WO2012050193A1 - エボラウイルスリポソームワクチン - Google Patents

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WO2012050193A1
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liposome
amino acid
acid sequence
phospholipid
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政則 松井
内田　哲也
麻衣子 種市
愛 三熊
横山　晶一
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学校法人 埼玉医科大学
国立感染症研究所長が代表する日本国
日油株式会社
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    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/14011—Filoviridae
    • C12N2760/14111—Ebolavirus, e.g. Zaire ebolavirus
    • C12N2760/14134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • the present invention relates to peptide-bonded liposomes and peptides useful as Ebola virus vaccines, and uses thereof.
  • Ebola virus is a minus-strand RNA virus of the Filoviridae family. Ebola virus causes severe Ebola hemorrhagic fever in primates, including humans. The fatality rate is extremely high, sometimes exceeding 90%. Therefore, strict containment of BSL4 is necessary when conducting research. Although bats have been reported to be natural hosts for Ebola virus, there are many unclear points. Ebola hemorrhagic fever was a pandemic in Sudan and Zaire in 1976, followed by sporadic epidemics in Central and West Africa. Originally considered a regional disease in Africa, the epidemic in the monkey quarantine room in the United States in 1989 led to a new recognition of the threat of Ebola virus in developed countries.
  • Non-patent Document 1 CTLs and antibodies against Ebola virus antigens exist in humans who have been infected with Ebola virus but have not died.
  • Non-Patent Document 2 In infection tests using mice, it has been reported that neutralizing antibodies and CTLs against Ebola virus antigens were effective (Non-Patent Documents 2 and 3).
  • Non-Patent Documents 4 to 7 Further, in infection tests using monkeys, it has been reported that DNA vaccines and recombinant virus vaccines were effective in suppressing infection by inducing cellular immunity and humoral immunity.
  • Non-patent Document 8 there is a report that neutralizing antibodies against Ebola virus antigens were ineffective.
  • Ebola virus humoral immunity
  • CTL cellular immunity
  • Patent Document 1 can efficiently and specifically enhance CTL for killing pathogen-infected cells or cancer cells using liposomes to which antigens are bound, and is useful for prevention and treatment of infectious diseases and cancers.
  • a method for preparing a T cell activator is disclosed.
  • Patent Document 2 discloses that an antigenic epitope particularly effective for the preparation of cytotoxic T lymphocytes was found from the highly conserved internal protein sequence of avian influenza virus, and the peptide containing the epitope was bound to the surface. It has been described that the prepared liposomes can induce extremely specific antigen-specific cytotoxic T lymphocytes.
  • JP 2008-37831 A International Publication No. 2010/061924
  • the problem to be solved by the present invention is that peptides capable of efficiently inducing cytotoxic T lymphocytes against Ebola virus antigens and expected to have therapeutic or preventive effects on Ebola virus infection and diseases resulting from the infection To provide a vaccine.
  • the present inventors have conducted intensive studies and searched for antigen epitopes that are particularly effective for inducing cytotoxic T lymphocytes in Ebola virus antigens, and as a result, found several excellent antigen epitopes. It was.
  • antigen-specific cytotoxic T lymphocytes can be induced extremely strongly, and Ebola virus infection and diseases associated with the infection can be treated or prevented.
  • the present invention has been completed.
  • a liposome to which a peptide is bound The peptide is (1) a partial sequence of 9 amino acids continuous contained in the amino acid sequence of an Ebola virus antigen protein, or (2) an amino acid sequence in which one or two amino acids are substituted in the amino acid sequence of (1), and Having a length of 9-11 amino acids, An Ebola virus antigenic peptide capable of inducing cytotoxic T lymphocytes restricted to HLA-A * 0201 or HLA-A * 2402;
  • the liposome contains a phospholipid having an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond or a hydrocarbon group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond, and a liposome stabilizer.
  • peptide is bound to the surface of the liposome; Peptide-bound liposomes.
  • phospholipid is a phospholipid having a C 14-24 acyl group having one unsaturated bond.
  • acyl group is an oleoyl group.
  • the phospholipid is at least one selected from diacylphosphatidylserine, diacylphosphatidylglycerol, diacylphosphatidic acid, diacylphosphatidylcholine, diacylphosphatidylethanolamine, succinimidyl-diacylphosphatidylethanolamine, and maleimide-diacylphosphatidylethanolamine.
  • the peptide-bonded liposome according to any one of [1] to [3].
  • [5] The peptide-bonded liposome according to any one of [1] to [4], wherein the liposome stabilizer is cholesterol.
  • the peptide has an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond or a hydrocarbon group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond contained in the phospholipid membrane constituting the liposome.
  • the peptide-bonded liposome according to any one of [1] to [5], which is bound to a phospholipid.
  • peptide-bonded liposome according to any one of [1] to [6], wherein the liposome has the following composition: (A) a phospholipid having 1 to 99.8 mol% of an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond or a hydrocarbon group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond; (B) Liposome stabilizer 0.2 to 75 mol%.
  • the peptide-bonded liposome according to any one of [1] to [7], wherein the liposome has the following composition: (I) An acidic phospholipid having 1 to 85 mol% of an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond or a hydrocarbon group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond; (II) a neutral phospholipid having an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond or a hydrocarbon group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond; 0.01 to 80 mol%; (III) Phospholipids having a peptide-bonded acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond or a hydrocarbon group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond 0.2 to 80 mol %; (IV) Liposome stabilizer 0.2-75 mol%.
  • the Ebola virus antigen protein is any one selected from the group consisting of Nucleoprotein, virion structural protein 40, Glycoprotein, virion structural protein 30 and RNA-dependent RNA polymer [8] The peptide-bonded liposome according to 1. [10] The peptide-bonded liposome according to any one of [1] to [9], wherein the partial sequence is the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 23.
  • a peptide capable of inducing cytotoxic T lymphocytes restricted by HLA-A * 0201 (1) an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 14, or (2) an amino acid sequence in which one or two amino acids are substituted in the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 14 And having a length of 9 to 11 amino acids.
  • a peptide capable of inducing cytotoxic T lymphocytes restricted to HLA-A * 2402 (1) an amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 15 to 23, or (2) an amino acid sequence in which one or two amino acids are substituted in the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 15 to 23 And having a length of 9 to 11 amino acids.
  • a cytotoxic T lymphocyte activator comprising the peptide-bonded liposome according to any one of [1] to [10] or the peptide according to [11] or [12].
  • An Ebola virus vaccine comprising the peptide-bound liposome according to any one of [1] to [10] or the peptide according to [11] or [12].
  • the Ebola virus vaccine according to [15] further comprising an adjuvant.
  • cytotoxic T lymphocytes against the Ebola virus antigen can be efficiently induced, and excellent therapeutic or preventive effects on Ebola virus infection and diseases caused by the infection are expected. it can.
  • the vertical axis represents IFN- ⁇ expression, and the horizontal axis represents CD8 expression.
  • the numbers in the graph indicate the percentage of gated CD8 + / IFN- ⁇ + T cells.
  • Induction of CD8 + / IFN- ⁇ + T cells by various peptide-bound liposomes. ( ⁇ 2) indicates immunization twice. All others were immunized once.
  • the vertical axis represents IFN- ⁇ expression, and the horizontal axis represents CD8 expression.
  • the numbers in the graph indicate the percentage of gated CD8 + / IFN- ⁇ + T cells.
  • Induction of CTL activity in vivo by various peptide-bound liposomes The number of immunizations is one.
  • the vertical axis represents the number of cells, and the horizontal axis represents CFSE expression.
  • the numbers in the graph indicate the percentage of cells in the M2 gate that were killed.
  • Induction of CD8 + / IFN- ⁇ + T cells by various peptide-bound liposomes The vertical axis represents IFN- ⁇ expression, and the horizontal axis represents CD8 expression.
  • the numbers in the graph indicate the percentage of gated CD8 + / IFN- ⁇ + T cells.
  • Induction of CTL activity in vivo by various peptide-bound liposomes The vertical axis represents the number of cells, and the horizontal axis represents CFSE expression.
  • the numbers in the graph indicate the percentage of cells in the gate that were killed.
  • the present invention is capable of inducing cytotoxic T lymphocytes restricted to HLA-A * 0201 or HLA-A * 2402, and has an Ebola virus antigenic peptide (peptide of the present invention) having a length of 9 to 11 amino acids. )I will provide a.
  • the peptide of the present invention is (1) A partial sequence of 9 amino acids long contained in the amino acid sequence of the Ebola virus antigen protein, or (2) an amino acid sequence in which one or two amino acids are substituted in the amino acid sequence of (1).
  • the Ebola virus antigen protein is preferably selected from the group consisting of Nucleoprotein (NP), virion structural protein 40 (VP40), Glycoprotein (GP), virion structural protein 30 (VP30) and RNA-dependent group. This protein.
  • the Ebola virus antigen protein is preferably RNA-dependent RNA polymerase (L).
  • Ebola virus includes Zaire strain, Sudan strain, Reston strain, Côte d'Ivoire strain, and Bundibuyo strain.
  • the Ebola virus is preferably a Zaire strain.
  • a representative amino acid sequence of Nucleoprotein (NP) of the Ebola virus Zaire strain is shown in SEQ ID NO: 24.
  • a typical amino acid sequence of virion structural protein 40 (VP40) of the Ebola virus Zaire strain is shown in SEQ ID NO: 25.
  • a representative amino acid sequence of Glycoprotein (GP) of Ebola virus Zaire strain is shown in SEQ ID NO: 26.
  • a representative amino acid sequence of virion structural protein 30 (VP30) of the Ebola virus Zaire strain is shown in SEQ ID NO: 27.
  • a representative amino acid sequence of RNA-dependent RNA polymerase (L) of Ebola virus Zaire strain is shown in SEQ ID NO: 28.
  • the present invention provides a peptide capable of inducing cytotoxic T lymphocytes restricted to HLA-A * 0201, comprising: In the amino acid sequence represented by (1 ′) any of SEQ ID NOs: 1 to 14 or (2 ′) amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 14, one or two amino acids were substituted. Peptides (peptides of the invention) comprising an amino acid sequence and having a length of 9-11 amino acids are provided.
  • the present invention has been completed based on the discovery of the following excellent epitope sequences (epitope sequences of the present invention) in the Ebola virus antigen protein: An amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 14; an amino acid sequence in which one or two amino acids are substituted in the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 14 (wherein the amino acids A peptide consisting of the sequence can induce cytotoxic T lymphocytes restricted to HLA-A * 0201).
  • amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1-14 are Nucleoprotein (NP) (SEQ ID NOs: 1-2), which is a protein of the Ebola virus Zaire strain, virion structural protein 40 (VP40) (SEQ ID NO: 3), Glycoprotein (GP) (SEQ ID NOs: 4-7), virion structural protein 30 (VP30) (SEQ ID NO: 8) or RNA-dependent RNA polymerase (L) (SEQ ID NOs: 9 to 14) It corresponds to a continuous partial sequence contained in the amino acid sequence.
  • NP Nucleoprotein
  • VP40 virion structural protein 40
  • GP Glycoprotein
  • VP30 virion structural protein 30
  • L RNA-dependent RNA polymerase
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 corresponds to a 9-amino acid continuous partial sequence starting from the 56th isoleucine contained in the NP amino acid sequence of the Ebola virus Zaire strain (NP-56).
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 corresponds to a partial sequence of 9 amino acids long starting from the 401st arginine contained in the NP amino acid sequence of the Ebola virus Zaire strain (NP-401).
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 corresponds to a partial sequence of 9 amino acids long starting from the 73rd phenylalanine contained in the VP40 amino acid sequence of the Ebola virus Zaire strain (VP40-73).
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 corresponds to a partial sequence of 9 amino acids long starting from the 25th isoleucine contained in the amino acid sequence of GP of Ebola virus Zaire strain (GP-25).
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 corresponds to a partial sequence of 9 amino acids continuous starting from the 160th phenylalanine contained in the GP amino acid sequence of Ebola virus Zaire strain (GP-160).
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 corresponds to a continuous partial sequence of 9 amino acids long starting from the 252nd phenylalanine contained in the GP amino acid sequence of Ebola virus Zaire strain (GP-252).
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 corresponds to a continuous partial sequence of 9 amino acids long starting from the 546th glycine contained in the GP amino acid sequence of the Ebola virus Zaire strain (GP-546).
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 corresponds to a continuous 9-amino acid long partial sequence starting from the 94th serine contained in the VP30 amino acid sequence of the Ebola virus Zaire strain (VP30-94).
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 corresponds to a continuous partial sequence of 9 amino acids in length starting from the 209th alanine contained in the L amino acid sequence of the Ebola virus Zaire strain (L-209).
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 corresponds to a continuous partial sequence of 9 amino acids long starting from the 293rd lysine contained in the L amino acid sequence of the Ebola virus Zaire strain (L-293).
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 corresponds to a continuous partial sequence of 9 amino acids long starting from the 771st arginine contained in the L amino acid sequence of the Ebola virus Zaire strain (L-771).
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 corresponds to a continuous 9-amino acid long partial sequence starting from the 932rd glycine contained in the L amino acid sequence of the Ebola virus Zaire strain (L-932).
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 corresponds to a continuous 9-amino acid long partial sequence starting from the 1099th alanine contained in the L amino acid sequence of the Ebola virus Zaire strain (L-1099).
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 corresponds to a partial sequence of 9 amino acids long starting from the 1955th valine contained in the L amino acid sequence of the Ebola virus Zaire strain (L-1955).
  • the mode of substitution in (2 ′) is not particularly limited as long as the peptide comprising the amino acid sequence can induce cytotoxic T lymphocytes restricted by HLA-A * 0201, but an Ebola virus strain different from the Zaire strain (Type / subtype) (Example: Sudan strain, Reston strain, Côte d'Irete strain, Bundi Bugyo strain) Reflecting known amino acid mutations occurring in the corresponding epitope sequences in the same antigen is a preferred embodiment.
  • the present invention is a peptide capable of inducing cytotoxic T lymphocytes restricted to HLA-A * 2402. (1 ′′) in the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 15 to 23, or (2 ′′) in the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 15 to 23, 1 or 2 amino acids are substituted.
  • a peptide (the peptide of the present invention) is provided which comprises the prepared amino acid sequence and has a length of 9 to 11 amino acids.
  • the present invention has been completed based on the discovery of the following excellent epitope sequences (epitope sequences of the present invention) in RNA-dependent RNA polymerase (L) of Ebola virus: An amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 15 to 23; an amino acid sequence in which one or two amino acids have been substituted in the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 15 to 23 (wherein the amino acids A peptide consisting of the sequence can induce cytotoxic T lymphocytes restricted to HLA-A * 2402.
  • amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 15 to 23 correspond to continuous partial sequences contained in the amino acid sequence of RNA-dependent RNA polymerase (L) of Ebola virus Zaire.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 corresponds to a continuous partial sequence of 9 amino acids long starting from the 105th lysine contained in the L amino acid sequence of the Ebola virus Zaire strain (L-105).
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 corresponds to a partial sequence of 9 amino acids long starting from the 407th threonine contained in the L amino acid sequence of the Ebola virus Zaire strain (L-407).
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 corresponds to a partial sequence of 9 amino acids continuous starting from the 1087th serine contained in the L amino acid sequence of the Ebola virus Zaire strain (L-1087).
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18 corresponds to a continuous partial sequence of 9 amino acids long starting from the 1359th glutamine contained in the L amino acid sequence of the Ebola virus Zaire strain (L-1359).
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 corresponds to a continuous partial sequence of 9 amino acids long starting from the 1847th lysine contained in the L amino acid sequence of the Ebola virus Zaire strain (L-1847).
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 corresponds to a continuous 9-amino acid long partial sequence starting from the 1939th leucine contained in the L amino acid sequence of the Ebola virus Zaire strain (L-1939).
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 corresponds to a partial sequence of 9 amino acids long starting from the 1943th valine contained in the L amino acid sequence of the Ebola virus Zaire strain (L-1943).
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 corresponds to a continuous 9-amino acid partial sequence starting from the 2000th tryptophan contained in the L amino acid sequence of the Ebola virus Zaire strain (L-2000).
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23 corresponds to a partial sequence of 9 amino acids long starting from the 2046th glutamine contained in the L amino acid sequence of the Ebola virus Zaire strain (L-2046).
  • the mode of substitution in (2 ′′) is not particularly limited as long as the peptide comprising the amino acid sequence can induce cytotoxic T lymphocytes restricted by HLA-A * 2402, but the Zaire strain Preferred is one that reflects known amino acid mutations in the corresponding epitope sequence in the same antigen of Ebola virus strains (types / subtypes) (eg, Sudan strains, Reston strains, Côte d'Irete strains, Bundibugi strains) As an example.
  • a peptide comprising the epitope sequence of the present invention has the following excellent properties:
  • the epitope peptide of the present invention has excellent binding properties to HLA-A * 0201 or HLA-A * 2402, which are the world's most popular human major histocompatibility antigens (HLA). -Stable presentation on A * 0201 or HLA-A * 2402.
  • HLA-A * 0201 or HLA-A * 2402. Since the epitope peptide of the present invention has the characteristics of (A) above, it can strongly induce cytotoxic T lymphocytes restricted by HLA-A * 0201 or HLA-A * 2402.
  • Antigen induces cytotoxic T lymphocytes restricted by HLA means that a mammal (eg, human, transgenic mouse, etc.) expressing a specific HLA (eg, HLA-A * 0201) is expressed as an antigen.
  • a mammal eg, human, transgenic mouse, etc.
  • HLA-A * 0201 the number and / or activity of cytotoxic T lymphocytes that are restricted by the HLA and specifically recognize the antigen (for example, IFN- ⁇ production or cytotoxicity) Activity).
  • HLA-A * 0201 and HLA-A * 2402 are the most popular HLA in the world, the epitope peptide of the present invention can be used in many humans in the world (especially regardless of race).
  • HLA-A * 0201 or HLA-A * 2402 expressing human) cytotoxic T lymphocytes can be induced to activate cellular immunity.
  • the peptide of the present invention may be the above-described epitope peptide of the present invention, or may be cleaved by the action of a proteasome or the like in a cell (preferably a human dendritic cell) to give the above-described epitope peptide of the present invention. Therefore, the peptide of the present invention has substantially the same excellent characteristics as the epitope peptide of the present invention, and the cytotoxic T lymphocyte activator and Ebola virus vaccine of the present invention as described below are produced. When used in the above, it can be expected to exhibit excellent effects in killing cells infected with Ebola virus and protecting against Ebola virus infection.
  • the length of the peptide of the present invention is not particularly limited, but is usually 9 to 11 amino acids, preferably 9 to 10 amino acids, more preferably 9 amino acids.
  • the peptide has an additional sequence on the N-terminal side and / or C-terminal side of the epitope sequence of the present invention.
  • the length of the additional sequence and the amino acid sequence are not particularly limited as long as the above properties of the peptide are not impaired.
  • the additional sequence may be an amino acid sequence actually present adjacent to the epitope sequence in the protein amino acid sequence of the Ebola virus Zaire strain from which each epitope sequence is derived.
  • the additional sequence that can be included in the peptide is from SEQ ID NO: 1 included in the amino acid sequence of Nucleoprotein (NP) of the Ebola virus Zaire strain. It may be an amino acid sequence that actually exists adjacent to the partial amino acid sequence.
  • NP Nucleoprotein
  • the peptide is presented on the major histocompatibility complex (MHC) in the cell, residues that can overcome the selection of the presented antigen due to individual differences (polymorphisms) of MHC are also added. Preferred as an array.
  • MHC major histocompatibility complex
  • the peptide of the present invention can be prepared by a known peptide synthesis technique such as liquid phase synthesis or solid phase peptide synthesis.
  • the peptide is produced by culturing a transformant (such as E. coli) into which an expression vector capable of expressing the peptide is introduced, and isolating the peptide from the culture by a well-known purification technique such as an affinity column. can do.
  • An expression vector capable of expressing the peptide can be constructed by linking a polynucleotide encoding the peptide downstream of a promoter in an appropriate expression vector using well-known genetic engineering techniques.
  • Peptide-bound liposome The present invention is a liposome to which the peptide of the present invention is bound,
  • the liposome contains a phospholipid having an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond or a hydrocarbon group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond, and a liposome stabilizer.
  • the peptide of the present invention is bound to the surface of the liposome; Peptide-bound liposomes (peptide-bound liposomes of the present invention) are provided.
  • one of the objects of the present invention is to provide cytotoxic T for killing Ebola virus-infected cells (preferably cells presenting the peptide of the present invention on HLA-A * 0201 by Ebola virus infection). It is to efficiently and specifically enhance lymphocytes (CD8 + T cells, CTL).
  • the peptide of the present invention used for the peptide-bonded liposome of the present invention is preferably an amino acid represented by SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 13 or 14. It contains an array.
  • one of the objects of the present invention is to provide cytotoxicity for killing Ebola virus-infected cells (preferably cells presenting the peptides of the present invention on HLA-A * 2402 by Ebola virus infection). This is to efficiently and specifically enhance T lymphocytes (CD8 + T cells, CTL).
  • the peptide of the present invention used for the peptide-bonded liposome of the present invention preferably contains the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, 16, 17, 20, 21, or 22.
  • the phospholipid membrane constituting the liposome part of the peptide-bonded liposome of the present invention is such that the phospholipid that is an amphiphilic surfactant forms an interface with the polar group facing the aqueous phase, and the hydrophobic group is on the opposite side of the interface It has a structure suitable for.
  • the liposome refers to a phospholipid bilayer membrane having a closed space.
  • the peptide contained in the peptide-bonded liposome of the present invention can be bound to the surface of the liposome via a functional group that it has.
  • the functional group in the peptide used for binding to the liposome surface include an amino group, a thiol group, a carboxyl group, a hydroxyl group, a disulfide group, or a hydrophobic group composed of a hydrocarbon group (alkyl group or the like) having a methylene chain. It is done.
  • amino group, thiol group, carboxyl group, hydroxyl group and disulfide group are covalently bonded, amino group and carboxyl group are bonded by ionic bond, hydrophobic group is hydrophobic group by hydrophobic bond, and the peptide is attached to the surface of liposome.
  • the peptide is preferably bound to the surface of the liposome via an amino group, carboxyl group or thiol group.
  • the phospholipid membrane constituting the liposome has an amino group, a succinimide group, a maleimide group, a thiol group, It is desirable to have a functional group such as a hydrophobic group composed of a carboxyl group, a hydroxyl group, a disulfide group, or a hydrocarbon group having a methylene chain (such as an alkyl group).
  • the functional group possessed by the phospholipid membrane constituting the liposome is preferably an amino group, a succinimide group or a maleimide group.
  • the combination of the functional group of the peptide involved in the binding of the peptide to the liposome and the functional group of the phospholipid membrane constituting the liposome can be freely selected within a range that does not affect the effects of the present invention.
  • Preferred combinations include an amino group and an aldehyde group, an amino group and an amino group, an amino group and a succinimide group, a thiol group and a maleimide group, respectively.
  • the ionic bond and the hydrophobic bond are preferable from the viewpoint of easy preparation of the peptide bond to the liposome, and the covalent bond is preferably a peptide bond point or peptide bond on the liposome surface.
  • the peptide-bound liposome of the present invention is that a peptide having a cytotoxic T lymphocyte activation effect is bound to the surface of the liposome, which is a constituent component thereof. Therefore, it is preferable from the viewpoint of further enhancing the effect of the present invention that the peptide is stably bound to the surface of the liposome even after being administered into the living body, for example, by an injection action in a practical stage. From such a viewpoint, the bond between the peptide and the liposome is preferably a covalent bond.
  • the phospholipid membrane constituting the liposome part of the peptide-bonded liposome of the present invention comprises an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond or a hydrocarbon group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond. It contains a phospholipid having, and a liposome stabilizer.
  • the carbon number of the acyl group is preferably 16 to 22, more preferably 18 to 22, and most preferably 18 It is.
  • Specific examples of the acyl group include a palmitooleoyl group, an oleoyl group, and an elcoyl group, and an oleoyl group is most preferred.
  • the carbon number of the hydrocarbon group is preferably 16 to 22, more preferably 18 to 22, most preferably 18 is preferable.
  • Specific examples of the hydrocarbon group include a tetradecenyl group, a hexadecenyl group, an octadecenyl group, a C20 monoene group, a C22 monoene group, and a C24 monoene group.
  • the unsaturated acyl group or unsaturated hydrocarbon group bonded to the 1-position and 2-position of the glycerin residue of the phospholipid may be the same or different. From the viewpoint of industrial productivity, the 1-position and 2-position groups are preferably the same.
  • a phospholipid having a C 14-24 acyl group having one unsaturated bond is preferably used.
  • an Ebola virus-infected cell preferably a cell in which the peptide of the present invention is presented on HLA-A * 0201 by Ebola virus infection, or the peptide of the present invention by Ebola virus infection is HLA-A *
  • the phospholipid preferably has an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond.
  • Examples of phospholipids having an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond or a hydrocarbon group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond include acidic phospholipids, neutral phospholipids, and peptides. Examples include reactive phospholipids having a functional group capable of binding. These can be selected as appropriate according to various requirements.
  • phosphatidylserine phosphatidylglycerol, phosphatidic acid, phosphatidylinositol and the like can be used.
  • Serine, diacylphosphatidylglycerol, diacylphosphatidic acid, and diacylphosphatidylinositol are preferably used.
  • the acidic phospholipid imparts an anionic ionizing group to the surface of the liposome, and thus imparts a negative zeta potential to the surface of the liposome. For this reason, liposomes have a charge repulsive force and can exist as a stable preparation in an aqueous solvent. Thus, acidic phospholipids are important in ensuring the stability of the liposome when the peptide-bound liposome of the present invention is in an aqueous solvent.
  • the neutral phospholipid for example, phosphatidylcholine and the like can be used.
  • the neutral phospholipid that can be used in the present invention can be used by appropriately selecting the type and amount thereof within the scope of achieving the enhancement of CTL activity addressed by the present invention.
  • the neutral phospholipid has a higher function of stabilizing the liposome and can improve the stability of the membrane, compared to the phospholipid to which the acidic phospholipid and the peptide of the present invention are bound.
  • the phospholipid membrane constituting the liposome part of the peptide-bonded liposome of the present invention preferably contains a neutral phospholipid.
  • the amount of neutral phospholipid used can be determined after ensuring the contents of acidic phospholipids used to achieve the CTL activity enhancing effect, reactive phospholipids for peptide bonds, and liposome stabilizers.
  • the peptide of the present invention contains an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond and 14 carbon atoms having one unsaturated bond contained in the phospholipid membrane constituting the liposome. It binds to the surface of liposomes by binding to phospholipids having ⁇ 24 hydrocarbon groups.
  • a reactive phospholipid having a functional group to which the peptide of the present invention can bind is used as the phospholipid for the peptide bond.
  • Reactive phospholipids having an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond or a hydrocarbon group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond can be classified according to various requirements, The ratio is appropriately selected.
  • the unsaturated acyl group or unsaturated hydrocarbon group contained in the phospholipid has more than 24 or less than 14.
  • Examples of the reactive phospholipid include phosphatidylethanolamine or a terminally modified product thereof. Further, phosphatidylglycerol, phosphatidylserine, phosphatidic acid, phosphatidylinositol, and terminally modified products thereof can also be used as reactive phospholipids. From the viewpoint of industrial availability, simplicity of the coupling step with the peptide of the present invention, yield, etc., phosphatidylethanolamine or a terminally modified product thereof is preferably used. Phosphatidylethanolamine has an amino group capable of binding the peptide of the present invention at its terminal.
  • the number of carbon atoms having one unsaturated bond is 14 to 14 carbon atoms.
  • diacylphosphatidylethanolamine having 24 acyl groups or a terminally modified product thereof.
  • Diacylphosphatidylethanolamine can be obtained, for example, by subjecting diacylphosphatidylcholine as a raw material to a base exchange reaction between choline and ethanolamine using phospholipase D.
  • a crude reaction product can be obtained by mixing a chloroform solution in which diacylphosphatidylcholine is dissolved with water in which phospholipase D and ethanolamine are dissolved in an appropriate ratio.
  • the crude reaction product can be purified on a silica gel column using a chloroform / methanol / water solvent to obtain the desired diacylphosphatidylethanolamine.
  • a person skilled in the art can carry out by appropriately selecting column purification conditions such as a solvent composition ratio.
  • the terminally modified product examples include a diacylphosphatidylethanolamine terminally modified product in which one end of a divalent reactive compound is bonded to the amino group of diacylphosphatidylethanolamine.
  • a divalent reactive compound a compound having at least one aldehyde group or succinimide group capable of reacting with the amino group of diacylphosphatidylethanolamine can be used.
  • the divalent reactive compound having an aldehyde group include glyoxal, glutaraldehyde, succindialdehyde, terephthalaldehyde and the like.
  • glutaraldehyde is used.
  • Dithiobis succinimidyl propionate
  • ethylene glycol-bis succinimidyl succinate
  • disuccinimidyl succinate disuccinimidyl suberate
  • divalent reactive compound having a succinimide group or Examples include disuccinimidyl glutarate.
  • N-succinimidyl-4- (p-maleimidophenyl) butyrate N-succinimidophenyl butyrate
  • sulfosuccinimidyl-4- (p-maleimide) Phenyl) butyrate N-succinimidyl-4- (p-maleimidophenyl) acetate
  • succinimidyl-4- (N-maleimidoethyl) -cyclohexane-1-carboxylate examples include sulfosuccinimidyl-4- (N-maleimidoethyl) -cyclohexane-1-carboxylate, N- ( ⁇ -maleimidobutyryloxy) succinimide, N- ( ⁇ -maleimidocaproyloxy) succinimide,
  • a diacylphosphatidylethanolamine terminal modified product having a maleimide group as a functional group can be obtained.
  • a functional group at one end of the divalent reactive compound as described above can be bonded to the amino group of diacylphosphatidylethanolamine to obtain a diacylphosphatidylethanolamine terminal-modified product.
  • Examples of a method for binding a peptide to the surface of the liposome include a method of preparing a liposome containing the above-mentioned reactive phospholipid and then adding the peptide to bind the peptide to the reactive phospholipid of the liposome. it can. In addition, by previously binding the peptide to the reactive phospholipid, and then mixing the obtained reactive phospholipid bound to the peptide with a phospholipid other than the reactive phospholipid and a liposome stabilizer. In addition, it is possible to obtain a liposome having a peptide bound to its surface. Methods for conjugating peptides to reactive phospholipids are well known in the art.
  • the phospholipid membrane constituting the liposome part of the peptide-bonded liposome of the present invention comprises an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond or a hydrocarbon group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond. It contains at least one, for example two or more, preferably three or more phospholipids.
  • the phospholipid membrane constituting the liposome part of the peptide-bonded liposome of the present invention includes diacylphosphatidylserine, diacylphosphatidylglycerol, diacylphosphatidic acid, diacylphosphatidylcholine, diacylphosphatidylethanolamine, succinimidyl-diacylphosphatidylethanolamine, and maleimide-diacyl At least one selected from phosphatidylethanolamine, for example, 2 or more, preferably 3 or more, an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond, or 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond A phospholipid having a hydrocarbon group.
  • the phospholipid membrane constituting the liposome part of the peptide-bonded liposome of the present invention is An acidic phospholipid having an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond or a hydrocarbon group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond; A neutral phospholipid having an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond or a hydrocarbon group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond, and 14 carbon atoms having one unsaturated bond It is preferable to contain at least one reactive phospholipid having a C14-24 hydrocarbon group having 1 to 24 acyl groups or one unsaturated bond.
  • sterols and tocopherols can be used as the liposome stabilizer.
  • the sterols may be those generally known as sterols, and examples thereof include cholesterol, sitosterol, campesterol, stigmasterol, and brassicasterol, and particularly preferably from the viewpoint of availability, Cholesterol is used.
  • tocopherol what is generally known as tocopherol should just be mentioned, For example, commercially available alpha-tocopherol is mentioned preferably from points, such as availability.
  • the phospholipid membrane constituting the liposome part of the peptide-bonded liposome of the present invention may contain a known component capable of constituting the liposome.
  • composition of the phospholipid membrane constituting the liposome portion of the peptide-bonded liposome of the present invention include the following: (A) a phospholipid having 1 to 99.8 mol% of an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond or a hydrocarbon group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond; (B) Liposome stabilizer 0.2 to 75 mol% In addition, content of each component is displayed as mol% with respect to all the structural components of the phospholipid membrane which comprises the liposome part of a peptide bond liposome.
  • the content of component (A) is preferably 10 to 90 mol%, more preferably 30 to 80 mol%, and still more preferably 50 to 70 mol%, from the viewpoint of liposome stability.
  • the content of the component (B) is preferably 5 to 70 mol%, more preferably 10 to 60 mol%, still more preferably 20 to 50 mol%, from the viewpoint of liposome stability.
  • the content of the stabilizer exceeds 75 mol%, the stability of the liposome is impaired, which is not preferable.
  • the component (A) includes the following: (A) a phospholipid having an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond or a hydrocarbon group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond, to which no peptide is bound, and (b) ) A phospholipid having an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond or a hydrocarbon group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond, to which a peptide is bound.
  • the content of the component (a) is usually 0.01 to 85 mol%, preferably 0.1 to 80 mol%, more preferably 0.1 to 60 mol%, still more preferably 0.1 to 50 mol%. It is.
  • the content of the component (b) is usually 0.2 to 80 mol%, preferably 0.3 to 60 mol%, more preferably 0.4 to 50 mol%, still more preferably 0.5 to 25 mol%. It is.
  • the content is less than 0.2 mol%, the amount of the peptide of the present invention decreases, and it becomes difficult to activate cytotoxic T lymphocytes at a practically sufficient level, and exceeds 80 mol%. And the stability of the liposomes is reduced.
  • the above component (a) phospholipid usually contains the above-mentioned acidic phospholipid and neutral phospholipid. Moreover, the above-mentioned reactive phospholipid is contained in the phospholipid of the said component (b).
  • the content of acidic phospholipid is usually 1 to 85 mol%, preferably 2 to 80 mol%, more preferably 4 to 60 mol%, and further preferably 5 to 40 mol%.
  • the content is less than 1 mol%, the zeta potential is reduced, the stability of the liposome is lowered, and it becomes difficult to activate cytotoxic T lymphocytes to a practically sufficient level.
  • the content exceeds 85 mol%, as a result, the content of the phospholipid bound to the peptide of the liposome decreases, and it is difficult to activate cytotoxic T lymphocytes to a practically sufficient level. Become.
  • the content of neutral phospholipid is usually 0.01 to 80 mol%, preferably 0.1 to 70 mol%, more preferably 0.1 to 60 mol%, still more preferably 0.1 to 50 mol%. is there.
  • the content of acidic phospholipids, peptide-bound phospholipids and liposome stabilizers contained in the liposomes decreases, and cytotoxic T lymphocytes are reduced to a practically sufficient level. It becomes difficult to activate.
  • the peptide-bound phospholipid is obtained by binding the peptide to the reactive phospholipid described above, and the ratio of the reactive phospholipid binding to the peptide is used for binding as long as the effect of the present invention is not hindered.
  • the type of functional group, coupling treatment conditions, and the like can be selected as appropriate.
  • a divalent reactive compound for example, when a terminal modified form of diacylphosphatidylethanolamine obtained by binding one end of disuccinimidylsuccinate, a divalent reactive compound, to the terminal amino group of diacylphosphatidylethanolamine is used as a reactive phospholipid.
  • a divalent reactive compound for example, 10-99% of the reactive phospholipid can be bound to the peptide.
  • the reactive phospholipid not bound to the peptide becomes acidic phospholipid and is contained in the liposome.
  • Preferred embodiments of the phospholipid membrane constituting the liposome part of the peptide-bonded liposome of the present invention can include the following compositions: (I) 1 to 85 mol% of acidic phospholipid having an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond or a hydrocarbon group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond; (II) 0.01 to 80 mol% of a neutral phospholipid having an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond or a hydrocarbon group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond; (III) Phospholipids having peptide-bound acyl groups having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond or hydrocarbon groups having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond 0.2 to 80 mol %; (IV) Liposome stabilizer 0.2 to 75 mol%. (Total 100 mol%)
  • the following composition can be mentioned: Component (I) 2-80 mol% Component (II) 0.1 to 70 mol% Component (III) 0.3-60 mol% 10 to 70 mol% of the above component (IV) (Total 100 mol%)
  • the following composition can be mentioned: Component (I) 4-60 mol% Component (II) 0.1-60 mol% Component (III) 0.4 to 50 mol% Component (IV) 20-60 mol% (Total 100 mol%)
  • compositions Component (I) 5-40 mol% Component (II) 0.1-50 mol% Component (III) 0.5-25 mol% Component (IV) 25-55 mol% (Total 100 mol%)
  • the peptide-bonded liposome of the present invention is characterized in that the unsaturated acyl group or unsaturated hydrocarbon group contained in the phospholipid in the phospholipid membrane constituting the liposome part has 14 to 24 carbon atoms.
  • a phospholipid containing an unsaturated acyl group or unsaturated hydrocarbon group having less than 14 or more than 24 carbon atoms may be included as long as the effects of the invention are not hindered.
  • the number of carbon atoms is 14 to 24 with respect to the total number of all unsaturated acyl groups or unsaturated hydrocarbon groups contained in the phospholipid in the phospholipid membrane constituting the liposome part of the peptide-bonded liposome of the present invention.
  • the ratio of the number of saturated acyl groups or unsaturated hydrocarbon groups is, for example, 50% or more, preferably 60% or more, more preferably 75% or more, still more preferably 90% or more, and most preferably 97% or more (for example, substantially 100%).
  • the phospholipid membrane constituting the liposome part of the peptide-bonded liposome of the present invention is a non-phospholipid lipid having an acyl group or a hydrocarbon group having 14 to 24 carbon atoms, as long as the effects of the present invention are not hindered. May be included.
  • the content of the lipid is usually 40 mol% or less, preferably 20 mol% or less, more preferably 10 mol% or less, still more preferably 5 mol% or less (for example, substantially 0 mol%).
  • the liposome portion of the peptide-bonded liposome of the present invention is appropriately formulated and processed using phospholipids, reactive phospholipids, liposome stabilizers, peptides, and the like, which are added to a suitable solvent, etc. It can be obtained by the method.
  • the form of the liposome is not particularly limited, and liposomes having various sizes and forms such as multilamellar liposomes, small unilamellar liposomes and large unilamellar liposomes are produced by appropriately selecting the above-described liposome production method. be able to.
  • the particle size of the liposome is not particularly limited, but from the viewpoint of storage stability, the particle size is 20 to 600 nm, preferably 30 to 500 nm, and preferably 40 to 400 nm, and more preferably. Is from 50 to 300 nm, most preferably from 70 to 230 nm.
  • a saccharide or a polyhydric alcohol is added to the inner aqueous phase and / or the outer aqueous phase of the liposome after the liposome preparation process or after the preparation. Also good.
  • saccharides or polyhydric alcohols are added and dissolved as a liposome protective agent, and water is removed by freeze-drying to freeze-dry the phospholipid composition. It is preferable to use a product.
  • saccharide examples include monosaccharides such as glucose, galactose, mannose, fructose, inositol, ribose and xylose; disaccharides such as saccharose, lactose, cellobiose, trehalose and maltose; trisaccharides such as raffinose and melezitose; oligosaccharides such as cyclodextrin Sugar; polysaccharides such as dextrin; sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, mannitol, maltitol and the like.
  • monosaccharides or disaccharides are preferable, and glucose or saccharose is more preferable in terms of availability.
  • polyhydric alcohols examples include glycerin-based compounds such as glycerin, diglycerin, triglycerin, tetraglycerin, pentaglycerin, hexaglycerin, heptaglycerin, octaglycerin, nonaglycerin, decaglycerin, polyglycerin; sorbitol, mannitol Sugar alcohol compounds such as ethylene glycol, diethylene glycol, triethylene glycol, tetraethylene glycol, pentaethylene glycol, hexaethylene glycol, heptaethylene glycol, octaethylene glycol, nonaethylene glycol and the like.
  • glycerin, diglycerin, triglycerin, sorbitol, mannitol, and polyethylene glycol having a molecular weight of 400 to 10,000 are preferable from the viewpoint of availability.
  • the concentration of saccharides or polyhydric alcohols contained in the inner aqueous phase and / or outer aqueous phase of the liposome is, for example, 1 to 20% by weight, preferably 2 to 10% by weight, based on the weight of the liposome liquid. Can be mentioned.
  • the peptide-bonded liposome of the present invention can be easily obtained by preparing a liposome before binding the peptide and then binding the peptide.
  • a suspension of liposomes containing phospholipids, liposome stabilizers, and reactive phospholipids for binding peptides to the membrane surface is prepared, and sucrose which is one of the above sugars in its outer aqueous phase 2 to 10% by weight is added and dissolved.
  • sucrose which is one of the above sugars in its outer aqueous phase 2 to 10% by weight is added and dissolved.
  • This sugar-added preparation is transferred to a 10 ml glass vial, placed in a shelf-type freeze dryer, cooled to ⁇ 40 ° C. or the like to freeze the sample, and a freeze-dried product is obtained by a conventional method.
  • the lyophilized product of the liposome obtained here can be stored for a long time since the water has been removed, and the final peptide of the present invention can be obtained by adding a specific peptide when necessary and carrying out the subsequent steps. Bound liposomes can be obtained simply and quickly. In the case where the interaction between the peptide and the liposome is strong and unstable, it is very convenient to store the liposome at the lyophilized product and bind the peptide when necessary.
  • the phospholipid membrane constituting the liposome part of the peptide-bonded liposome of the present invention can have a phospholipid to which a peptide is bound.
  • Examples of a method for obtaining liposomes containing phospholipids to which peptides are bound include the following methods (A) and (B).
  • a liposome containing a phospholipid, a reactive phospholipid, and a liposome stabilizer, a peptide and a divalent reactive compound are added thereto, and the functional group of the reactive phospholipid contained in the liposome And a functional group of the peptide linked via a divalent reactive compound.
  • divalent reactive compound that can be used here, those used in the preparation of a terminal modified form of a reactive phospholipid can be similarly used.
  • divalent reactive compound having an aldehyde group include glyoxal, glutaraldehyde, succindialdehyde, and terephthalaldehyde.
  • glutaraldehyde is used.
  • dithiobis succinimidyl propionate
  • ethylene glycol-bis succinimidyl succinate
  • disuccinimidyl succinate disuccinimidyl suberate as divalent reactive compounds having a succinimide group Or disuccinimidyl glutarate.
  • N-succinimidyl-4- (p-maleimidophenyl) butyrate N-succinimidophenyl butyrate
  • sulfosuccinimidyl-4- (p-maleimide) Phenyl) butyrate N-succinimidyl-4- (p-maleimidophenyl) acetate
  • succinimidyl-4- (N-maleimidoethyl) -cyclohexane-1-carboxylate Sulfosuccinimidyl-4- (N-maleimidoethyl) -cyclohexane-1-carboxylate
  • N- ( ⁇ -maleimidobutyryloxy) succinimide N- ( ⁇ -maleimidobutyryloxy) succinimide
  • N- ( ⁇ -maleimidocaproyloxy) succinimide etc
  • a liposome containing a phospholipid, a reactive phospholipid, and a liposome stabilizer is prepared, a peptide is added thereto, and the functional group of the reactive phospholipid and the functional group of the peptide are contained in the liposome.
  • Examples of the type of bond in the above (A) and (B) include an ionic bond, a hydrophobic bond, and a covalent bond, and a covalent bond is preferable.
  • Specific examples of the covalent bond include a Schiff base bond, an amide bond, a thioether bond, and an ester bond.
  • the peptide can be bound to the reactive phospholipid contained in the phospholipid membrane constituting the liposome, and the phospholipid bound to the peptide is formed in the liposome.
  • a specific example of the method of binding the raw material liposome and the peptide via a divalent reactive compound is, for example, a method using a Schiff base bond.
  • a method for linking a liposome and a peptide via a Schiff base bond a liposome having an amino group on its surface is prepared, the peptide is added to the suspension of the liposome, and then a divalent reactive compound is formed as a divalent reactive compound.
  • An example is a method in which an aldehyde is added to bind the amino group on the liposome surface and the amino group in the peptide via a Schiff base.
  • a reactive phospholipid eg, phosphatidylethanolamine
  • a liposome raw material lipid phospholipid, liposome stabilizer, etc.
  • A-3 glutaraldehyde is added as a divalent reactive compound and reacted for a predetermined time to form a Schiff base bond between the liposome and the peptide.
  • A-4 Thereafter, in order to deactivate the reactivity of excess glutaraldehyde, glycine as an amino group-containing water-soluble compound is added to the liposome suspension and reacted.
  • A-5) Peptide of the present invention is obtained by removing unbound peptide, reaction product of glutaraldehyde and glycine, and excess glycine by a method such as gel filtration, dialysis, ultrafiltration, and centrifugation. A bound liposome suspension is obtained.
  • a reactive phospholipid having a functional group capable of forming an amide bond, a thioether bond, a Schiff base bond, an ester bond, etc. is applied to the phospholipid membrane constituting the liposome.
  • the method to introduce is mentioned.
  • Specific examples of such functional groups include succinimide group, maleimide group, amino group, imino group, carboxyl group, hydroxyl group, thiol group and the like.
  • Examples of the reactive phospholipid introduced into the phospholipid membrane constituting the liposome include the above-mentioned 14 to 24 carbon acyl groups having one unsaturated bond or 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond.
  • a terminal modified product of the amino group of a reactive phospholipid having a hydrocarbon group eg, phosphatidylethanolamine can be used.
  • (B-1) A diacylphosphatidylethanolamine having a C 14-24 acyl group having one unsaturated bond and a disuccinimidyl succinate are reacted only at one end by a known method, and a succinimide group as a functional group To a disuccinimidyl succinate linked diacyl phosphatidylethanolamine.
  • a Schiff base bond can be formed by reacting with an succinimide group.
  • a thiol group is intended, a thioether bond can be formed by reacting with a maleimide group.
  • the present invention provides a cytotoxic T lymphocyte activator and an Ebola virus vaccine comprising the peptide of the present invention or the peptide-bonded liposome of the present invention.
  • Use of the peptide of the present invention and peptide-bound liposomes strongly induces cytotoxic T lymphocytes (CTLs) that recognize the peptide or epitope peptide of the present invention in a restricted manner by HLA-A * 0201 or HLA-A * 2402. It becomes possible to do.
  • CTLs cytotoxic T lymphocytes
  • Cells can be killed and these cells can be removed. Therefore, the peptides and peptide-bound liposomes of the present invention are useful as cytotoxic T lymphocyte activators and Ebola virus vaccines for the treatment and prevention of Ebola virus infection and diseases caused by the infection (Ebola hemorrhagic fever, etc.).
  • the type of strain of Ebola virus targeted by the Ebola virus vaccine of the present invention is not particularly limited as long as a preventive or therapeutic effect is exhibited against the Ebola virus infection.
  • Ebola virus strains include Zaire strain, Sudan strain, Reston strain, Côte d'Ivoire strain, and Bundibuyo strain. Since the epitope sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 14 are included in the amino acid sequence of the corresponding protein (NP, VP40, GP, L or VP30) of the Zaire strain, the Ebola virus vaccine of the present invention is Is expected to be particularly effective.
  • Ebola virus vaccine of the present invention is expected to exert an excellent effect on Ebola virus strains other than the Zaire strain in which the epitope sequence of the present invention is conserved as well as the Zaire strain.
  • Ebola virus strains in which the epitope sequences of the present invention are conserved are listed below.
  • SEQ ID NO: 1 Zaire strain, Sudan strain, Côte d'Irete strain, Bundi Bugyo strain
  • SEQ ID NO: 2 Zaire strain, Sudanese strain, Reston strain, Côte d'Ilude strain, Bundi Bugyo strain 4: Zaire strain
  • SEQ ID NO: 5 Zaire strain, Sudan strain, Reston strain, Côte d'Ilude strain
  • Bundi Bugyo strain SEQ ID NO: 6: Zaire strain
  • SEQ ID NO: 8 Zaire strain
  • SEQ ID NO: 8 Zaire strain, Sudan strain, Côte d'Irium strain
  • SEQ ID NO: 9 Zaire Strains
  • SEQ ID NO: 10 Zaire Strains
  • SEQ ID NO: 11 Zaire Strains, Sudan Strains, Reston Strains, Cote d'Ilude Strains, Bundi Bugyo Strains
  • SEQ ID NO: 12 Zaire Strains, Cot
  • the Ebola virus vaccine of the present invention is expected to be particularly effective against the Zaire strain. Further, the Ebola virus vaccine of the present invention is expected to exert an excellent effect on Ebola virus strains other than the Zaire strain in which the epitope sequence of the present invention is conserved as well as the Zaire strain. Ebola virus strains in which the epitope sequences of the present invention are conserved are listed below.
  • SEQ ID NO: 15 Zaire strain
  • SEQ ID NO: 16 Zaire strain, Côte d'Ivoire strain
  • Bundi Bugyo strain SEQ ID NO: 17: Zaire strain
  • SEQ ID NO: 18 Zaire strain
  • SEQ ID NO: 19 Zaire strain
  • SEQ ID NO: 23 Zaire strain
  • the peptide of the present invention or peptide-bound liposome When used as a cytotoxic T lymphocyte activator or Ebola virus vaccine, it can be formulated according to conventional means.
  • the peptides and peptide-bonded liposomes of the present invention have low toxicity and can be used as a liquid or as a pharmaceutical composition in an appropriate dosage form as a human or non-human mammal (eg, rat, rabbit, sheep, pig, cow, cat, Dogs, monkeys, etc.), birds (chicken, geese, ducks, ostriches, quail, etc.) and the like can be administered orally or parenterally (eg, intravascular administration, subcutaneous administration, etc.).
  • a human or non-human mammal eg, rat, rabbit, sheep, pig, cow, cat, Dogs, monkeys, etc.
  • birds chicken, geese, ducks, ostriches, quail, etc.
  • parenterally eg
  • the subject of administration of the peptide of the present invention or peptide-bound liposome is usually a mammal (eg, human) that can be infected with the target Ebola virus, and preferably expresses HLA-A * 0201 or HLA-A * 2402.
  • Human or transgenic mammals eg, HHD mice (Pascolo S, scBervas N, Ure JM, Smith AG, Lemonnier FA, Perarnau B. The Journal of Experimental Medicine 1997; 185 (12): 2043-2051) Mouse
  • the administration subject When administering the peptide of the present invention capable of inducing cytotoxic T lymphocytes restricted by HLA-A * 0201, or a peptide-bound liposome containing the peptide, the administration subject preferably expresses HLA-A * 0201 Or a transgenic mammal, most preferably a human that expresses HLA-A * 0201.
  • the administration subject When administering the peptide of the present invention capable of inducing cytotoxic T lymphocytes restricted by HLA-A * 2402, or a peptide-bound liposome containing the peptide, the administration subject preferably expresses HLA-A * 2402. Or a transgenic mammal, most preferably a human that expresses HLA-A * 2402.
  • the peptides and peptide-bound liposomes of the present invention are usually administered parenterally.
  • the cytotoxic T lymphocyte activator and Ebola virus vaccine of the present invention may be administered as an active ingredient peptide or peptide-bound liposome itself, or may be administered as an appropriate pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition used for administration may contain the peptide or peptide-bound liposome and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient. Such a pharmaceutical composition is provided as a dosage form suitable for oral or parenteral administration.
  • injections are dosage forms such as intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, infusions, and the like. May be included.
  • Such an injection can be prepared according to a known method.
  • a method for preparing an injection it can be prepared, for example, by dissolving or suspending the peptide or peptide-bound liposome in a sterile aqueous solvent usually used for injection.
  • the aqueous solvent for injection include distilled water; physiological saline; phosphate buffer, carbonate buffer, Tris buffer, acetate buffer, and other buffer solutions.
  • the pH of such an aqueous solvent is 5 to 10, preferably 6 to 8.
  • the prepared injection solution is preferably filled in a suitable ampoule.
  • the peptide preparation of the present invention or the powder preparation of the peptide-binding liposome of the present invention can be obtained by subjecting the solution of the peptide of the present invention or the suspension of the peptide-binding liposome of the present invention to a treatment such as vacuum drying or freeze drying. It can also be prepared.
  • the peptide of the present invention or the peptide-bonded liposome of the present invention is stored in a powder state, and can be used by dispersing the powder with an aqueous solvent for injection at the time of use.
  • the cytotoxic T lymphocyte activator and Ebola virus vaccine of the present invention may further contain an adjuvant in order to enhance the effect.
  • the adjuvant include aluminum hydroxide gel, complete Freund's adjuvant, incomplete Freund's adjuvant, Bordetella pertussis adjuvant, poly (I, C), CpG-DNA and the like, and CpG-DNA is particularly preferable.
  • CpG-DNA is a DNA containing a bacterial unmethylated CpG motif and is known to act as a ligand for a specific receptor (Toll-like receptor ⁇ 9) (for details, see Biochim. Biophys. Acta 1489, 107- 116 (1999) and Curr. Opin. Microbiol. 6, 472-477 (2003)).
  • CpG-DNA can enhance the induction of cytotoxic T lymphocytes by the peptides or peptide-bound liposomes of the present invention by activating dendritic cells (DC).
  • DC dendritic cells
  • the content of the active ingredient (the peptide of the present invention or the peptide-bound liposome) in the pharmaceutical composition is usually about 0.1 to 100% by weight, preferably about 1 to 99% by weight, more preferably the whole pharmaceutical composition. About 10 to 90% by weight.
  • the content of the adjuvant is appropriately determined within a range that can enhance the induction of cytotoxic T lymphocytes. Usually, it is about 0.01 to 10% by weight, preferably about 0.1 to 5% by weight of the whole pharmaceutical composition.
  • the dose of the peptide of the present invention or the peptide-bonded liposome of the present invention varies depending on the subject to be administered, the administration method, the administration form, etc., and for example, activates cytotoxic T lymphocytes in vivo by subcutaneous administration or nasal administration.
  • cytotoxic T lymphocytes in vivo by subcutaneous administration or nasal administration.
  • 1 ⁇ g to 1000 ⁇ g preferably in the range of 20 ⁇ g to 100 ⁇ g
  • as a peptide of the present invention usually per adult (body weight 60 kg), usually 2 times over 4 weeks to 18 months. 3 times.
  • the peptide of the present invention When Ebola virus infection is prevented by subcutaneous administration, the peptide of the present invention is in the range of 1 ⁇ g to 1000 ⁇ g, preferably in the range of 20 ⁇ g to 100 ⁇ g, usually twice for 4 weeks to 18 months. 3 times. Further, when a disease caused by Ebola virus infection (eg, Ebola hemorrhagic fever) is treated by subcutaneous administration, the peptide of the present invention is in the range of 1 ⁇ g to 1000 ⁇ g, preferably in the range of 20 ⁇ g to 100 ⁇ g, usually for 4 weeks. 2 to 3 doses over the next 18 months.
  • a disease caused by Ebola virus infection eg, Ebola hemorrhagic fever
  • the particle size of the liposome was adjusted using an extruder.
  • an 8 ⁇ m polycarbonate filter was passed, followed by a filter in the order of 5 ⁇ m, 3 ⁇ m, 1 ⁇ m, 0.65 ⁇ m, 0.4 ⁇ m and 0.2 ⁇ m.
  • An average particle size of 206 nm (measured by a dynamic light scattering method) of the liposome particles was obtained.
  • Example 1 Search for CTL epitopes 94 types of HLA-A * 0201-restricted CTL epitopes were selected from the amino acid sequence of Ebola virus (Zaire strain) polyprotein based on the motif sequence and the like. About the peptide (9 amino acid length) which consists of these epitopes, the binding property with respect to HLA-A * 0201 was evaluated by the following method.
  • RMA-S-HHD cells were incubated overnight at 26 ° C. Thereafter, RMA-S-HHD cells were incubated with various concentrations of the peptide to be evaluated at 37 ° C. for 3 hours. The cells were collected and treated with a conformation-sensitive anti-HLA-A * 0201 monoclonal antibody (BB7.2) (primary antibody), followed by staining with a FITC-labeled secondary antibody, and then HLA- The expression of A * 0201 was analyzed. RMA-S-HHD cells are deficient in TAP and stably express empty HLA-A * 0201 to which no self-peptide is bound at 26 ° C.
  • BB7.2 conformation-sensitive anti-HLA-A * 0201 monoclonal antibody
  • HLA-A * 0201 to which no peptide is bound is unstable, and BB7.2 cannot recognize this, so it is incubated at 37 ° C. in the presence of the peptide to be evaluated. Then, by analyzing the expression of HLA-A * 0201 using BB7.2, the binding ability of the peptide to be evaluated to HLA-A * 0201 can be evaluated.
  • BL 50 ( ⁇ M) was calculated for each peptide.
  • BL 50 means the concentration of each peptide that gives the half-maximal MFI of RMA-S-HHD cells incubated at 26 ° C. for 14-16 hours. The results are shown in Table 1.
  • Example 2 About 94 types of epitope peptides as in Example 1 to Ebola virus-specific CD8 + / IFN- ⁇ + T cell inducibility was evaluated Ebola virus-specific CD8 + / IFN- ⁇ + T cell inducibility.
  • HHD mice were immunized with 2 ⁇ 10 7 allogeneic syngeneic spleen cells pulsed with the peptide to be evaluated (10 ⁇ M).
  • mouse-specific MHC class I gene H-2D and mouse ⁇ 2-microglobulin gene are knocked out, and human HLA-A * 0201 and human ⁇ 2-microglobulin genes are introduced and expressed (Pascolo).
  • spleen cells from the immunized mice were incubated with 10 ⁇ M of the corresponding peptide to be evaluated in the presence of Brefeldin A for 5 hours in a CO 2 incubator.
  • Cells were harvested and anti-mouse CD16 / CD32 monoclonal antibody was added to block Fc receptors on the cells and stained with FITC-labeled anti-mouse CD8 ⁇ monoclonal antibody.
  • Cells were fixed, permeabilized, further stained with PE-labeled anti-mouse IFN- ⁇ monoclonal antibody, and then analyzed by flow cytometry. CTL inducibility was assessed by increasing the percentage of CD8 + / IFN- ⁇ + T cells.
  • Example 3 Evaluation of Ebola virus-specific CD8 + / IFN- ⁇ + T cell-inducing ability of peptide-bound liposomes 1) Preparation of peptide-bound liposome preparation Using 24 types of epitope peptides showing CTL-inducing activity in Example 2, peptide binding Liposomes were prepared by the following method. 1.5 ml of the liposome of Reference Example 1 (preparation of liposome) was collected in a test tube, 3 ml of each peptide pool solution prepared separately was added, and the mixture was gently stirred at 5 ° C. for 48 hours for reaction.
  • This reaction solution was subjected to gel filtration according to a conventional method using Sepharose CL-4B equilibrated with a buffer solution. Since the liposome fraction is cloudy, the target fraction can be easily confirmed, but it may be confirmed with a UV detector or the like. Phosphorus concentration in the obtained liposome suspension was measured (Phospholipid Test Wako), and the concentration was diluted with a buffer so that the phospholipid-derived phosphorus concentration was 2 mM. Got.
  • HHD mice were immunized with the peptide-bonded liposomes to be evaluated together with CpG.
  • spleen cells from the immunized mice were incubated with 10 ⁇ M of the corresponding peptide to be evaluated in the presence of Brefeldin A for 5 hours in a CO 2 incubator.
  • Cells were harvested and anti-mouse CD16 / CD32 monoclonal antibody was added to block Fc receptors on the cells and stained with FITC-labeled anti-mouse CD8 ⁇ monoclonal antibody.
  • Cells were fixed, permeabilized, further stained with PE-labeled anti-mouse IFN- ⁇ monoclonal antibody, and then analyzed by flow cytometry. CTL inducibility was assessed by increasing the percentage of CD8 + / IFN- ⁇ + T cells.
  • NP-56 peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • NP-401 A peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • VP40-73 a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • GP-25 A peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • GP-160 A peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5.
  • GP-252 a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6.
  • GP-546 A peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7.
  • VP30-94 a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8.
  • L-209 A peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9.
  • L-293 A peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10.
  • L-771 A peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11.
  • L-932 A peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12.
  • L-1099 A peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13.
  • L-1955 A peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14.
  • Example 4 Evaluation of CTL activity-inducing ability in vivo HHD mice were treated with each peptide to be evaluated (0.5 ⁇ g / ⁇ l was 100 ⁇ l / mouse) and CpG5002 (see Vaccine 25, 4914-4921 (2007)) (5 ⁇ g / mouse). ) Once. Seven days after immunization, splenocytes were prepared from another naive HHD mouse. 2 ⁇ 10 8 spleen cells were suspended in 2 ml of RPMI 1640, and the suspension was divided into two tubes of 1 ml each. Spleen cells were pulsed with the peptide by adding the peptide (10 ⁇ M) used for immunization to one tube and incubating at 37 ° C.
  • Splenocytes were centrifuged and the supernatant was removed. Splenocytes were washed once with 10 ml T10, centrifuged and the supernatant removed. Splenocytes were redispersed by adding 20 ml PBS / 0.1% BSA to the splenocyte pellet and vortexing rapidly. 10 ⁇ l of 5 mM CFSE is added to the splenocyte dispersion (final concentration: 2.5 ⁇ M), vortexed quickly and incubated at 37 ° C. for 10 minutes to label the peptide-pulsed splenocytes with a dense fluorescent dye (CFSE) did.
  • CFSE dense fluorescent dye
  • the other tube was labeled with a thin fluorescent dye (CFSE) (final concentration: 0.25 ⁇ M) without adding peptide.
  • CFSE thin fluorescent dye
  • Both splenocytes were centrifuged and the supernatant was removed. 10 ml of R10 was added to the washed splenocytes, centrifuged, and the supernatant was removed. Both splenocytes were resuspended in HBSS (or serum-free RPMI) and adjusted to a concentration of 5 ⁇ 10 7 cells / ml.
  • Spleen cells were transferred (1 ⁇ 10 7 cells / mouse) by mixing the same volume of these two groups of cell suspensions and injecting them intravenously into immunized mice. The next day (4-12 hours after transfer), mice were euthanized, and the spleen was collected, and the reduction rate of target cells labeled with a dense fluorescent dye (CFSE) 2.5 ⁇ M was analyzed by a flow cytometer. .
  • NP-56, NP-401, VP40-73, GP-160, GP-252, L-1955, L-293, L-209, L-1099, L-771 and VP30-94 have strong inductive ability Met.
  • Ebola virus-specific CD8 + / IFN- ⁇ + T cell inducibility 27 types of epitope candidates for HLA-A * 2402 restricted CTL based on motif sequence etc. from amino acid sequence of Ebola virus (Zaire strain) polyprotein Selected. Ebola virus-specific CD8 + / IFN- ⁇ + T cell inducing ability was evaluated for peptides consisting of these epitopes (9 or 10 amino acids long). A24Tg mice were immunized with 2 ⁇ 10 7 allogeneic syngeneic spleen cells pulsed with the peptide to be evaluated (10 ⁇ M).
  • mice In A24Tg mice, mouse-specific MHC class I genes H-2D and H-2K and mouse ⁇ 2-microglobulin gene were knocked out, and human HLA-A * 2402, human ⁇ 2-microglobulin, and human CD8 genes Introduced and expressed (J. Immunol 1993 vol150, 3681-3689; J Exp Med. 1995 Nov 1; 182 (5): 1315-25; Tissue Antigens. 1989 Jul; 34 (1): 50-63.) .
  • spleen cells from the immunized mice were incubated with 10 ⁇ M of the corresponding peptide to be evaluated in the presence of Brefeldin A for 5 hours in a CO 2 incubator.
  • Cells were harvested and anti-mouse CD16 / CD32 monoclonal antibody was added to block Fc receptors on the cells and stained with FITC-labeled anti-mouse CD8 ⁇ monoclonal antibody. Cells were fixed, permeabilized, further stained with PE-labeled anti-mouse IFN- ⁇ monoclonal antibody, and then analyzed by flow cytometry. CTL inducibility was assessed by increasing the percentage of CD8 + / IFN- ⁇ + T cells. Table 2 shows the percentage (%) of CD8 + / IFN- ⁇ + T cells induced upon stimulation with each peptide.
  • Example 6 Evaluation of Ebola virus-specific CD8 + / IFN- ⁇ + T cell-inducing ability of peptide-bound liposomes 1) Preparation of peptide-bound liposome preparation Using nine kinds of epitope peptides that showed strong CTL-inducing activity in Example 5, Peptide-bound liposomes were prepared as in Example 31 1).
  • mice were immunized three times per week with the peptide-binding liposomes to be evaluated together with CpG. Seven days after the final immunization, spleen cells from the immunized mice were incubated with 10 ⁇ M of the corresponding peptide to be evaluated in the presence of Brefeldin A for 5 hours in a CO 2 incubator. Cells were harvested and anti-mouse CD16 / CD32 monoclonal antibody was added to block Fc receptors on the cells and stained with FITC-labeled anti-mouse CD8 ⁇ monoclonal antibody.
  • Cells were fixed, permeabilized, further stained with PE-labeled anti-mouse IFN- ⁇ monoclonal antibody, and then analyzed by flow cytometry. CTL inducibility was assessed by increasing the percentage of CD8 + / IFN- ⁇ + T cells.
  • Example 7 Evaluation of CTL activity inducing ability in vivo Except for using A24Tg mice instead of HHD mice, each of the peptides to be evaluated bound to liposomes (9 types of epitope peptides selected in Example 5) The ability to induce CTL activity in vivo was evaluated.
  • each peptide-bound liposome induced CTL activity specific to each epitope in vivo.
  • the ability to induce L-105, L-407, L-1087, L-1847, L-1943, and L-2000 was particularly strong.
  • cytotoxic T lymphocytes against Ebola virus can be efficiently induced, and an excellent therapeutic or preventive effect against Ebola virus infection can be expected.
  • This application is based on Japanese Patent Application No. 2010-231918 (filing date: October 14, 2010) filed in Japan, the contents of which are incorporated in full herein.

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Abstract

　本発明は、ペプチドが結合したリポソームであって、 該ペプチドが、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１又はＨＬＡ－Ａ＊２４０２に拘束された細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導し得るエボラウイルス抗原ペプチドであり； 該リポソームが、不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４の炭化水素基を有するリン脂質、及びリポソームの安定化剤を含有し；且つ 該リポソームの表面に該ペプチドが結合している、 ペプチド結合リポソームを提供する。　また、本発明は、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１又はＨＬＡ－Ａ＊２４０２に拘束された細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導し得るエボラウイルス抗原ペプチドを提供する。　本発明のペプチド結合リポソームやペプチドは、細胞傷害性Ｔリンパ球活性化剤やエボラウイルスワクチンとして有用である。

Description

エボラウイルスリポソームワクチン
　本発明は、エボラウイルスワクチンとして有用なペプチド結合リポソーム、ペプチド、及びそれらの用途に関する。
　エボラウイルスは、フィロウイルス科のマイナス鎖ＲＮＡウイルスである。エボラウイルスはヒトを含む霊長類に重篤なエボラ出血熱を引き起こす。その致死率は極めて高く、時に９０％を超える。従って、研究を行う場合には、ＢＳＬ４の厳重な封じ込めが必要である。コウモリがエボラウイルスの自然宿主である可能性が報告されているが、不明な点も多い。エボラ出血熱は、１９７６年にスーダン及びザイールで大流行し、その後、中央・西アフリカで散発的に流行している。当初はアフリカにおける地域病と考えられていたが、１９８９年に米国のサル検疫室にて流行したことから、先進国におけるエボラウイルスの脅威が改めて認識されるに至った。近年においては、ペットのサルの輸入や、旅行者によるエボラウイルスの拡散、あるいはエボラウイルスを用いたバイオテロのリスクの増大が指摘されており、エボラ出血熱の効果的な予防又は治療法の開発が希求されているが、未だ効果的な予防又は治療法及びワクチンはない。
　エボラウイルスに対する免疫反応について様々な研究成果が報告されている。エボラウイルスに感染しながら死亡には至らなかったヒトにおいて、エボラウイルス抗原に対するＣＴＬや抗体が存在することが報告されている（非特許文献１）。マウスを用いた感染試験において、エボラウイルス抗原に対する中和抗体やＣＴＬが有効であったことが報告されている（非特許文献２及び３）。また、サルを用いた感染試験において、ＤＮＡワクチンや組換えウイルスワクチンが細胞性免疫や液性免疫を誘導し、感染抑制に有効であったことが報告されている（非特許文献４～７）。一方、エボラウイルス抗原に対する中和抗体は無効であったとの報告もあり（非特許文献８）、ヒトにおいては、エボラウイルスに対する抗体（液性免疫）はあまり有効ではないが、ＣＴＬ（細胞性免疫）は有効であろうと推測されている。
　一方、生体の免疫応答を増強するための方法として、リポソーム製剤を用いる方法が知られている。
　特許文献１には、抗原が結合したリポソームを用いた、病原体感染細胞又は癌細胞を殺傷するためのＣＴＬを効率よく特異的に増強することができ、感染症や癌の予防・治療に有用なＴ細胞活性化剤の調製法が開示されている。
　また特許文献２には、鳥インフルエンザウイルスの、保存性の高い内部タンパク質配列中から、細胞傷害性Ｔリンパ球の調製に特に有効な抗原エピトープを見出したこと、該エピトープを含むペプチドを表面に結合したリポソームが、極めて強力に抗原特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導し得ることが記載されている。
特開2008-37831号公報 国際公開第2010/061924号
Nat Immunol, 8: 1159, 2007 Science, 287: 1664, 2000 J Virol, 75: 2660, 2001 Nature, 408: 605, 2000 Nature, 424: 681, 2003 Nat Med, 11: 786, 2005 J Virol, 81: 6379, 2007 PLos Pathogens, 3: e9, 2007
　本発明が解決しようとする課題は、エボラウイルス抗原に対する細胞傷害性Ｔリンパ球を効率よく誘導することができ、エボラウイルス感染及び該感染に起因する疾患に対する治療効果又は予防効果が期待できるペプチドやワクチンを提供することである。
　本発明者らは、上記課題に鑑み、鋭意検討を行い、エボラウイルス抗原中に、細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導に特に有効な抗原エピトープを探索した結果、幾つかの優れた抗原エピトープを見出した。更に、このエピトープを含むペプチドが結合したリポソームによりワクチン接種を行うと、極めて強力に抗原特異的な細胞傷害性Tリンパ球を誘導し、エボラウイルス感染や該感染に伴う疾患を治療又は予防し得ることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は以下を提供するものである。
［１］ペプチドが結合したリポソームであって、
該ペプチドが、
（１）エボラウイルス抗原タンパク質のアミノ酸配列に含まれる連続する９アミノ酸長の部分配列、又は
（２）（１）のアミノ酸配列において、１又は２個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列
を含み、且つ
９～１１アミノ酸の長さを有する、
ＨＬＡ－Ａ＊０２０１又はＨＬＡ－Ａ＊２４０２に拘束された細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導し得るエボラウイルス抗原ペプチドであり；
該リポソームが、不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４の炭化水素基を有するリン脂質、及びリポソームの安定化剤を含有し；且つ
該リポソームの表面に該ペプチドが結合している、
ペプチド結合リポソーム。
［２］リン脂質が、不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４のアシル基を有するリン脂質である、［１］記載のペプチド結合リポソーム。
［３］アシル基がオレオイル基である、［１］又は［２］に記載のペプチド結合リポソーム。
［４］リン脂質が、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジン酸、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、サクシンイミジル－ジアシルホスファチジルエタノールアミン、及びマレイミド－ジアシルホスファチジルエタノールアミンから選ばれる少なくとも１つである、［１］～［３］のいずれかに記載のペプチド結合リポソーム。
［５］リポソームの安定化剤がコレステロールである、［１］～［４］のいずれかに記載のペプチド結合リポソーム。
［６］ペプチドが、リポソームを構成するリン脂質膜に含まれる不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４の炭化水素基を有するリン脂質に結合している、［１］～［５］のいずれかに記載のペプチド結合リポソーム。
［７］リポソームが以下の組成を有する、［１］～［６］のいずれかに記載のペプチド結合リポソーム：
（Ａ）不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４の炭化水素基を有するリン脂質　　１～９９．８モル％；
（Ｂ）リポソームの安定化剤　　０．２～７５モル％。
［８］リポソームが以下の組成を有する、［１］～［７］のいずれかに記載のペプチド結合リポソーム：
（Ｉ）不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４の炭化水素基を有する酸性リン脂質　　１～８５モル％；
（ＩＩ）不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４の炭化水素基を有する中性リン脂質　　０．０１～８０モル％；
（ＩＩＩ）ペプチドが結合した、不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４の炭化水素基を有するリン脂質　　０．２～８０モル％；
（ＩＶ）リポソームの安定化剤　　０．２～７５モル％。
［９］エボラウイルス抗原タンパク質が、Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ、ｖｉｒｉｏｎ　ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　４０、Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ、ｖｉｒｉｏｎ　ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　３０及びＲＮＡ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ＲＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅからなる群から選択されるいずれかである、［１］～［８］のいずれかに記載のペプチド結合リポソーム。
［１０］部分配列が、配列番号１～２３のいずれかで表されるアミノ酸配列である、［１］～［９］のいずれかに記載のペプチド結合リポソーム。
［１１］ＨＬＡ－Ａ＊０２０１に拘束された細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導し得るペプチドであって、
（１）配列番号１～１４のいずれかで表されるアミノ酸配列、又は
（２）配列番号１～１４のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１又は２個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列
を含み、且つ９～１１アミノ酸の長さを有する、ペプチド。
［１２］ＨＬＡ－Ａ＊２４０２に拘束された細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導し得るペプチドであって、
（１）配列番号１５～２３のいずれかで表されるアミノ酸配列、又は
（２）配列番号１５～２３のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１又は２個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列
を含み、且つ９～１１アミノ酸の長さを有する、ペプチド。
［１３］［１］～［１０］のいずれかに記載のペプチド結合リポソーム、或いは［１１］又は［１２］記載のペプチドを含む、細胞傷害性Ｔリンパ球活性化剤。
［１４］更にアジュバントを含有することを特徴とする、［１３］記載の細胞傷害性Ｔリンパ球活性化剤。
［１５］［１］～［１０］のいずれかに記載のペプチド結合リポソーム、或いは［１１］又は［１２］記載のペプチドを含む、エボラウイルスワクチン。
［１６］更にアジュバントを含有することを特徴とする、［１５］記載のエボラウイルスワクチン。
　本発明のペプチド又はペプチド結合リポソームを用いれば、エボラウイルス抗原に対する細胞傷害性Ｔリンパ球を効率よく誘導することができ、エボラウイルス感染や該感染に起因する疾患に対する優れた治療又は予防効果が期待できる。
エボラウイルス抗原タンパク質に由来する種々のペプチドによるＣＤ８＋／ＩＦＮ－γ＋Ｔ細胞の誘導。縦軸はＩＦＮ－γ発現を、横軸はＣＤ８発現をそれぞれ示す。グラフ中の数値は、ゲートされたＣＤ８＋／ＩＦＮ－γ＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す。 種々のペプチド結合リポソームによるＣＤ８＋／ＩＦＮ－γ＋Ｔ細胞の誘導。（×２）は２回免疫したことを示す。それ以外は全て１回免疫した。縦軸はＩＦＮ－γ発現を、横軸はＣＤ８発現をそれぞれ示す。グラフ中の数値は、ゲートされたＣＤ８＋／ＩＦＮ－γ＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す。 種々のペプチド結合リポソームによるインビボにおけるＣＴＬ活性の誘導。免疫回数は１回である。縦軸は細胞数を、横軸はＣＦＳＥの発現をそれぞれ示す。グラフ中の数値は殺傷されたＭ２ゲート内の細胞のパーセンテージを示す。 種々のペプチド結合リポソームによるＣＤ８＋／ＩＦＮ－γ＋Ｔ細胞の誘導。縦軸はＩＦＮ－γ発現を、横軸はＣＤ８発現をそれぞれ示す。グラフ中の数値は、ゲートされたＣＤ８＋／ＩＦＮ－γ＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す。 種々のペプチド結合リポソームによるインビボにおけるＣＴＬ活性の誘導。縦軸は細胞数を、横軸はＣＦＳＥの発現をそれぞれ示す。グラフ中の数値は殺傷されたゲート内の細胞のパーセンテージを示す。
１．ペプチド
　本発明は、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１又はＨＬＡ－Ａ＊２４０２に拘束された細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導し得、９～１１アミノ酸の長さを有する、エボラウイルス抗原ペプチド（本発明のペプチド）を提供する。本発明のペプチドは、
（１）エボラウイルス抗原タンパク質のアミノ酸配列に含まれる連続する９アミノ酸長の部分配列、又は
（２）（１）のアミノ酸配列において、１又は２個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列
を含む。
　エボラウイルス抗原タンパク質は、好ましくはＮｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＮＰ）、ｖｉｒｉｏｎ　ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　４０（ＶＰ４０）、Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＰ）、ｖｉｒｉｏｎ　ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　３０（ＶＰ３０）及びＲＮＡ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ＲＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｌ）からなる群から選択されるいずれかのタンパク質である。
　誘導される細胞傷害性Ｔリンパ球がＨＬＡ－Ａ＊２４０２拘束性である場合、エボラウイルス抗原タンパク質は、好ましくはＲＮＡ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ＲＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｌ）である。
　エボラウイルスには、ザイール株、スーダン株、レストン株、コートジボアール株、ブンディブギョ株が包含される。エボラウイルスは、好ましくはザイール株である。
　エボラウイルスザイール株のＮｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＮＰ）の代表的なアミノ酸配列を配列番号２４に示す。
　エボラウイルスザイール株のｖｉｒｉｏｎ　ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　４０（ＶＰ４０）の代表的なアミノ酸配列を配列番号２５に示す。
　エボラウイルスザイール株のＧｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＰ）の代表的なアミノ酸配列を配列番号２６に示す。
　エボラウイルスザイール株のｖｉｒｉｏｎ　ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　３０（ＶＰ３０）の代表的なアミノ酸配列を配列番号２７に示す。
　エボラウイルスザイール株のＲＮＡ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ＲＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｌ）の代表的なアミノ酸配列を配列番号２８に示す。
　一局面において、本発明は、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１に拘束された細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導し得るペプチドであって、
（１’）配列番号１～１４のいずれかで表されるアミノ酸配列、又は
（２’）配列番号１～１４のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１又は２個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列
を含み、且つ９～１１アミノ酸の長さを有する、ペプチド（本発明のペプチド）を提供する。
　一局面において、本発明は、エボラウイルス抗原タンパク質中に以下の優れたエピトープ配列（本発明のエピトープ配列）を見出したことに基づき完成されたものである：
・配列番号１～１４のいずれかで表されるアミノ酸配列
・配列番号１～１４のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１又は２個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列（ここで、該アミノ酸配列からなるペプチドがＨＬＡ－Ａ＊０２０１に拘束された細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導し得る）。
　一局面において、配列番号１～１４で表されるアミノ酸配列は、エボラウイルスザイール株のタンパク質である
Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＮＰ）（配列番号１～２）、
ｖｉｒｉｏｎ　ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　４０（ＶＰ４０）（配列番号３）、
Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＰ）（配列番号４～７）、
ｖｉｒｉｏｎ　ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　３０（ＶＰ３０）（配列番号８）又は
ＲＮＡ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ＲＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｌ）（配列番号９～１４）
のアミノ酸配列中に含まれる連続する部分配列に相当する。
　配列番号１で表されるアミノ酸配列は、エボラウイルスザイール株のＮＰのアミノ酸配列に含まれる第５６番目のイソロイシンから始まる連続する９アミノ酸長の部分配列に相当する（ＮＰ－５６）。
　配列番号２で表されるアミノ酸配列は、エボラウイルスザイール株のＮＰのアミノ酸配列に含まれる第４０１番目のアルギニンから始まる連続する９アミノ酸長の部分配列に相当する（ＮＰ－４０１）。
　配列番号３で表されるアミノ酸配列は、エボラウイルスザイール株のＶＰ４０のアミノ酸配列に含まれる第７３番目のフェニルアラニンから始まる連続する９アミノ酸長の部分配列に相当する（ＶＰ４０－７３）。
　配列番号４で表されるアミノ酸配列は、エボラウイルスザイール株のＧＰのアミノ酸配列に含まれる第２５番目のイソロイシンから始まる連続する９アミノ酸長の部分配列に相当する（ＧＰ－２５）。
　配列番号５で表されるアミノ酸配列は、エボラウイルスザイール株のＧＰのアミノ酸配列に含まれる第１６０番目のフェニルアラニンから始まる連続する９アミノ酸長の部分配列に相当する（ＧＰ－１６０）。
　配列番号６で表されるアミノ酸配列は、エボラウイルスザイール株のＧＰのアミノ酸配列に含まれる第２５２番目のフェニルアラニンから始まる連続する９アミノ酸長の部分配列に相当する（ＧＰ－２５２）。
　配列番号７で表されるアミノ酸配列は、エボラウイルスザイール株のＧＰのアミノ酸配列に含まれる第５４６番目のグリシンから始まる連続する９アミノ酸長の部分配列に相当する（ＧＰ－５４６）。
　配列番号８で表されるアミノ酸配列は、エボラウイルスザイール株のＶＰ３０のアミノ酸配列に含まれる第９４番目のセリンから始まる連続する９アミノ酸長の部分配列に相当する（ＶＰ３０－９４）。
　配列番号９で表されるアミノ酸配列は、エボラウイルスザイール株のＬのアミノ酸配列に含まれる第２０９番目のアラニンから始まる連続する９アミノ酸長の部分配列に相当する（Ｌ－２０９）。
　配列番号１０で表されるアミノ酸配列は、エボラウイルスザイール株のＬのアミノ酸配列に含まれる第２９３番目のリジンから始まる連続する９アミノ酸長の部分配列に相当する（Ｌ－２９３）。
　配列番号１１で表されるアミノ酸配列は、エボラウイルスザイール株のＬのアミノ酸配列に含まれる第７７１番目のアルギニンから始まる連続する９アミノ酸長の部分配列に相当する（Ｌ－７７１）。
　配列番号１２で表されるアミノ酸配列は、エボラウイルスザイール株のＬのアミノ酸配列に含まれる第９３２番目のグリシンから始まる連続する９アミノ酸長の部分配列に相当する（Ｌ－９３２）。
　配列番号１３で表されるアミノ酸配列は、エボラウイルスザイール株のＬのアミノ酸配列に含まれる第１０９９番目のアラニンから始まる連続する９アミノ酸長の部分配列に相当する（Ｌ－１０９９）。
　配列番号１４で表されるアミノ酸配列は、エボラウイルスザイール株のＬのアミノ酸配列に含まれる第１９５５番目のバリンから始まる連続する９アミノ酸長の部分配列に相当する（Ｌ－１９５５）。
　（２’）における置換の態様は、該アミノ酸配列からなるペプチドがＨＬＡ－Ａ＊０２０１に拘束された細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導し得る限り特に限定されないが、ザイール株とは異なるエボラウイルス株（型・亜型）（例、スーダン株、レストン株、コートジボアール株、ブンディブギョ株）の同一抗原における対応するエピトープ配列中に生じた既知のアミノ酸変異を反映したものが好適な態様として挙げられる。
　更なる局面において、本発明は、ＨＬＡ－Ａ＊２４０２に拘束された細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導し得るペプチドであって、
（１’’）配列番号１５～２３のいずれかで表されるアミノ酸配列、又は
（２’’）配列番号１５～２３のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１又は２個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列
を含み、且つ９～１１アミノ酸の長さを有する、ペプチド（本発明のペプチド）を提供する。
　更なる局面において、本発明は、エボラウイルスのＲＮＡ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ＲＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｌ）中に以下の優れたエピトープ配列（本発明のエピトープ配列）を見出したことに基づき完成されたものである：
・配列番号１５～２３のいずれかで表されるアミノ酸配列
・配列番号１５～２３のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１又は２個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列（ここで、該アミノ酸配列からなるペプチドがＨＬＡ－Ａ＊２４０２に拘束された細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導し得る）。
　更なる局面において、配列番号１５～２３で表されるアミノ酸配列は、エボラウイルスザイール株のＲＮＡ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ＲＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｌ）のアミノ酸配列中に含まれる連続する部分配列に相当する。
　配列番号１５で表されるアミノ酸配列は、エボラウイルスザイール株のＬのアミノ酸配列に含まれる第１０５番目のリジンから始まる連続する９アミノ酸長の部分配列に相当する（Ｌ－１０５）。
　配列番号１６で表されるアミノ酸配列は、エボラウイルスザイール株のＬのアミノ酸配列に含まれる第４０７番目のスレオニンから始まる連続する９アミノ酸長の部分配列に相当する（Ｌ－４０７）。
　配列番号１７で表されるアミノ酸配列は、エボラウイルスザイール株のＬのアミノ酸配列に含まれる第１０８７番目のセリンから始まる連続する９アミノ酸長の部分配列に相当する（Ｌ－１０８７）。
　配列番号１８で表されるアミノ酸配列は、エボラウイルスザイール株のＬのアミノ酸配列に含まれる第１３５９番目のグルタミンから始まる連続する９アミノ酸長の部分配列に相当する（Ｌ－１３５９）。
　配列番号１９で表されるアミノ酸配列は、エボラウイルスザイール株のＬのアミノ酸配列に含まれる第１８４７番目のリジンから始まる連続する９アミノ酸長の部分配列に相当する（Ｌ－１８４７）。
　配列番号２０で表されるアミノ酸配列は、エボラウイルスザイール株のＬのアミノ酸配列に含まれる第１９３９番目のロイシンから始まる連続する９アミノ酸長の部分配列に相当する（Ｌ－１９３９）。
　配列番号２１で表されるアミノ酸配列は、エボラウイルスザイール株のＬのアミノ酸配列に含まれる第１９４３番目のバリンから始まる連続する９アミノ酸長の部分配列に相当する（Ｌ－１９４３）。
　配列番号２２で表されるアミノ酸配列は、エボラウイルスザイール株のＬのアミノ酸配列に含まれる第２０００番目のトリプトファンから始まる連続する９アミノ酸長の部分配列に相当する（Ｌ－２０００）。
　配列番号２３で表されるアミノ酸配列は、エボラウイルスザイール株のＬのアミノ酸配列に含まれる第２０４６番目のグルタミンから始まる連続する９アミノ酸長の部分配列に相当する（Ｌ－２０４６）。
　更なる局面において、（２’’）における置換の態様は、該アミノ酸配列からなるペプチドがＨＬＡ－Ａ＊２４０２に拘束された細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導し得る限り特に限定されないが、ザイール株とは異なるエボラウイルス株（型・亜型）（例、スーダン株、レストン株、コートジボアール株、ブンディブギョ株）の同一抗原における対応するエピトープ配列中に生じた既知のアミノ酸変異を反映したものが好適な態様として挙げられる。
　本発明のエピトープ配列からなるペプチド（本発明のエピトープペプチド）は、以下の優れた特性を有する：
（Ａ）本発明のエピトープペプチドは、世界的に最もポピュラーなヒト主要組織適合性抗原（ＨＬＡ）の型であるＨＬＡ－Ａ＊０２０１又はＨＬＡ－Ａ＊２４０２への結合性に優れており、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１又はＨＬＡ－Ａ＊２４０２上に安定に提示される。
（Ｂ）本発明のエピトープペプチドは、上記（Ａ）の特性を有するため、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１又はＨＬＡ－Ａ＊２４０２に拘束された細胞傷害性Ｔリンパ球を強力に誘導することができる。「抗原がＨＬＡに拘束された細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導する」とは、特定のＨＬＡ（例えばＨＬＡ－Ａ＊０２０１）を発現している哺乳動物（例えばヒト、トランスジェニックマウス等）を抗原で免疫した場合に、該哺乳動物の生体内において、当該ＨＬＡに拘束され、且つ当該抗原を特異的に認識する細胞傷害性Ｔリンパ球の数及び／又は活性（例えばＩＦＮ－γ産生や細胞傷害活性）が上昇することを意味する。上述のように、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１及びＨＬＡ－Ａ＊２４０２は世界的に最もポピュラーなＨＬＡであることから、本発明のエピトープペプチドは、人種差に関わらず、世界中の多くのヒト（特に、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１又はＨＬＡ－Ａ＊２４０２を発現するヒト）の細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導し、細胞性免疫を活性化することができる。
　本発明のペプチドは、上記本発明のエピトープペプチド自体であるか、或いは細胞（好ましくはヒト樹状細胞）内でプロテアソーム等の作用により切断され、上記本発明のエピトープペプチドを生じ得る。従って、本発明のペプチドは、本発明のエピトープペプチドと実質的に同一の優れた特性を有し、下記に記したような本発明の細胞傷害性Tリンパ球活性化剤及びエボラウイルスワクチンの製造に供した場合、エボラウイルスが感染した細胞の殺傷やエボラウイルスの感染防御に優れた効果を発揮することが期待できる。
　本発明のペプチドの長さは、特に限定されないが通常９～１１アミノ酸、好ましくは９～１０アミノ酸、より好ましくは９アミノ酸である。該ペプチドの長さが１０アミノ酸以上である場合には、該ペプチドは、本発明のエピトープ配列のＮ末端側及び／又はＣ末端側に付加配列を有する。付加配列の長さやアミノ酸配列は、該ペプチドの上記特性を損なわない限り特に限定されない。例えば、該付加配列は、各エピトープ配列が由来するエボラウイルスザイール株のタンパク質のアミノ酸配列において、当該エピトープ配列に隣接して実際に存在するアミノ酸配列であり得る。例えば、本発明のペプチドが配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む場合、該ペプチドに含まれ得る付加配列はエボラウイルスザイール株のＮｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＮＰ）のアミノ酸配列中に含まれる、配列番号１からなる部分アミノ酸配列に隣接して実際に存在するアミノ酸配列であり得る。また該ペプチドが、細胞内で主要組織適合抗原複合体（MHC）上に提示される際に、MHCの個人差（多型性）による提示抗原の選別を克服できるような残基なども、付加配列として好ましい。
　本発明のペプチドは、例えば、液相合成又は固相ペプチド合成等の公知のペプチド合成技術によって調製できる。或いは、該ペプチドを発現し得る発現ベクターを導入した形質変換体（大腸菌等）を培養し、その培養物からアフィニティカラム等の周知の精製技術により該ペプチドを単離することにより、該ペプチドを製造することができる。該ペプチドを発現し得る発現ベクターは、周知の遺伝子工学的技術を用いて、該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを適切な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより構築することができる。
２．ペプチド結合リポソーム
　本発明は、上記本発明のペプチドが結合したリポソームであって、
該リポソームが、不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４の炭化水素基を有するリン脂質、及びリポソームの安定化剤を含有し；且つ
該リポソームの表面に上記本発明のペプチドが結合している、
ペプチド結合リポソーム（本発明のペプチド結合リポソーム）を提供する。
　一局面において、本発明の課題の一つは、エボラウイルス感染細胞（好ましくは、エボラウイルス感染により本発明のペプチドをＨＬＡ－Ａ＊０２０１上に提示した細胞）を殺傷するための細胞傷害性Ｔリンパ細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＴＬ）を効率よく特異的に増強することである。この観点から、本発明のペプチド結合リポソームに用いられる本発明のペプチドは、好ましくは、配列番号１、２、３、５、６、８、９、１０、１１、１３又は１４で表されるアミノ酸配列を含むものである。
　更なる局面において、本発明の課題の一つは、エボラウイルス感染細胞（好ましくは、エボラウイルス感染により本発明のペプチドをＨＬＡ－Ａ＊２４０２上に提示した細胞）を殺傷するための細胞傷害性Ｔリンパ細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＴＬ）を効率よく特異的に増強することである。この観点から、本発明のペプチド結合リポソームに用いられる本発明のペプチドは、好ましくは、配列番号１５、１６、１７、２０、２１又は２２で表されるアミノ酸配列を含むものである。
　本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜は、両親媒性界面活性剤であるリン脂質が、極性基を水相側に向けて界面を形成し、疎水基が界面の反対側に向く構造を有する。ここで、リポソームとは閉鎖空間を有するリン脂質二重膜のことを指す。
　本発明のペプチド結合リポソームに含まれるペプチドは、それが有する官能基を介してリポソームの表面に結合することができる。リポソーム表面への結合に用いられる該ペプチド中の官能基としては、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、水酸基、ジスルフィド基又はメチレン鎖を有する炭化水素基（アルキル基等）からなる疎水基等が挙げられる。これらの内、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、水酸基及びジスルフィド基は共有結合により、アミノ基及びカルボキシル基はイオン結合により、疎水基は疎水基同士で疎水結合により、該ペプチドをリポソームの表面に結合することができる。該ペプチドは、好ましくはアミノ基、カルボキシル基又はチオール基を介してリポソームの表面に結合する。
　本発明のペプチド結合リポソームに含まれるペプチドが有する官能基を介して、該ペプチドが安定にリポソームに結合するため、リポソームを構成するリン脂質膜は、アミノ基、サクシンイミド基、マレイミド基、チオール基、カルボキシル基、水酸基、ジスルフィド基、メチレン鎖を有する炭化水素基（アルキル基等）からなる疎水基等の官能基を有することが望ましい。リポソームを構成するリン脂質膜が有する官能基は、好ましくは、アミノ基、サクシンイミド基又はマレイミド基である。該ペプチドのリポソームへの結合に関与する、該ペプチドの有する官能基とリポソームを構成するリン脂質膜が有する官能基の組み合わせは、本発明の効果に影響しない範囲において自由に選択することができるが、好ましい組み合わせとしては、それぞれ、アミノ基とアルデヒド基、アミノ基とアミノ基、アミノ基とサクシンイミド基、チオール基とマレイミド基等が挙げられる。イオン結合及び疎水結合は、リポソームへのペプチドの結合手順が簡便であり、ペプチド結合リポソームの調製容易性の点から好ましく、また、共有結合は、リポソーム表面のペプチドの結合安定性の点又はペプチド結合リポソームを実用する際の保存安定性の点から好ましい。本発明のペプチド結合リポソームは、その構成成分であるリポソームの表面に細胞傷害性Ｔリンパ球活性化効果を有するペプチドが結合していることを１つの特徴としている。従って、実用段階で、例えば注射行為によって生体内に投与された後にも、該ペプチドがリポソームの表面に安定に結合していることが、本発明の効果をより高める点で好ましい。このような観点から、該ペプチドとリポソームとの結合としては、共有結合が好ましい。
　本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜は、不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４の炭化水素基を有するリン脂質、及びリポソームの安定化剤を含有してなる。
　不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４のアシル基を有するリン脂質における、該アシル基の炭素数は、好ましくは１６～２２であり、更に好ましくは１８～２２であり、最も好ましくは１８である。該アシル基としては、具体的には、パルミトオレオイル基、オレオイル基、エルコイル基等が挙げられ、最も好ましくはオレオイル基である。
　不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４の炭化水素基を有するリン脂質における、該炭化水素基の炭素数は、好ましくは１６～２２であリ、更に好ましくは１８～２２であり、最も好ましくは１８である。該炭化水素基としては、具体的には、テトラデセニル基、ヘキサデセニル基、オクタデセニル基、Ｃ２０モノエン基、Ｃ２２モノエン基、Ｃ２４モノエン基等が挙げられる。
　リン脂質が有するグリセリン残基の１－位、及び２－位に結合する不飽和のアシル基又は不飽和炭化水素基は、同一でも異なっていてもよい。工業的な生産性の観点から、１－位及び２－位の基が同一であることが好ましい。
　リン脂質としては、不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４のアシル基を有するリン脂質が好ましく用いられる。
　本発明の課題の一つは、エボラウイルス感染細胞（好ましくは、エボラウイルス感染により本発明のペプチドをＨＬＡ－Ａ＊０２０１上に提示した細胞、又はエボラウイルス感染により本発明のペプチドをＨＬＡ－Ａ＊２４０２上に提示した細胞）を殺傷するための細胞傷害性Ｔリンパ細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＴＬ）を効率よく特異的に増強することである。実用上十分なレベルにＣＴＬ活性を増強させる点から、リン脂質は不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４のアシル基を有することが好ましい。アシル基の炭素数が１３未満であると、リポソームの安定性が悪くなったり、またＣＴＬ活性増強効果が不十分になる場合がある。また、アシル基の炭素数が２４を超えると、リポソームの安定性が悪くなる場合がある。
　不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４の炭化水素基を有するリン脂質としては、酸性リン脂質、中性リン脂質、ペプチドを結合することのできる官能基を有する反応性リン脂質等の種類が挙げられる。これらは、種々の要求に応じて、その種類、割合を適宜選択することができる。
　酸性リン脂質としては、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール等を用いることができる。ＣＴＬ活性を実用上十分なレベルに増強する点、及び工業的な供給性、医薬品として用いるための品質等の点から、不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４のアシル基を有するジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジン酸、及びジアシルホスファチジルイノシトールが好ましく用いられる。酸性リン脂質は、リポソームの表面にアニオン性電離基を与えるので、リポソーム表面にマイナスのゼータ電位を付与する。このためリポソームは、電荷的な反発力を得、水性溶媒中で安定な製剤として存在できる。このように、酸性リン脂質は、本発明のペプチド結合リポソームが水性溶媒中にある際のリポソームの安定性を確保する点で重要である。
　中性リン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン等を用いることができる。本発明で用いることができる中性リン脂質は、本発明が課題として取り組むＣＴＬ活性増強を達成する範囲において、その種類・量を適宜選択して用いることができる。中性リン脂質は、酸性リン脂質及び本発明のペプチドを結合したリン脂質に比べ、リポソームを安定化する機能が高く、膜の安定性を向上させ得る。かかる観点から、本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜は、中性リン脂質を含有することが好ましい。ＣＴＬ活性増強効果を達成するために用いる酸性リン脂質、ペプチド結合のための反応性リン脂質及びリポソームの安定化剤の含有量を確保した上で、中性リン脂質の使用量を決定できる。
　本発明のペプチド結合リポソームにおいては、本発明のペプチドがリポソームを構成するリン脂質膜に含まれる不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４の炭化水素基を有するリン脂質に結合することにより、リポソームの表面に結合する。
　このペプチド結合のためのリン脂質として、本発明のペプチドが結合することのできる官能基を有する反応性リン脂質が用いられる。不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４の炭化水素基を有する反応性リン脂質は、種々の要求に応じて、その種類、割合が適宜選択される。前記リン脂質と同様に、反応性リン脂質においても、リン脂質に含まれる不飽和アシル基又は不飽和炭化水素基の炭素数が２４を超えるか、１４未満である場合は好ましくない。
　反応性リン脂質としては、ホスファチジルエタノールアミン又はその末端変性体が挙げられる。また、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール及びこれらの末端変性体も反応性リン脂質として用いることができる。工業的な入手性、本発明のペプチドとの結合工程の簡便性、収率等の点から、ホスファチジルエタノールアミン又はその末端変性体が好ましく用いられる。ホスファチジルエタノールアミンはその末端に本発明のペプチドを結合することのできるアミノ基を有する。更に、ＣＴＬ活性を実用上十分なレベルに増強する点、リポソームでの安定性、及び工業的な供給性、医薬品として用いるための品質等の点から、不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４のアシル基を有するジアシルホスファチジルエタノールアミン又はその末端変性体が最も好ましく用いられる。
　ジアシルホスファチジルエタノールアミンは、例えば、ジアシルホスファチジルコリンを原料に、ホスホリパーゼＤを用いてコリンとエタノールアミンを塩基交換反応させることで得ることができる。具体的には、ジアシルホスファチジルコリンを溶解したクロロホルム溶液と、ホスホリパーゼＤ及びエタノールアミンを溶解した水を適宜比率において混合し粗反応物を得ることができる。粗反応物を、クロロホルム／メタノール／水系溶媒を用いてシリカゲルカラムで精製し目的のジアシルホスファチジルエタノールアミンを得ることができる。当業者であれば、溶媒組成比等のカラム精製条件を適宜選択して実施することが可能である。
　末端変性体としては、ジアシルホスファチジルエタノールアミンのアミノ基に２価反応性化合物の一方の末端を結合させたジアシルホスファチジルエタノールアミン末端変性体が挙げられる。２価反応性化合物としては、ジアシルホスファチジルエタノールアミンのアミノ基と反応することができるアルデヒド基又はコハク酸イミド基を少なくとも片方の末端に有する化合物が利用できる。アルデヒド基を有する２価反応性化合物として、グリオキサール、グルタルアルデヒド、サクシンジアルデヒド、テレフタルアルデヒド等が挙げられる。好ましくは、グルタルアルデヒドが挙げられる。コハク酸イミド基を有する２価反応性化合物として、ジチオビス（サクシンイミジルプロピオネート）、エチレングリコール－ビス（サクシンイミジルサクシネート）、ジサクシンイミジルサクシネート、ジサクシンイミジルスベレート、又はジサクシンイミジルグルタレートが等挙げられる。
　また、一方の末端にサクシンイミド基、他方の片末端にマレイミド基を有する２価反応性化合物として、Ｎ－サクシンイミジル－４－（ｐ－マレイミドフェニル）ブチレート、スルホサクシンイミジル－４－（ｐ－マレイミドフェニル）ブチレート、Ｎ－サクシンイミジル－４－（ｐ－マレイミドフェニル）アセテート、Ｎ－サクシンイミジル－４－（ｐ－マレイミドフェニル）プロピオネート、サクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドエチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート、スルホサクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドエチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート、Ｎ－（γ－マレイミドブチリルオキシ）サクシンイミド、Ｎ－（ε－マレイミドカプロイルオキシ）サクシンイミド等が挙げられる。このような２価反応性化合物を用いると、官能基としてマレイミド基を有するジアシルホスファチジルエタノールアミン末端変性体が得られる。以上のような２価反応性化合物の一方の末端の官能基をジアシルホスファチジルエタノールアミンのアミノ基に結合し、ジアシルホスファチジルエタノールアミン末端変性体を得ることができる。
　リポソームの表面にペプチドを結合する方法としては、例えば、上記の反応性リン脂質を含有するリポソームを調製し、次にペプチドを加えてリポソームの反応性リン脂質にペプチドを結合する方法を挙げることができる。また、予めペプチドを反応性リン脂質に結合しておき、次に、得られたペプチドが結合した反応性リン脂質を、反応性リン脂質以外のリン脂質及びリポソームの安定化剤と混合することによっても、ペプチドを表面に結合したリポソームを得ることができる。反応性リン脂質へのペプチドの結合方法は、当該技術分野において周知である。
　本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜は、不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４の炭化水素基を有するリン脂質を少なくとも１種、例えば２種以上、好ましくは３種以上含有する。
　例えば、本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜は、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジン酸、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、サクシンイミジル－ジアシルホスファチジルエタノールアミン、及びマレイミド－ジアシルホスファチジルエタノールアミンから選ばれる少なくとも１種、例えば２種以上、好ましくは３種以上の、不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４の炭化水素基を有するリン脂質を含有する。
　また、本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜は、
不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４の炭化水素基を有する酸性リン脂質、
不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４の炭化水素基を有する中性リン脂質、及び
不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４の炭化水素基を有する反応性リン脂質を、それぞれ、少なくとも１種含有することが好ましい。
　本発明において、リポソームの安定化剤としては、ステロール類やトコフェロール類を用いることができる。前記のステロール類としては、一般にステロール類として知られるものであればよく、例えば、コレステロール、シトステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール等が挙げられ、入手性等の点から、特に好ましくは、コレステロールが用いられる。前記のトコフェロール類としては、一般にトコフェロールとして知られるものであればよく、例えば、入手性等の点から、市販のα-トコフェロールが好ましく挙げられる。
　さらに、本発明の効果を損なわない限り、本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜は、リポソームを構成することのできる、公知の構成成分を含んでいてもよい。
　本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜の組成としては、例えば以下を挙げることができる：
（Ａ）不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４の炭化水素基を有するリン脂質　　１～９９．８モル％；
（Ｂ）リポソームの安定化剤　　０．２～７５モル％
　尚、各成分の含有量は、ペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜の全構成成分に対するモル％として表示する。
　上記成分（Ａ）の含有量は、リポソームの安定性の観点から、好ましくは１０～９０モル％、より好ましくは３０～８０モル％、更に好ましくは５０～７０モル％である。
　上記成分（Ｂ）の含有量は、リポソームの安定性の観点から、好ましくは５～７０モル％、より好ましくは１０～６０モル％、更に好ましくは２０～５０モル％である。安定化剤の含有量が７５モル％を超えるとリポソームの安定性が損なわれ好ましくない。
　上記成分（Ａ）には、以下が含まれる：
（ａ）ペプチドが結合していない、不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４の炭化水素基を有するリン脂質、及び
（ｂ）ペプチドが結合した、不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４の炭化水素基を有するリン脂質。
　上記成分（ａ）の含有量は、通常０．０１～８５モル％、好ましくは０．１～８０モル％、より好ましくは０．１～６０モル％、更に好ましくは０．１～５０モル％である。
　上記成分（ｂ）の含有量は、通常０．２～８０モル％、好ましくは０．３～６０モル％、より好ましくは０．４～５０モル％、更に好ましくは０．５～２５モル％である。含有量が０．２モル％未満であると、本発明のペプチドの量が低下するため、実用上十分なレベルに細胞傷害性Ｔリンパ球を活性化することが困難となり、８０モル％を超えると、リポソームの安定性が低下する。
　上記成分（ａ）のリン脂質には、通常、上述の酸性リン脂質及び中性リン脂質が含まれる。また、上記成分（ｂ）のリン脂質には、上述の反応性リン脂質が含まれる。
　酸性リン脂質の含有量は、通常１～８５モル％、好ましくは２～８０モル％、より好ましくは４～６０モル％、更に好ましくは５～４０モル％である。含有量が１モル％未満であると、ゼータ電位が小さくなりリポソームの安定性が低くなり、また、実用上十分なレベルに細胞傷害性Ｔリンパ球を活性化することが困難となる。一方、含有量が８５モル％を超えると、結果として、リポソームのペプチドが結合したリン脂質の含有量が低下し、実用上十分なレベルに細胞傷害性Ｔリンパ球を活性化することが困難となる。
　中性リン脂質の含有量は、通常０．０１～８０モル％、好ましくは０．１～７０モル％、より好ましくは０．１～６０モル％、更に好ましくは０．１～５０モル％である。含有量が８０モル％を超えると、リポソームに含まれる酸性リン脂質、ペプチドが結合したリン脂質及びリポソームの安定化剤の含有量が低下し、実用上十分なレベルに細胞傷害性Ｔリンパ球を活性化することが困難となる。
　ペプチドが結合したリン脂質は、前記の反応性リン脂質にペプチドが結合して得られるもので、反応性リン脂質がペプチドと結合する割合は、本発明の効果を妨げない範囲において、結合に用いる官能基の種類、結合処理条件等を適宜実施して選択することができる。
　例えば、ジアシルホスファチジルエタノールアミンの末端アミノ基に２価反応性化合物であるジサクシンイミジルサクシネートの片末端を結合して得たジアシルホスファチジルエタノールアミンの末端変性体を反応性リン脂質として用いる場合、結合処理諸条件の選択によって反応性リン脂質の１０～９９％をペプチドと結合することができる。この場合、ペプチドと結合していない反応性リン脂質は、酸性リン脂質となってリポソームに含有される。
　本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜の好ましい態様としては、以下の組成を挙げることができる：
（Ｉ）　不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４の炭化水素基を有する酸性リン脂質１～８５モル％；
（ＩＩ）　不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４の炭化水素基を有する中性リン脂質０．０１～８０モル％；
（ＩＩＩ）　ペプチドが結合した、不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４の炭化水素基を有するリン脂質０．２～８０モル％；
（ＩＶ）　リポソームの安定化剤０．２～７５モル％。
（合計１００モル%）
　本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜のより好ましい態様としては、以下の組成を挙げることができる：
上記成分（Ｉ）　　　２～８０モル％
上記成分（ＩＩ）　　０．１～７０モル％
上記成分（ＩＩＩ）　０．３～６０モル％
上記成分（ＩＶ）　　１０～７０モル％
（合計１００モル%）
　本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜の更に好ましい態様としては、以下の組成を挙げることができる：
上記成分（Ｉ）　　　４～６０モル％
上記成分（ＩＩ）　　０．１～６０モル％
上記成分（ＩＩＩ）　０．４～５０モル％
上記成分（ＩＶ）　　２０～６０モル％
（合計１００モル%）
　本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜のとりわけ好ましい態様としては、以下の組成を挙げることができる：
上記成分（Ｉ）　　　５～４０モル％
上記成分（ＩＩ）　　０．１～５０モル％
上記成分（ＩＩＩ）　０．５～２５モル％
上記成分（ＩＶ）　　２５～５５モル％
（合計１００モル%）
　本発明のペプチド結合リポソームは、リポソーム部分を構成するリン脂質膜中のリン脂質に含まれる不飽和アシル基又は不飽和炭化水素基の炭素数が１４～２４であることを特徴とするが、本発明の効果を妨げない範囲で、炭素数が１４未満又は２４を超える不飽和アシル基又は不飽和炭化水素基を含むリン脂質を含んでいても差支えない。本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜中のリン脂質に含まれる全ての不飽和アシル基又は不飽和炭化水素基の合計数に対して、炭素数が１４～２４である不飽和アシル基又は不飽和炭化水素基の数の割合は、例えば５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７５％以上、更に好ましくは９０％以上、最も好ましくは９７％以上（例えば実質的に１００％）である。
　本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜は、本発明の効果を妨げない限り、炭素数が１４～２４の範囲のアシル基又は炭化水素基を有する、リン脂質以外の脂質を含んでもよい。該脂質の含有量は、通常は４０モル％以下であり、好ましくは２０モル％以下、より好ましくは１０モル％以下、更に好ましくは５モル％以下（例えば実質的に０モル％）である。
　本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分は、構成成分であるリン脂質、反応性リン脂質、リポソームの安定化剤、ペプチド等を用い、適宜配合や加工を行い、これを適当な溶媒に添加する等の方法で得ることができる。
　例えば、エクスツルージョン法、ボルテックスミキサー法、超音波法、界面活性剤除去法、逆相蒸発法、エタノール注入法、プレベシクル法、フレンチプレス法、W/O/Wエマルジョン法、アニーリング法、凍結融解法等の製造方法が挙げられる。リポソームの形態は、特に限定されず、前記のリポソーム製造方法を適宜選択することにより、多重層リポソーム、小さな一枚膜リポソーム、大きな一枚膜リポソーム等、種々の大きさや形態を有するリポソームを製造することができる。
　リポソームの粒径は特に限定されるものではないが、保存安定性等の点から、粒径は２０～６００ｎｍが挙げられ、好ましくは３０～５００ｎｍ、次に好ましくは４０～４００ｎｍであり、更に好ましくは、５０～３００ｎｍであり、最も好ましくは７０～２３０ｎｍである。
　なお、本発明においては、リポソームの物理化学的安定性を向上させるために、リポソーム調製過程又は調製後に、リポソームの内水相及び/又は外水相に、糖類又は多価アルコール類を添加しても良い。特に、長期保存或いは製剤化途上での保管が必要な場合には、リポソームの保護剤として、糖類或いは多価アルコール類を添加・溶解し、凍結乾燥により水分を除いてリン脂質組成物の凍結乾燥物とすることが好ましい。
　糖類としては、例えばグルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、イノシトール、リボース、キシロース等の単糖類；サッカロース、ラクトース、セロビオース、トレハロース、マルトース等の二糖類；ラフィノース、メレジトース等の三糖類；シクロデキストリン等のオリゴ糖；デキストリン等の多糖類；キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルチトール等の糖アルコール等が挙げられる。これらの糖類の中では単糖類又は二糖類が好ましく、中でもグルコース又はサッカロースが入手性等の点からより好ましく挙げられる。
　前記多価アルコール類としては、例えば、グリセリン、ジグリセリン、トリグリセリン、テトラグリセリン、ペンタグリセリン、ヘキサグリセリン、ヘプタグリセリン、オクタグリセリン、ノナグリセリン、デカグリセリン、ポリグリセリン等のグリセリン系化合物；ソルビトール、マンニトール等の糖アルコール系化合物；エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、ペンタエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール、ヘプタエチレングリコール、オクタエチレングリコール、ノナエチレングリコール等が挙げられる。このうち、グリセリン、ジグリセリン、トリグリセリン、ソルビトール、マンニトール、分子量４００～１０，０００のポリエチレングリコールが入手性の点から好ましく挙げられる。
　リポソームの内水相及び／又は外水相に含ませる、糖類或いは多価アルコール類の濃度は、リポソーム液に対する重量濃度で、例えば１～２０重量％が挙げられ、好ましくは２～１０重量％が挙げられる。
　本発明のペプチド結合リポソームを製造する場合、ペプチドを結合させる前のリポソームを作製した後、ペプチドを結合させることにより簡便に本発明のペプチド結合リポソームを得ることができる。
　例えば、リン脂質、リポソームの安定化剤及び膜表面にペプチドを結合するための反応性リン脂質を含有したリポソームの懸濁液を調製し、その外水相に前記の糖類の一つであるスクロースを２～１０重量％程度加えて溶解する。この糖添加製剤を１０ｍｌガラス製バイヤルに移して棚段式凍結乾燥機内に置き、－４０℃等に冷却して試料を凍結した後、常法により凍結乾燥物を得る。
　ここで得たリポソームの凍結乾燥物は、水分が取り除かれているため長期の保存が可能であり、必要時に特定のペプチドを加えて後の工程を実施することにより、本発明の最終的なペプチド結合リポソームを簡便に迅速に得ることができる。ペプチドとリポソームとの相互作用が強く不安定性が高い場合等は、このようにリポソームの凍結乾燥物の段階で保存し、必要な際にペプチドを結合して用いると非常に簡便である。
　本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜は、ペプチドが結合したリン脂質を有し得る。ペプチドが結合したリン脂質を含有するリポソームを得る方法としては、次の（Ａ）及び（Ｂ）による方法が挙げられる。
（Ａ）リン脂質、反応性リン脂質、リポソームの安定化剤を含有するリポソームを調製し、これにペプチド及び２価反応性化合物を添加し、リポソーム中に含有される反応性リン脂質の官能基と、該ペプチドの官能基とを、２価反応性化合物を介して連結する方法。ここで用いることができる２価反応性化合物は、反応性リン脂質の末端変性体調製において用いたものを同様に用いることができる。具体的には、アルデヒド基を有する２価反応性化合物として、グリオキサール、グルタルアルデヒド、サクシンジアルデヒド、テレフタルアルデヒド等が挙げられる。好ましくは、グルタルアルデヒドが挙げられる。更に、コハク酸イミド基を有する２価反応性化合物として、ジチオビス（サクシンイミジルプロピオネート）、エチレングリコール－ビス（サクシンイミジルサクシネート）、ジサクシンイミジルサクシネート、ジサクシンイミジルスベレート、又はジサクシンイミジルグルタレート等が挙げられる。また、片末端にサクシンイミド基、もう一方の片末端にマレイミド基を有する２価反応性化合物として、Ｎ－サクシンイミジル－４－（ｐ－マレイミドフェニル）ブチレート、スルホサクシンイミジル－４－（ｐ－マレイミドフェニル）ブチレート、Ｎ－サクシンイミジル－４－（ｐ－マレイミドフェニル）アセテート、Ｎ－サクシンイミジル－４－（ｐ－マレイミドフェニル）プロピオネート、サクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドエチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート、スルホサクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドエチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート、Ｎ－（γ－マレイミドブチリルオキシ）サクシンイミド、Ｎ－（ε－マレイミドカプロイルオキシ）サクシンイミド等を使用することができる。かかる２価反応性化合物を使用すると、官能基としてマレイミド基を有する反応性リン脂質（例えばホスファチジルエタノールアミン）の末端変性体が得られる。
（Ｂ）リン脂質、反応性リン脂質、リポソームの安定化剤を含有するリポソームを調製し、これにペプチドを添加し、リポソームに含まれる反応性リン脂質の官能基と、該ペプチドの官能基を連結して結合させる方法。
　前記（Ａ）及び（Ｂ）における結合の種類としては、例えば、イオン結合、疎水結合、共有結合等が挙げられるが、好ましくは共有結合である。更に共有結合の具体例としては、シッフ塩基結合、アミド結合、チオエーテル結合、エステル結合等が挙げられる。
　以上の２つの方法いずれとも、リポソームを構成するリン脂質膜に含まれる反応性リン脂質にペプチドを結合することができ、リポソームにおいてペプチドを結合したリン脂質が形成される。
　前記の（Ａ）の方法において、原料となるリポソームとペプチドとを２価反応性化合物を介して結合させる方法の具体例としては、例えば、シッフ塩基結合を利用する方法が挙げられる。シッフ塩基結合を介してリポソームとペプチドとを結合する方法としては、アミノ基を表面に有するリポソームを調製し、ペプチドを該リポソームの懸濁液に添加し、次に、２価反応性化合物としてジアルデヒドを加え、リポソーム表面のアミノ基と該ペプチド中のアミノ基とをシッフ塩基を介して結合する方法を挙げることができる。
　この結合手順の具体例としては、例えば、次の方法が挙げられる。
（Ａ－１）アミノ基を表面に有するリポソームを得るために、不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４の炭化水素基を有する反応性リン脂質（例　ホスファチジルエタノールアミン）をリポソーム原料脂質（リン脂質、リポソームの安定化剤等）中に混合して、アミノ基がリポソーム表面に所定量存在するリポソームを作成する。
（Ａ－２）前記リポソーム懸濁液に、ペプチドを添加する。
（Ａ－３）次に、２価反応性化合物としてグルタルアルデヒドを加えて、所定の時間反応させてリポソームとペプチドとの間にシッフ塩基結合を形成する。
（Ａ－４）その後、余剰のグルタルアルデヒドの反応性を失活させるため、アミノ基含有水溶性化合物としてグリシンをリポソーム懸濁液に加えて反応させる。
（Ａ－５）ゲルろ過、透析、限外ろ過、遠心分離等の方法により、リポソームに未結合のペプチド、グルタルアルデヒドとグリシンとの反応産物、及び余剰のグリシンを除去して、本発明のペプチド結合リポソーム懸濁液を得る。
　前記の（Ｂ）の方法の具体例としては、アミド結合、チオエーテル結合、シッフ塩基結合、エステル結合等を形成することのできる官能基を有する反応性リン脂質を、リポソームを構成するリン脂質膜に導入する方法が挙げられる。このような官能基の具体例としては、サクシンイミド基、マレイミド基、アミノ基、イミノ基、カルボキシル基、水酸基、チオール基等が挙げられる。
　リポソームを構成するリン脂質膜に導入する反応性リン脂質の例としては、前記の不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４の炭化水素基を有する反応性リン脂質（例　ホスファチジルエタノールアミン）のアミノ基末端の末端変性物を用いることができる。
　この結合手順の具体例として、ジアシルホスファチジルエタノールアミンを用いた場合を例にとって、以下説明する。
（Ｂ－１）不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４のアシル基を有するジアシルホスファチジルエタノールアミンとジサクシンイミジルサクシネートを公知の方法で片末端のみ反応させて、官能基としてサクシンイミド基を末端に有するジサクシンイミジルサクシネート結合ジアシルホスファチジルエタノールアミンを得る。
（Ｂ－２）前記ジサクシンイミジルサクシネート結合ジアシルホスファチジルエタノールアミンと他のリポソーム構成成分（リン脂質、リポソームの安定化剤等）とを公知の方法で混合し、表面に官能基としてサクシンイミド基を有するリポソームを作成する。
（Ｂ－３）前記リポソーム懸濁液に、ペプチドを加え、該ペプチド中のアミノ基と、リポソーム表面のサクシンイミド基とを反応させる。
（Ｂ－４）未反応のペプチド、反応副生物等を、ゲルろ過、透析、限外ろ過、遠心分離等の方法により除去して、本発明のペプチド結合リポソームの懸濁液を得る。
　リポソームとペプチドとを結合する場合、官能基として含有されることが多いアミノ基又はチオール基を対象とすることが実用上好ましい。アミノ基を対象とする場合には、サクシンイミド基と反応させることによりシッフ塩基結合を形成させることができる。チオール基を対象とする場合には、マレイミド基と反応させることによりチオエーテル結合を形成させることができる。
３．本発明のペプチド及びペプチド結合リポソームの用途
　本発明は、上記本発明のペプチド又は本発明のペプチド結合リポソームを含む細胞傷害性Ｔリンパ球活性化剤及びエボラウイルスワクチンを提供する。本発明のペプチドやペプチド結合リポソームを用いれば、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１又はＨＬＡ－Ａ＊２４０２拘束的に、本発明のペプチド又はエピトープペプチドを認識する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を強力に誘導することが可能となる。本発明のペプチドやペプチド結合リポソームにより誘導される細胞傷害性Ｔリンパ球は、エボラウイルス感染等の結果、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１又はＨＬＡ－Ａ＊２４０２上に本発明のペプチド又はエピトープペプチドを提示した細胞を殺傷し、これらの細胞を除去することができる。従って、本発明のペプチドやペプチド結合リポソームは、細胞傷害性Ｔリンパ球活性化剤やエボラウイルスワクチンとして、エボラウイルス感染や該感染により引き起こされる疾患（エボラ出血熱等）の治療や予防に有用である。
　本発明のエボラウイルスワクチンが標的とするエボラウイルスの株の種類は、該エボラウイルス感染に対して予防又は治療効果が発揮される限り特に限定されない。エボラウイルスの株としては、ザイール株、スーダン株、レストン株、コートジボアール株、ブンディブギョ株等が挙げられる。配列番号１～１４で表されるエピトープ配列は、ザイール株の対応するタンパク質（ＮＰ、ＶＰ４０、ＧＰ、Ｌ又はＶＰ３０）のアミノ酸配列に含まれるので、本発明のエボラウイルスワクチンは、ザイール株に対して特に効果が期待される。また、本発明のエピトープ配列が保存されたザイール株以外のエボラウイルスの株に対しても、ザイール株と同様に、本発明のエボラウイルスワクチンは、優れた効果を発揮することが期待される。各本発明のエピトープ配列が保存されたエボラウイルスの株を以下に列挙する。
配列番号１：ザイール株、スーダン株、コートジボアール株、ブンディブギョ株
配列番号２：ザイール株、スーダン株、レストン株、コートジボアール株、ブンディブギョ株
配列番号３：ザイール株、コートジボアール株、ブンディブギョ株
配列番号４：ザイール株
配列番号５：ザイール株、スーダン株、レストン株、コートジボアール株、ブンディブギョ株
配列番号６：ザイール株
配列番号７：ザイール株
配列番号８：ザイール株、スーダン株、コートジボアール株、ブンディブギョ株
配列番号９：ザイール株
配列番号１０：ザイール株
配列番号１１：ザイール株、スーダン株、レストン株、コートジボアール株、ブンディブギョ株
配列番号１２：ザイール株、コートジボアール株
配列番号１３：ザイール株、コートジボアール株
配列番号１４：ザイール株
　更なる局面において、配列番号１５～２３で表されるエピトープ配列は、ザイール株のＬのアミノ酸配列に含まれるので、本発明のエボラウイルスワクチンは、ザイール株に対して特に効果が期待される。また、本発明のエピトープ配列が保存されたザイール株以外のエボラウイルスの株に対しても、ザイール株と同様に、本発明のエボラウイルスワクチンは、優れた効果を発揮することが期待される。各本発明のエピトープ配列が保存されたエボラウイルスの株を以下に列挙する。
配列番号１５：ザイール株
配列番号１６：ザイール株、コートジボアール株、ブンディブギョ株
配列番号１７：ザイール株
配列番号１８：ザイール株、ブンディブギョ株
配列番号１９：ザイール株
配列番号２０：ザイール株
配列番号２１：ザイール株
配列番号２２：ザイール株
配列番号２３：ザイール株
　上に列挙された株以外であっても、当業者であれば、評価対象のエボラウイルス株において、目的とするエピトープ配列が保存されているか否かを、ＲＴ－ＰＣＲやダイレクトシークエンシング等の周知のヌクレオチド配列解析方法により、容易に決定することが出来る。
　本発明のペプチドやペプチド結合リポソームを細胞傷害性Ｔリンパ球活性化剤やエボラウイルスワクチンとして使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。本発明のペプチドやペプチド結合リポソームは低毒性であり、そのまま液剤として、又は適当な剤形の医薬組成物として、ヒト、非ヒト哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等）、鳥類（ニワトリ、ガチョウ、アヒル、ダチョウ、ウズラ等）等に対して経口的又は非経口的（例、血管内投与、皮下投与等）に投与することができる。本発明のペプチドやペプチド結合リポソームの投与対象は、通常、標的とするエボラウイルスが感染し得る哺乳動物（例、ヒト）であり、好ましくはＨＬＡ－Ａ＊０２０１又はＨＬＡ－Ａ＊２４０２を発現するヒト又はトランスジェニック哺乳動物（例：ＨＨＤマウス（Pascolo S, Bervas N, Ure JM, Smith AG, Lemonnier FA, Perarnau B. The Journal of Experimental Medicine 1997; 185(12):2043-2051）等のトランスジェニックマウス）であり、最も好ましくはＨＬＡ－Ａ＊０２０１又はＨＬＡ－Ａ＊２４０２を発現するヒトである。ＨＬＡ－Ａ＊０２０１に拘束された細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導し得る本発明のペプチド、又は該ペプチドを含むペプチド結合リポソームを投与する場合、投与対象は、好ましくはＨＬＡ－Ａ＊０２０１を発現するヒト又はトランスジェニック哺乳動物であり、最も好ましくはＨＬＡ－Ａ＊０２０１を発現するヒトである。ＨＬＡ－Ａ＊２４０２に拘束された細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導し得る本発明のペプチド、又は該ペプチドを含むペプチド結合リポソームを投与する場合、投与対象は、好ましくはＨＬＡ－Ａ＊２４０２を発現するヒト又はトランスジェニック哺乳動物であり、最も好ましくはＨＬＡ－Ａ＊２４０２を発現するヒトである。本発明のペプチドやペプチド結合リポソームは、通常、非経口的に投与される。
　本発明の細胞傷害性Ｔリンパ球活性化剤及びエボラウイルスワクチンは、その有効成分であるペプチド又はペプチド結合リポソーム自体を投与しても良いし、又は適当な医薬組成物として投与しても良い。投与に用いられる医薬組成物としては、上記ペプチド又はペプチド結合リポソームと薬理学的に許容され得る担体、希釈剤又は賦形剤とを含むものであっても良い。このような医薬組成物は、経口又は非経口投与に適する剤形として提供される。
　非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、上記ペプチド又はペプチド結合リポソームを通常注射剤に用いられる無菌の水性溶媒に溶解又は懸濁することによって調製できる。注射用の水性溶媒としては、例えば、蒸留水；生理的食塩水；リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液等の緩衝液等が使用できる。このような水系溶媒のｐＨは５～１０が挙げられ、好ましくは６～８である。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。
　また、本発明のペプチドの溶解液又は本発明のペプチド結合リポソームの懸濁液を、真空乾燥、凍結乾燥等の処理に付すことにより、本発明のペプチド又は本発明のペプチド結合リポソームの粉末製剤を調製することもできる。本発明のペプチド又は本発明のペプチド結合リポソームを粉末状態で保存し、使用時に該粉末を注射用の水系溶媒で分散することにより、使用に供することができる。
　本発明の細胞傷害性Ｔリンパ球活性化剤及びエボラウイルスワクチンは、その効果を増強するため、アジュバントをさらに含有してもよい。アジュバントとしては、水酸化アルミニウムゲル、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、百日咳菌アジュバント、ポリ（Ｉ，Ｃ）、ＣｐＧ－ＤＮＡ等が挙げられるが、ＣｐＧ－ＤＮＡがとりわけ好ましい。ＣｐＧ－ＤＮＡは細菌の非メチル化ＣｐＧモチーフを含むＤＮＡであり、特定の受容体（Toll-like receptor 9）のリガンドとしてはたらくことが知られている（詳細はBiochim. Biophys. Acta 1489, 107-116 (1999)及びCurr. Opin. Microbiol. 6, 472-477 (2003)参照）。ＣｐＧ－ＤＮＡは樹状細胞（ＤＣ）を活性化することにより、本発明のペプチド又はペプチド結合リポソームによる細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導を増強することができる。
　医薬組成物中の有効成分（本発明のペプチド又はペプチド結合リポソーム）の含有量は、通常、医薬組成物全体の約０．１～１００重量％、好ましくは約１～９９重量％、さらに好ましくは約１０～９０重量％程度である。
　本発明の細胞傷害性Ｔリンパ球活性化剤又はエボラウイルスワクチンがアジュバントを含む場合、該アジュバント（例えばＣｐＧ－ＤＮＡ）の含有量は、細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導を増強し得る範囲で適宜設定することができるが、通常、医薬組成物全体の約０．０１～１０重量％、好ましくは約０．１～５重量％程度である。
　本発明のペプチド又は本発明のペプチド結合リポソームの投与量は、投与する対象、投与方法、投与形態等によって異なるが、例えば、皮下投与或いは経鼻投与により生体内の細胞傷害性Ｔリンパ球を活性化する場合には、通常成人１人（体重６０ｋｇ）あたり本発明のペプチドとして一回当たり１μｇ～１０００μｇの範囲、好ましくは２０μｇ～１００μｇの範囲で、通常４週間から１８ヶ月に亘って、２回から３回投与する。また、皮下投与によりエボラウイルス感染を予防する場合には、本発明のペプチドとして一回当たり１μｇ～１０００μｇの範囲、好ましくは２０μｇ～１００μｇの範囲で、通常４週間から１８ヶ月に亘って、２回から３回投与する。更に、皮下投与によりエボラウイルス感染に起因する疾患（例、エボラ出血熱）を治療する場合には、本発明のペプチドとして一回当たり１μｇ～１０００μｇの範囲、好ましくは２０μｇ～１００μｇの範囲で、通常４週間から１８ヶ月に亘って、２回から３回投与する。
　以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
［参考例１］
リポソームの調製
１）脂質混合粉末の調製
　末端変性ホスファチジルエタノールアミンからなる反応性リン脂質（サクシンイミジル基-ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）の合成
　ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン2g及びトリエチルアミン180μlをクロロホルム50mlに溶解及び添加し、300ml容の4つ口フラスコに入れた。このフラスコをマグネットスタラーで室温で攪拌しつつ、別に調製した2価反応性化合物であるジサクシンイミジルスベレート3gをクロロホルム80mlに溶解した溶液を、常法に従って4時間に亘って滴下し、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンのアミノ基にジサクシンイミジルスベレートの片末端を反応させた。この粗反応溶液をナス型フラスコに移し、エバポレータによって溶媒を留去した。次に、このフラスコに粗反応物を溶解できるだけのクロロホルムを少量加えて高濃度粗反応物溶液を得、クロロホルム/メタノール/水（65/25/1、体積比）で平衡化したシリカゲルを用いて常法に従ってカラムクロマトグラフィーを行い、目的のジオレオイルホスファチジルエタノールアミンのアミノ基にジサクシンイミジルスベレートの片末端が結合した画分のみを回収し、溶媒を留去して目的の反応性リン脂質であるサクシンイミド基－ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンを得た。
２）脂質混合粉末の調製
　ジオレオイルホスファチジルコリン1.3354g（1.6987mmol）、前項で調製したサクシンイミド基-ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン0.2886g（0.2831mmol）、コレステロール0.7663g（1.9818mmol）及びジオレオイルホスファチジルグリセロールNa塩0.4513g（0.5662mmol）をナス型フラスコに取り、クロロホルム/メタノール/水（65/25/4、容量比）混合溶剤50mlを入れ、40℃にて溶解した。次にロータリーエバポレーターを使用して減圧下で溶剤を留去し、脂質の薄膜を作った。更に注射用蒸留水を30ml添加し、攪拌して均一のスラリーを得た。このスラリーを凍結させ、凍結乾燥機にて24時間乾燥させ脂質混合粉末を得た。
３）リポソームの調製
　次に、別途作製した緩衝液（1.0mM Na2HPO4/KH2PO4、0.25Ｍサッカロース、pH7.4、以後緩衝液と略す）60mlを上記脂質混合粉末の入ったナス型フラスコ内に入れ、40℃にて攪拌しながら脂質を水和させ、リポソームを得た。次にエクストルーダーを用いてリポソームの粒径を調整した。まず8μmのポリカーボネートフィルターを通過させ、続いて5μm、3μm、1μm、0.65μm、0.4μm及び0.2μmの順にフィルターを通過させた。リポソーム粒子の平均粒径206nm（動的光散乱法による測定）が得られた。
［実施例１］
ＣＴＬエピトープの検索
　エボラウイルス（ザイール株）polyproteinのアミノ酸配列から、モチーフ配列等に基づき、ＨＬＡ－Ａ*０２０１拘束性ＣＴＬのエピトープの候補を９４種類選択した。これらのエピトープからなるペプチド（９アミノ酸長）について、以下の方法によりＨＬＡ－Ａ*０２０１に対する結合性を評価した。
　ＲＭＡ－Ｓ－ＨＨＤ細胞を２６℃にて終夜インキュベートした。その後、ＲＭＡ－Ｓ－ＨＨＤ細胞を、種々の濃度の評価対象のペプチドと供に、３７℃で３時間インキュベートした。細胞を回収し、コンフォメーション感受性の抗ＨＬＡ－Ａ*０２０１モノクローナル抗体（ＢＢ７．２）（１次抗体）にて処理し、引き続きＦＩＴＣ標識した２次抗体で染色した後、フローサイトメトリーによりＨＬＡ－Ａ*０２０１の発現を解析した。ＲＭＡ－Ｓ－ＨＨＤ細胞は、ＴＡＰを欠損しているため、２６℃において、自己ペプチドが結合していない空の（empty）ＨＬＡ－Ａ*０２０１を安定に発現する。一方、３７℃では、ペプチドが結合していない空の（empty）ＨＬＡ－Ａ*０２０１は不安定であり、ＢＢ７．２はこれを認識できないため、評価対象のペプチド存在下で３７℃にてインキュベートした後のＨＬＡ－Ａ*０２０１の発現をＢＢ７．２にて解析することにより、評価対象のペプチドのＨＬＡ－Ａ*０２０１への結合性を評価することができる。
　各ペプチドについてＢＬ５０（μＭ）を算出した。ＢＬ５０は、２６℃にて１４～１６時間インキュベートしたＲＭＡ－Ｓ－ＨＨＤ細胞の半最大ＭＦＩ（half-maximal MFI）を与える各ペプチドの濃度を意味する。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  
［実施例２］
エボラウイルス特異的ＣＤ８＋／ＩＦＮ－γ＋Ｔ細胞誘導能の評価
　実施例１に記載した９４種類のエピトープペプチドについて、エボラウイルス特異的ＣＤ８＋／ＩＦＮ－γ＋Ｔ細胞誘導能を評価した。
　評価対象のペプチド（１０μＭ）でパルスした２×１０７個の同種同系脾臓細胞で、ＨＨＤマウスを免疫した。ＨＨＤマウスにおいては、マウス固有のMHCクラスI遺伝子であるH-2D、及びマウスβ2-microglobulin遺伝子がノックアウトされ、ヒトのHLA-A*0201及びヒトβ2-microglobulin遺伝子が導入され発現している（Pascolo S, Bervas N, Ure JM, Smith AG, Lemonnier FA, Perarnau B. The Journal of Experimental Medicine 1997; 185(12):2043-2051）。１週間後、免疫したマウスからの脾臓細胞を、１０μＭの対応する評価対象のペプチドと供に、ブレフェルディンＡの存在下、５時間、ＣＯ２インキュベーター中でインキュベートした。
　細胞を回収し、細胞上のＦｃレセプターをブロックするために抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２モノクローナル抗体を加え、ＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ８αモノクローナル抗体で染色した。細胞を固定し、透過処理し、ＰＥ標識抗マウスＩＦＮ－γモノクローナル抗体でさらに染色した後、フローサイトメトリーにより解析した。ＣＤ８＋／ＩＦＮ－γ＋Ｔ細胞の割合の増加により、ＣＴＬ誘導能を評価した。
　評価した９４種類のエピトープペプチドのうち、図１に示す２４種類のエピトープペプチドが各エピトープに特異的なＣＴＬを誘導した。
［実施例３］
ペプチド結合リポソームのエボラウイルス特異的ＣＤ８＋／ＩＦＮ－γ＋Ｔ細胞誘導能の評価
１）ペプチド結合リポソーム製剤の調製
　実施例２においてＣＴＬ誘導活性を示した２４種類のエピトープペプチドを用いて、ペプチド結合リポソームを以下の方法により調製した。
　参考例１（リポソームの調製）のリポソーム１．５ｍｌを試験管に採取し、別に調製した３ｍｌの各ペプチドプール溶液を加えた後、５℃で４８時間穏やかに攪拌し反応させた。この反応液を、緩衝液で平衡化したSepharoseCL-4Bを用いて常法に従ってゲル濾過した。尚、リポソーム画分は白濁しているので、目的画分は容易に確認できるが、ＵＶ検出器等で確認しても良い。
　得られたリポソーム懸濁液中のリン濃度を測定し（リン脂質テストＷａｋｏ）、リン脂質由来のリン濃度を２ｍＭになるように濃度を緩衝液で希釈調整し、各ペプチド結合リポソームの懸濁液を得た。
２）エボラウイルス特異的ＣＤ８＋／ＩＦＮ－γ＋Ｔ細胞誘導能の評価
　ＣｐＧと供に、評価対象のペプチド結合リポソームでＨＨＤマウスを免疫した。１週間後、免疫したマウスからの脾臓細胞を、１０μＭの対応する評価対象のペプチドと供に、ブレフェルディンＡの存在下、５時間、ＣＯ２インキュベーター中でインキュベートした。
　細胞を回収し、細胞上のＦｃレセプターをブロックするために抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２モノクローナル抗体を加え、ＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ８αモノクローナル抗体で染色した。細胞を固定し、透過処理し、ＰＥ標識抗マウスＩＦＮ－γモノクローナル抗体でさらに染色した後、フローサイトメトリーにより解析した。ＣＤ８＋／ＩＦＮ－γ＋Ｔ細胞の割合の増加により、ＣＴＬ誘導能を評価した。
　評価した２４種類のエピトープペプチドのうち、以下の１４種類のエピトープペプチドを用いて調製したペプチド結合リポソームが、有意にＣＴＬを誘導した。
ＮＰ－５６：配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
ＮＰ－４０１：配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
ＶＰ４０－７３：配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
ＧＰ－２５：配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
ＧＰ－１６０：配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
ＧＰ－２５２：配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
ＧＰ－５４６：配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
ＶＰ３０－９４：配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
Ｌ－２０９：配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
Ｌ－２９３：配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
Ｌ－７７１：配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
Ｌ－９３２：配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
Ｌ－１０９９：配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
Ｌ－１９５５：配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
　これら１４種類のエピトープペプチドに関する結果を図２に示す。特に、ＮＰ－５６、Ｌ－２９３及びＬ－２０９のＣＴＬ誘導能が強力であった。ＶＰ４０－７３、ＧＰ－１６０及びＧＰ－２５２は、２回免疫した場合に、強力にＣＴＬを誘導した。
［実施例４］
インビボにおけるＣＴＬ活性誘導能の評価
　HHDマウスを、リポソームに結合したそれぞれの評価対象のペプチド（0.5μg/μlを100μl/匹）及びCpG5002（Vaccine 25, 4914-4921 (2007)参照）（5μｇ/匹）で1回免疫した。免疫7日後に、別のナイーブなHHDマウスから脾細胞を調製した。２×１０８個の脾細胞を２ｍｌのＲＰＭＩ１６４０にサスペンドし、そのサスペンジョンを１ｍｌずつ２本のチューブに分けた。片方のチューブに免疫に使用したペプチド（10μM）を加え、３７℃で１時間インキュベートすることにより、脾細胞を該ペプチドでパルスした。脾細胞を遠心分離し、上清を除いた。脾細胞を１０ｍｌのＴ１０により１回洗浄し、遠心分離し、上清を除いた。脾細胞のペレットに２０ｍｌのＰＢＳ／０．１％ＢＳＡを加え、素早くボルテックスすることにより脾細胞を再分散した。脾細胞の分散液に５ｍＭのＣＦＳＥを１０μｌ加え（最終濃度：２．５μＭ）、素早くボルテックスし、３７℃で１０分間インキュベートすることにより、ペプチドでパルスした脾細胞を濃い蛍光色素（ＣＦＳＥ）で標識した。もう片方のチューブにはペプチドを加えないで、薄い蛍光色素（ＣＦＳＥ）（最終濃度：０．２５μＭ）で標識した。双方の脾細胞を遠心分離し、上清を除いた。洗浄した脾細胞に１０ｍｌのＲ１０を加え、遠心分離し、上清を除いた。双方の脾細胞をそれぞれＨＢＳＳ（又は血清不含ＲＰＭＩ）に再懸濁し、５×１０７個／ｍｌの濃度に調整した。この２グループの細胞懸濁液を同体積混ぜて、免疫したマウスの静脈内に注射することにより、脾細胞を移入（１×１０７個／匹）した。翌日（移入から４～１２時間後）、マウスを安楽殺した後に脾臓を回収して、その中の濃い蛍光色素（ＣＦＳＥ）2.5μM）で標識した標的細胞の減少率をフローサイトメーターにより解析した。
　図３に示されるように、いずれのペプチド結合リポソームも、インビボにおいて各エピトープに特異的なＣＴＬ活性を誘導した。特に、ＮＰ－５６、ＮＰ－４０１、ＶＰ４０－７３、ＧＰ－１６０、ＧＰ－２５２、Ｌ－１９５５、Ｌ－２９３、Ｌ－２０９、Ｌ－１０９９、Ｌ－７７１及びＶＰ３０－９４の誘導能が強力であった。
［実施例５］
エボラウイルス特異的ＣＤ８＋／ＩＦＮ－γ＋Ｔ細胞誘導能の評価
　エボラウイルス（ザイール株）polyproteinのアミノ酸配列から、モチーフ配列等に基づき、ＨＬＡ－Ａ＊２４０２拘束性ＣＴＬのエピトープの候補を２７種類選択した。これらのエピトープからなるペプチド（９又は１０アミノ酸長）について、エボラウイルス特異的ＣＤ８＋／ＩＦＮ－γ＋Ｔ細胞誘導能を評価した。
　評価対象のペプチド（１０μＭ）でパルスした２×１０７個の同種同系脾臓細胞で、Ａ２４Ｔｇマウスを免疫した。Ａ２４Ｔｇマウスにおいては、マウス固有のMHCクラスI遺伝子であるH-2D及びH-2K、並びにマウスβ2-microglobulin遺伝子がノックアウトされ、ヒトのHLA-A*2402、ヒトβ2-microglobulin、及びヒトCD8遺伝子が導入され発現している（J. Immunol 1993 vol150, 3681-3689；J Exp Med. 1995 Nov 1;182(5):1315-25；Tissue Antigens. 1989 Jul;34(1):50-63.）。１週間後、免疫したマウスからの脾臓細胞を、１０μＭの対応する評価対象のペプチドと供に、ブレフェルディンＡの存在下、５時間、ＣＯ２インキュベーター中でインキュベートした。
　細胞を回収し、細胞上のＦｃレセプターをブロックするために抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２モノクローナル抗体を加え、ＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ８αモノクローナル抗体で染色した。細胞を固定し、透過処理し、ＰＥ標識抗マウスＩＦＮ－γモノクローナル抗体でさらに染色した後、フローサイトメトリーにより解析した。ＣＤ８＋／ＩＦＮ－γ＋Ｔ細胞の割合の増加により、ＣＴＬ誘導能を評価した。各ペプチドで刺激した際に誘導されたＣＤ８＋／ＩＦＮ－γ＋Ｔ細胞の割合（％）を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  
　評価した２７種類のエピトープペプチドのうち、下記の表３に示す９種類のエピトープペプチドが各エピトープに特異的なＣＴＬを強力に誘導した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
  
［実施例６］
ペプチド結合リポソームのエボラウイルス特異的ＣＤ８＋／ＩＦＮ－γ＋Ｔ細胞誘導能の評価
１）ペプチド結合リポソーム製剤の調製
　実施例５において強力にＣＴＬ誘導活性を示した９種類のエピトープペプチドを用いて、ペプチド結合リポソームを実施例３ １）と同様に調製した。
２）エボラウイルス特異的ＣＤ８＋／ＩＦＮ－γ＋Ｔ細胞誘導能の評価
　ＣｐＧと供に、評価対象のペプチド結合リポソームでＡ２４Ｔｇマウスを１週間毎に３回免疫した。最終免疫から７日後、免疫したマウスからの脾臓細胞を、１０μＭの対応する評価対象のペプチドと供に、ブレフェルディンＡの存在下、５時間、ＣＯ２インキュベーター中でインキュベートした。
　細胞を回収し、細胞上のＦｃレセプターをブロックするために抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２モノクローナル抗体を加え、ＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ８αモノクローナル抗体で染色した。細胞を固定し、透過処理し、ＰＥ標識抗マウスＩＦＮ－γモノクローナル抗体でさらに染色した後、フローサイトメトリーにより解析した。ＣＤ８＋／ＩＦＮ－γ＋Ｔ細胞の割合の増加により、ＣＴＬ誘導能を評価した。
　評価した９種類のエピトープペプチド用いて調製したペプチド結合リポソームのいずれもが、有意にＣＴＬを誘導した（図４）。特に、Ｌ－１０５、Ｌ－４０７、Ｌ－１０８７、Ｌ－１９３９、Ｌ－１９４３及びＬ－２０００のＣＴＬ誘導能が強力であった。
［実施例７］
インビボにおけるＣＴＬ活性誘導能の評価
　ＨＨＤマウスに替えてＡ２４Ｔｇマウスを用いることを除き、実施例４と同様に、リポソームに結合したそれぞれの評価対象のペプチド（実施例５において選択した９種類のエピトープペプチド）についてインビボにおけるＣＴＬ活性誘導能を評価した。
　図５に示されるように、いずれのペプチド結合リポソームも、インビボにおいて各エピトープに特異的なＣＴＬ活性を誘導した。特に、特に、Ｌ－１０５、Ｌ－４０７、Ｌ－１０８７、Ｌ－１８４７、Ｌ－１９４３及びＬ－２０００の誘導能が強力であった。
　本発明のペプチド又はペプチド結合リポソームを用いれば、エボラウイルスに対する細胞傷害性Ｔリンパ球を効率よく誘導することができ、エボラウイルス感染に対する優れた治療又は予防効果が期待できる。
　本出願は、日本で出願された特願２０１０－２３１９１８（出願日：２０１０年１０月１４日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (16)

  1. 　ペプチドが結合したリポソームであって、
    該ペプチドが、
    （１）エボラウイルス抗原タンパク質のアミノ酸配列に含まれる連続する９アミノ酸長の部分配列、又は
    （２）（１）のアミノ酸配列において、１又は２個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列
    を含み、且つ
    ９～１１アミノ酸の長さを有する、
    ＨＬＡ－Ａ＊０２０１又はＨＬＡ－Ａ＊２４０２に拘束された細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導し得るエボラウイルス抗原ペプチドであり；
    該リポソームが、不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４の炭化水素基を有するリン脂質、及びリポソームの安定化剤を含有し；且つ
    該リポソームの表面に該ペプチドが結合している、
    ペプチド結合リポソーム。
  2. 　リン脂質が、不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４のアシル基を有するリン脂質である、請求項１記載のペプチド結合リポソーム。
  3. 　アシル基がオレオイル基である、請求項１又は２に記載のペプチド結合リポソーム。
  4. 　リン脂質が、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジン酸、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、サクシンイミジル－ジアシルホスファチジルエタノールアミン、及びマレイミド－ジアシルホスファチジルエタノールアミンから選ばれる少なくとも１つである、請求項１～３のいずれか１項に記載のペプチド結合リポソーム。
  5. 　リポソームの安定化剤がコレステロールである、請求項１～４のいずれか１項に記載のペプチド結合リポソーム。
  6. 　ペプチドが、リポソームを構成するリン脂質膜に含まれる不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４の炭化水素基を有するリン脂質に結合している、請求項１～５のいずれか１項に記載のペプチド結合リポソーム。
  7. 　リポソームが以下の組成を有する、請求項１～６のいずれか１項に記載のペプチド結合リポソーム：
    （Ａ）不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４の炭化水素基を有するリン脂質　　１～９９．８モル％；
    （Ｂ）リポソームの安定化剤　　０．２～７５モル％。
  8. 　リポソームが以下の組成を有する、請求項１～７のいずれか１項に記載のペプチド結合リポソーム：
    （Ｉ）不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４の炭化水素基を有する酸性リン脂質　　１～８５モル％；
    （ＩＩ）不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４の炭化水素基を有する中性リン脂質　　０．０１～８０モル％；
    （ＩＩＩ）ペプチドが結合した、不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４～２４の炭化水素基を有するリン脂質　　０．２～８０モル％；
    （ＩＶ）リポソームの安定化剤　　０．２～７５モル％。
  9. 　エボラウイルス抗原タンパク質が、Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ、ｖｉｒｉｏｎ　ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　４０、Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ、ｖｉｒｉｏｎ　ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　３０及びＲＮＡ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ＲＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅからなる群から選択されるいずれかである、請求項１～８のいずれか１項に記載のペプチド結合リポソーム。
  10. 　部分配列が、配列番号１～２３のいずれかで表されるアミノ酸配列である、請求項１～９のいずれか１項に記載のペプチド結合リポソーム。
  11. 　ＨＬＡ－Ａ＊０２０１に拘束された細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導し得るペプチドであって、
    （１）配列番号１～１４のいずれかで表されるアミノ酸配列、又は
    （２）配列番号１～１４のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１又は２個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列
    を含み、且つ９～１１アミノ酸の長さを有する、ペプチド。
  12. 　ＨＬＡ－Ａ＊２４０２に拘束された細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導し得るペプチドであって、
    （１）配列番号１５～２３のいずれかで表されるアミノ酸配列、又は
    （２）配列番号１５～２３のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１又は２個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列
    を含み、且つ９～１１アミノ酸の長さを有する、ペプチド。
  13. 　請求項１～１０のいずれか１項に記載のペプチド結合リポソーム、或いは請求項１１又は１２記載のペプチドを含む、細胞傷害性Ｔリンパ球活性化剤。
  14. 　更にアジュバントを含有することを特徴とする、請求項１３記載の細胞傷害性Ｔリンパ球活性化剤。
  15. 　請求項１～１０のいずれか１項に記載のペプチド結合リポソーム、或いは請求項１１又は１２記載のペプチドを含む、エボラウイルスワクチン。
  16. 　更にアジュバントを含有することを特徴とする、請求項１５記載のエボラウイルスワクチン。
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