WO2010044481A1 - 生体リズム予測方法 - Google Patents

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biological
clock
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温彦 相馬
山本　拓郎
真 明石
野出　孝一
岸井　典之
和博 中川
志功 山下
智広 早川
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ソニー株式会社
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    • G16B25/00—ICT specially adapted for hybridisation; ICT specially adapted for gene or protein expression

Definitions

  • the present invention relates to a method for predicting a biological rhythm of an individual to be examined. More specifically, the present invention relates to a method for predicting a biological rhythm by collecting a biological sample from a test individual only three times within 24 hours.
  • rhythm a periodic rhythm that vibrates independently.
  • This periodic rhythm is called “biological rhythm”.
  • circadian rhythm which has a cycle of about one day, is widely known to dominate biological phenomena such as salivary arousal cycle, body temperature, blood pressure, and diurnal fluctuations in hormone secretion. Yes.
  • the circadian rhythm is also related to the physical and mental activity level, exercise ability, drug sensitivity, and the like.
  • the biological rhythm is controlled by a group of genes called “clock genes”.
  • the clock gene functions as an “internal clock” by autonomously changing (vibrating) its expression, activity, localization, and the like.
  • Patent Document 1 discloses a method of estimating the body time based on gene expression product amount measurement data of a standard sample collected from an individual organism. In this body time estimation method, a molecular clock table for estimating body time is created based on the expression level of a gene expression product (that is, mRNA).
  • the main object of the present invention is to provide a method capable of predicting a biological rhythm with high accuracy by minimizing the number of biological samples collected from a subject.
  • the present invention is obtained by measuring the expression levels of two clock genes having different circadian phase phases of expression level changes from biological samples collected from test subjects three times within 24 hours.
  • a method for predicting the biological rhythm of an individual subject based on the time-series expression level data includes the following procedure.
  • a procedure for collecting a biological sample from a test individual three times within 24 hours (2) A procedure for measuring the expression level in a biological sample for two clock genes having different circadian phase phases of expression level change, (3) A procedure for calculating the circadian cycle from the time series expression level data obtained by the procedures (1) and (2).
  • the circadian period is calculated from the time series expression level data by the following formulas (I) and (II).
  • Ea (t), Aa, ⁇ , and Ca indicate the expression level, amplitude, initial phase, and offset value of one clock gene at the time t.
  • Eb ( t), Ab, and Cb represent the expression level, amplitude, and offset value of other clock genes at time t.
  • ⁇ represents the phase difference between the two clock genes.
  • Three-point sampling data is calculated from the time, the expression level at that time, and the above formulas (I) and (II), and the maximum value of the expression level is given between the model data and the three-point sampling data
  • the time difference of the time is calculated, and three time points where the average value of the time difference is less than 0.6 and the standard error is less than 0.4 are calculated, and these three time points are taken within 24 hours as the sampling time. It is preferable to collect the biological sample three times.
  • the biological rhythm can be predicted with high accuracy by collecting the biological sample three times at intervals of 8 hours within 24 hours from the subject.
  • the clock gene can be a Per3 gene and an Nr1d2 gene.
  • phase refers to an amount that characterizes the position / state of points such as peaks and valleys in a periodic fluctuation in one cycle.
  • the circadian period of the change in the expression level of the clock gene can be observed as a cosine wave function represented by the following formula (III).
  • E (t) represents the expression level of the clock gene at time t
  • A represents the amplitude of the expression level
  • C represents the offset value.
  • phase means the cosine of the formula (III), and specifically refers to “2 ⁇ (t + ⁇ ) / 24” of the formula (III).
  • phase difference refers to the difference in initial phase ⁇ between clock genes.
  • the present invention provides a method capable of predicting a biological rhythm with high accuracy by minimizing the number of biological samples collected from a subject.
  • FIG. 1 is a graph plotting the time when the maximum value of the expression level is given in the circadian cycle of the expression level change of the Per3 gene and the Nr1d2 gene (Example 1).
  • the X axis indicates the time when the expression level of the Per3 gene reaches the maximum value
  • the Y axis indicates the time when the expression level of the Nr1d2 gene reaches the maximum value.
  • the dotted line indicates the plot position where the time difference (phase difference) between the two times is 2 hours.
  • FIG. 2 is a diagram in which the time difference between the circadian period calculated at the sampling time interval and the time of giving the maximum value of the expression level between the model data is plotted for the time interval of the three sampling times ( Example 2).
  • the X axis indicates the standard error of the time difference in the sampling time interval
  • the Y axis indicates the average value.
  • FIG. 3 shows the circadian cycle of the change in the expression level of Per3 calculated by performing all three samplings with a time interval (A) of “8:08” or a time interval (B) of “9:15” from the model data. (Example 2) which is a figure which shows these.
  • reference numeral 1 denotes Per3 of model data
  • reference numeral 2 denotes a circadian cycle of Nr1d2 of model data
  • Reference numeral 3 represents Per3 of the three-point sampling data
  • reference numeral 4 represents the circadian period of Nr1d2 of the three-point sampling data.
  • FIG. 4 is a diagram showing circadian cycles of changes in expression levels of Per3 gene and Nr1d2 gene calculated by 3-point sampling at 8 hour intervals (Example 3).
  • symbols a1, b1, and c1 are circadian periods of the Per3 gene of the three-point sampling patterns a, b, and c, respectively
  • symbols a2, b2, and c2 are symbols of the Nr1d2 gene of the three-point sampling patterns a, b, and c, respectively.
  • Symbols d1 and d2 indicate the circadian period of the Per3 gene and Nr1d2 obtained by 7-point sampling.
  • the present inventors can reduce the number of times a biological sample is collected from a test individual by predicting a biological rhythm using a shift in the expression level change cycle between a plurality of clock genes. We thought that it might be, and examined. Then, by using two clock genes with different circadian phase phases of the expression level change as the measurement target, the biological rhythm can be obtained with high accuracy only by collecting biological samples from the test individual three times within 24 hours. It was found that can be predicted. That is, the biological rhythm prediction method according to the present invention measures the expression levels of two clock genes having different circadian cycle phases of expression level changes from a biological sample collected three times within 24 hours from the subject individual, Based on the obtained time-series expression level data, the biological rhythm of the test individual is predicted.
  • the circadian cycle of the change in the expression level of each clock gene can be expressed by the following cosine curve equation. It can be modeled by (I) and (II).
  • Ea (t), Aa, ⁇ , and Ca indicate the expression level, amplitude, initial phase, and offset value of the clock gene a at the time t.
  • Eb (t), Ab, and Cb indicate the expression level, amplitude, and offset value of the clock gene b at time t.
  • the cosine curve equations (I) and (II) are equations including five unknown constants ( ⁇ , Aa, Ab, Ca, Cb).
  • the biological rhythm prediction method includes (1) a procedure in which a biological sample is collected from a test individual three times within 24 hours, and (2) two phases with different circadian cycles of expression change.
  • a procedure for measuring the expression level in the biological sample a procedure for measuring the expression level in the biological sample
  • a procedure for calculating the circadian cycle of the expression level change of each clock gene from the time series expression level data obtained by these procedures including.
  • the subject individual to be tested includes a wide range of experimental animals such as mice, rats, monkeys, etc., in addition to humans. 2. Collection of biological sample
  • the biological sample collected from the subject individual is not particularly limited as long as it is a biological tissue containing a gene expression product (mRNA) of a clock gene.
  • mRNA gene expression product
  • a biological tissue that can be collected from the body surface such as hair, oral mucosa, and skin.
  • Hair sampling can be performed by removal.
  • Hair follicle cells are attached to the extracted hair root, and the clock gene mRNA in the cells can be measured.
  • the “hair follicle cell” refers to a group of cells that form an inner root sheath, an outer root sheath, and a papilla that adhere to the hair root of the removed body hair. It shall be said.
  • the hair sampling site is not particularly limited, and hair, wrinkles, arms and legs can be used. In order to suppress variation in measurement, it is desirable to perform each sampling at a nearby site.
  • the number of hairs sampled at one time is about 5 to 10 for human hair, 3 to 5 for hair, and about 10 to 20 for arm hair.
  • an amount of mRNA sufficient for quantifying the expression of clock genes can be extracted.
  • Sampling of the oral mucosa can be performed, for example, by scraping off the surface of the oral mucosa with a brush or a spatula. Thereby, the clock gene mRNA in the oral mucosa cells scraped off can be measured.
  • the sampling site of the oral mucosa is preferably the mucous membrane on the back side of the cheek, and it is desirable to collect it from the left and right mucosa in order to suppress variation in measurement.
  • the present inventors have examined the time interval of three sampling times in order to enable highly accurate biological rhythm prediction. As a result, it has been found that a biological sample can be obtained with high accuracy by collecting the biological sample three times at intervals of 8 hours within 24 hours from the test individual (see Example 2). That is, in the biological rhythm prediction method according to the present invention, the time interval between the first sampling time and the second sampling time and the time interval between the second sampling time and the third sampling time are both 8 hours. By performing sampling three times as described above, the biological rhythm can be predicted with the highest accuracy. 3. Measurement of expression level The expression level of a clock gene in a biological sample can be measured by a conventionally known method.
  • RNA is extracted from a biological sample using a commercially available RNA extraction kit, and cDNA is synthesized by a reverse transcription reaction using the extracted RNA as a template. Then, using this cDNA, the expression level is quantified by an exhaustive analysis method such as a DNA microarray (DNA chip) or an individual analysis method such as real-time PCR.
  • the clock gene to be measured may be a group of clock genes that have been identified to date. Representative clock genes include Per3 gene (NCBI Accession No.
  • time-series expression amount data is obtained by measuring expression amounts of two genes having different daily fluctuation phases of expression amount changes among these clock genes.
  • the expression level of the homologue (homology gene) in the target organism of the human clock gene is measured.
  • the two clock genes selected can be in any combination as long as the phase of the daily fluctuation of the expression level change is different.
  • the phase of the daily fluctuation of the expression level change of any two selected clock genes can be determined by the method described later in Example 1, for example.
  • the Per3 gene and the Nr1d2 gene can be used as a suitable combination of two clock genes.
  • the Per3 gene and the Nr1d2 gene are stably expressed in a biological sample, and the daily fluctuation (amplitude) of the expression level is large. Therefore, the biological rhythm can be accurately predicted by calculating the circadian cycle of the expression level change of the Per3 gene and the Nr1d2 gene from these time-series expression level data. 4).
  • the circadian cycle of the change in the expression level of the clock gene is calculated from the time-series expression level data indicating the temporal change in the gene expression level by the following formulas (I) and (II).
  • Ea (t), Aa, ⁇ , and Ca indicate the expression level, amplitude, initial phase, and offset value of the clock gene a at the time t.
  • Eb (t), Ab, and Cb indicate the expression level, amplitude, and offset value of the clock gene b at time t.
  • ⁇ represents the phase difference between both clock genes.
  • the burden on the subject for collecting the biological sample can be reduced. Furthermore, by performing three-point sampling at 8 hour intervals, a biological sample can be collected only during the time period when the subject is awake, so that the subject's sleep / wake cycle is not affected and accurate. Biological rhythm can be predicted.
  • the Per3 gene (hereinafter simply referred to as “Per3”) and the Nr1d2 gene (hereinafter referred to as “ Nr1d2 ”) was selected, and the phase difference of the circadian cycle of changes in the expression levels of both genes was determined.
  • Hair was collected from 15 men and women between the ages of 20-50.
  • a cell lysate was prepared by quickly immersing the hair root portion to which the hair follicle cells were attached in a cell lysis buffer (RNeasy Microkit: QIAGEN). Hair was collected at intervals of 3 to 4 hours, and 5 to 20 hairs were collected at each collection time.
  • RNA was extracted from the cell lysate stored at ⁇ 70 ° C. and subjected to reverse transcription.
  • Real-time PCR was performed using 1/20 of the reverse transcript, and the expression levels of Per3 and Nr1d2 were quantified.
  • Real-time PCR was performed with PRISM7300 (ABI) using SYBR Green (ABI) or TaqMan MGB probe (ABI).
  • the expression levels of Per3 and Nr1d2 were corrected by the expression level of 18S-rRNA as an internal standard, and used as time-series expression level data.
  • the obtained time-series expression level data was subjected to cosine fitting of the following cosine curve formula (IV) with a 24-hour period by the non-linear least square method to determine the phase difference of the circadian period of the expression level change of Per3 and Nr1d2.
  • E (t) is the expression level at time t
  • A is the amplitude of the expression level
  • ⁇ is the initial phase
  • C is the offset value.
  • the results are shown in FIG. The figure plots the time t giving the maximum expression level E (t) in the cosine curve equation (IV) after performing cosine fitting.
  • the time t at which the expression level E (t) of Per3 reaches the maximum value is plotted on the X axis
  • the time t at which the expression level E (t) of Nr1d2 reaches the maximum value is plotted on the Y axis.
  • the time t at which the expression level E (t) of Per3 reaches the maximum value for 15 subjects was widely scattered from 0:00 to 12:00.
  • the time t at which the maximum expression level E (t) is given for Nr1d2 is widely scattered from 0:00 to 12:00.
  • phase difference ⁇ the time difference between the time t at which the expression level E (t) of Per3 reaches the maximum value and the time t at which the expression level E (t) of Nr1d2 reaches the maximum value.
  • the value was close to.
  • the dotted line indicates the plot position when the phase difference between Per3 and Nr1d2 is 2 hours.
  • the average value and standard deviation of the phase difference between Per3 and Nr1d2 obtained for the 15 subjects were 2.3 and 0.8, respectively.
  • phase difference ⁇ circadian cycles of changes in the expression levels of Per3 and Nr1d2 were modeled by the following cosine curve equations (V) and (VI), respectively.
  • Eper3 (t) is the expression level of Per3 at time t, Aper3 is the amplitude of the expression level, ⁇ is the initial phase of Per3, and Cper3 is the offset value
  • Enr1d2 (t) is the expression level of Nr1d2 at time t
  • Anr1d2 is the amplitude of the expression level
  • ⁇ is the phase difference of the circadian period of the expression level change of Per3 and Nr1d2
  • Cnr1d2 is the offset value
  • the sum of squares d of the expression level v (t) substituted into the expressions (V) and (VI) and the expression level E (t) of the model data indicating the expression level change every hour is calculated.
  • the distance between the three-point sampling data and the model data was defined by the following formula (VII).
  • the amplitudes Aper3 ⁇ Anr1d2, the initial phase ⁇ , and the offset values Cper3 ⁇ Cnr1d that minimize the distance d were obtained by the conjugate gradient method.
  • the initial value of the unknown constant greatly affects the constant to be obtained. Therefore, unless an appropriate initial value is set, the distance d falls to a local extreme value, and the original circadian period cannot be obtained. Therefore, here, as an appropriate initial value of the amplitudes Aper3 and Anr1d2, an average value of the amplitude A of the model data indicating the change in the expression level every hour was set. Further, the average value of the three-point sampling data was set as the initial value for the offset values Cper3 and Cnr1d2. As for the amplitude A of the model data, the amplitude Aper3 of Per3 is 0.8014513, and the amplitude Anr1d2 of Nr1d2 is 0.6402411.
  • the initial phase ⁇ of Per3 is limited to an integer from 0 to 23 in order to facilitate calculation analysis. Then, an integer from 0 to 23 was given as an initial value one by one, and the conjugate gradient method was applied to obtain an initial phase ⁇ that can give the minimum distance d.
  • the amplitude t of the expression level Aper3, the initial phase ⁇ of Per3, the time t at which the maximum value of the expression level v (t) is obtained in the equation (V) for obtaining the offset value Cper3, and the expression level v in the model data The time difference from the time giving the maximum value of (t) was determined. And the time interval of the sampling time that this time difference becomes the minimum was examined.
  • the combinations of time intervals are listed in “Table 1” to “Table 5” in order from the smallest standard error and average value.
  • the time interval is displayed by combining the time interval between the first sampling time and the second sampling time and the time interval between the second sampling time and the third sampling time.
  • “13:06” in the figure indicates that the time interval between the first sampling time and the second sampling time is 13 hours, and the time interval between the second sampling time and the third sampling time is 6 hours.
  • FIG. 2 is a diagram in which combinations of time intervals are plotted with the X axis as the standard error and the Y axis as the average value. As shown in “Table 1” to “Table 5” and FIG.
  • reference numeral 3 shows the circadian changes in the expression level of Per3 calculated by performing all three samplings from the model data at the time interval (A) of “8:08” or the time interval (B) of “9:15”. Indicates the period.
  • reference numeral 1 denotes Per3 of model data
  • reference numeral 2 denotes a circadian cycle of Nr1d2 of model data
  • Reference numeral 3 represents Per3 of the three-point sampling data
  • reference numeral 4 represents the circadian period of Nr1d2 of the three-point sampling data. In the case where both the first and second samplings and the second and third samplings are performed at 8 hour intervals shown in FIG.
  • the model data and the three-point sampling data Per3 and Nr1d2 The circadian cycles are in good agreement and the circadian cycle is calculated with high accuracy.
  • the first and second samplings are performed at 9-hour intervals, and the second and third samplings are performed at 15-hour intervals as shown in FIG. It can be seen that the circadian cycles of the sampling data Per3 and Nr1d2 do not match and the circadian cycle cannot be calculated.
  • symbols a1, b1, and c1 are circadian periods of the Per3 gene of the three-point sampling patterns a, b, and c, respectively, and symbols a2, b2, and c2 are symbols of the Nr1d2 gene of the three-point sampling patterns a, b, and c, respectively.
  • the symbols d1 and d2 are obtained by cosine fitting the cosine curve equation (IV) to the time series expression amount data obtained by sampling 7 times from 12:00 to 36:00 by the nonlinear least square method. Circadian cycle.
  • Reference sign d1 indicates Per3, and reference sign d2 indicates the circadian period of Nr1d2. As shown in FIG.
  • the circadian period of the expression level change of Per3 and Nr1d2 was calculated with good reproducibility in the three-point sampling a to c.
  • the error was 0.75 hours on average. From this result, by calculating the circadian cycle of the expression level change by three-point sampling of the expression levels of Per3 and Nr1d2 in which the phase of the circadian cycle of the expression level change is different, the biological rhythm of the subject can be accurately determined. It was shown to be predictable.
  • the biological rhythm prediction method according to the present invention can be used for the realization of temporal medicine, the display of self-abilities, and dieting. In addition, it can be used for prevention of various diseases caused by deviations in biological rhythm and improvement of poor physical condition such as jet lag.

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Abstract

　被検個体からの生体試料の採取回数を最小限にして、高い精度で生体リズムを予測できる方法の提供。　被検個体から２４時間以内に３回採取した生体試料について、発現量変化の概日周期の位相が異なる２つの時計遺伝子の発現量を測定し、得られた時系列発現量データに基づいて、被検個体の生体リズムを予測する方法を提供する。この生体リズム予測方法では、被検個体から２４時間以内に８時間間隔で３回生体試料を採取することにより、特に高精度に生体リズムの予測を行うことができる。

Description

生体リズム予測方法
　本発明は、被検個体の生体リズムを予測する方法に関する。より詳しくは、被検個体からの生体試料の採取を２４時間以内に３回のみ行うことで生体リズムを予測する方法に関する。
　生物個体の様々な生体現象は、自立的に振動する「周期的なリズム」を示すことが知られている。この周期的なリズムは「生体リズム」と呼ばれている。特に、約一日を周期とする「概日リズム（サーカディアンリズム）」は、唾眠覚醒サイクルや体温、血圧、ホルモン分泌量の日内変動などの生体現象を広く支配していることが知られている。また、概日リズムは、心身の活動度や運動能力、薬剤感受性などにも関与している。
　生体リズムは、「時計遺伝子（クロックジーン）」と呼ばれる遺伝子群によって制御されている。時計遺伝子は、その発現や活性、局在等を自律的に周期変動（振動）させることにより「体内時計」として機能している。
　時計遺伝子の遺伝子多型や遺伝子変異は、癌や糖尿病、血管系疾患、神経変性疾患などの発症要因となることが明らかにされている。さらに、近年、双極性障害や鬱病のような精神疾患についても、時計遺伝子の遺伝子多型や変異が発症に関与していることが指摘されている。
　一方、生体リズムは、体内時計による自律的な制御だけでなく、社会生活による制約も受けている。例えば、睡眠覚醒サイクルでは、日々の就寝時刻や起床時刻の変化によって、「実生活の就寝起床サイクル」と「体内時計による睡眠覚醒サイクル」との間にリズムのずれ（位相のずれ）が生じる場合がある。
　このような生体リズムのずれは、いわゆる「時差ぼけ」や睡眠障害を引き起こし、さらには上述のような精神疾患の原因ともなると考えられている。これらの疾患を治療するため、変調した体内時計を光照射によってリセットする試みもなされ始めている。
　また、生体リズムを利用して、薬剤治療効果の最大化を図る試みも始まっている。薬剤の標的となる分子（薬剤標的分子）の発現量や薬剤を代謝する酵素（薬物代謝酵素）の活性の概日リズムに起因して、薬剤による治療効果も日内変動することが考えられる。そこで、薬剤ごとに最適な投薬時刻を定めて、治療効果を最大化しようとする「時間医療」という考え方が提唱されてきている。
　さらに、より身近には、心身の活動度や運動能力の概日リズムを利用して、学習やトレーニングにおいて自己の能力を最大限に引き出すための活動時刻や、太りにくい（又は、太りやすい）摂食時刻が検討され始めている。
　以上のことから、生体リズムを正確に評価することは、時差ぼけなどの体調不良の改善、種々の疾患の予防、時間医療の実現、自己能力の発揮、ダイエットなどに非常に有益と考えられる。
　特許文献１には、生物個体から採取した標準検体の遺伝子発現産物量測定データに基づき体内時刻を推定する方法などが開示されている。この体内時刻推定方法では、遺伝子発現産物量（すなわち、ｍＲＮＡ）の発現量に基づいて、体内時刻を推定するための分子時計表を作成するものである。
国際公開第２００４／０１２１２８号
　上記特許文献１には、具体的な測定対象遺伝子は記載されていないが、従来、時計遺伝子を測定対象として、その経時的な発現量変化に基づいて生体リズムを推定することが行われている。
　しかし、時計遺伝子の経時的な発現量変化を測定するためには、被検個体から継続的に生体試料を採取することが必要とされていた。すなわち、精度良く生体リズムの推定を行うためには、２４時間にわたって数時間おきに被検個体から生体試料を採取し、時計遺伝子発現量の時系列データを得る必要があった。
　このように一日に何回も生体試料の採取を行うことは、被検者（被検個体）にとって大きな負担となる。また、夜中に被検者を起こして生体試料の採取を行うこともあり、これによって被検者の睡眠覚醒サイクルが影響を受け、生体リズムそのものが変化してしまうおそれもあった。
　生体試料の採取のための被検者の負担を軽減することは、時差ぼけなどの体調不良の改善や種々の疾患の予防等を目的とした生体リズムの評価を広く普及させるための重要な課題と考えられる。
　そこで、本発明は、被検個体からの生体試料の採取回数を最小限にして、高い精度で生体リズムを予測できる方法を提供することを主な目的とする。
　上記課題解決のため、本発明は、被検個体から２４時間以内に３回採取した生体試料について、発現量変化の概日周期の位相が異なる２つの時計遺伝子の発現量を測定し、得られた時系列発現量データに基づいて、被検個体の生体リズムを予測する方法を提供する。
　この生体リズム予測方法は、より具体的には、以下の手順を含む。
（１）被検個体から生体試料を２４時間以内に３回採取する手順、
（２）発現量変化の概日周期の位相が異なる２つの時計遺伝子について、生体試料中の発現量を測定する手順、
（３）前記（１）及び（２）の手順で得られた時系列発現量データから、前記概日周期を算出する手順。
　発現量変化の概日周期の位相が異なる２つの時計遺伝子を測定対象とすることにより、被検個体からの生体試料の採取回数を２４時間以内に３回のみとできる。
　この生体リズム予測方法では、前記（３）の手順において、前記時系列発現量データから下記式（Ｉ）及び式（ＩＩ）によって前記概日周期の算出を行う。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
（式（Ｉ）中、Ｅａ（ｔ）、Ａａ、ω、Ｃａは、一の時計遺伝子の時刻ｔにおける発現量、振幅、初期位相、オフセット値を示す。また、式（ＩＩ）中、Ｅｂ（ｔ）、Ａｂ、Ｃｂは、他の時計遺伝子の時刻ｔにおける発現量、振幅、オフセット値を示す。さらに、θは両時計遺伝子の位相差を示す。）
　この生体リズム予測方法では、時系列発現量データをコサインフィッティングして得たコサインカーブから、１時間毎の発現量変化を示すモデルデータを算出し、このモデルデータから抽出された任意の３点の時刻と該時刻における発現量と、上記式（Ｉ）及び式（ＩＩ）とから、３点サンプリングデータを算出し、前記モデルデータと３点サンプリングデータとの間で、発現量の最大値を与える時刻の時間差を算出し、該時間差の平均値が０．６未満であり、標準誤差が０．４未満である３点の時刻を算出し、この３点の時刻を採取時刻として２４時間以内に３回生体試料の採取を行うことが好適となる。特に、被検個体から２４時間以内に８時間間隔で３回生体試料を採取することにより、高精度に生体リズムの予測を行うことができる。
　この生体リズム予測方法において、前記時計遺伝子は、Ｐｅｒ３遺伝子及びＮｒ１ｄ２遺伝子とすることができる。
　一般に「位相」とは、周期的な変動における山や谷といった点の位置・状態をひとつの周期の中に特徴付ける量をいう。時計遺伝子の発現量変化の概日周期は、おおむね下記式（ＩＩＩ）で示される余弦波関数として観測することができる。ここで、式中、Ｅ（ｔ）は時刻ｔにおける時計遺伝子の発現量、Ａは発現量の振幅、Ｃはオフセット値を表している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
　本発明において「位相」とは、この式（ＩＩＩ）のコサインの中を意味するものとし、具体的には式（ＩＩＩ）の「２π（ｔ＋ω）／２４」を指すものとする。また「初期位相」とは、時刻ｔ＝０における位相を決定する「ω」を指すものとする。さらに「位相差」とは、時計遺伝子間での初期位相ωの差を指す。
　本発明により、被検個体からの生体試料の採取回数を最小限にして、高い精度で生体リズムを予測可能な方法が提供される。
　図１は、Ｐｅｒ３遺伝子とＮｒ１ｄ２遺伝子の発現量変化の概日周期において、発現量の最大値を与える時刻をプロットした図である（実施例１）。Ｘ軸（横軸）はＰｅｒ３遺伝子の発現量が最大値となる時刻を、Ｙ軸（縦軸）はＮｒ１ｄ２遺伝子の発現量が最大値となる時刻を示す。図中、点線は、両時刻の時間差（位相差）が２時間となるプロット位置を示す。
　図２は、３回のサンプリング時刻の時間間隔について、そのサンプリング時間間隔で算出される概日周期とモデルデータとの間における発現量の最大値を与える時刻の時刻差をプロットした図である（実施例２）。図中、Ｘ軸（横軸）は、そのサンプリング時間間隔における時刻差の標準誤差を、Ｙ軸（縦軸）は、平均値を示す。
　図３は、モデルデータから「８：０８」の時間間隔（Ａ）又は「９：１５」の時間間隔（Ｂ）となる全ての３点サンプリングを行って算出したＰｅｒ３発現量変化の概日周期を示す図である（実施例２）。図中、符号１はモデルデータのＰｅｒ３、符号２はモデルデータのＮｒ１ｄ２の概日周期を示す。また、符号３は３点サンプリングデータのＰｅｒ３、符号４は３点サンプリングデータのＮｒ１ｄ２の概日周期を示す。
　図４は、８時間間隔の３点サンプリングによって算出したＰｅｒ３遺伝子及びＮｒ１ｄ２遺伝子の発現量変化の概日周期を示す図である（実施例３）。図中、符号ａ１、ｂ１、ｃ１はそれぞれ３点サンプリングパターンａ、ｂ、ｃのＰｅｒ３遺伝子の概日周期、符号ａ２、ｂ２、ｃ２はそれぞれ３点サンプリングパターンａ、ｂ、ｃのＮｒ１ｄ２遺伝子の概日周期を示す。また、符号ｄ１及びｄ２は、７点サンプリングで得られたＰｅｒ３遺伝子及びＮｒ１ｄ２の概日周期を示す。
１．生体リズム予測方法
　本発明者らは、複数の時計遺伝子間での発現量変化周期のずれを利用して生体リズムの予測を行うことで、被検個体からの生体試料の採取回数を少なくできるのではないかと考え、検討を行った。そして、発現量変化の概日周期の位相が異なる２つの時計遺伝子を測定対象とすることにより、被検個体からの生体試料の採取を２４時間以内に３回行うのみで、高い精度で生体リズムを予測できることを見出した。すなわち、本発明に係る生体リズム予測方法は、被検個体から２４時間以内に３回採取した生体試料について、発現量変化の概日周期の位相が異なる２つの時計遺伝子の発現量を測定し、得られた時系列発現量データに基づいて、被検個体の生体リズムを予測するものである。
　２つの時計遺伝子ａ、ｂが、異なる発現量変化の概日周期の位相を有する場合、その位相差を「θ」とすると、各時計遺伝子の発現量変化の概日周期はそれぞれ下記コサインカーブ式（Ｉ）及び（ＩＩ）によってモデル化することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
　ここで、式（Ｉ）中、Ｅａ（ｔ）、Ａａ、ω、Ｃａは、時計遺伝子ａの時刻ｔにおける発現量、振幅、初期位相、オフセット値を示す。また、式（ＩＩ）中、Ｅｂ（ｔ）、Ａｂ、Ｃｂは、時計遺伝子ｂの時刻ｔにおける発現量、振幅、オフセット値を示している。
　時計遺伝子ａ、ｂの位相差θが既知である場合、上記コサインカーブ式（Ｉ）及び（ＩＩ）は、５つの未知の定数（ω、Ａａ、Ａｂ、Ｃａ、Ｃｂ）を含む式となる。被検個体から時刻ｔに採取した生体試料中について、時計遺伝子ａ、ｂの発現量Ｅａ（ｔ）、Ｅｂ（ｔ）を測定することにより、コサインカーブ式（Ｉ）及び（ＩＩ）から２つの等式を得ることができる。従って、このモデルを用いることにより、異なる３つの時刻ｔに生体試料の採取（サンプリング）を行って、コサインカーブ式（Ｉ）及び（ＩＩ）から６つの等式を得れば、時計遺伝子ａ、ｂの発現量変化の概日周期を算出することが可能となる。
　数学的には５つの未知数を明らかにするには５つの等式があれば足りる。ここでは、位相差θが既知である時計遺伝子ａ、ｂを用いて、発現量変化の概日周期を上記コサインカーブ式（Ｉ）及び（ＩＩ）によりモデル化したことによって、６つの等式に基づき５つの未知数を算出する。すなわち、時計遺伝子ａ、ｂの位相差θを制約条件とすることで、未知数ω、Ａａ、Ａｂ、Ｃａ、Ｃｂをより正確に求めることを可能にしている。これにより、一般に正確な評価を行うことが難しい生体現象である時計遺伝子発現量の概日周期を高精度に算出することが可能となる。
　この生体リズム予測方法は、より具体的には、（１）被検個体から生体試料を２４時間以内に３回採取する手順と、（２）発現量変化の概日周期の位相が異なる２つの時計遺伝子について、生体試料中の発現量を測定する手順と、（３）これらの手順で得られた時系列発現量データから、各時計遺伝子の発現量変化の概日周期を算出する手順と、を含む。
　本発明に係る生体リズム予測方法において、対象とする被検個体には、ヒトの他、マウス・ラット・サル等の実験動物などが広く含まれる。
２．生体試料の採取
　被検個体から採取する生体試料は、時計遺伝子の遺伝子発現産物（ｍＲＮＡ）が含まれる生体組織であれば特に限定されない。採取作業の簡便さの観点からは、毛髪や口腔粘膜、皮膚等の体表面からの採取が可能な生体組織とすることが好ましい。
　毛髪のサンプリングは抜去により行うことができる。抜去された毛髪の毛根部には、毛包細胞が付着しており、この細胞中の時計遺伝子ｍＲＮＡを測定できる。ここで、「毛包細胞」とは、抜去された体毛の毛根部に付着する内毛根鞘（ｉｎｎｅｒ　ｒｏｏｔ　ｓｈｅａｔｈ）、外毛根鞘（ｏｕｔｅｒ　ｒｏｏｔ　ｓｈｅａｔｈ）及び毛乳頭（ｐａｐｉｌｌａ）を形成する細胞群がいうものとする。
　毛髪のサンプリング部位は、例えばヒトを対象とする場合、頭髪や髭、腕や足の毛などを用いることができ、特に限定されない。測定のばらつきを抑えるため、各回の採取は近傍の部位で行なうことが望ましい。
　一回にサンプリングする毛髪の本数は、ヒトの場合、頭髪では５~１０本、髭では３~５本、腕毛では１０~２０本程度である。この本数以上を使用することで、時計遺伝子の発現定量のために十分な量のｍＲＮＡを抽出することができる。
　口腔粘膜のサンプリングは、例えば、ブラシやスパーテル等で口腔粘膜表面から掻き取ることによって行うことができる。これにより、掻き取られた口腔粘膜細胞中の時計遺伝子ｍＲＮＡを測定できる。
　口腔粘膜のサンプリング部位は、頬の裏側の粘膜が好適であり、測定のばらつきを抑えるため左右両側の粘膜から採取することが望ましい。
　本発明者らは、高精度の生体リズムの予測を可能にするため、３回のサンプリング時刻の時間間隔について検討を行った。その結果、被検個体から２４時間以内に８時間間隔で３回生体試料を採取することにより、高い精度でできることを見出した（実施例２参照）。
　すなわち、本発明に係る生体リズム予測方法では、第１回目と第２回目のサンプリング時刻との時間間隔と、第２回目と第３回目のサンプリング時刻との時間間隔と、がともに８時間となるように３回のサンプリングを行うことで、最も高精度に生体リズムを予測することができる。
３．発現量の測定
　生体試料中の時計遺伝子の発現量は、従来公知の方法によって測定することができる。例えば、市販のＲＮＡ抽出キットを使用して生体試料からＲＮＡを抽出し、抽出したＲＮＡを鋳型とした逆転写反応によってｃＤＮＡを合成する。そして、このｃＤＮＡを用いてＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）のような網羅的解析手法や、リアルタイムＰＣＲのような個別的解析手法によって、発現量の定量を行う。
　測定を行う時計遺伝子は、現在までに同定されている一群の時計遺伝子であってよい。代表的な時計遺伝子としては、Ｐｅｒ３遺伝子（ＮＣＢＩ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿０１６８３１）、Ｐｅｒ２遺伝子（ＮＭ＿０２２８１７）、Ｂｍａｌ１遺伝子（ＮＭ＿００１０３０２７２）、Ｎｐａｓ２遺伝子（ＮＭ＿００２５１８）、Ｎｒ１ｄ２遺伝子（ＮＭ＿０２１７２４）、Ｎｒ１ｄ２遺伝子（ＮＭ＿００５１２６）、Ｄｂｐ遺伝子（ＮＭ＿００１３５２）、Ｃｒｙ１遺伝子（ＮＭ＿００４０７５）等がある。
　本発明に係る生体リズム予測方法では、これらの時計遺伝子のうち、発現量変化の日内変動の位相が異なる２つの遺伝子について発現量を測定し、時系列発現量データを得る。なお、ヒト以外を対象生物とする場合には、上記ヒト時計遺伝子の対象生物におけるホモログ（相同遺伝子）について発現量の測定を行う。
　選択される２つの時計遺伝子は、発現量変化の日内変動の位相が異なれば、任意の組合せとできる。選択された任意の２つの時計遺伝子の発現量変化の日内変動の位相は、例えば実施例１において後述する方法によって決定することができる。
　好適な２つの時計遺伝子の組合せには、Ｐｅｒ３遺伝子とＮｒ１ｄ２遺伝子を用いることができる。Ｐｅｒ３遺伝子とＮｒ１ｄ２遺伝子は、生体試料中に安定して発現し、発現量の日内変動（振幅）が大きい。そのため、これらの時系列発現量データから、Ｐｅｒ３遺伝子とＮｒ１ｄ２遺伝子の発現量変化の概日周期を算出することで、生体リズムを正確に予測することができる。
４．概日周期の算出
　時計遺伝子の発現量変化の概日周期の算出は、遺伝子発現量の経時的変化を示す時系列発現量データから、下記式（Ｉ）及び式（ＩＩ）によって算出する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
　ここで、式（Ｉ）中、Ｅａ（ｔ）、Ａａ、ω、Ｃａは、時計遺伝子ａの時刻ｔにおける発現量、振幅、初期位相、オフセット値を示す。また、式（ＩＩ）中、Ｅｂ（ｔ）、Ａｂ、Ｃｂは、時計遺伝子ｂの時刻ｔにおける発現量、振幅、オフセット値を示している。さらに、θは両時計遺伝子の位相差を示す。
　３回のサンプリングで得られた２つの時計遺伝子の時系列発現量データから、上記式（Ｉ）及び（ＩＩ）により６つの等式を得ることができる。この６つの等式から、共役勾配法等によって５つの未知数ω、Ａａ、Ａｂ、Ｃａ、Ｃｂを求める。これにより、被検個体の生体リズムを反映した、時計遺伝子の発現量変化の概日周期を算出することができる。
　以上のように、本発明に係る生体リズム予測方法では、発現量変化の概日周期の位相が異なる２つの時計遺伝子について、３点サンプリングによって発現量の測定を行うことによって、発現量変化の概日周期を高精度に算出して、被検個体の生体リズムを予測することが可能である。
　被検個体からの生体試料の採取を２４時間以内に３回のみとすることで、生体試料の採取のための被検者の負担を軽減することができる。さらに、３点サンプリングを８時間間隔で行うことで、被検者が起きている時間帯のみに生体試料を採取することができるため、被検者の睡眠覚醒サイクルに影響を与えず、正確な生体リズムの予測を行うことが可能となる。
１．Ｐｅｒ３遺伝子とＮｒ１ｄ２遺伝子の位相差の決定
　本実施例では、発現量変化の概日周期の位相が異なる２つの時計遺伝子として、Ｐｅｒ３遺伝子（以下、単に「Ｐｅｒ３」という）とＮｒ１ｄ２遺伝子（以下、「Ｎｒ１ｄ２」という）を選択し、両遺伝子の発現量変化の概日周期の位相差を決定した。
　２０~５０歳までの男女１５人から頭髪を採取した。毛包細胞が付着した毛根部を素早く細胞溶解バッファー（ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｃｒｏｋｉｔ：ＱＩＡＧＥＮ）に浸すことにより、細胞溶解液を調製した。毛髪の採取は３~４時間間隔で行い、各採取時刻において５~２０本を採取した。
　細胞溶解バッファーに添付のプロトコールに従って、−７０℃で保存しておいた細胞溶解液からトータルＲＮＡを抽出し、逆転写反応を行なった。逆転写産物の１／２０量を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、Ｐｅｒ３及びＮｒ１ｄ２の発現量を定量した。リアルタイムＰＣＲは、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ（ＡＢＩ）又はＴａｑＭａｎ　ＭＧＢ　ｐｒｏｂｅ（ＡＢＩ）を用いて、ＰＲＩＳＭ７３００（ＡＢＩ）により行った。Ｐｅｒ３及びＮｒ１ｄ２の発現量は、内部標準とした１８Ｓ−ｒＲＮＡの発現量によって補正を行い、時系列発現量データとした。
　得られた時系列発現量データに、２４時間周期の下記コサインカーブ式（ＩＶ）を、非線形最小二乗法によりコサインフィッティングして、Ｐｅｒ３とＮｒ１ｄ２の発現量変化の概日周期の位相差を求めた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
（式中、Ｅ（ｔ）は時刻ｔにおける発現量、Ａは発現量の振幅、ωは初期位相、Ｃはオフセット値を示す）。
　結果を図１に示す。図は、コサインフィッティングを行った後のコサインカーブ式（ＩＶ）において、最大の発現量Ｅ（ｔ）を与える時刻ｔをプロットしたものである。Ｐｅｒ３の発現量Ｅ（ｔ）が最大値となる時刻ｔをＸ軸に、Ｎｒ１ｄ２の発現量Ｅ（ｔ）が最大値となる時刻ｔをＹ軸にプロットしている。
　図１に示されるように、１５名の被検者について、Ｐｅｒ３の発現量Ｅ（ｔ）が最大値となる時刻ｔは、０時~１２時まで広く散らばっていた。同様に、Ｎｒ１ｄ２についても最大の発現量Ｅ（ｔ）を与える時刻ｔは、０時~１２時まで広く散らばっていた。
　しかし、Ｐｅｒ３の発現量Ｅ（ｔ）が最大値となる時刻ｔと、Ｎｒ１ｄ２の発現量Ｅ（ｔ）が最大値となる時刻ｔとの時間差（位相差）は、各被検者において２時間に近い値を示した。図１中、Ｐｅｒ３とＮｒ１ｄ２の位相差が２時間である場合のプロット位置を点線で示す。
　１５名の被検者について得られたＰｅｒ３とＮｒ１ｄ２との位相差の平均値と標準偏差は、それぞれ２．３、０．８であった。この位相差（以下、「位相差θ」という）を用いて、Ｐｅｒ３とＮｒ１ｄ２の発現量変化の概日周期を、それぞれ下記コサインカーブ式（Ｖ）及び式（ＶＩ）でモデル化した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
（式中、Ｅｐｅｒ３（ｔ）は時刻ｔにおけるＰｅｒ３発現量、Ａｐｅｒ３は発現量の振幅、ωはＰｅｒ３の初期位相、Ｃｐｅｒ３はオフセット値を示す）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
（式中、Ｅｎｒ１ｄ２（ｔ）は時刻ｔにおけるＮｒ１ｄ２発現量、Ａｎｒ１ｄ２は発現量の振幅、θはＰｅｒ３とＮｒ１ｄ２の発現量変化の概日周期の位相差、Ｃｎｒ１ｄ２はオフセット値を示す）
２．サンプリング時間間隔の検討
　上記コサインカーブ式（Ｖ）及び式（ＶＩ）を用いれば、最少で３回のサンプリングでＰｅｒ３又はＮｒ１ｄ２の発現量変化の概日周期を算出して、被検者の生体リズムを推定することが可能である。そこで、本実施例では、３回のサンプリング時刻の時間間隔について、最も高精度に生体リズムを推定することができる時間間隔を決定した。３回のサンプリングは２４時間以内に行うものとし、想定される全てのサンプリング時間間隔（２７６通り）について検討を行った。
　まず、実施例１において、Ｐｅｒ３及びＮｒ１ｄ２の時系列発現量データに対し、コサインフィッティングを行って得られたコサインカーブ式（ＩＶ）から、両遺伝子の１時間毎の発現量変化を算出した。そして、算出された１時間毎の発現量変化を示すモデルデータから、任意の３点の時刻ｔとその時刻における発現量Ｖ（ｔ）を３点サンプリングデータとして抽出した。
　この任意の３点の時刻ｔとその時刻における発現量ｖ（ｔ）を、式（Ｖ）及び式（ＶＩ）に代入し、発現量の振幅Ａｐｅｒ３・Ａｎｒ１ｄ２、Ｐｅｒ３の初期位相ω、オフセット値Ｃｐｅｒ３・Ｃｎｒ１ｄ２を共役勾配法によって求めた。
　共役勾配法は、以下の手順により行った。すなわち、まず、式（Ｖ）及び式（ＶＩ）に代入された発現量ｖ（ｔ）と、１時間毎の発現量変化を示すモデルデータの発現量Ｅ（ｔ）と、の平方和ｄを、３点サンプリングデータとモデルデータとの距離として下記式（ＶＩＩ）により定義した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009
　そして、この距離ｄが最小になるような振幅Ａｐｅｒ３・Ａｎｒ１ｄ２、初期位相ω、オフセット値Ｃｐｅｒ３・Ｃｎｒ１ｄを共役勾配法により求めた。なお、これらの未知定数は、非線形最小二乗法によって求めようとした場合、距離ｄが最小値に収束せず、求めることができなかった。
　ここで、共役勾配法を適用する際、未知定数の初期値は求まる定数に大きく影響する。従って、適切な初期値を設定しないと、距離ｄが局所的な極値に落ちてしまい、本来の概日周期を得ることができない。
　そこで、ここでは、振幅Ａｐｅｒ３・Ａｎｒ１ｄ２の適切な初期値として、１時間毎の発現量変化を示すモデルデータの振幅Ａの平均値を設定した。また、オフセット値Ｃｐｅｒ３・Ｃｎｒ１ｄ２には、３点サンプリングデータの平均値を初期値として設定した。なお、モデルデータの振幅Ａは、Ｐｅｒ３の振幅Ａｐｅｒ３が０．８０１４５１３、Ｎｒ１ｄ２の振幅Ａｎｒ１ｄ２が０．６４０２４１１であった。
　さらに、Ｐｅｒ３の初期位相ωは、演算解析を容易にするため、０から２３までの整数に限定した。そして、０から２３までの整数をひとつずつ初期値として与えて共役勾配法を適用し、最小の距離ｄを与え得る初期位相ωを求めた。
　以上のようにして、発現量の振幅Ａｐｅｒ３、Ｐｅｒ３の初期位相ω、オフセット値Ｃｐｅｒ３を求めた式（Ｖ）において発現量ｖ（ｔ）の最大値を与える時刻ｔと、モデルデータにおいて発現量ｖ（ｔ）の最大値を与える時刻との時刻差を求めた。そして、この時刻差が最小となるようなサンプリング時刻の時間間隔を検討した。
　０時から２３時までの１時間おきのすべての時刻を第１回目のサンプリング時刻として設定した。そして、この第１回目のサンプリングから、２４時間以内に第２回目及び第３回目のサンプリングが終了するような３回のサンプリング時刻の時間間隔の組み合せ（２７６通り）について検討を行った。全ての時間間隔の組み合わせについて、上記時刻差の平均値と標準誤差を求めた。標準誤差は、そのサンプリング時間間隔で算出される概日周期が、どの程度第１回目のサンプリング時刻に依存するかを示す。また、平均値は、算出された概日周期の精度を示す。従って、標準誤差及び平均値が小さい程、算出された概日周期が正確であると評価できる。
　全ての時間間隔の組み合わせについて得られた平均値と標準誤差を、「表１」~「表５」に示す。時間間隔の組み合わせは、標準誤差及び平均値が小さかったものから順に「表１」から「表５」に挙げた。時間間隔は、第１回目と第２回目のサンプリング時刻との時間間隔と、第２回目と第３回目のサンプリング時刻との時間間隔と、を組み合わせて表示した。例えば、図中「１３：０６」は、第１回目と第２回目のサンプリング時刻との時間間隔が１３時間、第２回目と第３回目のサンプリング時刻との時間間隔が６時間であることを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
 　また、図２には、各時間間隔の組み合わせを、Ｘ軸を標準誤差、Ｙ軸を平均値としてプロットした図を示す。
　「表１」~「表５」及び図２に示されるように、「８：０８」の時間間隔が、最も標準誤差及び平均値が小さかった。このことから、第１回目と第２回目のサンプリング時刻との時間間隔と、第２回目と第３回目のサンプリング時刻との時間間隔と、がともに８時間となるような３回サンプリングが、最も高精度に概日周期を算出できることが明らかとなった。
　この他、「表１」~「表４」に示す時間間隔の組み合わせでは、標準誤差及び平均値が十分に小さく、これらのサンプリン時間間隔を採用することで、正確な概日周期の算出が可能になると考えられた。一方、「表５」に示す時間間隔の組み合わせでは、標準誤差及び平均値が大きくなり、サンプリン時間間隔として不適当であることが明らかになった。
　図３には、モデルデータから「８：０８」の時間間隔（Ａ）又は「９：１５」の時間間隔（Ｂ）となる全ての３点サンプリングを行って算出したＰｅｒ３発現量変化の概日周期を示す。図中、符号１はモデルデータのＰｅｒ３、符号２はモデルデータのＮｒ１ｄ２の概日周期を示す。また、符号３は３点サンプリングデータのＰｅｒ３、符号４は３点サンプリングデータのＮｒ１ｄ２の概日周期を示す。
　図３（Ａ）に示す、第１回目と第２回目のサンプリングと、第２回目と第３回目のサンプリングをともに８時間間隔で行った場合では、モデルデータと３点サンプリングデータのＰｅｒ３及びＮｒ１ｄ２の概日周期が良く一致し、精度良く概日周期が算出されている。
　一方、図３（Ｂ）に示す、第１回目と第２回目のサンプリングを９時間間隔で、第２回目と第３回目のサンプリングを１５時間間隔で行った場合には、モデルデータと３点サンプリングデータのＰｅｒ３及びＮｒ１ｄ２の概日周期が一致せず、概日周期を算出できないことが分かる。
３．３点サンプリングによる生体リズムの推定
　実施例２の結果から、３回のサンプリングを８時間間隔で行うことにより、最も高精度に概日周期を算出できることが明らかとなった。そこで、実際に８時間間隔の３点サンプリングによる生体リズムの予測を試みた。３点サンプリングは、以下の「表６」に示す３パターンを行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
 　３点サンプリングａ~ｃについて、実施例１で説明した方法に従って、各時刻におけるＰｅｒ３及びＮｒ１ｄ２の発現量を定量した。そして、実施例２で説明した方法と同様にして、３点の時刻ｔとその時刻における発現量Ｅ（ｔ）を、式（Ｖ）及び式（ＶＩ）に代入し、発現量の振幅Ａｐｅｒ３・Ａｎｒ１ｄ２、Ｐｅｒ３の初期位相ω、オフセット値Ｃｐｅｒ３・Ｃｎｒ１ｄ２を共役勾配法によって求め、Ｐｅｒ３及びＮｒ１ｄ２の発現量変化の概日周期を算出した。
　結果を図４に示す。図中、符号ａ１、ｂ１、ｃ１はそれぞれ３点サンプリングパターンａ、ｂ、ｃのＰｅｒ３遺伝子の概日周期、符号ａ２、ｂ２、ｃ２はそれぞれ３点サンプリングパターンａ、ｂ、ｃのＮｒ１ｄ２遺伝子の概日周期を示す。また、符号ｄ１及びｄ２は、１２：００~３６：００までの７回のサンプリングで得られた時系列発現量データに、上記コサインカーブ式（ＩＶ）を非線形最小二乗法によりコサインフィッティングして求めた概日周期である。符号ｄ１はＰｅｒ３、符号ｄ２はＮｒ１ｄ２の概日周期を示す。
　図４に示されるように、３点サンプリングａ~ｃにおいて、Ｐｅｒ３及びＮｒ１ｄ２の発現量変化の概日周期が再現性良く算出できた。これらの３点サンプリングａ~ｃで得られたＰｅｒ３及びＮｒ１ｄ２の発現量変化の概日周期と、７回のサンプリングで得られた概日周期（図中、符号ｄ１及びｄ２参照）との位相の誤差は、平均で０．７５時間であった。
　この結果から、発現量変化の概日周期の位相が異なるＰｅｒ３とＮｒ１ｄ２の発現量の３点サンプリングによって、発現量変化の概日周期を算出することによって、被検者の生体リズムを高精度に予測できることが示された。
　本発明に係る生体リズム予測方法は、時間医療の実現や、自己能力の発揮、ダイエットに役立てることができる。また、生体リズムのずれを原因とする種々の疾患の予防や、時差ぼけなどの体調不良の改善に役立てることができる。

Claims (6)

  1. 　被検個体から２４時間以内に３回採取した生体試料について、発現量変化の概日周期の位相が異なる２つの時計遺伝子の発現量を測定し、得られた時系列発現量データに基づいて、被検個体の生体リズムを予測する方法。
  2. 　以下の手順を含む、請求項１記載の方法。
    （１）被検個体から生体試料を２４時間以内に３回採取する手順、
    （２）発現量変化の概日周期の位相が異なる２つの時計遺伝子について、生体試料中の発現量を測定する手順、
    （３）前記（１）及び（２）の手順で得られた時系列発現量データから、前記概日周期を算出する手順。
  3. 　前記（３）の手順において、前記時系列発現量データから下記式（Ｉ）及び式（ＩＩ）によって前記概日周期を算出する請求項２記載の方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
    （式（Ｉ）中、Ｅａ（ｔ）、Ａａ、ω、Ｃａは、一の時計遺伝子の時刻ｔにおける発現量、振幅、初期位相、オフセット値を示す。また、式（ＩＩ）中、Ｅｂ（ｔ）、Ａｂ、Ｃｂは、他の一の時計遺伝子の時刻ｔにおける発現量、振幅、オフセット値を示す。さらに、θは両時計遺伝子の位相差を示す。）
  4. 　時系列発現量データをコサインフィッティングして得たコサインカーブから、１時間毎の発現量変化を示すモデルデータを算出し、
    このモデルデータから抽出された任意の３点の時刻と該時刻における発現量と、上記式（Ｉ）及び式（ＩＩ）とから、３点サンプリングデータを算出し、
    前記モデルデータと３点サンプリングデータとの間で、発現量の最大値を与える時刻の時間差を算出し、
    該時間差の平均値が０．６未満であり、標準誤差が０．４未満である３点の時刻を算出し、この３点の時刻を採取時刻として２４時間以内に３回生体試料の採取を行う請求項３記載の方法。
  5. 　被検個体から２４時間以内に８時間間隔で３回生体試料を採取する請求項４記載の方法。
  6. 　前記時計遺伝子として、Ｐｅｒ３遺伝子及びＮｒ１ｄ２遺伝子を用いる請求項５記載の方法。
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