WO2010061924A1 - 鳥インフルエンザワクチン - Google Patents

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WO2010061924A1
WO2010061924A1 PCT/JP2009/070053 JP2009070053W WO2010061924A1 WO 2010061924 A1 WO2010061924 A1 WO 2010061924A1 JP 2009070053 W JP2009070053 W JP 2009070053W WO 2010061924 A1 WO2010061924 A1 WO 2010061924A1
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liposome
seq
amino acid
phospholipid
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内田　哲也
麻衣子 種市
喜一 梶野
政則 松井
小田　洋
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国立感染症研究所長が代表する日本国
国立大学法人 北海道大学
学校法人 埼玉医科大学
日油株式会社
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    • C12N2740/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • the present invention relates to peptides useful as avian influenza vaccines, peptide-bonded liposomes, and uses thereof.
  • Influenza virus causes epidemic every year by changing the surface antigenicity by continuous mutation.
  • Pandemic a new type of antigenic virus that is completely different from those due to discontinuous mutations emerges, and humans who do not have immunity to the new type of virus have become a global epidemic (hereinafter “ Pandemic ”).
  • pandemics such as past Spanish colds and Hong Kong colds are likely to have originated from avian influenza viruses, and future bird flu could cause 5 to 150 million deaths There is also a trial calculation result. Infection with highly pathogenic avian influenza (H5N1), which is currently fatal, has been reported all over the world, and effective countermeasures are urgently needed.
  • H5N1 highly pathogenic avian influenza
  • influenza viruses including avian influenza viruses
  • avian influenza viruses are prone to mutations during their growth.
  • virus that infects humans reassembles with a human influenza virus in the body, there is a possibility that a virus having high infectivity between humans may be born while maintaining high pathogenicity.
  • Such frequent changes in the virus itself cause the above epidemic to repeat.
  • Point mutations occur in genes encoding viral surface glycoproteins [hemagglutinin (hemagglutinin; HA) and neuraminidase (NA)], and both genes are immunologically different in antigen discontinuous mutations. New strains will arise.
  • the conventional vaccine induces the production of antibodies that specifically bind to the surface protein of influenza virus, and the infectivity of the virus is lost by the action of these antibodies.
  • surface proteins are easily mutated, and antibodies induced by such vaccines have not always been effective.
  • vaccines are prepared in anticipation of the types of viruses that are prevalent, but this may be unexpected and the damage may increase.
  • influenza virus is relatively highly conserved even in continuous mutants and discontinuous mutants, but it is difficult to inactivate them by binding antibodies from outside the virus. It has not been actively used as a target.
  • MHC major histocompatibility complex
  • an antigen-bound liposome is used to efficiently identify cytotoxic T lymphocytes (CD8 + T cells, cytotoxin lymphosite: CTL) for killing pathogen-infected cells or cancer cells.
  • cytotoxic T lymphocytes CD8 + T cells, cytotoxin lymphosite: CTL
  • a method for preparing a T cell activator useful for the prevention and treatment of infectious diseases and cancer is disclosed. However, it has not been clarified at all what antigen can be used to actually protect against avian influenza virus infection, and to prepare effective cytotoxic T lymphocytes.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a vaccine for effectively preventing infection with a highly pathogenic avian influenza virus that is not easily affected by virus mutations.
  • the present inventors have found that a highly pathogenic avian influenza virus has a highly conserved internal protein sequence and an antigen that is particularly effective for the preparation of the cytotoxic T lymphocytes. An epitope was found. Furthermore, it has been found that antigen-specific cytotoxic T lymphocytes can be induced very strongly when vaccination is performed with liposomes to which peptides containing this epitope are bound, and the present invention has been completed.
  • the present invention is as follows.
  • a peptide capable of inducing cytotoxic T lymphocytes restricted by HLA (1) an amino acid sequence represented by any of SEQ ID NO: 7, 3 or 8, or (2) SEQ ID NO: 7 A peptide comprising an amino acid sequence in which 1 or 2 amino acids are substituted in the amino acid sequence represented by either 3 or 8, and having a length of 9 to 11 amino acids.
  • SEQ ID NO: 7 A peptide comprising an amino acid sequence in which 1 or 2 amino acids are substituted in the amino acid sequence represented by either 3 or 8, and having a length of 9 to 11 amino acids.
  • a liposome to which a peptide is bound In the peptide, (1) the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 9, or (2) one or two amino acids substituted in the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 9 An amino acid sequence Has a length of 9-11 amino acids, and Capable of inducing cytotoxic T lymphocytes restricted to HLA;
  • the liposome comprises a phospholipid having an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond or a hydrocarbon group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond, and a liposome stabilizer.
  • the peptide is bound to the surface of the liposome; Peptide-bound liposomes.
  • the phospholipid is at least one selected from diacylphosphatidylserine, diacylphosphatidylglycerol, diacylphosphatidic acid, diacylphosphatidylcholine, diacylphosphatidylethanolamine, succinimidyl-diacylphosphatidylethanolamine, and maleimide-diacylphosphatidylethanolamine.
  • the peptide has an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond or a hydrocarbon group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond contained in the phospholipid membrane constituting the liposome.
  • a cytotoxic T lymphocyte activator comprising a peptide, In the peptide, (1) the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 9, or (2) one or two amino acids substituted in the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 9 An amino acid sequence Has a length of 9-11 amino acids, and It can induce cytotoxic T lymphocytes restricted to HLA. Cytotoxic T lymphocyte activator.
  • a cytotoxic T lymphocyte activator comprising the peptide-bonded liposome according to [3].
  • An avian influenza virus vaccine comprising a peptide, In the peptide, (1) the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 9, or (2) one or two amino acids substituted in the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 9 An amino acid sequence Has a length of 9-11 amino acids, and It can induce cytotoxic T lymphocytes restricted to HLA.
  • Avian influenza virus vaccine [16] An avian influenza virus vaccine comprising the peptide-bonded liposome according to [3]. [17] The avian influenza virus vaccine according to [15] or [16], further comprising CpG-DNA.
  • a peptide for use in the activation of cytotoxic T cells comprising: In the peptide, (1) the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 9, or (2) one or two amino acids substituted in the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 9 An amino acid sequence Has a length of 9-11 amino acids, and A peptide capable of inducing cytotoxic T lymphocytes restricted to HLA.
  • the peptide-bonded liposome according to [3] for use in the activation of cytotoxic T cells.
  • a pharmaceutical composition comprising the peptide-bonded liposome according to [3] and CpG-DNA for use in the activation of cytotoxic T cells.
  • a peptide for use in vaccination against avian influenza In the peptide, (1) the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 9, or (2) one or two amino acids substituted in the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 9 An amino acid sequence Has a length of 9-11 amino acids, and A peptide capable of inducing cytotoxic T lymphocytes restricted to HLA.
  • a pharmaceutical composition comprising the peptide-bound liposome according to [3] and CpG-DNA for use in vaccination against avian influenza.
  • an avian influenza vaccine can be prepared from an antigen derived from an internal protein of an avian influenza virus with high storage stability. According to the present invention, it is possible to provide a highly versatile avian influenza vaccine that is unlikely to be affected by a virus surface protein mutation and that does not require an accurate prediction of an epidemic virus strain (type / subtype), unlike a conventional avian influenza vaccine. .
  • the present invention relates to a peptide capable of inducing cytotoxic T lymphocytes restricted by HLA, wherein (1) the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 9, or (2) SEQ ID NO: 1 to Provided is a peptide (peptide of the present invention) comprising an amino acid sequence in which one or two amino acids are substituted in the amino acid sequence represented by any one of 9 and having a length of 9 to 11 amino acids.
  • the present invention has been completed based on the discovery of the following excellent epitope sequences (epitope sequences of the present invention) in highly pathogenic avian influenza virus antigens: An amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 9; an amino acid sequence in which one or two amino acids are substituted in the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 9 (wherein the amino acids Peptides consisting of sequences can induce cytotoxic T lymphocytes restricted to HLA).
  • amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 9 are the internal proteins of highly pathogenic avian influenza virus A / Hong_Kong / 483/97 (H5N1), PA (SEQ ID NOs: 2 and 3), PB1 (SEQ ID NOs: 1, 4, 5, 6 and 9) and the partial sequence present in the amino acid sequence of PB2 (SEQ ID NOs: 7 and 8).
  • the mode of substitution in (2) is not particularly limited as long as the peptide comprising the amino acid sequence can induce cytotoxic T lymphocytes restricted by HLA, but the identity of different avian influenza virus strains (type / subtype) is the same.
  • a preferred embodiment is one that reflects known amino acid mutations occurring in the corresponding epitope sequence in the antigen. Examples of such include the following.
  • MYQKCCTLF (SEQ ID NO: 6) ⁇ MYQRCCNLF (SEQ ID NO: 10) PR8 (H1N1) KTTPRPLRL (SEQ ID NO: 3) ⁇ KTTPRPIKL (SEQ ID NO: 11) Moscow (H3N2) RYTKTTYWW (SEQ ID NO: 4) ⁇ KYTKTTYWW (SEQ ID NO: 12) Moscow (H3N2) SYINRTGTF (SEQ ID NO: 5) ⁇ SYINKTGTF (SEQ ID NO: 13) Moscow (H3N2) MYQKCCTLF (SEQ ID NO: 6) ⁇ MYQKCCNLF (SEQ ID NO: 14) Moscow (H3N2) SYLIRALTL (SEQ ID NO: 9) ⁇ GYLIRALTL (SEQ ID NO: 15) Moscow (H3N2)
  • the epitope sequence of the present invention and a peptide comprising the sequence (epitope peptide of the present invention) have the following excellent properties:
  • (A) The epitope sequences of the present invention are highly conserved in continuous and discontinuous mutants of avian influenza virus.
  • (B) The epitope peptide of the present invention is stably presented on human major histocompatibility antigen (HLA).
  • HLA human major histocompatibility antigen
  • the type of HLA is not particularly limited, but the epitope peptide of the present invention is particularly excellent in binding to HLA-A * 0201 and HLA-A * 2402, which are the most popular HLA types in the world.
  • the epitope peptide of the present invention has the characteristics (B) above, it strongly induces cytotoxic T lymphocytes restricted by HLA (preferably HLA-A * 0201 or HLA-A * 2402). can do.
  • HLA preferably HLA-A * 0201 or HLA-A * 2402.
  • Antigen induces cytotoxic T lymphocytes restricted by HLA means a mammal expressing a specific HLA (eg, HLA-A * 0201 or HLA-A * 2402) (eg, human, trans
  • HLA-A * 0201 or HLA-A * 2402 eg, human, trans
  • the epitope peptide of the present invention can be used for human cytotoxic T lymphocytes worldwide regardless of race. Spheres can be induced and cellular immunity can be activated.
  • HLA-A * 0201 restricted PB1_410 GMFNMLSTV (SEQ ID NO: 1) and HLA-A * 2402 restricted PA_130: YYLEKANKI (SEQ ID NO: 2), PA_262: KTTPRPLRL (SEQ ID NO: 3), PB1_430: RYTKTTYWW (SEQ ID NO: 4), PB1_482: SYINRTGTF (SEQ ID NO: 5), PB1_688: MYQKCCTLF (SEQ ID NO: 6) and PB2_549: TYQWIIRNW (SEQ ID NO: 7) are preferred, and PB1_410: GMFNMLSTV (SEQ ID NO: 1), PA_130 : YYLEKANKI (SEQ ID NO: 2), PB1_430: RYTKTTYWW (SEQ ID NO: 4), PB1_688: MYQKCCTLF (SEQ ID NO: 6) and PB2_549:
  • the peptide of the present invention is the above-described epitope peptide of the present invention itself, or is cleaved by the action of a proteasome or the like in the cell to produce the above-described epitope peptide of the present invention. Therefore, the peptide of the present invention has substantially the same superior characteristics as the epitope peptide of the present invention, and the cytotoxic T lymphocyte activator and avian influenza virus vaccine of the present invention described below are used. When used for production, it exhibits excellent effects in killing cells infected with avian influenza virus and protecting against infection with avian influenza virus.
  • the length of the peptide of the present invention is not particularly limited, but is usually 9 to 11 amino acids, preferably 9 to 10 amino acids, more preferably 9 amino acids.
  • the peptide of the present invention has an additional sequence on the N-terminal side and / or C-terminal side of the epitope sequence of the present invention.
  • the length of the additional sequence and the amino acid sequence are not particularly limited as long as the above properties of the peptide of the present invention are not impaired.
  • the additional sequence is any one of SEQ ID NOs: 1 to 9 in the amino acid sequences of PA, PB1 and PB2 proteins of avian influenza virus (for example, highly pathogenic avian influenza virus A / Hong_Kong / 483/97 (H5N1)) It may be an amino acid sequence actually present adjacent to the partial sequence corresponding to.
  • the peptide is a residue that can overcome the selection of the presented antigen due to individual differences (polymorphism) of MHC when forming a major histocompatibility complex (MHC) in a cell.
  • the peptide of the present invention comprises a plurality of types (for example, 2 to 9 types, preferably 5 to 9 types) of the epitope sequences of the present invention.
  • the number and combination of types of epitope sequences can be arbitrarily set.
  • the ability of the peptide of the present invention to induce cytotoxic T lymphocytes is increased, and the peptide of the present invention is used for the production of an avian influenza virus vaccine.
  • the protective effect of avian influenza virus can be dramatically improved.
  • the peptide of the present invention can be prepared by a known peptide synthesis technique such as liquid phase synthesis or solid phase peptide synthesis. Alternatively, by culturing a transformant (such as E. coli) into which an expression vector capable of expressing the peptide of the present invention is introduced, and isolating the peptide of the present invention from the culture by a well-known purification technique such as an affinity column, The peptide of the present invention can be produced.
  • An expression vector capable of expressing the peptide of the present invention can be constructed by linking a polynucleotide encoding the peptide of the present invention downstream of a promoter in an appropriate expression vector using well-known genetic engineering techniques. it can.
  • the present invention is a liposome to which the peptide of the present invention is bound,
  • the liposome contains a phospholipid having an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond or a hydrocarbon group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond, and a liposome stabilizer.
  • the peptide of the present invention is bound to the surface of the liposome; Peptide-bound liposomes (peptide-bound liposomes of the present invention) are provided.
  • the phospholipid membrane constituting the liposome part of the peptide-bonded liposome of the present invention is such that the phospholipid that is an amphiphilic surfactant forms an interface with the polar group facing the aqueous phase, and the hydrophobic group is on the opposite side of the interface It has a structure suitable for.
  • the liposome refers to a phospholipid bilayer membrane having a closed space.
  • the peptide of the present invention can be bound to the surface of the liposome via the functional group that it has.
  • the functional group in the peptide of the present invention used for binding to the liposome surface include a hydrophobic group composed of an amino group, a thiol group, a carboxyl group, a hydroxyl group, a disulfide group, or a hydrocarbon group having a methylene chain (such as an alkyl group). Is mentioned.
  • the amino group, thiol group, carboxyl group, hydroxyl group and disulfide group are covalently bonded, the amino group and carboxyl group are ionically bonded, the hydrophobic group is hydrophobically bonded to each other, and the peptide of the present invention is bound to the liposome.
  • the peptide of the present invention is preferably bound to the surface of the liposome via an amino group, a carboxyl group or a thiol group.
  • the phospholipid membrane constituting the liposome has an amino group, a succinimide group, a maleimide group, a thiol group, a carboxyl group, and a hydroxyl group. It is desirable to have a functional group such as a hydrophobic group composed of a hydrocarbon group (alkyl group or the like) having a disulfide group or a methylene chain.
  • the functional group possessed by the phospholipid membrane constituting the liposome is preferably an amino group, a succinimide group or a maleimide group.
  • the combination of the functional group of the peptide of the present invention involved in the binding of the peptide of the present invention to the liposome and the functional group of the phospholipid membrane constituting the liposome is freely selected within a range that does not affect the effect of the present invention.
  • Preferred combinations include amino group and aldehyde group, amino group and amino group, amino group and succinimide group, thiol group and maleimide group, respectively.
  • the ionic bond and the hydrophobic bond are preferable from the viewpoint of ease of preparation of the peptide-bonded liposome, since the peptide binding procedure to the liposome is simple, and the covalent bond is preferable from the viewpoint of the binding stability of the peptide of the present invention on the surface of the liposome.
  • the peptide-bound liposome of the present invention is that the peptide of the present invention is bound to the surface of the constituent liposome, thereby achieving an excellent cytotoxic T lymphocyte activation effect. ing. Therefore, it is preferable from the viewpoint of enhancing the effect of the present invention that the peptide of the present invention is stably bound to the surface of the liposome even after being administered into the living body, for example, by an injection action. From such a viewpoint, the bond between the peptide of the present invention and the liposome is preferably a covalent bond.
  • the phospholipid membrane constituting the liposome part of the peptide-bonded liposome of the present invention comprises an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond or a hydrocarbon group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond. It contains a phospholipid having, and a liposome stabilizer.
  • the carbon number of the acyl group is preferably 16 to 22, more preferably 18 to 22, and most preferably 18 It is.
  • Specific examples of the acyl group include a palmitooleoyl group, an oleoyl group, and an elcoyl group, and an oleoyl group is most preferred.
  • the carbon number of the hydrocarbon group is preferably 16 to 22, more preferably 18 to 22, most preferably 18 is preferred.
  • hydrocarbon group examples include a tetradecenyl group, a hexadecenyl group, an octadecenyl group, a C20 monoene group, a C22 monoene group, and a C24 monoene group.
  • the unsaturated acyl group or unsaturated hydrocarbon group bonded to the 1-position and 2-position of the glycerin residue of the phospholipid may be the same or different. From the viewpoint of industrial productivity, the 1-position and 2-position groups are preferably the same.
  • the phospholipid a phospholipid having a C 14-24 acyl group having one unsaturated bond is preferably used.
  • the phospholipid preferably has an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond.
  • the acyl group has less than 13 carbon atoms, the liposome stability may be deteriorated, and the CTL activity enhancing effect may be insufficient.
  • the carbon number of the acyl group exceeds 24, the stability of the liposome may deteriorate.
  • Examples of phospholipids having an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond or a hydrocarbon group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond include acidic phospholipids, neutral phospholipids and peptides. Examples include reactive phospholipids having a functional group capable of binding. These can be selected as appropriate according to various requirements.
  • phosphatidylserine phosphatidylglycerol, phosphatidic acid, phosphatidylinositol and the like can be used.
  • Serine, diacylphosphatidylglycerol, diacylphosphatidic acid, and diacylphosphatidylinositol are preferably used.
  • the acidic phospholipid imparts an anionic ionizing group to the surface of the liposome, and thus imparts a negative zeta potential to the surface of the liposome. For this reason, liposomes have a charge repulsive force and can exist as a stable preparation in an aqueous solvent. Thus, acidic phospholipids are important in ensuring the stability of the liposome when the peptide-bound liposome of the present invention is in an aqueous solvent.
  • the neutral phospholipid for example, phosphatidylcholine and the like can be used.
  • the neutral phospholipid that can be used in the present invention can be used by appropriately selecting the type and amount thereof within the scope of achieving the enhancement of CTL activity addressed by the present invention.
  • the neutral phospholipid has a higher function of stabilizing the liposome and can improve the stability of the membrane, compared to the phospholipid to which the acidic phospholipid and the peptide of the present invention are bound.
  • the phospholipid membrane constituting the liposome part of the peptide-bonded liposome of the present invention preferably contains a neutral phospholipid.
  • the amount of neutral phospholipid used can be determined after securing the contents of acidic phospholipid used to achieve the CTL activity enhancing effect, reactive phospholipid for peptide binding, and liposome stabilizer.
  • the peptide of the present invention contains an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond or 14 carbon atoms having one unsaturated bond contained in the phospholipid membrane constituting the liposome. It binds to the surface of liposomes by binding to phospholipids having ⁇ 24 hydrocarbon groups.
  • a reactive phospholipid having a functional group to which the peptide of the present invention can bind is used as the phospholipid for binding this peptide.
  • Reactive phospholipids having an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond or a hydrocarbon group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond can be classified according to various requirements. The ratio is appropriately selected. Similar to the phospholipid, also in the reactive phospholipid, it is not preferable that the unsaturated acyl group or unsaturated hydrocarbon group contained in the phospholipid has more than 24 or less than 14.
  • Examples of the reactive phospholipid include phosphatidylethanolamine or a terminally modified product thereof. Further, phosphatidylglycerol, phosphatidylserine, phosphatidic acid, phosphatidylinositol, and terminally modified products thereof can also be used as reactive phospholipids. From the viewpoint of industrial availability, simplicity of the coupling step with the peptide of the present invention, yield, etc., phosphatidylethanolamine or a terminally modified product thereof is preferably used. Phosphatidylethanolamine has an amino group capable of binding the peptide of the present invention at its terminal.
  • the number of carbon atoms having one unsaturated bond is 14 to 14
  • diacylphosphatidylethanolamine having 24 acyl groups or a terminally modified product thereof.
  • Diacylphosphatidylethanolamine can be obtained, for example, by base exchange reaction between choline and ethanolamine using phospholipase D using diacylphosphatidylcholine as a raw material.
  • a crude reaction product can be obtained by mixing a chloroform solution in which diacylphosphatidylcholine is dissolved with water in which phospholipase D and ethanolamine are dissolved in an appropriate ratio.
  • the crude reaction product can be purified on a silica gel column using a chloroform / methanol / water solvent to obtain the desired diacylphosphatidylethanolamine.
  • a person skilled in the art can carry out by appropriately selecting column purification conditions such as a solvent composition ratio.
  • the terminally modified product examples include a diacylphosphatidylethanolamine terminally modified product in which one end of a divalent reactive compound is bonded to the amino group of diacylphosphatidylethanolamine.
  • a divalent reactive compound a compound having at least one aldehyde group or succinimide group capable of reacting with the amino group of diacylphosphatidylethanolamine can be used.
  • the divalent reactive compound having an aldehyde group include glyoxal, glutaraldehyde, succindialdehyde, terephthalaldehyde and the like.
  • glutaraldehyde is used.
  • dithiobis succinimidyl propionate
  • ethylene glycol-bis succinimidyl succinate
  • disuccinimidyl succinate disuccinimidyl suberate
  • disuccinimidyl glutarate examples include disuccinimidyl glutarate.
  • N-succinimidyl 4- p-maleimidophenyl butyrate, sulfosuccinimidyl-4- (p-maleimidophenyl) ) Butyrate, N-succinimidyl-4- (p-maleimidophenyl) acetate, N-succinimidyl-4- (p-maleimidophenyl) propionate, succinimidyl-4- (N-maleimidoethyl) -cyclohexane-1-carboxylate, sulfo Examples include succinimidyl-4- (N-maleimidoethyl) -cyclohexane-1-carboxylate, N- ( ⁇ -maleimidobutyryloxy) succinimide, N- ( ⁇ -maleimidocaproyloxy) succinimide, and the
  • a diacylphosphatidylethanolamine terminal modified product having a maleimide group as a functional group can be obtained.
  • a functional group at one end of the divalent reactive compound as described above can be bonded to the amino group of diacylphosphatidylethanolamine to obtain a diacylphosphatidylethanolamine terminal-modified product.
  • a liposome containing the above reactive phospholipid is prepared, and then the peptide of the present invention is added to bind the peptide to the reactive phospholipid of the liposome.
  • the method of doing can be mentioned.
  • the peptide of the present invention is previously bound to the reactive phospholipid, and then the resulting reactive phospholipid bound to the peptide of the present invention is stabilized with phospholipids other than the reactive phospholipid and liposomes.
  • a liposome having the peptide of the present invention bound to its surface can be obtained.
  • the phospholipid membrane constituting the liposome part of the peptide-bonded liposome of the present invention comprises an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond or a hydrocarbon group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond. It contains at least one, for example two or more, preferably three or more phospholipids.
  • the phospholipid membrane constituting the liposome part of the peptide-bonded liposome of the present invention includes diacylphosphatidylserine, diacylphosphatidylglycerol, diacylphosphatidic acid, diacylphosphatidylcholine, diacylphosphatidylethanolamine, succinimidyl-diacylphosphatidylethanolamine, and maleimide-diacyl At least one selected from phosphatidylethanolamine, for example, 2 or more, preferably 3 or more, an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond, or 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond A phospholipid having a hydrocarbon group.
  • the phospholipid membrane constituting the liposome part of the peptide-bonded liposome of the present invention is An acidic phospholipid having an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond or a hydrocarbon group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond; Neutral phospholipid having an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond or a hydrocarbon group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond, and 14 carbon atoms having one unsaturated bond It is preferable to contain at least one kind of reactive phospholipid each having ⁇ 24 acyl groups or C 14-24 hydrocarbon groups having one unsaturated bond.
  • sterols and tocopherols can be used as the liposome stabilizer.
  • the sterols may be those generally known as sterols, and examples thereof include cholesterol, sitosterol, campesterol, stigmasterol, and brassicasterol, and particularly preferably from the viewpoint of availability, Cholesterol is used.
  • tocopherol what is generally known as tocopherol should just be mentioned, For example, commercially available alpha-tocopherol is mentioned preferably from points, such as availability.
  • the phospholipid membrane constituting the liposome part of the peptide-bonded liposome of the present invention may contain a known component capable of constituting the liposome.
  • composition of the phospholipid membrane constituting the liposome portion of the peptide-bonded liposome of the present invention include the following: (A) a phospholipid having 1 to 99.8 mol% of an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond or a hydrocarbon group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond; (B) Liposome stabilizer 0.2-75 mol%
  • each component is expressed as mol% with respect to all components of the phospholipid membrane constituting the liposome part of the peptide-bonded liposome.
  • the content of the component (A) is preferably 10 to 90 mol%, more preferably 30 to 80 mol%, still more preferably 50 to 70 mol%, from the viewpoint of liposome stability.
  • the content of the component (B) is preferably 5 to 70 mol%, more preferably 10 to 60 mol%, still more preferably 20 to 50 mol%, from the viewpoint of liposome stability.
  • the content of the stabilizer exceeds 75 mol%, the stability of the liposome is impaired, which is not preferable.
  • the component (A) includes the following: (A) a phospholipid having an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond or a hydrocarbon group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond, to which the peptide of the present invention is not bound, And (b) a phospholipid having an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond or a hydrocarbon group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond, to which the peptide of the present invention is bound.
  • the content of the component (a) is usually 0.01 to 85 mol%, preferably 0.1 to 80 mol%, more preferably 0.1 to 60 mol%, still more preferably 0.1 to 50 mol%.
  • the content of the component (b) is usually 0.2 to 80 mol%, preferably 0.3 to 60 mol%, more preferably 0.4 to 50 mol%, still more preferably 0.5 to 25 mol%.
  • the content is less than 0.2 mol%, the amount of the peptide of the present invention decreases, so it becomes difficult to activate cytotoxic T lymphocytes to a practically sufficient level, and when it exceeds 80 mol%, Liposome stability is reduced.
  • the above component (a) phospholipid usually contains the above-mentioned acidic phospholipid and neutral phospholipid. Moreover, the above-mentioned reactive phospholipid is contained in the phospholipid of the said component (b).
  • the content of acidic phospholipid is usually 1 to 85 mol%, preferably 2 to 80 mol%, more preferably 4 to 60 mol%, and further preferably 5 to 40 mol%.
  • the content is less than 1 mol%, the zeta potential is reduced, the stability of the liposome is lowered, and it becomes difficult to activate cytotoxic T lymphocytes to a practically sufficient level.
  • the content exceeds 85 mol%, as a result, the content of the phospholipid bound to the peptide of the present invention in the liposome decreases, and cytotoxic T lymphocytes are activated to a practically sufficient level. It becomes difficult.
  • the content of neutral phospholipid is usually 0.01 to 80 mol%, preferably 0.1 to 70 mol%, more preferably 0.1 to 60 mol%, and still more preferably 0.1 to 50 mol%.
  • the content exceeds 80.0 mol% the content of acidic phospholipids contained in liposomes, phospholipids bound with the peptides of the present invention and liposome stabilizers is reduced, and cytotoxic T is reduced to a practically sufficient level. It becomes difficult to activate lymphocytes.
  • the phospholipid to which the peptide of the present invention is bound is obtained by binding the peptide of the present invention to the reactive phospholipid, and the ratio of the reactive phospholipid to the peptide of the present invention is the effect of the present invention.
  • the type of functional group used for bonding, the bonding treatment conditions, and the like can be selected as appropriate.
  • a divalent reactive compound for example, when using a terminal modified form of diacylphosphatidylethanolamine obtained by binding one end of disuccinimidyl succinate, a divalent reactive compound, to the terminal amino group of diacylphosphatidylethanolamine as a reactive phospholipid, Depending on the choice of binding treatment conditions, 10-99% of the reactive phospholipids can be bound to the peptides of the invention. In this case, the reactive phospholipid not bound to the peptide of the present invention is converted into an acidic phospholipid and contained in the liposome.
  • Preferred embodiments of the phospholipid membrane constituting the liposome part of the peptide-bonded liposome of the present invention can include the following compositions: (I) 1 to 85 mol% of acidic phospholipid having an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond or a hydrocarbon group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond; (II) 0.01 to 80 mol% of a neutral phospholipid having an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond or a hydrocarbon group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond; (III) Phospholipids having a C 14-24 acyl group having one unsaturated bond or a C 14-24 hydrocarbon group having one unsaturated bond, to which the peptide of the present invention is bound 0.2-80 Mol%; (IV) Liposome stabilizer 0.2-75 mol%. (Total 100 mol%)
  • the following composition can be mentioned: Ingredient (I) 2-80 mol% Ingredient (II) 0.1-70 mol% Ingredient (III) 0.3-60 mol% Ingredient (IV) 10-70 mol% (Total 100 mol%)
  • the following composition can be mentioned: Ingredient (I) 4-60 mol% Ingredient (II) 0.1-60 mol% Ingredient (III) 0.4-50 mol% Ingredient (IV) 20-60 mol% (Total 100 mol%)
  • Particularly preferred embodiments of the phospholipid membrane constituting the liposome portion of the peptide-bonded liposome of the present invention can include the following compositions: Ingredient (I) 5-40 mol% Ingredient (II) 0.1-50 mol% Ingredient (III) 0.5-25 mol% Ingredient (IV) 25-55 mol% (Total 100 mol%)
  • the peptide-bonded liposome of the present invention is characterized in that the unsaturated acyl group or unsaturated hydrocarbon group contained in the phospholipid in the phospholipid membrane constituting the liposome part has 14 to 24 carbon atoms.
  • a phospholipid containing an unsaturated acyl group or unsaturated hydrocarbon group having less than 14 or more than 24 carbon atoms may be included as long as the effects of the invention are not hindered.
  • the carbon number is 14 to 24 with respect to the total number of all unsaturated acyl groups or unsaturated hydrocarbon groups contained in the phospholipid in the phospholipid membrane constituting the liposome part of the peptide-bonded liposome of the present invention.
  • the ratio of the number of saturated acyl groups or unsaturated hydrocarbon groups is, for example, 50% or more, preferably 60% or more, more preferably 75% or more, still more preferably 90% or more, and most preferably 97% or more (for example, substantially 100%).
  • the phospholipid membrane constituting the liposome portion of the peptide-bonded liposome of the present invention is a non-phospholipid lipid having an acyl group or a hydrocarbon group having 14 to 24 carbon atoms as long as the effects of the present invention are not hindered. May be included.
  • the content of the lipid is usually 40 mol% or less, preferably 20 mol% or less, more preferably 10 mol% or less, still more preferably 5 mol% or less (for example, substantially 0 mol%).
  • the liposome portion of the peptide-bonded liposome of the present invention is appropriately mixed and processed using the constituent components of phospholipid, reactive phospholipid, liposome stabilizer, peptide of the present invention, etc. It can be obtained by a method such as addition. Extrusion method, vortex mixer method, ultrasonic method, surfactant removal method, reverse phase evaporation method, ethanol injection method, prevesicle method, French press method, W / O / W emulsion method, annealing method, freeze-thaw And other manufacturing methods.
  • the form of the liposome is not particularly limited, and liposomes having various sizes and forms such as multilamellar liposomes, small unilamellar liposomes and large unilamellar liposomes are produced by appropriately selecting the above-described liposome production method. be able to.
  • the particle size of the liposome is not particularly limited, but from the viewpoint of storage stability, the particle size is 20 to 600 nm, preferably 30 to 500 nm, and then preferably 40 to 400 nm, and more preferably Is from 50 to 300 nm, most preferably from 70 to 230 nm.
  • a saccharide or a polyhydric alcohol is added to the inner aqueous phase and / or the outer aqueous phase of the liposome after the liposome preparation process or after the preparation. Also good.
  • a phospholipid composition freeze-dried product is prepared by adding or dissolving sugar or a polyhydric alcohol as a liposome protective agent and removing water by freeze-drying. It is preferable that
  • saccharide examples include monosaccharides such as glucose, galactose, mannose, fructose, inositol, ribose and xylose; disaccharides such as saccharose, lactose, cellobiose, trehalose and maltose; trisaccharides such as raffinose and melezitose; oligosaccharides such as cyclodextrin Sugar; polysaccharides such as dextrin; sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, mannitol, maltitol and the like.
  • monosaccharides or disaccharides are preferable, and glucose or saccharose is more preferable in terms of availability.
  • polyhydric alcohols examples include glycerin-based compounds such as glycerin, diglycerin, triglycerin, tetraglycerin, pentaglycerin, hexaglycerin, heptaglycerin, octaglycerin, nonaglycerin, decaglycerin, polyglycerin; sorbitol, mannitol Sugar alcohol compounds such as ethylene glycol, diethylene glycol, triethylene glycol, tetraethylene glycol, pentaethylene glycol, hexaethylene glycol, heptaethylene glycol, octaethylene glycol, nonaethylene glycol and the like.
  • glycerin-based compounds such as glycerin, diglycerin, triglycerin, tetraglycerin, pentaglycerin, hexaglycerin, heptaglycerin, octaglycerin, nonaglycerin, decaglycerin
  • glycerin, diglycerin, triglycerin, sorbitol, mannitol, and polyethylene glycol having a molecular weight of 400 to 10,000 are preferable from the viewpoint of availability.
  • concentration of saccharides or polyhydric alcohols contained in the inner aqueous phase and / or outer aqueous phase of the liposome is, for example, 1 to 20% by weight, preferably 2 to 10% by weight, based on the weight of the liposome liquid. Can be mentioned.
  • the peptide-bonded liposome of the present invention can be easily obtained by preparing the liposome before binding the peptide of the present invention and then binding the peptide of the present invention.
  • a liposome suspension containing a phospholipid, a liposome stabilizer, and a reactive phospholipid for binding the peptide of the present invention to the membrane surface is prepared, and one of the aforementioned sugars is added to the outer aqueous phase. Add about 2 to 10% by weight of sucrose and dissolve.
  • This sugar-added preparation is transferred to a 10 ml glass vial, placed in a shelf-type freeze dryer, cooled to ⁇ 40 ° C.
  • a freeze-dried product is obtained by a conventional method.
  • the liposome freeze-dried product obtained here can be stored for a long period of time because the water has been removed.
  • the final step of the present invention can be performed by adding a specific peptide of the present invention and performing the subsequent steps.
  • a simple peptide-bonded liposome can be obtained easily and rapidly. In the case where the interaction between the peptide of the present invention and the liposome is strong and unstable, etc., it is very useful to store it at the lyophilized product of the liposome and bind the peptide of the present invention when necessary. Convenient.
  • the phospholipid membrane constituting the liposome part of the peptide-bonded liposome of the present invention can have a phospholipid to which the peptide of the present invention is bound.
  • Examples of a method for obtaining a liposome containing a phospholipid to which the peptide of the present invention is bound include the following methods (A) and (B).
  • a liposome containing a phospholipid, a reactive lipid, and a liposome stabilizer is prepared, the peptide of the present invention and a divalent reactive compound are added thereto, and the reactive phospholipid contained in the liposome is added.
  • the divalent reactive compound that can be used here can be the same as that used in the preparation of the terminal modified form of the reactive phospholipid.
  • Specific examples of the divalent reactive compound having an aldehyde group include glyoxal, glutaraldehyde, succindialdehyde, and terephthalaldehyde.
  • glutaraldehyde is used.
  • N-succinimidyl-4- (p-maleimidophenyl) butyrate N-succinimidophenyl butyrate
  • sulfosuccinimidyl-4- (p-maleimide) Phenyl) butyrate N-succinimidyl-4- (p-maleimidophenyl) acetate
  • N-succinimidyl-4- (p-maleimidophenyl) propionate succinimidyl-4- (N-maleimidoethyl) -cyclohexane-1-carboxylate
  • Use of sulfosuccinimidyl-4- (N-maleimidoethyl) -cyclohexane-1-carboxylate N- ( ⁇ -maleimidobutyryloxy) succinimide, N- ( ⁇ -maleimidocaproyloxy) succinimide,
  • a terminal modified product of a reactive phospholipid having a maleimide group as a functional group for example, phosphatidylethanolamine
  • a functional group for example, phosphatidylethanolamine
  • a liposome containing a phospholipid, a reactive phospholipid, and a liposome stabilizer is prepared, and the peptide of the present invention is added thereto.
  • the functional group of the reactive phospholipid contained in the liposome A method of linking and bonding functional groups of peptides.
  • Examples of the type of bond in (A) and (B) include an ionic bond, a hydrophobic bond, and a covalent bond, and a covalent bond is preferable.
  • Specific examples of the covalent bond include a Schiff base bond, an amide bond, a thioether bond, and an ester bond.
  • a specific example of the method of binding the liposome as a raw material and the peptide of the present invention via a divalent reactive compound is, for example, a method using a Schiff base bond.
  • a method of binding the liposome and the peptide of the present invention via a Schiff base bond a liposome having an amino group on the surface is prepared, the peptide of the present invention is added to the suspension of the liposome, and then 2
  • An example is a method in which dialdehyde is added as a valence-reactive compound, and the amino group on the surface of the liposome and the amino group in the peptide of the present invention are bound via a Schiff base.
  • a reactive phospholipid eg, phosphatidylethanolamine
  • a liposome raw material lipid phospholipid, liposome stabilizer, etc.
  • a reactive phospholipid having a functional group capable of forming an amide bond, a thioether bond, a Schiff base bond, an ester bond, etc. is applied to the phospholipid membrane constituting the liposome.
  • the method to introduce is mentioned.
  • Specific examples of such functional groups include succinimide group, maleimide group, amino group, imino group, carboxyl group, hydroxyl group, thiol group and the like.
  • the reactive phospholipid introduced into the phospholipid membrane constituting the liposome include the above-mentioned 14 to 24 carbon acyl groups having one unsaturated bond or 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond.
  • a terminal modified product of the amino group of a reactive phospholipid having a hydrocarbon group eg, phosphatidylethanolamine
  • (B-1) A diacylphosphatidylethanolamine having a C 14-24 acyl group having one unsaturated bond and disuccinimidyl succinate are reacted only at one end by a known method, and a succinimide group as a functional group To a disuccinimidyl succinate linked diacyl phosphatidylethanolamine.
  • B-2 The disuccinimidyl succinate-bound diacylphosphatidylethanolamine and other liposome constituents (phospholipid, liposome stabilizer, etc.) are mixed by a known method, and a succinimide group as a functional group on the surface To make liposomes.
  • B-3 The peptide of the present invention is added to the liposome suspension, and the amino group in the peptide of the present invention is reacted with the succinimide group on the liposome surface.
  • B-4) Unreacted peptide of the present invention, reaction by-products, etc. are removed by a method such as gel filtration, dialysis, ultrafiltration, centrifugation, etc., and the liposome containing the peptide-bound phospholipid of the present invention is removed. A suspension is obtained.
  • a Schiff base bond can be formed by reacting with an succinimide group.
  • a thiol group is intended, a thioether bond can be formed by reacting with a maleimide group.
  • HLA preferably HLA-A * 0201 or HLA-A * 2402
  • HLA restrictively and specifically recognizes the peptide of the present invention (preferably the epitope peptide of the present invention).
  • CTL cytotoxic T lymphocytes
  • cytotoxic T lymphocytes induced by the peptide of the present invention and peptide-bound liposomes kill and remove cells presenting the peptide of the present invention on HLA. Therefore, the peptides and peptide-bound liposomes of the present invention are useful as cytotoxic T lymphocyte activators and avian influenza virus vaccines.
  • the peptides of the present invention contain highly conserved epitopes in continuous and discontinuous mutants of avian influenza virus. Therefore, the peptides and peptide-bound liposomes of the present invention are useful as vaccines against various types of [(H1 to H16) ⁇ (N1 to N9)] avian influenza viruses, and in particular, highly pathogenic avian influenza viruses (H5N1 Type). The peptides and peptide-bound liposomes of the present invention are useful as vaccines against various mutant strains.
  • the peptide of the present invention or peptide-bound liposome When used as a cytotoxic T lymphocyte activator or avian influenza virus vaccine, it can be formulated according to conventional means.
  • the peptides and peptide-bonded liposomes of the present invention have low toxicity and can be used as a liquid or as a pharmaceutical composition in an appropriate dosage form as a human or non-human mammal (eg, rat, rabbit, sheep, pig, cow, cat, Dogs, monkeys, etc.), birds (chicken, geese, ducks, ostriches, quail, etc.) and the like can be administered orally or parenterally (eg, intravascular administration, subcutaneous administration, etc.).
  • a human or non-human mammal eg, rat, rabbit, sheep, pig, cow, cat, Dogs, monkeys, etc.
  • birds chicken, geese, ducks, ostriches, quail, etc.
  • parenterally e
  • the animals to which the peptides of the present invention and peptide-bonded liposomes are administered are usually mammals and birds that can be infected with the target avian influenza virus.
  • the peptides and peptide-bound liposomes of the present invention are usually administered parenterally.
  • the cytotoxic T lymphocyte activator and avian influenza virus vaccine of the present invention may be administered as an active ingredient peptide or peptide-bound liposome itself, or may be administered as an appropriate pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition used for administration may contain the peptide or peptide-bound liposome and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient. Such a pharmaceutical composition is provided as a dosage form suitable for oral or parenteral administration.
  • injections are dosage forms such as intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, infusions, and the like. May be included.
  • Such an injection can be prepared according to a known method.
  • a method for preparing an injection it can be prepared, for example, by dissolving or suspending the peptide or peptide-bound liposome in a sterile aqueous solvent usually used for injection.
  • the aqueous solvent for injection include distilled water; physiological saline; phosphate buffer, carbonate buffer, Tris buffer, acetate buffer, and other buffer solutions.
  • the pH of such an aqueous solvent is 5 to 10, preferably 6 to 8.
  • the prepared injection solution is preferably filled in a suitable ampoule.
  • the peptide preparation of the present invention or the powder preparation of the peptide-binding liposome of the present invention can be obtained by subjecting the solution of the peptide of the present invention or the suspension of the peptide-binding liposome of the present invention to a treatment such as vacuum drying or freeze drying. It can also be prepared.
  • the peptide of the present invention or the peptide-bonded liposome of the present invention is stored in a powder state, and can be used by dispersing the powder with an aqueous solvent for injection at the time of use.
  • the cytotoxic T lymphocyte activator and avian influenza virus vaccine of the present invention may further contain an adjuvant in order to enhance the effect.
  • the adjuvant include aluminum hydroxide gel, complete Freund's adjuvant, incomplete Freund's adjuvant, Bordetella pertussis adjuvant, poly (I, C), CpG-DNA and the like, and CpG-DNA is particularly preferable.
  • CpG-DNA is a DNA containing a bacterial unmethylated CpG motif and is known to act as a ligand for a specific receptor (Toll-like receptor 9) (for details, see Biochim. Biophys. Acta 1489, 107- 116 (1999) and Curr. Opin. Microbiol. 6, 472-477 (2003)).
  • CpG-DNA can enhance the induction of cytotoxic T lymphocytes by the peptides or peptide-bound liposomes of the present invention by activating dendritic cells (DC).
  • DC dendritic cells
  • the content of the active ingredient (the peptide of the present invention or peptide-bound liposome) in the pharmaceutical composition is usually about 0.1 to 100% by weight, preferably about 1 to 99% by weight, more preferably about 10% by weight of the whole pharmaceutical composition. About 90% by weight.
  • the content of the adjuvant is within a range that can enhance the induction of cytotoxic T lymphocytes.
  • the content of the adjuvant eg, CpG-DNA
  • it is usually about 0.01 to 10% by weight, preferably about 0.1 to 5% by weight of the whole pharmaceutical composition.
  • the dose of the peptide of the present invention or the peptide-bonded liposome of the present invention varies depending on the subject to be administered, the administration method, the dosage form, etc., and for example, activates cytotoxic T lymphocytes in vivo by subcutaneous administration or nasal administration.
  • cytotoxic T lymphocytes in vivo by subcutaneous administration or nasal administration.
  • the peptide of the present invention is in the range of 1 ⁇ g to 1000 ⁇ g, preferably in the range of 20 ⁇ g to 100 ⁇ g, usually for 4 weeks to 18 months. Administer 2 to 3 times.
  • Example 1 Searching for CTL epitopes From the amino acid sequences of eight viral internal proteins (M1, M2, NP, NS1, NS2, PA, PB1, PB2) of the highly pathogenic avian influenza virus A / Hong_Kong / 483/97 (H5N1) strain, Binds to HLA-A * 0201 or HLA-A * 2402, one of the major human histocompatibility complex (MHC) class I molecules, and is expected to have antigenicity against killer T cells (CTL) Epitope search was performed using the following four types of prediction programs available on the net.
  • MHC major human histocompatibility complex
  • NetCTL server 1.2 http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/) b.nHLAPred (http://www.imtech.res.in/raghava/nhlapred/) c. BIMAS (http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/) d. SYFPEITHI (http://www.syfpeithi.de/home.htm)
  • PB1_410 GMFNMLSTV (SEQ ID NO: 1)
  • PA_130 YYLEKANKI (SEQ ID NO: 2)
  • PA_262 KTTPRPLRL (SEQ ID NO: 3)
  • PB1_430 RYTKTTYWW (sequence number 4)
  • PB1_482 SYINRTGTF (SEQ ID NO: 5)
  • PB1_688 MYQKCCTLF (SEQ ID NO: 6)
  • PB2_322 SFSFGGFTF (SEQ ID NO: 8)
  • PB1_216 SYLIRALTL (SEQ ID NO: 9)
  • M2_40 LWILDRLFF (SEQ ID NO: 16), PB2_117: TYFEKVERL (SEQ ID NO: 17),
  • PB1_331 EWFRNVLSI
  • the solvent was distilled off under reduced pressure using a rotary evaporator to form a lipid thin film. Further, 30 ml of distilled water for injection was added and stirred to obtain a uniform slurry. This slurry was frozen and dried in a freeze dryer for 24 hours to obtain a lipid mixed powder.
  • Example 3 Preparation of liposome preparation 1.5 ml of the liposome of Example 2 (preparation of liposome) was collected in a test tube, and 3 ml of each peptide solution (1.25 mM, buffer solution) prepared separately was added, and then gently at 48C for 48 hours. And reacted. This reaction solution was subjected to gel filtration according to a conventional method using Sepharose CL-4B equilibrated with a buffer solution. Since the liposome fraction is cloudy, the target fraction can be easily confirmed, but it may be confirmed with a UV detector or the like.
  • the phosphorus concentration in the liposome suspension obtained here was measured (Phospholipid Test Wako), and the concentration of the phospholipid-derived phosphorus was diluted with a buffer solution so that the phosphorus concentration derived from the suspension was suspended in each peptide-bound liposome. A liquid was obtained.
  • transgenic mice that do not have the original MHC class I molecules (H2-D and H2-K) and that express the HLA-A * 0201 molecule for the peptide of SEQ ID NO: 1 (HHD mice)
  • transgenic mice A24Tg expressing HLA-A * 2402 molecules were combined with each candidate peptide (200 ⁇ l / 0.5 ⁇ g / ⁇ l) bound to oleic acid liposomes and CpG5002 (5′-TCCATGACGTTCTGATGTT-3 ′ (SEQ ID NO: 23); for details, see Vaccine 25, 4914-4921 (2007)) (10 ⁇ g / animal) and immunized twice at weekly intervals.
  • target cells (5 ⁇ 10 5 A24Tg mouse spleen cells / mouse) labeled with the immunized peptide (0.5 ⁇ M) and fluorescent dye (CFDA-SE) were intravenously administered with the control, and 16 hours later After euthanasia, the spleen was collected, and the reduction rate of the target cells therein was analyzed by a flow cytometer.
  • immunized peptide 0.5 ⁇ M
  • CFDA-SE fluorescent dye
  • Spleen Adherent Cells SAC
  • CD4 + and CD8 + T Cells Spleen cell suspensions were prepared using RPMI-1640 containing 10% FCS.
  • Cells (5 ⁇ 10 7 cells) in medium containing 5 ml of 10% FCS are seeded in a 50 mm plastic tissue culture dish (No. # 3002; Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ) and humidified 5% CO 2 atmosphere The mixture was incubated at 37 ° C. for 2 hours. After culture, non-adherent cells were removed by gentle washing in warm medium, and then adherent cells were collected with a cell scraper.
  • T cells Purification of CD4 + and CD8 + T cells from spleen cells (SC) of mice immunized with each peptide-alum was obtained by magnetic cell sorter system MACS according to the manufacturer's protocol, anti-CD4 and anti-CD8 antibody coated microbeads (Miltenyi Biotec GmbH). T cells were suspended in RPMI-1640 containing 10% FCS at a cell density of 2 ⁇ 10 6 ml.
  • CFDA-SE In vivo cytotoxicity assay (measurement of CTL activity)
  • the mouse spleen cells were labeled with 0.5 or 5 ⁇ M CFDA-SE (Sigma) for 15 minutes at room temperature and washed twice.
  • CFDA-SE bright (M2) cells were pulsed with 0.5 ⁇ g / ml of each peptide for 90 minutes at 37 ° C.
  • CFDA-SE dark cells (M1) were pulsed with irrelevant NP366-374 (ASNENMDAM) peptide for 90 minutes at 37 ° C. as a control.
  • PB1_410 GMFNMLSTV (SEQ ID NO: 1), PA_130: YYLEKANKI (SEQ ID NO: 2), PA_262: KTTPRPLRL (SEQ ID NO: 3), PB1_430: RYTKTTYWW (SEQ ID NO: 4), PB1_482: SYINRTGTF (SEQ ID NO: 5), PB1_688: MYQKCCTLF (SEQ ID NO: 6), PB2_549: TYQWIIRNW (SEQ ID NO: 7), PB2_322: SFSFGGFTF (SEQ ID NO: 8), PB1_216: SYLIRALTL (SEQ ID NO: 9) showed high CTL activity, but M2_40: LWILDRLFF (SEQ ID NO: 16), PB2_117: TYFEKVERL (SEQ ID NO: 17), PB1_331: EWFRNVLSI (SEQ ID NO:
  • Example 5 Intracellular cytokine staining was performed as described in J Virol 78, 9093-9104 (2004). 50 ⁇ l of the following peptides (PB1_410, PA_130, PB1_430, PB2_549) 0.7 ⁇ g / ⁇ l or 50 ⁇ l of the liposome bound with the peptide prepared according to Example 3 was administered by fp in the presence of 5 ⁇ g CpG, and one week later, comfort After killing, the spleen was collected, and 2 ⁇ 10 6 spleen cells were present in the presence of brefeldin A (GolgiPlug TM , BD Biosciences, San Jose, Calif.) For 5 hours at 37 ° C.
  • brefeldin A GolgiPlug TM , BD Biosciences, San Jose, Calif.
  • Example 6 The virus infection resistance test was conducted as follows. 5 mg each of PA_130 and PB2_549 in DDW were coupled to liposomes in the same manner as in Example 3 using disuccinimidyl suberate-dioleoylphosphatidylethanolamine (DSS-Ole). 50 ⁇ l or 100 ⁇ l of peptide-bound liposome per mouse was administered by fp in the presence of 5 ⁇ g CpG. One week later, ketamine (175 mg / g weight) (Sigma-Aldrich) and xylazine (3.5 mg / g weight) (Bayer Holding Ltd.
  • DSS-Ole disuccinimidyl suberate-dioleoylphosphatidylethanolamine
  • mice were euthanized 5 days after virus inoculation and virus titers in their lungs were measured using Cottey R, Rowe CA, Bender BS (2001) Influenza virus.
  • TCID50 In Current Protocols in Immunology. John Wiley & Sons, Determined by measuring TCID50 using MDCK cells as described in Inc. 19.11.1-19.11.32.
  • the lung was homogenized in 1 ml PBS, and the homogenate was centrifuged at 2,000 rpm for 10 minutes to precipitate fragments.
  • a 10-fold dilution series of the homogenate was prepared in a U-shaped bottom 96-well plate, 5 wells per dilution. Dilution series were prepared from 10 -1 to 10 -7 with DMEM containing 5% FCS. MDCK cells in D-5 was added to all wells (2.5 ⁇ 10 4 cells / well), under 5% C0 2, and incubated at 35 ° C..
  • the peptide used was derived from the highly pathogenic avian influenza virus A / Hong_Kong / 483/97 (H5N1), but the high-efficiency infection-inhibiting effect described above was shown against H3N2 viruses with different subtypes. From this, the effect of the peptide-bonded liposome of the present invention as a prependemimic vaccine was proved.
  • a highly pathogenic avian influenza virus that is highly likely to cause a pandemic can be provided with a highly effective vaccine that is not easily affected by the surface protein mutation.
  • the avian influenza vaccine of the present invention when the actual epidemic strain (type / subtype) is different from the prediction, it can overcome the weaknesses of the current prepandemic vaccine, which would have a limited effect. Can provide a pre-pandemic vaccine.
  • the present invention is based on Japanese Patent Application No. 2008-303444 filed on Nov. 28, 2008, the entire contents of which are included in the present specification.

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Abstract

　本発明は、ペプチドが結合したリポソームを含む鳥インフルエンザウイルスワクチンであって、 該ペプチドが、（１）配列番号１～９のいずれかで表されるアミノ酸配列、又は（２）配列番号１～９のいずれかで表されるアミノ酸配列において、1又は2個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含み、 9～11アミノ酸の長さを有し、且つ HLAに拘束された細胞傷害性Tリンパ球を誘導し得るものであり； 該リポソームが、不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有するリン脂質、及びリポソームの安定化剤を含有し；且つ 該リポソームの表面に該ペプチドが結合している、 鳥インフルエンザウイルスワクチンを提供する。

Description

鳥インフルエンザワクチン
　本発明は、鳥インフルエンザワクチンとして有用なペプチド、ペプチド結合リポソーム、及びそれらの用途に関する。
　インフルエンザウイルスは、表面の抗原性を連続変異で変化させ、毎年流行を引き起こしている。加えて約10年から40年の周期で、それらとは不連続変異により全く異なる抗原性の新型のウイルスが出現し、その新型のウイルスに対する免疫を有しない人類に、世界的大流行（以下「パンデミック」という）を引き起こしてきた。
　過去のスペイン風邪、香港風邪等のパンデミックは鳥インフルエンザウイルスに由来するものであった可能性が高いといわれており、将来鳥インフルエンザによって500万～1億5000万人の死者が出る可能性があるとの試算結果もある。現在致死率の高い高病原性鳥インフルエンザ（H5N1）の感染が世界各地で報告されてきており、有効な対策が急務となっている。
　鳥インフルエンザウイルスを含め、一般的に、インフルエンザウイルスは増殖の過程で突然変異を起こしやすい。更に、人間に感染したウイルスが体内でヒトインフルエンザウイルスと遺伝子再集合をした場合、高病原性を保持したまま人間同士での感染力の高いウイルスが生まれる可能性もある。こういったウイルス本体の頻繁な変化が、上記のような流行を繰り返す原因となっている。
　点突然変異（抗原連続変異）はウイルス表面糖タンパク質[ヘマグルチニン（赤血球凝集素；HA）及びノイラミニダーゼ（NA）]をコードする遺伝子に生じ、抗原の不連続変異では両遺伝子が免疫学的に異なった新規の株が生じることになる。
　従来のワクチンでは、インフルエンザウイルスの表面タンパク質に特異的に結合する抗体の産生を誘導し、この抗体の作用によってウイルスの感染能力を失わせる。しかしながら上記のように表面タンパク質は変異しやすく、このようなワクチンによって誘導される抗体が必ずしも常に有効なわけではなかった。現状では、流行するウイルスの型を予想してワクチンを準備しているが、その予想が外れ、被害が拡大することもあり得る。
　他方、インフルエンザウイルスの内部タンパク質は連続変異株及び不連続変異株内でも比較的高度に保存されるが、これにウイルス外部から抗体を結合させて失活させることは困難であり、従来のワクチンの標的として積極的には用いられてこなかった。
　ウイルスが感染した細胞はウイルス内部タンパク質のアミノ酸配列の1部を組み込んだ主要組織適合抗原複合体（MHC）を細胞表面に露出する。このような特徴を示すウイルス感染細胞を特異的に殺傷できる細胞傷害性Tリンパ球を調製できれば、それによって変異に影響されずにウイルスの複製、ひいては増殖及び拡散を効果的に防ぐことができる。
　特許文献１には、抗原が結合したリポソームを用いて、病原体感染細胞又は癌細胞を殺傷するための細胞傷害性Tリンパ細胞（CD8+T細胞、サイトトキシックリンホサイト：CTL）を効率よく特異的に増強することができ、感染症や癌の予防・治療に有用なT細胞活性化剤の調製法が開示されている。しかし、実際に鳥インフルエンザウイルスの感染防御に有効となり得るのか、更には有効な細胞傷害性Tリンパ球を調製するためには、どのような抗原を用いたらよいのかは、全く明らかではなかった。
特開2008-37831号公報
　本発明が解決しようとする課題は、ウイルス突然変異の影響を受けにくい、高病原性鳥インフルエンザウイルスの感染を効果的に予防するためのワクチンを提供することである。
　本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、高病原性鳥インフルエンザウイルスの、保存性の高い内部タンパク質配列中に、上記細胞傷害性Tリンパ球の調製に特別に有効な抗原エピトープを見出した。更に、このエピトープを含むペプチドが結合したリポソームによりワクチン接種を行うと、極めて強力に抗原特異的な細胞傷害性Tリンパ球を誘導し得ることを見出し、本発明を完成させた。
　即ち、本発明は以下に示すとおりである。
［１］　HLAに拘束された細胞傷害性Tリンパ球を誘導し得るペプチドであって、（１）配列番号７、３又は８のいずれかで表されるアミノ酸配列、或いは（２）配列番号７、３又は８のいずれかで表されるアミノ酸配列において、1又は2個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含み、且つ9～11アミノ酸の長さを有する、ペプチド。
［２］　HLAがHLA－A＊0201又はHLA－A＊2402である、［１］記載のペプチド。
［３］　ペプチドが結合したリポソームであって、
該ペプチドが、（１）配列番号１～９のいずれかで表されるアミノ酸配列、又は（２）配列番号１～９のいずれかで表されるアミノ酸配列において、1又は2個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含み、
9～11アミノ酸の長さを有し、且つ
HLAに拘束された細胞傷害性Tリンパ球を誘導し得るものであり；
該リポソームが、不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有するリン脂質、及びリポソームの安定化剤を含有し；且つ
該リポソームの表面に該ペプチドが結合している、
ペプチド結合リポソーム。
［４］　HLAがHLA－A＊0201又はHLA－A＊2402である、［３］記載のペプチド結合リポソーム。
［５］　リン脂質が、不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基を有するリン脂質である、［３］記載のペプチド結合リポソーム。
［６］　アシル基がオレオイル基である、［３］記載のペプチド結合リポソーム。
［７］　リン脂質が、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジン酸、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、サクシンイミジル－ジアシルホスファチジルエタノールアミン、及びマレイミド－ジアシルホスファチジルエタノールアミンから選ばれる少なくとも１つである、［３］記載のペプチド結合リポソーム。
［８］　リポソームの安定化剤がコレステロールである、［３］記載のペプチド結合リポソーム。
［９］　ペプチドが、リポソームを構成するリン脂質膜に含まれる不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有するリン脂質に結合している、［３］記載のペプチド結合リポソーム。
［１０］　リポソームが以下の組成を有する、［３］記載のペプチド結合リポソーム：
（Ａ）不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有するリン脂質　　1～99.8モル%；
（Ｂ）リポソームの安定化剤　　0.2～75モル%。
［１１］　リポソームが以下の組成を有する、［３］記載のペプチド結合リポソーム：
(I)不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有する酸性リン脂質　　1～85モル%；
(II)不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有する中性リン脂質　　0.01～80モル%；
(III)ペプチドが結合した、不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有するリン脂質　　0.2～80モル%；
(IV)リポソームの安定化剤　　0.2～75モル%。
［１２］　ペプチドを含む、細胞傷害性Tリンパ球活性化剤であって、
該ペプチドが、（１）配列番号１～９のいずれかで表されるアミノ酸配列、又は（２）配列番号１～９のいずれかで表されるアミノ酸配列において、1又は2個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含み、
9～11アミノ酸の長さを有し、且つ
HLAに拘束された細胞傷害性Tリンパ球を誘導し得るものである、
細胞傷害性Tリンパ球活性化剤。
［１３］　［３］記載のペプチド結合リポソームを含む、細胞傷害性Tリンパ球活性化剤。
［１４］　更にCpG－DNAを含有することを特徴とする、［１２］又は［１３］記載の細胞傷害性Tリンパ球活性化剤。
［１５］　ペプチドを含む、鳥インフルエンザウイルスワクチンであって、
該ペプチドが、（１）配列番号１～９のいずれかで表されるアミノ酸配列、又は（２）配列番号１～９のいずれかで表されるアミノ酸配列において、1又は2個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含み、
9～11アミノ酸の長さを有し、且つ
HLAに拘束された細胞傷害性Tリンパ球を誘導し得るものである、
鳥インフルエンザウイルスワクチン。
［１６］　［３］記載のペプチド結合リポソームを含む、鳥インフルエンザウイルスワクチン。
［１７］　更にCpG－DNAを含有することを特徴とする、［１５］又は［１６］記載の鳥インフルエンザウイルスワクチン。
［１８］　細胞傷害性T細胞の活性化において使用するためのペプチドであって、
該ペプチドが、（１）配列番号１～９のいずれかで表されるアミノ酸配列、或いは（２）配列番号１～９のいずれかで表されるアミノ酸配列において、1又は2個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含み、
9～11アミノ酸の長さを有し、且つ
HLAに拘束された細胞傷害性Tリンパ球を誘導し得るものである、ペプチド。
［１９］　細胞傷害性T細胞の活性化において使用するための、［３］記載のペプチド結合リポソーム。
［２０］　細胞傷害性T細胞の活性化において使用するための、［３］記載のペプチド結合リポソーム及びCpG-DNAを含有する医薬組成物。
［２１］　鳥インフルエンザに対するワクチン接種において使用するためのペプチドであって、
該ペプチドが、（１）配列番号１～９のいずれかで表されるアミノ酸配列、或いは（２）配列番号１～９のいずれかで表されるアミノ酸配列において、1又は2個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含み、
9～11アミノ酸の長さを有し、且つ
HLAに拘束された細胞傷害性Tリンパ球を誘導し得るものである、ペプチド。
［２２］　鳥インフルエンザに対するワクチン接種において使用するための、［３］記載のペプチド結合リポソーム。
［２３］　鳥インフルエンザに対するワクチン接種において使用するための、［３］記載のペプチド結合リポソーム及びCpG-DNAを含有する医薬組成物。
　本発明のペプチド及びペプチド結合リポソームを用いることにより、保存性が高い鳥インフルエンザウイルスの内部タンパク質由来の抗原から鳥インフルエンザワクチンを調製できる。本発明により、従来の鳥インフルエンザワクチンとは異なる、ウイルス表面タンパク質変異の影響を受けにくく、流行ウイルス株（型・亜型）の正確な予測を要しない、汎用性の高い鳥インフルエンザワクチンを提供できる。
　本発明は、HLAに拘束された細胞傷害性Tリンパ球を誘導し得るペプチドであって、（１）配列番号１～９のいずれかで表されるアミノ酸配列、又は（２）配列番号１～９のいずれかで表されるアミノ酸配列において、1又は2個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含み、且つ9～11アミノ酸の長さを有する、ペプチド（本発明のペプチド）を提供する。
　本発明は、高病原性鳥インフルエンザウイルス抗原中に以下の優れたエピトープ配列（本発明のエピトープ配列）を見出したことに基づき完成されたものである：
・　配列番号１～９のいずれかで表されるアミノ酸配列
・　配列番号１～９のいずれかで表されるアミノ酸配列において、1又は2個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列（ここで、該アミノ酸配列からなるペプチドがHLAに拘束された細胞傷害性Tリンパ球を誘導し得る）。
　配列番号１～９で表されるアミノ酸配列は、高病原性鳥インフルエンザウイルスA/Hong_Kong/483/97(H5N1)の内部タンパク質、PA（配列番号２及び３）、PB1（配列番号１、４、５、６及び９）及びPB2（配列番号７及び８）のアミノ酸配列中に存在する部分配列に相当する。
　（２）における置換の態様は、該アミノ酸配列からなるペプチドがHLAに拘束された細胞傷害性Tリンパ球を誘導し得る限り特に限定されないが、異なる鳥インフルエンザウイルス株（型・亜型）の同一抗原における対応するエピトープ配列中に生じた既知のアミノ酸変異を反映したものが好適な態様として挙げられる。そのような例としては、例えば、以下を挙げることができる。
MYQKCCTLF（配列番号６）→MYQRCCNLF（配列番号１０）　PR8（H1N1）
KTTPRPLRL（配列番号３）→KTTPRPIKL（配列番号１１）　Moscow（H3N2）
RYTKTTYWW（配列番号４）→KYTKTTYWW（配列番号１２）　Moscow（H3N2）
SYINRTGTF（配列番号５）→SYINKTGTF（配列番号１３）　Moscow（H3N2）
MYQKCCTLF（配列番号６）→MYQKCCNLF（配列番号１４）　Moscow（H3N2）
SYLIRALTL（配列番号９）→GYLIRALTL（配列番号１５）　Moscow（H3N2）
　本発明のエピトープ配列、及び該配列からなるペプチド（本発明のエピトープペプチド）は、以下の優れた特性を有する：
（Ａ）本発明のエピトープ配列は、鳥インフルエンザウイルスの連続変異株及び不連続変異株において高度に保存されている。
（Ｂ）本発明のエピトープペプチドは、ヒト主要組織適合性抗原（HLA）上に安定に提示される。HLAの型は特に限定されないが、本発明のエピトープペプチドは特に世界的に最もポピュラーなHLAの型であるHLA-A*0201及びHLA-A*2402への結合性に優れている。
（Ｃ）本発明のエピトープペプチドは、上記（Ｂ）の特性を有するため、HLA（好ましくはHLA-A*0201又はHLA-A*2402）に拘束された細胞傷害性Tリンパ球を強力に誘導することができる。「抗原がHLAに拘束された細胞傷害性Tリンパ球を誘導する」とは、特定のHLA（例えばHLA-A*0201又はHLA-A*2402）を発現している哺乳動物（例えばヒト、トランスジェニックマウス等）を抗原で免疫した場合に、該哺乳動物の生体内において、当該HLAに拘束され、且つ当該抗原を特異的に認識する細胞傷害性Tリンパ球の数及び／又は活性（例えば細胞傷害活性）が上昇することを意味する。上述のように、HLA-A*0201及びHLA-A*2402は世界的に最もポピュラーであることから、本発明のエピトープペプチドは、人種差に関わらず、世界中のヒトの細胞傷害性Tリンパ球を誘導し、細胞性免疫を活性化することができる。以上のような観点から、HLA-A*0201拘束性のPB1_410：GMFNMLSTV（配列番号１）並びにHLA-A*2402拘束性のPA_130：YYLEKANKI（配列番号２）、PA_262：KTTPRPLRL（配列番号３）、PB1_430：RYTKTTYWW（配列番号４）、PB1_482：SYINRTGTF（配列番号５）、PB1_688：MYQKCCTLF（配列番号６）及びPB2_549：TYQWIIRNW（配列番号７）のエピトープが好ましく、PB1_410：GMFNMLSTV（配列番号１）、PA_130：YYLEKANKI（配列番号２）、PB1_430：RYTKTTYWW（配列番号４）、PB1_688：MYQKCCTLF（配列番号６）及びPB2_549：TYQWIIRNW（配列番号７）がとりわけ好ましい。
　本発明のペプチドは、上記本発明のエピトープペプチド自体であるか、或いは細胞内でプロテアソーム等の作用により切断され、上記本発明のエピトープペプチドを生じる。従って、本発明のペプチドは、本発明のエピトープペプチドと実質的に同一の優れた特性を有し、下記に記したような本発明の細胞傷害性Tリンパ球活性化剤及び鳥インフルエンザウイルスワクチンの製造に供した場合、鳥インフルエンザウイルスが感染した細胞の殺傷や鳥インフルエンザウイルスの感染防御に優れた効果を発揮する。
　本発明のペプチドの長さは、特に限定されないが通常9～11アミノ酸、好ましくは9～10アミノ酸、より好ましくは9アミノ酸である。本発明のペプチドの長さが10アミノ酸以上である場合には、本発明のペプチドは、本発明のエピトープ配列のN末端側及び／又はC末端側に付加配列を有する。付加配列の長さやアミノ酸配列は、本発明のペプチドの上記特性を損なわない限り特に限定されない。例えば、該付加配列は、鳥インフルエンザウイルス（例えば高病原性鳥インフルエンザウイルスA/Hong_Kong/483/97(H5N1)）のPA、PB1及びPB2タンパク質のアミノ酸配列中で、配列番号１～９のいずれかに相当する部分配列に隣接して実際に存在するアミノ酸配列であり得る。また上記ペプチドが、細胞内で主要組織適合抗原複合体（MHC）を形成する際に、MHCの個人差（多型性）による提示抗原の選別を克服できるような残基であればとりわけ好ましい。
　一つの好ましい態様において、本発明のペプチドは、複数種（例えば2～9種類、好ましくは5～9種類）の上記本発明のエピトープ配列を含む。エピトープ配列の種類の数や組み合わせは任意に設定することができる。このように本発明のペプチド中に複数の本発明のエピトープ配列が含まれることにより、本発明のペプチドの細胞傷害性Tリンパ球誘導能が上昇し、鳥インフルエンザウイルスワクチンの製造に供した場合に、鳥インフルエンザウイルスの感染防御効果が飛躍的に向上し得る。
　本発明のペプチドは、例えば、液相合成又は固相ペプチド合成等の公知のペプチド合成技術によって調製できる。或いは、本発明のペプチドを発現し得る発現ベクターを導入した形質変換体（大腸菌等）を培養し、その培養物からアフィニティカラム等の周知の精製技術により本発明のペプチドを単離することにより、本発明のペプチドを製造することができる。本発明のペプチドを発現し得る発現ベクターは、周知の遺伝子工学的技術を用いて、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを適切な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより構築することができる。
　また、本発明は、上記本発明のペプチドが結合したリポソームであって、
該リポソームが、不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有するリン脂質、及びリポソームの安定化剤を含有し；且つ
該リポソームの表面に上記本発明のペプチドが結合している、
ペプチド結合リポソーム（本発明のペプチド結合リポソーム）を提供する。
　本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜は、両親媒性界面活性剤であるリン脂質が、極性基を水相側に向けて界面を形成し、疎水基が界面の反対側に向く構造を有する。ここで、リポソームとは閉鎖空間を有するリン脂質二重膜のことを指す。
　本発明のペプチドは、それが有する官能基を介してリポソームの表面に結合することができる。リポソーム表面への結合に用いられる本発明のペプチド中の官能基としては、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、水酸基、ジスルフィド基又はメチレン鎖を有する炭化水素基（アルキル基等）からなる疎水基等が挙げられる。これらの内、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、水酸基及びジスルフィド基は共有結合により、アミノ基及びカルボキシル基はイオン結合により、疎水基は疎水基同士で疎水結合により、本発明のペプチドをリポソームの表面に結合することができる。本発明のペプチドは、好ましくはアミノ基、カルボキシル基又はチオール基を介してリポソームの表面に結合する。
　本発明のペプチドが有する官能基を介して、本発明のペプチドが安定にリポソームに結合するため、リポソームを構成するリン脂質膜は、アミノ基、サクシンイミド基、マレイミド基、チオール基、カルボキシル基、水酸基、ジスルフィド基、メチレン鎖を有する炭化水素基（アルキル基等）からなる疎水基等の官能基を有することが望ましい。リポソームを構成するリン脂質膜が有する官能基は、好ましくは、アミノ基、サクシンイミド基又はマレイミド基である。本発明のペプチドのリポソームへの結合に関与する、本発明のペプチドの有する官能基とリポソームを構成するリン脂質膜が有する官能基の組み合わせは、本発明の効果に影響しない範囲において自由に選択することができるが、好ましい組み合わせとしては、それぞれ、アミノ基とアルデヒド基、アミノ基とアミノ基、アミノ基とサクシンイミド基、チオール基とマレイミド基等が挙げられる。イオン結合及び疎水結合は、リポソームへのペプチドの結合手順が簡便であり、ペプチド結合リポソームの調製容易性の点から好ましく、また、共有結合は、リポソーム表面の本発明のペプチドの結合安定性の点又はペプチド結合リポソームを実用する際の保存安定性の点から好ましい。本発明のペプチド結合リポソームは、その構成成分であるリポソームの表面に本発明のペプチドが結合していることを1つの特徴としており、これにより優れた細胞傷害性Tリンパ球活性化効果を達成している。従って、実用段階で、例えば注射行為によって生体内に投与された後にも、本発明のペプチドがリポソームの表面に安定に結合していることが、本発明の効果をより高める点で好ましい。このような観点から、本発明のペプチドとリポソームとの結合としては、共有結合が好ましい。
　本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜は、不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有するリン脂質、及びリポソームの安定化剤を含有してなる。
　不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基を有するリン脂質における、該アシル基の炭素数は、好ましくは16～22であり、更に好ましくは18～22であり、最も好ましくは18である。該アシル基としては、具体的には、パルミトオレオイル基、オレオイル基、エルコイル基等が挙げられ、最も好ましくはオレオイル基である。
　不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有するリン脂質における、該炭化水素基の炭素数は、好ましくは16～22であリ、更に好ましくは18～22であり、最も好ましくは18である。該炭化水素基としては、具体的には、テトラデセニル基、ヘキサデセニル基、オクタデセニル基、C20モノエン基、C22モノエン基、C24モノエン基等が挙げられる。
　リン脂質が有するグリセリン残基の1-位、及び2-位に結合する不飽和のアシル基又は不飽和炭化水素基は、同一でも異なっていてもよい。工業的な生産性の観点から、1-位及び2-位の基が同一であることが好ましい。
　リン脂質としては、不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基を有するリン脂質が好ましく用いられる。
　本発明の課題の一つは、鳥インフルエンザウイルス感染細胞を殺傷するための細胞傷害性Tリンパ細胞（CD8+T細胞、CTL）を効率よく特異的に増強することである。実用上十分なレベルにCTL活性を増強させる点から、リン脂質は不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基を有することが好ましい。アシル基の炭素数が13未満であると、リポソームの安定性が悪くなったり、またCTL活性増強効果が不十分になる場合がある。また、アシル基の炭素数が24を超えると、リポソームの安定性が悪くなる場合がある。
　不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有するリン脂質としては、酸性リン脂質、中性リン脂質、ペプチドを結合することのできる官能基を有する反応性リン脂質等の種類が挙げられる。これらは、種々の要求に応じて、その種類、割合を適宜選択することができる。
　酸性リン脂質としては、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール等を用いることができる。CTL活性を実用上十分なレベルに増強する点、及び工業的な供給性、医薬品として用いるための品質等の点から、不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基を有するジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジン酸、及びジアシルホスファチジルイノシトールが好ましく用いられる。酸性リン脂質は、リポソームの表面にアニオン性電離基を与えるので、リポソーム表面にマイナスのゼータ電位を付与する。このためリポソームは、電荷的な反発力を得、水性溶媒中で安定な製剤として存在できる。このように、酸性リン脂質は、本発明のペプチド結合リポソームが水性溶媒中にある際のリポソームの安定性を確保する点で重要である。
　中性リン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン等を用いることができる。本発明で用いることができる中性リン脂質は、本発明が課題として取り組むCTL活性増強を達成する範囲において、その種類・量を適宜選択して用いることができる。中性リン脂質は、酸性リン脂質及び本発明のペプチドを結合したリン脂質に比べ、リポソームを安定化する機能が高く、膜の安定性を向上させ得る。かかる観点から、本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜は、中性リン脂質を含有することが好ましい。CTL活性増強効果を達成するために用いる酸性リン脂質、ペプチド結合のための反応性リン脂質及びリポソームの安定化剤の含有量を確保した上で、中性リン脂質の使用量を決定できる。
　本発明のペプチド結合リポソームにおいては、本発明のペプチドがリポソームを構成するリン脂質膜に含まれる不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有するリン脂質に結合することにより、リポソームの表面に結合する。
　このペプチドの結合のためのリン脂質として、本発明のペプチドが結合することのできる官能基を有する反応性リン脂質が用いられる。不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有する反応性リン脂質は、種々の要求に応じて、その種類、割合が適宜選択される。前記リン脂質と同様に、反応性リン脂質においても、リン脂質に含まれる不飽和アシル基又は不飽和炭化水素基の炭素数が24を超えるか、14未満である場合は好ましくない。
　反応性リン脂質としては、ホスファチジルエタノールアミン又はその末端変性体が挙げられる。また、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール及びこれらの末端変性体も反応性リン脂質として用いることができる。工業的な入手性、本発明のペプチドとの結合工程の簡便性、収率等の点から、ホスファチジルエタノールアミン又はその末端変性体が好ましく用いられる。ホスファチジルエタノールアミンはその末端に本発明のペプチドを結合することのできるアミノ基を有する。更に、CTL活性を実用上十分なレベルに増強する点、リポソームでの安定性、及び工業的な供給性、医薬品として用いるための品質等の点から、不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基を有するジアシルホスファチジルエタノールアミン又はその末端変性体が最も好ましく用いられる。
　ジアシルホスファチジルエタノールアミンは、例えば、ジアシルホスファチジルコリンを原料に、ホスホリパーゼDを用いてコリンとエタノールアミンを塩基交換反応させることで得ることができる。具体的には、ジアシルホスファチジルコリンを溶解したクロロホルム溶液と、ホスホリパーゼD及びエタノールアミンを溶解した水を適宜比率において混合し粗反応物を得ることができる。粗反応物を、クロロホルム/メタノール/水系溶媒を用いてシリカゲルカラムで精製し目的のジアシルホスファチジルエタノールアミンを得ることができる。当業者であれば、溶媒組成比等のカラム精製条件を適宜選択して実施することが可能である。
　末端変性体としては、ジアシルホスファチジルエタノールアミンのアミノ基に2価反応性化合物の一方の末端を結合させたジアシルホスファチジルエタノールアミン末端変性体が挙げられる。2価反応性化合物としては、ジアシルホスファチジルエタノールアミンのアミノ基と反応することができるアルデヒド基又はコハク酸イミド基を少なくとも片方の末端に有する化合物が利用できる。アルデヒド基を有する2価反応性化合物として、グリオキサール、グルタルアルデヒド、サクシンジアルデヒド、テレフタルアルデヒド等が挙げられる。好ましくは、グルタルアルデヒドが挙げられる。コハク酸イミド基を有する2価反応性化合物として、ジチオビス（サクシンイミジルプロピオネート）、エチレングリコール－ビス（サクシンイミジルサクシネート）、ジサクシンイミジルサクシネート、ジサクシンイミジルスベレート、又はジサクシンイミジルグルタレート等が挙げられる。
　また、一方の末端にサクシンイミド基、他方の片末端にマレイミド基を有する2価反応性化合物として、N-サクシンイミジル4-（p-マレイミドフェニル）ブチレート、スルホサクシンイミジル-4-（p-マレイミドフェニル）ブチレート、N-サクシンイミジル-4-（p-マレイミドフェニル）アセテート、N-サクシンイミジル-4-（p-マレイミドフェニル）プロピオネート、サクシンイミジル-4-（N-マレイミドエチル）-シクロヘキサン-1-カルボキシレート、スルホサクシンイミジル-4-（N-マレイミドエチル）-シクロヘキサン-1-カルボキシレート、N-（γ-マレイミドブチリルオキシ）サクシンイミド、N-（ε-マレイミドカプロイルオキシ）サクシンイミド等が挙げられる。このような2価反応性化合物を用いると、官能基としてマレイミド基を有するジアシルホスファチジルエタノールアミン末端変性体が得られる。以上のような2価反応性化合物の一方の末端の官能基をジアシルホスファチジルエタノールアミンのアミノ基に結合し、ジアシルホスファチジルエタノールアミン末端変性体を得ることができる。
　リポソームの表面に本発明のペプチドを結合する方法としては、例えば、上記の反応性リン脂質を含有するリポソームを調製し、次に本発明のペプチドを加えてリポソームの反応性リン脂質にペプチドを結合する方法を挙げることができる。また、予め本発明のペプチドを反応性リン脂質に結合しておき、次に、得られた本発明のペプチドが結合した反応性リン脂質を、反応性リン脂質以外のリン脂質及びリポソームの安定化剤と混合することによっても、本発明のペプチドを表面に結合したリポソームを得ることができる。反応性リン脂質への本発明のペプチドの結合方法は、当該技術分野において周知である。
　本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜は、不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有するリン脂質を少なくとも1種、例えば2種以上、好ましくは3種以上含有する。
　例えば、本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜は、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジン酸、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、サクシンイミジル－ジアシルホスファチジルエタノールアミン、及びマレイミド－ジアシルホスファチジルエタノールアミンから選ばれる少なくとも1種、例えば2種以上、好ましくは3種以上の、不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有するリン脂質を含有する。
　また、本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜は、
不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有する酸性リン脂質、
不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有する中性リン脂質、及び
不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有する反応性リン脂質
を、それぞれ、少なくとも1種含有することが好ましい。
　本発明において、リポソームの安定化剤としては、ステロール類やトコフェロール類を用いることができる。前記のステロール類としては、一般にステロール類として知られるものであればよく、例えば、コレステロール、シトステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール等が挙げられ、入手性等の点から、特に好ましくは、コレステロールが用いられる。前記のトコフェロール類としては、一般にトコフェロールとして知られるものであればよく、例えば、入手性等の点から、市販のα-トコフェロールが好ましく挙げられる。
　さらに、本発明の効果を損なわない限り、本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜は、リポソームを構成することのできる、公知の構成成分を含んでいてもよい。
　本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜の組成としては、例えば以下を挙げることができる：
（Ａ）不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有するリン脂質　　1～99.8モル%；
（Ｂ）リポソームの安定化剤　　0.2～75モル%
　尚、各成分の含有量は、ペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜の全構成成分に対するモル%として表示する。
　上記成分（Ａ）の含有量は、リポソームの安定性の観点から、好ましくは10～90モル%、より好ましくは30～80モル%、更に好ましくは50～70モル%である。
　上記成分（Ｂ）の含有量は、リポソームの安定性の観点から、好ましくは5～70モル%、より好ましくは10～60モル%、更に好ましくは20～50モル%である。安定化剤の含有量が75モル%を超えるとリポソームの安定性が損なわれ好ましくない。
　上記成分（Ａ）には、以下が含まれる：
（ａ）本発明のペプチドが結合していない、不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有するリン脂質、及び
（ｂ）本発明のペプチドが結合した、不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有するリン脂質。
　上記成分（ａ）の含有量は、通常0.01～85モル%、好ましくは0.1～80モル%、より好ましくは0.1～60モル%、更に好ましくは0.1～50モル%である。
　上記成分（ｂ）の含有量は、通常0.2～80モル%、好ましくは0.3～60モル%、より好ましくは0.4～50モル%、更に好ましくは0.5～25モル%である。含有量が0.2モル%未満であると、本発明のペプチドの量が低下するため、実用上十分なレベルに細胞傷害性Tリンパ球を活性化することが困難となり、80モル%を超えると、リポソームの安定性が低下する。
　上記成分（ａ）のリン脂質には、通常、上述の酸性リン脂質及び中性リン脂質が含まれる。また、上記成分（ｂ）のリン脂質には、上述の反応性リン脂質が含まれる。
　酸性リン脂質の含有量は、通常1～85モル%、好ましくは2～80モル%、より好ましくは4～60モル%、更に好ましくは5～40モル%である。含有量が1モル%未満であると、ゼータ電位が小さくなりリポソームの安定性が低くなり、また、実用上十分なレベルに細胞傷害性Tリンパ球を活性化することが困難となる。一方、含有量が85モル%を超えると、結果として、リポソームの本発明のペプチドが結合したリン脂質の含有量が低下し、実用上十分なレベルに細胞傷害性Tリンパ球を活性化することが困難となる。
　中性リン脂質の含有量は、通常0.01～80モル%、好ましくは0.1～70モル%、より好ましくは0.1～60モル%、更に好ましくは0.1～50モル%である。含有量が80.0モル%を超えると、リポソームに含まれる酸性リン脂質、本発明のペプチドが結合したリン脂質及びリポソームの安定化剤の含有量が低下し、実用上十分なレベルに細胞傷害性Tリンパ球を活性化することが困難となる。
　本発明のペプチドが結合したリン脂質は、前記の反応性リン脂質に本発明のペプチドが結合して得られるもので、反応性リン脂質が本発明のペプチドと結合する割合は、本発明の効果を妨げない範囲において、結合に用いる官能基の種類、結合処理条件等を適宜考慮して選択することができる。
　例えば、ジアシルホスファチジルエタノールアミンの末端アミノ基に2価反応性化合物であるジサクシンイミジルサクシネートの片末端を結合して得たジアシルホスファチジルエタノールアミンの末端変性体を反応性リン脂質として用いる場合、結合処理諸条件の選択によって反応性リン脂質の10～99%を本発明のペプチドと結合することができる。この場合、本発明のペプチドと結合していない反応性リン脂質は、酸性リン脂質となってリポソームに含有される。
　本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜の好ましい態様としては、以下の組成を挙げることができる：
(I) 不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有する酸性リン脂質1～85モル%；
(II) 不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有する中性リン脂質0.01～80モル%；
(III) 本発明のペプチドが結合した、不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有するリン脂質0.2～80モル%；
(IV) リポソームの安定化剤0.2～75モル%。
（合計100モル%）
　本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜のより好ましい態様としては、以下の組成を挙げることができる：
上記成分(I)　　2～80モル%
上記成分(II)　0.1～70モル%
上記成分(III)　0.3～60モル%
上記成分(IV)　10～70モル%
（合計100モル%）
　本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜の更に好ましい態様としては、以下の組成を挙げることができる：
上記成分(I)　　4～60モル%
上記成分(II)　0.1～60モル%
上記成分(III)　0.4～50モル%
上記成分(IV)　20～60モル%
（合計100モル%）
　本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜のとりわけ好ましい態様としては、以下の組成を挙げることができる：
上記成分(I)　　5～40モル%
上記成分(II)　0.1～50モル%
上記成分(III)　0.5～25モル%
上記成分(IV)　25～55モル%
（合計100モル%）
　本発明のペプチド結合リポソームは、リポソーム部分を構成するリン脂質膜中のリン脂質に含まれる不飽和アシル基又は不飽和炭化水素基の炭素数が14～24であることを特徴とするが、本発明の効果を妨げない範囲で、炭素数が14未満又は24を超える不飽和アシル基又は不飽和炭化水素基を含むリン脂質を含んでいても差支えない。本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜中のリン脂質に含まれる全ての不飽和アシル基又は不飽和炭化水素基の合計数に対して、炭素数が14～24である不飽和アシル基又は不飽和炭化水素基の数の割合は、例えば50%以上、好ましくは60%以上、より好ましくは75%以上、更に好ましくは90%以上、最も好ましくは97%以上（例えば実質的に100%）である。
　本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜は、本発明の効果を妨げない限り、炭素数が14～24の範囲のアシル基又は炭化水素基を有する、リン脂質以外の脂質を含んでもよい。該脂質の含有量は、通常は40モル%以下であり、好ましくは20モル%以下、より好ましくは10モル%以下、更に好ましくは5モル%以下（例えば実質的に0モル%）である。
　本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分は、構成成分であるリン脂質、反応性リン脂質、リポソームの安定化剤、本発明のペプチド等を用い、適宜配合や加工を行い、これを適当な溶媒に添加する等の方法で得ることができる。
　例えば、エクスツルージョン法、ボルテックスミキサー法、超音波法、界面活性剤除去法、逆相蒸発法、エタノール注入法、プレベシクル法、フレンチプレス法、W/O/Wエマルジョン法、アニーリング法、凍結融解法等の製造方法が挙げられる。リポソームの形態は、特に限定されず、前記のリポソーム製造方法を適宜選択することにより、多重層リポソーム、小さな一枚膜リポソーム、大きな一枚膜リポソーム等、種々の大きさや形態を有するリポソームを製造することができる。
　リポソームの粒径は特に限定されるものではないが、保存安定性等の点から、粒径は20～600nmが挙げられ、好ましくは30～500nm、次に好ましくは40～400nmであり、更に好ましくは、50～300nmであり、最も好ましくは70～230nmである。
　なお、本発明においては、リポソームの物理化学的安定性を向上させるために、リポソーム調製過程又は調製後に、リポソームの内水相及び/又は外水相に、糖類又は多価アルコール類を添加しても良い。特に、長期保存或いは製剤化途上での保管が必要な場合には、リポソームの保護剤として、糖或いは多価アルコールを添加・溶解し、凍結乾燥により水分を除いてリン脂質組成物の凍結乾燥物とすることが好ましい。
　糖類としては、例えばグルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、イノシトール、リボース、キシロース等の単糖類；サッカロース、ラクトース、セロビオース、トレハロース、マルトース等の二糖類；ラフィノース、メレジトース等の三糖類；シクロデキストリン等のオリゴ糖；デキストリン等の多糖類；キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルチトール等の糖アルコール等が挙げられる。これらの糖類の中では単糖類又は二糖類が好ましく、中でもグルコース又はサッカロースが入手性等の点からより好ましく挙げられる。
　前記多価アルコール類としては、例えば、グリセリン、ジグリセリン、トリグリセリン、テトラグリセリン、ペンタグリセリン、ヘキサグリセリン、ヘプタグリセリン、オクタグリセリン、ノナグリセリン、デカグリセリン、ポリグリセリン等のグリセリン系化合物；ソルビトール、マンニトール等の糖アルコール系化合物；エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、ペンタエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール、ヘプタエチレングリコール、オクタエチレングリコール、ノナエチレングリコール等が挙げられる。このうち、グリセリン、ジグリセリン、トリグリセリン、ソルビトール、マンニトール、分子量400～10,000のポリエチレングリコールが入手性の点から好ましく挙げられる。
　リポソームの内水相及び/又は外水相に含ませる、糖類或いは多価アルコール類の濃度は、リポソーム液に対する重量濃度で、例えば1～20重量%が挙げられ、好ましくは2～10重量%が挙げられる。
　本発明のペプチド結合リポソームを製造する場合、本発明のペプチドを結合させる前のリポソームを作製した後、本発明のペプチドを結合させることにより簡便に本発明のペプチド結合リポソームを得ることができる。
　例えば、リン脂質、リポソームの安定化剤及び膜表面に本発明のペプチドを結合するための反応性リン脂質を含有したリポソームの懸濁液を調製し、その外水相に前記の糖類の一つであるスクロースを2～10重量%程度加えて溶解する。この糖添加製剤を10mlガラス製バイヤルに移して棚段式凍結乾燥機内に置き、-40℃等に冷却して試料を凍結した後、常法により凍結乾燥物を得る。
　ここで得たリポソームの凍結乾燥物は、水分が取り除かれているため長期の保存が可能であり、必要時に特定の本発明のペプチドを加えて後の工程を実施することにより、本発明の最終的なペプチド結合リポソームを簡便に迅速に得ることができる。本発明のペプチドとリポソームとの相互作用が強く不安定性が強い場合等は、このようにリポソームの凍結乾燥物の段階で保存し、必要な際に本発明のペプチドを結合して用いると非常に簡便である。
　本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜は、本発明のペプチドが結合したリン脂質を有し得る。本発明のペプチドが結合したリン脂質を含有するリポソームを得る方法としては、次の（Ａ）及び（Ｂ）による方法が挙げられる。
（Ａ）リン脂質、反応性脂質、リポソームの安定化剤を含有するリポソームを調製し、これに本発明のペプチド及び2価反応性化合物を添加し、リポソーム中に含有される反応性リン脂質の官能基と、本発明のペプチドの官能基とを、2価反応性化合物を介して連結する方法。ここで用いることができる2価反応性化合物は、反応性リン脂質の末端変性体調製において用いたものを同様に用いることができる。具体的には、アルデヒド基を有する2価反応性化合物として、グリオキサール、グルタルアルデヒド、サクシンジアルデヒド、テレフタルアルデヒド等が挙げられる。好ましくは、グルタルアルデヒドが挙げられる。更に、コハク酸イミド基を有する2価反応性化合物として、ジチオビス（サクシンイミジルプロピオネート）、エチレングリコール－ビス（サクシンイミジルサクシネート）、ジサクシンイミジルサクシネート、ジサクシンイミジルスベレート、又はジサクシンイミジルグルタレート等が挙げられる。また、片末端にサクシンイミド基、もう一方の片末端にマレイミド基を有する2価反応性化合物として、N-サクシンイミジル-4-（p-マレイミドフェニル）ブチレート、スルホサクシンイミジル-4-（p-マレイミドフェニル）ブチレート、N-サクシンイミジル-4-（p-マレイミドフェニル）アセテート、N-サクシンイミジル-4-（p-マレイミドフェニル）プロピオネート、サクシンイミジル-4-（N-マレイミドエチル）-シクロヘキサン-1-カルボキシレート、スルホサクシンイミジル-4-（N-マレイミドエチル）-シクロヘキサン-1-カルボキシレート、N-（γ-マレイミドブチリルオキシ）サクシンイミド、N-（ε-マレイミドカプロイルオキシ）サクシンイミド等を使用することができる。かかる2価反応性化合物を使用すると、官能基としてマレイミド基を有する反応性リン脂質（例えばホスファチジルエタノールアミン）の末端変性体が得られる。
（Ｂ）リン脂質、反応性リン脂質、リポソームの安定化剤を含有するリポソームを調製し、これに本発明のペプチドを添加し、リポソームに含まれる反応性リン脂質の官能基と、本発明のペプチドの官能基を連結して結合させる方法。
　前記（Ａ）及び（Ｂ）における結合の種類としては、例えば、イオン結合、疎水結合、共有結合等が挙げられるが、好ましくは共有結合である。更に共有結合の具体例としては、シッフ塩基結合、アミド結合、チオエーテル結合、エステル結合等が挙げられる。
　以上の2つの方法いずれとも、リポソームを構成するリン脂質膜に含まれる反応性リン脂質に本発明のペプチドを結合することができ、リポソームに本発明のペプチドを結合したリン脂質が形成される。
　前記の（Ａ）の方法において、原料となるリポソームと本発明のペプチドとを2価反応性化合物を介して結合させる方法の具体例としては、例えば、シッフ塩基結合を利用する方法が挙げられる。シッフ塩基結合を介してリポソームと本発明のペプチドとを結合する方法としては、アミノ基を表面に有するリポソームを調製し、本発明のペプチドを該リポソームの懸濁液に添加し、次に、2価反応性化合物としてジアルデヒドを加え、リポソーム表面のアミノ基と本発明のペプチド中のアミノ基とをシッフ塩基を解して結合する方法を挙げることができる。
　この結合手順の具体例としては、例えば、次の方法が挙げられる。
（Ａ－１）アミノ基を表面に有するリポソームを得るために、不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有する反応性リン脂質（例 ホスファチジルエタノールアミン）をリポソーム原料脂質（リン脂質、リポソームの安定化剤等）中に混合して、アミノ基がリポソーム表面に所定量存在するリポソームを作成する。
（Ａ－２）前記リポソーム懸濁液に、本発明のペプチドを添加する。
（Ａ－３）次に、2価反応性化合物としてグルタルアルデヒドを加えて、所定の時間反応させてリポソームと本発明のペプチドとの間にシッフ塩基結合を形成する。
（Ａ－４）その後、余剰のグルタルアルデヒドの反応性を失活させるため、アミノ基含有水溶性化合物としてグリシンをリポソーム懸濁液に加えて反応させる。
（Ａ－５）ゲルろ過、透析、限外ろ過、遠心分離等の方法により、リポソームに未結合の本発明のペプチド、グルタルアルデヒドとグリシンとの反応産物、及び余剰のグリシンを除去して、本発明のペプチド結合リポソーム懸濁液を得る。
　前記の（Ｂ）の方法の具体例としては、アミド結合、チオエーテル結合、シッフ塩基結合、エステル結合等を形成することのできる官能基を有する反応性リン脂質を、リポソームを構成するリン脂質膜に導入する方法が挙げられる。このような官能基の具体例としては、サクシンイミド基、マレイミド基、アミノ基、イミノ基、カルボキシル基、水酸基、チオール基等が挙げられる。
　リポソームを構成するリン脂質膜に導入する反応性リン脂質の例としては、前記の不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有する反応性リン脂質（例 ホスファチジルエタノールアミン）のアミノ基末端の末端変性物を用いることができる。
　この結合手順の具体例として、ジアシルホスファチジルエタノールアミンを用いた場合を例にとって、以下説明する。
（Ｂ－１）不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基を有するジアシルホスファチジルエタノールアミンとジサクシンイミジルサクシネートを公知の方法で片末端のみ反応させて、官能基としてサクシンイミド基を末端に有するジサクシンイミジルサクシネート結合ジアシルホスファチジルエタノールアミンを得る。
（Ｂ－２）前記ジサクシンイミジルサクシネート結合ジアシルホスファチジルエタノールアミンと他のリポソーム構成成分（リン脂質、リポソームの安定化剤等）とを公知の方法で混合し、表面に官能基としてサクシンイミド基を有するリポソームを作成する。
（Ｂ－３）前記リポソーム懸濁液に、本発明のペプチドを加え、本発明のペプチド中のアミノ基と、リポソーム表面のサクシンイミド基とを反応させる。
（Ｂ－４）未反応の本発明のペプチド、反応副生物等を、ゲルろ過、透析、限外ろ過、遠心分離等の方法により除去して、本発明のペプチド結合リン脂質を含有するリポソームの懸濁液を得る。
　リポソームと本発明のペプチドとを結合する場合、官能基として含有されることが多いアミノ基又はチオール基を対象とすることが実用上好ましい。アミノ基を対象とする場合には、サクシンイミド基と反応させることによりシッフ塩基結合を形成させることができる。チオール基を対象とする場合には、マレイミド基と反応させることによりチオエーテル結合を形成させることができる。
　本発明のペプチドやペプチド結合リポソームを用いれば、HLA（好ましくはHLA-A*0201又はHLA-A*2402）拘束的且つ特異的に、本発明のペプチド（好ましくは本発明のエピトープペプチド）を認識する細胞傷害性Tリンパ球（CTL）を強力に誘導することが可能となる。本発明のペプチドやペプチド結合リポソームにより誘導される細胞傷害性Tリンパ球は、鳥インフルエンザウイルスに感染した結果、HLA上に本発明のペプチドを提示した細胞を殺傷し、これらの細胞を除去する。従って、本発明のペプチドやペプチド結合リポソームは、細胞傷害性Tリンパ球活性化剤や鳥インフルエンザウイルスワクチンとしてとして有用である。
　上述のように、本発明のペプチドは、鳥インフルエンザウイルスの連続変異株及び不連続変異株において高度に保存されたエピトープを含む。従って、本発明のペプチドやペプチド結合リポソームは、多様な型[(H1～H16)×(N1～N9)]の鳥インフルエンザウイルスに対するワクチンとして有用であるが、とりわけ、高病原性鳥インフルエンザウイルス（H5N1型）に対して有効である。また、本発明のペプチドやペプチド結合リポソームは、種々の変異株に対するワクチンとして有用である。
　本発明のペプチドやペプチド結合リポソームを細胞傷害性Tリンパ球活性化剤や鳥インフルエンザウイルスワクチンとして使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。本発明のペプチドやペプチド結合リポソームは低毒性であり、そのまま液剤として、又は適当な剤形の医薬組成物として、ヒト、非ヒト哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等）、鳥類（ニワトリ、ガチョウ、アヒル、ダチョウ、ウズラ等）等に対して経口的又は非経口的（例、血管内投与、皮下投与等）に投与することができる。本発明のペプチドやペプチド結合リポソームの投与対象である動物は、通常、標的とする鳥インフルエンザウイルスが感染し得る哺乳動物及び鳥類である。本発明のペプチドやペプチド結合リポソームは、通常、非経口的に投与される。
　本発明の細胞傷害性Tリンパ球活性化剤及び鳥インフルエンザウイルスワクチンは、その有効成分であるペプチド又はペプチド結合リポソーム自体を投与しても良いし、又は適当な医薬組成物として投与しても良い。投与に用いられる医薬組成物としては、上記ペプチド又はペプチド結合リポソームと薬理学的に許容され得る担体、希釈剤又は賦形剤とを含むものであっても良い。このような医薬組成物は、経口又は非経口投与に適する剤形として提供される。
　非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、上記ペプチド又はペプチド結合リポソームを通常注射剤に用いられる無菌の水性溶媒に溶解又は懸濁することによって調製できる。注射用の水性溶媒としては、例えば、蒸留水；生理的食塩水；リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液等の緩衝液等が使用できる。このような水系溶媒のpHは5～10が挙げられ、好ましくは6～8である。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。
　また、本発明のペプチドの溶解液又は本発明のペプチド結合リポソームの懸濁液を、真空乾燥、凍結乾燥等の処理に付すことにより、本発明のペプチド又は本発明のペプチド結合リポソームの粉末製剤を調製することもできる。本発明のペプチド又は本発明のペプチド結合リポソームを粉末状態で保存し、使用時に該粉末を注射用の水系溶媒で分散することにより、使用に供することができる。
　本発明の細胞傷害性Tリンパ球活性化剤及び鳥インフルエンザウイルスワクチンは、その効果を増強するため、アジュバントをさらに含有してもよい。アジュバントとしては、水酸化アルミニウムゲル、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、百日咳菌アジュバント、ポリ（I,C）、CpG-DNA等が挙げられるが、CpG-DNAがとりわけ好ましい。CpG-DNAは細菌の非メチル化CpGモチーフを含むDNAであり、特定の受容体（Toll-like receptor 9）のリガンドとしてはたらくことが知られている（詳細はBiochim. Biophys. Acta 1489, 107-116 (1999) 及び Curr. Opin. Microbiol. 6, 472-477 (2003)参照）。CpG-DNAは樹状細胞（DC）を活性化することにより、本発明のペプチド又はペプチド結合リポソームによる細胞傷害性Tリンパ球の誘導を増強することができる。
　医薬組成物中の有効成分（本発明のペプチド又はペプチド結合リポソーム）の含有量は、通常、医薬組成物全体の約0.1～100重量%、好ましくは約1～99重量%、さらに好ましくは約10～90重量%程度である。
　本発明の細胞傷害性Tリンパ球活性化剤又は鳥インフルエンザウイルスワクチンがアジュバントを含む場合、該アジュバント（例えばCpG-DNA）の含有量は、細胞傷害性Tリンパ球の誘導を増強し得る範囲で適宜設定することができるが、通常、医薬組成物全体の約0.01～10重量%、好ましくは約0.1～5重量%程度である。
　本発明のペプチド又は本発明のペプチド結合リポソームの投与量は、投与する対象、投与方法、投与形態等によって異なるが、例えば、皮下投与或いは経鼻投与により生体内の細胞傷害性Tリンパ球を活性化する場合には、通常成人1人（体重60ｋｇ）あたり本発明のペプチドとして一回当たり1μg～1000μgの範囲、好ましくは20μg～100μgの範囲で、通常4週間から18ヶ月に亘って、2回から3回投与する。また、皮下投与により鳥インフルエンザウイルス感染に対して予防する場合には、本発明のペプチドとして一回当たり1μg～1000μgの範囲、好ましくは20μg～100μgの範囲で、通常4週間から18ヶ月に亘って、2回から3回投与する。
　以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
［実施例１］
CTLエピトープの検索
　高病原性鳥インフルエンザウイルスA/Hong_Kong/483/97（H5N1）株の8種類のウイルス内部タンパク質（M1、M2、NP、NS1、NS2、PA、PB1、PB2）のアミノ酸配列から、ヒト主要組織適合抗原複合体（MHC）クラスI分子の1つであるHLA-A*0201又はHLA-A*2402に結合し、キラーT細胞（CTL）に対して抗原性を持つと予想されるエピトープの検索を、ネット上で利用できる次の4種類の予測プログラムを使って行った。
a. NetCTL server 1.2 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/)
b. nHLAPred (http://www.imtech.res.in/raghava/nhlapred/)
c. BIMAS (http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/)
d. SYFPEITHI (http://www.syfpeithi.de/home.htm)
　それぞれのプログラムによりエピトープ活性を持つと予想された41種類の候補ペプチドの中から、
PB1_410：GMFNMLSTV（配列番号１）
PA_130：YYLEKANKI（配列番号２）、
PA_262：KTTPRPLRL（配列番号３）、
PB1_430：RYTKTTYWW（配列番号４）、
PB1_482：SYINRTGTF（配列番号５）、
PB1_688：MYQKCCTLF（配列番号６）、
PB2_549：TYQWIIRNW（配列番号７）、
PB2_322：SFSFGGFTF（配列番号８）、
PB1_216：SYLIRALTL（配列番号９）、
M2_40：LWILDRLFF（配列番号１６）、
PB2_117：TYFEKVERL（配列番号１７）、
PB1_331：EWFRNVLSI（配列番号１８）、
PA_8：CFNPMIVEL（配列番号１９）、
NP_257：IFLARSALI（配列番号２０）、
NP_481：MSNEGSYFF（配列番号２１）、
M2_2：SLLTEVETL（配列番号２２）
を選び、ペプチド合成後にそれぞれのペプチドによる免疫で誘導されるCTL活性の測定を行った。
［実施例２］
リポソームの調製
１）脂質混合粉末の調製
　末端変性ホスファチジルエタノールアミンからなる反応性リン脂質（サクシンイミジル基-ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）の合成
　ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン2g及びトリエチルアミン180μlをクロロホルム50mlに溶解及び添加し、300ml容の4つ口フラスコに入れた。このフラスコをマグネットスタラーで室温で攪拌しつつ、別に調製した2価反応性化合物であるジサクシンイミジルスベレート3gをクロロホルム80mlに溶解した溶液を、常法に従って4時間に亘って滴下し、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンのアミノ基にジサクシンイミジルスベレートの片末端を反応させた。この粗反応溶液をナス型フラスコに移し、エバポレータによって溶媒を留去した。次に、このフラスコに粗反応物を溶解できるだけのクロロホルムを少量加えて高濃度粗反応物溶液を得、クロロホルム/メタノール/水（65/25/1、体積比）で平衡化したシリカゲルを用いて常法に従ってカラムクロマトグラフィーを行い、目的のジオレオイルホスファチジルエタノールアミンのアミノ基にジサクシンイミジルスベレートの片末端が結合した画分のみを回収し、溶媒を留去して目的の反応性リン脂質であるサクシンイミド基－ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンを得た。
２）脂質混合粉末の調製
　ジオレオイルホスファチジルコリン1.3354g（1.6987mmol）、前項で調製したサクシンイミド基-ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン0.2886g（0.2831mmol）、コレステロール0.7663g（1.9818mmol）及びジオレオイルホスファチジルグリセロールNa塩0.4513g（0.5662mmol）をナス型フラスコに取り、クロロホルム/メタノール/水（65/25/4、容量比）混合溶剤50mlを入れ、40℃にて溶解した。次にロータリーエバポレーターを使用して減圧下で溶剤を留去し、脂質の薄膜を作った。更に注射用蒸留水を30ml添加し、攪拌して均一のスラリーを得た。このスラリーを凍結させ、凍結乾燥機にて24時間乾燥させ脂質混合粉末を得た。
３）リポソームの調製
　次に、別途作製した緩衝液（1.0mM Na2HPO4/KH2PO4、0.25Ｍサッカロース、pH7.4、以後緩衝液と略す）60mlを上記脂質混合粉末の入ったナス型フラスコ内に入れ、40℃にて攪拌しながら脂質を水和させ、リポソームを得た。次にエクストルーダーを用いてリポソームの粒径を調整した。まず8μmのポリカーボネートフィルターを通過させ、続いて5μm、3μm、1μm、0.65μm、0.4μm及び0.2μmの順にフィルターを通過させた。リポソーム粒子の平均粒径206nm（動的光散乱法による測定）が得られた。
［実施例３］
リポソーム製剤の調製
　実施例２（リポソームの調製）のリポソーム1.5mlを試験管に採取し、別に調製した3mlの各ペプチド溶液（1.25mM、緩衝液溶液）を加えた後、5℃で48時間穏やかに攪拌し反応させた。この反応液を、緩衝液で平衡化したSepharoseCL-4Bを用いて常法に従ってゲル濾過した。尚、リポソーム画分は白濁しているので、目的画分は容易に確認できるが、UV検出器等で確認しても良い。
　ここで得られたリポソーム懸濁液中のリン濃度を測定し（リン脂質テストWako）、リン脂質由来のリン濃度を2mMになるように濃度を緩衝液で希釈調整し各ペプチド結合リポソームの懸濁液を得た。
［実施例４］
CTL活性の検出
　ペプチド活性の検出は、in vivoにおけるキリング活性の誘導能を重視したため、次の方法で行った。まずマウス本来のMHCクラスI分子（H2-D及びH2-K）を持たず、配列番号１のペプチドについてはHLA-A*0201分子を発現する遺伝子導入マウス（HHDマウス）、配列番号２以降のペプチドについてはHLA-A*2402分子を発現する遺伝子導入マウス（A24Tg）を、オレイン酸リポソームに結合したそれぞれの候補ペプチド（0.5μg/μlを200μl/匹）及びCpG5002（5’-TCCATGACGTTCTGATGTT-3’（配列番号２３）；詳細はVaccine 25, 4914-4921 (2007)参照）（10μg/匹）で1週間間隔で2回免疫した。最終免疫から6日後、免疫したペプチド（0.5μM）と蛍光色素（CFDA-SE）で標識した標的細胞（A24Tgマウス脾細胞5×105個/匹）を対照とともに静脈内投与し、16時間後、安楽殺した後に脾臓を回収して、その中の標的細胞の減少率をフローサイトメーターにより解析した。
脾臓接着細胞（SAC）、CD4+及びCD8+T細胞の調製
　脾臓細胞懸濁液を10%FCSを含有するRPMI-1640を用いて調製した。5mlの10%FCSを含有する培地中の細胞（5×107個）を50mmプラスチック組織培養ディッシュ（No.#3002; BectonDickinson Labware, Franklin Lakes, NJ）中に播種し、加湿5%CO2雰囲気下、37℃にて2時間インキュベートした。培養後、非接着細胞を、暖かい培地中での穏やかな洗浄（washing）により除去し、次に接着細胞をセルスクレーパーにより回収した。各ペプチド－アラムで免疫されたマウスの脾臓細胞（SC）からのCD4+及びCD8+T細胞精製は、磁気セルソーターシステムMACSにより、製造者のプロトコールに従って、抗CD4及び抗CD8抗体被覆マイクロビーズ（Miltenyi Biotec GmbH）を用いて行った。T細胞は、10%FCSを含むRPMI-1640中に、2×106mlの細胞密度で懸濁された。
インビボ細胞障害性アッセイ（CTL活性の測定）
　上記マウスの脾細胞を0.5又は5μM CFDA-SE（Sigma）により室温で15分間標識し、2回洗浄した。次に、CFDA-SEが明るい（M2）細胞を、0.5μg/ml各ペプチドにより37℃で90分間パルスした。CFDA-SEが暗い細胞（M1）を、対照として、無関係のNP366-374（ASNENMDAM）ペプチドにより、37℃で90分間パルスした。細胞を1：1の比で混合し、全部で5×106個の細胞を、1～2週間前に100μgの抗IL-10モノクローナル抗体2A5、5μgのCpG5002及びそれぞれの各ペプチド結合リポソームが注入されたマウスへ静注した。8時間後にそれぞれのマウスから回収された脾細胞をフローサイトメトリーにより解析した。各ペプチドでパルスされた画分の蛍光標識脾細胞の減少の程度をCTL活性の指標とした。各ペプチド結合リポソームにより免疫されたマウスにCTLが誘導されていれば、各ペプチドでパルスされた画分の蛍光標識脾細胞のみが消滅することとなる。
結果
　以下に活性のあったペプチドと、そのスクリーニング結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　検索によって選択したペプチドのうち、PB1_410：GMFNMLSTV（配列番号１）、PA_130：YYLEKANKI（配列番号２）、PA_262：KTTPRPLRL（配列番号３）、PB1_430：RYTKTTYWW（配列番号４）、PB1_482：SYINRTGTF（配列番号５）、PB1_688：MYQKCCTLF（配列番号６）、PB2_549：TYQWIIRNW（配列番号７）、PB2_322：SFSFGGFTF（配列番号８）、PB1_216：SYLIRALTL（配列番号９）は高いCTL活性を示したが、M2_40：LWILDRLFF（配列番号１６）、PB2_117：TYFEKVERL（配列番号１７）、PB1_331：EWFRNVLSI（配列番号１８）、PA_8：CFNPMIVEL（配列番号１９）、NP_257：IFLARSALI（配列番号２０）、NP_481：MSNEGSYFF（配列番号２１）、M2_2：SLLTEVETL（配列番号２２）の活性は低かった。
［実施例５］
　細胞内サイトカイン染色を、J Virol 78, 9093-9104（2004）に記載された通りに行った。下記の各ペプチド（PB1_410、PA_130、PB1_430、PB2_549）0.7μg/μlを50μl又は実施例３に準じて製造した該ペプチドが結合したリポソーム50μlを5μg CpG存在下でfp投与し、１週間後、安楽殺した後に脾臓を回収して、脾臓細胞2×106個をbrefeldin A（GolgiPlugTM, BD Biosciences, San Jose, CA）存在下、37℃で5時間、10μMの各ペプチド（PB1_410、PA_130、PB1_430、PB2_549）それぞれとインキュベートした。ラット抗マウスCD16/CD32モノクローナル抗体（Fc BlockTM, BD Biosciences）によりFc受容体をブロッキングした後、細胞をFITC結合ラット抗マウスCD8αモノクローナル抗体（BD Biosciences）により4℃で30分間染色した。次いで細胞を固定し、透過性を高め、フィコエリトリン（PE）結合ラット抗マウスインターフェロンγ（IFN-γ）モノクローナル抗体（BD Biosciences）により染色した。細胞を洗浄後、サイトメトリ解析を行った。
結果
　以下に染色結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　各ペプチドを、リポソームに結合させた状態でマウスに免疫することにより、高い効率で、抗原特異的CD8+細胞が誘導された。中でも、PB2_549の抗原特異的CD8+細胞誘導能は極めて高かった。上記結果により、本発明のペプチド結合リポソームの優れた抗原特異的CD8+細胞誘導効果が確認できた。PB1_410、PA_130及びPB1_430の各ペプチドを、リポソームへの結合なしで免疫に用いても、ほとんど抗原特異的CD8+細胞を誘導しなかったが、PB2_549については、リポソームへの結合なしで免疫に用いた場合に、他のペプチドをはるかに上回る有意な抗原特異的CD8+細胞誘導効果が確認できた。
［実施例６］
　ウイルス感染抵抗性試験を以下の通り行った。DDW中のPA_130及びPB2_549各5mgをジサクシンイミジルスベレート-ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DSS-Ole）用いて実施例３と同様にリポソームにカップリングした。マウス当たり50μl又は100μlのペプチド結合リポソームを5μg CpG存在下でfp投与し、1週間後、ketamine（175 mg/g weight）（Sigma-Aldrich）及びxylazine（3.5 mg/g weight）（Bayer Holding Ltd., Tokyo, Japan）を腹膜内注射してマウスを麻酔し、40μl PBS中に再懸濁したH3N2(A/Uruguay)ウイルスをマウス1匹当たり10000PFU鼻腔内投与した。ウイルスのタイターについては、マウスをウイルス接種から5日後に安楽殺してその肺中のウイルスタイターを、Cottey R, Rowe CA, Bender BS (2001) Influenza virus. In Current Protocols in Immunology. John Wiley & Sons, Inc. 19.11.1-19.11.32に記載された通りにMDCK細胞を用いてTCID50を測定することにより決定した。即ち、肺を1ml PBS中でホモジェナイズし、ホモジェネートを2,000rpmで10分間遠心して破砕片を沈殿させた。次いで当該ホモジェネートの10倍希釈系列を、U字形底の96ウェルプレートに希釈1回につき5ウェルずつ調製した。希釈系列は5% FCSを含むDMEMで10-1から10-7まで調製した。D-5中のMDCK細胞を全ウェルに添加（2.5×104細胞/ウェル）し、5％C02の下、35℃でインキュベートした。1日後、各ウェル中の培養培地を2μg/mlのアセチル化トリプシン(Sigma-Aldrich)含有DMEMと交換し、プレートをC02インキュベーター中35℃で4日間更にインキュベートした。PBS中0.5%ニワトリ赤血球懸濁液50μlを各ウェルに添加後、各試料について凝集パターンを観察し、TCID50（詳細はCottey R, Rowe CA, Bender BS (2001) Influenza virus. In Current Protocols in Immunology. John Wiley & Sons, Inc. 19.11.1-19.11.32を参照）を算出することによりウイルスタイターを決定した。各実験群にはマウスを5匹ずつ用いた。本アッセイの検出限界は103 TCID50/マウスであった。
結果
　以下に感染抵抗性試験結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　いずれのペプチドを結合させたリポソームによって免疫した場合においても、高いウイルス感染阻害効果が確認できた。用いたペプチドは高病原性鳥インフルエンザウイルスA/Hong_Kong/483/97(H5N1)由来のものであるが、亜型の異なるH3N2ウイルスに対しても上記のような高効率の感染阻害効果が示されたことから、本発明のペプチド結合リポソームのプレパンデミックワクチンとしての効果が証明された。
　本発明によれば、パンデミックを引き起こす可能性が高い高病原性鳥インフルエンザウイルスに対し、その表面タンパク質の変異の影響を受けにくく、効果が高いワクチンを提供できる。また、本発明の鳥インフルエンザワクチンによれば、実際の流行株(型・亜型)が予測と異なった場合、効果が限定的となるであろう現在のプレパンデミックワクチンの弱点を克服できる、新規のプレパンデミックワクチンを提供できる。
　本発明は、２００８年１１月２８日出願の日本国特許出願、特願２００８-３０３４４４を基礎としており、その内容は全て本明細書に包含される。

Claims (23)

  1. 　HLAに拘束された細胞傷害性Tリンパ球を誘導し得るペプチドであって、（１）配列番号７、３又は８のいずれかで表されるアミノ酸配列、或いは（２）配列番号７、３又は８のいずれかで表されるアミノ酸配列において、1又は2個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含み、且つ9～11アミノ酸の長さを有する、ペプチド。
  2. 　HLAがHLA－A＊0201又はHLA－A＊2402である、請求項１記載のペプチド。
  3. 　ペプチドが結合したリポソームであって、
    該ペプチドが、（１）配列番号１～９のいずれかで表されるアミノ酸配列、又は（２）配列番号１～９のいずれかで表されるアミノ酸配列において、1又は2個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含み、
    9～11アミノ酸の長さを有し、且つ
    HLAに拘束された細胞傷害性Tリンパ球を誘導し得るものであり；
    該リポソームが、不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有するリン脂質、及びリポソームの安定化剤を含有し；且つ
    該リポソームの表面に該ペプチドが結合している、
    ペプチド結合リポソーム。
  4. 　HLAがHLA－A＊0201又はHLA－A＊2402である、請求項３記載のペプチド結合リポソーム。
  5. 　リン脂質が、不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基を有するリン脂質である、請求項３記載のペプチド結合リポソーム。
  6. 　アシル基がオレオイル基である、請求項３記載のペプチド結合リポソーム。
  7. 　リン脂質が、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジン酸、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、サクシンイミジル－ジアシルホスファチジルエタノールアミン、及びマレイミド－ジアシルホスファチジルエタノールアミンから選ばれる少なくとも１つである、請求項３記載のペプチド結合リポソーム。
  8. 　リポソームの安定化剤がコレステロールである、請求項３記載のペプチド結合リポソーム。
  9. 　ペプチドが、リポソームを構成するリン脂質膜に含まれる不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有するリン脂質に結合している、請求項３記載のペプチド結合リポソーム。
  10. 　リポソームが以下の組成を有する、請求項３記載のペプチド結合リポソーム：
    （Ａ）不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有するリン脂質　　1～99.8モル%；
    （Ｂ）リポソームの安定化剤　　0.2～75モル%。
  11. 　リポソームが以下の組成を有する、請求項３記載のペプチド結合リポソーム：
    (I)不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有する酸性リン脂質　　1～85モル%；
    (II)不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有する中性リン脂質　　0.01～80モル%；
    (III)ペプチドが結合した、不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有するリン脂質　　0.2～80モル%；
    (IV)リポソームの安定化剤　　0.2～75モル%。
  12. 　ペプチドを含む、細胞傷害性Tリンパ球活性化剤であって、
    該ペプチドが、（１）配列番号１～９のいずれかで表されるアミノ酸配列、又は（２）配列番号１～９のいずれかで表されるアミノ酸配列において、1又は2個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含み、
    9～11アミノ酸の長さを有し、且つ
    HLAに拘束された細胞傷害性Tリンパ球を誘導し得るものである、
    細胞傷害性Tリンパ球活性化剤。
  13. 　請求項３記載のペプチド結合リポソームを含む、細胞傷害性Tリンパ球活性化剤。
  14. 　更にCpG－DNAを含有することを特徴とする、請求項１２又は１３記載の細胞傷害性Tリンパ球活性化剤。
  15. 　ペプチドを含む、鳥インフルエンザウイルスワクチンであって、
    該ペプチドが、（１）配列番号１～９のいずれかで表されるアミノ酸配列、又は（２）配列番号１～９のいずれかで表されるアミノ酸配列において、1又は2個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含み、
    9～11アミノ酸の長さを有し、且つ
    HLAに拘束された細胞傷害性Tリンパ球を誘導し得るものである、
    鳥インフルエンザウイルスワクチン。
  16. 　請求項３記載のペプチド結合リポソームを含む、鳥インフルエンザウイルスワクチン。
  17. 　更にCpG－DNAを含有することを特徴とする、請求項１５又は１６記載の鳥インフルエンザウイルスワクチン。
  18. 　細胞傷害性T細胞の活性化において使用するためのペプチドであって、
    該ペプチドが、（１）配列番号１～９のいずれかで表されるアミノ酸配列、或いは（２）配列番号１～９のいずれかで表されるアミノ酸配列において、1又は2個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含み、
    9～11アミノ酸の長さを有し、且つ
    HLAに拘束された細胞傷害性Tリンパ球を誘導し得るものである、ペプチド。
  19. 　細胞傷害性T細胞の活性化において使用するための、請求項３記載のペプチド結合リポソーム。
  20. 　細胞傷害性T細胞の活性化において使用するための、請求項３記載のペプチド結合リポソーム及びCpG-DNAを含有する医薬組成物。
  21. 　鳥インフルエンザに対するワクチン接種において使用するためのペプチドであって、
    該ペプチドが、（１）配列番号１～９のいずれかで表されるアミノ酸配列、或いは（２）配列番号１～９のいずれかで表されるアミノ酸配列において、1又は2個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含み、
    9～11アミノ酸の長さを有し、且つ
    HLAに拘束された細胞傷害性Tリンパ球を誘導し得るものである、ペプチド。
  22. 　鳥インフルエンザに対するワクチン接種において使用するための、請求項３記載のペプチド結合リポソーム。
  23. 　鳥インフルエンザに対するワクチン接種において使用するための、請求項３記載のペプチド結合リポソーム及びCpG-DNAを含有する医薬組成物。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012033142A1 (ja) 2010-09-08 2012-03-15 学校法人 埼玉医科大学 Ｃ型肝炎ウイルスリポソームワクチン
WO2012050193A1 (ja) * 2010-10-14 2012-04-19 学校法人 埼玉医科大学 エボラウイルスリポソームワクチン

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8828929B2 (en) * 2008-11-28 2014-09-09 Nof Corporation Cytotoxic T cell epitope peptide for SARS coronavirus, and use thereof
US11517617B2 (en) 2017-09-08 2022-12-06 The University Of Melbourne Methods and compositions for preventing influenza infection
EP3766514A4 (en) * 2018-01-26 2022-03-02 National Federation of Agricultural Cooperative Associations ANTIGEN SURFACE-COATED LIPOSOME VACCINE FOR NON-HUMAN ANIMALS

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001000225A1 (en) * 1999-06-29 2001-01-04 Epimmune Inc. Hla binding peptides and their uses
JP2005145959A (ja) * 2003-10-20 2005-06-09 Nof Corp リン脂質膜製剤
US20080032921A1 (en) * 2006-05-18 2008-02-07 Pharmexa Inc. Inducing immune responses to influenza virus using polypeptide and nucleic acid compositions
JP2008037831A (ja) 2006-08-09 2008-02-21 Nof Corp Ｔ細胞活性化剤
WO2008039267A2 (en) * 2006-07-21 2008-04-03 Pharmexa Inc. Inducing cellular immune responses to influenza virus using peptide and nucleic acid compositions
JP2008303444A (ja) 2007-06-11 2008-12-18 Koyo Thermo System Kk 連続浸炭方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4789633A (en) 1984-04-19 1988-12-06 University Of Tennessee Research Corporation Fused liposome and acid induced method for liposome fusion
US9340577B2 (en) 1992-08-07 2016-05-17 Epimmune Inc. HLA binding motifs and peptides and their uses

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001000225A1 (en) * 1999-06-29 2001-01-04 Epimmune Inc. Hla binding peptides and their uses
JP2005145959A (ja) * 2003-10-20 2005-06-09 Nof Corp リン脂質膜製剤
US20080032921A1 (en) * 2006-05-18 2008-02-07 Pharmexa Inc. Inducing immune responses to influenza virus using polypeptide and nucleic acid compositions
WO2008039267A2 (en) * 2006-07-21 2008-04-03 Pharmexa Inc. Inducing cellular immune responses to influenza virus using peptide and nucleic acid compositions
JP2008037831A (ja) 2006-08-09 2008-02-21 Nof Corp Ｔ細胞活性化剤
JP2008303444A (ja) 2007-06-11 2008-12-18 Koyo Thermo System Kk 連続浸炭方法

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOCHIM. BIOPHYS. ACTA, vol. 1489, 1999, pages 107 - 116
COTTEY R, ROWE CA, BENDER BS: "Current Protocols in Immunology", 2001, JOHN WILEY & SONS, INC., article "Influenza virus", pages: 19.11.1 - 19.11.32
COTTEY R, ROWE CA, BENDER BS: "Influenza virus. In Current Protocols in Immunology", 2001, JOHN WILEY & SONS, INC., pages: 19.11.1 - 19.11.32
CURR. OPIN. MICROBIOL., vol. 6, 2003, pages 472 - 477
J VIROL, vol. 78, 2004, pages 9093 - 9104
See also references of EP2368899A4
TETSUYA UCHIDA ET AL.: "Banno Influenza Vaccine Jitsugen e Tsunagaru CTL Yudogata Liposome Vaccine no Kaihatsu", BIO INDUSTRY, vol. 25, no. 11, 12 November 2008 (2008-11-12), pages 95 - 103, XP008164379 *
TETSUYA UCHIDA ET AL.: "Liposome Hyomen Ketsugo Kogen o Mochiita Vaccine Sosei", JAPANESE JOURNAL OF CLINICAL MEDICINE, vol. 66, no. 10, 1 October 2008 (2008-10-01), pages 1894 - 1902, XP008164339 *
VACCINE, vol. 25, 2007, pages 4914 - 4921

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012033142A1 (ja) 2010-09-08 2012-03-15 学校法人 埼玉医科大学 Ｃ型肝炎ウイルスリポソームワクチン
JP5930967B2 (ja) * 2010-09-08 2016-06-08 学校法人 埼玉医科大学 Ｃ型肝炎ウイルスリポソームワクチン
US9814785B2 (en) 2010-09-08 2017-11-14 Saitama Medical University Hepatitis C virus liposome vaccine
WO2012050193A1 (ja) * 2010-10-14 2012-04-19 学校法人 埼玉医科大学 エボラウイルスリポソームワクチン

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