CN102232083B - 禽流感疫苗 - Google Patents

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Abstract

含有脂质体和与脂质体结合的肽的禽流感病毒疫苗，其中：所述肽包含：(1) SEQ ID NO:1至SEQ ID NO：9的任一个所示的氨基酸序列，或(2) SEQ ID NO:1至SEQ ID NO：9的任一个所示的氨基酸序列中通过一个或两个氨基酸取代产生的氨基酸序列，具有9至11个氨基酸残基的长度，并且可诱导HLA-限制性细胞毒性T淋巴细胞；且所述脂质体包括具有含有一个不饱和键的C14-24酰基、或含有一个不饱和键的C14-24烃基的磷脂，和脂质体稳定剂；并且其中所述肽与所述脂质体的表面结合。

Description

禽流感疫苗
技术领域
本发明涉及用于禽流感疫苗的肽和肽结合的脂质体、以及它们的应用。
背景技术
流感病毒通过遗传漂变而改变其表面抗原性，每年引起流行。此外，在约10年至40年的周期中，由于转变已出现了抗原性谱(profile)与其完全不同的新型病毒，这在对该新型病毒缺乏免疫性的人类中引起了世界大流行(下文称为“流行病”)。
据称，过去的西班牙流感、香港流感和其它流行病有可能是禽流感病毒引起的；存在将来500万至1亿5000万人将有可能死于禽流感的估计。目前，引起高死亡率的高致病性禽流感(H5N1)的感染在世界各地被报告；迫切需要有效的对策。
通常地，包括禽流感病毒在内的流感病毒很可能在增殖过程中经历突变。而且，如果感染了人的病毒在体内与人流感病毒重排列，则可能出现在人之间有高感染性、同时保持高致病性的病毒。病毒本身的这些频繁变化是上述重复流行病的原因。
点突变(抗原遗传漂变)在编码病毒表面糖蛋白[血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)]的基因中发生，而抗原转变产生两个基因都在免疫学上改变的新毒株。
常规疫苗诱导与流感病毒表面蛋白特异性结合的抗体的产生，并且通过该抗体的作用使病毒丧失感染潜力。但是，如上所述，表面蛋白很可能经历突变，从而使得上述疫苗诱导的抗体不总是有效。目前，根据预期流行的病毒类型储备疫苗，但该预期可能是令人失望的，引起损害扩大。
同时，流感病毒的内部蛋白即使在遗传漂变突变体和转变突变体中也相对地高度保守，难以通过从病毒外部结合抗体而使该蛋白失活，从而使得内部蛋白尚未被积极地用作常规疫苗的靶。
病毒-感染的细胞在其表面上暴露掺入病毒内部蛋白的氨基酸序列的一部分的主要组织相容性抗原复合体(MHC)。如果可以制备能够特异性地杀伤表现这些特征的病毒-感染的细胞的细胞毒性T淋巴细胞，那么就可能有效地防止病毒的复制并从而防止其增殖和扩散，而不受突变的影响。
专利文献1公开了制备T细胞激活剂的方法，所述T细胞激活剂能够有效地和特异性地增加用于杀伤病原体-感染的细胞或癌细胞的细胞毒性T淋巴细胞(CD8+ T细胞，细胞毒性淋巴细胞：CTL)，其应用抗原结合的脂质体，并且所述T细胞激活剂用于传染病和癌症的预防或治疗。但是，完全不清楚的是，该方法是否可在实际上有效地预防禽流感病毒感染，和哪类抗原可用于制备有效的细胞毒性T淋巴细胞。
现有技术文献
专利文献
专利文献1: JP-A-2008-37831
发明概述
本发明要解决的问题
本发明的一个目的是提供不太可能受病毒突变影响的、用于有效地预防高致病性禽流感病毒感染的疫苗。
解决问题的手段
本发明人勤勉地进行研究而完成上述目的，并在高致病性禽流感病毒的高度保守的内部蛋白序列中发现了在制备上述细胞毒性T淋巴细胞中尤其有效的抗原表位。而且，本发明人发现，通过用结合了包含该表位的肽的脂质体进行接种疫苗，抗原-特异性细胞毒性T淋巴细胞可以被非常有力地诱导，并开发了本发明。
因此，本发明如下。
[1] 能够诱导HLA-限制性细胞毒性T淋巴细胞的肽，
所述肽包含：
(1) SEQ ID NO:7、3或8中的任一个所示的氨基酸序列，或
(2) SEQ ID NO:7、3或8中的任一个所示的氨基酸序列，其中一个或两个氨基酸被取代，
并具有9至11个氨基酸的长度。
[2] 根据[1]的肽，其中HLA是HLA-A*0201或HLA-A*2402。
[3] 肽结合的脂质体，其中
所述肽包括：
(1) SEQ ID NO:1至9的任一个所示的氨基酸序列，或
(2) SEQ ID NO:1至9的任一个所示的氨基酸序列，其中一个或两个氨基酸被取代，
具有9至11个氨基酸的长度,并且
能够诱导HLA-限制性细胞毒性T淋巴细胞；
其中所述脂质体包括具有带有14至24个碳原子和一个不饱和键的酰基、或带有14至24个碳原子和一个不饱和键的烃基的磷脂，和脂质体稳定剂；并且
其中所述肽与所述脂质体的表面结合。
[4] 根据[3]的肽结合的脂质体，其中所述HLA是HLA-A*0201或HLA-A*2402。
[5] 根据[3]的肽结合的脂质体，其中所述磷脂是具有带有14至24个碳原子和一个不饱和键的酰基的磷脂。
[6] 根据[3]的肽结合的脂质体，其中所述酰基是油酰基。
[7] 根据[3]的肽结合的脂质体，其中所述磷脂是选自下列的至少一种：二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酰甘油、二酰基磷脂酸、二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、琥珀酰亚胺基-二酰基磷脂酰乙醇胺和马来酰亚胺基-二酰基磷脂酰乙醇胺。
[8] 根据[3]的肽结合的脂质体，其中所述脂质体稳定剂是胆固醇。
[9] 根据[3]的肽结合的脂质体，其中所述肽与构成脂质体的磷脂膜中含有的、具有带有14至24个碳原子和一个不饱和键的酰基或带有14至24个碳原子和一个不饱和键的烃基的磷脂结合。
[10] 根据[3]的肽结合的脂质体，其中所述脂质体具有下列组成：
(A) 具有带有14至24个碳原子和一个不饱和键的酰基、或带有14至24个碳原子和一个不饱和键的烃基的磷脂   1至99.8 mol%；
(B) 脂质体稳定剂  0.2至75 mol%。
[11] 根据[3]的肽结合的脂质体，其中所述脂质体具有下列组成：
(I)  具有带有14至24个碳原子和一个不饱和键的酰基、或带有14至24个碳原子和一个不饱和键的烃基的酸性磷脂   1至85 mol%；
(II) 具有带有14至24个碳原子和一个不饱和键的酰基、或带有14至24个碳原子和一个不饱和键的烃基的中性磷脂   0.01至80 mol%；
(III) 具有带有14至24个碳原子和一个不饱和键的酰基、或带有14至24个碳原子和一个不饱和键的烃基的磷脂，带有与其结合的肽  0.2至80 mol%；
(IV) 脂质体稳定剂  0.2至75 mol%。
[12] 细胞毒性T淋巴细胞激活剂，包括肽，
其中所述肽包括：
(1) SEQ ID NO:1至9的任一个所示的氨基酸序列，或
(2) SEQ ID NO:1至9的任一个所示的氨基酸序列，其中一个或两个氨基酸被取代，
具有9至11个氨基酸的长度，并且
能够诱导HLA-限制性细胞毒性T淋巴细胞。
[13] 细胞毒性T淋巴细胞激活剂，其包括根据[3]的肽结合的脂质体。
[14] 根据[12]或[13]的细胞毒性T淋巴细胞激活剂，其进一步包括CpG-DNA。
[15] 禽流感病毒疫苗，其包括肽，
其中所述肽包括：
(1) SEQ ID NO:1至9的任一个所示的氨基酸序列，或
(2) SEQ ID NO:1至9的任一个所示的氨基酸序列，其中一个或两个氨基酸被取代，
具有9至11个氨基酸的长度，并且
能够诱导HLA-限制性细胞毒性T淋巴细胞。
[16] 禽流感病毒疫苗，其包括根据[3]的肽结合的脂质体。
[17] 根据[15]或[16]的禽流感病毒疫苗，其进一步包括CpG-DNA。
[18] 用于细胞毒性T细胞的活化的肽，
其中所述肽包括：
(1) SEQ ID NO:1至9的任一个所示的氨基酸序列，或
(2) SEQ ID NO:1至9的任一个所示的氨基酸序列，其中一个或两个氨基酸被取代，
具有9至11个氨基酸的长度，并且
能够诱导HLA-限制性细胞毒性T淋巴细胞。
[19] 根据[3]的肽结合的脂质体，其用于细胞毒性T细胞的活化。
[20] 药物组合物，其用于细胞毒性T细胞的活化，其包括根据[3]的肽结合的脂质体和CpG-DNA。
[21] 肽，其用于针对禽流感的接种疫苗，
其中所述肽包括：
(1) SEQ ID NO:1至9的任一个所示的氨基酸序列，或
(2) SEQ ID NO:1至9的任一个所示的氨基酸序列，其中一个或两个氨基酸被取代，
具有9至11个氨基酸的长度，并且
能够诱导HLA-限制性细胞毒性T淋巴细胞。
[22] 根据[3]的肽结合的脂质体，其用于针对禽流感的接种疫苗。
[23] 药物组合物，其用于针对禽流感的接种疫苗，其包括根据[3]的肽结合的脂质体和CpG-DNA。
本发明的效果
应用本发明的肽和肽结合的脂质体，可以从衍生自禽流感病毒的高度保守内部蛋白的抗原制备禽流感疫苗。根据本发明，可能提供高度通用的禽流感疫苗，其不同于常规禽流感疫苗且不太可能受到病毒表面蛋白突变的影响，从而消除了对预期要流行的病毒毒株(型或亚型)进行正确估计的需要。
实施本发明的方式
本发明提供了能够诱导HLA-限制性细胞毒性T淋巴细胞的肽，其包括：(1) SEQ ID NO:1至9的任一个所示的氨基酸序列，或(2) SEQ ID NO:1至9的任一个所示的氨基酸序列，其中一个或两个氨基酸被取代，并且具有9至11个氨基酸的长度(本发明的肽)。
本发明已基于高致病性禽流感病毒抗原中下列优异表位序列(本发明的表位序列)的发现而开发：
- SEQ ID NO:1至9的任一个所示的氨基酸序列，
- SEQ ID NO:1至9的任一个所示的氨基酸序列，其中一个或两个氨基酸被取代(此处，由该氨基酸序列构成的肽能够诱导HLA-限制性细胞毒性T淋巴细胞)。
SEQ ID NO:1至9所示的氨基酸序列相当于高致病性禽流感病毒A/Hong_Kong/483/97(H5N1)的内部蛋白PA(SEQ ID NO:2和3)、PB1(SEQ ID NO:1、4、5、6和9)和PB2(SEQ ID NO:7和8)的氨基酸序列中存在的部分序列。
对(2)中的取代方式没有特别限制，只要由该氨基酸序列构成的肽能够诱导HLA-限制性细胞毒性T淋巴细胞即可；反映在不同的禽流感病毒毒株(型或亚型)的相同抗原中的对应表位序列中已发生的已知氨基酸突变的取代方式可作为优选方式而提到。可提到下列作为此种取代的实例。
本发明的表位序列和由该序列构成的肽(本发明的表位肽)具有下列优异特性：
(A) 本发明的表位在禽流感病毒的遗传漂变突变体和转变突变体中是高度保守的。
(B) 本发明的表位肽稳定地存在于人主要组织相容性抗原(HLA)上。尽管对HLA的类型没有特别限制，但本发明的表位肽在对世界上最通常类型的HLA——HLA-A*0201和HLA-A*2402的结合性方面是特别优异的。
(C) 由于具有特性(B)，本发明的表位肽能够有力地诱导HLA(优选地，HLA-A*0201或HLA-A*2402)-限制性细胞毒性T淋巴细胞。“抗原诱导HLA-限制性细胞毒性T淋巴细胞”意味着当用抗原免疫接种表达特定HLA(例如, HLA-A*0201或HLA-A*2402)的哺乳动物(例如，人、转基因小鼠等)时，在该哺乳动物体内，限于HLA且特异性地识别抗原的细胞毒性T淋巴细胞的数目和/或活性(例如, 细胞毒性活性)升高。由于如上所述，HLA-A*0201和HLA-A*2402是世界上最通常的类型，本发明的表位肽能够不论人种差异地在全世界的人中诱导细胞毒性T淋巴细胞，以激活细胞免疫性。根据上述观点，HLA-A*0201-限制性PB1_410: GMFNMLSTV (SEQ ID NO:1)和HLA-A*2402-限制性PA_130: YYLEKANKI (SEQ ID NO:2)、PA_262: KTTPRPLRL (SEQ ID NO:3)、PB1_430: RYTKTTYWW (SEQ ID NO:4)、PB1_482: SYINRTGTF (SEQ ID NO:5)、PB1_688: MYQKCCTLF (SEQ ID NO:6)和PB2_549: TYQWIIRNW (SEQ ID NO:7)的表位是优选的，并且PB1_410: GMFNMLSTV (SEQ ID NO:1)、PA_130: YYLEKANKI (SEQ ID NO:2)、PB1_430: RYTKTTYWW (SEQ ID NO:4)、PB1_688: MYQKCCTLF (SEQ ID NO:6)和PB2_549: TYQWIIRNW (SEQ ID NO:7)是特别优选的。
本发明的肽照原来样子是上述本发明的表位肽，或通过细胞内蛋白酶等的作用进行切割，以产生上述本发明的表位肽。因此，本发明的肽具有与本发明的表位肽基本上相同的优异特性；当用于产生如下述的本发明细胞毒性T淋巴细胞激活剂和禽流感病毒疫苗时，本发明的肽在杀伤感染禽流感病毒的细胞和预防禽流感病毒感染方面表现出优异作用。
对本发明的肽的长度没有特别限制，且通常是9至11个氨基酸、优选地9至10个氨基酸、以及更优选地9个氨基酸。当本发明的肽的长度是10个氨基酸或更多时，本发明的肽在本发明表位序列的N-末端侧和/或C-末端侧具有附加序列。对附加序列的长度和氨基酸序列没有特别限制，只要本发明的肽的上述特性不受影响。例如，附加序列可以是禽流感病毒(例如，高致病性禽流感病毒 A/Hong_Kong/483/97(H5N1))的PA、PB1和PB2 蛋白的氨基酸序列中与SEQ ID NO:1至9的任一个对应的部分序列邻近地实际存在的氨基酸序列。特别优选的是这样的残基：当上述肽在细胞内形成主要组织相容性抗原复合体(MHC)时，其能够克服由于MHC的个人差异(多态性)引起的待呈递的抗原的选择。
在优选的方式中，本发明的肽包括多种(例如，2至9种、优选地5至9种)上述本发明的表位序列。表位序列种类的数目和组合可以任选设定。由于如上所述地，本发明的肽中包括多个本发明的表位序列，本发明的肽诱导细胞毒性T淋巴细胞的潜力增加；当像这样的本发明的肽用于产生禽流感病毒疫苗时，对禽流感病毒感染的预防作用可以大大提高。
本发明的肽可以通过例如用于肽合成的已知技术，诸如液相合成或固相肽合成而制备。可选地，培养掺入能够表达本发明的肽的表达载体的转化体(大肠杆菌(Escherichia coli)等)，并且通过公知的纯化技术诸如亲和柱从培养物中分离本发明的肽，由此可以产生本发明的肽。通过使用公知的基因工程技术，将编码本发明的肽的多核苷酸连接在适当表达载体中的启动子下游，可以构建能够表达本发明的肽的表达载体。
本发明也提供肽结合的脂质体，其为结合有上述本发明肽的脂质体，其中
所述脂质体包括具有带有14至24个碳原子和一个不饱和键的酰基、或带有14至24个碳原子和一个不饱和键的烃基的磷脂，和脂质体稳定剂；并且
其中上述本发明的肽与脂质体的表面结合(本发明的肽结合的脂质体)。
构成本发明的肽结合的脂质体的脂质体部分的磷脂膜具有下列结构，其中作为两性表面活性剂的磷脂形成其极性基团朝向水相侧的界面，且其疏水基朝向界面的对侧。此处，脂质体指具有封闭空间的磷脂双层膜。
本发明的肽能够通过其具有的官能团与脂质体表面结合。作为用于与脂质体表面结合的本发明的肽中的官能团，可以提到氨基、硫羟基、羧基、羟基、二硫基、由具有亚甲基链的烃基(烷基等)构成的疏水基等。这些基团能够允许本发明的肽与脂质体表面结合，对于氨基、硫羟基、羧基、羟基和二硫基是通过共价键结合，对于氨基和羧基是通过离子键结合，以及通过疏水基间的疏水键结合。本发明的肽优选地通过氨基、羧基或硫羟基与脂质体表面结合。
期望地，构成脂质体的磷脂膜具有诸如氨基、琥珀酰亚胺基、马来酰亚胺基、硫羟基、羧基、羟基、二硫基或由具有亚甲基链的烃基(烷基等)构成的疏水基的官能团，从而本发明的肽可通过本发明的肽具有的官能团稳定地与脂质体结合。构成脂质体的磷脂膜具有的官能团优选地是氨基、琥珀酰亚胺基或马来酰亚胺基。与本发明的肽与脂质体的结合有关的、本发明的肽具有的官能团与构成脂质体的磷脂膜具有的官能团的组合可以任选选择，只要本发明的效果不受影响即可；作为优选的组合，可以提到氨基和醛基、氨基和氨基、氨基和琥珀酰亚胺基、硫羟基和马来酰亚胺基等。从易于制备肽结合的脂质体的观点看来，离子键和疏水键是优选的，这是因为肽与脂质体的结合程序方便，并且考虑到本发明的肽在脂质体表面上的结合稳定性或肽结合的脂质体在实际使用中的储存稳定性，共价键是优选的。本发明肽结合的脂质体的特征在于，本发明的肽与脂质体的表面结合，从而成为其组分，由此实现优异的细胞毒性T淋巴细胞活化作用。因此，在实际情况下，考虑到本发明效果的增强，优选地，例如，即使在通过注射行为施用于活的生物之后，本发明的肽也与脂质体的表面稳定地结合。从该观点看来，本发明的肽和脂质体之间的键优选地是共价键。
构成本发明的肽结合的脂质体的脂质体部分的磷脂膜包括：具有带有14至24个碳原子和一个不饱和键的酰基、或带有14至24个碳原子和一个不饱和键的烃基的磷脂，和脂质体稳定剂。
在具有带有14至24个碳原子和一个不饱和键的酰基的磷脂中，酰基的碳原子数优选地是16至22，更优选地是18至22，和最优选地是18。具体而言，作为酰基，可以提到棕榈油酰基、油酰基、芥酰基(erucoyl group)等，且油酰基是最优选的。
在具有带有14至24个碳原子和一个不饱和键的烃基的磷脂中，烃基的碳原子数优选地是16至22，更优选地是18至22，和最优选地是18。具体而言，作为烃基，可以提到十四碳烯基、十六碳烯基、十八碳烯基、C20单烯基、C22单烯基、C24单烯基等。
与磷脂中存在的甘油残基的1-位和2-位结合的不饱和酰基或不饱和烃基可以是相同的或不同的。从工业生产力的观点看来，优选1-位和2-位的基团是相同的。
作为磷脂，优选地应用具有带有14至24个碳原子和一个不饱和键的酰基的磷脂。
本发明的一个目的是有效地和特异性地增加用于杀伤感染了禽流感病毒的细胞的细胞毒性T淋巴细胞(CD8+T细胞，CTL)。考虑到将CTL 活性增强至实际上足够的水平，优选磷脂具有带有14至24个碳原子和一个不饱和键的酰基。如果酰基的碳原子数低于13，那么脂质体稳定性变坏，或CTL活性增强效果在一些情况下不充分。如果酰基的碳原子数超过24，那么脂质体稳定性在一些情况下变坏。
作为具有带有14至24个碳原子和一个不饱和键的酰基、或带有14至24个碳原子和一个不饱和键的烃基的磷脂，可以提到酸性磷脂、中性磷脂、具有能够结合肽的官能团的反应性磷脂和其它种类。根据各种要求，可以就它们的种类和比例而言适当选择。
作为酸性磷脂，可以使用磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰肌醇等。考虑到将CTL 活性增强至实际上足够的水平和工业供给，药物应用质量等，优选地使用具有带有14至24个碳原子和一个不饱和键的酰基的二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酰甘油、二酰基磷脂酸和二酰基磷脂酰肌醇。酸性磷脂将阴离子电离基团赋予脂质体表面，因此将负ζ电势赋予脂质体表面。由于这一原因，脂质体获得基于电荷的排斥力，并且可以在水性溶剂中作为稳定的制剂存在。因此，酸性磷脂在本发明的肽结合的脂质体存在于水性溶剂中时确保脂质体稳定性方面是重要的。
作为中性磷脂，可以使用例如磷脂酰胆碱等。可以就其种类和量而言适当地选择可用于本发明的中性磷脂，只要完成本发明的一个目的——CTL活性增强即可。与酸性磷脂和结合有本发明的肽的磷脂相比，中性磷脂稳定脂质体的功能更高，因而能够改进膜稳定性。从这一观点看来，优选构成本发明的肽结合的脂质体的脂质体部分的磷脂膜包括中性磷脂。倘若用于实现CTL活性增强效果的酸性磷脂、用于肽结合的反应性磷脂和脂质体稳定剂的足够含量得以保证，就可以确定所用的中性磷脂的量。
在本发明的肽结合的脂质体中，本发明的肽通过与构成脂质体的磷脂膜中含有的具有带有14至24个碳原子和一个不饱和键的酰基、或带有14至24个碳原子和一个不饱和键的烃基的磷脂结合而与脂质体的表面结合。
作为用于该肽结合的磷脂，使用具有能够结合本发明的肽的官能团的反应性磷脂。根据各种要求，可以就其种类和比例而言适当地选择具有带有14至24个碳原子和一个不饱和键的酰基、或带有14至24个碳原子和一个不饱和键的烃基的反应性磷脂。与上述磷脂一样，对于反应性磷脂，不希望磷脂中包含的不饱和酰基或不饱和烃基的碳原子数超过24或低于14。
作为反应性磷脂，可以提到磷脂酰乙醇胺或其末端改性衍生物。磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰肌醇和其末端改性衍生物也可用作反应性磷脂。从工业可用性、与本发明的肽结合的步骤的简单性、百分比得率等的观点看来，优选使用磷脂酰乙醇胺或其末端改性衍生物。磷脂酰乙醇胺具有其末端能够结合本发明的肽的氨基。而且，考虑到将CTL 活性增强至实际上足够的水平、脂质体中的稳定性、工业供给、药物应用质量等，最优选地使用具有带有14至24个碳原子和一个不饱和键的酰基的二酰基磷脂酰乙醇胺或其末端改性衍生物。
例如，通过利用二酰基磷脂酰胆碱作为原材料，使用磷脂酶D使胆碱和乙醇胺进行碱交换反应，可以获得二酰基磷脂酰乙醇胺。具体而言，将二酰基磷脂酰胆碱的氯仿溶液和其中溶解了磷脂酶D和乙醇胺的水以适当比例混合，由此可以获得粗反应产物。使用氯仿/甲醇/水性溶剂，在硅胶柱中纯化该粗反应产物，由此可以获得期望的二酰基磷脂酰乙醇胺。本领域技术人员能够使用适当选择的诸如溶剂组成比的柱纯化条件来实施该过程。
作为末端改性衍生物，可以提到通过使二价反应性化合物的一个末端结合到二酰基磷脂酰乙醇胺的氨基而制备的二酰基磷脂酰乙醇胺末端改性衍生物。作为二价反应性化合物，可以利用在其至少一个末端具有能够与二酰基磷脂酰乙醇胺的氨基反应的醛基或琥珀酰亚胺基的化合物。作为具有醛基的二价反应性化合物，可以提到乙二醛、戊二醛、丁二醛、对苯二甲醛等。优选地，可以提到戊二醛，作为具有琥珀酰亚胺基的二价反应性化合物可以提到二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)、乙二醇-双(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)、二琥珀酰亚胺基琥珀酸酯、二琥珀酰亚胺基辛二酸酯、二琥珀酰亚胺基戊二酸酯等。
作为在其一个末端具有琥珀酰亚胺基且在另一末端具有马来酰亚胺基的二价反应性化合物，可以提到N-琥珀酰亚胺基4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯、磺基琥珀酰亚胺基-4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯、N-琥珀酰亚胺基-4-(对-马来酰亚胺基苯基)乙酸酯、N-琥珀酰亚胺基-4-(对-马来酰亚胺基苯基)丙酸酯、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基乙基)-环己烷-1-羧酸酯、磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基乙基)-环己烷-1-羧酸酯、N-(γ-马来酰亚胺基丁酰氧基)琥珀酰亚胺、N-(ε-马来酰亚胺基已酰氧基)琥珀酰亚胺等。使用这些二价反应性化合物，可以获得具有马来酰亚胺基作为官能团的二酰基磷脂酰乙醇胺末端改性衍生物。将如上述的二价反应性化合物的一个末端的官能团与二酰基磷脂酰乙醇胺的氨基结合，由此可以获得二酰基磷脂酰乙醇胺末端改性衍生物。
作为将本发明的肽结合至脂质体表面的方法的一个实例，可以提到下列方法：其中制备包括一个上述反应性磷脂的脂质体，并且然后添加本发明的肽，以使得该肽与脂质体中的反应性磷脂结合。同样地，通过预先将本发明的肽与反应性磷脂结合，并且然后混合如此获得的结合了本发明的肽的反应性磷脂与不同于该反应性磷脂的磷脂和脂质体稳定剂，可以获得本发明的肽与其表面结合的脂质体。将本发明的肽与反应性磷脂结合的方法是本领域公知的。
构成本发明的肽结合的脂质体的脂质体部分的磷脂膜包括至少1种，例如2种或更多种，优选地3种或更多种的具有带有14至24个碳原子和一个不饱和键的酰基、或带有14至24个碳原子和一个不饱和键的烃基的磷脂。
例如，构成本发明的肽结合的脂质体的脂质体部分的磷脂膜包括选自下列的至少1种，例如2种或更多种，优选地3种或更多种的具有带有14至24个碳原子和一个不饱和键的酰基、或带有14至24个碳原子和一个不饱和键的烃基的磷脂：二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酰甘油、二酰基磷脂酸、二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、琥珀酰亚胺基-二酰基磷脂酰乙醇胺和马来酰亚胺基-二酰基磷脂酰乙醇胺。
构成本发明的肽结合的脂质体的脂质体部分的磷脂膜优选地包括下列每一个的至少1种：
酸性磷脂，其具有带有14至24个碳原子和一个不饱和键的酰基、或带有14至24个碳原子和一个不饱和键的烃基，
中性磷脂，其具有带有14至24个碳原子和一个不饱和键的酰基、或带有14至24个碳原子和一个不饱和键的烃基，和
反应性磷脂，其具有带有14至24个碳原子和一个不饱和键的酰基、或带有14至24个碳原子和一个不饱和键的烃基。
在本发明中，作为脂质体稳定剂，可以使用固醇或生育酚。固醇可以是通常称为固醇的那些，例如，可以提到胆固醇、谷固醇、菜油固醇、豆固醇、菜子固醇等；考虑到可用性等，特别优选地使用胆固醇。上述生育酚可以是通常称为生育酚的那些，例如，考虑到可用性等，优选地提到商业可得的α-生育酚。
而且，只要不影响本发明的效果，构成本发明的肽结合的脂质体的脂质体部分的磷脂膜可包括能够构成脂质体的公知的组分。
作为构成本发明的肽结合的脂质体的脂质体部分的磷脂膜的组成的一个实例，可以提到下列：
(A) 具有带有14至24个碳原子和一个不饱和键的酰基、或带有14至24个碳原子和一个不饱和键的烃基的磷脂   1至99.8 mol%;
(B) 脂质体稳定剂   0.2至75 mol%
各组分的含量被表示为相对于构成肽结合的脂质体的脂质体部分的磷脂膜的所有组分的mol%。
从脂质体稳定性的观点看来，上述组分(A)的含量优选地是10至90 mol%，更优选地是30至80 mol%，以及还更优选地是50至70 mol%。
从脂质体稳定性的观点看来，上述组分(B)的含量优选地是5至70 mol%，更优选地是10至60 mol%，以及还更优选地是20至50 mol%。如果稳定剂的含量超过75 mol%，那么脂质体稳定性受到影响，且这是不合需要的。
上述组分(A)包括下列：
(a) 具有带有14至24个碳原子和一个不饱和键的酰基、或带有14至24个碳原子和一个不饱和键的烃基的磷脂，本发明的肽不与其结合，和
(b) 具有带有14至24个碳原子和一个不饱和键的酰基、或带有14至24个碳原子和一个不饱和键的烃基的磷脂，本发明的肽与其结合。
上述组分(a)的含量正常是0.01至85 mol%，优选地0.1至80 mol%，更优选地0.1至60 mol%，还更优选地0.1至50 mol%。
上述组分(b)的含量正常是0.2至80 mol%，优选地0.3至60 mol%，更优选地0.4至50 mol%，以及还更优选地0.5至25 mol%。如果该含量低于0.2 mol%，那么本发明的肽的量降低，从而难以将细胞毒性T淋巴细胞活化至实际上足够的水平；如果该含量超过80 mol%，那么脂质体稳定性降低。
上述组分(a)的磷脂正常包括上述酸性磷脂和中性磷脂。上述组分(b)的磷脂包括上述反应性磷脂。
酸性磷脂的含量正常是1至85 mol%，优选地2至80 mol%，更优选地4至60 mol%，和还更优选地5至40 mol%。如果该含量低于1 mol%，那么ζ电势降低且脂质体稳定性下降，并且难以将细胞毒性T淋巴细胞活化至实际上足够的水平。同时，如果该含量超过85 mol%，那么脂质体中与本发明的肽结合的磷脂含量降低，从而使得难以将细胞毒性T淋巴细胞活化至实际上足够的水平。
中性磷脂的含量正常是0.01至80 mol%，优选地0.1至70 mol%，更优选地0.1至60 mol%，以及还更优选地0.1至50 mol%。如果该含量超过80.0 mol%，那么脂质体中的酸性磷脂、结合有本发明的肽的磷脂和脂质体稳定剂的含量降低，从而难以将细胞毒性T淋巴细胞活化至实际上足够的水平。
通过将本发明的肽与上述反应性磷脂结合，获得结合有本发明的肽的磷脂；可以根据用于结合的官能团的种类、所用的结合处理条件等适当地选择与本发明的肽结合的反应性磷脂比例，只要不妨碍本发明的效果即可。
例如，当通过将二价反应性化合物二琥珀酰亚胺基琥珀酸酯的一个末端与二酰基磷脂酰乙醇胺的末端氨基结合而获得的二酰基磷脂酰乙醇胺的末端改性衍生物用作反应性磷脂时，通过选择结合处理条件，可能将10至99%的反应性磷脂与本发明的肽结合。在该情况下，不与本发明的肽结合的反应性磷脂变为酸性磷脂并包含在脂质体中。
作为构成本发明的肽结合的脂质体的脂质体部分的磷脂膜的一个优选方式，可以提到下列组成：
(I) 具有带有14至24个碳原子和一个不饱和键的酰基、或带有14至24个碳原子和一个不饱和键的烃基的酸性磷脂   1至85 mol%；
(II) 具有带有14至24个碳原子和一个不饱和键的酰基、或带有14至24个碳原子和一个不饱和键的烃基中性磷脂   0.01至80 mol%；
(III) 具有带有14至24个碳原子和一个不饱和键的酰基、或带有14至24个碳原子和一个不饱和键的烃基的磷脂，本发明的肽与其结合   0.2至80 mol%；
(IV) 脂质体稳定剂  0.2至75 mol%。
(总计100 mol%)
作为构成本发明的肽结合的脂质体的脂质体部分的磷脂膜的一个更优选方式，可以提到下列组成：
上述成分 (I)  2至80 mol%
上述成分 (II)  0.1至70 mol%
上述成分 (III) 0.3至60 mol%
上述成分 (IV)  10至70 mol%
(总计100 mol%)
作为构成本发明的肽结合的脂质体的脂质体部分的磷脂膜的一个还更优选的方式，可以提到下列组成：
上述成分 (I)  4至60 mol%
上述成分 (II)  0.1至60 mol%
上述成分 (III) 0.4至50 mol%
上述成分 (IV)  20至60 mol%
(总计100 mol%)
作为构成本发明的肽结合的脂质体的脂质体部分的磷脂膜的一个特别优选方式，可以提到下列组成：
上述成分 (I)  5至40 mol%
上述成分 (II)  0.1至50 mol%
上述成分 (III) 0.5至25 mol%
上述成分 (IV)  25至55 mol%
(总计100 mol%)
本发明的肽结合的脂质体的特征在于，构成其脂质体部分的磷脂膜中的磷脂中含有的不饱和酰基或不饱和烃基具有14至24个碳原子；只要不妨碍本发明的效果，磷脂膜可包括下列磷脂：其包含具有少于14或超过24的碳原子数的不饱和酰基或不饱和烃基。相对于构成本发明的肽结合的脂质体的脂质体部分的磷脂膜中的磷脂中包含的所有不饱和酰基或不饱和烃基的总数，具有14至24个碳原子的不饱和酰基或不饱和烃基的数目比是例如50%或更高，优选地60%或更高，更优选地75%或更高，还更优选地90%或更高，和最优选地97%或更高(例如，基本上100%)。
只要不妨碍本发明的效果，构成本发明的肽结合的脂质体的脂质体部分的磷脂膜可包括具有14至24个碳原子的酰基或烃基的、不同于磷脂的脂质。该脂质的含量正常是40 mol%或更低，优选地20 mol%或更低，更优选地10 mol%或更低，和还更优选地5 mol%或更低(例如，基本上0 mol%)。
本发明的肽结合的脂质体的脂质体部分可以通过下列方法获得：其中将组分(磷脂、反应性磷脂、脂质体稳定剂和本发明的肽等)适当地掺和并加工，并将产品添加到适当的溶剂中，或可以通过其它方法获得。
例如，可以提到下列生产方法，诸如挤出法、涡旋混合器法、超声处理法、表面活性剂去除法、反相蒸发法、乙醇注射法、小泡前（pre-vesicle）法、弗氏压碎（French press）法、W/O/W乳剂法、退火法和冻融法。对脂质体的形式没有特别限制；通过适当地选择前述脂质体生产方法之一，可以产生具有各种尺寸和形式的脂质体，诸如多层脂质体、小单层膜脂质体和大单层膜脂质体。
对脂质体的粒径没有特别限制，但考虑到储存稳定性等，粒径是20至600 nm，优选地 30至500 nm，更优选地40至400 nm，还更优选地 50至300nm，和最优选地70至230 nm。
在本发明中，为了改进脂质体的物理化学稳定性，在制造脂质体期间或之后，可以将糖类或多元醇添加到脂质体的内部水相和/或外部水相。特别地，如果需要长期保存或在制剂制备期间保存，那么优选添加和溶解糖类或多元醇作为脂质体保护剂，并通过冷冻干燥去除水，以获得磷脂组合物的冷冻干燥产物。
作为糖类的实例，可以提到：单糖，诸如葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、肌醇、核糖和木糖；二糖，诸如蔗糖、乳糖、纤维二糖、海藻糖和麦芽糖；三糖，诸如棉子糖和松三糖；寡糖，诸如环糊精；多糖，诸如糊精；糖醇，诸如木糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇和麦芽糖醇(maltitol)等。在这些糖类中，单糖或二糖是优选的，并且考虑到可用性等，葡萄糖或蔗糖是特别优选的。
作为多元醇的实例，可以提到：甘油化合物，诸如甘油、双甘油、三甘油、四甘油、五甘油、六甘油、七甘油、八甘油、九甘油、十甘油和聚甘油；糖醇化合物，诸如山梨糖醇和甘露糖醇；乙二醇、二甘醇、三甘醇、四甘醇、五甘醇、六甘醇、七甘醇、八甘醇、九甘醇等。其中，考虑到可用性，甘油、二甘油、三甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和分子量400至10,000的聚乙二醇是优选的。
基于相对于脂质体液体的按重量计的浓度，内部水相和/或外部水相中含有的糖类或多元醇的浓度例如是按重量计1至20%，优选地按重量计2至10%。
在生产本发明的肽结合的脂质体时，通过制备本发明的肽结合之前的脂质体、然后结合本发明的肽，可能方便地获得本发明的肽结合的脂质体。
例如，制备包含磷脂、脂质体稳定剂和用于将本发明的肽与膜表面结合的反应性磷脂的脂质体悬浮液，并以按重量计约 2至10%向其外部水相中添加前述糖类之一的蔗糖和使其溶解。将该加糖制剂转移到10 ml玻璃小瓶中，放在板架型冷冻干燥器（shelf rack type freeze-drier）中，并冷却至-40℃等以冷冻样品，其后通过常规方法获得冷冻干燥的产品。
此处获得的脂质体的冷冻干燥的产品因为去除了水而可以长时间保存，通过在需要时添加本发明的特定的肽并实施随后的步骤，可以方便和迅速地获得完成的本发明的肽结合的脂质体。如果本发明的肽和脂质体之间的相互作用强且不稳定性严重等，那么如此处所述地在冷冻干燥的产品阶段保存该脂质体和在需要时在使用前结合本发明的肽是非常方便的。
构成本发明的肽结合的脂质体的脂质体部分的磷脂膜可以具有结合有本发明的肽的磷脂。作为获得含有结合有本发明的肽的磷脂的脂质体的方法，可以提到下列方法(A)和(B)。
(A) 方法，其中制备含有磷脂、反应性脂质和脂质体稳定剂的脂质体，向其中添加本发明的肽和二价反应性化合物，并通过二价反应性化合物连接脂质体中含有的反应性磷脂的官能团和本发明的肽的官能团。此处使用的二价反应性化合物可以与用于制备反应性磷脂的末端改性衍生物的那些相同。具体而言，作为具有醛基的二价反应性化合物，可以提到乙二醛、戊二醛、丁二醛、对苯二甲醛等。优选地，可以提到戊二醛。而且，作为具有琥珀酰亚胺基的二价反应性化合物，可以提到二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)、乙二醇-双(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)、二琥珀酰亚胺基琥珀酸酯、二琥珀酰亚胺基辛二酸酯或二琥珀酰亚胺基戊二酸酯等。作在一个末端具有琥珀酰亚胺基且在另一末端具有马来酰亚胺基的二价反应性化合物，可以使用N-琥珀酰亚胺基-4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯、磺基琥珀酰亚胺基-4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯、N-琥珀酰亚胺基-4-(对-马来酰亚胺基苯基)乙酸酯、N-琥珀酰亚胺基-4-(对-马来酰亚胺基苯基)丙酸酯、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基乙基)-环己烷-1-羧酸酯、磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基乙基)-环己烷-1-羧酸酯、N-(γ-马来酰亚胺基丁酰氧基)琥珀酰亚胺、N-(ε-马来酰亚胺基已酰氧基)琥珀酰亚胺等。使用这样的二价反应性化合物，获得具有马来酰亚胺基作为官能团的反应性磷脂(例如, 磷脂酰乙醇胺)的末端改性衍生物。
(B) 方法，其中制备含有磷脂、反应性磷脂和脂质体稳定剂的脂质体，向其中添加本发明的肽，并连接和结合脂质体中包含的反应性磷脂的官能团和本发明的肽的官能团。
作为前述(A)和(B)中键的种类的实例，可以提到离子键、疏水键、共价键等，并且该键优选地是共价键。而且，作为共价键的具体实例可以提到席夫碱键、酰胺键、硫醚键、酯键等。
这两种方法都使得能够将本发明的肽结合到构成脂质体的磷脂膜中包含的反应性磷脂，从而导致脂质体中形成结合有本发明的肽的磷脂。
作为将原材料脂质体与本发明的肽通过二价反应性化合物结合的方法的具体实例，在前述方法(A)中，可以提到使用席夫碱键的方法。作为将脂质体与本发明的肽通过席夫碱键结合的方法，可以提到下列方法，其中制备在其表面上具有氨基的脂质体，将本发明的肽添加到脂质体悬浮液，然后将二醛作为二价反应性化合物添加，并且通过席夫碱结合脂质体表面上的氨基和本发明的肽中的氨基。
作为该结合程序的具体实例，可以提到下列方法。
(A-1) 为了获得在其表面具有氨基的脂质体，将具有带有14至24个碳原子和一个不饱和键的酰基、或带有14至24个碳原子和一个不饱和键的烃基的反应性磷脂(例如磷脂酰乙醇胺)与脂质体原材料脂质(磷脂、脂质体稳定剂等)混合以制备脂质体，其中特定量的氨基存在于脂质体表面上。
(A-2) 将本发明的肽添加到脂质体悬浮液。
(A-3) 随后，添加作为二价反应性化合物的戊二醛，并允许反应进行特定时间，以在脂质体和本发明的肽之间形成席夫碱键。
(A-4) 其后，为了灭活过量戊二醛的反应性，将甘氨酸作为含有氨基的水溶性化合物添加到脂质体悬浮液以引起反应。
(A-5) 通过诸如凝胶过滤、透析、超滤或离心的方法去除未与脂质体结合的本发明的肽部分、戊二醛和甘氨酸的反应产物和过量的甘氨酸，以得到本发明的肽结合的脂质体悬浮液。
作为上述方法(B)的具体实例，可以提到下列方法，其中将具有能够形成酰胺键、硫醚键、席夫碱键、酯键等的官能团的反应性磷脂引入构成脂质体的磷脂膜。作为官能团的具体实例，可以提到琥珀酰亚胺基、马来酰亚胺基、氨基、亚氨基、羧基、羟基、硫羟基等。
作为要引入构成脂质体的磷脂膜的反应性磷脂的一个实例，可以使用前述具有带有14至24个碳原子和一个不饱和键的酰基、或带有14至24个碳原子和一个不饱和键的烃基的反应性磷脂(例如，磷脂酰乙醇胺)在其氨基末端被改性的末端改性衍生物。
下文中参考其中使用二酰基磷脂酰乙醇胺的情况来描述该结合程序的具体实例。
(B-1) 用已知的方法使具有带有14至24个碳原子和一个不饱和键的酰基的二酰基磷脂酰乙醇胺和二琥珀酰亚胺基琥珀酸酯仅在一个末端反应，以产生在末端具有琥珀酰亚胺基作为官能团的二琥珀酰亚胺基琥珀酸酯-结合的二酰基磷脂酰乙醇胺。
(B-2) 通过公知方法混合前述二琥珀酰亚胺基琥珀酸酯-结合的二酰基磷脂酰乙醇胺和其它脂质体组分(磷脂，脂质体稳定剂等)，以制备在其表面具有琥珀酰亚胺基作为官能团的脂质体。
(B-3) 将本发明的肽添加到前述脂质体悬浮液，以允许本发明的肽中的氨基和脂质体表面上的琥珀酰亚胺基彼此反应。
(B-4) 通过诸如凝胶过滤、透析、超滤或离心的方法，去除未反应的本发明的肽部分、反应副产物等，以产生含有结合有本发明的肽的磷脂的脂质体悬浮液。
当脂质体和本发明的肽结合时，在实践上优选的是，将通常作为官能团被包含的氨基或硫羟基作为对象。当氨基是对象时，可以通过与琥珀酰亚胺基反应而形成席夫碱键。当硫羟基是对象时，可以通过与马来酰亚胺基反应而形成硫醚键。
使用本发明的肽或肽结合的脂质体，可能有力地诱导以HLA(优选地 HLA-A*0201或HLA-A*2402)-限制性和特异性方式识别本发明的肽(优选地，本发明的表位肽)的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。本发明的肽或肽结合的脂质体诱导的细胞毒性T淋巴细胞杀伤由于感染了禽流感病毒而在HLA上递呈本发明的肽的细胞，并除去这些细胞。因此，本发明的肽和肽结合的脂质体用作细胞毒性T淋巴细胞激活剂或禽流感病毒疫苗。
如上所述，本发明的肽包括在禽流感病毒的遗传漂变突变体和转变突变体中高度保守的表位。因此，本发明的肽和肽结合的脂质体用作多种类型[(H1至H16)X(N1至N9)]的禽流感病毒的疫苗，并且对高致病性禽流感病毒(H5N1型)特别有效。本发明的肽和肽结合的脂质体也用作各种突变体的疫苗。
当本发明的肽或肽结合的脂质体用作细胞毒性T淋巴细胞激活剂或禽流感病毒疫苗时，可以根据常规方法将其制成制剂。本发明的肽或肽结合的脂质体是低毒性的，且可以作为原样液体或作为合适剂型的药物组合物经口或肠胃外(例如，血管内施用、皮下施用等)施用于人、非人哺乳动物(例如大鼠、兔、羊、猪、牛、猫、狗、猴等)、鸟类(鸡、鹅、家鸭、鸵鸟、鹌鹑等)。作为本发明的肽或肽结合的脂质体的施用受试者的动物正常是可以感染靶禽流感病毒的哺乳动物或鸟类。本发明的肽或肽结合的脂质体正常肠胃外施用。
本发明的细胞毒性T淋巴细胞激活剂和禽流感病毒疫苗可以作为活性成分肽或肽结合的脂质体照原来样子施用，或可以作为适当的药物组合物施用。用于施用的药物组合物可包括上述肽或肽结合的脂质体和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。这种药物组合物作为适于经口或肠胃外施用的剂型而提供。
作为肠胃外施用的组合物的实例，使用注射剂、栓剂等；注射剂可包括诸如静脉内注射剂、皮下注射剂、皮内注射剂、肌内注射剂和点滴注射注射剂的剂型。这种注射剂可以根据已知的方法制备。注射剂可以通过例如将上述肽或肽结合的脂质体溶解或悬浮在正常用于注射剂的无菌水性溶剂而制备。作为用于注射的水性溶剂的实例，可以使用蒸馏水、生理盐水、缓冲液诸如磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、tris缓冲液和乙酸盐缓冲液等。水性溶剂的pH是5至10，优选地6至8。制备的注射液体优选地填充在适当的安瓿中。
另外，通过对本发明的肽的溶液或本发明的肽结合的脂质体的悬浮液进行诸如真空干燥或冷冻干燥的处理，也可以制备本发明的肽或本发明的肽结合的脂质体的粉末制剂。本发明的肽或本发明的肽结合的脂质体可以在粉末状态下保存，并且可以通过在使用前将粉末分散在水性溶剂中用于新近注射而供给使用。
为了增强其效果，本发明的细胞毒性T淋巴细胞激活剂和禽流感病毒疫苗可进一步包括佐剂。作为佐剂，可以提到氢氧化铝凝胶、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)佐剂、聚肌胞苷酸(poly(I,C))、CpG-DNA等，并且CpG-DNA是特别优选的。CpG-DNA是包含细菌非甲基化CpG基序的DNA，已知其作为特定受体(Toll-样受体9)的配体起作用(细节参见Biochim. Biophys. Acta 1489, 107-116 (1999)和Curr. Opin. Microbiol. 6, 472-477 (2003))。CpG-DNA能够通过活化树突细胞(DC)而增强本发明的肽或肽结合的脂质体对细胞毒性T淋巴细胞的诱导。
药物组合物中活性成分(本发明的肽或肽结合的脂质体)的含量正常是相对于全部药物组合物按重量计约 0.1至100%，优选地按重量计约1至99%，以及还更优选地按重量计约10至90%。
如果本发明的细胞毒性T淋巴细胞激活剂或禽流感病毒疫苗包括佐剂，那么佐剂(例如，CpG-DNA)的含量可以适当地设定，只要可以增强细胞毒性T淋巴细胞的诱导即可，并且该含量正常是相对于全部药物组合物按重量计约 0.01至10%，优选地按重量计约 0.1至5%。
本发明的肽或本发明的肽结合的脂质体的剂量依赖于施用受试者、施用方法、剂型等而变化；例如，在通过皮下施用或经鼻施用活化活的生物内的细胞毒性T淋巴细胞的情况下，给予的剂量范围正常是，对每一成年人(体重60 kg)，基于本发明的肽每次施用1 μg至1000 μg，优选地 20 μg至100 μg，正常持续4周至18个月，2至3次。在通过皮下施用预防禽流感病毒感染的情况下，给予的剂量范围正常是，基于本发明的肽每次施用1 μg至1000 μg，优选地 20 μg至100 μg，正常持续4周至18个月，2至3次。
实施例
在下文中参考下列实施例对本发明进行更详细地描述，但本发明不以任何方式受到限制。
[实施例 1]
CTL表位的检索
从高致病性禽流感病毒A/Hong_Kong/483/97 (H5N1)毒株的8 种病毒内部蛋白(M1、M2、NP、NS1、NS2、PA、PB1、PB2)的氨基酸序列，检索预期与人主要组织相容性抗原复合体(MHC)I类分子HLA-A*0201或HLA-A*2402结合以表现出对杀伤T细胞(CTL)的抗原性的表位，所述检索使用可在因特网上得到的下列4 种评价程序。
在每一程序预期表现表位活性的41 种候选肽中，选择了：
；
合成这些肽之后，测量用每一肽免疫接种所诱导的CTL活性。
[实施例 2]
脂质体的制备
1) 混合脂质粉末的制备
由末端改性磷脂酰乙醇胺(琥珀酰亚胺基-二油酰磷脂酰乙醇胺)构成的反应性磷脂的合成
将2 g二油酰磷脂酰乙醇胺和180 μl三乙胺添加到和溶解于50 ml氯仿中，并将该溶液置于300 ml容量的四口瓶中。于室温用磁力搅拌器搅动该瓶时，根据常规方法通过在4小时期间滴下而滴加单独制备的作为二价反应性化合物的3 g二琥珀酰亚胺基辛二酸酯在80 ml氯仿中的溶液，以允许二琥珀酰亚胺基辛二酸酯的一个末端与二油酰磷脂酰乙醇胺的氨基反应。将该粗反应溶液转移到茄子型瓶中，并使用蒸发器将溶剂蒸出。然后，将足以溶解粗反应产物的少量氯仿添加到该瓶，以获得高浓度粗反应溶液，并使用之前用氯仿/甲醇/水(65/25/1，体积比)平衡的硅胶根据常规方法进行柱层析；仅回收所需的级分，其中二琥珀酰亚胺基辛二酸酯的一个末端与二油酰磷脂酰乙醇胺的氨基结合，并且将溶剂蒸出以产生作为所需的反应性磷脂的琥珀酰亚胺基-二油酰磷脂酰乙醇胺。
2) 混合脂质粉末的制备
将1.3354 g (1.6987 mmol)的二油酰磷脂酰胆碱、0.2886 g (0.2831 mmol)的前述部分中制备的琥珀酰亚胺基-二油酰磷脂酰乙醇胺、0.7663 g(1.9818 mmol)的胆固醇和0.4513 g(0.5662 mmol)的二油酰磷脂酰甘油钠装在茄子型瓶中，在其中放置50 ml的氯仿/甲醇/水混合溶剂(65/25/4，体积比)，且将内容物在40℃溶解。然后，使用旋转蒸发器在减压下蒸出溶剂，以产生脂质膜。另外，添加30 ml注射用蒸馏水，随后搅动以产生均一的浆。冷冻该浆并在冷冻干燥器中干燥24小时，以产生混合的脂质粉末。
3) 脂质体的制备
然后，将60 ml单独制备的缓冲液(1.0mM Na2HPO4/KH2PO4，0.25M蔗糖，pH 7.4，此后简写成缓冲液)放在含有上述混合的脂质粉末的茄子型瓶中，并且伴随在40℃的搅动而水合脂质，以产生脂质体。随后，应用挤出机调整脂质体的粒径。首先，将脂质体通过8 μm聚碳酸酯滤器，且随后按此顺序通过5 μm、3 μm、1 μm、0.65 μm、0.4 μm和0.2 μm滤器。获得平均粒径为206 nm(通过动态光散射方法测量)的脂质体颗粒。
[实施例 3]
脂质体制剂的制备
将1.5 ml实施例2(脂质体的制备)的脂质体装在试管中，添加3 ml单独制备的各肽溶液(1.25 mM，缓冲液溶液)，并在其后于5℃轻柔搅动溶液48小时以允许反应。通过常规方法，使用之前用缓冲液平衡的Sepharose CL-4B，使将该反应液体进行凝胶过滤。由于脂质体级分是白色混浊的，所以可容易地鉴定所需的级分，但UV检测器等可用于鉴定。
测量由此获得的脂质体悬浮液中的磷浓度(Phospholipid Test Wako)，并通过用缓冲液稀释悬浮液来调整来自磷脂的磷浓度至2mM，以产生各肽结合的脂质体的悬浮液。
[实施例 4]
CTL 活性的检测
由于重视体内诱导杀伤活性的潜能，通过下述方法进行肽活性的检测。首先，用与油酸脂质体结合的各候选肽(0.5 μg/μl，以200 μl/动物施用)和CpG5002(5’-TCCATGACGTTCTGATGTT-3’(SEQ ID NO:23)；细节参见Vaccine 25, 4914-4921 (2007))(10 μ/动物)，以1-周时间间隔2次免疫接种不具有小鼠固有的MHC I类分子(H2-D和H2-K)和对于SEQ ID NO:1的肽表达HLA-A*0201分子的小鼠(HHD小鼠)、以及不具有小鼠固有的MHC I类分子(H2-D和H2-K)和对于SEQ ID NO:2和超过SEQ ID NO:2的肽表达HLA-A*2402分子的转基因小鼠(A24Tg)。末次免疫接种之后6天，用免疫肽(0.5 μM)和荧光染料(CFDA-SE)标记的靶细胞(A24Tg小鼠脾细胞，5X105个细胞/动物)与对照一起静脉内施用；16小时后，对动物实施安死术，其后回收脾，并用流式细胞仪分析其中靶细胞的百分比减少。
脾贴壁细胞(SAC)及CD4+和CD8+ T细胞的制备
使用含10% FCS的RPMI-1640制备脾细胞悬浮液。将 5 ml含10% FCS的培养基中的细胞(5 X 107个细胞)铺平板在50 mm塑料组织培养皿(No.#3002; BectonDickinson Labware, Franklin Lakes, NJ)上，并在潮湿的5% CO2气氛中于37℃温育2小时。培养之后，通过在温暖的培养基中轻柔洗涤而去除非贴壁细胞，然后使用细胞刮棒回收贴壁细胞。通过磁力细胞分选仪系统MACS，按照制造商的规程，使用抗-CD4和抗-CD8 抗体-包被的微珠(microbead)(Miltenyi Biotec GmbH)，进行对来自用各肽-明矾免疫接种的小鼠的脾细胞(SC)的CD4+和CD8+ T 细胞的纯化。将T细胞以2 X 106 ml的细胞密度悬浮于含10% FCS的RPMI-1640中。
体内细胞毒性测定(CTL 活性的测量)
用0.5或5 μM CFDA-SE(Sigma)于室温标记上述小鼠脾细胞15分钟，并洗涤2次。然后，于37℃用0.5 μg/ml的各肽脉冲具有亮CFDA-SE的细胞(M2)90分钟。于37℃用无关NP366-374 (ASNENMDAM)肽脉冲作为对照的具有暗CFDA-SE的细胞(M1)90分钟。以1:1比例混合细胞，将总共5X106个细胞静脉内注射到小鼠中，所述小鼠在1至2周前已接受100 μg的抗-IL-10单克隆抗体 2A5、5 μg的CpG5002和各肽结合的脂质体的注射。8小时后，从各小鼠回收脾细胞并通过流式细胞术分析。用各肽脉冲的级分的荧光标记的脾细胞的减少程度充当CTL活性的指标。如果CTL在用各肽结合的脂质体免疫接种的小鼠中被诱导，那么只有用各肽脉冲的级分的荧光标记的脾细胞消失。
结果
下文中示出表现一些活性的肽和其筛选结果。
表1
在通过检索选择的肽中，PB1_410: GMFNMLSTV (SEQ ID NO:1)、PA_130: YYLEKANKI (SEQ ID NO:2)、PA_262: KTTPRPLRL (SEQ ID NO:3)、PB1_430: RYTKTTYWW (SEQ ID NO:4)、PB1_482: SYINRTGTF (SEQ ID NO:5)、PB1_688: MYQKCCTLF (SEQ ID NO:6)、PB2_549: TYQWIIRNW (SEQ ID NO:7)、PB2_322: SFSFGGFTF (SEQ ID NO:8)和PB1_216: SYLIRALTL (SEQ ID NO:9)表现高CTL活性，而M2_40: LWILDRLFF (SEQ ID NO:16)、PB2_117: TYFEKVERL (SEQ ID NO:17)、PB1_331: EWFRNVLSI (SEQ ID NO:18)、PA_8: CFNPMIVEL (SEQ ID NO:19)、NP_257: IFLARSALI (SEQ ID NO:20)、NP_481: MSNEGSYFF (SEQ ID NO:21)和M2_2: SLLTEVETL (SEQ ID NO:22)表现低活性。
[实施例 5]
细胞内细胞因子染色如J Virol 78, 9093-9104 (2004)中所述地进行。下列各肽(PB1_410、PA_130、PB1_430、PB2_549)(0.7 μg/μl, 50 μl)或根据实施例3产生的肽结合的脂质体(50 μl)在5 μg CpG存在下fp-施用。1周后，对动物实施安死术，回收脾，并在布雷菲尔德菌素A(GolgiPlugTM, BD Biosciences, San Jose, CA)存在下于37℃将脾细胞(2×106)与10 μM各肽(PB1_410、PA_130、PB1_430、PB2_549)温育5小时。用大鼠抗小鼠CD16/CD32单克隆抗体(Fc BlockTM,BD Biosciences)封闭Fc受体，并用FITC-缀合的大鼠抗小鼠CD8α单克隆抗体(BD Biosciences)于4℃染色细胞30分钟。然后固定细胞，增强其透性，并用藻红蛋白(PE)-缀合的大鼠抗小鼠干扰素γ (IFN-γ)单克隆抗体(BD Biosciences)染色细胞。洗涤细胞并对其进行细胞计量术分析。
结果
染色结果在下文中示出。
表2
用与脂质体结合的各肽免疫接种小鼠，由此高效地诱导抗原-特异性CD8+细胞。特别地，PB2_549的抗原-特异性CD8+细胞-诱导能力是极高的。上述结果已证实本发明的肽结合的脂质体的优异抗原-特异性CD8+细胞-诱导作用。当肽PB1_410、PA_130和PB1_430各自用于免疫接种而不结合脂质体时，抗原特异性CD8+细胞几乎不诱导。然而，当 PB2_549用于免疫接种而不结合脂质体时，可证实大大超过其他肽的作用的显著的抗原特异性CD8+细胞-诱导作用。
[实施例 6]
病毒感染抗性试验如下进行。以与实施例 3中相同的方式和使用二琥珀酰亚胺基辛二酸酯-二油酰磷脂酰乙醇胺 (DSS-Ole)，将DDW中的PA_130和PB2_549(各5 mg)偶联于脂质体。在5 μg CpG存在下fp施用肽结合的脂质体(50 μl或100 μl/每只小鼠)。1周后，通过腹膜内注射氯胺酮(175 mg/g体重，Sigma-Aldrich)和赛拉嗪(3.5 mg/g体重，Bayer Holding Ltd., Tokyo, 日本)麻醉小鼠，并且以10000 PFU/小鼠鼻内施用在PBS (40 μl)中重悬浮的H3N2(A/Uruguay)病毒。通过在病毒接种后5天对小鼠实施安死术、以及如Cottey R, Rowe CA, Bender BS (2001) Influenza Virus. In Current Protocols in Immunology. John Wiley & Sons, Inc. 19.11.1-19.11.32所述用MDCK 细胞测定TCID50而获得肺中的病毒效价，来测定病毒效价。即，肺在PBS(1 ml)中匀浆，且匀浆于2,000 rpm离心10分钟，以引起破碎片的沉淀。然后，在具有U形底的96孔板中制备匀浆的10-倍稀释系列，1次稀释5个孔。稀释系列用含5% FCS的DMEM从10-1制备到至10-7。将D-5中的MDCK细胞添加到各孔(2.5×104个细胞/孔)并使板于35℃、5% CO2温育。1日后，各孔中的培养基交换为含2 μg/ml乙酰化胰蛋白酶(Sigma-Aldrich)的DMEM，并且使板在CO2培养箱中于35℃再温育4日。将PBS中的0.5%鸡红细胞悬浮液(50 μl)添加到各孔，观察各样品的凝固模式，并计算TCID50(细节参见Cottey R, Rowe CA, Bender BS (2001) Influenza Virus.  In Current Protocols in Immunology. John Wiley & Sons, Inc. 19.11.1-19.11.32)，由此确定病毒效价。各实验组含有5只小鼠。该测定的检出限是103 TCID50/小鼠。
结果
感染抗性试验结果在下文示出。
表3
通过用任一肽结合的脂质体进行免疫接种来证实高病毒感染抑制作用。尽管所用的肽衍生自高致病性禽流感病毒A/Hong_Kong/483/97(H5N1)，但如上所述的高效感染抑制作用也针对亚型不同的H3N2病毒而显示。因此，本发明的肽结合的脂质体作为流行前疫苗的作用得以证实。
工业实用性
根据本发明，可能提供针对有可能引起流行病的高致病性禽流感病毒的高效疫苗，该疫苗不太可能受到其表面蛋白突变的影响。根据本发明的禽流感疫苗，可能提供新颖的流行前疫苗，所述疫苗克服了目前可得的流行前疫苗的缺陷，所述缺陷是其作用在实际流行的毒株(型/亚型)不同于预期的毒株的情况下受到限制。
本发明基于2008年11月28日提交的JP专利申请号2008-303444，其内容全部包含在本说明书中。
                                                                         序列表
 
<110>  JAPAN AS REPRESENTED BY THE DIRECTOR-GENERAL OF NATIONAL INSTITUTE
             OF INFECTIOUS DISEASES
             NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION HOKKAIDO UNIVERSITY
             SAITAMA MEDICAL UNIVERSITY
             NOF CORPORATION
 
<120>  禽流感疫苗
 
<130>  091488
 
<150>  JP2008-303444
<151>  2008-11-28
 
<160>  23   
 
<170>  PatentIn version 3.1
 
<210>  1
<211>  9
<212>  PRT
<213>  高致病性禽流感病毒A/Hong_Kong/483/97(H5N1)
 
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<213>  高致病性禽流感病毒A/Hong_Kong/483/97(H5N1)
 
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<213>  高致病性禽流感病毒A/Hong_Kong/483/97(H5N1)
 
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<213>  高致病性禽流感病毒A/Hong_Kong/483/97(H5N1)
 
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<213>  高致病性禽流感病毒A/Hong_Kong/483/97(H5N1)
 
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<213>  高致病性禽流感病毒A/Hong_Kong/483/97(H5N1)
 
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<213>  高致病性禽流感病毒A/Hong_Kong/483/97(H5N1)
 
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<213>  禽流感病毒A/Moscow(H3N2)
 
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<213>  禽流感病毒A/Moscow(H3N2)
 
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<213>  高致病性禽流感病毒A/Hong_Kong/483/97(H5N1)
 
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<213>  高致病性禽流感病毒A/Hong_Kong/483/97(H5N1)
 
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<213>  高致病性禽流感病毒A/Hong_Kong/483/97(H5N1)
 
<400>  19
 
Cys Phe Asn Pro Met Ile Val Glu Leu
1                         5                  
 
 
<210>  20
<211>  9
<212>  PRT
<213>  高致病性禽流感病毒A/Hong_Kong/483/97(H5N1)
 
<400>  20
 
Ile Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Ile
1                       5                  
 
 
<210>  21
<211>  9
<212>  PRT
<213>  高致病性禽流感病毒A/Hong_Kong/483/97(H5N1)
 
<400>  21
 
Met Ser Asn Glu Gly Ser Tyr Phe Phe
1                         5                   
 
 
<210>  22
<211>  9
<212>  PRT
<213>  高致病性禽流感病毒A/Hong_Kong/483/97(H5N1)
 
<400>  22
 
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Leu
1                         5                  
 
 
<210>  23
<211>  19
<212>  DNA
<213>  人工的
 
<220>
<223>  合成的寡核苷酸
 
<400>  23
tccatgacgt tctgatgtt                                                 19

Claims (21)

1.能够诱导HLA-限制性细胞毒性T淋巴细胞的肽，
所述肽由SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列组成。
2.肽结合的脂质体，其中
所述肽由SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列组成；
其中所述脂质体包括具有带有14至24个碳原子和一个不饱和键的酰基、或带有14至24个碳原子和一个不饱和键的烃基的磷脂，和脂质体稳定剂；并且
其中所述肽与所述脂质体的表面结合。
3.权利要求2所述的肽结合的脂质体，其中所述磷脂是具有带有14至24个碳原子和一个不饱和键的酰基的磷脂。
4.权利要求2所述的肽结合的脂质体，其中所述酰基是油酰基。
5.权利要求2所述的肽结合的脂质体，其中所述磷脂是选自下列的至少一种：二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酰甘油、二酰基磷脂酸、二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、琥珀酰亚胺基-二酰基磷脂酰乙醇胺和马来酰亚胺基-二酰基磷脂酰乙醇胺。
6.权利要求2所述的肽结合的脂质体，其中所述脂质体稳定剂是胆固醇。
7.权利要求2所述的肽结合的脂质体，其中所述肽与构成所述脂质体的磷脂膜中含有的、具有带有14至24个碳原子和一个不饱和键的酰基或带有14至24个碳原子和一个不饱和键的烃基的磷脂结合。
8.权利要求2所述的肽结合的脂质体，其中所述脂质体具有下列组成：
(A) 具有带有14至24个碳原子和一个不饱和键的酰基、或带有14至24个碳原子和一个不饱和键的烃基的磷脂   1至99.8 mol%；
(B) 脂质体稳定剂  0.2至75 mol%。
9.权利要求2所述的肽结合的脂质体，其中所述脂质体具有下列组成：
(I)  具有带有14至24个碳原子和一个不饱和键的酰基、或带有14至24个碳原子和一个不饱和键的烃基的酸性磷脂   1至85 mol%；
(II) 具有带有14至24个碳原子和一个不饱和键的酰基、或带有14至24个碳原子和一个不饱和键的烃基的中性磷脂   0.01至80 mol%；
(III) 具有带有14至24个碳原子和一个不饱和键的酰基、或带有14至24个碳原子和一个不饱和键的烃基的磷脂，带有与其结合的肽  0.2至80 mol%；
(IV) 脂质体稳定剂  0.2至75 mol%。
10.细胞毒性T淋巴细胞激活剂，包括肽，
其中所述肽由SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列组成。
11.细胞毒性T淋巴细胞激活剂，其包括权利要求2所述的肽结合的脂质体。
12.权利要求10或11所述的细胞毒性T淋巴细胞激活剂，其进一步包括CpG-DNA。
13.禽流感病毒疫苗，其包括肽，
其中所述肽由SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列组成。
14.禽流感病毒疫苗，其包括权利要求2所述的肽结合的脂质体。
15.权利要求13或14所述的禽流感病毒疫苗，其进一步包括CpG-DNA。
16.肽在生产用于细胞毒性T细胞的活化的试剂中的用途，
其中所述肽由SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列组成。
17.权利要求2所述的肽结合的脂质体在生产用于细胞毒性T细胞的活化的试剂中的用途。
18.权利要求2所述的肽结合的脂质体和CpG-DNA在生产用于细胞毒性T细胞的活化的药物组合物中的用途。
19.肽在生产用于针对禽流感的接种疫苗的试剂中的用途，
其中所述肽由SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列组成。
20.权利要求2所述的肽结合的脂质体在生产用于针对禽流感的接种疫苗的试剂中的用途。
21.权利要求2所述的肽结合的脂质体和CpG-DNA在生产用于针对禽流感的接种疫苗的药物组合物中的用途。
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