KR20230079418A - SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인의 입자 기반 제제 - Google Patents

SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인의 입자 기반 제제 Download PDF

Info

Publication number
KR20230079418A
KR20230079418A KR1020237014760A KR20237014760A KR20230079418A KR 20230079418 A KR20230079418 A KR 20230079418A KR 1020237014760 A KR1020237014760 A KR 1020237014760A KR 20237014760 A KR20237014760 A KR 20237014760A KR 20230079418 A KR20230079418 A KR 20230079418A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
rbd
cobalt
bilayer
porphyrin
copop
Prior art date
Application number
KR1020237014760A
Other languages
English (en)
Inventor
조나단 로벨
웨이-치아오 후앙
Original Assignee
더 리서치 파운데이션 포 더 스테이트 유니버시티 오브 뉴욕
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 더 리서치 파운데이션 포 더 스테이트 유니버시티 오브 뉴욕 filed Critical 더 리서치 파운데이션 포 더 스테이트 유니버시티 오브 뉴욕
Publication of KR20230079418A publication Critical patent/KR20230079418A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/125—Picornaviridae, e.g. calicivirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/215—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/545—Heterocyclic compounds
    • A61K47/546—Porphyrines; Porphyrine with an expanded ring system, e.g. texaphyrine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A61K9/0021—Intradermal administration, e.g. through microneedle arrays, needleless injectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55577—Saponins; Quil A; QS21; ISCOMS
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55583—Polysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Abstract

SARS-CoV-2 바이러스에 대한 면역 반응 (중화 항체 포함)의 생성을 위한 백신 조성물 및 방법이 제공된다. 상기 백신 조성물은 코발트-포르피린-인지질 접합체를 포함하는 리포좀에 통합된 SARS-CoV-2 바이러스의 폴리히스티딘-태그된 수용체 결합 도메인 (RBD)을 포함하여, 폴리히스티딘 태그의 하나 이상의 히스티딘이 코발트-포르피린의 코발트에 배위결합되고, 상기 RBD의 적어도 일부가 리포좀의 외부로 노출된다.

Description

SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인의 입자 기반 제제
관련 출원의 인용
본 출원은 미국 가출원 63/085,734호 (2020년 9월 30일 출원)에 대한 우선권을 주장하는 국제출원 PCT/US2021/052907호 (2021년 9월 30일 출원)에 출원의 국내 단계 출원으로, 상기 두 문헌은 모두 본원에 인용에 의해 포함된다.
기술분야
본 발명은 SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인의 입자 기반 제제에 관한 것이다.
SARS-CoV-2는 전세계적으로 파괴적인 바이러스 대유행을 야기하였다 (Petersen et al., The Lancet Infectious Diseases (2020), 20(e238-e244)). 효과적인 백신 대책에 대한 탐구는 생의학 연구 커뮤니티에서 활발하게 진행되고 있다 (Poland et al., SARS-CoV-2 Vaccine Development: Current Status, Mayo Clinic Proceedings (2020), doi-org/10.1016/j.mayocp.2020.07.021).바이러스 표면의 스파이크 (S) 단백질은 결합, 융합 및 숙주 세포로의 진입을 위한 도구이며, 여러 고급 백신 후보물질의 주요 면역원이기도 하다 (Funk et al., Frontiers in Pharmacology 11(937) (2020)). S 단백질에는 숙주 수용체인 안지오텐신 전환 효소 2 (ACE2)에 결합하는 수용체 결합 도메인 (RBD)이 포함되어 있다. RBD는 SARS-CoV-2 감염 중에 생성된 대부분의 중화 항체들이 이를 향하기 때문에 매력적인 항원이다 (Nat. Commun. 11(1) 2020); ter Muelen et al., PLoS Med 3(7) (2006) e237). RBD 단백질은 대략 S의 아미노산 330-350을 포함한다.
RBD는 비인간 영장류를 바이러스 공격으로부터 보호하는, 임상전 연구에서 생존가능한 면역원인 것으로 나타났다 (Yang et al., Nature (2020), doi.org/10.1038/s441586-020-2599-8n). 그러나, 4개의 내부 이황화 결합을 가진 비교적 작고 컴팩트한 면역원으로서, RBD는 자신의 면역원성을 제한하는 합텐 유사 특성을 나타낼 것으로 예상되기에, 항원 용량을 더 많이 사용할 필요가 있을 수 있어서 RBD 백신의 대규모의 롤아웃을 복잡하게 만들 수 있다. 실제로, 면역원성은 단백질 작제물을 이량체 (Dai et al., Cell 182(3) (2020) 722-733.e11) 및 올리고머 구조 (Walls, biorXiv doi.org/10.1101/2020.08.11.247395 (2020))로 조작 가공함으로써 향상되는 것으로 밝혀졌고, 또 다른 접근법은 RBD를 담체 단백질에 접합시키는 것이 필요했다 (Quinlan et al., 2020, dx.doi.org/10.2139/ssrn.3575134). 이러한 접근 방법들이 효과적이기는 하나, 시간이 많이 걸리고 RBD의 다운스트림 특성화에 혼란을 줄 수 있다.
본 발명은 SARS-CoV-2 RBD의 면역원성을 강화하여 SARS-CoV-2에 대한 중화 항체를 비롯한 특이적 면역 반응을 유도하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
본 발명은 면역원성을 강화하여 바이러스 중화 항체 반응을 유도하기 위한 SARS-CoV-2 RBD의 미립자 제시의 사용에 대하여 기술한다. 우리는 재조합 RBD가 코발트-포르피린-인지질 (CoPoP) 리포좀과 혼합되는 경우에 항원 입자들이 신속하고 자발적으로 형성됨을 실증하고 있다. CoPoP를 사용한 RBD 면역화는 강화된 중화 항체를 생성하였다. 보조제인 QS21을 포함시키면, T 세포 도움을 제공하는 것을 기초로 하여 면역 반응을 강화할 수 있다. 이러한 데이터는 CoPoP을 사용한 RBD의 입자 제시가 SARS CoV-2에 대한 안전하고 강력한 백신으로 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.
한 양태에서, 본 발명은 작용화된 나노구조를 포함하는 리포좀 조성물로서, 상기 나노구조가 SARS-CoV-2의 폴리펩타이드/단백질 유래의 서열을 그 안에 포함하고 있는, 리포좀 조성물을 제공한다. 단백질의 예는 S 단백질이다. 스파이크 단백질 서열의 예는 RBD이다. 나노구조는 이중층을 가질 수 있다. 나노구조는 리포좀 형태일 수 있다. 리포좀의 이중층은 코발트-포르피린-인지질 접합체, 선택적으로 포르피린에 접합되지 않은 인지질, 선택적으로 스테롤, 및 선택적으로 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다. 또한, 리포좀은 하나 이상의 보조제를 포함할 수도 있다. 폴리히스티딘 태그가 있는 SARS-CoV-2의 폴리펩타이드의 하나 이상의 서열 (예컨대, 스파이크 단백질 서열 또는 스파이크 단백질의 RBD 서열(들))이 이중층에 포함되어, 폴리히스티딘 태그의 일부가 상기 이중층에 존재하고 SARS-CoV-2 폴리펩타이드의 적어도 일부가 이중층의 외부로 노출되어 있게 된다. 또한, 리포좀은 하나 이상의 보조제도 그 안에 포함할 수 있다.
한 양태에서, 본 발명은 SARS-CoV2에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 본 방법은 코발트-포르피린-인지질 접합체, 선택적으로 포르피린에 접합되지 않은 인지질, 선택적으로 스테롤, 및 선택적으로 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함하고, 폴리히스티딘 태그가 있는 SARS-CoV-2의 폴리펩타이드의 하나 이상의 서열 (예컨대, 스파이크 단백질 서열, 예를 들어 RBD 서열)이 이중층에 포함되어, 폴리히스티딘 태그의 일부가 상기 이중층에 존재하고 SARS-CoV-2 폴리펩타이드의 적어도 일부가 이중층의 외부로 노출되어 있게 되는 리포좀을 포함하는 조성물을 면역화가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 또한, 리포좀은 하나 이상의 보조제를 포함할 수도 있다. 면역 반응은 체액성 반응 (예를 들어, 항체의 생성), 세포성 반응 (예를 들어, T 세포 계열 반응) 또는 양자 모두를 포함할 수 있다. 항체는 중화 항체일 수 있다. T-세포 반응은 CD4+ 및/CD8+ 세포의 증가, 예를 들어 IFNγ, IL-2 및 TNFα를 분비하는 CD4+ 또는 CD8+ 세포의 증가를 포함할 수 있다.
한 실시형태에서, 본 발명은 코발트-포르피린-인지질 접합체, 선택적으로 포르피린에 접합되지 않은 인지질, 선택적으로 스테롤, 및 선택적으로 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함하고, RBD 서열 또는 이와 적어도 85% 상동성을 갖는 이의 변이체로서, 폴리히스티딘 태그가 있는 상기 RBD 서열 또는 이의 변이체가 이중층에 포함되어, 폴리히스티딘 태그의 적어도 일부가 상기 이중층에 존재하고 상기 RBD 또는 변이체가의 적어도 일부가 리포좀의 외부로 노출되어 있게 되는 리포좀을 포함하는 백신 조성물을 제공한다. 다양한 실시형태에서, RBD 또는 이의 변이체의 전부 또는 거의 전부가 리포좀의 외부로 노출되고, 폴리히스티딘 태그의 전부 또는 거의 전부가 이중층에 존재한다.
한 실시형태에서, 본 발명은 SARS-CoV-2 감염에 대해 대상체를 면역화시키는 방법을 제공한다. 본 방법은 복수의 리포좀을 포함하는 조성물을 면역화가 필요한 대상체에게 투여하는 단계로서, 상기 리포좀의 적어도 일부가 코발트 포르피린-인지질 접합체, 선택적으로 포르피린에 접합되지 않은 인지질, 선택적으로 스테롤, 및 선택적으로 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함하고, RBD 서열 또는 이와 적어도 85% 상동성을 갖는 이의 변이체를 가지되, 폴리히스티딘 태그가 있는 상기 RBD 서열 또는 이의 변이체가 이중층에 포함되어, 상기 폴리히스티딘 태그의 일부가 상기 이중층에 존재하고 상기 RBD 또는 변이체의 적어도 일부가 상기 이중층의 외부로 노출되어 있게 되는 것인, 단계를 포함한다. 상기 조성물은 하나 이상의 보조제를 추가로 포함할 수 있는데, 상기 보조제는 리포좀에 혼입될 수 있거나, 또는 해당 조성물 내의 리포좀과 분리될 수도 있다.
한 실시형태에서, 본 발명은 치료가 필요한 대상체에게 나노구조를 포함하는 조성물을 투여함으로써 SARS-CoV-2의 RBD 펩타이드의 면역원성을 증가시키고/시키거나 SARS-CoV-2에 대한 중화 항체를 유도하는 방법으로서, 상기 나노구조가 코발트-포르피린-인지질 접합체, 선택적으로 포르피린에 접합되지 않은 인지질, 선택적으로 스테롤, 및 선택적으로 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함하는 이중층을 포함하고, RBD 서열 또는 이와 적어도 85% 상동성을 갖는 이의 변이체로서, 폴리히스티딘 태그가 있는 상기 RBD 서열 또는 이의 변이체가 상기 이중층에 포함되어, 폴리히스티딘 태그의 일부가 상기 이중층에 존재하고 상기 RBD 또는 변이체의 적어도 일부가 상기 이중층의 외부로 노출되어 있게 되는 것인, 방법을 제공한다. 선택적으로, 하나 이상의 보조제는 나노구조에 혼입되거나 별도로 투여될 수도 있다.
도 1. 재조합 RBD는 온전한 입체형태로 CoPoP에 결합한다. A) Ni-NTA 비드 경쟁 분석. 나타낸 발현 시스템에서 생성된 RBD 항원을 리포좀과 함께 3시간 동안 항온배양한 다음, Ni-NTA 비드를 첨가한 후 분리하였다. 리포좀에 안정적으로 결합되었던 단백질은 상청액 ("S") 레인에 있는 반면, 결합되지 않은 단백질은 비드 ("B") 분획에 있다. B) 고속 원심분리 분석에 의해 평가된 바와 같이 3시간의 항온배양 후 CoPoP 리포좀에 대한 RBD의 결합. C) 형광 표지된 RBD의 CoPoP 리포좀에 결합 동역학. 형광단 표지된 RBD가 CoPoP 리포좀에 결합하면, 에너지 전달로 인해 형광단 소광 (quenching)이 나타난다. D) Ni-NTA 비드 경쟁을 기반으로 한 HEK293 세포에서 생성된 RBD를 사용하여 CoPoP/MPLA 또는 CoPoP/MPLA/QS21 리포좀과 RBD의 결합 동역학. E) 가용성 또는 미립자 형태의 흡착된 RBD 또는 Pfs25 (관련이 없는 대조군 항원)에 대한 ACE2 결합의 슬롯 블롯 검출. F) hACE2-발현 세포에 대한 가용성 또는 미립자 형태의 형광단 표지된 RBD의 결합. G) RBD 또는 관련이 없는 Pfs25 대조군 항원이 제공된 리포좀 자체의 hACE2 코팅된 플레이트에 대한 결합 (PoP 신호에 기초함).
도 2. CoPoP/RBD 입자는 작고 안정적이며 면역 세포에 우선적으로 흡수된다. A) 동적 광 산란에 의해 측정된, RBD 결합 후 리포좀의 크기. 각 세트에서, 왼쪽에서 오른쪽으로, 막대는 무항원, RBD (HEK293) 및 RBD (sf9)이다. B) 나타낸 리포좀에 결합된 RBD (HEK293)의 저온 전자 현미경 사진. 100 nm 축적 막대를 표시하였다. C) 형광단 표지된 RBD의 리포좀에 대한 결합으로 측정한, 37℃에서 항온배양된 20% 인간 혈청에서 1주간 항온배양한 입자 안정성. D) 쥐과의 RAW264.7 또는 골수 유래의 수지상 세포 (BMDC)와 함께 항온배양 후 시험관내 RBD 흡수. 사이토칼라신 B를 식세포작용 억제제로 사용하였고 클로르프로마진은 세포내 이입 억제제로 사용하였다. E) 마우스의 근육내 면역화 후 생체내 배액 림프절 내의 면역 세포에서의 RBD 흡수. 표지된 RBD 흡수는 유동세포분석법 및 표시된 표면 마커들과의 공동-염색으로 평가하였다. A와 D에서의 막대 그래프는 n=3 측정값에 대한 평균 +/- 표준 편차를 나타낸다. E의 경우, 데이터는 일원 분산 분석 ANOVA에 이어서 다중 비교를 위해 조정된 터키의 사후 분석으로 분석하였다. (p*<0.05, p**<0.01)
도 3. 다양한 백신 보조제와 혼합된 RBD에 의해 유도된 마우스 항체의 기능 평가. 28일째에 혈청을 수집하기 전 0일째와 14일째에 지정된 보조제와 혼합된 100 ng의 RBD로 이계 교배 마우스를 면역화하였다. A) 항-RBD IgG 역가. B) 가상바이러스 IC50 억제 역가. C) RBD와 hACE2 간의 상호작용을 측정하는 대체 바이러스 (surrogate virus) 중화 시험에서의 억제. D) 면역 후 마우스 혈청에서 SARS-CoV-2 생바이러스 중화 역가. A와 B의 경우, log10 변환된 역가를 일원 분산분석 ANOVA 시험에 이어 터키의 비교로 분석한 결과, QS21이 존재 혹은 부재하는 CoPoP 리포좀들 간에는 통계적 차이가 없고; 다른 보조제들은 모두 CoPoP 리포좀과 비교했을 때 p<0.005로 유의한 차이를 나타내었다. C와 D의 경우, 데이터를 일원 분산분석 ANOVA에 이어 터키의 비교로 분석한 결과, QS21이 존재 혹은 부재하는 CoPoP 리포좀들 간에는 통계적 차이가 없고; 다른 보조제들은 모두 CoPoP 리포좀과 비교했을 때 p<0.001로 유의한 차이를 나타내었다.
도 4. 토끼 RBD 면역화. 0일째와 21일째에 지정된 보조제들과 혼합된 20 ㎍의 RBD로 토끼를 면역화시키고, 42일째에 혈청을 수집하였다. 나타낸 시점에서의 항-RBD IgG 역가 A) 및 가상바이러스 중화 B). C) RBD와 hACE2 간의 상호작용을 측정하는 대체 바이러스 중화 시험에서의 억제. D) 면역 후 혈청을 사용한 SARS-CoV-2 생바이러스 중화. A와 B의 경우, log10 변환된 역가를 일원 분산분석 ANOVA에 이어 터키의 비교로 분석하였다. C와 D의 경우, 데이터를 일원 분산분석 ANOVA에 이어 터키의 비교로 분석하였다. p*<0.05, p**<0.01, p***<0.005, p****<0.001.
도 5. 항체 및 세포성 면역 활성화. A) 근육내 투여 48시간 후 마우스의 배액 림프절에서 면역 세포들의 동원. 각 세트의 경우, 왼쪽에서 오른쪽으로, 막대는 다음을 나타낸다: 대조군, CoPoP/MPLA/QS21, CoPoP/MPLA 및 명반. 배중심 활성화의 유도는 유세포 분석법을 사용하여 확인하였고, B) 배중심 B 세포 및 C) Tfh 세포의 개체군은 CoPoP 리포좀 또는 명반과 혼합된 100 ng의 RBD (HEK293)로 면역화 1주 후에 림프절로부터 측정하였다. 면역화된 마우스로부터 비장 세포를 수집하여 RBD 항원으로 자극하였다. D) IFN-γ 분비. E) CD4+ T 세포에서 삼중 사이토카인 (IFNγ, IL-2 및 TNFα)의 세포내 염색. A-E의 경우, 데이터를 일원 분산분석 ANOVA 시험에 이어 터키의 비교로 분석하였다. p*<0.05, p**<0.01, p***<0.005, p****<0.001. A와 E의 경우, 박스 안의 선은 중앙값을 나타내고, 박스에서 나오는 수염은 해당 그룹의 최소값과 최대값까지 확장된다. 박스의 길이는 사분위수 범위를 나타낸다.
도 6. CoPoP을 사용한 RBD 면역화는 내약성이 좋다. A) 다른 보조제들 (모두 주입 전에 혼합함)와 비교한 CoPoP 리포좀의 국소 반응원성. B) 그룹당 n=5 마우스에 대해 1 ㎍의 RBD (작용 용량보다 10배 더 큼)로 면역화시킨 후 마우스의 중량 변화. C) 100 ng의 RBD 면역화 1차 접종 (prime) 및 지정된 보조제로 2차 접종 (boost) 후 혈청 내 코발트 수준. A의 막대 그래프는 n=4 마우스/그룹에 대해 평균 +/- 표준 편차를 나타낸다. A의 경우, 데이터를 일원 분산분석 ANOVA 시험에 이어 터키의 비교로 분석하였다. p*<0.05, p**<0.01, p****<0.001.
도 7. His-태그된 RBD/CoPoP 리포좀의 결합 분석 및 입체형태 분석의 개략도.
도 8. CoPoP 리포좀 표면의 RBD는 슬롯 블롯에서 ACE2를 인식한다. A) 유리 RBD, 또는 막에 CoPoP/MPLA 리포좀을 갖는 RBD의 서로 다른 용량. Pfs25를 음성 대조군으로 사용하였다. B) CoPoP/MPLA 리포좀이 있는 RBD와 CoPoP/MPLA/QS21 리포좀이 있는 RBD 간의 비교.
도 9. CoPoP 리포좀 표면의 RBD는 슬롯 블롯에서 특정 항체에 의해 인식되었다.
도 10. RBD_DY490은 ACE2/HEK293에 결합한다.
도 11. 리포좀 분포를 DLS를 사용하여 측정하였다. A) CoPoP/MPLA 및 B) CoPoP/MPLA/QS21 리포좀. 리포좀을 실온에서 3시간 동안 RBD (HEK293) 또는 RBD (sf9)와 함께 항온배양하였다.
도 12. 림프절에서 RBD의 APC 섭취를 위한 게이팅 전략. 세포를 SSC-FSC에 의해 게이팅한 후, CD11c-APC, F4/80-PE, B220-APC 및 IA-IE-양성 항원 흡수를 DY490 표지된 RBD를 사용하여 평가하였다. n=5 마우스를 사용한 생물학적으로 독립된 실험으로부터 대표적인 플롯을 나타내었다.
도 13. CoPoP 리포좀이 있는 His-태그된 RBD는 이계 교배 마우스에서 면역원성이다. 화살표로 표시한 시점에서 마우스를 A) RBD-HEK293 및 B) RBD-sf9로 면역화하였다.
도 14. ACE2/HEK293 및 HEK293 세포에서 가상바이러스 진입.
도 15. 혈청 희석과 ACE-HEK293 세포로의 Psv 진입에 대한 억제율. A) RBD-HEK293 항원 또는 B) 표시된 보조제와 혼합된 RBD-sf9로 면역화시킨 마우스의 혈청.
도 16. 토끼 면역화에 있어서 CoPoP 리포좀에 대한 His-태그된 RBD의 결합 능력.
도 17. 토끼를 0일째와 42일째에 CoPoP 리포좀 또는 명반과 함께 20 ㎍의 RBD로 면역화시켰다. A) 면역화시킨 혈청을 서로 다른 희석 배율로 Psv와 함께 항온배양하였다. 명반 그룹이 아닌 CoPoP 리포좀으로 면역화시킨 토끼의 최종 출혈 혈청에서 용량 의존적 억제가 관찰되었다. B) 면역화 후 토끼의 중량.
도 18. 배액 림프절에서 면역 세포의 동원. A) CoPoP/MPLA 리포좀 주입 후 48시간 후에 수집된 림프절 세포의 점 그래프. x-y 축은 CD11c-APC와 CD11b-PE cy7을 나타낸다. B) 영역 1은 대식세포, 침윤성 단핵구, 호중구 및 호산구를 포함한다. C) 영역 2는 mDC를 나타내고, 영역 3은 CD11blow DC를 나타내며, 영역 4는 CD11b- DC를 나타낸다.
도 19. 배중심 (GC) 활성화를 위한 게이팅 전략. GC 세포들 (GL7+CD95+; B220+ 세포군 내)은 A) B 세포를 식별하기 위한 B220 표면 마커로 게이팅한 후, B) GL7+CD95+ 개체군을 게이팅하였다. Tfh 세포들 (CXCR5+PD-1+; CD4+ 세포군 내)은 C) CD4+ T 세포를 식별하기 위한 CD4 표면 마커로 게이팅한 후 D) CXCR5+PD-1+을 게이팅하였다.
도 20. CoPoP 리포좀, ISA720 및 PoP 리포좀의 이소형 비율. A) IgG1 및 B) IgG2a.
도 21. CD4 + T 세포 및 CD8 + T 세포의 게이팅. A) 생세포와 사멸 세포를 게이팅한 다음, TCRbeta+CD4+ T 세포를 게이팅한 후, CD44high 개체군을 게이팅하였다. 이후, Foxp- 개체군을 게이팅하였고, IL2+ 세포들을 게이팅한 후에 B) TNFα+IFNγ+ 세포군을 게이팅하였다. C) 생세포와 사멸 세포를 게이팅한 다음, TCRbeta+CD8+ T 세포를 게이팅한 후, CD44high 개체군을 게이팅하였다. 그 후, IL2+ 세포를 게이팅한 후, D) TNFα+IFNγ+ 세포군을 게이팅하였다.
도 22. 면역화된 마우스로부터 비장 세포를 수집하여 RBD 항원으로 자극하였다. A) CD4+ T 세포 및 B) CD8+ T 세포에서 신호 사이토카인의 세포내 염색. C) CD8+ T 세포에서 삼중 사이토카인. 각 세트에서 왼쪽에서 오른쪽으로, 막대는 다음을 나타낸다: CoPoP/MPLA/QS221, CoPoP/MPLA, PoP/MPLA, AS01-유사, 명반, ISA720, Addavax 및 대조군.
도 23. CD-1 마우스에서 1 ㎍의 His-태그된 RBD를 함유한 CoPoP 리포좀의 내약성. 마우스를 "CoPoP/MPLA+RBD" (1 ㎍의 Pfs25, 4 ㎍의 CoPoP 및 1.6 ㎍의 MPLA) 또는 "CoPoP/MPLA/QS21+RBD" (1 ㎍의 Pfs25, 4 ㎍의 CoPoP와 1.6 ㎍의 MPLA 및 1.6 ㎍의 QS21)로 처리하였다. 값은 그룹당 n=6 마우스에 대한 평균 +/- 표준 편차를 나타낸다. A) 적혈구 세포에 대한 일반 혈액 검사 (Complete blood count) 매개변수들은 다음과 같다: RBC (적혈구 수), HGB (헤모글로빈), HCT (헤마토크리트); MCV (평균 세포 부피); MCH (평균 세포 헤모글로빈), MCHC (평균 세포 헤모글로빈 농도) 및 RDW (적혈구 분포폭); 백혈구 매개변수들은 다음과 같다: WBC (백혈구), NEU (호중구), LYM (림프구), MONO (단핵구); EOS (호산구), BAS (호염기구). 혈소판 매개변수들은 다음과 같다: PLT (혈소판) 및 MPV (평균 혈소판 부피). B) 혈청 마커와 이들에 대한 일반적인 설명은 다음과 같다. 신장 기능 마커들은 다음과 같다: BUN (혈액 요소 질소), CREA (크레아티닌), PHOS (인), Ca+ (칼슘), 췌장의 기능은 다음과 같다: 단백질 TP (총 단백질), ALB (알부민), GLOB (글로불린), 기타 GLU (글루코스), CHOL (콜레스테롤). 간 기능은 다음과 같다: ALT (알라닌 아미노트랜스퍼라제), ALP (알칼리성 포스파타제), ALB (알부민), TBIL (총 빌리루빈). 박스 안의 선은 중앙값을 나타내고, 박스에서 나오는 수염은 해당 그룹의 최소값과 최대값까지 확장된다. 박스의 길이는 사분위수 범위를 나타낸다. 통계 분석에 독립표본 양측 스튜던트 T-검정을 사용하였고, *는 대조군에 대한 CoPoP 리포좀들 간의 비교 (p<0.1)를 나타낸 것이고, **는 대조군에 CoPoP 리포좀들 간의 비교 (p<0.05)를 나타낸 것이다. 각 세트에서 왼쪽에서 오른쪽으로, 막대는 다음을 나타낸다: CP, CPQ 및 미처리.
도 24. 표 1. CD-1 마우스에서 미처리 마우스와 CoPoP 리포좀으로 처리한 마우스 간의 일반 혈액 검사 (CBC) 매개변수의 비교. 마우스를 "CoPoP/MPLA+RBD" (1 ㎍의 RBD, 4 ㎍의 CoPoP 및 1.6 ㎍의 MPLA) 또는 "CoPoP/MPLA/QS21+RBD" (1 ㎍의 Pfs25, 4 ㎍의 CoPoP와 1.6 ㎍의 MPLA 및 1.6 ㎍의 QS21)로 처리하였다. 값은 그룹당 n=6 마우스에 대한 평균 +/- 표준 편차를 나타낸다. 적혈구에 대한 CBC 매개변수들은 다음과 같다: RBC (적혈구 수), HGB (헤모글로빈), HCT (헤마토크리트); MCV (평균 세포 부피); MCH (평균 세포 헤모글로빈), MCHC (평균 세포 헤모글로빈 농도) 및 RDW (적혈구 분포폭); 백혈구 매개변수들은 다음과 같다: WBC (백혈구), NEU (호중구), LYM (림프구), MONO (단핵구); EOS (호산구), BAS (호염기구). 혈소판 매개변수들은 다음과 같다: PLT (혈소판) 및 MPV (평균 혈소판 부피).
도 25. 표 2. 미처리 또는 CoPoP 리포좀 처리 CD-1 마우스 간의 혈액 화학 검사 (Blood Chemistry Panel)의 비교. 마우스를 "CoPoP/MPLA+RBD" (1 ㎍의 RBD, 4 ㎍의 CoPoP 및 1.6 ㎍의 MPLA)로 처리하였다. 값은 그룹당 n=6 마우스에 대한 평균 +/- 표준 편차를 나타낸다. 혈청 마커와 이들에 대한 일반적인 설명은 다음과 같다. 신장 기능 마커들은 다음과 같다: BUN (혈액 요소 질소), CREA (크레아티닌), PHOS (인), Ca+ (칼슘), 췌장의 기능은 다음과 같다: 단백질 TP (총 단백질), ALB (알부민), GLOB (글로불린), 기타 GLU (글루코스), CHOL (콜레스테롤). 간 기능은 다음과 같다: ALT (알라닌 아미노트랜스퍼라제), ALP (알칼리성 포스파타제), ALB (알부민), TBIL (총 빌리루빈).
도 26. 표 3. 쥐과 면역화 데이터 요약
도 27. 표 4. 토끼 면역화 데이터 요약.
본 출원 전반에서, 단수형의 사용은 복수형을 포함하며 그 역도 마찬가지이다. 예를 들어, 기재된 한 불특정 항목은, 달리 언급하지 않는 한, 복수의 언급한 항목들도 포함한다.
본 명세서 전반에 걸쳐 제시된 모든 수치 범위는 이의 상한 및 하한 값을 포함할 뿐만 아니라, 그 안에 속하는 보다 좁은 모든 수치 범위를 (마치 이러한 보다 좁은 수치 범위들이 모두 본원에 명시적으로 기재되었던 것처럼) 포함하며, 모든 값은 하한값의 10분의 1까지 포함된다.
본원에 사용된 "치료"라는 용어는 치료되는 특정 질환 또는 의심 질환의 존재와 관련되는 하나 이상의 증상 또는 특징의 완화를 가리킨다. 치료는 반드시 완전한 치유나 차도를 의미하지 않으며, 재현이나 재발을 배제하지도 않는다. 치료는 단기간에 걸쳐, 중기간에 걸쳐 수행될 수 있거나, 또는 예컨대 유지 요법과 관련해서는 장기간의 치료일 수도 있다. 치료는 연속적이거나 간헐적일 수도 있다.
본원에 사용된 "유효량"이라는 용어는 단회 또는 다회분 용량으로 치료 또는 투여의 의도한 목적을 달성하기에 충분한 제제의 양을 의미한다. 원하거나 필요한 정확한 양은 사용되는 특정 화합물 또는 조성물, 이의 투여 방식, 환자 세부적인 사항 등에 따라 달라질 것이다. 적절한 유효량은 일상적인 실험만을 사용하여 본 발명에 의해 알려진 당업자에 의해 결정될 수 있다.
SARS-CoV-2의 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 (RBD)은 인간 안지오텐신 전환 효소 2 (ACE2)에 결합하여 바이러스 진입을 유도하는 후보 백신 항원이다. 여기에서, 우리는 코발트-포르피린-인지질 (CoPoP)을 함유하는 리포좀과의 혼합을 통해 재조합 RBD를 미립자 형태로 신속하게 전환시키는 것이 기능적 항체 반응을 향상시킬 수 있음을 보여주고 있다. 본 조성물은 체액성 (예를 들어, 항체의 생성) 및/또는 세포성 (T-세포 매개형) 면역 반응의 유도에 사용될 수 있다. T 세포 반응은 CD4+, CD8+ 및/또는 다른 면역 세포들을 포함할 수 있다. 본 조성물의 투여는 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 적응성 반응 및/또는 선천적 반응의 증가를 유도할 수 있다. 여기에 제공된 데이터는 본 조성물의 투여가 SARS-CoV-2 중화 항체를 유도하였음을 입증하고 있다. 본 조성물은 세포성 및 체액성 반응을 모두 유도할 수 있었다. 세포성 반응은 증가된 수와 활성의 T 세포의 형태일 수 있다. 예를 들어, 사이토카인 생성 세포 (CD4+ 및 CD8+)의 증가가 IFNγ, IL-2 및 TNFα에 대해 관찰되었다.
여기에 제공된 데이터는 CoPoP 이중층으로의 His-태그 삽입을 통한 항원 결합이 리포좀 표면에서 RBD의 혈청 안정적이고 입체형태 구조상으로도 온전한 제시를 유도함을 입증하고 있다. 다른 백신 제제와 비교할 때, RBD가 혼합된 CoPoP 리포좀을 사용한 면역화가 마우스에서 항체 역가의 몇 십배 더 높은 수준을 유도하여, 인간 세포에서 가상바이러스 세포 진입을 중화하고, ACE-2와의 RBD 상호작용을 차단하고/하거나, 생바이러스 복제를 억제함을 발견한 것은 놀라운 일이었다. 향상된 면역원성은 항원 제시 세포로 미립자 형태의 RBD 흡수 증가 및 배액 림프절에서 면역 세포 침윤의 개선에 의해 설명될 수 있다. 보조제 QS21이 사용되는 경우, 항원 특이적인 다작용성 T 세포 반응이 강화될 수도 있다. 동물 모델에서, 고용량 면역화는 최소한의 국소 반응원성을 초래하였고, 내약성이 좋았으며, 혈청 코발트 수준을 상승시키지 않았다. 종합해 보면, 이러한 결과들은 RBD 면역원의 미립자 제시가 SARS-CoV-2에 대한 중화 항체 반응을 유도하는데 사용될 수 있음을 보여주는 것이다.
항체 (예: 숙주 면역 반응의 일부로 생성된 항체)와 관련하여 본원에 사용된 "중화"라는 용어는, 중화가 달성될 수 있는 기전과는 관계없이, SARS-CoV-2 바이러스가 자신의 복제를 위해 표적 세포를 감염시키는 것을 억제하는 항체 또는 항원 결합 단편을 가리킨다. 예를 들어, SARS-CoV-2가 포유동물 숙주 세포로 진입하는 것을 억제하거나, 또는 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질을 제시하는 유사형 바이러스가 포유동물 숙주 세포로 진입하는 것을 억제함으로써 바이러스를 중화시킬 수 있다. "가상바이러스"라는 용어는 표면에 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질도 발현하는 리포터 유전자를 포함하는 재조합 바이러스 입자를 가리킨다.
한 양태에서, 본 발명은 리포좀을 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체 (예컨대, 인간 대상체)에서 SARS-CoV-2 감염의 중증도를 예방하거나 감소시키는 방법으로서, 상기 리포좀의 이중층이 코발트-포르피린-인지질을 포함하여 코발트가 해당 이중층 내에 존재하고, 폴리히스티딘-태그된 SARS-CoV-2 단백질 또는 펩타이드 (예컨대, 스파이크 단백질, 예를 들어 서열번호 1의 서열 또는 이와 적어도 90% 상동성을 갖는 이의 변이체를 갖는 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인)의 하나 이상의 히스티딘에 배위결합하는, 방법을 제공한다. 상기 조성물의 투여는 SARS-CoV-2 감염에 대한 특이적인 체액성 및/또는 세포성 반응을 유도하는데 사용될 수 있다. 체액성 및/또는 세포성 면역 반응은, RBD가 본 발명의 CoPoP 리포좀에 포함되지 않은 경우에 RBD 투여로 유발된 반응보다 더 크다.
한 양태에서, 본 발명은 나노구조를 포함하는 조성물로서, 상기 나노구조 (예컨대, 리포좀의 형태)가, 코발트가 킬레이트된 포르피린-인지질 접합체를 포함하여 코발트가 그 안에 존재하는 이중층, 및 하나 이상의 펩타이드 분자로서, 서열번호 1의 서열 또는 이와 적어도 85% 또는 적어도 90% 상동성을 갖는 이의 변이체를 갖고, 폴리-히스티딘 태그를 가져 상기 폴리-히스티딘 태그가 이중층 내에 존재하는 코발트와 배위결합할 수 있는, 상기 하나 이상의 펩타이드 분자를 포함하고, 상기 RBD 분자의 적어도 일부가 해당 나노구조의 표면으로 노출되는 것인, 조성물을 제공한다. 상기 이중층은 선택적으로 포르피린에 접합되지 않은 인지질을 가질 수 있고, 선택적으로 스테롤을 가지며, 선택적으로 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 가질 수 있다. 리포좀은 하나 이상의 보조제를 추가로 포함할 수 있다. 보조제의 예로는 MF59, QS21, 및 모노포스포릴 지질 A와 같은 약독화된 지질 A 유도체, 또는 3-데아실화된 모노포스포릴 지질 A 또는 모노포스포릴 헥사-아실 지질 A, 3-데아실과 같은 합성 유도체를 포함한다. 보조제들의 조합도 사용할 수 있다. 모노포스포릴지질 A는 지질 유사 구조를 가지고 있어서, 지질 이중층 내에도 존재하면서 리포좀을 형성한다.
한 양태에서, 본 발명은 나노구조 (예컨대, 리포좀의 형태)를 포함하는 백신 조성물로서, 상기 나노구조가 이중층으로서, 포르피린-인지질 접합체, 선택적으로 포르피린에 접합되지 않은 인지질, 선택적으로 스테롤, 선택적으로 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)를 포함하고, 상기 포르피린-인지질 접합체에 코발트 킬레이트되어 코발트가 그 안에 존재하는 상기 이중층; 및 하나 이상의 펩타이드 분자로서, 서열번호 1의 서열 또는 이와 적어도 85% 상동성을 갖는 이의 변이체를 갖고, 폴리-히스티딘 태그를 가져 상기 폴리-his 태그가 이중층 내에 존재하는 코발트와 배위결합할 수 있는, 상기 하나 이상의 펩타이드 분자; 및 선택적으로 보조제를 포함하며, 이때 상기 RBD 분자의 적어도 일부가 해당 나노구조의 표면으로 노출되며, 상기 보조제가 상기 리포좀에 포함될 수 있거나, 또는 상기 리포좀에 포함되지 않고 조성물 내에 존재할 수 있거나, 또는 양자 모두의 경우인 것인, 백신 조성물을 제공한다.
한 실시형태에서, 본 발명은 SARS-CoV-2 바이러스 감염에 대해 효과적인 백신 조성물로서, i) SARS-CoV-2의 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 (RBD)의 폴리히스티딘-태그된 아미노산 서열, ii) 보조제, 및 iii) 약제학적 담체를 포함하고, 상기 보조제는 이중층(i)을 포함하는 리포좀을 포함하며, 이때 상기 이중층은 하나 이상의 인지질, 및 하나 이상의 포르피린을 포함하고, 상기 하나 이상의 포르피린에는 코발트가 배위결합 (예를 들어, 킬레이트화)되어 코발트-포르피린을 형성하며, 상기 코발트-포르피린은 적어도 일부의 인지질에 접합되어 코발트-포르피린-인지질을 형성하고; 상기 RBD는 상기 리포좀 내에 포함되어 상기 폴리히스티딘 태그의 일부가 상기 이중층의 소수성 부분에 존재하며, 상기 폴리히스티딘 태그의 하나 이상의 히스티딘은 상기 코발트-포르피린 내의 코발트에 배위결합하고, 상기 RBD의 일부는 리포좀의 외부로 노출되는 것인, 백신 조성물을 제공한다. 상기 백신 조성물은 추가의 보조제, 예컨대 QS21을 포함할 수 있다.
나노구조와 리포좀이라는 용어는 본 명세서에서 서로 교환하여 사용된다.
한 양태에서, 본 발명은 적어도 이중층을 포함하는 나노구조를 제공한다. 상기 이중층은 코발트가 이중층 내에 존재하도록 코발트가 킬레이트된 포르피린-인지질 접합체를 포함한다. 상기 이중층 구조는 리포좀을 형성할 수 있다. 상기 구조는 2개의 단일층 (이중층)으로서, 상기 2개의 단일층의 소수성 기는 서로 대향하고 있고 친수성 기는 외부로 노출되어 있는, 두 단일층을 포함할 수 있다. 상기 이중층에 관한 본 명세서의 개시내용은 단일층에도 적용가능하다. 이중층 또는 단일층은 본원에서 "막"으로도 지칭한다.
본 발명의 나노구조의 이중층은 그 안에 포함된 하나 이상의 SARS-CoV-2 폴리펩타이드 또는 이의 일부를 갖는다. 예를 들어, 본 발명의 리포좀은 그 안에 포함된 SARS-CoV-2의 his-태그된 스파이크 단백질의 일부를 가질 수 있다. 스파이크 단백질의 일부의 예로 RBD 영역을 들 수 있다. 한 실시형태에서, 본 발명의 리포좀은 그 안에 포함된 RBD의 서열(들)을 갖는다. 리포좀은 추가로 그 안에 포함된 하나 이상의 보조제를 가질 수 있다.
이중층에 있는 코발트-포르피린의 일부 또는 전부는 폴리히스티딘-태그된 분자들 (예컨대, SARS-CoV-2의 RBD 서열)에 비공유적으로 결합할 수 있어, 상기 폴리히스티딘 태그의 적어도 일부가 이중층 내에 존재하게 되고, 상기 태그된 분자는 이중층의 표면에 제시된다. 본 발명의 이중층에서, 폴리히스티딘 태그의 하나 이상의 히스티딘 잔기들이 이중층 내의 코발트에 배위결합함으로써, 해당 구조에 안정성을 제공하는 것으로 생각된다. 전체 히스티딘 태그는 이중층 내에 존재할 수 있다. 코발트가 접합된 포르피린 인지질 접합체는 본원에서 CoPoP로 지칭한다. 이중층이 CoPoP를 포함하는 리포좀은 본원에서 CoPoP 리포좀으로 지칭한다. 코발트가 접합되지 않은 포르피린 인지질 접합체는 본원에서 PoP로 지칭한다. 이중층이 PoP만을 포함하는 (즉, CoPoP를 포함하지 않는) 리포좀은 본원에서 PoP 리포좀으로 지칭한다. CoPoP 리포좀도 PoP를 포함할 수 있다. CoPoP 리포좀은 히스티딘 태그된 분자로 작용화될 수 있다. 본원에 사용된 "his-태그된 분자"라는 용어는 히스티딘 꼬리를 갖는 분자, 예를 들어 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 의미한다. 예를 들어, 히스티딘 꼬리가 있는 펩타이드가 his-태그된 분자이다. 이러한 his-태그 함유 CoPoP 리포좀은 본원에서 his-태그된 CoPoP 리포좀 또는 his-태그된 CoPoP로 지칭한다.
본원에서, "인지질"은 글리세롤 백본을 통해 소수성 지질 꼬리에 연결된 포스페이트 기를 갖는 친수성 헤드기를 갖는 지질이다. 인지질은 6개 내지 22개의 탄소 (모든 정수개의 탄소 및 그 사이의 범위 포함)의 아실 측쇄를 포함한다. 특정 실시형태에서, 포르피린 접합체 내의 인지질은 1-팔미토일-2-하이드록시-sn-글리세로-3-포스포콜린이다. 포르피린 접합체의 인지질은 포스파티딜콜린 (PC), 포스파티딜에탄올아민 (PE), 포스파티딜세린 (PS) 및/또는 포스파티딜이노시톨 (PI)을 포함하거나 필수적으로 이들로 이루어질 수 있다. 인지질의 예로는, 이에 제한되지는 않지만, 디팔미토일포스파티딜콜린 (DPPC), 디올레오일 포스파티딜콜린 (DOPC), 디미리스토일포스파티딜콜린 (DMPC), 디스테아로일포스파티딜콜린 (DSPC), 디스테아로일포스파티딜에탄올아민 (DSPE) 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
한 실시형태에서, 본 발명은 이중층이 CoPoP, 및 하나 이상의 his-태그된 RBD 서열을 포함하는 리포좀으로서, 상기 폴리히스티딘 태그의 적어도 일부가 이중층 내에 존재하고 RBD의 적어도 일부가 이중층의 표면에 제시되는 것인, 리포좀을 제공한다. 리포좀은 하나 이상의 보조제를 추가로 포함할 수 있다. 보조제의 예로는 모노포스포릴 지질 A (MPLA)와 같은 약독화된 지질 A 유도체, 또는 3-데아실화된 모노포스포릴 지질 A 또는 모노포스포릴 헥사-아실 지질 A, 3-데아실과 같은 합성 유도체를 포함한다.
보조제는 인산염 완충 식염수 중 0.001 내지 50 중량% 용액으로 사용될 수 있으며, 항원은 마이크로그램 내지 밀리그램 정도, 예를 들어 약 0.0001 내지 약 5 중량%, 예컨대 약 0.0001 내지 약 1 중량%, 또는 예컨대 약 0.0001 내지 약 0.05 중량%로 존재한다. 항원은 마이크로그램 내지 밀리그램 정도, 또는 약 0.001 내지 약 20 중량%, 예컨대 약 0.01 내지 약 10 중량%, 또는 약 0.05 내지 약 5 중량%의 양으로 존재할 수 있다.
보조제는 면역원성 조성물에 별도의 성분으로 투여될 수 있거나, 또는 리포좀에 포함될 수도 있다. 보조제의 예로는 완전 프로인트 보조제, 불완전 프로인트 보조제, 모노포스포릴 지질 A (MPLA), 인산알루미늄, 수산화알루미늄, 명반, 인산화 헥사아실 이당류 (PHAD), 시그마 보조제 시스템 (SAS), AddaVax (Invitrogen), MF59, QS21, 사포닌 및 이들의 조합을 포함한다. 습윤제, 유화제, 충전제 등과 같은 다른 담체들도 사용될 수 있다. PHAD, PHAD-504 및 3D6A-PHAD를 비롯한 합성 MPLA도 본 발명의 조성물 및 방법에 사용될 수 있다. 실시형태에서, 리포좀은 4:2:1:X의 DPPC:콜레스테롤:CoPoP:MPLA (여기서, MPLA는 각각의 이러한 유형의 합성 형태이고, X는 5, 4, 3, 2 또는 1임)로 형성될 수 있다.
한 실시형태에서, CoPoP/MPLA 리포좀 제제는 [DPPC:CHOL:MPLA:CoPoP] [4:2:0.4:1]의 질량비를 가질 수 있다. QS21도 존재하는 실시형태에서, CoPoP/MPLA/QS21 리포좀 제제는 [DOPC:CHOL:MPLA:CoPoP:QS21] [20:5:0.4:1:0.4]의 질량비를 가질 수 있다. AS01 유사 리포좀 제제는 [DOPC:CHOL:MPLA:QS21] [20:5:0.4:0.4]의 질량비를 가질 수 있다.CoPoP/MPLA 리포좀 제제의 범위는 MPLA와 QS21의 질량비를 변경하여 [DOPC:CHOL:MPLA:CoPoP:QS21] [20:5:0.1-1:1:0.1-1]이 될 수 있다. his-태그된 폴리펩타이드 : 리포좀의 범위는 1:1 내지 1:8 질량비의 his-태그된 폴리펩타이드: CoPoP일 수 있다.
RBD의 서열은, 분비 신호 펩타이드와 C-말단 his-태그를 제외하고는, 다음과 같다.
RBD 서열:
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNF (서열번호 1)
실시형태에서, 서열이 서열번호 1과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있는 상기 서열의 변이체도 사용될 수 있다. 서열번호 1의 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 더 긴 서열도 사용될 수 있다. 더 긴 서열은 하나 이상의 신호 펩타이드 서열, 분비 서열, C-말단 his-태그, 클로닝 관련 서열 등, 또는 임의의 다른 아미노산도 포함할 수 있다. 실시형태에서, 서열번호 1의 더 짧은 부분들도 사용될 수 있다.
RBD 또는 다른 서열들은 면역원성을 변형시키는 치환을 포함할 수도 있다. 변형된 서열은 자연 발생 아미노산만을 가질 수 있거나, 또는 자연 발생 아미노산과 비자연 발생 아미노산의 혼합물일 수도 있다. 일부 실시형태에서, RBD 서열 또는 이의 변이체는 리포좀에 존재하는 유일한 아미노산 서열일 수 있다.
히스티딘 태그에 부착된 RBD 서열을 갖는, his-태그된 CoPoP 이중층을 포함하는 나노구조는 바람직한 안정성을 나타낸다. his-태그된 RBD 서열은 CoPoP에 비공유결합 (배위결합)되어 항온배양 공정을 통해 제조될 수 있다. 따라서, 이 공정은 반응성 모이어티 - 예컨대, 말레이미드 등 -의 제거 또는 부동태화나, 또는 다른 유형의 접합 화학에 사용되는 외인성 촉매 또는 비천연 아미노산을 필요로 하지 않는다.
코발트-포르피린-인지질은 이중층의 1 내지 100 mol% (0.1 mol% 값과 그 사이의 범위를 포함)를 구성할 수 있다. 예를 들어, 코발트-포르피린-인지질은 이중층의 1 내지 20 mol%, 또는 5 내지 10 mol%를 구성할 수 있다. 코발트-포르피린-인지질이 이중층의 100%를 구성하면, 코발트-포르피린에 접합되지 않은 인지질은 존재하지 않는다. 이중층은 하나 이상의 스테롤 및/또는 폴리에틸렌 글리콜도 포함할 수 있다. 스테롤은 콜레스테롤일 수 있다. 한 실시형태에서, CoPoP는 나노입자 중에 0.1 내지 10 mol%로 존재하고, 나머지 99.9 내지 90 mol% (전체 이중층 지질의 퍼센트임)는 추가의 지질에 의해 구성된다. 예를 들어, CoPoP 및 PoP의 조합은 0.1 내지 10 mol%로 존재할 수 있고, 스테롤은 0.1 내지 50 mol%로 존재할 수 있으며, 선택적으로 모노포스포릴 지질 A 또는 3-데아실화 모노포스포릴 지질 A와 같은 약독화 지질 A 유도체 또는 관련 유사체는 0 내지 20 mol% 또는 0.1 내지 20 mol%로 존재할 수 있고, 나머지는 추가의 인지질로 구성될 수 있다. 한 실시형태에서, CoPoP 및 PoP의 조합은 나노입자 중에 0.1 내지 10 mol%로 존재할 수 있고, 나머지 99.9 내지 90 mol%는 추가의 인지질에 의해 구성된다. 예를 들어, CoPoP와 PoP의 조합은 0.1 내지 10 mol%로 존재할 수 있고, 스테롤은 0 내지 50 mol% 또는 0.1 내지 50 mol%로 존재할 수 있으며, 선택적으로 PEG는 0 내지 20 mol% 또는 0.1 내지 20 mol%로 존재할 수 있고, 나머지는 인지질, 예컨대 DOPC, DSPC, DMPC 또는 이들의 조합으로 구성될 수 있으며, 스테롤이 존재하는 경우라면 콜레스테롤일 수 있다.
이중층의 폴리히스티딘 태그에 있는 히스티딘의 수는 2 내지 20개일 수 있다. 예를 들어, 폴리히스티딘 태그의 히스티딘 수는 6 내지 10개일 수 있다. 예를 들어, 히스티딘의 수는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개일 수 있다. 히스티딘 태그 (his-tag)는 다양한 용도에 있어서 관심대상인 다양한 제시 분자들을 운반할 수 있다. his-태그의 적어도 하나 또는 양 말단은 리포좀의 외부 표면 가까이에 존재할 수 있다. 실시형태에서, 폴리히스티딘 태그의 적어도 하나의 말단은 제시 분자에 공유결합된다. 한 실시형태에서, his-태그의 한 말단 (예를 들어, C-말단)은 유리되어 있고 (예를 들어, 상기 말단이 C-말단인 경우, 상기 말단은 보호되지 않은 아미드 또는 보호되지 않은 카르복실산임), 펩타이드 (예를 들어, RBD 서열)는 다른 말단 (예를 들어, N-말단)에 부착된다. his-태그의 적어도 일부가 이중층 내에 위치하고 있어, 이것이 이중층 내에 포함되어 있는 코발트에 배위결합되는 것으로 생각된다.
리포좀은 구형 또는 비구형일 수 있다. 리포좀의 크기는 50 내지 1000 nm 또는 그 이상일 수도 있다. 한 실시형태에서, 리포좀은 50 내지 1000 nm (모든 정수의 nm 값과 그 사이의 범위를 포함)의 크기 (예를 들어, 가장 긴 치수, 예컨대, 직경)를 갖는다. 예를 들어, 크기는 50 내지 200 nm 또는 20 내지 1000 nm일 수 있다. 리포좀이 구형이 아닌 경우라면, 가장 긴 치수는 50 내지 1000 nm일 수 있다. 이러한 치수는 이중층의 나노구조 폭을 유지하면서 달성될 수 있다. RBD 서열 또는 이의 일부는 이중층에 포함될 수 있다. 리포좀은 수성 구획의 탑재물을 추가로 운반할 수 있다. 한 실시형태에서, 리포좀은 30 nm 내지 250 nm의 크기 (nm까지의 모든 정수 및 그 사이의 범위를 포함)를 가질 수 있다. 한 실시형태에서, 리포좀의 크기는 100 내지 175 nm이다. 한 실시형태에서, 조성물 내의 리포좀의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100%는 30 내지 250 nm 또는 100 내지 175 nm의 크기를 갖는다. 리포좀 또는 나노구조는 200 nm 이상일 수 있다. 한 실시형태에서, 나노구조는 1000 nm 초과이다. 한 실시형태에서, 나노구조는 200 내지 1000 nm이다. 한 실시형태에서, 나노구조의 가장 큰 치수는 200 nm 미만이지만, 이중층의 나노구조 폭을 유지한다. 한 실시형태에서, 나노구조의 크기는 일부 치수에서 200 nm를 초과하지만, 이중층의 나노구조 폭을 유지한다. 한 실시형태에서, 나노구조의 크기는 일부 차원에서 1000 nm를 초과하지만, 이중층의 나노구조 폭을 유지한다.
본원에 기재된 바와 같은, 코팅 또는 이중층을 갖는 리포좀 또는 나노입자는 항원 분자 및/또는 표적 분자일 수 있는 추가의 제시 분자를 그 위에 제시할 수 있다. 제시 분자는 표적화 능력 및/또는 이미징 또는 기타 기능들을 제공할 수도 있다.
his-태그된 폴리펩타이드 및 CoPoP 조성물을 포함하는 리포좀 또는 다른 나노구조들은 his-태그된 폴리펩타이드의 리포좀에 대한 결합과 관련하여 높은 혈청 안정성을 나타낸다. 한 실시형태에서, 실온에서 혈청 (예를 들어, 희석된 혈청)과 함께 항온배양하는 경우, his-태그된 펩타이드의 60% 이상이 24시간의 항온배양 후에 CoPoP 함유 이중층에 결합된 채로 있다. 한 실시형태에서, his-태그된 펩타이드의 85% 이상은 24시간 동안 혈청 (예를 들어, 50% 혈청 또는 그 이상)과 함께 항온배양 후에 CoPoP 층에 결합된 채로 있다. 따라서, 이러한 구조들은 혈청 또는 농축되거나 희석된 혈청 조건 하에서 안정할 수 있다.
본 구조에서, 이중층의 코발트-포르피린은 포르피린에 접합된 코발트(Co) 양이온을 갖는 포르피린이다. 포르피린은 인지질에 접합될 수 있다 (본원에서는 코발트-포르피린-인지질 또는 코발트-포르피린-인지질 접합체라고 함). 리포좀의 이중층 또는 다른 구조의 이중층의 적어도 일부를 구성하는 코발트-포르피린 또는 코발트-포르피린 접합체의 포르피린 부분은 포르피린, 포르피린 유도체, 포르피린 유사체 또는 이들의 조합을 포함한다. 예시적인 포르피린으로는 헤마토포르피린, 프로토포르피린 및 테트라페닐포르피린을 포함한다. 예시적인 포르피린 유도체로는 피로페오포비드, 박테리오클로로필, 클로로필 A, 벤조포르피린 유도체, 테트라하이드록시페닐 클로린, 퍼푸린, 벤조클로린, 나프토클로린, 베르딘, 로딘, 케토 클로린, 아자클로린, 박테리오클로린, 톨릴포르피린 및 벤조박테리오클로린을 포함한다. 예시적인 포르피린 유사체로는 확장된 포르피린 계열 구성원 (예: 텍사피린, 사피린 및 헥사피린) 및 포르피린 이성질체 (예: 포르피센, 역 포르피린, 프탈로시아닌 및 나프탈로시아닌)를 포함한다. 예를 들어, 코발트-포르피린은 비타민 B12 (코발라민) 또는 유도체일 수 있다.
한 실시형태에서, CoPoP는 코발트-피로페오포비드-인지질이다. 피로페오포비드-인지질의 구조를 하기에 나타내었다:
Figure pct00001
한 실시형태에서, 층 (단일층 또는 이중층)은 his-태그된 제시 분자들이 매립된 CoPoP만을 갖는다. 이 실시형태에서, 층 내의 유일한 인지질은 CoPoP이다 (즉, CoPoP가 100 mol%임). 한 실시형태에서, 층은 CoPoP 및 포르피린 접합된 인지질 (PoP) 만을 가지며, 여기서 상기 층에는 히스티딘이 매립되어 있으며, 히스티딘은 그에 부착된 펩타이드 또는 다른 제시 분자들 (예를 들어, RBD 서열)을 갖는다. 특정 실시형태에서, 다른 인지질들은 존재하지 않지만, 층은 선택적으로 스테롤 및/또는 PEG-지질을 함유할 수 있다.
한 실시형태에서, CoPoP 이외에도, 이중층은 포르피린에 접합되지 않고 이에 따라 Co와 배위결합되지 않은 인지질도 포함한다. 이러한 인지질은 본원에서 "추가의 인지질"로 지칭할 수 있다. 이중층은 하나 이상의 스테롤 및 PEG 또는 PEG-지질을 포함할 수도 있다. 한 실시형태에서, 이중층은 CoPoP, 포르피린에 접합되지 않은 인지질, 및 선택적으로 하나 이상의 스테롤 및/또는 PEG로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지며, 이 경우, 상기 PEG는 지질에 접합될 수 있다. 한 실시형태에서, 이중층 중 유일한 금속-PoP는 CoPoP이고, 이때 상기 층에는 his-태그된 제시 분자가 매립되어 있다. 한 실시형태에서, 이중층의 유일한 금속은 Co이다.
한 실시형태에서, 리포좀의 이중층은 CoPoP 및 PoP를 포함한다. CoPoP 및 PoP 이외에도, 이중층은 추가의 인지질을 가질 수 있다. 이중층은 하나 이상의 스테롤 및/또는 PEG를 추가로 포함할 수 있다. PEG는 지질에 접합될 수 있다. 한 실시형태에서, 이중층은 CoPoP, PoP, 추가의 인지질, 및 선택적으로 하나 이상의 스테롤 및/또는 PEG로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지며, 이 경우, 상기 PEG는 지질에 접합될 수 있다. 한 실시형태에서, 이중층 내의 유일한 금속-PoP는 CoPoP이다. 한 실시형태에서, 이중층의 유일한 금속은 Co이다.
특정 실시형태에서, 포르피린은 1 내지 20개의 탄소 (이 범위 사이의 모든 정수개의 탄소 포함)의 탄소 사슬 링커에 의해 인지질 상의 글리세롤 기에 접합된다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 포르피린 접합체 이외에도, 리포좀의 이중층은 다른 인지질들도 포함한다. 이러한 인지질의 지방산 사슬은 적절한 수의 탄소 원자를 포함하여 이중층을 형성할 수 있다. 예를 들어, 지방산 사슬은 12, 14, 16, 18 또는 20개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 실시형태에서, 이중층은 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린 및/또는 포스파티딜이노시톨을 포함한다.
본 발명의 이중층은 다양한 스테롤을 포함할 수도 있다. 스테롤은 동물성 스테롤 또는 식물성 스테롤일 수 있다. 스테롤의 예로는 콜레스테롤, 시토스테롤, 스티그마스테롤 및 콜레스테롤을 포함한다. 실시형태에서, 콜레스테롤은 0 mol% 내지 50 mol% 또는 0.1 내지 50 mol%일 수 있다. 다른 실시형태에서, 콜레스테롤은 1 내지 50 mol%, 5 내지 45 mol%, 또는 10 내지 30 mol%로 존재할 수 있다.
특정 실시형태에서, 이중층은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)-지질을 추가로 포함한다. PEG-지질은 DSPE-PEG-2000, DSPE-PEG-5000 또는 다른 크기의 DSPE-PEG와 같은 DSPE-PEG일 수 있다. PEG-지질은 0 내지 20 mol% (이 범위 사이의 모든 백분율 양을 소수점 이하 10자리까지 포함)의 양으로 존재한다. PEG 모이어티의 평균 분자량은 500 내지 5000 달톤, 및 이 범위 사이의 모든 정수값과 범위일 수 있다.
한 양태에서, 본 발명은 본 발명의 리포좀 또는 다른 구조 또는 서로 다른 리포좀 또는 다른 구조들의 혼합물을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 조성물은 인간을 비롯한 대상체에게 투여하기 위한 멸균된 적절한 담체, 예를 들어 생리학적 완충제, 예컨대 수크로스, 덱스트로스, 식염수, pH 완충 (예컨대, pH 5 내지 9, pH 7 내지 8, pH 7.2 내지 7.6, 예컨대 7.4)) 성분, 예컨대 시트레이트 또는 포스페이트를 포함할 수도 있다. 한 실시형태에서, 본 조성물은 적어도 0.1% (w/v)의 CoPoP 리포좀 또는 his-태그된-CoPoP 리포좀 또는 다른 구조를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 본 조성물은 0.1 내지 100 mol%의 CoPoP 리포좀 또는 his-태그된 CoPoP 리포좀 또는 다른 구조, 예컨대 이중층 코팅된 나노입자를 포함한다. 한 실시형태에서, 본 조성물은 his-태그된 제시 분자가 결합된 0.1 내지 99 mol%의 CoPoP 리포좀을 포함한다.
한 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 말레이미드 또는 숙신이미딜 에스테르 반응성 기가 없다. 한 실시형태에서, 막에 부착될 태그된 분자는 비천연 아미노산을 함유하지 않는다.
또한, 본 발명은 본원에 기술된 이중층을 함유하는 구조물을 사용하는 방법도 제공한다. 한 실시형태에서, 본 발명은 숙주에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 상기 면역 반응은 항체를 생성할 수 있다. 상기 방법은 히스티딘 태그된 항원이 접합된 CoPoP 이중층을 함유하는 구조를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 조성물은 피하, 피내, 근육내, 종양내 또는 임의의 기타 경로를 포함하는 임의의 표준 면역화 경로에 의해 투여될 수 있다. 본 조성물은 단회 투여로 투여될 수 있거나, 또는 추가 접종을 포함하는 다회 투여로 투여될 수도 있다. 항체 역가를 측정하여 면역 반응을 모니터링할 수 있다.
실시예에 제공된 데이터는, 2개의 개별 RBD 단백질, 즉 곤충 세포에서 생성된 것과 포유동물 세포에서 생성된 것이 모두 CoPoP 리포좀에 의해 보조될 수 있으며, 면역화에 있어서는 안정적인 입자 형성을 유도하지 않는 다른 백신 보조제들에 비해 10배 더 큰 기능적 IgG 반응을 나타냄을 보여주고 있다. RBD가 CoPoP 리포좀과 함께 매우 효과적으로 작동한다는 것은 놀라운 일이었다. 예를 들어, 말라리아 항원 단편 Pfs230과 같은 다른 재조합 단백질 단편들은 명반과 같은 통상적인 백신 보조제에 비해 더 높은 항체 수준을 유도하지 않는 것으로 보고되었다 (Huang et al., npj Vaccines volume 5, 23, 2020). 따라서, 본원에서 볼 수 있는 보조제의 효능은 놀랍고도 예측할 수 없었던 것이다.
CoPoP를 포함하는 이중층은 다음과 같이 제조될 수 있다. 유리염기 PoP는 클로로포름 중 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 및 4-디메틸아미노피리딘을 사용하여 피로페오포비드-a와 같은 모노카르복실산 포르피린을 2-팔미토일-2-히드록시-sn-글리세로-3-포스포콜린 (lyso-C16-PC) (Avanti #855675P)와 함께 1:1:2:2의 lyso-C16-PC:피로:EDC:DMAP 몰비로 실온에서 밤새 교반함으로써 에스테르화하여 제조할 수 있다. 그런 다음, PoP를 실리카겔 크로마토그래피로 정제한다. CoPoP는 포르피린-인지질 접합체를 암실에서 용매 (예: 메탄올) 중 몰 과량 (예: 10배 몰 과량)의 코발트 염 (예: 코발트(II) 아세테이트 4수화물)과 접촉시켜 생성할 수 있다.
한 양태에서, 본 발명은 CoPoP 및 his-태그된 SARS-CoV-2 폴리펩타이드 서열 (예: 스파이크 단백질의 RBD 부분)을 포함하는 리포좀을 포함하는 백신 조성물을 제공한다. 백신 조성물은 하나 이상의 보조제를 포함할 수 있다. 백신 조성물은 희석제, 보조제, 부형제 또는 담체와 같은 첨가제를 포함할 수 있다. 이러한 첨가제들은, 원하는 투여 경로와 제제에 따라, 물, 오일, 염수, 글루코스 등과 같은 액체, 및 보조제, 안정화제, 증점제 또는 윤활제, 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제, 겔화제 또는 점도 향상 첨가제, 계면활성제 및 가용화제 (예: TWEEN® 20, TWEEN® 80: 폴리소르베이트 20 또는 80이라고도 함), 항산화제 (예: 아스코르브산, 메타중아황산나트륨), 보존제 (예: 티메로살, 벤질 알코올), 팽창 물질(예: 락토스, 만니톨), 향미제, 착색제 등일 수 있다. 문헌 [Remington:The Science and Practice of Pharmacy (2012) 22nd Edition]을 참조한다. 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 예를 들면 올리브 오일 및 옥수수 오일, 젤라틴 및 주사가능한 유기 에스테르, 예를 들면 에틸 올레에이트와 같은 비수성 용매 또는 비히클이 사용될 수 있다. 제제는 동결건조시켜 사용 직전에 재용해시키거나 재현탁시킬 수 있다. 제제는, 예를 들면, 박테리아 보유 필터를 통한 여과에 의해, 멸균제를 해당 조성물에 혼입시킴으로써, 해당 조성물을 방사선 조사시킴으로써, 또는 해당 조성물을 가열함으로써, 멸균될 수 있다.
조성물은 비경구, 피하, 복강내, 근육내, 정맥내, 점막, 국소, 피내 및 경구 투여를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 적절한 투여 경로를 사용하여 대상체에게 주입할 수 있다.
면역화는 단일 용량으로 수행될 수 있거나, 또는 간격을 두어 다회 용량으로도 수행할 수 있다. 예를 들어, 초기 투여 및 후속의 추가 용량을 사용할 수 있다. 조성물은 단독으로 투여될 수 있거나, 또는 다른 예방제 (예를 들어, 다른 면역원성 조성물) 또는 치료 조성물 (예를 들어, 항바이러스제)과 공동 투여되거나 순차적으로 투여될 수도 있다.
한 양태에서, 본 발명은 대상체에서 SARS-CoV-2 감염, 또는 (예를 들어, 입원 또는 바이러스 표적 투약이 필요한) 중증 SARS-CoV-2 감염 (본원에서 COVID-19 감염으로도 지칭함)을 예방하는 방법으로서, 유효량의 본원에 기재된 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 것인, 방법을 제공한다. 백신 조성물은 1회 또는 다수회 투여될 수 있다. 예를 들어, 백신 조성물의 다회 용량은 수일, 수주 또는 수개월과 같은 적절한 기간 사이에 투여될 수 있고/있거나, 연간 또는 임의의 다른 주기적 방식으로 투여될 수 있다. 또한, 본 발명은 개체군 내의 복수의 대상체에게 유효량의 본원에 기술된 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체군에서 SARS-CoV-2 감염의 전체 발병률을 감소시키는 방법을 제공하는데, 이로써 면역원성 조성물의 투여는 개체군 내의 대상체의 적어도 일부에서 SARS-CoV-2 감염의 발생을 예방하여 상기 개체군 내의 SARS-CoV-2 감염의 전반적인 발병률을 감소시킨다. 상기 백신 조성물의 투여는 감염을 예방할 수 있고, 투약 또는 입원이 필요한 중증 감염을 예방할 수 있고/있거나, 감염으로 인한 사망을 방지할 수 있다. 주어진 개체군에서 충분한 수의 대상체에게 상기 백신을 투여하면 '집단' 면역이 생기기 때문에, 상기 백신 조성물을 투여받는 사람들을 넘어서 보호를 확장시킬 수 있다.
한 실시형태에서, 본 발명은 본원에 기술된 리포좀 조성물의 1회 이상의 용량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 상기 리포좀이 CoPoP 및 his-태그된 SARS-CoV-2 폴리펩타이드 서열 (예컨대, 스파이크 단백질의 RBD 부분 (예: 서열번호 1 또는 이의 변이체))을 포함하는 것인, 방법을 제공한다. 백신 조성물은 리포좀에 포함되거나 해당 조성물에 개별적으로 존재하는 하나 이상의 보조제를 포함할 수 있다.
마우스 면역화에 필요한 RBD의 용량은 100 ng 내지 5 ㎍ 범위 (모든 0.1 ng 값 및 그 사이의 범위들을 포함)이다. RBD의 예상된 인체 투여량은 5 내지 50 ㎍일 수 있다. 실시형태에서, 용량은 0.1 ㎍ 내지 1.0 mg일 수 있다. 예를 들어, 용량은 1 ㎍ 내지 500 mg일 수 있다. 실시형태에서, 용량은 1 내지 100 ㎍ 또는 10 내지 50 ㎍ 또는 5 내지 10 ㎍ 또는 1 내지 10 ㎍ 또는 약 5 ㎍일 수 있다.
실시형태에서, 본 발명은 리포좀으로서,
a) 다음을 포함하거나 필수적으로 다음으로 이루어지는 이중층:
i) 인지질, 및
ii) 코발트가 배위결합하여 코발트-포르피린을 형성하는 포르피린; 및
b) 폴리히스티딘-태그된 SARS-CoV-2 분자
를 포함하고, 상기 폴리히스티딘 태그의 적어도 일부가 상기 이중층의 소수성 부분에 존재하며, 상기 폴리히스티딘 태그의 하나 이상의 히스티딘이 코발트-포르피린의 코발트에 배위결합되고, 상기 폴리히스티딘-태그된 SARS-CoV-2 분자의 적어도 일부가 리포좀의 외부로 노출되며, 상기 폴리히스티딘-태그된 SARS-CoV-2가 SARS-CoV-2의 단백질 또는 폴리펩타이드의 면역원성 서열을 포함하고, 상기 리포좀이 수성 구획을 둘러싸는 것인, 리포좀을 제공한다.
실시형태에서, SARS-CoV-2 폴리펩타이드의 면역원성 서열, 예컨대 RBD 서열 (예: 서열번호 1) 또는 이의 변이체는 이중층에 존재하는 유일한 아미노산 서열이다. 일부 실시형태에서, 다른 S 단백질 서열, 또는 SARS-CoV-2 바이러스의 다른 단백질의 서열 및/또는 다른 면역원성 단백질 서열도 존재할 수 있다.
대상체에게 본 발명의 백신 조성물을 투여하면, 대상체에서 면역 반응을 발생시킬 수 있다. 면역 반응은 SARS-CoV-2 바이러스, 또는 SARS-CoV-2 바이러스의 단백질 표적 (예: 스파이크 단백질)에 대한 체액성 반응 (예: 항체의 생성) 또는 세포성 반응 (예: T 세포, 대식세포, 호중구 및/또는 자연 살해 세포의 활성화)일 수 있다. 실시형태에서, 본 발명의 백신 조성물의 투여는 SARS-CoV-2 감염의 공격에 대해 보호하거나 또는 SARS-CoV-2 감염의 중증도를 감소시킬 수 있는 보호 면역 반응을 유도할 수 있다. 보호 면역 반응은 SARS-CoV-2 중화 항체의 높은 역가, CD4+ 또는 CD8+ 세포의 증가, IFNγ, IL-2 및 TNFα 증가 중 하나 이상으로 나타날 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 SARS-CoV-2 바이러스에 감염될 위험이 있는 대상체 (예컨대, 일선 의료 종사자), 면역 시스템이 손상된 대상체 또는 일반 대중에게 투여될 수 있다. 본 백신 조성물은 모든 연령과 성별의 인간에게 투여될 수 있다. 본 백신 조성물은 SARS-CoV-2 바이러스가 감염시킬 수 있는 인간 이외의 종에서도 사용될 수 있다.
다음 진술은 본 발명의 다양한 예시 및 실시형태를 기술한다:
진술 1. 리포좀으로서,
a) 다음을 포함하는 이중층:
i) 인지질, 및
ii) 코발트가 배위결합하여 코발트-포르피린을 형성하는 포르피린; 및
b) 폴리히스티딘-태그된 제시 분자
를 포함하고, 상기 폴리히스티딘 태그의 적어도 일부가 상기 이중층의 소수성 부분에 존재하고, 상기 폴리히스티딘 태그의 하나 이상의 히스티딘이 코발트-포르피린의 코발트에 배위결합되며,
상기 폴리히스티딘-태그된 제시 분자의 적어도 일부가 리포좀의 외부로 노출되고, 상기 폴리히스티딘-태그된 제시 분자가 SARS-CoV-2의 단백질 또는 폴리펩타이드의 면역원성 서열을 포함하며, 리포좀이 수성 구획을 둘러싸는, 리포좀.
진술 2. 진술 1에 있어서, 상기 단백질이 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질의 RBD 부분인 것인, 리포좀.
진술 3. 진술 1에 있어서, 상기 코발트-포르피린이 인지질에 접합되어 코발트-포르피린-인지질 접합체를 형성하는 것인, 리포좀.
진술 4. 진술 3에 있어서, 상기 코발트-포르피린-인지질 접합체가 이중층의 1 내지 25 mol%를 구성하는 것인, 리포좀.
진술 5. 진술 4에 있어서, 상기 코발트-포르피린-인지질 접합체가 이중층의 5 내지 10 mol%를 구성하는 것인, 리포좀.
진술 6. 진술 1에 있어서, 상기 이중층이 콜레스테롤 및/또는 포스파티딜세린을 추가로 포함하는 것인, 리포좀.
진술 7. 진술 1에 있어서, 상기 폴리히스티딘 태그가 6개 내지 10개의 히스티딘 잔기를 포함하는 것인, 리포좀.
진술 8. 진술 1에 있어서, 상기 리포좀의 크기가 50 nm 내지 200 nm인 것인, 리포좀.
진술 9. 진술 1에 있어서, 이중층에 하나 이상의 보조제를 추가로 포함하는, 리포좀.
진술 10. 진술 9에 있어서, 상기 보조제 중 적어도 하나가 약독화된 지질 A 유도체 또는 인산화된 헥사아실 이당류인 것인, 리포좀.
진술 11. 진술 10에 있어서, 제2 보조제가 QS21인 것인, 리포좀.
진술 12. 나노구조로서,
a) 코어; 및
b) 하기를 포함하는 상기 코어 위의 이중층:
i) 인지질 단량체, 및
ii) 코발트가 배위결합하여 코발트-포르피린을 형성하는 포르피린; 및
c) 미생물의 에피토프를 포함하는 폴리히스티딘-태그된 제시 분자
를 포함하고,
상기 폴리히스티딘 태그의 적어도 일부가 상기 이중층의 소수성 부분에 존재하고, 상기 폴리히스티딘 태그의 하나 이상의 히스티딘이 코발트-포르피린의 코발트에 배위결합되며, 상기 폴리히스티딘-태그된 제시 분자의 적어도 일부가 상기 나노구조의 외부로 노출되는 것인, 나노구조.
진술 13. 진술 12에 있어서, 상기 코어가 금 나노입자인 것인, 나노구조.
진술 14. 진술 12에 있어서, 상기 미생물이 SARS-CoV-2인 것인, 나노구조.
진술 15. 진술 14에 있어서, 상기 제시 분자가 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질의 일부인 것인, 나노구조.
진술 16. 진술 15에 있어서, 상기 일부가 스파이크 단백질의 RBD 영역인 것인, 나노구조.
진술 17. 전술한 진술들 중 임의의 진술의 리포좀을 포함하는 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 숙주 개체에서 면역 반응을 발생시키는 방법.
진술 18. 진술 17에 있어서, 상기 개체가 인간인 것인, 방법.
진술 19. 리포좀을 포함하는 백신 조성물로서, 상기 리포좀의 적어도 일부가 CoPoP, 및 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질의 일부를 포함하고, 상기 스파이크 단백질의 일부가 폴리-히스티딘에 공유 결합되며, 상기 스파이크 단백질의 폴리-히스티딘 부분이 CoPoP 부분의 Co에 배위결합되어, 폴리-his 태그의 적어도 일부가 리포좀의 이중층 내에 존재하게 되고 스파이크 단백질의 적어도 일부가 리포좀의 외부로 노출되는 것인, 백신 조성물.
진술 20. 진술 19에 있어서, 상기 스파이크 단백질의 일부가 RBD인 것인, 백신 조성물.
하기 실시예를 제공하여 본 발명을 설명한다. 본 실시예는 어떤 식으로든 본 발명을 한정하지 않는다.
실시예
본 실시예는 본 발명의 실시형태를 예시한다.
결과 및 논의
온전한, 혈청 안정된 RBD 입자들은 CoPoP 리포좀과의 혼합을 통해 수득한다. C-말단 His 태그를 함유하는 재조합 RBD 단백질은 포유동물 (HEK293; 스파이크 잔기 319-541) 및 곤충 (sf9; 스파이크 잔기 330-530) 발현 시스템으로부터 얻었다. CoPoP를 함유하는 리포좀 뿐만 아니라, 보조제인 모노포스포릴 지질 A (MPLA) 및/또는 QS21을 RBD와 함께 실온에서 3시간 동안 4:1 질량비의 CoPoP:단백질로 혼합한 후, 리포좀에 대한 RBD 결합을 평가하였다. PoP 분자 내에 코발트가 없으나 그 외에는 동일하였던 대조군 리포좀도 시험하였다.
도 1A는 Ni-NTA 비드를 이용한 경쟁 분석을 기초로 한 RBD의 입자 형성을 나타낸 것이다. 유리 단백질은 비드 ("B")에 의해 포획되는 한편, 리포좀 결합된 RBD는 상청액 ("S")에 남아 있지 않았다. HEK293 및 sf9 생성된 RBD는 거의 동일한 결합 패턴을 나타내어 CoPoP를 함유하는 리포좀에 대한 완전한 결합을 보여주었으나, 코발트가 없지만 PoP 모이어티를 함유하고 있던 동일한 리포좀에 대해서는 사실상 결합하지 않았다. 이중층에서 QS21의 존재는 결합에 영향을 미치지 않았다. PoP가 아닌 CoPoP 리포좀에 대한 RBD의 결합도 독립적인 고속 원심분리 분석을 사용하여 나타내었다 (도 1B). 형광 공명 에너지 전달 분석은, 리포좀에 결합시 CoPoP 발색단으로의 에너지 전이로 인해 소광되는, 형광 표지된 RBD를 사용하여 개발되었다. 도 1C는 항온배양 15분 이내에 대부분의 항원이 입자를 형성하는 RBD 입자화를 나타낸 것이다. 이 결과는 Ni-NTA 비드 경쟁 분석을 사용하여 확인하였다 (도 1D).
다음으로, 입자 형태의 RBD의 입체형태 구조의 온전성을 평가하였다. 슬롯 블롯은 RBD의 결합 표적인 ACE2를 사용하여 개발되었는데, 상기 ACE2를 니트로셀룰로오스에 흡착된 가용성 또는 입자 형태의 RBD와 함께 항온배양하였다. 그런 다음, 2차 항체를 사용하여 ACE2를 검출하였다. 예상대로, ACE2는 분석에 포함되어 있던 Pfs25 대조군 항원을 인식하지 못했다. 예상외로, ACE2는 가용성 형태보다는 미립자 형태의 RBD를 보다 강하게 인식하여, 분석에 사용될 필요가 있는 입자화된 RBD의 양이 감소되었다 (도 1E). 이러한 거동의 이유는 명확하지 않지만, 가용성 RBD는 ACE2가 접근하기 어렵게 되는 방식으로 막에 흡착할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 상기 결과는 RBD가 입자 형태의 표적 수용체에 결합하는 능력을 유지함을 보여주고 있다. 도 8A는 다양한 용량에서의 가용성 또는 입자 형태의 RBD의 슬롯 블롯을 비교하고 있다. 도 8B는 고정된 RBD 양에서 ACE2 반응성을 나타낸 것이다. 입자화된 RBD는 SARS-CoV-2 RBD와 상호작용하는 것으로 알려진 CR3022 중화 단일클론 항체 (도 9)에 의해서도 인식될 수 있었다.
인간 ACE2 (HEK293/hACE2)를 과발현하는 HEK293 세포를 가용성 및 입자 형태의 형광 표지된 RBD와 함께 항온배양한 경우, 전체 세포 용해물 분석으로 평가시, 강력한 흡수가 관찰되었다 (도 1F). hACE2 발현이 부족한 동일한 세포주는 모든 경우에서 최소한의 RBD 흡수를 나타냈다. 유세포 분석법을 사용하여도 유사한 경향이 관찰되었다 (도 10). RBD는 hACE2 발현 세포에 의해 우선적으로 흡수되었을 뿐만 아니라, CoPoP 리포좀 자체도 RBD가 제공되었을 경우에 강한 흡수력을 나타내었다 (도 1G). 이와는 대조적으로, Pfs25가 제공된 리포좀은 최소한의 흡수를 나타내었다. 전반적으로, 이러한 생화학적 데이터는 His 태그된 RBD가 CoPoP 리포좀과 함께 항온배양되는 경우에 구조적 온전성을 유지하면서 신속하게 입자를 형성함을 보여주는 것이다.
다음으로, 입자들 자체의 성질을 추가로 평가하였다. RBD에 결합한 후 CoPoP/MPLA 리포좀의 크기는 미미하게 증가하였던 반면, CoPoP/MPLA/QS21 리포좀은 RBD 존재 혹은 부재에 관계없이 동일한 크기를 유지하였다 (도 2A, 도 11). 어떠한 리포좀 유형도 항원 결합시 응집을 나타내지 않았다. 저온 전자현미경을 통해, 입자화된 RBD 입자들은 사실상 구형이었으며, QS21 리포좀은 크기가 약간 더 작았는데 (도 2B), 이는 동적 광산란 결과와 일치하는 것이었다. 도 2C에 도시된 바와 같이, 입자 형성 후, RBD는 형광 소광 분석에 기초하였을 때 혈청 안정된 항원 입자를 형성하였는데, 이는 해당 항원이 20% 인간 혈청과 37℃로 1주간 항온배양 후에도 온전한 입자 형태를 여전히 유지하고 있었음을 시사하는 것이다. 항원 제시 세포 (APC)에 의한 항원 입자들의 흡수를 조사해 보기 위해, 이계 교배 마우스로부터 얻은 RAW264.7 쥐과 대식세포와 골수 유래의 수지상 세포 (BMDC)를 사용하여 시험관 내 연구를 수행하였다. APC를 형광 표지된 RBD와 함께 항온배양하고 흡수를 평가하였다 (도 2D). RBD를 CoPoP 리포좀과 혼합하였으나 동일한 PoP 리포좀이 아닌 경우 (입자 형성을 유도하지 않음)에는, 대식세포와 BMDC 모두에 의한 더 높은 RBD 흡수가 관찰되었다. 그러나, 이러한 세포들을 사이토칼라신 B (식세포작용 억제제) 또는 클로르프로마진 (세포내 이입 억제제)으로 처리하였을 경우에는, 입자화된 RBD 흡수가 억제되었다. 이러한 데이터는 APC에 의한 개선된 흡수와 관련된 CoPoP 리포좀의 효능에 대한 주요 기전과 일치한다. 생체 내 흡수 향상 여부를 조사하기 위해, 다양한 제제들과 혼합한 형광 표지된 RBD를 사용하여 마우스를 근육내로 면역화 접종하고, 2일 후에 배액 림프절을 수집하고, 마커 B220 (B 세포용), F4/80 (대식세포용), CD11c (수지상 세포용) 및 I-A/I-E (MHCII-발현 세포용)를 사용하여 유세포 분석을 통해 상주 APC들을 RBD 흡수에 대해 시험하였다. 도 2E 및 도 12에 도시된 바와 같이, RBD가 CoPoP 리포좀과 혼합되어 미립자 형태로 제시는 경우에 모든 주요 유형의 APC에 의해 상당히 흡수되었다. 한편, 명반 또는 비입자화 AS01-유사 리포좀으로 보강되었을 경우에는, APC에 의한 최소 항원 흡수가 관찰되었다. AS01-유사 리포좀은 실험실에서 제조하였으며, 임상 리포좀 보조제의 제제를 모방한 합성 MPLA 및 QS21을 포함하였다. 이러한 데이터는 RBD가 CoPoP와 혼합한 후, 혈청에서 안정한 100 nm 입자로 변환되어 APC에 의해 시험관 내 및 생체 내에서 우선적으로 흡수되었음을 보여주는 것이다.
RBD는 입자 형태로 마우스와 토끼에서 중화 항체 반응을 강하게 유도한다. 마우스를 100 ng의 RBD (곤충 또는 포유동물 발현 시스템으로부터 제조됨)로 근육내 면역화 접종시켰는데, 면역화 전에 상기 RBD를 상업적으로 입수한 백신 보조제인 명반, Montanide ISA720 또는 Addavax, 또는 대안으로, 실험실에서 만든 CoPoP/MPLA, CoPoP/MPLA/QS21, PoP/MPLA 또는 AS01-유사 리포좀 보조제와 혼합하였다. 항원과 보조제를 혼합한 후에는 추가의 정제를 수행하지 않았다. RBD 특이적 IgG의 유의한 증가는 14일째 추가 접종 전에 CoPoP 보조제에서 관찰되었다 (도 13). 도 3A는 28일 종료 시점의 항-RBD 역가를 나타낸 것으로, CoPoP와의 혼합이, PoP/MPLA 리포좀 (코발트가 없지만 그 이외는 CoPoP/MPLA와 동일함) 뿐만 아니라 다른 보조제들과 비교하였을 때, 항-RBD 역가 수준을 100-1000배 증가시켰음을 입증하고 있다. 포유동물과 곤충이 생산한 RBD에 의해 유도된 반응들도 유사하였다. 항원을 포함하지 않은 보조제 자체는 어떠한 RBD 항체들도 유도하지 않았다. CoPoP 샘플에 대한 항체 반응의 크기는, RBD를 입자 형태로 전달하는 이점에 대한 증거를 제공하는데, 이는 아마도 APC에 의해 흡수가 향상되었기 때문일 것이다 (도 2E).
항체 기능은 처음에는 가상바이러스 (PsV) 분석으로 평가하였다. 루시퍼라제를 발현하는 쥐과 백혈병 바이러스 계열 PsV 및 SARS-CoV-2(SARS2)의 S 단백질로 가성형태화된 (pseudotyped) gag/pol 단백질은 HEK293T 세포에서 생성되었고, hACE2를 발현하는 세포에 선택적으로 진입하는 것으로 밝혀졌다 (도 14). 도 3B에 나타낸 바와 같이, 다른 백신 보조제 그룹에 비해, RBD/CoPoP 그룹의 혈청은 바이러스 진입을 강력하게 억제하였다. CoPoP/MPLA 리포좀과 혼합한, 포유동물이 생산한 RBD로 면역화시킨 마우스의 NT50 (중화 항체 역가의 50%)은 16,430이었던 반면, CoPoP/MPLA/QS21을 이용한 경우의 NT50은 30,827이었다. 이러한 NT50 값은 대부분의 다른 보조제들, 예컨대 ISA720 (NT50: 339); Addavax (NT50: 78); PoP/MPLA (NT50: 56.6); 명반 (NT50: 219); AS01 (NT50: 191)보다 훨씬 더 큰 자릿수였다. 이러한 PsV 중화 역가는 곤충이 생산한 RBD와 유사하였다. 도 15A와 도 15B는 포유동물과 곤충이 생산한 RBD에 대한 완전한 PsV 진입 억제 곡선을 나타낸 것이다.
SARS-CoV-2 대용 바이러스 중화 시험 (sVNT)을 사용하여 기능적 항체의 성질을 추가로 평가하였다. sVNT 분석은 hACE2와 RBD의 상호작용을 차단하는 항체를 검출하는시험관내 무세포 방법으로서, 임상 검체에서 중화 항체 역가를 예측하는데 사용되어 왔다. 도 3C에 나타낸 바와 같이, 100배 희석도에서, CoPoP로 면역화시킨 마우스의 면역후 혈청은 RBD와 ACE2 간의 상호작용의 99%를 억제하였다. 이와는 대조적으로, 다른 모든 백신 보조제들은 임의의 RBD 면역원을 전혀 투여받지 않은 마우스의 혈청과 동일한 수준이었던 약 30%의 기준선 수준의 억제를 나타내었다. 다시, sVNT 결과는 포유동물과 곤충이 생산한 RBD 간에는 유사하였다.
다음으로, SARS-CoV-2 균주인 USA-WA1/2020을 사용하여 생바이러스 중화 시험 (VNT)을 수행하였다. CoPoP 리포좀과 혼합된, 포유동물 또는 곤충이 생산한 RBD로 면역화된 마우스의 혈청은 1:1,280 희석된 혈청 (평가된 최고의 희석도)에서 병원성 세포 감염을 예방하였다 (도 3D). 회복기 혈청 요법은 1:160 VNT 역가의 혈청 사용을 권장하기 때문에, 마우스에서 나노그램 투약이 강력한 작용성 항체를 유도하였다. 명반과 혼합되는 경우, RBD는 바이러스 중화 능력이 제한된 항체를 유도하였다. 이를 종합해 보면, 다양한 항체 시험을 통해, RBD는 입자 형성을 유도하는 백신 보조제와 혼합할 때 큰 이점이 있음을 알 수 있다.
다음으로, 다른 동물 종에서 RBD 면역화를 평가하기 위해, 0일 및 21일째에 CoPoP 리포좀 또는 명반과 혼합된 인간에 적절한 RBD 20 ㎍ 용량을 근육내로 토끼에게 면역화 접종하였다. 면역후 혈청은 21일째에 항-RBD IgG 존재를 보였고, 그후 종료일인 42일째에는 항체 수준이 명반에 비해 CoPoP에서 약 10배 더 높아지는 면역증진 효과를 나타내었다 (도 4A). 이는 마우스에서 관찰된 명반에 비해서는 2-3배 정도 향상이 덜한 것이다. 도 4B 및 도 17에 나타낸 바와 같이, CoPoP 리포좀으로 면역화한 토끼에서 높은 가상바이러스 중화 활성이 나타났다. 흥미로운 점은, 리포좀에 QS21을 포함시켰더니 추가접종 후 중화 역가가 크게 향상되었다는 것이다. 다시 말하지만, 이 결과는 QS21 이점이 별로 크지 않게 나타난 마우스 데이터와는 다르다. QS21을 포함시킨 것이 ACE2와 RBD 간의 상호작용 차단을 향상시켰던 sVNT 분석에서 유사한 결과들이 관찰되었다 (도 4C). SARS-CoV-2 생바이러스 중화를 VNT로 평가했을 때, CoPoP/MPLA/QS21 리포좀으로 면역화한 토끼의 면역 후 혈청은 시험한 최고 희석도 (1:1,200)에서 감염을 예방하였던 반면, CoPoP/MPLA 리포좀으로 면역화시킨 토끼 4마리 중 단 1마리만이 유사한 효능을 갖는 중화 항체를 나타냈다 (도 4D). 토끼에서 QS21의 향상에 대한 이유는 추가의 연구가 필요하지만, 토끼에 사용된 더 높은 항원 용량과 관련이 있을 수 있거나, 또는 더 가능성이 있는 것으로는, 종 간의 면역학적 차이와 관련이 있을 수 있다. 마우스 항체 데이터를 검사한 결과, 일반적으로 QS21 CoPoP 면역 후 혈청도 일반적으로 개선된 바이러스 억제 기능을 가졌으나, 그 개선은 미미했던 것으로 밝혀졌다.
세포성 및 체액성 반응. CoPoP/MPLA 리포좀, CoPoP/MPLA/QS21 리포좀, 명반 또는 PBS와 혼합된 100 ng의 RBD로 마우스 근육내 면역화 접종하고 2일 후에 면역세포 동원에 대하여 평가하였다. 유세포 분석법을 사용하여 배액 림프절에서 다양한 세포들을 식별하였다. 도 5A 및 도 18에 도시된 바와 같이, CoPoP/MPLA 리포좀과 CoPoP/MPLA/QS21 리포좀은 명반에 비해 향상된 대식세포 및 단핵구 동원을 유도하였다. 증가된 수준의 CD11b- DC는 모든 보조제 그룹에서 나타났다. Cd11b- DC 세포들은 세포성 적응 면역 반응에서 역할을 한다. CoPoP/MPLA/QS21로 처리된 마우스에서는 CD11blow DC의 증가된 수준이 관찰되었지만, CoPoP/MPLA 리포좀이나 명반에서는 그렇지 않았다. 따라서, CoPoP가, APC로의 항원 전달을 개선하는 것 이외에, 강력한 면역화를 유도하는 것으로 보이는 제2 요인은 APC의 동원을 강화하는 것이다.
면역화 후 배중심 (GC) 형성을 평가하였다. CoPoP 리포좀은 GC B 세포의 개체군 뿐만 아니라 T 여포 헬퍼 세포 (Tfh 세포)의 개체군도 강화시켰다. QS21은 보다 높은 수준의 GC 제제를 유도하였다 (도 5B 및 5C; 도 19). Tfh 세포는 B 세포가 중화 항체를 생성하도록 도와줌으로써 보호 면역에 중요한 역할을 한다. 이 결과로 토끼에서 관찰된 QS21 함유 리포좀의 향상된 면역성을 설명할 수 있다. 도 20A 및 20B는 CoPoP/MPLA 뿐만 아니라 CoPoP/MPLA/QS21 리포좀으로 면역화된 마우스가 IgG1 항체보다 더 높은 수준의 IgG2a 항체를 유도하였음을 보여주는데, 이는 상기 면역 반응이 Th1 반응 쪽으로 편향되었음을 시사하는 것이다.
0일 및 14일째에 RBD 면역화 후, 비장 세포를 분리하고 항원에 노출시킨 후에 인터페론 감마 (IFNγ) 분비의 유도에 대해 평가하였다. CoPoP로 면역화시킨 마우스의 비장 세포는 다른 보조제들에 비해서 더 높은 수준의 IFNγ를 분비하였다. 이는 CoPoP 보조제로 생성되었던 더 높은 항원 특이적 T 세포군을 반영하는 것이다. 다시 말하지만, QS21 첨가는 T 세포 반응을 향상시키는데 유익한 것으로 보였다. 여러가지 사이토카인들을 발현하는 다작용성 T 세포는 바이러스 감염에서 보호 면역성이 있는 것으로 밝혀졌다. IFNγ, IL-2 및 TNFα를 분비하는 항원 특이적 CD4+ T 세포는 감염의 공격으로부터 보호하는데 바람직하다. IFNγ 및 TNFα를 분비하는 항원 특이적 CD8+ 및 CD4+ T 세포는 기억 표현형을 나타내어 SARS-CoV에 대한 장기간의 보호로 이어질 수 있다. 다작용성 T 세포의 유도에 대한 문제를 다루기 위해, 면역화된 마우스로부터 비장 세포를 수집한 후, 시험관 내에서 RBD 자극을 수행하였다. 세포들을 유세포 분석법으로 평가하고, 먼저 생/사멸 세포를 게이팅한 후, 기억 CD4+ T 세포의 경우 TCRβ+CD4+CD44hiFoxp3-를 게이팅하고, 기억 CD8+ T 세포의 경우 TCRβ+CD8+CD44hi를 게이팅하였다 (도 21). 도 22A-B에 나타낸 바와 같이, CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포에서의 단일 사이토카인-생산 개체군이 IFNγ, IL-2 및 TNFα에 대해 관찰되었다. 이후, 세포들을 게이팅하여 3가지 사이토카인을 모두 평가하였는데, 이를 통해 RBD 및 CoPoP/MPLA/QS21로 면역화된 마우스의 비장 세포가 CD4+ T 세포 (도 5D) 뿐만 아니라 CD8+ T 세포 (도 22C)에서도 더 강력한 삼중 사이토카인 생성 개체군을 생성하였던 것으로 나타났다.
CoPoP를 사용한 RBD 면역화의 안전성. 다양한 보조제들과 혼합된 RBD의 국소 반응원성은, 단회의 피내 백신 주사 후 발바닥 부어오름 분석을 사용하여 마우스에서 평가하였다. CoPoP/MPLA 리포좀은 AS01-유사 리포좀, 명반, Addavax 및 ISA720을 포함하는 평가된 모든 보조제들 중에서 최소량의 국소 반응원성을 나타내었다 (도 6A). 본 작업의 모든 실험에 사용된 CoPoP 리포좀의 MPLA 및 QS21 함량은 AS01-유사 제제보다 60%가 적은데, 이것이 상대적으로 감소된 반응원성의 원인일 수 있다.
안전성 연구는 CoPoP/MPLA 또는 CoPoP/MPLA/QS21 리포좀 (+ 1.6 ㎍의 MPLA 및 QS21 용량)과 함께 1 ㎍의 RBD를 사용하여 마우스에서 수행하였다. 이는 면역원성 연구에 사용되었던 것보다 10배 더 많은 용량이다. CoPoP로 면역화된 마우스는 미처리 마우스에 비해 정상적인 체중 증가를 나타냈다 (도 6B). 처리 2주 후에 일반 혈액 검사 (도 24 (표 1), 도 23A)와 혈청 화학 패널 분석 (도 25 (표 2), 도 23B)은 평가된 모든 매개변수들에 대해 정상 범위를 나타냈다. 평가된 대부분의 매개변수들이 대조군과 면역화된 마우스 간에 차이가 없었으나, CoPoP/MPLA/QS21을 미처리 마우스와 비교하였을 때 백혈구 (WBC), 호중구 (NEU), 림프구 (LYM), 글루코스 (GLU), 콜레스테롤 (CHOL) 및 알칼리성 포스파타제 (ALP) 수치에 차이가 있었고, 미처리 마우스에 비해 CoPoP/MPLA로 처리된 경우에 EOS 및 CHOL 수치에 차이가 있었다. 그러나, 모든 측정값들은 시험의 정상 범위 내에 있었기 때문에, 우리는 고용량으로 사용되었을지라도 해당 측정값들이 독성의 징후를 반영하는 것으로 간주하지 않는다. CoPoP에서 코발트의 사용은 백신에 대한 잠재적인 우려 사항이지만, 코발트 테트라피롤인 비타민 B12가 CoPoP에 대해 예상되는 것보다 약 10,000배 더 높은 수준인 5 g의 정맥내 투여해도 인간에게 안전한 것으로 밝혀졌음은 주목할 만한 일이다. 마우스 면역화 후, 혈청 코발트 수준은 명반과 함께 RBD를 투여받은 마우스에 비해 상승하지 않았다 (따라서, 임의의 외인성 코발트는 없음) (도 6C).
재료 및 방법
재료: 인간 배아 신장 293 세포 (HEK293) 세포주에서 발현된 His-태그된 RBD는 RayBiotech (Cat # 230-01102-100)에서 구입하였고, sf9 세포에서 발현된 His-태그된 RBD는 Genscript (Cat # Z03479)에서 구입하였다. CoPoP와 PoP는 앞서 설명한 대로 제조하였다.
PoP 합성: PoP는 CoPoP의 전구체로서, 로벨 등 (Lovell et al.)의 초기 설명에서 변형된 절차를 사용하여 합성한다. (Nat Mater. 2011; 10(4): 324-32). C16 포스파티딜콜린 리소리피드 (Cat# #855675P; Avanti Polar Lipids, 앨러배마주 앨러배스터 소재) 및 포르피린 (Cat#P109-0014; Proactive Molecular Research, 플로리다주 앨라추아 소재)은 모두 각각 분석 인증서와 함께 시판된다. 포르피린 지질 에스테르화 반응은 카르보디이미드 화학을 이용하며; 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제되며; 분말로 동결건조시키고; 분취하여 -20℃로 보관한다. 순도는 HPLC로 평가하고 동일성은 질량 분광법과 NMR로 확인한다. 배치 기록 양식이 있는 당사의 현재 표준 작업 절차는 >85%의 수율과 >95%의 순도로 4 g 규모의 PoP를 생산할 수 있다.
CoPoP 합성: CoPoP는 우리가 보고한 문헌에서 변형된 절차로 생성한다 (Shao et al., Nat Chem. 2015; 7(5): 438-446). 요약하면, 30몰 과량의 질산코발트 (Cat# 36418; Alfa Aesar)를 실온에서 메탄올 (100 mL) 중에서 밤새 교반하여 PoP (2 g)에 의해 킬레이트화한다. 킬레이트화되지 않은 코발트는 1% 메탄올/물과 클로로포름 용액을 사용하는 액체-액체 추출에 의해 제거해 지질과 물을 추출하고 과량의 코발트를 제거한다. 클로로포름은 회전 증발을 사용하여 액체-액체 추출 정제된 CoPoP로부터 제거한다. 고체 CoPoP를 tert-부탄올에 재용해시키고, -20℃에서 보관을 위해 짙은 녹색 분말로 동결건조시킨다. 기존의 프로토콜을 사용한 현재 3 g의 CoPoP 수율은 CoPoP:항원의 비율이 4:1인 10 ㎍ 용량의 경우, 75,000개의 인간 투약량에 충분하다. 고체 CoPoP를 tert-부탄올에 재용해시키고, -20℃에서 보관을 위해 짙은 녹색 분말로 동결건조시킨다. CoPoP 순도는 HPLC로 평가하고 동일성은 질량 분광법과 NMR로 확인한다 (Shao et al., Nat Chem. 2015; 7(5): 438-446).
하기 보조제들을 얻었다: Montanide ISA720 (SEPPIC) 및 Alhydrogel 2% 알루미늄 겔 (Accurate Chemical and Scientific Corporation; Cat #A1090BS), Addavax (InVivoGen Cat # vac-adx-10). 다음 지질을 사용하였다: 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPPC, Corden Cat # LP-R4-057), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC, Avanti cat # 850375), 콜레스테롤 (PhytoChol, Wilshire Technologies), 합성 모노포스포릴 헥사-아실 지질 A, 3-데아실 (PHAD-3D6A, Avanti Cat # 699855). QS21은 Desert King에서 구입하였다. 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)는 Shenandoah Biotechnology (GM-CSF; cat # 200-15-AF)에서 구입하였다. 사이토칼라신 B는 ThermoFisher Scientific (cat # 14930-96-2)에서 구입하였다. 유세포 분석용 항체: 림프절의 면역 세포 동원을 위해, Biolegend에서 하기의 항체를 입수하였다: CD11c-APC Cy7 (클론: N418; Cat # 117323; Lot B237078), CD3 PerCP/Cy5.5 (클론: 17A2; Cat # 100217; Lot B233419), I-A/I-E Alex Fluor 700 (클론: M5/114.15.2; Cat # 107621; Lot B24168), F4/80 Pacific Blue (클론: BM8; Cat # 123123; Lot B217177), Ly-6G PE (클론: 1A8; Cat # 127607; Lot B235376), Ly-6C (클론: HK1.4; Cat # 128021: Lot B221000), CD11b PE/Cy7 (클론: M1/70; Cat # 101215; Lot B249267). 배액 림프절 면역 세포로의 항원 흡수를 위해, Biolegend에서 얻은 하기의 항체들: I-A/I-E Pacific Blue (클론: M5/114.15.2; Cat # 107619; Lot: B252426), CD11c APC (클론: N418; Cat # 117310; Lot: B253461), F4/80 PE (클론: BM8; Cat # 123109; Lot: B251636)를 사용하였다. GC B 세포 염색의 경우, GL7에 대한 다음 항체들, Pacific Blue (클론: GL7; Cat # 144613; Lot: B244647), CD95 PE (클론: SA367H8; Cat # 152607; Lot: B239352), B220 APC (클론: RA3-6B2; Cat # 103211; Lot: B205878)를 사용하였다. Tfh 세포를 평가하기 위해, Biolegend에서 다음 항체를 얻었다: CXCR5 APC (클론: L138D7 Cat # 145505; Lot B243491), PD-1 PE (클론: 29F.1A12; Cat # 135205; Lot: B251877), Alexa Fluor 488 CD4 (클론: GK1.5; Cat # 100425; Lot: B238433). 세포내 사이토카인 염색의 경우: CD4+ 및 CD8+ T 세포를 확인하기 위한 표면 마커, 예컨대, TCRβ APC/Cy7 (클론: H57-597; Cat # 109219), CD4 PE/Cy7 (클론: RM4-4; Cat # 116015), CD8 PreCP/Cy5.5 (클론: 53-5.8; Cat # 140417), CD44 BV605 (클론: IM7; Cat # 563058), 생/사멸 마커 (Cat # L34957); 세포내 마커, 예컨대 IFNγ Pacific Blue (클론: XMG1.2; Cat # 505817), TNFα PE (클론: MP6-XT22; Cat # 506305), Foxp3 Alex Fluor 488 (클론: MF-14, Cat # 126405), IL2 PE/TexasRed.(클론: JES6-5H4; Cat # 503839).
세포 배양: RAW264.7 쥐과 대식세포의 세포들은 ATCC로부터 얻어서, 10% 소태아 혈청 (FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 (Pen/Strep)이 첨가된 둘베코의 변형된 이글 배지 (DMEM)에서 배양하였다. HEK293T 세포는 버팔로 대학 (University at Buffalo)의 브루스 데이빗슨 (Bruce Davidson)에 의해 제공되었으며, 세포들은 10% FBS, 1% Pen/Strep 및 10 mM 피루브산나트륨이 함유된 DMEM에서 배양하였다. HEK293T-ACE2 세포는 스크립스 연구소 (Scripps Research Institute)의 후이후이 뮤(Huihui Mu)에 의해 제공되었으며, 세포들은 10% FBS 및 1% Pen/Strep, 10 mM 피루브산나트륨 및 2 ㎍/ml의 퓨로마이신이 함유된 DMEM에서 배양하였다. 골수 수지상 세포 (BMDC)는 미감작 CD-1 마우스에서 유래하였고, 10% FBS, 1% Pen/Strep 및 20 ng/ml의 GM-CSF가 함유된 RPMI 배지에서 배양하였다. 마우스의 대퇴골과 경골에서 골수를 채취하였다. 0일째에 세포의 농도를 107 개의 세포/ml로 시딩하고 10% FBS 및 20 ng/ml의 재조합 GM-CSF를 함유하는 RPMI 1640 배양 배지 중의 10 cm 페트리 접시에서 배양하였다. 3일째에, GM-CSF를 함유하는 추가의 10 ml의 RPMI 배지를 첨가하여 해당 배지의 최종 부피가 20 ml가 되도록 하였다. 6일째에, 비부착성 세포를 수집하여 10% FBS와 1% Pen/Strep을 함유하는 RPMI 배양 배지에서 5×105 개의 세포/ml로 24-웰 플레이트에서 배양한 후, CoPoP/MPLA, CoPoP/MPLA/QS21 및 PBS를 CoPoP 대 RBD의 질량비를 4:1로 고정하고 RBD를 1 ㎍/mL으로 혼합하여 24시간 동안 항온배양하였다. 세포를 0.1% BSA와 0.05% 아지드화나트륨을 함유하는 PBS로 3회 세척하고, 유세포 분석 전에 얼음 위에서 30분간 CD11c-APC/Cy7, CD40-Pacific blue, CD80-APC, CD86-APC 및 MHC-II-PE에 대한 항체로 염색하였다.
리포좀 제조: 리포좀은 에탄올 주입 방법에 이어서, 60℃에서 수행된 인산염 완충 식염수 (PBS) 중의 질소 가압 지질 압출에 의해 제조하였다. 남아있는 에탄올은 4℃에서 PBS에 대한 투석을 2회 실시하여 제거하였다. QS21을 함유하는 리포좀의 경우, 형성 후 QS21 (1 mg/ml)을 MPLA와 동일한 질량비로 리포좀에 첨가하였다. 최종 리포좀 농도를 320 ㎍/ml의 CoPoP로 조정하고 0.2 μm의 멸균 필터를 통과시켜 4℃에서 보관하였다. 리포좀 크기와 다분산도 지수는 PBS 중에서 200배 희석한 후 NanoBrook 90 plus PALS 장비를 사용하여 동적 광산란 (DLS)에 의해 측정하였다. CoPoP/MPLA 리포좀 제제는 [DPPC: CHOL: MPLA: CoPoP] [4:2:0.4:1]의 질량비를 가졌고, CoPoP/MPLA/QS21 리포좀 제제는 [DOPC: CHOL: MPLA: CoPoP: QS21] [20:5:0.4:1:0.4]의 질량비를 가졌으며, PoP/MPLA 리포좀은 CoPoP/MPLA 리포좀과 유사한 제제를 갖지만 포르피린-인지질에 코발트가 없는 대조군 리포좀으로 사용되었고, 상기 제제는 [DPPC: CHOL: MPLA: PoP] [4:2:0.4:1]의 질량비를 가졌으며, AS01-유사 리포좀 제제는 [DOPC: CHOL: MPLA: QS21] [20:5:0.4:0.4]의 질량비를 가졌다.
항원 입체형태에 대한 슬롯 블롯: 리포좀 샘플은 다음과 같이 제조하였다: CoPoP 리포좀 (CoPoP 320 g/ml)을 RBD 항원 (80 g/ml)과 항원: CoPoP=1:4 질량비로 혼합하고, Pfs25 (말라리아 항원)와 CoPoP 리포좀은 이 실험에서 음성 대조군으로 사용하였다. 48-웰 슬롯 블롯 (Cat # M1706545)은 설명서에 따라 설정하였다. 개스킷 지지판을 진공 매니폴드 위에 놓은 후, 밀봉 개스킷을 상기 지지판 위에 놓았다. 니트로셀룰로스 막을 실온에서 10분간 PBS에 미리 적신 후, 상기 밀봉 개스킷 위에 놓았다. 24-웰 샘플 주형을 상기 막 위에 놓고 나사를 조여 고정시켰다. 50 ㎕의 혼합된 샘플들을 각 웰에 서서히 가하여, 전체 샘플을 중력에 의해 막을 통해 흐르도록 하였다. 상기 막을 제거하고 RT에서 30분간 PBS 중 5% BSA를 사용하여 차단한 다음, 1000X 희석된 인간 ACE2, Fc 태그 (Acrobiosystems의 cat # AC2-H5257)와 함께 RT에서 1시간 동안 항온배양하였다. 상기 막을 PBS로 5분간 2회 세척한 후, HRP 항-인간 IgG (Jackson ImmunoResearch, cat # 109-035-098)와 함께 RT에서 30분간 항온배양하였다. 항온배양 후, 상기 막을 PBS로 5분간 2회 세척하였다. Bio-Rad ChemiDoc™ 영상 장치를 사용하여 상기 막을 촬영하였다.
Ni-NTA 경쟁 결합 시험: RBD 항원 결합 안정성을 확인하기 위해, Ni-NTA 자성 비드 (ThermoFisher cat # 88831)를 사용하여 리포좀에 사전에 결합되어 있던 단백질 (총 단백질: CoPoP가 1:4 질량비)과 경쟁시켰다. 샘플 내 유리 단백질의 완전한 결합을 담보하기에 충분한 비드들을 첨가하였다. 샘플들을 30분간 상기 비드와 함께 항온배양한 후, 상청액과 자성 비드들을 분리하여 자성 분리기 (ThermoFisher cat # 12321D)를 사용하여 수집하였다. 그런 다음, 비드들을 PBS에 재현탁하였다. 이후, 변성용 환원성 로딩 염료를 모든 샘플들 (상청액과 비드)에 첨가하고 10분간 100℃부근에서 가열하였다.그런 다음, 샘플들을 Novex 4-12% Bis-Tris 아크릴아미드 겔 (Invitrogen cat # NP0321BOX)에 로딩하여 PAGE를 거친 후, 밴드를 쿠마시 염색으로 보일 수 있게 하였다.
형광단 표지된 RBD: RBD는 DY-490-NHS-에스테르 (DY-490)로 표지하였다. 표지화는 DY-490: RBD를 10:1의 몰비로 수행하였다. 먼저, 100 ㎍의 RBD를 100 mM 중탄산나트륨 완충액 (pH 9)에 대해 4-6시간 동안 4℃에서 2회 투석한 후, 계속 교반하면서 실온에서 1시간 동안 DY-490으로 표지하였다. 4℃에서 PBS에 대해 3회 투석하여 유리 염료를 제거하였다.
형광 소광 분석: DY-490로 표지된 RBD는 40 ㎍/ml의 최종 항원 농도에서 RBD: CoPoP 또는 PoP의 1:4 질량비로 항원과 리포좀을 항온하여 수행하였다. 각 샘플의 소광은 RT에서 0.5, 1, 2 및 3시간에 평가하였다. 형광 신호를 확인하기 위해, 96-웰 플레이트에 각각의 항온배양 샘플을 PBS 중에서 200배 희석하여, 491/515의 여기/발광도에서 형광 신호를 측정하였다. 결합 백분율은 하기 공식에 기초하여 계산하였다: % 항원 결합 = [1-FL리포좀+항원/FL항원]×100% (FL = 형광 강도).
혈청 안정성: DY-490 표지된 RBD (80 ㎍/ml)와 CoPoP 리포좀 (320 ㎍/ml의 CoPoP)의 혼합물을 실온에서 3시간 동안 항온배양한 다음, 동일한 양의 PBS 중 40% 인간 혈청을 샘플에 첨가하여 20% 인간 혈청의 최종 농도를 달성하였다. 지정된 기간 동안 샘플을 37℃에서 항온배양하였다.
가용성 및 입자 형태 RBD의 HEK293T-ACE2 세포에 대한 결합 분석: HEK293T 세포 또는 HEK293T-ACE2 세포의 5×105 개의 세포를 CoPoP/MPLA 리포좀과 CoPoP/MPLA/QS21 리포좀 및 PBS 단독과 함께 표지된 RBD (0.5 ㎍/ml)와 함께 얼음 위에서 20분간 항온배양하였다. 항온배양 후, 세포들을 얼음처럼 차가운 PBS로 2회 세척하였다. 세포들을 60℃에서 10분간 용해 완충액 (0.1% 트리톤 + 20 ㎍/ml의 프로테이나제 K)으로 용해시켰다.샘플들을 96-웰 플레이트에 놓고, 형광 신호를 DY-490 표지된 RBD에 대해 491/515의 여기/방출도에서 확인하였다.
hACE2 코팅된 플레이트에서 검출된 리포좀: 코팅 완충액 (3.03 g의 Na2CO3; 1L의 증류수 중 6 g의 NaHCO3, pH 9.6) 중 1 ㎍/mL의 hACE2를 37℃에서 2시간 동안 플레이트 상에 코팅하였다. 웰들을 세척하고 PBS 중 2% BSA로 37℃에서 2시간 동안 차단하였다. 그 사이, RBD를 CoPoP/MPLA* 리포좀 및 CoPoP/MPLA/QS21* 리포좀과 함께 3시간 동안 항온배양하였다. RBD (RBD 0.4 ㎍/ml)와 CoPoP 리포좀을 각 웰에 첨가하여 실온에서 1시간 동안 항온배양하였다. 상기 웰들을 PBS로 4회 세척한 후, 0.5% Triton X가 함유된 PBS 200 ㎕를 각 웰에 첨가하여 리포좀을 파괴하였다. 본 연구에서 CoPoP 리포좀은 소량의 PoP 지질을 함유하고 있으며, 리포좀 제제는 CoPoP/MPLA* 리포좀 (DPPC: Chol: MPLA: CoPoP: PoP=4:2::0.4:0.8:0.2)과 CoPoP/MPLA/QS21* 리포좀 (DOPC: Chol: MPLA: QS21: CoPoP: PoP=20:5:0.4:0.4:0.8:0.2)이다.
가상바이러스 제조: HEK293T 세포를 10% FBS가 함유된 DMEM 배지를 사용하여 T75 플라스크 중에 5x105 개의 세포/ml로 밤새 시딩하였다. 세포들이 약 60% 전면배양되었을 때, 반딧불이 루시퍼라제 (FLuc)를 암호화하는 레트로바이러스 벡터 pQCXIX, MLV gag 및 pol 단백질을 발현하는 플라스미드, 및 SARS-CoV-2 단백질의 S 단백질을 발현하는 플라스미드를 사용하여 이들을 5:5:1의 질량비로 형질감염시켰다. 총 DNA 11 ㎍을 PEI 44 ㎍과 실온에서 20분간 혼합한 후, 상기 혼합물을 상기 세포들에 천천히 첨가하였다. 37℃에서 6시간 항온배양 후, 상기 배지를 완전 DMEM 배지 10 ml로 교체하고 상기 배양물을 32℃에서 항온배양하였다. 형질감염하고 48시간 후, 가상바이러스를 함유하는 배양 배지를 수거하여 0.45 ㎛의 공극 크기의 필터를 통과시키고, 바이러스 상청액에 10 mM HEPES를 보충하고, 분취하여 -80℃로 보관하였다.
극저온 전자 현미경: RBD-HEK293 (80 ㎍/ml) 20 ㎕를 CoPoP/MPLA 리포좀 또는 CoPoP/MPLA/QS21 리포좀 20 ㎕와 PBS 중에서 혼합하였다. 다공성 탄소 격자 (Holey carbon grid) (c-flat CF-2/2-2C-T)를 클로로포름으로 세척하고 샘플 적용 직전에 15초간 5 mA로 글로우 방전시켰다. 3.6 ㎕ 부피의 샘플을 상기 격자에 침착시키고, 상기 격자를 3초간 1회 블롯팅하고 블롯힘 +2로 하여 블롯팅하여 Vitrobot (ThermoFisher)에서 유리화를 수행한 후, 액체 에탄에 넣었다. 유리화 공정 동안의 온도와 상대 습도는 각각 25℃와 100%로 유지하였다. 격자들은 Gatan 626 단일 틸트 극저온 홀더를 사용하여 200 kV에서 작동하는 Tecnai F20 전자 현미경에 로딩하였다. Gatan Ultrascan 4000 4k×4k CCD 카메라 시스템 모델 895에서 공칭 배율 60,000×로 이미지를 수집하여, 1.8 Å/픽셀의 보정된 픽셀 크기로 이미지를 생성하였다. -2.7 내지 -3.5 μm 범위의 디포커스를 사용하여 약 50 e-/Å2의 총 선량으로 이미지를 수집하였다. 어도비 포토샵 프로그램을 사용하여 이미지들을 잘라 도면을 제작하였다.
쥐과 면역화 및 혈청 분석: 5주령의 암컷 CD-1 마우스 (Envigo RMS LLC에서 주문함)에게 하기의 리포좀 보조제들과 조합된 100 ng의 RBD를 함유하는 근육 주사제를 0일과 14일째에 투여하였다. [4:2:0.4:1]의 [DPPC: CHOL: MPLA: CoPoP] 조성을 갖는 CoPoP/MPLA 리포좀, [4:2:0.4:1:0.4]의 [DOPC: CHOL: MPLA: CoPoP: QS21] 조성을 갖는 CoPoP/MPLA/QS21 리포좀, [4:2:0.4:1]의 [DPPC: CHOL: MPLA: PoP] 조성을 갖는 PoP/MPLA 리포좀, [4:2:1:1:1]의 [DOPC:CHOL:MPLA:CoPoP:QS21] 조성을 갖는 AS01-유사 리포좀. 하기 보조제들을 사용하여 CoPoP 리포좀 보조제 vs. 시판 보조제인 ISA720, 명반 및 Addavax를 비교하였다.
비장 세포들을 수거하여 RBD 특이적 사이토카인을 확인한다. 28일째에 면역화된 마우스로부터 비장 세포를 수거하였다. 비장을 수집한 후, 50 mL 튜브에서 70 μm의 세포 여과기를 통과시켜 단일 세포를 수집하였다. 세포들을 500 rcf에서 원심분리하고, 적혈구 용해 완충액을 얼음 위에서 5분간 첨가하여 적혈구를 용해시켰다. 항온배양 후, 20 mL의 PBS를 첨가하여 용해 완충액을 희석하고, 샘플을 500 rcf에서 5분간 원심분리하였다.96-웰 배양 플레이트에서, 2.5×105 개의 세포/웰을 1 ㎕/ml의 RBD로 자극시켜 10% FBS, 1% Pen/Strep, 1 mM 피루브산 및 1 mM 비필수 아미노산, 50 μM의 2-머캅토에탄올이 함유된 RPMI 배지에서 배양하였다. IFNγ 분비를 확인하기 위해, 48시간 후 배양 배지를 채취하고, IFNγ 분비 수준은 IFNγ 마우스 ELISA 키트 (fisher Scientific, Cat. 50-183-06)에 기초하여 측정하였다. 한편, 특정 T 세포에서의 사이토카인을 확인하기 위해, 비장 세포를 1 ㎕/ml의 RBD로 18시간 동안 자극시킨 후, 브레펠딘 A (Biosciences, Cat. # 555029)로 6시간 더 항온배양하여 세포로부터 사이토카인 분비를 차단하였다. 얼음 위에서 25분간 FASC 완충액 (0.5% BSA 및 0.05% 아지드화나트륨을 함유하는 저온 PBS)에 희석한 TCRβ APC/Cy7, CD4 PE/Cy7, CD8 PreCP/Cy5.5, CD44 BV605, 생/사멸 마커 (Cat. L34957)를 사용하여 세포들을 표면 마커에 대해 염색하였다. 세포들을 FASC 완충액으로 2회 세척한 후, 고정/투과 완충액 (BD cytofix/perm 키트; Biosciences Cat. # 555028)으로 10분간 얼음 위에서 고정시켰다. 세포들을 FASC 완충액으로 2회 세척하고, 투과 완충액 (BD cytofix/perm 키트; Biosciences Cat. # 555028)을 얼음 위에서 20분 동안 각 웰에 첨가하였다. IFNγ Pacific Blue, TNFα PE, Foxp3 Alex Fluor 488, IL2 PE/TexasRed를 비롯한 세포내 마커들을 투과 완충액 중에서 희석하고, 세포들을 얼음 위에서 25분간 염색하였다. 염색된 세포들을 투과 완충액으로 2회 세척한 후, BD LSRFortessa TM X-20 유세포 분석 전에 FASC 완충액 중에 재현탁시켰다.
뉴질랜드 흰토끼 면역화: 0일과 21일째에 10-12주령의 암컷 토끼에게 RBD-HEK293 20 ㎍과 [DPPC: CHOL: MPLA: CoPoP = 4: 2: 0.4: 1] 질량비의 CoPoP/MPLA 리포좀 또는 [DPPC: CHOL: MPLA: CoPoP: QS21 = 20: 5: 0.4: 1: 0.4] 질량비의 CoPoP/MPLA/QS21 리포좀을 근육내 주사로 투여했다. 혈청은 0일, 21일 및 42일째에 수집하였다.
ELISA 분석: 항-RBD IgG 역가를 96-웰 플레이트에서 ELISA에 의해 평가하였다. 코팅 완충액 (3.03 g의 Na2CO3; 1L의 증류수 중 6 g의 NaHCO3, pH 9.6) 중 2.5 ㎍/mL의 RBD를 37℃에서 2시간 동안 플레이트 상에 코팅하였다. 웰들을 세척하고 0.1% Tween-20 (PBS-T)을 함유하는 PBS 중 2% BSA로 37℃에서 2시간 동안 차단시켰다. (1% BSA가 함유된 PBS-T에 희석된) 마우스 혈청을 웰에서 항온배양한 후, PBS-T로 세척하였다. 염소 항-마우스 IgG-HRP를 첨가하였다. PBS-T로 웰을 다시 세척한 후, 테트라메틸벤지딘 용액을 첨가하였다. 역가는 450 nm에서의 흡광도가 0.5 흡광도 단위 이상으로 백그라운드를 초과하는 혈청 희석배율의 역수로 정의되었다.
가상바이러스 기반 중화 분석: HEK293T-ACE2 세포들을 2×105 개의 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 밤새 시딩하였다. 단계 희석한 마우스 및 토끼의 면역화된 혈청을 실온에서 30분간 가상바이러스와 함께 항온배양한 다음, 50 ㎕의 배양 배지를 제거한 후 서로 다른 희석도의 혈청을 갖는 50 ㎕의 가상바이러스를 각 웰에 첨가하고, 상기 세포들을 48시간 동안 배양하였다. 상기 배지를 각 웰에서 제거하고 상기 세포들을 200 ㎕의 PBS로 세척한 다음, 30 ㎕의 용해 완충액 (Promega E1500)을 10분간 첨가하였다.상기 용해물을 백색 플레이트로 옮기고, 기질 100 ㎕를 첨가하였다. CentroPRO (Cat. # LB 962)를 사용하여 루시퍼라제 활성을 측정하였다.
RBD-hACE2 억제 분석: SARS-CoV-2 대용 바이러스 중화 시험 (sVNT) 키트 (GenScript, Cat. L00847)를 사용하여 면역 후 혈청이 hACE2와 HRP-RBD 항원 간의 상호작용을 차단할 수 있는지를 확인하였다. 마우스 혈청은 100배로 희석하였고 토끼 혈청은 샘플 희석 완충액으로 20배 희석하였다. 양성 및 음성 대조군을 키트에 포함시켰고, 대조군 바이알은 10배 희석하였다. 상기 희석된 양성 및 음성 대조군과 희석된 샘플들을 HRP-RBD 용액과 1:1 부피비로 혼합한 후, 37℃에서 30분간 항온배양하였다. 100 ㎕의 이러한 혼합물을 hACE2로 미리 코팅시킨 ELISA 플레이트의 웰에 로딩하고 37℃에서 15분간 항온배양하였다.상기 플레이트를 4회 세척하여 결합되지 않은 HRP-RBD를 제거하였다. 억제율 = (1 - OD450 면역후 혈청/OD450 음성 대조군)×100.
VNT 분석 (생바이러스 중화 시험): SARS-CoV-2 숙주 세포 감염을 중화하는 혈장 샘플의 능력은, 질병 통제 예방 센터에 기탁되고 BEI Resources, NIAID, NIH를 통해 얻은 SARS-CoV-2 분리주: SARS 관련 코로나바이러스 2, 분리주 USA-WA1/2020, NR-52281을 사용하는 전통적인 VN 분석으로 측정하였다. 상기 분석은 3회 수행하였고, 혈청에 대한 일련의 8개의 2배 단계 희석액을 평가하였다. 100개의 조직 배양 감염 용량 50 (TCID50) 단위의 SARS-CoV-2를 혈청의 2배 희석액에 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 항온배양하였다. 상기 바이러스와 혈청 혼합물을 96-웰 미량역가 플레이트에서 성장시킨 Vero E6 세포에 첨가하고, 3일간 항온배양한 후, 숙주 세포를 크리스탈 바이올렛-포름알데히드 염색 (0.013% 크리스탈 바이올렛, 2.5% 에탄올, 및 0.01 M PBS 중 10% 포름알데히드)으로 1시간 동안 처리하였다. 미세중화 검정의 종료점은, 육안 검사로 평가시, 3개의 웰 중 3개 모두 또는 2개가 바이러스 감염으로부터 보호되지 않는 가장 높은 혈장 희석배율로 정하였다.
RBD 흡수에 대한 림프절 연구: CoPoP/MPLA, CoPoP/MPLA/QS21, 명반 또는 AS01-유사 리포좀과 1 ㎍의 RBD-DY490으로 마우스를 면역화시켰다. 48시간 후, 마우스를 희생시키고 사타구니 림프절을 수집하였다. 림프절은 70 μm의 세포 여과기를 통과시키고 튜브당 5X105 개의 세포를 IA/IE, B220, CD11c 또는 F4/80 (모두 BioLegend)에 대한 하기의 쥐과 항체로 실온에서 30분 동안 염색하였다. BD LSRFortessa TM X-20 유세포 분석 전에 상기 샘플들을 FASC 완충액으로 2회 세척하였다. 데이터 분석에는 Flowjo (버전 10) 소프트웨어를 사용하였다.
GC 세포 및 Tfh 세포군: 마우스에게 CoPoP/MPLA, CoPoP/MPLA/QS21 또는 명반으로 보강된 100 ng의 RBD를 투여하였다. 면역화 7일 후, 마우스를 희생시키고 사타구니 LN을 수집하였다. 림프절을 70 μm의 세포 여과기를 통과시킨 후, 튜브당 5X105 개의 세포를 B220, CD95, GL7, CD4, CXCR5 또는 PD-1에 대한 항체로 얼음 위에서 30분 동안 염색하였다. BD LSRFortessa TM X-20 유세포 분석 전에 상기 샘플들을 FASC 완충액으로 2회 세척하였다. 데이터 분석에는 Flowjo (버전 10) 소프트웨어를 사용하였다.
림프절 세포 동원의 경우: 마우스에게 CoPoP/PHAD 리포좀 또는 명반을 100 ng의 Pfs25와 함께 근육내 주사하였다. 주사하고 48시간 후, 마우스를 희생시키고 세포 추출을 위해 림프절을 수집하였다. Ly6C, CD11b, Ly6G, CD11c, CD3, IA/IE 및 F4/80에 대한 조합 항체로 세포들을 얼음 위에서 30분간 염색하였다. BD LSRFortessa TM X-20 유세포 분석 전에 상기 샘플들을 FASC 완충액으로 2회 세척하였다. 데이터 분석에는 Flowjo (버전 10) 소프트웨어를 사용하였다. 먼저, 세포들을 CD11c 및 CD11b로 게이팅한 다음, CD11chigh와 CD11blow , 호중구 (Ly6Ghigh), 호산구 (Ly6Gint, F4/80int, SSC), 단핵구 (Ly6C high) 및 대식세포 (F4/80 high)에서 표면 마커를 기초로 면역 세포들을 확인하였다. 골수성 DC의 경우, 3가지 유형의 DC 세포들을 게이팅되었는데, 우리는 먼저 Cd11chigh와 CD11bhigh를 게이팅한 다음, MHC-II 양성 세포를 게이팅하였다.
급성 독성 연구: 8주령의 암컷 CD-1 마우스를 CoPoP/MPLA/RBD 또는 CoPoP/MPLA/QS21/RBD와 1 ㎍의 RBD를 함께 근육 주사하여 처리하였다. 2주 후에, 혈액과 혈청을 수집하여 표준 일반 혈액 검사 및 혈청 패널 (IDEXX Cat # 98-20590-00)에 거치도록 하였다.
보조제들의 국소 반응원성: 마우스의 발바닥에 서로 다른 유형의 보조제들과 혼합된 1 ㎍의 RBD를 투여하고, 마우스당 50 ㎕의 샘플을 사용하였다. CoPoP/MPLA 리포좀의 경우, CoPoP/MPLA/QS21 리포좀, AS01 리포좀, 1:1 질량비의 RBD (80 ㎍/mL): 리포좀을 실온에서 3시간 동안 항온배양하였다. 명반과 Addavax의 경우, 1:1 질량비의 RBD (80 ㎍/mL): 보조제를 주사 직전에 혼합하였다. Montanide ISA720을 PBS와 혼합하고 Montanide ISA720: PBS를 3:7 부피비로 40분간 최대 속도로 볼텍싱 처리하였다. 상기 마우스의 왼쪽 발바닥에 50 ㎕의 보조제 샘플을, 오른쪽 발바닥에 대조군으로서 50 ㎕의 PBS를 주사하였다. 발바닥 주사 48시간 후 캘리퍼스로 발바닥의 두께를 측정하였고, 부어오름은 [왼쪽 발바닥 두께 - 오른쪽 발바닥 두께]의 공식으로 계산하였다.
본 발명을 구체적인 실시형태들을 통해 설명하였으나, 통상적인 변형은 당업자에게 명백할 것이고, 이러한 변형들도 본 발명의 범위 내에 포함시키고자 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Research Foundation for The State University of New York <120> PARTICLE BASED FORMULATIONS OF SARS-COV-2 RECEPTOR BINDING DOMAIN <130> 011520.01638 <150> 63/085,734 <151> 2020-09-30 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 223 <212> PRT <213> severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 <400> 1 Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn 1 5 10 15 Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser 35 40 45 Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val 50 55 60 Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp 65 70 75 80 Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln 85 90 95 Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr 100 105 110 Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly 115 120 125 Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys 130 135 140 Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr 145 150 155 160 Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser 165 170 175 Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val 180 185 190 Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly 195 200 205 Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe 210 215 220

Claims (40)

  1. 대상체에서 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 중화 항체를 생성하는 방법으로서, 상기 방법은
    a) 리포좀; 및
    b) 약제학적 담체
    를 포함하는 백신 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고,
    상기 리포좀은, 코발트가 배위결합되어 코발트-포르피린을 형성하고 있는 포르피린, 및 인지질을 포함하는 이중층(i); 및 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 (RBD)의 폴리히스티딘-태그된 아미노산 서열(ii)을 포함하고, 이때 상기 폴리히스티딘 태그의 적어도 일부가 상기 이중층의 소수성 부분에 존재하고, 상기 폴리히스티딘 태그의 하나 이상의 히스티딘이 상기 코발트-포르피린의 코발트에 배위결합되며, 상기 아미노산 서열의 적어도 일부가 리포좀의 외부로 노출되는 것인, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 RBD가 서열번호 1로 표시되는 서열 또는 서열번호 1의 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 이의 변이체를 갖는 것인, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 코발트-포르피린이 인지질에 접합되어 코발트-포르피린-인지질 접합체를 형성하는 것인, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 코발트-포르피린-인지질 접합체가 상기 이중층의 0.1 내지 25 mol%를 구성하는 것인, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 코발트-포르피린-인지질 접합체가 상기 이중층의 5 내지 10 mol%를 구성하는 것인, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 이중층이 콜레스테롤을 추가로 포함하는 것인, 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 폴리히스티딘 태그가 6개 내지 10개의 히스티딘 잔기를 포함하는 것인, 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 리포좀의 크기가 50 nm 내지 200 nm인 것인, 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 리포좀이 하나 이상의 보조제를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 보조제가 약독화된 지질 A 유도체, 인산화된 헥사아실 이당류 및/또는 QS21인 것인, 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 리포좀과 결합되지 않은 하나 이상의 보조제를 추가로 포함하는, 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 대상체가 인간인 것인, 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 조성물을 수회 투여하는 것인, 방법.
  14. SARS-CoV-2에 대한 대상체의 면역 반응을 생성하는 방법으로서,
    a) SARS-CoV-2의 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 (RBD)을 제공하는 단계로서, 상기 RBD가 폴리히스티딘 태그를 추가로 포함하는 것인, 단계;
    b) 상기 폴리히스티딘 태그된 RBD를 이중층(i)을 포함하는 리포좀과 복합체화하는 단계로서, 상기 이중층이 코발트-포르피린-인지질을 포함하여, 상기 폴리히스티딘 태그의 적어도 일부가 상기 이중층의 소수성 부분에 포함되고, 상기 폴리히스티딘 태그의 하나 이상의 히스티딘이 상기 코발트-포르피린-인지질의 코발트에 배위결합되며, 상기 RBD의 적어도 일부가 리포좀의 외부로 노출되는 것인, 단계; 및
    c) 상기 복합체화된 RBD를 상기 대상체에게 투여하여 면역 반응을 생성하는 단계를 포함하고,
    상기 SARS-CoV-2에 대한 대상체의 면역 반응이, RBD를 상기 리포좀과 복합체화하지 않고 RBD를 투여함으로써 생성된 면역 반응보다 큰 것인, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 RBD가 서열번호 1에 제시된 서열 또는 서열번호 1에 제시된 서열과 적어도 90% 상동성인 서열을 갖는 것인, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 면역 반응이 체액성인 것인, 방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 면역 반응이 세포성인 것인, 방법.
  18. 제15항에 있어서, 상기 면역 반응이 체액성 및 세포성 모두인 것인, 방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 세포성 면역 반응이 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 증가를 포함하는 것인, 방법.
  20. 제14항에 있어서, 상기 RBD가 서열번호 1로 표시되는 서열 또는 서열번호 1의 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 이의 변이체를 갖는 것인, 방법.
  21. 제14항에 있어서, 상기 코발트-포르피린이 인지질에 접합되어 코발트-포르피린-인지질 접합체를 형성하는 것인, 방법.
  22. 제14항에 있어서, 상기 코발트-포르피린-인지질 접합체가 상기 이중층의 0.1 내지 25 mol%를 구성하는 것인, 방법.
  23. 제14항에 있어서, 상기 코발트-포르피린-인지질 접합체가 상기 이중층의 5 내지 10 mol%를 구성하는 것인, 방법.
  24. 제14항에 있어서, 상기 이중층이 콜레스테롤을 추가로 포함하는 것인, 방법.
  25. 제14항에 있어서, 상기 폴리히스티딘 태그가 6개 내지 10개의 히스티딘 잔기를 포함하는 것인, 방법.
  26. 제14항에 있어서, 상기 리포좀의 크기가 50 nm 내지 200 nm인 것인, 방법.
  27. 제14항에 있어서, 상기 리포좀이 하나 이상의 보조제를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  28. 제14항에 있어서, 상기 하나 이상의 보조제가 약독화된 지질 A 유도체, 인산화된 헥사아실 이당류 및/또는 QS21인 것인, 방법.
  29. 제14항에 있어서, 상기 리포좀과 결합되지 않은 하나 이상의 보조제를 추가로 포함하는, 방법.
  30. 제14항에 있어서, 상기 대상체가 인간인 것인, 방법.
  31. 제14항에 있어서, 상기 조성물을 수회 투여하는 것인, 방법.
  32. 백신 조성물로서,
    a) 리포좀; 및
    b) 약제학적 담체를 포함하고,
    상기 리포좀은, 코발트가 배위결합되어 코발트-포르피린을 형성하고 있는 포르피린, 및 인지질을 포함하는 이중층(i); 및 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 (RBD)의 폴리히스티딘-태그된 아미노산 서열(ii)을 포함하고, 이때 상기 폴리히스티딘 태그의 적어도 일부가 상기 이중층의 소수성 부분에 존재하고, 상기 폴리히스티딘 태그의 하나 이상의 히스티딘이 상기 코발트-포르피린의 코발트에 배위결합되며, 상기 아미노산 서열의 적어도 일부가 리포좀의 외부로 노출되는 것인, 백신 조성물.
  33. 제32항에 있어서, 상기 RBD가 서열번호 1로 기재된 서열 또는 서열번호 1의 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 이의 변이체를 갖는 것인, 백신 조성물.
  34. 제32항에 있어서, 상기 코발트-포르피린-인지질 접합체가 상기 이중층의 0.1 내지 25 mol%를 구성하는 것인, 백신 조성물.
  35. 제32항에 있어서, 상기 코발트-포르피린-인지질 접합체가 상기 이중층의 5 내지 10 mol%를 구성하는 것인, 백신 조성물.
  36. 제32항에 있어서, 상기 폴리히스티딘 태그가 6개 내지 10개의 히스티딘 잔기를 포함하는 것인, 백신 조성물.
  37. 제32항에 있어서, 상기 리포좀의 크기가 50 nm 내지 200 nm인 것인, 백신 조성물.
  38. 제32항에 있어서, 상기 리포좀이 하나 이상의 보조제를 추가로 포함하는 것인, 백신 조성물.
  39. 제38항에 있어서, 상기 하나 이상의 보조제가 약독화된 지질 A 유도체, 인산화된 헥사아실 이당류 및/또는 QS21인 것인, 백신 조성물.
  40. 제32항에 있어서, 상기 리포좀과 결합되지 않은 하나 이상의 보조제를 추가로 포함하는, 백신 조성물.
KR1020237014760A 2020-09-30 2021-09-30 SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인의 입자 기반 제제 KR20230079418A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063085734P 2020-09-30 2020-09-30
US63/085,734 2020-09-30
PCT/US2021/052907 WO2022072654A1 (en) 2020-09-30 2021-09-30 Particle based formulations of sars-cov-2 receptor binding domain

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230079418A true KR20230079418A (ko) 2023-06-07

Family

ID=80950856

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237014760A KR20230079418A (ko) 2020-09-30 2021-09-30 SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인의 입자 기반 제제

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20230390414A1 (ko)
EP (1) EP4221749A1 (ko)
KR (1) KR20230079418A (ko)
WO (1) WO2022072654A1 (ko)

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2865392T7 (es) * 2015-04-16 2022-09-07 The Research Foundation For The State Univ Of New York Univ At Buffalo Nanoestructuras que comprenden conjugados de porfirina de cobalto-fosfolípido y etiquetas de polihistidina
SG11202103404PA (en) * 2020-04-02 2021-04-29 Regeneron Pharma Anti-sars-cov-2-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022072654A1 (en) 2022-04-07
US20230390414A1 (en) 2023-12-07
EP4221749A1 (en) 2023-08-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2360173B1 (en) Cytotoxic t cell epitope peptide for sars coronavirus, and use thereof
CN111375055B (zh) 一种2019-nCoV亚单位疫苗组合物及其免疫方法
CA2884677C (en) Cell penetrating peptides derived from the epstein barr virus, compositions and methods thereof
EA000839B1 (ru) Липосомальная вакцинная композиция, применение липосомальной вакцинной композиции и способ лечения млекопитающего
KR101225199B1 (ko) 항원보강제를 함유하는 기능적으로 재구성된 바이러스막
JP2007532614A (ja) 抗原デリバリベクタ及びコンストラクト
JP2014518620A (ja) リポソーム製剤
Wu et al. CASTING: a potent Supramolecular strategy to cytosolically deliver STING agonist for cancer immunotherapy and SARS-CoV-2 vaccination
US20080038329A1 (en) T-cell activating agent
Mohammadi et al. Incorporation of the tat cell‐penetrating peptide into nanofibers improves the respective antitumor immune response
AU2022257111A1 (en) Hyperactivators of mammalian dendritic cells
US20230256082A1 (en) Vaccine against human-pathogenic coronaviruses
WO2012050193A1 (ja) エボラウイルスリポソームワクチン
JP2023523423A (ja) ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチン及びその調製物
CN114466659A (zh) 免疫治疗组合物
KR20230079418A (ko) SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인의 입자 기반 제제
Francis et al. Increasing cellular immunogenicity to peptide-based vaccine candidates using a fluorocarbon antigen delivery system
EP1361862B1 (en) Liposome-mediated dna administration
EP4108251A1 (en) Griffithsin for use in a method of preventing or treating infections with respiratory viruses
US20230104171A1 (en) Engineered Alum-binding SARS-CoV-2 Immunogens
KR101756202B1 (ko) 신규한 ｇｐ41 항원
JP2024502633A (ja) Ｍｈｃ－ｉ拘束性エピトープ免疫化のための製剤及び方法
TW202342094A (zh) 高度活化之脂質奈米粒子
CN116212012A (zh) 复合佐剂以及包含它的疫苗制剂
WO2000057919A2 (en) Lipid-based artificial particles inducing cell-mediated immunity