WO2010047103A1 - Ｎｆａｔシグナル阻害剤及び育毛剤 - Google Patents

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WO2010047103A1
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general formula
dihydrooroselol
angeloyloxy
hair
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充好 逆井
祐輔 渋谷
安曇 長澤
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花王株式会社
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    • C07D493/04—Ortho-condensed systems

Definitions

  • the present invention relates to a NFAT (nuclear factor of activated T cells) signal inhibitor and a hair restorer.
  • NFAT nuclear factor of activated T cells
  • NFAT Nuclear factor-of-activated T-cells
  • IL-2 Interleukin-2
  • FK506 tacrolimus
  • CsA and FK506 are approved not only as transplant immunosuppressants but also as therapeutic agents for rheumatoid arthritis, psoriasis, and atopic dermatitis, which are known to be involved in the immune system.
  • a system in which transcription of a gene downstream of the NFAT binding sequence is promoted by binding such NFAT to the NFAT binding sequence (“NFAT site” in FIG. 2) is referred to as “NFAT signal”.
  • Non-patent Document 1 Non-patent Document 1
  • CsA derivatives that inhibit the NFAT signal can be used as hair restorers.
  • alopecia such as male pattern alopecia
  • alopecia areata, empirically, blood circulation promoter, immunosuppressant, metabolism promoter, vitamin agent, anti-androgen hormone agent, etc.
  • the drugs are used. However, these drugs often have different effects depending on the symptoms and constitution, and the effects are still not satisfactory.
  • alopecias such as male pattern alopecia and alopecia areata are still unclear about the mechanism of their onset and are currently searching for suitable hair growth agents.
  • NFAT is not limited to hair-growth and immune system, but is also used in many organs such as muscle tissue formation by regulating myocardial / skeletal muscle differentiation, neural network formation in the brain, and bone metabolism by regulating osteoblast differentiation. It has come to be understood as a "multifunctional transcription factor" that plays an important role.
  • Non-Patent Document 2 immunosuppressive action
  • Non-Patent Document 3 psoriasis treatment
  • Non-Patent Document 2 psoriasis treatment
  • Patent Document 4 psoriasis treatment
  • Patent Document 5 atopic dermatitis treatment
  • Patent document 5 (heart) muscle hypertrophy suppression
  • possibility as an anti-rheumatic drug (non-patent document 6)
  • osteoclast differentiation inhibitory action non-patent document 7
  • NFAT signal inhibitors are used to treat diseases that are thought to involve immune cytokines including autoimmune diseases. Useful for prevention.
  • target diseases include various cancers, various leukemias, various hepatitis, various infections, systemic lupus erythematosus, inflammatory bowel diseases (ulcerative colitis, Crohn's disease), multiple sclerosis, insulin-dependent diabetes mellitus, digestion Ulcer, septic shock, tuberculosis, infertility, arteriosclerosis, Behcet's disease, asthma, nephritis, acute bacterial meningitis, acute myocardial infarction, acute pancreatitis, acute viral encephalitis, adult respiratory distress syndrome, bacterial pneumonia, chronic pancreatitis, peripheral Examples include vascular disease, sepsis, interstitial liver disease, localized ileitis, and multiple sclerosis.
  • a new NFAT signal inhibitor is identified, an immunosuppressive agent, a psoriasis therapeutic agent, an atopic dermatitis therapeutic agent, a (heart) muscle hypertrophy inhibitor, an anti-rheumatic agent, a bone metabolic disease therapeutic agent, and the above New medical uses such as those listed are expected.
  • an immunosuppressive agent a psoriasis therapeutic agent, an atopic dermatitis therapeutic agent, a (heart) muscle hypertrophy inhibitor, an anti-rheumatic agent, a bone metabolic disease therapeutic agent, and the above New medical uses such as those listed are expected.
  • quasi-drugs and cosmetics are expected as hair restorers and hair growth promoters.
  • Patent Documents 3 to 6 disclose a hair nourishing / hair restoring agent containing an extract of Angelica sinensis.
  • Patent Document 4 discloses a hair nourishing agent containing Angelica glauca essential oil.
  • Patent Document 5 discloses a hair growth / hair growth promoting material containing an extract of peanut (Angelica dahurica Benth. Et Hook.).
  • Patent Document 6 discloses a hair-care product such as hair-growth hair containing an extract of Ashitaba (Angelica Keiskei Koidz).
  • Non-Patent Document 10 describes that linear type furanocoumarins such as impellerin have an inhibitory action on NFAT signal.
  • the angular type furanocoumarins according to the present invention have not been described so far. It is not known about the relationship and the relationship with hair growth, hair growth or hair restoration effect.
  • Non-patent Document 11 apigenin (Non-Patent Document 11) and rosmarinic acid (Non-Patent Document 12) contained in various edible plants are known, and NFAT Genistein (Non-patent Document 13) is known as a compound having signal enhancement activity.
  • the present invention relates to the following 1) to 9). 1) The following general formula (I):
  • R 1 and R 2 may be the same or different from each other, and may be a hydrogen atom or a general formula (II):
  • R 3 represents a linear or branched alkyl group or alkenyl group having 1 to 20 carbon atoms.
  • An NFAT signal inhibitor comprising as an active ingredient at least one compound selected from the group consisting of those salts.
  • R 1 is at least one functional group selected from the group consisting of an angeloyl group, an isovaleroyl group, and a senecioyl group
  • R 2 is an angeloyl group, an isovaleroyl group, a 2-methylbutyl group, and a senecioyl group.
  • the coumarin derivatives represented by the above general formula (1) are arcangelicin, 3'-angeloyloxy-4'-isovaleryloxy-2 ', 3'-dihydrooroselol, 3'-angeloyloxy-4'-senecioyloxy-2' NFAT signal inhibitor as described above, which is at least one compound selected from the group consisting of 3,3'-dihydrooroselol and 3'-hydroxy-4'-angeloyloxy-2 ', 3'-dihydrooroselol.
  • a hair restorer containing as an active ingredient at least one compound selected from the group consisting of coumarin derivatives represented by the above general formula (1) and pharmacologically acceptable salts thereof.
  • a NFAT signal inhibition method comprising administering at least one compound selected from the group consisting of a coumarin derivative represented by the general formula (1) and a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • FIG. 1 It is a schematic diagram which shows the elution fraction at the time of isolating active ingredients from American Angelica. Of the American Angelica extract and fractions, Fr. E to Fr. J are the results of HPLC analysis. It is a characteristic view which shows the result of having calculated the NFAT signal inhibition rate about an American Angelica extract and a fraction. It is a characteristic view which shows the result of having calculated the NFAT signal inhibition rate about the deacylated body of the component A obtained in Example 1, the component B, the component C, and the component A prepared in Example 3. It is a schematic block diagram of an NFAT signal showing the binding between NFAT and an NFAT binding site and the promotion of gene transcription downstream thereof. It is a characteristic view which shows the result of having calculated the hair elongation rate about the component A and the component B which were obtained in Example 1.
  • FIG. 1 It is a schematic diagram which shows the elution fraction at the time of isolating active ingredients from American Angelica. Of the American Angelica extract and fractions, Fr
  • the present invention relates to providing pharmaceuticals, external preparations, cosmetics and the like having an NFAT signal inhibitory action or a hair-growing action.
  • the inventor of the present application has conducted extensive research on substances having an NFAT signal inhibitory action or a hair-growing action, and as a result, the compound represented by the above formula (I), particularly the known compound contained in American Angelica and the above formula (III) Since the novel compound has an excellent NFAT signal inhibitory action and hair growth action, the compound represented by the above formula (I) can prevent, improve or treat a disease caused by enhanced transcription promoting activity by NFAT, or It has been found that it is useful as a pharmaceutical, an external preparation, a cosmetic and the like that exhibits effects such as hair restoration and hair growth promotion.
  • NFAT signal inhibitor and hair restorer of the present invention (hereinafter also referred to as “NFAT signal inhibitor etc.”), prevention, improvement, treatment or hair growth / fostering of symptoms and diseases caused by enhanced transcription promoting activity by NFAT. Hair becomes possible.
  • the active ingredient used for the NFAT signal inhibitor and the like according to the present invention can be obtained from an American Angelica plant or an extract of the plant.
  • American Angelica is a plant that has the scientific name Angelica atropurpurea and is classified into the celery family.
  • the “active ingredient” is a coumarin derivative represented by the following general formula (I) or a pharmacologically acceptable salt thereof. As shown in the general formula (I), the active ingredient is an angular type coumarin derivative among coumarin derivatives.
  • the fraction containing linear furanocoumarin derivatives such as imperatorin and xanthotoxin has no NFAT signal inhibitory activity or
  • the fraction containing the angular type furanocoumarin derivative according to the present invention, and the isolated component A, component B, and component C were found to have strong NFAT signal inhibitory activity.
  • the angular type furanocoumarin derivative according to the invention has been found to have an excellent NFAT signal inhibitory activity as compared with a linear type furanocoumarin derivative such as imperatrin which is a known NFAT signal inhibitor.
  • R 1 and R 2 may be the same or different, and may be a hydrogen atom or the general formula (II):
  • R 3 represents a linear or branched alkyl or alkenyl group having 1 to 20 carbon atoms).
  • the coumarin derivative that can be used as the active ingredient includes various compounds in the range of R 1 , R 2, and R 3 as defined above.
  • R 1 is preferably a functional group selected from the group consisting of an angeloyl group, an isovaleroyl group, and a senecioyl group.
  • R 2 is preferably a functional group selected from the group consisting of an angeloyl group, an isovaleroyl group, a 2-methylbutyl group, and a senecioyl group.
  • R 1 is an angeloyl group
  • R 2 is a coumarin derivative which is an angeloyl group
  • R 1 is an isovaleroyl group
  • a coumarin derivative R 2 is an angeloyl group
  • R 1 is a senecioyl
  • a coumarin derivative in which R 2 is an angeloyl group is preferred.
  • the angular type furocoumarin derivative obtained by deacylating these coumarin derivatives is also preferable.
  • a coumarin derivative in which R 1 is an angeloyl group and R 2 is an angeloyl group is a compound known as an anti-tumor and anti-inflammatory action as an alkangelicin, and R 1 is an isovaleroyl group
  • a coumarin derivative in which 2 is an angeloyl group, for example, 3′-angeloyloxy-4′-isovaleryloxy-2 ′, 3′-dihydrooroselol is a known compound, and as shown in the examples below, It has been clarified to have hair growth activity and NFAT signal inhibition activity.
  • R 1 is a senecioyl group and R 2 is an angeloyl group, for example, 3′-angeloyloxy-4′-senecioyloxy-2 ′, 3′-dihydrooroselol, is shown in the examples below.
  • the compound was found as a novel compound having NFAT signal inhibitory activity.
  • the coumarin derivative of the present invention includes those obtained by known chemical synthesis methods, plant extracts containing these as active main components, or purified or isolated products thereof.
  • the plant extract is subjected to separation and purification techniques such as activated carbon treatment, liquid chromatography, liquid partitioning, gel filtration, precision distillation, etc., and inert impurities, etc. are extracted from the extract. It may be removed and the desired compound may be purified and isolated.
  • separation and purification techniques such as activated carbon treatment, liquid chromatography, liquid partitioning, gel filtration, precision distillation, etc., and inert impurities, etc. are extracted from the extract. It may be removed and the desired compound may be purified and isolated.
  • coumarin derivatives as active ingredients in particular the above-mentioned arcangelicin, 3'-angeloyloxy-4'-isovaleryloxy-2 ', 3'-dihydrooroselol and 3'-angeloyloxy-4'-senecioyloxy-2', 3 ' -Dihydrooroselol is a fraction containing, as a main component of activity, one or more selected from the above-mentioned coumarin derivatives, particularly these compounds, from a ciraceae plant (preferably an American Angelica plant) or an extract thereof (Hereinafter also referred to as “active fraction”) or the compound of interest can be isolated therefrom. Further, these intermediates may be extracted from plants, and then the target product may be obtained by chemical synthesis.
  • the whole plant, leaves, stems, flowers, fruits, seeds, rhizomes or roots of the above plant are used as they are by crushing, pulverizing or extracting them, or these treated ones are used after drying or pulverizing. be able to.
  • a root is preferably used as a site to be used.
  • the plant extract is a variety obtained by extraction means such as extraction of the plant under a constant temperature (low temperature, normal temperature or warming); or extraction using an extractor such as a Soxhlet extractor. It means a solvent extract, its diluted solution, its concentrated solution or its powder. Specifically, means such as solid-liquid extraction, liquid-liquid extraction, immersion, decoction, leaching, reflux extraction, ultrasonic extraction, microwave extraction, and stirring can be used as the extraction means.
  • the extraction solvent used for obtaining the plant extract either a polar solvent or a nonpolar solvent can be used.
  • the extraction solvent include water; alcohols such as methanol, ethanol, propanol and butanol; polyhydric alcohols such as propylene glycol and butylene glycol; ketones such as acetone and methyl ethyl ketone; esters such as methyl acetate and ethyl acetate; Chain and cyclic ethers such as tetrahydrofuran and diethyl ether; Polyethers such as polyethylene glycol; Hydrocarbons such as squalane, hexane, cyclohexane and petroleum ether; Aromatic hydrocarbons such as toluene; Dichloromethane, chloroform, dichloroethane, etc.
  • halogenated hydrocarbons and carbon dioxide.
  • the mixture which combined 2 or more types of the said solvent can be used as an extraction solvent.
  • alcohols preferably, alcohols having 1 to 4 carbon atoms
  • alcohols / water mixture are used.
  • concentration of the alcohols is 70 to 100% by volume (preferably 80 to 100% by volume). Is preferred.
  • the amount of the extraction solvent used is preferably 1 to 50 parts by mass and preferably 5 to 40 parts by mass with respect to 1 part by mass of the plant (in terms of dry matter).
  • the extraction temperature is preferably 0 to 100 ° C, more preferably 4 to 80 ° C, and further preferably 10 to 40 ° C.
  • the extraction time is preferably 1 minute to 50 days, more preferably 1 hour to 50 days, and further preferably 1 to 10 days.
  • the above-mentioned plant or extract thereof is subjected to separation techniques such as liquid chromatography and liquid partitioning, and the above-mentioned alkangelicin, which is an active ingredient, 3'-angeloyloxy-4'-isovaleryloxy-2 ', 3'- An active fraction containing dihydrooroselol and 3′-angeloyloxy-4′-senecioyloxy-2 ′, 3′-dihydrooroselol may be obtained, or these may be isolated.
  • the extract is subjected to reverse phase resin column chromatography such as octadecylated silica gel, octylated silica gel, and trimethylsilylated silica gel, and eluted with acetonitrile-0.05 to 0.2% TFA solvent to activate the extract.
  • An active fraction containing the components may be obtained.
  • 3'-hydroxy-4'-angeloyloxy-2 ', 3'-dihydrooroselol is obtained by deacylating arcangelicin.
  • a conventionally known compound can be used as an active ingredient as long as it is a compound represented by the above chemical formula (I).
  • known compounds represented by the above chemical formula (I) include asamantin, synifolin B (Cniforin B), edulisin II (Edulisin II) and edulisin V (Edulisin ⁇ V), which are used as active ingredients. can do.
  • the coumarin derivative of the present invention can improve water solubility and increase physiological effectiveness by making it into a salt.
  • These salts may be pharmaceutically acceptable salts.
  • Examples of such basic substances for salt formation include hydroxides of alkali metals such as lithium hydroxide, sodium hydroxide and potassium hydroxide; hydroxides of alkaline earth metals such as magnesium hydroxide and calcium hydroxide. Products; inorganic bases such as ammonium hydroxide, basic amino acids such as arginine, lysine, histidine, ornithine; organic bases such as monoethanolamine, diethanolamine, and triethanolamine are used, particularly alkali metals or alkaline earth metals Hydroxides are preferred.
  • these salts may be prepared and then added to the composition comprising other components, or chlorogenic acids and the salt-forming component may be separately added to the composition, In this, a salt may be formed.
  • the coumarin derivative of the present invention or a salt thereof has an NFAT signal inhibitory action and a hair growth action as shown in Examples below.
  • the NFAT signal inhibitory action means acting directly or indirectly on NFAT to reduce the transcription promoting activity by NFAT. Further, the above-described NFAT signal inhibitory action (activity) can be evaluated using the NFAT signal inhibition rate as an index.
  • the method for measuring this NFAT signal inhibitory action is not particularly limited, and examples include a reporter assay using a host in which a known NFAT binding sequence and a plasmid having a reporter gene downstream of the NFAT binding sequence are introduced. Can do. Incidentally, since the activity of NFAT depends on calcium ions, the reporter assay is performed under conditions that allow calcium ions to flow into the host.
  • the reporter gene is not particularly limited, and any reporter gene conventionally used in the field of biochemical experiments can be used.
  • examples of the reporter gene include luciferase gene, ⁇ -glucuronidase gene (GUS gene), and green fluorescent protein gene (GFP gene).
  • NFAT binding sequence examples include an oligonucleotide consisting of a sequence to which NFAT binds, for example, a base sequence such as GGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGT (pNFAT-Luc, Stratagene) shown in SEQ ID NO: 1.
  • a plurality of sets of such NFAT binding sequences may be linked and introduced.
  • the NFAT signal inhibitory activity can be evaluated as the NFAT signal inhibition rate calculated from the reporter assay described above.
  • hair growth action acts on hair follicles, promotes hair elongation, increases thickness, promotes transition from rest period of hair cycle to growth phase, inhibits transition from growth phase to regression phase, etc. Means to increase the amount of hair. Therefore, the concept of hair growth, hair restoration, and hair loss prevention is included in hair growth.
  • the hair-growth action (activity) can be evaluated using the hair elongation acceleration rate as an index.
  • the hair elongation acceleration rate means the acceleration rate of the hair elongation rate when the coumarin derivative is allowed to act on the hair elongation rate when the coumarin derivative is not acted on.
  • the method for measuring the hair-growth action (activity) is not particularly limited, and examples thereof include a method of organ-culturing an isolated hair follicle and measuring the amount of hair elongation during the culture period.
  • the active ingredient reduces the transcription promotion (positively controlled transcription) activity by NFAT, it can inhibit NFAT signals in cells and tissues.
  • the NFAT signal in the cell or tissue can be inhibited by bringing the coumarin derivative of the present invention or a salt thereof into contact with the target cell or tissue.
  • various gene expressions caused by NFAT signals can be suppressed at the transcription level.
  • the active ingredient mentioned above promotes hair growth and hair growth and is effective for various alopecia.
  • the coumarin derivative of the present invention or a salt thereof can be used as an NFAT signal inhibitor, a hair growth / hair growth promoter, or the like because it reduces transcription promoting activity by NFAT; it promotes hair growth / hair growth. Can be used to produce these formulations.
  • the NFAT signal inhibitor and the like according to the present invention can be used as a therapeutic agent, an improving agent or a prophylactic agent for symptoms and diseases caused by enhanced transcription promoting activity by NFAT.
  • Symptoms and diseases resulting from the enhanced transcription promoting activity by NFAT include immune system diseases, psoriasis, atopic dermatitis, myopathy including myocardium, rheumatism, bone metabolic diseases, various cancers, various leukemias, various hepatitis, Various infections, systemic lupus erythematosus, inflammatory bowel disease (ulcerative colitis, Crohn's disease), multiple sclerosis, insulin-dependent diabetes, peptic ulcer, septic shock, tuberculosis, infertility, arteriosclerosis, Behcet's disease, Asthma, nephritis, acute bacterial meningitis, acute myocardial infarction, acute pancreatitis, acute viral encephalitis, adult respiratory distress syndrome,
  • the NFAT signal inhibitor and the like according to the present invention can be used as an immunosuppressant, a psoriasis therapeutic agent, a (cardiac) muscle hypertrophy inhibitor, an anti-rheumatic drug, a bone metabolic disease therapeutic agent, and the like.
  • the above-mentioned active ingredients can be used as pharmaceuticals, external preparations, cosmetics, foods, feeds, etc. that exhibit NFAT signal inhibitory action, hair growth action, and the like.
  • the dosage form is not particularly limited, but examples thereof include solid preparations such as powders, granules, capsules, pills and tablets, liquids such as liquids, suspensions and emulsions, ointments and the like. Can be mentioned.
  • the above-mentioned active ingredients are used alone or in addition, generally used according to the form of oral administration, excipients, disintegrants, binders, lubricants, surfactants Alcohols, water, water-soluble polymers, sweeteners, corrigents, acidulants and the like can be added and produced according to conventional methods.
  • excipients include immunosuppressive agents, psoriasis therapeutic agents, (cardiac) muscle hypertrophy inhibitors and anti-rheumatic agents.
  • the above-mentioned active ingredients are used alone or in addition, generally used depending on the form of transdermal administration, vegetable oil, animal oil, synthetic oil, fatty acid, and natural and synthetic glycerides Oily bases such as, lubricants, surfactants, alcohols, thickeners and the like can be added and produced according to conventional methods.
  • oilsy bases such as, lubricants, surfactants, alcohols, thickeners and the like can be added and produced according to conventional methods.
  • pharmaceuticals for transdermal administration include immunosuppressive agents, psoriasis therapeutic agents, atopic dermatitis therapeutic agents, hair growth promoters and the like.
  • an external preparation and a hair restorer are used, for example as a quasi-drug for skin, and are provided as a dosage form suitable for a use form.
  • Specific dosage forms are not particularly limited, and examples thereof include ointments, liquids, extracts, lotions, tonics, sprays, and emulsions.
  • pharmaceutically acceptable carriers such as auxiliaries, stabilizers, wetting agents, emulsifiers, absorption enhancers and surfactants are used alone or in addition to the above-mentioned active ingredients. Any combination can be blended.
  • hair restorer in addition to the above-mentioned active ingredients, commonly used hair nourishing agents such as hair follicle activators, blood circulation promoters, antibacterial agents, anti-inflammatory agents, moisturizers, antiseborrheic agents, topical A stimulant, an anti-androgen agent, a potassium channel opener, an antioxidant and the like can be appropriately blended as necessary to improve the hair-growth effect.
  • hair follicle activators such as hair follicle activators, blood circulation promoters, antibacterial agents, anti-inflammatory agents, moisturizers, antiseborrheic agents, topical A stimulant, an anti-androgen agent, a potassium channel opener, an antioxidant and the like
  • hair nourishing agents such as hair follicle activators, blood circulation promoters, antibacterial agents, anti-inflammatory agents, moisturizers, antiseborrheic agents, topical A stimulant, an anti-androgen agent, a potassium channel opener, an antioxidant and the like can be appropriately blended as necessary to improve the hair-growth effect.
  • hair follicle activators include flavonols, N-acetyl-L-methionine, pantothenic acid and derivatives thereof, adenosine and derivatives thereof, potassium aspartate, glyceride pentadecanoate, 6-benzylaminopurine, mononitroguaiacol sodium and the like.
  • Examples of the blood circulation promoter include carbon dioxide, nicotinamide, benzyl nicotinate, assembly extract, carrot extract, carpronium chloride, vitamin E and derivatives thereof.
  • Antibacterial agents include isopropylmethylphenol, benzalkonium chloride, octopirox, zinc pyrithione, hinokitiol and the like.
  • anti-inflammatory agents include licorice extract, glycyrrhizic acid and its derivatives, glycyrrhetinic acid and its derivatives, azulene, guaiazulene, oxon extract, chamomile extract, kumazasa extract, birch extract, mallow extract, peach leaf extract, yarrow extract .
  • humectant include hypericum extract, oat extract, glycerin, tuberose polysaccharide, cordyceps extract, life-saving grass extract, barley extract, grape extract, propylene glycol, bellflower extract, and cypressin extract.
  • antiseborrheic agents include sulfur, lecithin, cachet extract, and thioxolone.
  • local stimulants include camphor and chili tincture.
  • Anti-androgen agents include cyproterone acetate, 11 ⁇ -hydroxyprogesterone, flutamide, 3-deoxyadenosine, chlormadinone acetate, ethinyl estradiol, spironolactone, epitesterone, finasteride, aloe, salamander, clove extract, quacharalate extract, Panax ginseng.
  • potassium channel openers include minoxidil, cromakalim, diazoxide and its derivatives, pinacidil and the like.
  • antioxidant include black tea extract, tea extract, age extract, jaundice extract, vitamin C and its derivatives, erythorbic acid, propyl gallate, dibutylhydroxytoluene and the like.
  • the dosage form is not particularly limited.
  • a water-in-oil or oil-in-water emulsified cosmetic cream, lotion, gel, foam, essence, foundation, Packs, sticks, powders and the like can be mentioned.
  • the above-mentioned active ingredients alone or in addition to them oils, surfactants, ultraviolet absorbers, alcohols, chelating agents, pH adjusters, preservatives generally used as cosmetic ingredients , Thickeners, pigments, fragrances, various skin nutrients, and the like can be arbitrarily combined.
  • medicinal ingredients blended in skin cosmetics for example, ultraviolet absorbers such as fine particle zinc oxide, titanium oxide, persole MCX, persole 1789, vitamins such as ascorbic acid, sodium hyaluronate, petrolatum, glycerin, urea Moisturizers such as humectants, hormonal agents, and other whitening ingredients such as kojic acid, arbutin, placenta extract, lucinol, steroids, arachidonic acid metabolites and histamine, and other chemical transmitter production / release inhibitors (indomethacin, Ibuprofen), anti-inflammatory agents such as receptor antagonists, anti-androgen agents, vitamin A acid, royal jelly extract, sebum secretion inhibitors such as royal jelly acid, peripheral blood vessels such as tocopherol nicotinate, alprostadil, isoxpurine hydrochloride, and trazoline hydrochloride Dilator and peripheral vasodilatory effect Certain carbon dioxide, minoxidil, carpron
  • quasi drugs for example, powders such as chalk, talc, fuller's earth, kaolin, starch, rubber, colloidal silica sodium polyacrylate; oils such as mineral oil, vegetable oil, silicone oil, etc.
  • Oily substances eg emulsifiers such as sorbitan trioleate, sorbitan tristearate, glycerol monooleate, polymeric silicone surfactants; preservatives such as para-hydroxybenzoate esters; antioxidants such as butylhydroxytoluene; glycerol, sorbitol , 2-pyrrolidone-5-carboxylate, dibutyl phthalate, gelatin, polyethylene glycol and other wetting agents; buffers such as lactic acid with a base such as triethanolamine or sodium hydroxide; glycerin fatty acid ester, sorbi Surfactants such as fatty acid esters, sucrose fatty acid esters, alkyl glucosides; waxes such as beeswax, ozokerite wax, paraffin wax; thickeners; activity enhancers; colorants; Combinations can be used as appropriate.
  • emulsifiers such as sorbitan trioleate, sorbitan tristearate
  • the amount of the above-mentioned active ingredient is usually of the total composition such as medicine, quasi-drug or cosmetic, in terms of coumarin derivatives. It is preferably 0.00001 to 5% by mass, particularly 0.0001 to 0.1% by mass.
  • the dosage of the above-mentioned active ingredient is desirably 0.01 mg to 1 g / day for a normal adult (60 kg).
  • Example 1 Isolation of Active Ingredients from American Angelica (1) According to the process shown in FIG. 1, the compounds “Component A” and “Component B” of the present invention were obtained from the root of American Angelica (Angelica atropurpurea). And “Component C” was isolated. (2) Angelica atropurpurea rhizomes (160 g) were extracted by immersing them in 95 w / v% ethanol-water (1.6 L) at room temperature (10-40 ° C) for 5 days to obtain 95 w / v% ethanol. -A water extract was obtained. The extract was filtered and then concentrated on a rotary evaporator to obtain 14.3 g of a solid content.
  • fr. I-1 46.5mg fr. I-2: 27.6mg fr. I-3: 3.4mg fr. I-4: 6.3mg fr. I-5: 18.8mg fr. I-6: 84.6mg fr. I-7: 5.4mg fr. I-8: 46.9mg
  • the compound of the present invention was obtained almost as a single compound in fr. I-6 (component A), fr. I-8 (component B), and fr. I-5 (component C).
  • Example 2 Identification of component A, component B and component C (1) The compound obtained in Example 1 was subjected to 1 H NMR analysis and 13 C NMR analysis. Table 1 shows data obtained as a result of 1 H NMR (500 MHz, CDCl 3 ) and 13 C NMR (125 MHz, CDCl 3 ) analysis.
  • component A, component B and component C are each an alkangelicin, 3'-angeloyloxy-4'-isovaleryloxy-2 ', 3'-dihydrooroselol and 3'-angeloyloxy-4'-senecioyloxy-2', 3 ' -It was found to be dihydrooroselol.
  • 3'-angeloyloxy-4'-senecioyloxy-2 ', 3'-dihydrooroselol of component C was a novel compound with no report in the past.
  • Example 3 Preparation of deacylated form of component A (alcangelicin)
  • component A 70 mg
  • component A 70 mg
  • 7 mL of concentrated aqueous ammonia was added, and the mixture was stirred overnight at room temperature.
  • the reaction solution was concentrated (75 mg), subjected to preparative high performance liquid chromatography (inner diameter 10 ⁇ 250 mm), and eluted with 0.1% formic acid-acetonitrile system to fractionate the main product (17 mg).
  • Example 4 Identification of deacylated form of component A (alcangelicin) (1) The compound obtained in Example 3 was subjected to 1 H NMR analysis and 13 C NMR analysis. Table 2 shows data obtained as a result of 1 H NMR (500 MHz, CDCl 3 ) and 13 C NMR (125 MHz, CDCl 3 ) analysis.
  • Example 3 was an angular furocoumarin derivative having the following structure from which the angeloyl group at the 3'-position of the arcangelicin was eliminated.
  • Example 5 NFAT signal inhibitory effect
  • the NFAT signal inhibitory effect of the component A, component B and component C obtained in Example 1 and the deacylated form of component A prepared in Example 3 was verified. .
  • HEK293 human kidney cells were purchased from ATCC (American Type Culture Collection) and used. HEK293 cells were cultured in DMEM (High glucose, 10% heat-inactivated FBS) at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • DMEM High glucose, 10% heat-inactivated FBS
  • HEK293 cells transfected with plasmid pNFAT-Luc (Stratagene) having firefly luciferase introduced downstream of the NFAT binding sequence was used.
  • pNFAT-luc (STRATAGENE) in which a firefly luciferase gene was introduced downstream of a quadruple NFAT binding sequence was transfected into HEK293 cells for evaluation of NFAT transcriptional activity.
  • pRL-CMV Promega
  • Renilla luciferase was introduced downstream of the CMV promoter was simultaneously transfected in order to correct the signal derived from firefly luciferase.
  • the transfection was performed using LipofectAMINE 2000 reagent (Invitrogen) according to the instruction manual. The medium was changed 8 hours after transfection and incubated overnight. Thereafter, component A, component B and component C obtained in Example 1 and the deacylated form of component A prepared in Example 3 were added, and 1 ⁇ M ionomycin was added 1 hour later. After 8 hours, a luciferase reporter assay was performed.
  • Luciferase reporter assay The luciferase reporter assay was performed using Dual-Glo Luciferase Assay System (Promega) according to the instruction manual. That is, after removing the medium, Dual-Glo luciferase reagent diluted 2-fold with PBS was added, stirred, and firefly luciferase activity was measured 20 minutes later. Thereafter, an equal amount of Dual-Glo Stop & Glo reagent was added and stirred, and then Renilla luciferase activity was measured. The luciferase activity was measured using MiniLumat LB 9506 (EG & G BERTHOLD), and the amount of luminescence by luciferase was quantitatively detected. In both cases, the measurement time for luciferase activity was 2 seconds.
  • NFAT signal inhibition rate 100-(test sample and Ionomycin added group-unstimulated group) / (Ionomycin only added group-unstimulated group) x 100
  • results are shown in FIG.
  • component A, component B and component C obtained in Example 1 and the deacylated form of component A prepared in Example 3 all inhibited the NFAT signal. That is, the deacylated form of component A, component B, and component A can suppress transcription that is positively controlled by NFAT. Therefore, the deacylated form of component A, component B and component A are excellent NFAT signal inhibitors, such as immunosuppressants, psoriasis therapeutic agents, atopic dermatitis therapeutic agents, (heart) muscle hypertrophy inhibitor and anti-antibody It has been identified as a candidate substance such as a rheumatic drug.
  • Example 6 Hair growth effect
  • the hair growth effect of component A and component B obtained in Example 1 was verified using an in vitro experimental system capable of verifying the hair growth effect of the target substance.
  • Evaluation of hair elongation by porcine hair follicle organ culture The buttocks skin of pork for meat was cut into an appropriate size, and excess adipose tissue was removed. Porcine skin was disinfected by immersing it in Hibiten solution (5% Hibiten solution (Sumitomo Pharma) diluted 5 to 20 times with water) for 5 to 10 minutes under aseptic conditions, and then washed several times with D-PBS. .
  • Hibiten solution 5% Hibiten solution (Sumitomo Pharma) diluted 5 to 20 times with water
  • hair follicles were isolated from pig skin washed under a stereomicroscope and collected in William's Medium E medium (Invitrogen) medium.
  • the isolated hair follicles were placed one by one in a 24-well culture plate containing 400 ⁇ l of William's Medium E medium (added with 1% Penicillin-Streptomycin solution (Invitrogen)) per well.
  • the hair follicles were cultured for 8 days under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 , during which the medium was changed every other day or two days.
  • Component A and component B obtained in Example 1 were added to the above medium, and cultured for 8 days together with the ethanol addition group as a solvent control.
  • Example 1 Take a stereomicroscopic image of the start date (day 0) and 8th day with a CCD camera (pixera model.No.PVC 100C) and measure the length from the base of the hair bulb to the tip of the hair shaft. It was measured. Thereafter, the hair elongation rate of component A and component B obtained in Example 1 was calculated with the amount of hair elongation before and after culturing in the solvent control group as 100%.
  • Results The results of calculating the hair elongation rate are shown in FIG. As can be seen from FIG. 6, in the group to which component A and component B obtained in Example 1 were added, significant hair elongation was observed as compared to the solvent control group. From this result, it became clear that the component A and the component BC obtained in Example 1 have a hair-growth effect. That is, it became clear that the component A and the component B obtained in Example 1 are active ingredients exhibiting a hair restoring effect and can be used as a hair restoring agent or as an external preparation.

Abstract

　ＮＦＡＴシグナル阻害剤等の提供。 　一般式（式（Ｉ）中、Ｒ１及びＲ２は、各々同じであっても異なっていてもよく、水素原子又は式（ＩＩ）で示される基（一般式（ＩＩ）中、Ｒ３は炭素数１～２０の直鎖又は分枝アルキル基又はアルケニル基を示す）である）で示されるクマリン誘導体及び薬理学的に許容されるそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を有効成分とするＮＦＡＴシグナル阻害剤等。

Description

ＮＦＡＴシグナル阻害剤及び育毛剤
　本発明は、NFAT（nuclear factor of activated T cells）シグナル阻害剤及び育毛剤に関する。
　Nuclear factor of activated T cells（以下、NFATと略称する）は、T細胞活性化に重要なInterleukin-2（IL-2）の転写を活性化する因子として発見され、免疫抑制剤であるサイクロスポリンA（以下、CsAと略称する）やタクロリムス（以下、FK506と略称する）の標的であるセリン／スレオニン脱リン酸化酵素カルシニューリンによりその転写活性調節が行われていることが報告されている（図５参照）。すなわちCsAやFK506はNFATシグナルを阻害することによりT細胞活性化を抑制する。CsAやFK506は移植免疫抑制剤としてのみならず、免疫系の関与することが知られている関節リウマチ、乾癬、アトピー性皮膚炎の治療薬としても認可されている。このようなNFATがNFAT結合配列（図２においては“NFAT site”）に結合することによって、当該NFAT結合配列より下流の遺伝子の転写が促進される系を『NFATシグナル』と称する。
　一方、NFATシグナルを阻害することによって育毛（発毛を含む）効果を期待できると報告されている（非特許文献１）。また、NFATシグナルを阻害するCsAの誘導体が育毛剤として使用可能であることも報告されている（特許文献１及び２）。
　ここで、従来、育毛剤として、男性型脱毛症、円形脱毛症などの脱毛症の治療には、経験的に、血行促進剤、免疫抑制剤、代謝促進剤、ビタミン剤、抗男性ホルモン剤等の薬剤が用いられている。しかしながら、これらの薬剤では、症状や体質によっては効果が異なる場合が多く、その効果も未だ満足出来るものではない。また、多量に使用すると適応部位に不快な刺激臭感覚を与えたり、継続使用により皮膚炎が発生するといった場合がある。男性型脱毛症、円形脱毛症などの脱毛症の多くは、未だその発症機序の詳細が不明であり、適した育毛剤を探索しているのが現状である。
　また、NFATは、育毛作用や免疫系への作用に留まらず、心筋・骨格筋の分化調節による筋組織形成、脳における神経ネットワークの形成、骨芽細胞分化調節による骨代謝など、多くの臓器で発現し、重要な役割を果たす"多機能転写因子"として捉えられるようになってきた。
　NFATシグナルが生体において及ぼす役割としては上述したとおりであるが、NFATシグナルを阻害することで、免疫抑制作用（非特許文献２）、乾癬治療（非特許文献３）、アトピー性皮膚炎治療（非特許文献４）、（心）筋肥大抑制（非特許文献５）、抗リウマチ薬としての可能性（非特許文献６）及び破骨細胞分化抑制作用（非特許文献７）などが期待できると報告されている。
　また、前述のようにNFATは免疫性サイトカインIL-2を産生する経路を介していることから、NFATシグナル阻害剤は自己免疫疾患を含む免疫性サイトカインが関与していると考えられる疾患の治療または予防に有用である。
　かかる対象疾患としては、例えば各種のガン、各種白血病、各種肝炎、各種感染症、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病）、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、消化性潰瘍、敗血症ショック、結核、不妊症、動脈硬化、ベーチェット病、喘息、腎炎、急性バクテリア髄膜炎、急性心筋梗塞、急性膵炎、急性ウイルス脳炎、成人呼吸促迫症候群、バクテリア肺炎、慢性膵炎、末梢血管疾患、敗血症、間質性肝疾患、時局性回腸炎、多発性硬化症などが挙げられる。
　したがって、新規にNFATシグナル阻害剤が同定されれば、免疫抑制剤、乾癬治療剤、アトピー性皮膚炎治療剤、（心）筋肥大抑制剤、抗リウマチ薬、骨代謝疾患治療剤及び、上記に列記したような新規な医薬用途が期待される。また、新規にNFATシグナル阻害剤が同定されれば、育毛剤、発毛促進剤としての医薬部外品や化粧品用途が期待される。
　ところで、アンジェリカ属に属する植物については、その抽出物に育毛、発毛或いは養毛効果が認められるという報告もある（特許文献３～６）。具体的に特許文献３には、カラトウキ（Angelica sinensis）抽出物を含む養毛・育毛剤が開示されている。特許文献４には、Angelica glaucaの精油を含有する養毛剤が開示されている。特許文献５には、ビャクシ（Angelica dahurica Benth. Et Hook.）の抽出物を含有する発毛・育毛促進料が開示されている。特許文献６にはアシタバ（Angelica Keiskei Koidz）の抽出物を含む育毛養毛等美髪料が開示されている。
　また、アンジェリカ植物に含まれる成分については、非特許文献８、９を参照することができ、アメリカンアンジェリカの抽出物にインペラトリン、キサントトキシン等のリニア型フラノクマリンや、アンジェリシンなどのアンギュラー型フラノクマリンが含まれていることが示されている。また非特許文献１０にはインペラトリン等のリニア型フラノクマリンがNFATシグナルの阻害作用を有するとの記載があるが、一方、本発明に係るアンギュラー型フラノクマリンについては、これまでにNFATシグナルとの関連や育毛、発毛或いは養毛効果との関連については知られていない。
　なお、現在のところ、上記以外にNFATシグナル阻害活性を有する化合物としては、種々の食用植物に含まれるアピゲニン（非特許文献１１）及びロスマリン酸（非特許文献１２）が知られており、またNFATシグナル亢進活性を有する化合物としてゲニステイン（非特許文献１３）が知られている。
国際公開第01/035914号パンフレット（特表2003-514000号公報） 国際公開第2004/041221号パンフレット（特表2006-508103号公報） 特許3527584号公報 特開2005-89392号公報 特開平1-38013号公報 特開昭63-145216号公報
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　本発明は、以下の１）～９）に係るものである。
　１）次の一般式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
（上記一般式（Ｉ）中、Ｒ１及びＲ２は、各々同じであっても異なっていてもよく、水素原子又は一般式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
で示される基〔上記一般式（ＩＩ）中、Ｒ３は炭素数１～２０の直鎖又は分枝のアルキル基又はアルケニル基を示す〕である）で示されるクマリン誘導体及び薬理学的に許容されるそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を有効成分とするNFATシグナル阻害剤。
　２）上記式（Ｉ）中Ｒ１が、アンゲロイル基、イソバレロイル基及びセネシオイル基からなる群から選ばれる少なくとも１種の官能基であり、Ｒ２はアンゲロイル基、イソバレロイル基、２メチルブチル基及びセネシオイル基からなる群から選ばれる少なくとも１種の官能基である上記記載のNFATシグナル阻害剤。
　３）上記一般式（１）で表されるクマリン誘導体が、アルカンジェリシン、3’-angeloyloxy-4’-isovaleryloxy-2’,3’-dihydrooroselol、3’-angeloyloxy-4’-senecioyloxy-2’,3’-dihydrooroselol及び3’-hydroxy-4’-angeloyloxy-2’,3’-dihydrooroselolからなる群より選択される少なくとも１種の化合物である上記記載のNFATシグナル阻害剤。
　４）上記一般式（１）で表されるクマリン誘導体及び薬理学的に許容されるそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を有効成分とする育毛剤。
　５）次の一般式（III）で示される化合物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　６）NFATシグナル阻害剤を製造するための、上記一般式（１）で表されるクマリン誘導体及び薬理学的に許容されるそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物の使用。
　７）育毛剤を製造するための、上記一般式（１）で表されるクマリン誘導体及び薬理学的に許容されるそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物の使用。
　８）上記一般式（１）で表されるクマリン誘導体及び薬理学的に許容されるそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を投与するNFATシグナル阻害方法。
　９）上記一般式（１）で表されるクマリン誘導体及び薬理学的に許容されるそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を投与する育毛方法。
アメリカンアンジェリカからの活性成分類の単離する際の溶出画分を示す模式図である。 アメリカンアンジェリカ抽出液および、分画物のうち、Fr. E～Fr. Jについて、HPLC分析を行った結果である。 アメリカンアンジェリカ抽出液および、分画物について、NFATシグナル阻害率を算出した結果を示す特性図である。 実施例１で得られた成分Ａ、成分Ｂ及び成分Ｃ並びに実施例３で調製した成分Aの脱アシル体についてNFATシグナル阻害率を算出した結果を示す特性図である。 NFATとNFAT結合部位との結合及びその下流の遺伝子転写促進を示す、NFATシグナルの概略構成図である。 実施例１で得られた成分A及び成分Bについて毛伸長率を算出した結果を示す特性図である。
　本発明は、NFATシグナル阻害作用、又は育毛作用を有する、医薬品、外用剤、化粧品等を提供することに関する。
　本願発明者は、NFATシグナル阻害作用又は育毛作用を有する物質について鋭意研究を重ねた結果、上記式（I）で表される化合物、特にアメリカンアンジェリカに含まれていた既知化合物及び上記式（III）の新規化合物に優れたNFATシグナル阻害作用及び育毛作用があることから、上記式（I）で表される化合物がNFATによる転写促進活性の亢進に起因する疾患の予防、改善或いは治療、又は育毛・養毛、発毛促進等の効果を発揮する、医薬品、外用剤、化粧品等として有用であることを見出した。
　本発明のNFATシグナル阻害剤及び育毛剤（以下、「NFATシグナル阻害剤等」とも云う）によれば、NFATによる転写促進活性の亢進に起因する症状や疾患の予防、改善或いは治療又は育毛・養毛が可能となる。
　本発明に係わるNFATシグナル阻害剤等に使用する活性成分は、アメリカンアンジェリカ植物又は当該植物の抽出物などから得ることができる。ここで、アメリカンアンジェリカとは、学名をAngelica atropurpureaと称し、セリ科に分類される植物である。
　ここで、「活性成分」とは、次の一般式（Ｉ）で示されるクマリン誘導体若しくは薬理学的に許容されるその塩である。
　一般式（I）に示すように、上記活性成分は、クマリン誘導体の中でもアンギュラー型クマリン誘導体である。後記実施例に示すように、アメリカンアンジェリカを分画し、活性成分を単離する工程において、インペラトリンやキサントトキシン等のリニア型フラノクマリン誘導体を含む画分にはNFATシグナル阻害活性が全く或いは殆ど認められなかったのに対し、本発明に係るアンギュラー型フラノクマリン誘導体を含む画分、更に単離した成分Ａ、成分Ｂ及び成分Ｃには強いNFATシグナル阻害活性が認められたことから、本発明に係るアンギュラー型フラノクマリン誘導体は、既知のNFATシグナル阻害剤であるインペラトリン等のリニア型フラノクマリン誘導体に比し、優れたNFATシグナル阻害活性作用を有するものとして見出されたものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　上記一般式（I）中、Ｒ１及びＲ２は、各々同じであっても異なっていてもよく、水素原子又は一般式（II）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
で示される基（上記一般式（II）中、Ｒ３は炭素数１～２０の直鎖又は分枝のアルキル基又はアルケニル基を示す）である。
　すなわち、上記活性成分として使用できるクマリン誘導体は、上述のように規定したＲ１、Ｒ２及びＲ３の範囲で種々の化合物を含むことになる。
　特に、上記Ｒ１としては、アンゲロイル基、イソバレロイル基及びセネシオイル基からなる群から選ばれる官能基であることが好ましい。また、上記Ｒ２はアンゲロイル基、イソバレロイル基、２メチルブチル基及びセネシオイル基からなる群から選ばれる官能基であることが好ましい。
　さらに、上記Ｒ２がアンゲロイル基、イソバレロイル基、２メチルブチル基又はセネシオイル基であるクマリン誘導体を、脱アシル化することによってクマリン骨格の３’位をヒドロキシル基（上記Ｒ２が水素原子の場合に相当）とすることができる。
　なかでも、上記活性成分としては、Ｒ１がアンゲロイル基であり、Ｒ２がアンゲロイル基であるクマリン誘導体；Ｒ１がイソバレロイル基であり、Ｒ２がアンゲロイル基であるクマリン誘導体、及びＲ１がセネシオイル基であり、Ｒ２がアンゲロイル基であるクマリン誘導体が好ましい。また、上記活性成分としては、これらクマリン誘導体を脱アシル化して得られるアンギュラー型フロクマリン誘導体も好ましい。
　特に、Ｒ１がアンゲロイル基であり、Ｒ２がアンゲロイル基であるクマリン誘導体は、アルカンジェリシンとして抗腫瘍、抗炎症作用が知られた化合物であり、また、Ｒ１がイソバレロイル基であり、Ｒ２がアンゲロイル基であるクマリン誘導体、例えば3’-angeloyloxy-4’-isovaleryloxy-2’,3’-dihydrooroselolは、公知化合物であるが、これらは、後記実施例に示すように、本発明において、育毛活性及びNFATシグナル阻害活性を有することが明らかになったものである。
　さらに、Ｒ１がセネシオイル基であり、Ｒ２がアンゲロイル基であるクマリン誘導体、例えば3’-angeloyloxy-4’-senecioyloxy-2’,3’-dihydrooroselolは、後記実施例に示すように、本発明において、NFATシグナル阻害活性を有する新規化合物として見出されたものである。
　また、上記化学式（I）で示される公知化合物としては、例えば、アサマンチン（Athamantin）、シニフォリンB（Cniforin B）、エデュリシンII（Edulisin II）及びエデュリシンV（Edulisin V）等が挙げられる。
　なお、上記活性成分として、これら公知化合物及び新規化合物から選ばれる１種又は２種以上のものを使用してもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　ここで、本発明のクマリン誘導体には、上述のように、公知の化学合成法により得られるものや、これを活性の主体成分として含有する植物抽出物若しくはその精製物や単離物も包含される。
　なお、必要に応じて、上記植物等抽出物を、活性炭処理、液体クロマトグラフィー、液々分配、ゲルろ過、精密蒸留等の分離精製技術に供し、当該抽出物から、不活性な夾雑物等を除去し、目的の化合物を精製及び単離してもよい。
　一例として、活性成分であるクマリン誘導体、特に上述したアルカンジェリシン、3’-angeloyloxy-4’-isovaleryloxy-2’,3’-dihydrooroselol及び3’-angeloyloxy-4’-senecioyloxy-2’,3’-dihydrooroselolについては、セリ科植物（好ましくは、アメリカンアンジェリカ植物）又はその抽出物から、上記クマリン誘導体、特にこれら化合物から選ばれる１種又は２種以上のものを活性の主体成分として含有する画分（以下、「活性画分」とも云う）を得ること又はこれらから目的の化合物を単離することができる。また、これらの中間体を植物から抽出し、次いで化学合成により目的物を得ても良い。
　ここで、上記植物の全草、葉、茎、花、果実、種子、根茎又は根等を、そのまま、破砕、粉砕、搾取して用いるか、又はこれら処理されたものを乾燥若しくは粉末化して用いることができる。用いる部位としては、根を、使用するのが好ましい。
　上記植物の抽出物とは、当該植物を一定温度（低温、常温又は加温）下にて抽出すること；又はソックスレー抽出器等の抽出器具を用いて抽出すること等の抽出手段により得られる各種溶剤抽出液、その希釈液、その濃縮液又はその粉末を意味するものである。抽出手段は、具体的には、固液抽出、液液抽出、浸漬、煎出、浸出、還流抽出、超音波抽出、マイクロ波抽出、攪拌等の手段を用いることができる。
　上記植物抽出物を得るために用いられる抽出溶剤としては、極性溶剤又は非極性溶剤のいずれをも使用することができる。抽出溶剤としては、例えば水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；プロピレングリコール、ブチレングリコール等の多価アルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等の鎖状及び環状エーテル類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；スクワラン、ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等の炭化水素類；トルエン等の芳香族炭化水素類；ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類；及び二酸化炭素等が挙げられる。或いは、上記溶剤の２種以上を組み合わせた混合物を、抽出溶剤として用いることができる。
　好ましくは、アルコール類（好ましくは、炭素数１～４のアルコール類）、アルコール類・水混合液であり、このときのアルコール類の濃度は７０～１００容量％（好ましくは８０～１００容量％）であるのが好ましい。
　抽出溶剤の使用量は、植物１質量部（乾燥物換算）に対して、１～５０質量部であるのが好ましく、５～４０質量部であるのが好ましい。抽出温度は、０～１００℃であるのが好ましく、より４～８０℃、更に１０～４０℃であるのが好ましい。抽出時間は、１分～５０日間であるのが好ましく、より１時間～５０日間、更に１～１０日間であるのが好ましい。
　更に、上記植物又はその抽出物から、液体クロマトグラフィーや液々分配等の分離技術に供し、活性成分である上述したアルカンジェリシン、3’-angeloyloxy-4’-isovaleryloxy-2’,3’-dihydrooroselol及び3’-angeloyloxy-4’-senecioyloxy-2’,3’-dihydrooroselolを含有する活性画分を得てもよいし、これらを単離してもよい。
　具体的には、当該抽出物を、オクタデシル化シリカゲル、オクチル化シリカゲル、トリメチルシリル化シリカゲル等の逆相樹脂カラムクロマトに付し、アセトニトリル－０．０５～０．２％ＴＦＡ系溶媒で溶出し、活性成分を含有する活性画分を得てもよい。
　また、アルカンジェリシンを脱アシル化することによって3’-hydroxy-4’-angeloyloxy-2’,3’-dihydrooroselolが得られる。
　ただし、本発明においては、上記化学式（I）で示される化合物であれば、従来公知の化合物を活性成分として使用することができる。上記化学式（I）で示される公知化合物としては、例えば、アサマンチン（Athamantin）、シニフォリンB（Cniforin B）、エデュリシンII（Edulisin II）及びエデュリシンV（Edulisin V）を挙げることができ、活性成分として使用することができる。
　また、本発明のクマリン誘導体は、塩にすることにより水溶性を向上させ、生理学的有効性を増大させることができる。これらの塩としては、薬学的に許容される塩であればよい。このような塩形成用の塩基物質としては、例えば、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属の水酸化物；水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム等のアルカリ土類金属の水酸化物；水酸化アンモニウム等の無機塩基、アルギニン、リジン、ヒスチジン、オルニチン等の塩基性アミノ酸；モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン等の有機塩基が用いられるが、特にアルカリ金属又はアルカリ土類金属の水酸化物が好ましい。本発明においては、これらの塩を調製してから、その他の成分からなる組成物中に添加したものでもよいし、クロロゲン酸類等と塩形成成分とを別々に該組成物中に添加して、この中で塩を形成せしめたものでもよい。
　本発明のクマリン誘導体又はその塩は、後記実施例に示すとおり、NFATシグナル阻害作用、及び育毛作用を有する。
　ここで、NFATシグナル阻害作用とは、NFATに対して直接的又は間接的に作用してNFATによる転写促進活性を低減させることを意味する。
　また、上述したNFATシグナル阻害作用（活性）は、NFATシグナル阻害率を指標として評価することができる。
　このNFATシグナル阻害作用（活性）を測定する方法としては、特に限定されないが、例えば公知のNFAT結合配列と当該NFAT結合配列の下流にレポーター遺伝子と有するプラスミドを導入した宿主を用いるレポーターアッセイを挙げることができる。
　因みに、NFATの活性はカルシウムイオンに依存するため、レポーターアッセイはカルシウムイオンを宿主に流入させる条件下で行う。レポーター遺伝子としては、特に限定されず、従来、生化学実験の分野で使用されている如何なるレポーター遺伝子も使用することができる。例えばレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子、βグルクロニダーゼ遺伝子（GUS遺伝子）及びグリーンフルオレセントプロテイン遺伝子（GFP遺伝子）等を挙げることができる。
　NFAT結合配列とは、NFATが結合する配列からなるオリゴヌクレオチド、例えば、配列番号１に示すGGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGT（pNFAT-Luc、Stratagene）といった塩基配列を例示することができる。なお、上述したプラスミドにおいては、このようなNFAT結合配列を１セットとして複数セットを連結して導入してもよい。複数のNFAT結合配列を連結して使用することによって、NFATによる転写促進活性をより高感度に測定することができる。なお、NFATシグナル阻害活性は、上述したレポーターアッセイから算出したNFATシグナル阻害率として評価することができる。
　また、育毛作用（活性）とは、毛包に作用し、毛の伸長の促進、太さの増大、毛周期の休止期から成長期への移行促進、成長期から退行期への移行阻害などを行なうことにより毛の量を増加させることを意味する。従って、育毛には、発毛、養毛及び脱毛予防の概念が包含されるものとする。
　育毛作用（活性）は、毛伸長促進率を指標として評価することができる。ここで、毛伸長促進率とは、要するに、クマリン誘導体を作用させないときの毛伸長率に対して、クマリン誘導体を作用させたときの当該毛伸長率の促進率を意味している。
　この育毛作用（活性）を測定する方法としては、特に限定されないが、例えば単離毛包を器官培養し、培養期間中の毛の伸長量を測定する方法が挙げられる。
　上述した活性成分は、NFATによる転写促進（正に制御される転写）活性を低減させることから、細胞や組織におけるNFATシグナルを阻害することができる。具体的には、本発明のクマリン誘導体又はその塩を、対象とする細胞や組織に接触させることによって、当該細胞や組織におけるNFATシグナルを阻害することができる。これにより、当該細胞や組織においては、NFATシグナルによって生ずる種々の遺伝子発現を転写レベルで抑制することができる。
　また、上述した活性成分は、育毛・発毛を促進し、種々の脱毛症に有効である。
　従って、本発明のクマリン誘導体又はその塩は、NFATによる転写促進活性を低減させること；育毛・発毛を促進させることから、NFATシグナル阻害剤や育毛・発毛促進剤等として使用することができ、これらの製剤を製造するために使用することができる。
　本発明に係るNFATシグナル阻害剤等は、NFATによる転写促進活性の亢進に起因する症状や疾患に対する治療剤、改善剤又は予防剤として使用することができる。
　NFATによる転写促進活性の亢進に起因する症状や疾患としては、免疫系疾患、乾癬、アトピー性皮膚炎、心筋を含む筋肥大症、リウマチ、骨代謝疾患、各種のガン、各種白血病、各種肝炎、各種感染症、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病）、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、消化性潰瘍、敗血症ショック、結核、不妊症、動脈硬化、ベーチェット病、喘息、腎炎、急性バクテリア髄膜炎、急性心筋梗塞、急性膵炎、急性ウイルス脳炎、成人呼吸促迫症候群、バクテリア肺炎、慢性膵炎、末梢血管疾患、敗血症、間質性肝疾患、時局性回腸炎、多発性硬化症等を挙げることができる。したがって、本発明に係るNFATシグナル阻害剤等は、免疫抑制剤、乾癬治療剤、（心）筋肥大抑制剤、抗リウマチ薬及び骨代謝疾患治療剤等として使用することができる。
　斯様に、上述した活性成分は、NFATシグナル阻害作用や育毛作用等を発揮する医薬品、外用剤、化粧品、食品、飼料等として使用できる。
　医薬品として使用する場合、その剤形は、特に限定されないが、例えば散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤等の固形製剤、水剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、軟膏剤等が挙げられる。
　経口投与の医薬品として使用する場合、上述した活性成分を単独で又は、この他、経口投与剤の形態に応じて一般に用いられる、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、界面活性剤、アルコール類、水、水溶性高分子、甘味料、矯味剤、酸味料等を添加し、常法に従って製造することができる。経口投与用医薬品としては、免疫抑制剤、乾癬治療剤、（心）筋肥大抑制剤及び抗リウマチ薬等が挙げられる。
　経皮投与の医薬品として使用する場合、上述した活性成分を単独で又は、この他、経皮投与剤の形態に応じて一般に用いられる、植物油、動物油、合成油、脂肪酸、及び天然、合成のグリセライド等の油性基剤、滑沢剤、界面活性剤、アルコール類、増粘剤等を添加し、常法に従って製造することができる。経皮投与用医薬品としては、免疫抑制剤、乾癬治療剤、アトピー性皮膚炎治療剤、発毛促進剤等が挙げられる。
　また、外用剤及び育毛剤は、例えば皮膚用の医薬部外品として使用するものであり、使用形態に適した剤形として提供される。具体的に剤形としては、特に限定されるものではないが、例えば、軟膏、水剤、エキス剤、ローション剤、トニック剤、スプレー剤及び乳剤等が挙げられる。
　当該医薬部外品には、上述した活性成分を単独で又は、この他に、助剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、吸収促進剤及び界面活性剤等の薬学的に許容される担体を任意に組合せて配合することができる。また、育毛剤においては、上述した有効成分の他に、通常用いられる養毛薬効剤、例えば、毛包賦活剤、血行促進剤、抗菌剤、抗炎症剤、保湿剤、抗脂漏剤、局所刺激剤、抗男性ホルモン剤、カリウムチャンネルオープナー、抗酸化剤等を必要に応じて適宜配合し、育毛効果の向上を図ることができる。毛包賦活剤としては、フラバノノール類、N-アセチル-L-メチオニン、パントテン酸及びその誘導体、アデノシン及びその誘導体、アスパラギン酸カリウム、ペンタデカン酸グリセリド、6-ベンジアルアミノプリン、モノニトログアヤコールナトリウム等が挙げられる。血行促進剤としては、二酸化炭素、ニコチン酸アミド、ニコチン酸ベンジル、センブリエキス、ニンジンエキス、塩化カルプロニウム、ビタミンE及びその誘導体等が挙げられる。抗菌剤としては、イソプロピルメチルフェノール、塩化ベンザルコニウム、オクトピロックス、ジンクピリチオン、ヒノキチオール等が挙げられる。抗炎症剤としては、甘草エキス、グリチルリチン酸及びその誘導体、グリチルレチン酸及びその誘導体、アズレン、グアイアズレン、オウゴンエキス、カミツレエキス、クマザサエキス、シラカバエキス、ゼニアオイエキス、桃葉エキス、セイヨウノコギリソウエキス等が挙げられる。保湿剤としては、オトギリソウエキス、オーツ麦エキス、グリセリン、チューベロースポリサッカライド、冬虫夏草エキス、延命草エキス、オオムギエキス、ブドウエキス、プロピレングリコール、桔梗エキス、ヨクイニンエキス等が挙げられる。抗脂漏剤としては、イオウ、レシチン、カシュウエキス、チオキソロン等が挙げられる局所刺激剤としては、カンファー、トウガラシチンキ等が挙げられる。抗男性ホルモン剤としては、サイプロテロンアセテート、1 1α-ハイドロキシプロゲステロン、フルタマイド、3-デオキシアデノシン、酢酸クロルマジノン、エチニルエストラジオール、スピロノラクトン、エピテステロン、フィナステライド、アロエ、サンショウ、チョウジエキス、クアチャララーテエキス、オタネニンジン等が挙げられる。カリウムチャンネルオープナーとしては、ミノキシジル、クロマカリム、ジアゾキシド及びその誘導体、ピナシジル等が挙げられる。抗酸化剤としては、紅茶エキス、茶エキス、エイジツエキス、黄杞エキス、ビタミンＣ及びその誘導体、エリソルビン酸、没食子酸プロピル、ジブチルヒドロキシトルエン等が挙げられる。
　化粧料として使用する場合には、剤形としては、特に限定されるものではないが、例えば、油中水型又は水中油型の乳化化粧料、クリーム、ローション、ジェル、フォーム、エッセンス、ファンデーション、パック、スティック及びパウダー等が挙げられる。
　当該化粧料には、上述した活性成分を単独で又は、この他に、化粧料成分として一般に使用されている油分、界面活性剤、紫外線吸収剤、アルコール類、キレート剤、pH調整剤、防腐剤、増粘剤、色素類、香料及び各種皮膚栄養剤等を任意に組合せて配合することができる。
　具体的には、皮膚化粧料に配合される薬効成分、例えば微粒子酸化亜鉛、酸化チタン、パーソールＭＣＸ、パーソール１７８９等の紫外線吸収剤、アスコルビン酸等のビタミン類、ヒアルロン酸ナトリウム、ワセリン、グリセリン、尿素等の保湿剤、ホルモン剤、及びコウジ酸、アルブチン、プラセンタエキス、ルシノール等の他の美白成分、ステロイド剤、アラキドン酸代謝物やヒスタミン等に代表される化学伝達物質産生・放出抑制剤（インドメタシン、イブプロフェン）、レセプター拮抗剤等の抗炎症剤、抗男性ホルモン剤、ビタミンＡ酸、ローヤルゼリーエキス、ローヤルゼリー酸等の皮脂分泌抑制剤、ニコチン酸トコフェロール、アルプロスタジル、塩酸イソクスプリン、塩酸トラゾリン等の抹消血管拡張剤及び末梢血管拡張作用のある炭酸ガス等、ミノキシジル、塩化カルプロニウム、トウガラシチンキ、ビタミンＥ誘導体、イチョウエキス、センブリエキス等の血行促進剤、ペンタデカン酸グリセリド、ニコチン酸アミド等の細胞賦活化剤、ヒノキチオール、L-メントール、イソプロピルメチルフェノール等の殺菌剤、グリチルリチン酸およびその誘導体またはその塩等の薬剤、セラミド及びセラミド類似化合物等を添加配合することができる。
　また、上述した医薬品、医薬部外品、化粧品においては、例えばチョーク、タルク、フラー土、カオリン、デンプン、ゴム、コロイドシリカナトリウムポリアクリレート等の粉体；例えば鉱油、植物油、シリコーン油等の油又は油状物質；例えばソルビタントリオレエート、ソルビタントリステアレート、グリセロールモノオレエート、高分子シリコーン界面活性剤等の乳化剤；パラ－ヒドロキシベンゾエートエステル等の防腐剤；ブチルヒドロキシトルエン等の酸化防止剤；グリセロール、ソルビトール、２－ピロリドン－５－カルボキシレート、ジブチルフタレート、ゼラチン、ポリエチレングリコール等の湿潤剤；トリエタノールアミン又は水酸化ナトリウムのような塩基を伴う乳酸等の緩衝剤；グリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、アルキルグルコシド等の界面活性剤；密ろう、オゾケライトワックス、パラフィンワックス等のワックス類；増粘剤；活性増強剤；着色料；香料等、を必要に応じ適宜組合せて用いることができる。
　上述した活性成分を医薬、医薬部外品又は化粧料等として使用する場合、上述した活性成分の配合量は、クマリン誘導体換算で、通常、医薬、医薬部外品又は化粧料等の全組成の０．００００１～５質量％、特に０．０００１～０．１質量％とすることが好ましい。また、本発明に係るNFATシグナル阻害剤を医薬として用いる場合、上述した活性成分の投与量は、通常の成人（６０ｋｇ）で０．０１ｍｇ～１ｇ／１日とすることが望ましい。
　以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
〔実施例1〕アメリカンアンジェリカからの活性成分類の単離
（１）図１に示す工程に従って、アメリカンアンジェリカ（Angelica atropurpurea（セリ科）の根茎から本発明の化合物「成分A」、「成分B」及び「成分C」を単離した。
（２）アンジェリカ（Angelica atropurpurea）の根茎（160g）を95 w/v%エタノール-水（1.6L）に、常温（10～40℃）で5日間浸漬して抽出し、95 w/v%エタノール-水抽出液を得た。この抽出液をろ過後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、固形分14.3gを得た。この濃縮乾固物1gを中圧ODSカラムクロマトグラフィ（オクタデシルシリル化シリカゲル：内径2.6×30cm）に付し、アセトニトリル-0.1% TFA系で溶出し以下の画分（fr. A～K）を得た。
　ＨＰＬＣ分析
カラム：Inertsil ODS-3 (3μm, 2.1ｘ150mm)
溶出溶媒A:0.1%TFA, B:MeCN
　0%B→100%B(30min)→100％B(40min) →0%B(40.1min)→0%B(60min)
カラム温度37℃, 測定波長UV254nm, 流速0.25mL/min, 5μL inj.,
　なお、各画分固形分を50mLの95w/v%エタノールに溶解し、それぞれODS-HPLC（内径2.1×150mm、アセトニトリル-0.1% TFA系溶離液）にて分析したところ、リニア型フラノクマリンのキサントトキシンはfr. Fおよびfr. Gに、インペラトリンはfr. Hに存在していることを確認した（図２）。各画分固形分を50mLの95w/v％エタノール溶液について、後述の方法にてNFATシグナル阻害活性を調べたところ、最も強い活性はfr. Iに認められ、一方でインペラトリンやキサントトキシンを含むfr. F、fr. G、fr. Hには活性が全く又は殆ど認められなかったことから（図３）、アメリカンアンジェリカの主たるNFATシグナル阻害活性成分は、インペラトリンやキサントトキシン以外の成分であることが分かり、この結果は前述の非特許文献１０の記載からすると全く意外であった。
fr. A: 0.23g
fr. B: 0.01g
fr. C: 0.03g
fr. D: 0.07g
fr. E: 0.05g
fr. F: 0.02g
fr. G: 0.02g
fr. H: 0.15g
fr. I: 0.24g
fr. J: 0.10g
fr. K: 0.03g
（３）上記（２）で得られたNFATシグナル阻害画分であるfr. I(0.24g)を分取高速液体クロマトグラフィ（オクタデシルシリル化シリカゲル：内径10×250mm）に付し、アセトニトリル-0.1% TFA系（58%）系で溶出し、以下の画分（fr. I-1～I-8）を得た。
fr. I - 1: 46.5mg
fr. I - 2: 27.6mg
fr. I - 3: 3.4mg
fr. I - 4: 6.3mg
fr. I - 5: 18.8mg
fr. I - 6: 84.6mg
fr. I - 7: 5.4mg
fr. I - 8: 46.9mg
　本発明の化合物は、分析の結果、fr. I-6(成分A)、fr. I-8(成分B)、fr. I-5(成分C)にほぼ単一化合物として得られた。
　〔実施例2〕成分A、成分B及び成分Cの同定
（１）実施例1で得られた化合物について、1H NMR解析及び13C NMR解析を行った。
1H NMR（500 MHz, CDCl3）及び13C NMR(125 MHz, CDCl3)解析の結果として得られたデータを表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（２）表１に示した解析結果より、成分A、成分B及び成分Cの化合物は下記構造を有するアンギュラー型フロクマリン誘導体であることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　すなわち、成分A、成分B及び成分Cは、それぞれアルカンジェリシン、3’-angeloyloxy-4’-isovaleryloxy-2’,3’-dihydrooroselol及び3’-angeloyloxy-4’-senecioyloxy-2’,3’-dihydrooroselolであることが判った。ここで、成分Cの3’-angeloyloxy-4’-senecioyloxy-2’,3’-dihydrooroselolは過去に報告例がなく、新規化合物であった。
〔実施例３〕成分A(アルカンジェリシン)の脱アシル体の調製
　本例では、実施例１及び２で成分Aとして単離したアルカンジェリシンの脱アシル化を行った。まず、成分A(70mg)を7mLのアセトンに溶解後、濃アンモニア水7ｍLを添加し、室温で一昼夜攪拌した。反応液を濃縮後（75mg）、分取高速液体クロマトグラフィ（内径10×250mm）に付し、0.1%ギ酸-アセトニトリル系で溶出し、主生成物を分取した（17mg）。
〔実施例４〕成分A(アルカンジェリシン)の脱アシル体の同定
　（１）実施例３で得られた化合物について、1H NMR解析及び13C NMR解析を行った。1H NMR（500MHz, CDCl3）及び13C NMR(125MHz, CDCl3)解析の結果として得られたデータを表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　（２）表２に示した解析分析より、実施例３における生成物はアルカンジェリシンの3’位のアンゲロイル基が脱離した、下記構造を有するアンギュラー型フロクマリン誘導体であることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
〔実施例５〕NFATシグナル阻害効果
　本例では、実施例１で得られた成分A、成分B及び成分C並びに実施例３で調製した成分Aの脱アシル体についてのNFATシグナル阻害効果を検証した。
（１）評価システムのための材料及び方法
細胞培養
　上記評価システムには、ヒト腎（HEK293）細胞をATCC（American Type Culture Collection）より購入し、使用した。HEK293細胞は、DMEM（High glucose、10% heat-inactivated FBS）中37℃、5% CO2条件下で培養した。
プラスミド、トランスフェクション
　上記評価システムには、NFAT結合配列の下流にホタルルシフェラーゼが導入されたプラスミドpNFAT-Luc（Stratagene）をHEK293細胞にトランスフェクションしたものを使用した。詳細には、NFAT転写活性の評価用に4連のNFAT結合配列の下流にホタルルシフェラーゼ遺伝子が導入されたpNFAT-luc（STRATAGENE）をHEK293細胞にトランスフェクションした。また、トランスフェクション効率によるばらつきをなくすことを目的として、ホタルルシフェラーゼに由来するシグナルを補正するためにCMV promoterの下流にウミシイタケルシフェラーゼが導入されたpRL-CMV（Promega）を同時にトランスフェクションした。
　トランスフェクションは、LipofectAMINE 2000 reagent（Invitrogen）を用いて使用説明書に従って行った。トランスフェクションの8時間後に培地を交換し、一晩インキュベートした。その後、実施例１で得られた成分A、成分B及び成分C並びに実施例３で調製した成分Aの脱アシル体を添加し、その1時間後に1μM Ionomycinを添加した。8時間後、ルシフェラーゼレポーターアッセイを行った。
ルシフェラーゼレポーターアッセイ
　ルシフェラーゼレポーターアッセイは、Dual-Glo Luciferase Assay System（Promega）を用い、使用説明書に従って行った。すなわち、培地を除去後、PBSにより2倍希釈したDual-Glo luciferase reagentを加え、攪拌した後、20分後にホタルルシフェラーゼ活性を測定した。その後、等量のDual-Glo Stop&Glo reagentを加え、攪拌した後にウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ活性測定はMiniLumat LB 9506（EG&G BERTHOLD）を用いて行い、ルシフェラーゼによる発光量を定量的に検出した。双方ともルシフェラーゼ活性の測定時間は2秒とした。
NFATシグナル阻害率の算出
　全てのNFAT転写活性（ホタルルシフェラーゼ活性）はトランスフェクション効率補正のために導入されたウミシイタケルシフェラーゼ活性にて除することで補正した。その後、NFATシグナル阻害率を以下の式にて算出した。
　下記計算により、Ionomycin刺激によるNFATシグナル活性化をテストサンプルが何%阻害したかについて算出することができる。
　　NFATシグナル阻害率（%）＝100－（試験サンプル及びIonomycin添加群－無刺激群）／（Ionomycinのみ添加群－無刺激群）×100
結果
　NFATシグナル阻害率を算出した結果を図４に示す。図４から判るように、実施例１で得られた成分A、成分B及び成分C並びに実施例３で調製した成分Aの脱アシル体は、いずれもNFATシグナルを阻害した。すなわち、成分A、成分B及び成分Aの脱アシル体は、NFATにより正に制御される転写を抑制することができる。したがって、成分A、成分B及び成分Aの脱アシル体は、優れたNFATシグナル阻害剤であり、例えば免疫抑制剤、乾癬治療剤、アトピー性皮膚炎治療剤、（心）筋肥大抑制剤及び抗リウマチ薬等の候補物質として同定されたこととなる。
〔実施例６〕育毛効果
　本例では、対象物質の育毛効果を検証できるin vitroの実験系を用いて実施例１で得られた成分A及び成分Bの育毛効果を検証した。
ブタ毛包器官培養による毛伸長評価
　食肉用豚種の臀部皮膚を適当な大きさに切り分け、余分な脂肪組織を除いた。豚皮は無菌下でヒビテン液（5%ヒビテン液（住友製薬）を水で5～20倍に希釈）に5分～10分浸することにより消毒を行った後にD-PBSで数回洗浄した。その後、実体顕微鏡下にて洗浄した豚皮から毛包を単離してWilliam's Medium E培地（Invitrogen）培地中に集めた。
　単離した毛包は、1ウェルあたり400μlのWilliam's Medium E培地（1% Penicillin-Streptomycin 溶液（Invitrogen）添加）が入った24ウェル培養プレートに1本ずつ入れた。毛包は37℃、5% CO2条件下にて8日間培養し、その間、1日または2日おきに培地の交換を行った。
　上記の培地に実施例１で得られた成分A、成分Bを添加し、溶媒コントロールであるエタノール添加群とともに8日間培養した。培養を開始日（0日目）および8日目の実体顕微鏡画像をCCDカメラ（pixera model.No.PVC 100C）で撮影し、その画像から毛球部基底部から毛幹先端までの長さを測定した。その後、溶媒コントロール群の培養前後における毛伸長量を100%として実施例１で得られた成分A及び成分Bの毛伸長率を算出した。
結果
　毛伸長率を算出した結果を図６に示す。図６から判るように、実施例１で得られた成分A及び成分Bの添加群においては、溶媒コントロール群と比較して有意な毛伸長が認められた。この結果から、実施例１で得られた成分A及び成分BCは育毛効果を有することが明らかとなった。すなわち、実施例１で得られた成分A及び成分Bは、育毛効果を示す活性成分であり、育毛剤として、或いは外用剤として使用できることが明らかとなった。

Claims (19)

  1. 　次の一般式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
     （上記一般式（Ｉ）中、Ｒ１及びＲ２は、各々同じであっても異なっていてもよく、水素原子又は一般式（ＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
     で示される基〔上記一般式（ＩＩ）中、Ｒ３は炭素数１～２０の直鎖又は分枝のアルキル基又はアルケニル基を示す〕である）で示されるクマリン誘導体及び薬理学的に許容されるそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を有効成分とするNFATシグナル阻害剤。
  2. 　上記式（Ｉ）中、Ｒ１がアンゲロイル基、イソバレロイル基及びセネシオイル基からなる群から選ばれる少なくとも１種の官能基であり、Ｒ２はアンゲロイル基、イソバレロイル基、２メチルブチル基及びセネシオイル基からなる群から選ばれる少なくとも１種の官能基である請求項１記載のNFATシグナル阻害剤。
  3. 　上記一般式（１）で表されるクマリン誘導体が、アルカンジェリシン、3’-angeloyloxy-4’-isovaleryloxy-2’,3’-dihydrooroselol、3’-angeloyloxy-4’-senecioyloxy-2’,3’-dihydrooroselol及び3’-hydroxy-4’-angeloyloxy-2’,3’-dihydrooroselolからなる群より選択される少なくとも１種の化合物である請求項１記載のNFATシグナル阻害剤。
  4. 　次の一般式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
     （上記一般式（Ｉ）中、Ｒ１及びＲ２は、各々同じであっても異なっていてもよく、水素原子又は一般式（II）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
     で示される基〔上記一般式（II）中、Ｒ３は炭素数１～２０の直鎖又は分枝のアルキル基又はアルケニル基を示す〕である）で示されるクマリン誘導体及び薬理学的に許容されるそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を有効成分とする育毛剤。
  5. 　上記式（Ｉ）中、Ｒ１がアンゲロイル基、イソバレロイル基及びセネシオイル基からなる群から選ばれる少なくとも１種の官能基であり、Ｒ２はアンゲロイル基、イソバレロイル基、２メチルブチル基及びセネシオイル基からなる群から選ばれる少なくとも１種の官能基である請求項４記載の育毛剤。
  6. 　上記一般式（１）で表されるクマリン誘導体が、アルカンジェリシン、3’-angeloyloxy-4’-isovaleryloxy-2’,3’-dihydrooroselol、及び3’-hydroxy-4’-angeloyloxy-2’,3’-dihydrooroselolからなる群より選択される少なくとも１種の化合物である請求項４記載の育毛剤。
  7. 　次の一般式（III）で示される化合物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
  8. 　NFATシグナル阻害剤を製造するための、次の一般式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
     （上記一般式（Ｉ）中、Ｒ１及びＲ２は、各々同じであっても異なっていてもよく、水素原子又は一般式（ＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
     で示される基〔上記一般式（ＩＩ）中、Ｒ３は炭素数１～２０の直鎖又は分枝のアルキル基又はアルケニル基を示す〕である）で示されるクマリン誘導体及び薬理学的に許容されるそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物の使用。
  9. 　上記式（Ｉ）中、Ｒ１がアンゲロイル基、イソバレロイル基及びセネシオイル基からなる群から選ばれる少なくとも１種の官能基であり、Ｒ２はアンゲロイル基、イソバレロイル基、２メチルブチル基及びセネシオイル基からなる群から選ばれる少なくとも１種の官能基である請求項８記載の使用。
  10. 　上記一般式（１）で表されるクマリン誘導体が、アルカンジェリシン、3’-angeloyloxy-4’-isovaleryloxy-2’,3’-dihydrooroselol、3’-angeloyloxy-4’-senecioyloxy-2’,3’-dihydrooroselol及び3’-hydroxy-4’-angeloyloxy-2’,3’-dihydrooroselolからなる群より選択される少なくとも１種の化合物である請求項８記載の使用。
  11. 　育毛剤を製造するための、次の一般式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
     （上記一般式（Ｉ）中、Ｒ１及びＲ２は、各々同じであっても異なっていてもよく、水素原子又は一般式（II）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
     で示される基〔上記一般式（II）中、Ｒ３は炭素数１～２０の直鎖又は分枝のアルキル基又はアルケニル基を示す〕である）で示されるクマリン誘導体及び薬理学的に許容されるそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物の使用。
  12. 　上記式（Ｉ）中、Ｒ１がアンゲロイル基、イソバレロイル基及びセネシオイル基からなる群から選ばれる少なくとも１種の官能基であり、Ｒ２はアンゲロイル基、イソバレロイル基、２メチルブチル基及びセネシオイル基からなる群から選ばれる少なくとも１種の官能基である請求項１１記載の使用。
  13. 　上記一般式（１）で表されるクマリン誘導体が、アルカンジェリシン、3’-angeloyloxy-4’-isovaleryloxy-2’,3’-dihydrooroselol、及び3’-hydroxy-4’-angeloyloxy-2’,3’-dihydrooroselolからなる群より選択される少なくとも１種の化合物である請求項１１記載の使用。
  14. 　次の一般式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
     （上記一般式（Ｉ）中、Ｒ１及びＲ２は、各々同じであっても異なっていてもよく、水素原子又は一般式（ＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
     で示される基〔上記一般式（ＩＩ）中、Ｒ３は炭素数１～２０の直鎖又は分枝のアルキル基又はアルケニル基を示す〕である）で示されるクマリン誘導体及び薬理学的に許容されるそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を投与するNFATシグナル阻害方法。
  15. 　上記式（Ｉ）中、Ｒ１がアンゲロイル基、イソバレロイル基及びセネシオイル基からなる群から選ばれる少なくとも１種の官能基であり、Ｒ２はアンゲロイル基、イソバレロイル基、２メチルブチル基及びセネシオイル基からなる群から選ばれる少なくとも１種の官能基である請求項１４記載のNFATシグナル阻害方法。
  16. 　上記一般式（１）で表されるクマリン誘導体が、アルカンジェリシン、3’-angeloyloxy-4’-isovaleryloxy-2’,3’-dihydrooroselol、3’-angeloyloxy-4’-senecioyloxy-2’,3’-dihydrooroselol及び3’-hydroxy-4’-angeloyloxy-2’,3’-dihydrooroselolからなる群より選択される少なくとも１種の化合物である請求項１４記載のNFATシグナル阻害方法。
  17. 　次の一般式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
     （上記一般式（Ｉ）中、Ｒ１及びＲ２は、各々同じであっても異なっていてもよく、水素原子又は一般式（II）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
     で示される基〔上記一般式（II）中、Ｒ３は炭素数１～２０の直鎖又は分枝のアルキル基又はアルケニル基を示す〕である）で示されるクマリン誘導体及び薬理学的に許容されるそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を投与する育毛方法。
  18. 　上記式（Ｉ）中、Ｒ１がアンゲロイル基、イソバレロイル基及びセネシオイル基からなる群から選ばれる少なくとも１種の官能基であり、Ｒ２はアンゲロイル基、イソバレロイル基、２メチルブチル基及びセネシオイル基からなる群から選ばれる少なくとも１種の官能基である請求項１７記載の育毛方法。
  19. 　上記一般式（１）で表されるクマリン誘導体が、アルカンジェリシン、3’-angeloyloxy-4’-isovaleryloxy-2’,3’-dihydrooroselol、及び3’-hydroxy-4’-angeloyloxy-2’,3’-dihydrooroselolからなる群より選択される少なくとも１種の化合物である請求項１７記載の育毛方法。
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