Los controles fueron células sin tratar con el inhibidor, pero sí con el disolvente DMSO utilizado y para el control del tratamiento con T/l, células no tratadas, se utilizó tubulina como control de carga. Los resultados muestran que la inhibición de TAK1 previene la expresión de PAI-1 en células mesoteliales primarias estimuladas con TGF-beta combinado con IL-1 (Fig. 3E).
EJEMPLO 2. Comparación de la inhibición de TAK1 y de MEK1 en células de efluente de paciente. Con el fin de validar y comparar el uso de inhibidores de TAK1 para el tratamiento y prevención de fibrosis peritoneal, se procedió a comparar la inhibición de TAK1 con la inhibición de otra molécula implicada en la fibrosis peritoneal ya conocida MEK1 en células de efluentes de pacientes que habían sufrido diálisis peritoneal.
En los experimentos de la invención, la inhibición de TAK1 (con NP-009245) produce una reversión más fuerte que la inhibición de MEK1 (con CI-1040). Dicha reversión se ha demostrado en células de efluente de pacientes que han sufrido diálisis peritoneal mediante estudios morfológicos en los que se observa que la inhibición de TAK1 provoca una reversión mayor hacia un fenotipo epitelial al generar células menos largas y más anchas que en las que se han tratado con el inhibidor de MEK1 (Fig. 4). Además, también se ha demostrado que la inhibición de TAK1 produce una represión mayor de la proteína fibronectina (el marcador mesenquimal) aunque el aumento de la expresión de la proteína de E-cadherina es similar con los dos inhibidores (Fig.5A). El aumento de la expresión de E-cadherina en efluente de pacientes se demostró para el caso de la inhibición de TAK1 con NP-009245 tanto a nivel de proteína (Fig. 5A) como a nivel de mRNA (Fig. 5B). Además, se comparó la expresión de la proteína E-cadherina con la expresión de la proteína N-cadherina en este tipo de muestras mediante western blotting (Fig. 5C) con el inhibidor de TAK1 y con el inhibidor de MEK1 por separado y de manera conjunta y se observó una relación inversa en la expresión de las dos proteínas antes y después del tratamiento farmacológico. El análisis del mRNA de N-cadherina demostró que la inhibición de N-cadherina por parte del inhibidor de TAK1 es de naturaleza transcripcional (Fig. 5D). También se analizó la expresión de la proteína vimentina. Los niveles de vimentina también se redujeron después del tratamiento con NP-009245 (Fig. 5E). Estos datos, por lo tanto sirven para validar el uso de inhibidores de TAK1 para el tratamiento de la fibrosis peritoneal.
EJEMPLO 3. Expresión y localización de marcadores epiteliales y mesenquimales tras inhibición de TAK1 en células de efluente de pacientes.
Con el fin de visualizar en células de efluente de pacientes que han sufrido DP la expresión y la localización de marcadores epiteliales y mesenquimales en dichas células, se utilizó microscopía confocal en células tratadas y sin tratar con el inhibidor de TAK1 NP-009245. Tras un tratamiento de 48 horas con este inhibidor se observó un incremento del marcador epitelial pan-citoqueratina (Fig. 6), un decremento de los marcadores mesenquimales actina alfa de músculo liso (alfa smooth muscle actin, alfa-SMA) (Fig. 7) y fibronectina (Fig. 8) en estas células, así como un incremento de la expresión de membrana del marcador "zona ocludens 1" ("tight junction protein 1", ZO-1 ) (Fig. 9).
EJEMPLO 4. Inhibición de TAK1 mediante siRNA en células de efluente de pacientes.
Quisimos confirmar los datos ya obtenidos con el inhibidor farmacológico IMP009245 usando la técnica del siRNA. El silenciamiento de TAK1 mediante siRNA en células de pacientes produjo un incremento de los niveles de E- cadherina, y un decremento de fibronectina (Fig. 10A). El incremento de E- cadherina fue también medido a nivel de mRNA, por RT-PCR (Fig. 10B). Por lo tanto, el conjunto de los resultados obtenidos en los ejemplos descritos previamente, demuestran que la inhibición de TAK1 causa el incremento y la relocalización de marcadores epiteliales (E-cadherina, citoqueratina, ZO-1 ) y el decremento de marcadores mesenquimales asociados a la TEM y a la fibrosis en células mesoteliales (N-cadherina, fibronectina, colágeno, vimentina, PAI-1 ). La inhibición de TAK1 puede ser realizada tanto con el uso de inhibidores químicos como con el uso de siRNA.
EJEMPLO 5. Ensayo de invasión. Con el fin de analizar si la inhibición de TAK1 puede controlar eventos funcionales relacionados con la TEM y la fibrosis, se analizó la invasión de células mesoteliales a través de geles de colágeno tipo I. Se ha demostrado previanienteque que durante de la diálisis peritoneal las células mesoteliales pueden invadir el estroma submesotelial y pueden tener un papel en la instauración de la fibrosis peritoneal. Se comparó la acción de la inhibición de TA 1 y MEK1 por separado y conjuntamente. Como se aprecia en la figura 1 1 , la invasión de las células se redujo en células pre-tratadas con el inhibidor NP-009245, así como en células tratadas con el inhibidor de MEK1 . Sin embargo, el tratamiento simultáneo con inhibidores de IVIEK1 y TAK1 farmacológico no redujo aún más la invasión de las células mesoteliaíes. Estos resultados demuestran que TAK1 controla la invasión de las células mesoteliaíes, y que es una característica importante dei programa de la TEÍVl y fíbrosis perifonea!.
MATERIAL Y MÉTODOS EMPLEADOS.
Obtención de células mesoteliaíes primarias humanas y células de efluente de pacientes.
Las células mesoteliaíes primarias humanas fueron aisladas siguiendo el protocolo descrito en Strippoli R et al. 2008. Dis Model Mech. 1 :264-274 a partir de pacientes sometidos a diálisis peritoneal que sufrieron cirugía abdominal no relacionada con daño peritoneal. Brevemente, tras digestión de las muestras de omento con 0.125% de solución de tripsina con 0.01 % EDTA, se cultivaron las células en medio Earle M199 suplementado con 20% de suero fetal de ternera, 50 U/ml de penicilina, 50 microgramos/ml estreptomicina y 2% Biogro-2 (conteniendo insulina, tranferrina, teanolamina y puterscina). Las células de efluente de paciente fueron aisladas de 13 pacientes clínicamente estables utilizando los métodos descritos en dicha publicación. Las células fueron cultivadas de la misma manera y después de 10-15 días los cultivos alcanzaron confluencia tras lo que se realizó un pasaje a una proporción 1 :2. Las características morfológicas de las células en cultivos confluentes fueron comparadas y permanecieron estables durante dos o tres pasajes. De las 13 líneas primarias derivadas de efluente de paciente, seis tenían fenotipo similar a epitelial y siete tenían fenotipo no-epitelial. Para controlar la posible contaminación con fibroblastos, la pureza del omento y de las células mesoteliaíes derivadas de efluente de pacientes fue determinada utilizando la expresión de marcadores mesoteliaíes estándares, la molécula de adhesión intercelular ICAM-1 y citoqueratinas. Las células mesoteliales expresaban altos niveles de ICAM-1 y bajos niveles de marcador específico de fibroblasto S100, permitiendo de esta manera distinguirlas fácilmente de los fibroblastos peritoneales. Los cultivos de células mesoteliales fueron también negativos para el marcador endotelial CD31 y el marcador de macrófagos CD45. Durante el aislado de ambos tipos celulares, se obtuvo generalmente poblaciones celulares altamente purificadas con únicamente menos del 5% de células contaminantes tras determinación con análisis de FACS. Las muestras que tuvieron más del 5% de células contaminantes fueron descartadas.
El estudio se realizó de acuerdo a los principios de Declaración de Helsinki y fueron aprobados por el Comité de Ética para la Investigación Básica del Hospital Universitario de la Princesa (Madrid, España). Se obtuvo consentimiento informado escrito de todos los voluntarios.
Tratamiento de células con inhibidores.
Para la inhibición de TAK1 , las células fueron tratadas con el inhibidor NP- 009245 (600nM) o con un vector retroviral que codifica para un dominante negativo de TAK1 (TAK1 D175A) o con los siRNA. Para la inhibición de p38 se utilizaron SB203580 (10μΜ) o BIRB 796 (250 nM). Para la inhibición de MEK1 se usó CI-1040 (2 micromolar durante 48 horas).Como controles negativos se utilizaron DMSO o la infección con un vector retroviral vacío. Infección con el dominante negativo TAK1 D175A.
El dominante negativo utilizado denominado en la invención TAKD175A comprende el fragmento de la proteína TAK1 SEQ NO: 1 que comprende los aminoácidos de 2 a 549, pero con una mutación D175A que inactiva la actividad quinasa TAK1 al sustituir el aminoácido aspártico de la posición 175 por una alanina. El plásmido que contiene el TAK1 D175A utilizado en la invención es el pCMV5 que contiene marcadores para la selección de los recombinantes y marcadores para la detección de la proteína recombinante (myc). La infección con el retrovirus que contenía el dominante negativo se realizó de la misma manera que se describe en Strippoli et al. 2008. Dis Mod Mech 1 :264-274 para el retrovirus pRV-IRES-CopGreen (Genetrix). Brevemente, las células primarias mesoteliales de omento se siembran 24 horas antes de la infección en placas de 6 pocilios (2x105 células por pocilio). Para la infección, el sobrenadante (previamente filtrado) de las células productoras de los retrovirus (células 293T) se añadió a las células mesoteliales a las que previamene se había eliminado el sobrenadante. Este proceso se repitió dos veces en intervalos de 24 horas. 24h después de la última exposición a los retrovirus, la eficiencia de la infección se monitorizó mediante microscopía de fluorescencia (Cari Zeiss Standort Góttingen) o análisis de FACs (Becton Dickinson Laboratories). Inhibición de TAK1 con siRNA.
TAK1 fue silenciado usando el kit "on target plus smart pool, Human MAP3K7" (L-003790-00-0005) (Dharmacon, Lafayette, CO). Brevemente, 120000 células fueron transfectadas con dicho "on target plus smart pool siRNA" (100 nanomolar). Las transfecciones se realizaron mediante incubación durante 16 horas con una mezcla de siRNA y Dharmafect 1 (Dharmacon, Lafayette, CO) en medio libre de antibióticos, de acuerdo con los procedimientos del fabricante. El tratamiento fue repetido otra vez después de 48 horas, realizando la incubación con siRNA durante 8 horas. Las células se analizaron 72 horas después de la segunda transfección. Los siRNA utilizados en el ejemplo de la invención son las SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18.
Transdiferenciación epitelio-mesénquima de células mesoteliales humanas. Las células mesoteliales primarias humanas fueron tratadas con los inhibidores de p38 MAPK, SB203580 (10 μΜ) o BIRB 796 (250 nM) y/o con TGF-beta (0.5 ng/ml) en combinación con IL-1 -beta (2 ng/ml ) (T/l) durante 24 horas. Antes de la inducción de la transición epitelio-mesénquima, las células mesoteliales primarias humanas fueron tratadas con los inhibidores de TAK1 o con DMSO durante 1 hora antes del tratamiento con inhibidores de p38 y/o T/l.
Análisis morfológico de células en cultivo. Tras el tratamiento de las células, éstas se observaron en microscopio de contraste de fases para determinar su morfología. El análisis estadístico del fenotipo epitelial, fue realizado utilizando el software MetaMorph en el que se cuantifica la variación del factor elíptico (elongación/ancho) de las células. Análisis por Western blot.
Después de que las células fueron tratadas con los diferentes inhibidores, las células fueron lisadas y los niveles de proteína analizados por Western-blot según el método conocido en el estado de la técnica. Brevemente, se lisaron monocapas de células mesoteliales en un RIPA buffer modificado cuya composición era: 50mM Tris-HCI; pH 7,4; 1 % NP-40; 0,1 % SDS; 0,25% Nadeoxycolato; 150mM NaCI; 1 mM EDTA; 1 mM EGTA; 1 mM PMSF; 1 g/ml de aprotinina, leupeptina y pepstatina; y 25mM de NaF (Todos los compuestos listados de la casa SIGMA). Cantidades similares de lisado proteico fueron resueltas con SDS-PAGE. Las proteínas fueron transferidas a membranas de nitrocelulosa (Amersham Life Sciences, Little Chalfont, UK) e incubadas con anticuerpos, siguiendo las instrucciones del proveedor. Los anticuerpos adheridos a la membrana de nitrocelulosa fueron revelados con quimioluminiscencia mediante el uso de ECL utilizando los anticuerpos que se describen a continuación (Enhanced ChemiLuminescence) (Amersham Life Sciences, Little Chalfont, UK). Los anticuerpos utilizados fueron los siguientes: anti-cadherina-E (1 :1000, monoclonal de ratón de Becton-Dickinson Laboratories), anti-fibronectina (1 :500, policlonal de conejo de Sigma) y anti- TAK1 (1 :1000, policlonal de conejo de Cell Signalling), anti-PAI-1 (1 :500, monoclonal de ratón de Santa Cruz), anti-N-cadherina (1 :1000 de Zymed) y anti-vimentina (1 :2000, monoclonal de ratón de Sigma). Se utilizó la detección de tubulina como control de carga (1 :2500, monoclonal de ratón de Sigma).
Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR).
Después del tratamiento con los inhibidores correspondientes, se determinó la expresión del RNAm amplificando a partir del RNA total por medio de RT-PCR cuantitativa según el método conocido en el estado de la técnica. Brevemente, se extrajo el RNA total con el Kit RNeasy (Qiagen GmbH), y el cDNA se obtuvo a partir de 500ng de RNA total utilizando el Kit Omniscript RT (Qiagen). La PCR cuantitativa fue ejecutada con el sistema LightCycler® (Roche Diagnostics GmbH) utilizando el Kit SYBR Green (Roche Diagnostics GmbH) usando los cebadores específicos recogidos en las secuencias siguientes: SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7 para E-cadherina; SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9 para SnaiM ; SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 1 1 para Colágeno I; SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13 para Fibronecitna; SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 15 para la histona H3, usada como control y SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20 para la N-cadherina. La temperatura de anillamiento para la amplificación de E-cadherina y la histona H3 fue 62°C, mientras que fue de 64°C y de 66°C para la amplificación de colágeno I y de fibronectina respectivamente. La fluorescencia fue medida al finalizar cada ciclo de elongación. Para la amplificación de SnaiM , la temperatura de anillamiento fue de 55°C y la fluorescencia fue medida a 88°C para todos los casos excepto para la fibronectina que fue a 72°C después de cada ciclo de elongación. Todos los experimentos fueron ejecutados por duplicado. Los productos de la PCR fueron contrastados con un análisis de la curva de melting y un gel de electroforesis.
Análisis por microscopía confocal e immunofluorescencia La inmuno-fluorescencia y la microscopía confocal se realizó según el método conocido en el estado de la técnica y siguiendo las instrucciones de los fabricantes de los anticuerpos y los fluoroforos correspondientes. Se visualizó la expresión de alpha-SMA, fibronectina y pan-citoqueratina (citoqueratina) en las células de efluente de pacientes tratados con el inhibidor NP-009245 durante 48horas mediante inmunocitoquímica. Se utilizaron los siguientes anticuerpos: anti-alpha-SMA (1 :100 obtenido en ratón, Sigma); y anti- fibronectina (1 :100, obtenido en conejo, Sigma), pan-citoqueratina (1 :100 obtenido en ratón, Sigma) y anti-ZO-1 (1 :100, policlonal de conejo de Zymed).. Para la visualización de actina se utilizó "Rhodamin phalloidin" (1 :250, Invitrogen) y para la visualización de los núcleos de las células se utilizó tinción con Hoeschst 33342 a una dilución 1 :1000 (Invitrogen). La inmunotinción se observó mediante microscopía confocal. Ensayo de invasión
El ensayo de invasión se realizó con insertos de policarbonato con poros de 8 μηι de tamaño (Costar, Cambridge, MA). Las inserciones se pre-revistieron con 40 μΙ de solución de colágeno de tipo I (300 μg ml) (PureCol, Inamed, Fremont, Canadá) y se incubaron durante la noche a 37 0 C para permitir la formación del gel. Las células mesoteliales fueron pre-tratadas con DMSO, NP-009 245 (600 nm) o CI-1040 (2 μ M) durante 24 horas en 10% de suero fetal bovino (FBS) en medio M 199. 5x104 células mesoteliales en 100 μΙ de medio del ensayo (M-199 0% de FBS) fueron añadidas a la cámara alta. El estímulo de invasión (10% de FBS) fue introducido en la cámara baja en 600 μ I de medio 199. Las células mesoteliales invadieron el gel durante 24 horas. Las inserciones se fijaron con paraformaldehído al 4% y las células que no invadieron en la cara superior de la membrana se eliminaron con un bastoncillo de algodón, los filtros se cortaron y los núcleos de las células invasoras se tiñeron con Hoechst 33342. Las células invasoras fueron contadas en diez campos por muestra usando un microscopio de fluorescencia (40x aumentos). Cada experimento se llevó a cabo en dos ejemplares, y se realizaron al menos 5 experimentos.
Análisis estadístico
El análisis estadístico fue determiando utilizando el t-test del software OriginPro7 (OriginLab Co.). Valores de p<0.05 fueron considerados significativos.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Uso de una composición que comprende un agente inhibidor de la actividad de TAK1 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de la fibrosis peritoneal.
2. Uso según la reivindicación 1 donde el agente inhibidor que inhibe la actividad de TAK1 es un inhibidor químico.
Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, donde el agente inhibidor se selecciona de la lista que comprende: NP-009245 y LYTAKI inh, y cualquiera de sus sales farmacéuticamente aceptables o cualquiera de sus combinaciones.
Uso según la reivindicación 3, donde el agente inhibidor es NP-009245, o cualquiera de sus sales farmacéuticamente aceptables.
Uso según la reivindicación 1 , en la que el agente inhibidor es un oligonucleótido antisentido.
Uso según la reivindicación 5 donde el oligonucleótido antisentido es un ARN pequeño de interferencia (siRNA).
Uso según la reivindicación 6 donde el siRNA se selecciona de la lista que comprende: la secuencia SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 o cualquiera de sus combinaciones.
8. Uso según la reivindicación 7 donde el siRNA se selecciona de la lista que comprende: la secuencia SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5.
9. Uso según la reivindicación 7 donde los siRNA son SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18.
10. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde el medicamento además comprende al menos un excipiente y/o al menos un vehículo farmacéuticamente aceptables.
11 . Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde el medicamento además comprende al menos otro principio activo.
12. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 , donde el medicamento se presenta en una forma adaptada a la administración por vía oral, parenteral o por diálisis.
13. Uso de al menos un producto de la expresión de TAK1 , o cualquiera de sus fragmentos, o de su actividad como biomarcador para la determinación de fibrosis peritoneal o para determinar la progresión de fibrosis peritoneal, en una muestra biológica aislada de un mamífero.
14. Método para el diagnóstico y/o pronóstico de la fibrosis peritoneal que comprende,
a. Obtener una muestra biológica aislada de un mamífero, y b. detectar y/o cuantificar en la muestra obtenida en el paso (a) al menos un producto de la expresión de TAK1 , cualquiera de sus fragmentos, o su actividad.
15. Método según la reivindicación 14, donde además comprende comparar los datos obtenidos en el paso (b) con datos obtenidos con al menos una muestra control para buscar una desviación significativa.
16. Método según la reivindicación 15, donde además comprende atribuir la desviación significativa al desarrollo de fibrosis peritoneal en dicho mamífero.
17. Método para determinar la progresión de fibrosis peritoneal que comprende,
a. Determinar una primera concentración o actividad de al menos un producto de la expresión de TAK1 , o cualquiera de sus fragmentos en una muestra biológica aislada de un mamífero b. Determinar una segunda concentración o actividad de dicho producto de expresión del paso (a) en una muestra biológica aislada de un mamífero, y
c. Comparar la segunda concentración o actividad obtenida en el paso (b) con la primera concentración o actividad obtenida en el paso (a) para buscar una desviación significativa.
18. Uso de un kit que comprende la secuencia que codifica para TAK1 o un fragmento de la misma o la proteína que codifica para el diagnóstico de la fibrosis peritoneal.
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