WO2010060282A1 - Mm9作为卵巢癌的诊断标记物的用途 - Google Patents

Mm9作为卵巢癌的诊断标记物的用途 Download PDF

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WO2010060282A1
WO2010060282A1 PCT/CN2009/001339 CN2009001339W WO2010060282A1 WO 2010060282 A1 WO2010060282 A1 WO 2010060282A1 CN 2009001339 W CN2009001339 W CN 2009001339W WO 2010060282 A1 WO2010060282 A1 WO 2010060282A1
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mmp
antibody
ovarian cancer
sample
kit
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PCT/CN2009/001339
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林标扬
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浙江大学
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    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57449—Specifically defined cancers of ovaries
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
    • G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
    • G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96486—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • G01N2333/96491—Metalloendopeptidases (3.4.24) with definite EC number
    • G01N2333/96494—Matrix metalloproteases, e. g. 3.4.24.7

Definitions

  • MMP9 as a diagnostic marker for ovarian cancer
  • the invention belongs to the field of biomedical technology.
  • the present invention relates to a method for improving the accuracy of sample classification, and a kit for detecting MMP-9 protein in a sample. Background technique
  • EOC Epithelial ovarian cancer
  • the present invention is based in part on the following findings: in sera of ovarian cancer patients
  • the MMP-9 content is significantly higher than the MMP-9 content in the serum of healthy subjects, and is statistically significant and can be used as a diagnostic marker for ovarian cancer. Accordingly, the present invention provides the following embodiments.
  • Embodiment 1 A method of diagnosing ovarian cancer in a subject, comprising: detecting a content of MMP-9 in a sample from a subject,
  • Whether the subject has ovarian cancer is determined based on the analysis result.
  • the samples are classified according to the analysis results.
  • Embodiment 3 A method for diagnosis, prognosis evaluation, treatment effect monitoring or course monitoring of ovarian cancer in a subject, comprising: detecting expression of MMP-9 in a blood sample of the subject.
  • kits of claim 14 further comprising: a labeled antibody capable of binding to MMP-9.
  • An antibody marker for detection that can bind to an antibody to form a conjugate.
  • An optional carrying tool the space of which is optionally divided into compartment-defining components; optionally an auxiliary reagent selected from the group consisting of a color developer, an enzyme inhibitor, a buffer, a stabilizer, a diluent, and a wash reagent ; with
  • a method for improving the accuracy of sample classification which comprises:
  • the content of MMP-9 and the content of MMP-9 in the sample were measured in time.
  • the change of MMP-9 content in time was used as a variable, and the ROC curve was drawn according to the sensitivity and specificity of cancer diagnosis. And calculate the area under the curve AUC;
  • Samples were classified according to AUC values, sensitivity, and specificity.
  • ROC curve interface for MMP-9 detection of a patient's serum sample.
  • specificity refers to specificity
  • sensitivity refers to sensitivity.
  • MMP-9 Matrix Metalloproteinase-9, which is meant to be either or otherwise known.
  • subject refers to any mammal, for example, a mouse, a rat, a rabbit, a dog, a cow, especially a primate, such as a human. In some preferred embodiments of the invention, the "subject” is a human. As used herein, the terms “subject” and “individual” are sometimes used interchangeably.
  • blood sample refers to a sample of blood from a subject, such as a whole blood, plasma, or serum sample.
  • binding agent for MMP-9 refers to the ability to specifically A reagent that binds to MMP-9, such as an antibody against MMP-9, a binding ligand (such as Aptmer), and the like.
  • specific binding means that the specific binding agent of the present invention specifically binds to the MMP-9 antigen.
  • affinity of an MMP-9 antibody to bind to an MMP-9 antigen is at least 2 times that of a non-specific antigen (e.g., BSA, casein) that binds to an MMP-9 antigen.
  • a "MMP-9 binding fragment" of an MMP-9 antibody refers to one or more fragments of an MMP-9 antibody that retain the ability to bind to an MMP-9 antigen, such as Fab, F(ab,) 2 , Fv or Single-chain Fv fragment. It has been shown that the antigen binding function of antibodies can be carried out by fragments of full length antibodies.
  • Antibody "MMP-9 binding fragment” include (i) Fab fragment, a monovalent fragment consisting of the V H, Q ⁇ C H 1 domains of; (ii) F (ab, ) 2 fragment, which is contained in the hinge bivalent fragment area by two disulfide linked Fab fragments; (iii) Fd fragment consisting of the V H and C H * consisting of domains; (iv) by a single arm of VL and V H domains of an antibody, F v fragments, (V) dAb fragment (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546 ) ( herein by reference in its entirety is incorporated herein), which is a V H domain; and (vi) Isolated complementarity determining regions (CDRs).
  • CDRs Isolated complementarity determining regions
  • the two domains VL and VH of the FV fragment are encoded by different genes, they can be joined by recombinant methods via a synthetic linker that makes VL and VH a single protein chain, where the VL and VH regions are paired to form a unit price.
  • Molecules referred to as single-chain Fv (scFv); see, for example, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 85: 5879-5883
  • a human monoclonal antibody refers to a preparation of antibody molecules of a single molecular component. Monoclonal antibody components show a single binding specificity and affinity for a particular epitope. Thus, the term “monoclonal antibody” refers to an antibody that exhibits a single binding specificity.
  • a human monoclonal antibody is produced by a hybridoma comprising B cells fused to an immortalized cell obtained from a transgenic non-human animal, eg, a transgenic mouse, the animal's genome comprising Human heavy chain transgene and light chain transgene.
  • the preparation of antibodies is well known in the art, and those skilled in the art can readily prepare antibodies to MMP-9.
  • labeled antibody refers to an antibody labeled by a labeling molecule, such as an antibody labeled with a fluorophore, a chemiluminescent substance, horseradish peroxidase or the like.
  • optional carrying means means that the carrying tool can be present, There may be no such carrying tool. This can be done by a person skilled in the art according to the situation. Choose.
  • the ELISA of the present invention is carried out using a kit, which allows for a quick operation, thereby avoiding the cumbersomeness of routine experimental testing.
  • a preferred ELISA kit of the invention comprises an MMP-9 assay kit.
  • MMP-9 test kit In order to improve the sensitivity, specificity and accuracy of disease diagnosis, it is preferred to use the MMP-9 test kit, which can measure the two sets of test results separately or simultaneously to achieve rapid efficacy.
  • the MMP-9 detection kit of the invention comprises at least:
  • MMP-9 When MMP-9 binds to an antibody defined in (1), it is capable of binding to a labeled antibody of MMP-9.
  • the above kit may further comprise:
  • a standard consisting of a solution containing a known amount of MMP-9, which may be derived from genetically engineered bacterial expression, animal or human body fluids;
  • An antibody marker for detection for example, an enzyme label as a reporter method such as horseradish peroxidase, or a fluorescent label, which can bind to an antibody to form a conjugate.
  • the kit may further comprise at least one of the following: (5) a carrying tool whose space is divided into compartments that can accommodate one or more containers, 96-well plates or slats, and the like.
  • the container is, for example, a vial, a test tube and the like, each of which may contain a separate component for use in the method of the invention; (6) ancillary reagents, for example, chromogenic reagents, enzyme inhibitors, buffers Liquid, stabilizer, diluent, washing reagent and the like; (7) instructions, which can be written on bottles, test tubes and the like, or written on a separate piece of paper, or on the outside or inside of the container; It can be in the form of multimedia, such as CDs, computer discs, videos, and so on.
  • the antibody can be immobilized on a solid support to form a capture antibody. Capturing antibodies is particularly convenient in operation.
  • the antibody contained includes any antibody fragment capable of binding to MMP-9, and may be a recombinant, a chimeric antibody, a humanized antibody, and a murine antibody.
  • the antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, preferably a monoclonal antibody.
  • the antibody conjugate can be photometrically determined using an ELISA reader, such as a microplate reader.
  • an ELISA reader such as a microplate reader.
  • the sample used in the present invention may comprise various forms such as whole blood, plasma, serum, urine, cerebrospinal fluid, saliva, or tears. Among them, serum is preferred.
  • Sample preparation can be carried out according to a common method such as centrifugation or the like, for example, see: Young, DS & Bermes, EW “Specimen collection and processing" in Tietz Textbook of Clinical Chemistry 2nd Edition” Eds. Burtis, CA & Ashwood, ER, Saunders (1994); Methods in Enzymology H. Van Vunakis and JJ Langone (Eds), 1981, 72(B); Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, P Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, RJ Burden and PH Van Knippenberg (Eds), Elsevier, 1985; Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques, T. Chard, ibid, 3rd Edition, 1987; Methods in Enzymology, H. Van Vunakis and JJ Langone (Eds) 1981, 74(C) (in This is incorporated herein by reference in its entirety.
  • a common method such as centrifugation or the
  • the present invention can be used to detect protein MMP-9 in an individual sample using ELISA or other protein quantification techniques.
  • detection can be carried out using a specific binding agent for MMP-9, such as an antibody against MMP-9.
  • the antibody of MMP-9 is immobilized on a solid support, for example as a capture antibody.
  • the enzyme linked immunosorbent assay is a commonly used protein content analysis method in the field of molecular biology, which can be used for the determination of antigens and for the determination of antibodies.
  • the invention can be used in a variety of different types, such as: double antibody sandwich method, two-site one-step method, indirect method for measuring antibodies, competition method, and capture method for measuring IgM antibody. , and ELISA using avidin and biotin.
  • Quantitative Western blot is also a commonly used method for protein content analysis in the field of molecular biology.
  • a quantitative assay such as gelatin zymography or fluorometric detection by chemical means for determining the degree of activity of the MMP-9 enzyme can also be employed.
  • the MMP-9 concentration in the measured sample can be statistically processed by a mathematical analysis method, and a classification standard having the meaning of the sample classification is obtained.
  • a mathematical analysis method is preferably performed by a computer. For example, use these data to draw ROC curves to classify individual samples. For example, individuals can be classified into cancer or health, treatment response is good and bad, and long-term and short-term survival is predicted.
  • the ROC curve is called the receiver operator characteristic curve, also known as the receiver operating characteristic curve, and is mainly used for clinical biochemical diagnostic tests.
  • the ROC curve is a comprehensive index reflecting the true positive rate (sensitivity, also known as sensitivity, sensitivity) and false positive rate (1-specificity, specificity). It is a compositional method to reveal the correlation between sensitivity and specificity. It calculates a series of sensitivity and specificity by setting a series of different cut-off values (threshold or cut-off value, which is the boundary value separating the normal and abnormal results of the diagnostic test results), and then For the ordinate, 1 - specificity is plotted on the abscissa, the larger the area under the curve (AUC), the higher the diagnostic accuracy.
  • AUC area under the curve
  • the point closest to the upper left of the graph is the critical value with higher sensitivity and specificity.
  • the ROC curve AUC value is between 1.0 and 0.5. In the case of AUC > 0.5, the closer AUC is to 1, the better the diagnostic effect.
  • AUC has lower accuracy from 0.5 to 0.7, AUC has a certain accuracy from 0.7 to 0.9, and AUC has higher accuracy above 0.9.
  • the evaluation method of the ROC curve is different from the traditional evaluation method. According to the actual situation, an intermediate state is allowed, and the test result can be divided into multiple ordered classifications, such as: normal, roughly normal, suspicious, rough abnormal, and abnormal five. Levels.
  • the above ordered classification, for the diagnosis of diseases can be classified into: negative, uncertain, and positive. Further, for cancer diagnosis, it can be divided into: cancer, health.
  • the method for improving the accuracy of sample classification of the present invention may include the following steps:
  • test sample cancer or health
  • the ROC curve can be drawn using software or systems in the prior art, such as: MedCalc 9.2.0.1 Medical Statistics Software, SPSS 9.0, ROCPOWER.SAS DESIGN OCFOR, MULTIREADER_POWER.SAS, CREATE-ROC.SAS, GB STAT VI 0.0 (Dynamic Microsystems, Inc. Silver Spring, MD, USA) and many more.
  • the present invention also provides a combined test kit for diagnosis, prognosis evaluation, therapeutic effect monitoring or course monitoring of ovarian cancer, comprising at least: (1) an antibody capable of binding to MMP-9; and (2) When MMP-9 binds to an antibody defined in (1), it is capable of binding to a labeled antibody of MMP-9.
  • the invention provides a method for diagnosis, prognosis assessment, treatment effect monitoring or course monitoring of ovarian cancer in a subject, comprising: detecting MMP-9 in a blood sample of a subject The amount of expression and the amount of MMP-9 in time (eg, different cancer development periods, pre-treatment and post-treatment, etc.).
  • the present invention also provides a method for improving the accuracy of sample classification, which comprises: determining the content of MMP-9 in a sample, and the temporal change of the content of MMP-9 (eg, different cancer development periods, pre-treatment and treatment) After the change of MMP-9 protein content as a variable, the ROC curve was drawn according to the sensitivity and specificity of the different broad value for cancer diagnosis, and the area under the curve AUC was calculated; according to the AUC value, sensitivity and specificity Sexually classify samples. For example, individuals can be classified into cancer or health, treatment response is good and bad, and long-term and short-term survival is predicted.
  • the MMP-9 content can be compared to a reference value from a healthy subject, and if significantly higher than the reference value, the subject is determined to have ovarian cancer.
  • the ovarian cancer diagnosis is exemplified by taking individual serum as a sample, and the present invention will be further described in detail.
  • ELISA analysis 1 utilizes the quantitative MMP-9 immunoassay kit (cat # DMP900) developed by R&D Systems.
  • the ELISA kit is mainly used Serum samples were assayed for total MMP-9 (92 kDa pro-and 82 kDa active forms). ELISA analysis can be performed according to the instructions. Serum samples validated with MMP-9 were provided by the Chinese Genetic Repository and the Tumor Bank of the National Population and Family Planning Commission's Institute of Science and Technology (IRB approved). The RO STAT curve was analyzed using the GB STAT statistical package developed by Dynamic Microsystems.
  • microplate is incubated at room temperature (18-28 ° C) for 55 - 65 minutes.
  • the concentration of MMP-9 is closely related to the ovarian cancer state, that is, the serum MMP-9 protein content of ovarian cancer patients is significantly higher than that of healthy volunteers.
  • the Spring, MD USA system, based on the MMP-9 protein content, plots the ROC curve for sensitivity and specificity of cancer diagnosis based on different thresholds, and calculates the area under the curve AUC; plots the ROC curve and calculates the curve Area (AUC), as shown in Figure 1.
  • FIG. 1 shows that the AUC of the ROC curve is 0.92.
  • the threshold of MMP-9 concentration was 27.46 (ng/mL)
  • the sensitivity rate for diagnosing ovarian cancer was 87%
  • the specificity was 83%
  • the accuracy was 86%.
  • Table 1 Comparison of the expression levels of MMP9 in ovarian cancer patients and normal human serum. ng/ml

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Description

MMP9作为卵巢癌的诊断标记物的用途 相关申请的交叉援引
本申请要求 2008年 1 1 月 27 日提交的申请号为 200810182038.X 的中国发明专利申请的优先权， 在此通过援引将该专利申请的全部内 容并入本文。 技术领域
[0001] 本发明属于生物医学技术领域。具体地说，本发明涉及一 种提高样本分类准确性的方法、以及一种用于检测样本中 MMP-9蛋白 的试剂盒。 背景技术
[0002] 上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer, EOC)在所有女性 癌症死亡原因中排名第五位。美国癌症学会预计 2008年将会新增 21650 个卵巢癌病例， 同 时大约有 15520 例病患将死于该疾病 (www.cancer.org) 0 EOC的高死亡率都是发生在起始阶段， 因为大部分 妇女在诊断时已是晚期 (stage III/IV),其中 15-20%的病人有 5年的存活 率（ 1 )。 相比较而言， 被准确诊断为 stage I的小部分病人， 超过 90% 只 5年的存活率 （2 ) 。 当前 EOC检测的候选策略是建立在生物化学 肿瘤标志物的基础之上， 例如 CA125和通过超声或者卵巢的多普勒显 像得到的生物物理标记物。 不幸的是， 利用这些策略进行早期 EOC检 测的阳性预测值 (PPV)—致性小于 10% ( 3 , 4 ) 。 通过利用 CA125 复 杂算法 (complex longitudinal algorithms) ( 5-7 ) 、 串联测试 (sequential testing) ( 8，9 )和全新生物标记物（ 10 )的应用，在对上皮性卵巢癌（EOC) 早期诊断中得到了一定的提高。 所以， 现在仍非常需要继续发展新的 循环生物标志物对卵巢癌进行早期诊断。 发明内容
[0003] 本发明部分地基于以下发现： 卵巢癌患者血清中的
MMP-9含量明显高于健康受试者血清中的 MMP-9含量， 并且具有统 计学显著性， 可用作卵巢癌的诊断标志物。 [0004] 因此， 本发明提供了以下实施方案。
[0005] [实施方案 1] 一种诊断受试者中的卵巢癌的方法，包括： 检测来自受试者的样本中的 MMP-9含量，
对所述 MMP-9含量进行分析， 和
根据分析结果确定所述受试者是否患有卵巢癌。
[0006] [实施方案 2] —种提高样本分类准确性的方法， 包括： 检测所述样本中的 MMP-9含量，
对所述 MMP-9含量进行分析， 和
根据所述分析结果， 对样本进行分类。
[0007] [实施方案 3] —种对受试者的卵巢癌进行诊断、 预后评 估、 治疗效果监测或病程监测的方法， 包括： 检测受试者血液样本中 MMP-9的表达。
[0008] [实施方案 4] 权利要求 1-3之任一项的方法， 其中所述 样本选自由尿液、 脑脊液、 唾液和眼泪所构成的组。
[0009] [实施方案 5] 权利要求 1-3之任一项的方法， 其中所述 样本为血液样本。
[0010] [实施方案 6] 权利要求 1-3之任一项的方法， 其中所述 样本为血清样本。
[001 1] [实施方案 7] 权利要求 1-6之任一项的方法， 其中所述 检测采用 ELISA或定量 Western blot进行。
[0012] [实施方案 8] 权利要求 1-7之任一项的方法， 其中所述 检测采用 MMP-9的特异结合剂进行。
[0013] [实施方案 9] 权利要求 8的方法， 其中所述 MMP-9的 特异结合剂为 MMP-9的抗体或其 MMP-9结合片段。
[0014] [实施方案 10] 权利要求 8的方法， 其中所述 MMP-9的 抗体为单克隆抗体。
[0015] [实施方案 1 1] 权利要求 8的方法， 其中所述 MMP-9的 抗体为多克隆抗体。
[0016] [实施方案 12] 权利要求 1-11之任一项的方法， 其中所 述分析包括绘制 ROC曲线， 其中以 MMP-9为变量， 根据不同的阈值 绘制出 ROC曲线， 并计算曲线下面积 AUC， 并且按照期望的灵敏度和 特异性进行判断。 [0017] [实施方案 13] 权利要求 1-1 1之任一项的方法， 其中所 述分析包括将所述 MMP-9含量与来自健康受试者的参比值进行比较， 如果明显高于所述参比值则确定所述受试者患有卵巢癌。
[0018] [实施方案 14] 用于实施权利要求 1-13之任一项的方法 的试剂盒， 其包含： MMP-9的特异结合剂。
[0019] [实施方案 15] 权利要求 14的试剂盒， 还包含： 能够结 合 MMP-9的标记抗体。
[0020] [实施方案 16] 权利要求 14-15之任一项的试剂盒，其中 所述 MMP-9的特异结合剂为 MMP-9的抗体或其 MMP-9结合片段。
[0021] [实施方案 17] 权利要求 16的试剂盒，其中所述 MMP-9 的抗体为单克隆抗体。
[0022] [实施方案 18] 权利要求 16的试剂盒，其中所述 MMP-9 的抗体为多克隆抗体。
[0023] [实施方案 I9] 权利要求 15-18之任一项的试剂盒，其中 所述标记抗体被辣根过氧化物酶或者荧光标记。
[0024] [实施方案 20] 权利要求 14-19之任一项的试剂盒，还包 含：
包含已知量 MMP-9溶液的标准样； 以及
用于检测的抗体标记物， 其可以与抗体结合形成偶联物。
[0025] [实施方案 21] 权利要求 20的试剂盒， 其中所述抗体标 记物为辣根过氧化物酶或者荧光物质。
[0026] [实施方案 22] 权利要求 14 _ 21之任一项的试剂盒， 还 包含：
任选的携带工具， 其空间任选地被划分为限定空间的组分； 任选的选自由显色剂、 酶抑制剂、 緩沖液、 稳定剂、 稀释剂、 洗 涤试剂构成的组的辅助试剂； 和
任选的说明书。
[0027] [实施方案 23] 权利要求 14-22之任一项的试剂盒，其中 所述 MMP-9的特异结合剂被固定于固相载体上。
[0028] [实施方案 24] MMP-9的特异结合剂在制备用于诊断卵 巢癌的试剂中的用途。
[0029] [实施方案 25] 权利要求 24的用途， 其中所述 MMP-9 的特异结合剂为 MMP-9的抗体或其 MMP-9结合片段。
[0030] [实施方案 26] 权利要求 25 的用途， 其中所述 MMP-9 的抗体为单克隆抗体。
[0031] [实施方案 27] 权利要求 25 的用途， 其中所述 MMP-9 的抗体为多克隆抗体。
[0032] [实施方案 28] MMP-9作为卵巢癌诊断标志物的用途。
[0033] [实施方案 29] —种提高样本分类准确性的方法， 其包 括：
测定样本中 MMP-9的含量， 和 MMP-9的含量在时间上的变化； 以 MMP-9含量在时间上的变化为变量，根据不同的阈值对癌症诊 断的灵敏度和特异性绘制出 ROC曲线， 并计算曲线下面积 AUC;
按照 AUC值、 灵敏度和特异性对样本进行分类。
[0034] 研究表明，采用本发明的方法及试剂盒对个体的样本中蛋 白 MMP-9进行联合检测， 可以有效提高癌症诊断的灵敏度、 特异性和 准确率， 并且可以推广至许多疾病的诊断、 预后评估、 治疗效果评估 及病程监测。 附图说明
[0035] 图 1是对患者血清样本进行 MMP-9检测的 ROC曲线界 面。 其中， specificity是指特异性， sensitivity是指灵敏度。 具体实施方式
术语
[0036] 本文所用的术语 "MMP-9"是指基质金属蛋白酶 -9(Matrix Metalloproteinase-9), 其含义是本领 i或公知的。
[0037] 本文中使用的术语"受试者"， 指任意哺乳动物， 例如， 小 鼠、 大鼠、 兔子、 狗、 牛， 特别是灵长类动物， 如人。 在本发明的某 些优选实施方式中， "受试者"是人。 在本文中， 术语"受试者 "和"个体" 有时可互换使用。
[0038] 本文中使用的术语"血液样本，，，指来自受试者的血液的样 本， 例如全血、 血浆或者血清样本。
[0039] 本文中使用的术语" MMP-9 的特异结合剂"， 指能够特异 结合 MMP-9的试剂， 例如 MMP-9的抗体、 结合配体（如 Aptmer )等。
[0040] 本文中使用的术语"特异结合"指本发明的特异结合剂专 一性地结合 MMP-9抗原。例如，通常情况下， MMP-9抗体结合 MMP-9 抗原的亲和力是结合 MMP-9抗原之外的非特异抗原 （例如， BSA、 酪 蛋白） 的亲和力的至少 2倍。
[0041] MMP-9抗体的 "MMP-9结合片段"是指 MMP-9抗体的一 个或多个片段， 其保留结合 MMP-9抗原的能力， 例如 Fab、 F(ab，)2、 Fv或单链 Fv片段。已经表明通过全长抗体的片段可以实施抗体的抗原 结合功能。抗体的 "MMP-9结合片段"包括 (i)Fab片段， 其是由 VH、 Q^ CH 1结构域组成的单价片段； （ii ) F(ab，)2片段， 其是含有在铰链 区通过二硫键连接的两个 Fab片段的二价片段； （iii ) 由 VH和 CH * 构域组成的 Fd片段； （iv)由抗体的单臂的 VL和 VH结构域组成的 Fv片 段， （ V ) dAb片段 (Ward等人， (1989)Nature 341 : 544-546) (在此通过 援引将其全部内容并入本文） , 其由 VH结构域组成； 和 （vi )分离的 互补决定区 （CDR ) 。 此外， 尽管 FV片段的两个结构域 VL和 VH由 不同的基因编码， 它们可以经重组方法通过合成的接头连接， 所述接 头使得 VL和 VH成为一条蛋白质链， 其中 VL和 VH区配对形成单价 分子（称作单链 Fv(scFv);见，例如， Bird等人（1988)Science242: 423-426; 和 Huston等人（1988) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 85: 5879-5883)(在此通 过援引将其全部内容并入本文） 。
[0042] 文中所用术语"单克隆抗体"指单一分子成分的抗体分子 的制备物。 单克隆抗体成分显示出对特定表位的单一结合特异性和亲 和性。 因此， 术语"单克隆抗体"指显示出单一结合特异性的抗体。 在一 个实施方案中， 通过杂交瘤产生人单克隆抗体， 所述杂交瘤包括从转 基因非人动物， 例如， 转基因小鼠中获得的、 与永生化细胞融合的 B 细胞， 所述动物的基因组包含人重链转基因和轻链转基因。 抗体的制 备是本领域公知的， 本领域技术人员可以容易地制备 MMP-9的抗体。
[0043] 文中所用术语 "标记抗体"指通过标记分子进行标记的抗 体， 例如由荧光团、 化学发光物质、 辣根过氧化物酶等标记的抗体。
[0044] 本文所用的术语"任选" (optional, optionally)表示"可有可 无，，或"非必需 "等含义。 例如， "任选的携带工具"是指可以有该携带工 具， 也可以没有该携带工具。 这可以由本领域技术人员根据情况进行 选择。
试剂盒
[0045] 在一个优选实施方案中， 本发明的 ELISA使用试剂盒完 成， 这样可以实现快捷操作， 从而避免常规实验检测的繁瑣。 本发明 的优选的 ELISA试剂盒包括 MMP-9检测试剂盒。 为提高疾病诊断的 灵敏度、 特异性和准确率， 优选使用 MMP-9检测试剂盒， 其可以分别 或同时测得两组检测结果， 以达到快捷功效。
[0046] 在一个优选实施方案中， 本发明的 MMP-9检测试剂盒至 少包含：
( 1 ) 能够结合 MMP-9的抗体； 以及
( 2 )当 MMP-9结合于（ 1 )中限定的抗体时， 能够结合于 MMP-9 的标记抗体。
上述试剂盒还可包含：
( 3 ) 由含有已知量 MMP-9的溶液组成的标准样， 该标准样可以 来源于基因工程菌表达、 动物或人的体液； 以及
( 4 )用于检测的抗体标记物， 例如， 作为报告方法的酶标签比如 辣根过氧化物酶， 或者荧光标记， 其可以与抗体结合形成偶联物。
[0047] 更优选地， 试剂盒还可进一步包括下述物品中的至少之 一： （5 )携带工具， 其空间划分为可以收容一种或多种容器、 96孔板 或板条等的限定空间， 该容器例如是药瓶、 试管和类似物， 每样容器 都可含有一个单独的用于本发明方法的组分； （6 )辅助试剂， 比如， 显色剂、 酶抑制剂、 緩冲液、 稳定剂、 稀释剂、 洗涤试剂以及类似物； ( 7 )说明书， 其可以写在瓶子、 试管和类似物上， 或者写在一张单独 的纸上，或者在容器的外部或内部；也可以是多媒体的形式， 比如 CD、 电脑光盘、 录像等等。
[0048] 优选抗体可以固定于固相载体上，形成捕获抗体。捕获抗 体在操作上特别方便。
[0049] 所含抗体包括任何能够结合 MMP-9的抗体片段， 并且可 以是重组体、 嵌合抗体、 人源化抗体和鼠源性抗体。 所述抗体可以是 单克隆抗体或多克隆抗体， 优选单克隆抗体。
[0050] 优选抗体偶联物能够用 ELISA阅读机， 比如， 酶标仪进 行光度测定。 样本
[0051] 本发明所用样本可以包含多种形式， 比如全血、血浆、 血 清、 尿液、 脑脊液、 唾液、 或眼泪。 其中优选血清。
[0052] 样本制备可根据普通方法比如离心等进行，例如， 参见如 下文献： Young, D. S. & Bermes, E. W. "Specimen collection and processing"in Tietz Textbook of Clinical Chemistry 2nd Edition" Eds. Burtis, C. A. & Ashwood, E. R.， Saunders (1994); Methods in Enzymology H. Van Vunakis and J. J. Langone (Eds), 1981， 72(B); Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, P Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, R. J. Burden and P. H. Van Knippenberg (Eds), Elsevier, 1985; Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques, T. Chard, ibid, 3rd Edition, 1987; Methods in Enzymology, H. Van Vunakis and J. J. Langone (Eds) 1981， 74(C) (在此 通过援引将以上文献的全部内容并入本文） 。
检测方法
[0053] 本发明可以使用 ELISA或其它蛋白定量技术对个体的样 本进行蛋白 MMP-9的检测。优选地， 可以采用 MMP-9的特异结合剂， 例如 MMP-9的抗体进行检测。 在一个优选实施方式中， MMP-9的抗 体被固定在固相载体上， 例如作为捕获抗体使用。
[0054] 醉联免疫吸附剂测定 ( enzyme linked immunosorbent assay, ELISA )是分子生物学领域常用的蛋白质含量分析方法， 其可 用于测定抗原， 也可用于测定抗体。 根据试剂的来源、 样本的性状以 及检测的具体条件， 本发明可以采用多种不同类型， 比如： 双抗体夹 心法、 双位点一步法、 间接法测抗体、 竟争法、 捕获法测 IgM抗体、 . 以及应用亲和素和生物素的 ELISA等。 定量 Western blot也是分子生 物学领域常用的蛋白质含量分析方法。
[0055] 还可以采用通过化学方法测定 MMP-9酶的活性程度的定 量分析如明胶原位酶谱（ gelatin zymography)或荧光法检测。
ROC曲线
[0056] 在用 ELISA检测出样本中 MMP-9的浓度后，可用数学分 析方法对测得的样本中 MMP-9浓度进行统计学处理，在此基础上获得 具有样本分类意义的分级标准。 这样的数学方法优选由计算机完成， 比如用这些数据绘制 ROC曲线， 从而对个体的样本进行分类。 例如， 可以将个体分为癌症或健康， 治疗反应好和坏， 预测存活期长和短等。
[0057] ROC曲线全称为受试者工作特征曲线 （receiver operator characteristic curve ) , 又称为接收者操作特性曲线， 主要用于临床生化 诊断试验。 ROC曲线是反映真阳性率（灵敏度，又称敏感性， sensitivity ) 和假阳性率 （ 1-特异性， specificity ) 连续变量的综合指标， 是用构图 法揭示灵敏度和特异性的相互关系。 它通过设定一系列不同的分界值 (阈值或临界值， cut-off value, 是划分诊断试验结果正常与异常的界 值） 作为连续变量， 从而计算出一系列灵敏度和特异性， 再以灵敏度 为纵坐标、 1 -特异性为横坐标绘制的曲线， 曲线下面积 （AUC )越大, 诊断准确性越高。 在 ROC曲线上， 最靠近坐标图左上方的点为灵敏度 和特异性均较高的临界值。 ROC曲线 AUC值在 1.0和 0.5之间。在 AUC > 0.5的情况下， AUC越接近于 1， 说明诊断效果越好。 AUC在 0.5 ~ 0.7时有较低准确性， AUC在 0.7 ~ 0.9时有一定准确性， AUC在 0.9 以上时有较高准确性。
[0058] ROC 曲线的评价方法与传统的评价方法不同， 根据实际 情况， 允许有中间状态， 可以把试验结果分为多个有序分类， 比如： 正常、 大致正常、 可疑、 大致异常和异常五个等级。
[0059] 上述有序分类， 对于疾病的诊断而言， 可分为： 阴性、 不 确定、 阳性。 进一步地， 对于癌症诊断而言， 可分为: 癌症、 健康。
[0060] 在一个实施方式中， 本发明提高样本分类准确性的方法， 可以包括如下步骤：
( 1 )分别测定样本中蛋白 MMP-9的含量；
( 2 ) 以 MMP-9蛋白含量的比值为变量， 根据不同的阈值对癌症 诊断的灵敏度和特异性绘制出 ROC曲线， 并计算曲线下面积 AUC; 以 及
( 3 )按照期望的灵敏度和特异性， 对测定样本进行分类（癌症或 健康） 。
[0061] ROC 曲线的绘制可以使用现有技术中的软件或系统， 比 如： MedCalc 9.2.0.1 医学统计软件、 SPSS 9.0、 ROCPOWER.SAS DESIGN OCFOR, MULTIREADER_POWER.SAS , CREATE— ROC.SAS、 GB STAT VI 0.0 (Dynamic Microsystems, Inc. Silver Spring, MD, USA) 等等。
卵巢癌的诊断、 预后评估、 治疗效果监测或病程监测
[0062] 本发明还提供了一种用于卵巢癌的诊断、预后评估、治疗 效果监测或病程监测的联合测试试剂盒， 其至少包含： （ 1 ) 能够结合 MMP-9的抗体； 以及（2 ) 当 MMP-9结合于 （ 1 ) 中限定的抗体时， 能够结合于 MMP-9的标记抗体。
[0063] 在一个优选实施方式中，本发明提供了一种对受试者的卵 巢癌进行诊断、 预后评估、 治疗效果监测或病程监测的方法， 包括： 检测受试者血液样本中 MMP-9的表达量和 MMP-9的含量在时间上的 变化 （如， 不同癌症发展时期， 治疗前和治疗后等） 。 本发明还提供 了一种提高样本分类准确性的方法， 其包括： 测定样本中 MMP-9的含 量， 和 MMP-9的含量在时间上的变化（如， 不同癌症发展时期， 治疗 前和治疗后等）； 以 MMP-9蛋白含量在时间上的变化为变量， 根据不 同的阔值对癌症诊断的灵敏度和特异性绘制出 ROC曲线， 并计算曲线 下面积 AUC; 按照 AUC值、 灵敏度和特异性对样本进行分类。 例如， 可以将个体分为癌症或健康， 治疗反应好和坏， 预测存活期长和短等。 在一个优选实施方式中， 例如， 可以将 MMP-9含量与来自健康受试者 的参比值进行比较， 如果明显高于所述参比值则确定所述受试者患有 卵巢癌。
[0064] 以下结合具体实施例， 对本发明作进一步说明。 应理解，
实施例 1
[0065] 以下以个体的血清为样本进行卵巢癌诊断为例，对本发明 作进一步详细说明。
样本的采集
[0066] 在浙江大学医学院一附院随机采取 37例 50-60岁卵巢癌 患者的血清 1 mL; 作为阳性对照， 另采取 12例 50-60岁健康志愿者的 正常血样 1 mL, 进行 MMP-9浓度测试。
测 MMP-9含量
[0067] ELISA 分析一运用了 R&D Systems 公司开发的定量 MMP-9免疫测定试剂盒 (cat # DMP900)。 该 ELISA试剂盒主要是用来 测定血清样品总的 MMP-9(92 kDa pro-and 82 kDa active forms)。 ELISA 分析可根据说明书操作。利用 MMP-9验证的血清样品都是由中国遗传 资源库和国家人口计生委科学技术研究所 (IRB批准)的肿瘤库所提供。 利用 Dynamic Microsystems公司开发的 GB STAT统计包来分析 ROC 曲线。
[0068] 并且使用 Bio-Rad 680型酶标仪（美国）进行 ELISA操作 , 包括：
1、 取出冷藏储存的试剂盒， 放置， 恢复温度至室温 (20-25 °C)。 计 算要检测的标本总数和质控数。 每个标本需要一个抗原包被孔。 每次 实验都要做阳性对照、 阴性对照和校准品。 确定需要的微孔数量。 当 板条温度至室温时， 打开板条的保护袋， 拿出抗原包被的微孔板条。 本次实验不需要使用的试剂条应放入这个可重新密封的袋子， 密封， 重新存放在 2-8 °C。
2、 依次在 孔板上加入 20 的标准液、 对照液和血清样本。 此 过程务必在三十分钟内完成。
3、 在每个微孔中加入 100 的捕获液， 用移液器在孔中反复吹 打进行混匀。
4、 用微孔板盖盖好板， 在室温下（18-25 °0)进行温育 55 - 65分钟。
5、 按下述步骤手工洗板 3次：
A、 剧烈摇动并倒掉板中的液体；
B、 在孔中加满洗液。 保证孔中无残余气泡。
C、 再重复前两步骤两次。
D、 摇动并去除孔中的洗液。 把板翻转， 在纸巾上轻拍， 以便能拍 干所有洗液。 观察微孔板， 确保无残留的洗液。
6、 在酶标抗体复合物的瓶子里加入 7 mL的再生緩沖液， 存放于 室温下待用。
7、 按照同样的次序把稀释好的酶复合物加 100 到微孔板上
8、 用微孔板盖盖好板， 在室温下 （18-28°C )进行温育 55 - 65分 钟。
9、 配制底物， 在底物緩沖液中加入一片底物固体， 30-60分钟后 溶解， 强烈摇晃， 使溶液完全混合。
10、 按照步骤 5中 A到 D的方法进行洗板。 11、 以同样的速度和次序把底物液加 100 到每孔中。
12、 微孔板在室温下（18-28°C )进行温育 55 - 65分钟。
13、 以同样的速度和次序在每个孔中加入 100 的终止液。 加了 终止液后应轻轻敲打微孔板， 确保样品全部混匀。
14、 设置酶标仪的检测波长在 405 nm处。 检测每个孔的 OD值。 应在加了终止液的 15钟之内进行读数。
15、 用一线性校准曲线 "Y=mx+b"来分析 MMP-9的结果。
16、 通过标准曲线来读出血清样本和对照液中 MMP-9的浓度。 结果
[0069] 经上述步骤， 得到的检测结果如表 1所示。
[0070] 由表 1可以看出， MMP-9的浓度与卵巢癌症状有密切的 相关性， 即卵巢癌患者血清中 MMP-9蛋白的含量明显高于健康志愿者 血清中的含量。
ROC曲线绘制
[0071] 使用 GB STAT V10.0 (Dynamic Microsystems, Inc. Silver
Spring, MD USA)系统， 以 MMP-9蛋白含量为变量， 才艮据不同的阈值 对癌症诊断的灵敏度和特异性绘制出 ROC 曲线， 并计算曲线下面积 AUC; 绘制出 ROC曲线并计算曲线下面积 （AUC ) ， 如图 1所示。
[0072] 我们最近对 37个卵巢癌病人和 12个正常对照，用免疫酶 标的办法对 MMP9在诊断卵巢癌的敏感性和精确性作了一个分析， 发 现它的敏感率为 87%、 特异性为 83%、 精确率为 86%， 这些指标都超 过了目前卵巢癌的诊断标记物 CA125 , 尤其在特异性方面， 远远超过 了 CA125。 因此我们认为 MMP9作为卵巢癌的诊断标记物具有很大的 开发价值。
[0073] 我们利用 R & D Systems公司开发的 MMP-9免疫测定试 剂盒， 比较了 37个卵巢癌病人和 12个正常个体的血清表达情况。 正 常个体血清平均表达水平是 1.68+-30.06, 而卵巢癌病人的平均表达水 平为 72.77+-72.17。 TTest P value是 1.02837E-05。
[0074] MMP-9的 ROC曲线分析结果如图 1所示。
[0075] 图 1显示， ROC曲线的 AUC为 0.92。 当 MMP-9浓度的 阈值为 27.46( ng/mL )时，诊断卵巢癌的敏感率为 87%、特异性为 83%、 精确率为 86%。 表 1. MMP9在卵巢癌病人和正常人血清中的表达水平的比较 诊断 ng/ml
卵巢癌 159.83
卵巢癌 -2.51
卵巢癌 63.17
卵巢癌 50.49
卵巢癌 52.19
卵巢癌 16.1 1
卵巢癌 18.13
卵巢癌 45.00
卵巢癌 85.57
卵巢癌 37.68
卵巢癌 356.36
卵巢癌 55.48
卵巢癌 59.32
卵巢癌 31.56
卵巢癌 37.24
卵巢癌 30.93
卵巢癌 22.79
卵巢癌 29.80
卵巢癌 43.43
卵巢癌 296.61
卵巢癌 93.84
卵巢癌 70.81
卵巢癌 86.14
卵巢癌 63.30
卵巢癌 63.74
卵巢癌 174.97
卵巢癌 52.83
卵巢癌 72.32 卵巢癌 74.09
卵巢癌 9.42
卵巢癌 148.16
卵巢癌 32.57
卵巢癌 62.54
卵巢癌 65.10
卵巢癌 35.92
卵巢癌 46.64
卵巢癌 28.79
正常 -69.19
正常 -12.35
正常 2.70
正常 -8.88
正常 48.28
正常 31.75
正常 27.46
正常 23.87
正常 3.36
正常 -13.1 1
正常 -4.84
正常 -8.88
[0076] 本文中所涉及的参考文献， 包括专利文件、 学术论文、 出 版物等， 均以引用的方式将其全部内容包括在本文中， 其效果与逐一: 声明将这些参考文献的全部内容通过援引加入本文相同。
[0077] 应当理解， 在不偏离本发明的精神和范围的情况下， 本领: 域的普通技术人员可以在形式和细节上对其做出各种改变和改进， 而 这些均被认为落入了本发明的保护范围。 参考文献
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Claims

权 利 要 求
1. 一种诊断受试者中的卵巢癌的方法， 包括：
检测来自受试者的样本中的 MMP-9含量，
对所述 MMP-9含量进行分析， 和
根据分析结果确定所述受试者是否患有卵巢癌。
2. 一种提高样本分类准确性的方法， 包括：
检测所述样本中的 MMP-9含量，
对所述 MMP-9含量进行分析， 和
根据所述分析结果， 对样本进行分类。
3. 一种对受试者的卵巢癌进行诊断、 预后评估、 治疗效果监测或 病程监测的方法， 包括： 检测受试者血液样本中 MMP-9的表达。
4. 权利要求 1-3之任一项的方法， 其中所述样本选自由尿液、 脑 脊液、 唾液和眼泪所构成的组。
5. 权利要求 1-3之任一项的方法， 其中所述样本为血液样本。
6. 权利要求 1-3之任一项的方法， 其中所述样本为血清样本。
7. 权利要求 1-6之任一项的方法， 其中所述检测采用 ELISA或定 量 Western blot进行。
8. 权利要求 1-7之任一项的方法， 其中所述检测采用 MMP-9的 特异结合剂进行。
9. 权利要求 8的方法， 其中所述 MMP-9的特异结合剂为 MMP-9 的抗体或其 MMP-9结合片段。
10. 权利要求 8的方法， 其中所述 MMP-9的抗体为单克隆抗体。
11. 权利要求 8的方法， 其中所述 MMP-9的抗体为多克隆抗体。
12. 权利要求 1-1 1之任一项的方法， 其中所述分析包括绘制 ROC 曲线， 其中以 MMP-9为变量， 根据不同的阈值绘制出 ROC曲线， 并 计算曲线下面积 AUC， 并且按照期望的灵敏度和特异性进行判断。
13. 权利要求 1-11 之任一项的方法， 其中所述分析包括将所述 MMP-9含量与来自健康受试者的参比值进行比较， 如果明显高于所述 参比值则确定所述受试者患有卵巢癌。
14. 用于实施权利要求 1-13之任一项的方法的试剂盒， 其包含： MMP-9的特异结合剂。
15. 权利要求 14的试剂盒， 还包含： 能够结合 MMP-9的标记抗 体。
16. 权利要求 14-15之任一项的试剂盒， 其中所述 MMP-9的特异 结合剂为 MMP-9的抗体或其 MMP-9结合片段。
17. 权利要求 16的试剂盒， 其中所述 MMP-9的抗体为单克隆抗 体。
18. 权利要求 16的试剂盒， 其中所述 MMP-9的抗体为多克隆抗 体。
19. 权利要求 15-18之任一项的试剂盒，其中所述标记抗体被辣根 过氧化物酶或者荧光标记。
20. 权利要求 14-19之任一项的试剂盒， 还包含：
包含已知量 MMP-9溶液的标准样； 以及
用于检测的抗体标记物， 其可以与抗体结合形成偶联物。
21. 权利要求 20的试剂盒， 其中所述抗体标记物为辣根过氧化物 酶或者荧光物质。
22. 权利要求 14 - 21之任一项的试剂盒， 还包含：
任选的携带工具， 其空间任选地被划分为限定空间的组分； 任选的选自由显色剂、 酶抑制剂、 緩冲液、 稳定剂、 稀释剂、 洗 涤试剂构成的组的辅助试剂； 和
任选的说明书。
23. 权利要求 14-22之任一项的试剂盒， 其中所述 MMP-9的特异 结合剂被固定于固相载体上。
24. MMP-9 的特异结合剂在制备用于诊断卵巢癌的试剂中的用 途。
25. 权利要求 24的用途，其中所述 MMP-9的特异结合剂为 MMP-9 的抗体或其 MMP-9结合片段。
26. 权利要求 25的用途， 其中所述 MMP-9的抗体为单克隆抗体。
27. 权利要求 25的用途， 其中所述 MMP-9的抗体为多克隆抗体。
28. MMP-9作为卵巢癌诊断标志物的用途。
29. 一种提高样本分类准确性的方法， 其包括：
测定样本中 MMP-9的含量， 和 MMP-9的含量在时间上的变化； 以 MMP-9含量在时间上的变化为变量，根据不同的阈值对癌症诊 断的灵敏度和特异性绘制出 ROC曲线， 并计算曲线下面积 AUC; 按照 AUC值、 灵敏度和特异性对样本进行分类。
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