JP5547381B2 - 育毛剤及びnfatシグナル阻害剤 - Google Patents
育毛剤及びnfatシグナル阻害剤 Download PDFInfo
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Description
アンソクコウノキ抽出物の製造
アンソクコウノキの樹脂(産地不明)を10gとり、100mLの50%エタノールを加え、室温で7日間静置抽出後、ろ過して抽出液106mLを得た。蒸発残分7.8w/v%であった。
オノスマ・ヒスピヅムの根茎(ネパール産)を10gとり、100mLの95%エタノールを加え、室温で7日間静置抽出後、ろ過して抽出液79mLを得た。エバポレーターにてこの抽出液を濃縮し、エタノールを加えて26mLに溶解させた。蒸発残分0.6w/v%であった。
チョウカシの果実(中国産)を10gとり、100mLの50%エタノールを加え、室温で7日間静置抽出後、ろ過して抽出液87mLを得た。エバポレーターにてこの抽出液を濃縮し、エタノールを加えて58mLに溶解させた。蒸発残分0.7w/v%であった。
本例では、NFATシグナル阻害効果を検証するための評価システムを構築し、当該評価システムを用いて実施例1で製造した植物抽出物についてのNFATシグナル阻害効果を検証した。
細胞培養
上記評価システムには、ヒト腎(HEK293)細胞をATCC(American Type Culture Collection)より購入し、使用した。HEK293細胞は、DMEM(High glucose、10% heat-inactivated FBS)中37℃、5% CO2条件下で培養した。
上記評価システムには、NFAT結合配列の下流にホタルルシフェラーゼが導入されたプラスミドpNFAT-Luc(Stratagene)をHEK293細胞にトランスフェクションしたものを使用した。詳細には、NFAT転写活性の評価用に4連のNFAT結合配列の下流にホタルルシフェラーゼ遺伝子が導入されたpNFAT-luc(STRATAGENE)をHEK293細胞にトランスフェクションした。また、トランスフェクション効率によるばらつきをなくすことを目的として、ホタルルシフェラーゼに由来するシグナルを補正するためにCMV promoterの下流にウミシイタケルシフェラーゼが導入されたpRL-CMV(Promega)を同時にトランスフェクションした。
ルシフェラーゼレポーターアッセイは、Dual-Glo Luciferase Assay System(Promega)を用い、使用説明書に従って行った。すなわち、培地を除去後、PBSにより2倍希釈したDual-Glo luciferase reagentを加え、攪拌した後、20分後にホタルルシフェラーゼ活性を測定した。その後、等量のDual-Glo Stop&Glo reagentを加え、攪拌した後にウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ活性測定はMiniLumat LB 9506(EG&G BERTHOLD)を用いて行い、ルシフェラーゼによる発光量を定量的に検出した。双方ともルシフェラーゼ活性の測定時間は2秒とした。
全てのNFAT転写活性(ホタルルシフェラーゼ活性)はトランスフェクション効率補正のために導入されたウミシイタケルシフェラーゼ活性にて除することで補正した。その後、NFATシグナル阻害率を以下の式にて算出した。
NFATシグナル阻害率(%)=100−(試験サンプル及びIonomycin添加群−無刺激群)/(Ionomycinのみ添加群−無刺激群)×100
上記計算により、Ionomycin刺激によるNFATシグナル活性化をテストサンプルが何%阻害したかについて算出することができる。
実施例1で製造した3種類の植物抽出物によるNFATシグナル阻害率を表1に示した。
本例では、対象物質の育毛効果を検証できるin vitroの実験系を用いて実施例1で製造した植物抽出物の育毛効果を検証した。
食肉用豚種の臀部皮膚を適当な大きさに切り分け、余分な脂肪組織を除いた。豚皮は無菌下でヒビテン液(5%ヒビテン液(住友製薬)を水で5〜20倍に希釈)に5分〜10分浸することにより消毒を行った後にD-PBSで数回洗浄した。その後、実体顕微鏡下にて洗浄した豚皮から毛包を単離してWilliam's Medium E培地(Invitrogen)培地中に集めた。
Claims (3)
- アンソクコウノキ植物の樹脂又はチョウカシ植物の果実の水性アルコール抽出物を有効成分とする育毛剤。
- アンソクコウノキ植物の樹脂又はチョウカシ植物の果実の水性アルコール抽出物を有効成分とするNFATシグナル阻害剤。
- 対象の細胞又は組織に対して、請求項2記載のNFATシグナル阻害剤を接触させる、人体への処置を除くNFAT活性阻害方法。
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