RU2512069C2 - Способ определения биологического ритма - Google Patents

Способ определения биологического ритма Download PDF

Info

Publication number
RU2512069C2
RU2512069C2 RU2011113819/10A RU2011113819A RU2512069C2 RU 2512069 C2 RU2512069 C2 RU 2512069C2 RU 2011113819/10 A RU2011113819/10 A RU 2011113819/10A RU 2011113819 A RU2011113819 A RU 2011113819A RU 2512069 C2 RU2512069 C2 RU 2512069C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
time
expression levels
expression
points
gene
Prior art date
Application number
RU2011113819/10A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2011113819A (ru
Inventor
Харухико СОМА
Такуро ЯМАМОТО
Макото АКАСИ
Коити НОДЕ
Нориюки КИСИИ
Казухиро НАКАГАВА
Сико ЯМАСИТА
Томохиро ХАЯКАВА
Original Assignee
Сони Корпорейшн
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Сони Корпорейшн filed Critical Сони Корпорейшн
Publication of RU2011113819A publication Critical patent/RU2011113819A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2512069C2 publication Critical patent/RU2512069C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B25/00—ICT specially adapted for hybridisation; ICT specially adapted for gene or protein expression
    • G16B25/10—Gene or protein expression profiling; Expression-ratio estimation or normalisation
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B40/00—ICT specially adapted for biostatistics; ICT specially adapted for bioinformatics-related machine learning or data mining, e.g. knowledge discovery or pattern finding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B10/00—Other methods or instruments for diagnosis, e.g. instruments for taking a cell sample, for biopsy, for vaccination diagnosis; Sex determination; Ovulation-period determination; Throat striking implements
    • A61B10/02—Instruments for taking cell samples or for biopsy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B25/00—ICT specially adapted for hybridisation; ICT specially adapted for gene or protein expression

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Artificial Intelligence (AREA)
  • Bioethics (AREA)
  • Computer Vision & Pattern Recognition (AREA)
  • Software Systems (AREA)
  • Data Mining & Analysis (AREA)
  • Evolutionary Computation (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Databases & Information Systems (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области хронобиологии. Способ определения циркадного цикла у субъекта на основе временных рядов данных по уровням экспрессии, полученных при измерении уровней экспрессии двух часовых генов в биологических образцах, которые берут у субъекта три раза в сутки. Причем часовые гены имеют разные фазы циркадного цикла изменений уровня экспрессии. Способ позволяет определить биологический ритм с большой точностью и сводит к минимуму количество раз взятия биологических образцов у субъекта. 3 з.п. ф-лы, 4 ил., 6 табл., 3 пр.

Description

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение имеет отношение к способу определения биологического ритма у субъекта. В частности, настоящее изобретение касается способа определения биологического ритма посредством взятия биологических образцов у субъекта всего лишь три раза в сутки.
Уровень техники
Известно, что различные биологические явления у живых организмов проявляют "периодический ритм", который совершает автономные колебания. Этот периодический ритм называется "биологическим ритмом". В частности, известно, что "циркадный ритм", период которого составляет около суток, в большой степени контролирует такие биологические явления, как цикл сна/бодрствования, температура тела, кровяное давление и суточные колебания секреции гормонов. Кроме того, циркадный ритм задействован в активности ума и тела, спортивных способностях и чувствительности к лекарственным препаратам.
Биологический ритм контролируется кластером генов, именуемых "часовыми генами". Часовые гены действуют в качестве "внутренних часов", самостоятельно вызывающих периодические колебания экспрессии, активности, локализации и т.д. часовых генов.
Очевидно, что генный полиморфизм и мутации часовых генов являются причиной возникновения рака, диабета, сосудистых заболеваний, нейродегенеративных и других заболеваний. Более того, недавно было высказано предположение, что генный полиморфизм и мутации часовых генов участвуют в возникновении таких психических заболеваний, как биполярный психоз и меланхолия.
С другой стороны, биологический ритм не только автономно контролируется внутренними часами, но и подвергается ограничениям из-за жизни в обществе. Например, в цикле сна/бодрствования могут быть отличия в ритме (фазовые отличия) между "циклом отхода ко сну/вставания в действительной жизни" и "запускаемым внутренними часами циклом сна/бодрствования" вследствие различий во времени регулярного отхода ко сну и времени вставания.
Считается, что отличия в биологическом ритме вызывают так называемый "синдром смены часовых поясов" и нарушения сна, а также вышеприведенные психические заболевания. Для лечения таких заболеваний предпринимаются попытки перенастроить аномальные внутренние часы с помощью облучения светом.
Более того, предпринимаются попытки довести до максимума действие лекарств с помощью биологического ритма. Полагают, что действие лекарств также подвержено суточным колебаниям из-за колебаний уровня экспрессии молекул (молекул-мишеней препарата), на которые воздействует препарат, и циркадного ритма ферментов (ферментов метаболизма препарата), метаболизирующих препарат. Поэтому была выдвинута концепция "ориентированной по времени медицинской помощи", которая стремится довести до максимума лечебное действие путем установки надлежащего времени введения для каждого препарата.
Кроме того, в более известных случаях, с использованием циркадного ритма активности ума и тела и спортивных способностей началось изучение такого периода активности, в который достигают максимума способности к обучению и тренировке, и такого времени приема внутрь, в которое с трудом происходит увеличение веса (или легко происходит увеличение веса).
В связи с вышесказанным полагаем, что точная оценка биологического ритма имеет положительное значение для улучшения такого плохого физического состояния, как синдром смены часовых поясов, предупреждения различных заболеваний, осуществления ориентированной по времени медицинской помощи, проявления своих способностей и похудания.
В PTL 1 раскрыт способ определения внутреннего времени организма на основе данных по измерению уровня продукта экспрессии гена в стандартном образце, взятом у живого индивидуума. В этом способе определения внутреннего времени организма составляется таблица молекулярных часов для оценки внутреннего времени организма на основе уровня экспрессии продукта экспрессии гена (т.е. мРНК).
Список цитируемых документов
PTL 1: International Publication No. 2004/012128.
Раскрытие изобретения
В PTL 1 не раскрыт конкретный ген мишени для измерения. Биологические ритмы обычно оценивают, используя часовой ген в качестве мишени для измерения на основе изменений уровня экспрессии часового гена во времени.
Однако для измерения изменений уровня экспрессии часового гена во времени необходимо постоянно брать биологические образцы у субъекта. То есть для оценки биологического ритма с большой точностью необходимо брать биологические образцы у субъекта на протяжении 24 часов с интервалом в несколько часов, чтобы получить временной ряд данных по уровню экспрессии часового гена.
Для субъекта (данного индивидуума) взятие биологических образцов по несколько раз в день таким образом очень обременительно. Более того, субъекта иногда будят среди ночи, чтобы взять биологический образец. Это влияет на цикл сна/бодрствования у субъекта, что может привести к изменению самого биологического ритма.
Полагаем, что нужно уменьшить нагрузку на организм субъекта при взятии биологических образцов для того, чтобы расширить пределы оценки биологического ритма, к примеру, с целью улучшения такого плохого физического состояния, как синдром смены часовых поясов и предупреждения различных заболеваний.
Соответственно, главной целью настоящего изобретения является получение способа, которым достигается определение биологического ритма с большой точностью и сводится к минимуму количество раз взятия биологических образцов у субъекта.
Для достижения вышеприведенной цели настоящим изобретением предусмотрен способ определения биологического ритма у субъекта на основе временных рядов данных по уровням экспрессии, полученных при измерении уровней экспрессии двух часовых генов в биологических образцах, взятых у субъекта три раза в сутки, причем часовые гены имеют разные фазы циркадного цикла изменений уровня экспрессии.
В частности, способ определения биологического ритма включает стадии:
(1) взятия биологических образцов у субъекта три раза за 24 часа;
(2) измерения уровней экспрессии двух часовых генов в биологических образцах, причем эти два часовых гена имеют разные фазы циркадного цикла изменений уровня экспрессии; и
(3) вычисления циркадных циклов из временных рядов данных по уровням экспрессии, полученных на стадиях (1) и (2).
При измерении двух часовых генов, имеющих разные фазы циркадного цикла изменений уровня экспрессии, взятие биологических образцов у субъекта может производиться всего лишь три раза в сутки.
На стадии (3) этого способа определения биологического ритма циркадные циклы рассчитывают из временных рядов данных по уровням экспрессии по приведенным ниже формулам (I) и (II):
Figure 00000001
В формуле (I): Ea(t), Aa, ω и Ca означают уровень экспрессии, амплитуду, начальную фазу и величину смещения одного из часовых генов в момент времени t. А в формуле (II): Eb(t), Ab, и Cb означают уровень экспрессии, амплитуду и величину смещения другого часового гена в момент времени t. Кроме того, θ означает разность фаз между двумя часовыми генами.
Этот способ определения биологического ритма предпочтительно включает вычисление данных моделирования из графика, полученного путем аппроксимации косинусом временного ряда данных по уровням экспрессии, причем данные моделирования отражают изменения уровня экспрессии через каждый час; вычисление выборочных данных по трем точкам из трех произвольных точек времени и уровней экспрессии в этих точках из данных моделирования по приведенным выше формулам (I) и (II); вычисление разницы по времени между данными моделирования и выборочными данными по трем точкам в те моменты, в которые уровни экспрессии достигают максимума; и вычисление трех точек времени, в которых среднее значение разницы по времени составляет менее 0,6, а стандартная ошибка разницы по времени составляет менее 0,4; и взятие биологических образцов три раза в сутки именно в эти три точки времени как точки взятия образцов. В частности, можно определить биологический ритм с большой точностью при взятии биологических образцов у субъекта три раза в сутки с интервалом в 8 часов.
В этом способе определения биологического ритма часовыми генами могут быть ген Per3 и ген Nr1d2.
В общем случае "фаза" означает такое количество, которое характеризует, за один период, положение и состояние точек типа пиков и провалов при периодическом изменении. Циркадный цикл изменений уровня экспрессии часового гена можно наблюдать в виде волновой функции косинуса, представленной формулой (III) ниже. При этом E(t) - уровень экспрессии часового гена в момент времени t, A - амплитуда уровня экспрессии, а C - величина смещения:
Figure 00000002
В настоящем изобретении "фаза" задается выражением внутри скобок косинуса в формуле (III), а именно: "2π(t+ω)/24" в формуле (III). Кроме того, "начальная фаза" есть "ω", определяющая фазу в момент времени t=0. А "разность фаз" означает разность начальных фаз ω между часовыми генами.
В соответствии с настоящим изобретением предусмотрен способ, которым достигается определение биологического ритма с большой точностью и сводится к минимуму количество раз взятия биологических образцов у субъекта.
Краткое описание фигур
На фиг.1 представлен график, полученный нанесением точек времени, в которых уровни экспрессии достигают максимума в циркадных циклах изменения уровней экспрессии гена Per3 и гена Nr1d2 (Пример 1). По оси X (горизонтальной оси) - время, за которое достигает максимума уровень экспрессии гена Per3, а по оси Y (вертикальной оси) - время, за которое достигает максимума уровень экспрессии гена Nr1d2. На фиг. пунктирной линией обозначено положение графика в том случае, когда разница по времени (разность фаз) между точками составляет 2 часа.
На фиг.2 представлен график, полученный нанесением разницы по времени в точках, в которых уровни экспрессии достигают максимума, между данными моделирования и циркадными циклами, рассчитанными по тем интервалам, в которых образцы брали три раза (пример 2). На фиг. по оси X (горизонтальной оси) -стандартная ошибка разницы по времени по интервалам взятия образцов, а по оси Y (вертикальной оси) - среднее значение.
На фиг.3 представлены графики циркадного цикла изменений уровня экспрессии Per3, рассчитанные при выполнении всех профилей взятия образцов по трем точкам интервала "8:08" (A) или интервала "9:15" (B) по данным моделирования (Пример 2). На фиг. цифрой 1 обозначен циркадный цикл Per3 по данным моделирования, а цифрой 2 обозначен циркадный цикл Nr1d2 по данным моделирования. Далее цифрой 3 обозначен циркадный цикл Per3 по данным взятия образцов по трем точкам, а цифрой 4 обозначен циркадный цикл Nr1d2 по данным взятия образцов по трем точкам.
На фиг.4 представлены графики циркадного цикла изменений уровня экспрессии гена Per3 и гена Nr1d2, рассчитанные при взятии образцов по трем точкам с интервалом в 8 часов (Пример 3). На фиг. символами a1, b1 и c1 соответственно обозначены циркадные циклы гена Per3 при взятии образцов по трем точкам профилей a, b и c, а символами a2, b2 и c2 соответственно обозначены циркадные циклы гена Nr1d2 при взятии образцов по трем точкам профилей a, b и c. Далее символами d1 и d2 обозначены циркадные циклы гена Per3 и гена Nr1d2, полученные при взятии образцов по семи точкам.
Осуществление изобретения
1. Способ определения биологического ритма
Авторы настоящего изобретения посчитали, что количество раз, когда у субъекта берутся биологические образцы, можно сократить путем определения биологического ритма по различиям в циклах изменений уровня экспрессии между несколькими часовыми генами, и рассмотрели это предположение. Затем авторы изобретения обнаружили, что биологический ритм можно определить с большой точностью путем измерения двух часовых генов с различными фазами циркадного цикла изменений уровня экспрессии при взятии биологических образцов у субъекта всего лишь три раза в сутки. То есть в способе определения биологического ритма по настоящему изобретению измеряются уровни экспрессии двух часовых генов с различными фазами циркадного цикла изменений уровня экспрессии для биологических образцов, взятых у субъекта три раза в сутки, а биологический ритм субъекта прогнозируется на основе полученного временного ряда данных по уровням экспрессии.
Если два часовых гена a и b имеют различные фазы циркадного цикла изменений уровня экспрессии и разность фаз равняется "0", то циркадные циклы изменения уровней экспрессии часовых генов можно смоделировать с помощью приведенных ниже формул косинусных графиков (I) и (II):
Figure 00000003
При этом в формуле (I): Ea(t), Aa, ω и Ca означают уровень экспрессии, амплитуду, начальную фазу и величину смещения часового гена а в момент времени t. А в формуле (II): Eb(t), Ab, и Cb означают уровень экспрессии, амплитуду и величину смещения часового гена b в момент времени t.
В том случае, когда известна разность фаз θ между двумя часовыми генами a и b, формулы косинусных графиков (I) и (II) включают 5 неизвестных констант (ω, Aa, Ab, Ca и Cb). Измеряя уровни экспрессии Ea(t) и Eb(t) часовых генов a и b в биологических образцах, взятых у субъекта в момент времени t, по формулам косинусных графиков (I) и (II) можно получить 2 уравнения. Следовательно, на этой модели, получая 6 уравнений по формулам косинусных графиков (I) и (II) при взятии (отборе) биологических образцов в три разных момента времени t, можно рассчитать циркадные циклы изменений уровней экспрессии часовых генов a и b.
Математически для нахождения 5 неизвестных требуется 5 уравнений. В настоящем изобретении, при моделировании циркадных циклов изменений уровней экспрессии часовых генов a и b с известной разностью фаз θ между ними по приведенным выше формулам косинусных графиков (I) и (II), рассчитывают 5 неизвестных на основе 6 уравнений. А именно, принимая разность фаз θ между часовыми генами a и b в качестве ограничивающего условия, можно более точно рассчитать неизвестные ω, Aa, Ab, Ca и Cb. Таким образом, с большой точностью можно рассчитать циркадный цикл уровня экспрессии часового гена, что является биологическим явлением, точная оценка которого обычно проводится с трудом.
Более конкретно, способ определения биологического ритма включает стадии: (1) взятия биологических образцов у субъекта три раза в сутки; (2) измерения уровней экспрессии двух часовых генов в биологических образцах, причем эти два часовых гена имеют разные фазы циркадного цикла изменений уровня экспрессии; и (3) вычисления циркадных циклов изменений уровней экспрессии часовых генов из временных рядов данных по уровням экспрессии, полученных на предыдущих стадиях.
В способе определения биологического ритма по настоящему изобретению примеры субъектов в широком смысле включают, наряду с человеком, и таких лабораторных животных, как мыши, крысы и обезьяны.
2. Взятие биологических образцов
Биологические образцы, взятые у субъекта, не имеют особых ограничений, если только они представляет собой биологическую ткань, содержащую продукт экспрессии (мРНК) часового гена. В отношении легкости взятия образцов предпочтительно берут биологическую ткань из поверхности тела, как то волосы, слизистые ротовой полости или кожу.
Волосы можно брать путем вырывания с корнем. Корни вырванных волос содержат клетки волосяной сумки, и в них можно измерить мРНК часовых генов. При этом "клетки волосяной сумки" представляют собой группу клеток, которые образуют внутреннюю оболочку корней, внешнюю оболочку корней и сосочки, прилегающие к корням вырванных из тела волос.
Например, в том случае, когда субъектом является человек, место взятия волос не имеет ограничений, и можно использовать волосы из головы, бороды, ног или рук и т.п. Чтобы уменьшить разброс при измерении, предпочтительно каждый раз берут образцы из участков, близких друг к другу.
В случае человека приблизительное количество волос, отбираемых за один раз, составляет от 5 до 10 для волос головы, от 3 до 5 для бороды и от 10 до 20 для волос рук. Используя количество волос, большее или равное вышеприведенному количеству волос, можно экстрагировать достаточное количество мРНК для количественного определения уровней экспрессии часовых генов.
Образцы из слизистых ротовой полости можно получить путем соскабливания из поверхности ротовой полости, к примеру, с помощью щеточки или шпателя. При этом можно измерить мРНК часовых генов в соскобленных клетках слизистых оболочек ротовой полости.
Образцы слизистых оболочек ротовой полости предпочтительно получают из слизистых оболочек, находящихся на внутренней выстилке щеки. Чтобы уменьшить разброс при измерении, образцы слизистых оболочек ротовой полости предпочтительно берут из слизистых оболочек и левой, и правой щеки.
Авторы настоящего изобретения исследовали, какой промежуток времени между взятием образцов при трехкратном взятии образцов дает очень точное определение биологического ритма. В результате этого они обнаружили, что большая точность достигается при взятии биологических образцов у субъекта три раза в сутки с интервалом в 8 часов (см. Пример 2).
Иными словами, в способе определения биологического ритма по настоящему изобретению можно определить биологический ритм с наибольшей точностью при трехкратном взятии образцов с тем, что промежуток времени между взятием первого и второго образца и промежуток времени между взятием второго и третьего образца одновременно составляет 8 часов.
3. Измерение уровня экспрессии
Уровень экспрессии часового гена в биологическом образце можно измерить общеизвестным способом. Например, из биологического образца экстрагируют ДНК с помощью коммерчески доступного набора для выделения РНК и синтезируют кДНК по реакции обратной транскрипции, используя в качестве матрицы выделенную РНК. Затем количественно определяют уровень экспрессии с использованием кДНК при помощи комплексного аналитического метода типа ДНК-микроматрицы (ДНК-чипа) либо индивидуального аналитического метода типа ПЦР в реальном времени.
Подлежащие измерению часовые гены могут представлять собой группу часовых генов, идентифицированных к настоящему времени. Репрезентативные примеры часовых генов включают ген Per3 (номер доступа в NCBI NM_016831), ген Per2 (NM_022817), ген Bmal1 (NM_001030272), ген Npas2 (NM_002518), ген Nr1d2 (NM_02174), ген Nr1d2 (NM_005126), ген Dbp (NM_001352) и ген Cry1 (NM_004075).
В способе определения биологического ритма по настоящему изобретению измеряются уровни экспрессии двух из этих часовых генов для получения временных рядов данных по уровням экспрессии, причем эти два гена имеют разные фазы суточных колебаний уровней экспрессии. При этом в случае, когда субъектом является не человек, а другие организмы, измеряются уровни экспрессии гомологов (гомологичных генов) вышеприведенных часовых генов человека у данных организмов.
Комбинацию из двух часовых генов можно выбрать свободно, если только они имеют разные фазы суточных колебаний уровней экспрессии. Фазы суточных колебаний уровней экспрессии двух свободно выбранных часовых генов можно определить, к примеру, методом, описанным ниже в примере 1.
В качестве предпочтительной комбинации двух часовых генов можно использовать ген Per3 и ген Nr1d2. Ген Per3 и ген Nr1d2 устойчиво экспрессируются в биологических образцах и проявляют большие суточные колебания (амплитуды) уровней экспрессии. Таким образом, биологический ритм можно точно определить путем вычисления циркадных циклов изменения уровней экспрессии гена Per3 и гена Nr1d2 из этих временных рядов данных по уровням экспрессии.
4. Вычисление циркадного цикла
Циркадные циклы изменения уровней экспрессии часовых генов рассчитывают по приведенным ниже формулам (I) и (II) из временных рядов данных по уровням экспрессии, показывающих изменения уровней экспрессии генов во времени:
Figure 00000004
При этом в формуле (I): Ea(t), Aa, ω и Ca означают уровень экспрессии, амплитуду, начальную фазу и величину смещения часового гена а в момент времени t. А в формуле (II): Eb(t), Ab, и Cb означают уровень экспрессии, амплитуду и величину смещения часового гена b в момент времени t. Кроме того, θ означает разность фаз между двумя часовыми генами.
По вышеприведенным формулам (I) и (II) можно получить 6 уравнений из временных рядов данных по уровням экспрессии двух часовых генов при трехкратном взятии образцов. Из этих 6 уравнений получают 5 неизвестных ω, Aa, Ab, Ca и Cb методом сопряженных градиентов или др. Таким образом можно рассчитать циркадные циклы изменения уровней экспрессии часовых генов, причем циркадные циклы будут отражать биологический ритм субъекта.
Как описано выше, в способе определения биологического ритма по настоящему изобретению измеряются уровни экспрессии двух часовых генов с разными фазами циркадного цикла изменений уровня экспрессии при взятии образцов по трем точкам, при этом с большой точностью можно рассчитать циркадные циклы изменения уровней экспрессии и тем самым определить биологический ритм субъекта.
Устанавливая, что взятие биологических образцов у субъекта производится всего лишь три раза в сутки, можно уменьшить нагрузку на организм субъекта при взятии биологических образцов. Более того, при взятии образцов по трем точкам с интервалом в 8 часов можно брать образцы только в тот период времени, когда субъект бодрствует. Таким образом, можно точно определить биологический ритм без ущерба для цикла сна/бодрствования у субъекта.
Пример 1. Определение разности фаз между геном Per3 и геном Nr1d2
В этом примере выбрали ген Per3 (в дальнейшем просто "Per3") и ген Nr1d2 (в дальнейшем просто "Nr1d2") в качестве двух часовых генов с разными фазами циркадного цикла изменений уровня экспрессии и определяли разность фаз между циркадными циклами изменения уровней экспрессии этих генов.
Брали волосы из головы у 15 мужчин и женщин в возрасте от 20 до 50 лет. Корни волос, включая прикрепленные к ним клетки волосяной сумки, быстро погружали в буфер для лизиса клеток (набор RNEasy Microkit: QIAGEN) для получения раствора лизата клеток. Волосы брали с интервалом в 3-4 часа, а за каждый раз отбирали 5-20 волос.
Из раствора лизата клеток, хранившегося при -70°C, экстрагировали общую РНК в соответствии с методикой, приложенной к буферу для лизиса клеток, и проводили реакцию обратной транскрипции. Для количественного определения уровней экспрессии Per3 и Nr1d2 проводили ПЦР в реальном времени, используя продукт обратной транскрипции в количестве 1/20 этого продукта. ПЦР в реальном времени проводили на приборе PRISM 7300 (ABI) с помощью зонда SYBR Green (ABI) или TaqMan MGB (ABI). Уровни экспрессии Per3 и Nr1d2 подвергали коррекции по уровню экспрессии 18S-pPHK, служившей внутренним стандартом, получая временные ряды данных по уровням экспрессии.
Строили графики по полученным временным рядам данных по уровням экспрессии с аппроксимацией по приведенной ниже формуле косинуса (IV) с периодом в 24 часа нелинейным методом наименьших квадратов, получая разность фаз между циркадными циклами изменения уровней экспрессии Per3 и Nr1d2:
Figure 00000005
где E(t) - уровень экспрессии в момент времени t, A - амплитуда уровня экспрессии, ω - начальная фаза, а C - величина смещения.
Результаты представлены на фиг.1. График получен при нанесении моментов времени t, в которые уровень экспрессии E(t) достигал максимума на графике после аппроксимации по формуле косинуса (IV). Моменты времени t, в которые достигал максимума уровень экспрессии E(t) гена Per3, наносили по оси X, а моменты времени t, в которые достигал максимума уровень экспрессии E(t) гена Nr1d2, наносили по оси Y.
Как видно из фиг.1, у 15 субъектов момент времени t, в который достигал максимума уровень экспрессии E(t) гена Per3, имел широкий разброс от 0 до 12. Точно так же момент времени t, в который достигал максимума уровень экспрессии E(t) гена Nr1d2, имел широкий разброс от 0 до 12.
Однако разница по времени (разность фаз) между моментом времени t, в который достигал максимума уровень экспрессии E(t) гена Per3, и моментом времени t, в который достигал максимума уровень экспрессии E(t) гена Nr1d2, составляла примерно 2 часа для каждого из субъектов. На фиг.1 пунктирной линией представлено положение графика в том случае, когда разность фаз между Per3 и Nr1d2 составляет 2 часа.
Среднее значение и стандартное отклонение разности фаз между Per3 и Nr1d2 по 15 субъектам равнялись 2,3 и 0,8, соответственно. По этой разности фаз (в дальнейшем "разность фаз θ") проводили моделирование циркадных циклов изменения уровней экспрессии Per3 и Nr1d2 по приведенным ниже формулам функции косинуса (V) и (VI) соответственно:
Figure 00000006
где EPer3(t) - уровень экспрессии Per3 в момент времени t, APer3 - амплитуда уровня экспрессии, ω - начальная фаза Per3, а CPer3 - величина смещения;
Figure 00000007
где ENr1d2(t) - уровень экспрессии Nr1d2 в момент времени t, ANr1d2 - амплитуда уровня экспрессии, θ - разность фаз между циркадными циклами изменения уровней экспрессии Per3 и Nr1d2, a CNr1d2 - величина смещения.
Пример 2. Изучение интервала между взятием образцов
При использовании вышеприведенных формул графиков косинуса (V) и (VI) можно рассчитать циркадные циклы изменений уровня экспрессии Per3 или Nr1d2 при взятии образцов по меньшей мере три раза и таким образом оценить биологический ритм субъекта. Так, в данном примере, определяли интервал времени между трехкратным взятием образцов с тем, чтобы с наибольшей точностью оценить биологический ритм. Принимая, что взятие образцов проводится три раза в сутки, исследовали все возможные интервалы между взятием образцов (276 профилей).
Сначала рассчитывали почасовые изменения уровней экспрессии двух генов по формуле косинуса (IV), приведенной в примере 1, и проводили аппроксимацию графиков по временным рядам данных по уровням экспрессии Per3 и Nr1d2. Затем отбирали три произвольные точки времени t и уровни экспрессии V(t) в этих точках в качестве данных из образцов по трем точкам из расчетных данных моделирования, представляющих почасовые изменения уровней экспрессии.
Эти три произвольные точки времени t и уровни экспрессии V(t) в этих точках подставляли в формулы (V) и (VI) и получали амплитуды уровней экспрессии APer3 и ANr1d2, начальную фазу ω гена Per3 и величины смещения CPer3 и CNr1d2 методом сопряженных градиентов.
Метод сопряженных градиентов выполняли по приведенной ниже методике. А именно, сначала определяли сумму квадратов d из подставленных в формулы (V) и (VI) уровней экспрессии V(t) и уровней экспрессии E(t) из данных моделирования, представляющих почасовые изменения уровней экспрессии, как расстояние между данными при взятии образцов по трем точкам и данными моделирования по приведенной ниже формуле (VII):
Figure 00000008
Затем методом сопряженных градиентов получали амплитуды APer3 и ANr1d2; начальную фазу ω и величины смещения CPer3 и CNr1d2, сводящие к минимуму расстояние d. Отметим, что в том случае, когда применялся нелинейный метод наименьших квадратов, эти неизвестные константы было невозможно получить, так как расстояние d не сходилось к минимальному значению.
При этом, когда применяется метод сопряженных градиентов, начальные значения неизвестных констант существенно влияют на получаемые константы. Так, если выбраны неправильные начальные значения, то расстояние d сходится к локальному экстремуму и поэтому невозможно получить правильные циркадные циклы.
Поэтому в таком случае в качестве правильных начальных значений амплитуд APer3 и ANr1d2 принимали среднее значение амплитуды A из данных моделирования, представляющих почасовые изменения уровней экспрессии. Кроме того, в качестве начальных значений величин смещения CPer3 и CNr1d2 принимали среднее значение из данных при взятии образцов по трем точкам. Отметим, что в отношении амплитуды A по данным моделирования амплитуда APer3 гена Per3 составила 0,8014513, а амплитуда ANr1d2 гена Nr1d2 составила 0,6402411.
Кроме того, начальную фазу ω гена Per3 ограничивали целыми числами от 0 до 23, чтобы облегчить операционный анализ. Затем получали начальную фазу ω, обеспечивающую минимальное расстояние d, задавая по одному целые числа от 0 до 23 в качестве начальных значений и применяя метод сопряженных градиентов.
Как описано выше, получали разницу по времени между моментом времени t, в который достигал максимума уровень экспрессии V(t) по формуле (V), по которой определяли амплитуду APer3 уровня экспрессии, начальную фазу ω гена Per3 и величину смещения CPer3, и моментом времени, в который достигал максимума уровень экспрессии V(t) по данным моделирования. Затем исследовали интервал между взятием образцов с тем, чтобы свести к минимуму разницу по времени.
В качестве первого времени взятия образцов принимали все времена через каждый час от 0 до 23. Затем исследовали комбинации (276 профилей) промежутков времени между тремя моментами взятия образцов с тем, чтобы второе и третье взятие образцов завершались в пределах 24 часов от первого. В отношении комбинаций из всех промежутков времени получали среднее значение и стандартную ошибку разницы по времени. Стандартная ошибка показывает, насколько циркадный цикл, рассчитанный при данном интервале взятия образцов, зависит от первого времени взятия образцов. А среднее значение показывает точность рассчитанного циркадного цикла. Таким образом, можно сказать, что рассчитанный циркадный цикл становится более точным по мере уменьшения стандартной ошибки и среднего значения.
В таблицах 1-5 представлены средние значения и стандартные ошибки, полученные в отношении комбинаций из всех интервалов. Комбинации всех интервалов времени в таблицах 1-5 приведены в порядке уменьшения стандартной ошибки и среднего значения интервалов. Интервалы представлены путем сочетания промежутка времени между первым и вторым взятием образцов и промежутка времени между вторым и третьим взятием образцов. Например, "13:06" на фиг. означает, что интервал между первым и вторым взятием образцов составляет 13 часов, а интервал между вторым и третьим взятием образцов составляет 6 часов.
Кроме того, на фиг.2 представлен график, на котором каждая из комбинаций интервалов нанесена таким образом, что стандартная ошибка приводится по оси X, а среднее значение - по оси Y.
Таблица 1
Интервал Станд. ошибка Среднее Интервал Станд. ошибка Среднее Интервал Станд. ошибка Среднее
8:08 0,000 0,127 5:10 0,045 0,130 13:05 0,057 0,134
7:09 0,017 0,129 9:10 0,045 0,130 5:06 0,057 0,134
9:08 0,017 0,129 10:05 0,045 0,128 4:10 0,062 0,131
8:07 0,017 0,129 5:09 0,045 0,128 10:10 0,062 0,132
9:07 0,017 0,127 10:09 0,045 0,130 10:04 0,062 0,131
7:08 0,017 0,127 9:05 0,045 0,129 9:04 0,062 0,131
8:09 0,017 0,127 6:12 0,046 0,129 4:11 0,062 0,131
7:07 0,026 0,129 6:06 0,046 0,129 11:09 0,062 0,132
7:10 0,026 0,129 12:06 0,046 0,129 4:09 0,063 0,132
10:07 0,026 0,129 5:11 0,047 0,129 9:11 0,063 0,131
9:06 0,030 0,128 11:08 0,047 0,128 11:04 0,063 0,133
6:09 0,030 0,129 8:05 0,047 0,128 12:08 0,064 0,134
9:09 0,030 0,127 11:05 0,048 0,128 4:12 0,064 0,132
6:08 0,032 0,127 8:11 0,048 0,129 8:04 0,065 0,133
10:06 0,032 0,127 5:08 0,048 0,130 8:12 0,065 0,133
8:10 0,032 0,127 7:12 0,051 0,131 4:08 0,065 0,132
8:06 0,032 0,127 12:05 0,051 0,130 12:04 0,065 0,132
6:10 0,032 .0,127 5:07 0,051 0,131 5:05 0,066 0,132
10:08 0,032 0,128 5:12 0,051 0,131 14:05 0,066 0,133
11:07 0,037 0,129 12:07 0,051 0,130 5:14 0,066 0,133
6:11 0,037 0,129 7:05 0,051 0,130 13:04 0,067 0,134
7:06 0,038 0,129 5:13 0,057 0,131 7:13 0,067 0,133
11:06 0,038 0,129 13:06 0,057 0,130 4:07 0,067 0,132
7:11 0,038 0,129 6:05 0,057 0,131 4:13 0,068 0,133
6:07 0,038 0,129 6:13 0,057 0,134 7:04 0,068 0,132
Таблица 2
Интервал Станд. ошибка Среднее Интервал Станд. ошибка Среднее Интервал Станд. ошибка Среднее
13:07 0,068 0,133 13:03 0,084 0,136 16:03 0,094 0,141
6:14 0,071 0,133 8:13 0,084 0,135 5:16 0,094 0,142
14:04 0,071 0,133 3:08 0,084 0,135 3:16 0,097 0,142
4:06 0,071 0,133 13:08 0,084 0,135 16:05 0,098 0,139
6:04 0,072 0,133 3:13 0,085 0,137 5:03 0,098 0,139
4:14 0,072 0,133 8:03 0,085 0,137 4:17 0,100 0,139
14:06 0,072 0,133 7:14 0,085 0,137 3:04 0,100 0,143
4:05 0,077 0,134 14:03 0,085 0,139 17:03 0,100 0,143
5:15 0,077 0,134 3:07 0,085 0,139 3:03 0,105 0,146
15:04 0,077 0,134 3:14 0,086 0,139 18:03 0,105 0,146
5:04 0,077 0,134 14:07 0,086 0,136 3:18 0,105 0,145
15:05 0,077 0,136 7:03 0,086 0,136 17:05 0,106 0,142
4:15 0,077 0,135 4:16 0,087 0,136 16:06 0,106 0,143
10:11 0,082 0,135 4:04 0,087 0,137 6:02 0,106 0,143
3:10 0,082 0,135 16:04 0,087 0,137 2:16 0,107 0,145
11:03 0,082 0,135 3:15 0,088 0,137 5:02 0,107 0,144
3:11 0,083 0,137 15:06 0,088 0,137 2:17 0,107 0,145
11:10 0,083 0,135 6:03 0,088 0,137 4:02 0,108 0,140
10:03 0,083 0,136 6:15 0,089 0,138 2:18 0,108 0,140
9:12 0,083 0,135 15:03 0,089 0,136 2:01 0,108 0,141
3:09 0,083 0,137 3:06 0,089 0,140 18:04 0,109 0,142
12:03 0,083 0,137 17:04 0,091 0,139 1:20 0,109 0,143
12:09 0,084 0,138 4:03 0,092 0,136 3:01 0,109 0,143
3:12 0,084 0,136 3:17 0,092 0,136 20:03 0,110 0,143
9:03 0,084 0,136 3:05 0,094 0,141 2:03 0,110 0,143
Таблица 3
Интервал Станд. ошибка Среднее Интервал Станд. ошибка Среднее Интервал Станд. ошибка Среднее
3:19 0,110 0,143 20:02 0,136 0,165 1:14 0,160 0,167
19:02 0,111 0,142 8:02 0,136 0,171 15:02 0,160 0,170
2:04 0,111 0,143 2:05 0,136 0,170 7:15 0,162 0,170
18:02 0,111 0,143 10:12 0,138 0,171 2:07 0,162 0,169
4:18 0,112 0,143 2:10 0,139 0,167 21:02 0,162 0,166
18:05 0,113 0,141 12:02 0,139 0,168 22:01 0,165 0,166
1:18 0,113 0,141 7:02 0,140 0,162 15:08 0,165 0,162
5:01 0,114 0,141 2:15 0,141 0,166 1:15 0,165 0,163
2:19 0,114 0,142 15:07 0,142 0,168 8:01 0,170 0,176
3:02 0,114 0,142 7:01 0,144 0,170 6:17 0,171 0,179
19:03 0,116 0,144 16:07 0,144 0,165 1:06 0,171 0,181
2:11 0,116 0,146 1:16 0,145 0,167 17:01 0,172 0,175
11:02 0,116 0,146 2:12 0,147 0,168 21:01 0,173 0,182
11:11 0,118 0,145 12:10 0,148 0,168 8:15 0,173 0,179
1:21 0,118 0,144 10:02 0,148 0,166 15:01 0,176 0,175
16:02 0,119 0,147 2:14 0,151 0,174 1:08 0,177 0,169
2:06 0,122 0,148 14:08 0,151 0,175 6:01 0,177 0,170
6:16 0,122 0,148 13:09 0,151 0,176 17:06 0,179 0,175
17:02 0,122 0,145 2:13 0,153 0,167 1:17 0,180 0,179
5:17 0,126 0,146 9:13 0,154 0,165 1:22 0,180 0,181
2:20 0,126 0,146 2:09 0,154 0,166 1:01 0,183 0,176
14:02 0,127 0,147 13:02 0,157 0,175 20:01 0,183 0,172
2:08 0,130 0,151 9:02 0,157 0,176 3:20 0,184 0,172
8:14 0,130 0,152 9:01 0,157 0,171 1:03 0,187 0,172
2:02 0,130 0,152 14:09 0,160 0,166 18:01 0,188 0,179
Таблица 4
Интервал Станд. ошибка Среднее Интервал Станд. ошибка Среднее
1:05 0,188 0,178 1:02 0,209 0,187
5:18 0,191 0,176 1:19 0,210 0,189
19:01 0,191 0,173 19:04 0,213 0,184
4:19 0,192 0,171 4:01 0,213 0,185
1:13 0,195 0,188 1:04 0,215 0,179
10:01 0,195 0,186 13:01 0,288 0,328
2:21 0,196 0,194 1:10 0,289 0,327
13:10 0,199 0,176 10:13 0,290 0,331
1:09 0,200 0,175 1:12 0,321 0,445
14:01 0,200 0,172 11:01 0,322 0,444
9:14 0,203 0,179 12:11 0,323 0,443
16:01 0,203 0,180 1:11 0,355 0,515
1:07 0,204 0,180 12:01 0,355 0,516
7:16 0,208 0,181 11:12 0,356 0,514
Таблица 5
Интервал Станд. ошибка Среднее Интервал Станд. ошибка Среднее
9:15 3,27 12,78 3:21 4,20 22,66
8:16 3,47 14,57 21:03 4,26 22,89
23:01 3,55 15,25 19:05 4,31 23,21
16:08 3,64 15,82 13:11 4,38 24,09
2:22 3,75 17,57 15:09 4,48 25,25
22:02 3,82 17,96 7:17 4,57 26,00
1:23 3,87 18,17 17:07 4,65 26,59
6:18 3,92 18,96 5:19 4,77 30,21
14:10 3,98 19,57 4:20 4,87 29,47
20:04 4,03 20,02 10:14 5,08 32,81
12:12 4,08 21,25 18:06 5,40 38,23
11:13 4,15 21,23      
Как видно из таблиц 1-5 и фиг.2, стандартная ошибка и среднее значение достигают минимума в интервале "8:08". Из этого ясно, что циркадный цикл может быть рассчитан с большой точностью при трехкратном взятии образцов с тем, что интервал между первым и вторым взятием образцов и интервал между вторым и третьим взятием образцов одновременно составляет 8 часов.
Кроме того, стандартная ошибка и среднее значение являются достаточно низкими в комбинациях интервалов, приведенных в таблицах 1-4. Полагаем, что при использовании этих интервалов взятия образцов можно рассчитать правильные циркадные циклы. С другой стороны, оказалось, что комбинации интервалов, приведенные в таблице 5, не подходят, так как стандартная ошибка и среднее значение являются высокими.
На фиг.3 представлен циркадный цикл изменений уровня экспрессии Per3, рассчитанный при выполнении всех профилей взятия образцов по трем точкам для интервала "8:08" (А) или интервала "9:15" (В) по данным моделирования. На фиг. цифрой 1 обозначен циркадный цикл Per3 по данным моделирования, а цифрой 2 обозначен циркадный цикл Nr1d2 по данным моделирования. Далее цифрой 3 обозначен циркадный цикл Per3 по данным взятия образцов по трем точкам, а цифрой 4 обозначен циркадный цикл Nr1d2 по данным взятия образцов по трем точкам.
Как видно из фиг.3(А), в том случае, когда интервал между первым и вторым взятием образцов и интервал между вторым и третьим взятием образцов одновременно составляет 8 часов, циркадные циклы Per3 и Nr1d2 по данным моделирования и по данным взятия образцов по трем точкам хорошо согласуются друг с другом, что означает, что циркадные циклы могут быть рассчитаны с большой точностью.
С другой стороны, в том случае, когда интервал между первым и вторым взятием образцов составляет 9 часов, а интервал между вторым и третьим взятием образцов составляет 15 часов, циркадные циклы Per3 и Nr1d2 по данным моделирования и по данным взятия образцов по трем точкам не согласуются друг с другом, что означает, что циркадные циклы невозможно рассчитать.
Пример 3. Оценка биологического ритма при взятии образцов по трем точкам
Из приведенных в Примере 2 результатов оказалось, что циркадный цикл можно рассчитать с большой точностью при взятии образцов три раза с интервалом в 8 часов. Поэтому была сделана попытка определить биологический ритм при фактическом выполнении взятия образцов по трем точкам с интервалом в 8 часов. Взятие образцов по трем точкам проводили по трем профилям, приведенным ниже в таблице 6.
Таблица 6
  Время взятия образцов
Первый раз Второй раз Третий раз
По трем точкам a 12:00 20:00 28:00
По трем точкам b 16:00 24:00 32:00
По трем точкам с 20:00 28:00 36:00
При взятии образцов по трем точкам профилей a-c в каждый момент времени количественно определяли уровни экспрессии Per3 и Nr1d2 методом, описанным в Примере 1. Затем по той же методике, что описана в Примере 2, в формулы (V) и (VI) подставляли три точки времени t и уровни экспрессии E(t) в этих точках и получали амплитуды APer3 и ANr1d2 уровней экспрессии, начальную фазу ω гена Per3 и величины смещения CPer3 и CNr1d2 методом сопряженных градиентов. Таким образом рассчитывали циркадные циклы изменения уровней экспрессии Per3 и Nr1d2.
Результаты представлены на фиг.4. На фиг. символами a1, b1 и c1 соответственно обозначены циркадные циклы гена Per3 при взятии образцов по трем точкам профилей a, b и c, а символами a2, b2 и c2 соответственно обозначены циркадные циклы гена Nr1d2 при взятии образцов по трем точкам профилей a, b и c. Далее символами d1 и d2 обозначены циркадные циклы, полученные при аппроксимации по приведенной выше формуле косинуса (IV) нелинейным методом наименьших квадратов временных рядов данных по уровням экспрессии, полученных при взятии образцов семь раз с 12:00 до 36:00. Символом d1 обозначен циркадный цикл Per3, а символом d2 обозначен циркадный цикл Nr1d2.
Как видно из фиг.4, при взятии образцов по трем точкам профилей a-c циркадные циклы изменения уровней экспрессии Per3 и Nr1d2 были рассчитаны с высокой воспроизводимостью. Ошибка по фазе между циркадными циклами изменения уровней экспрессии Per3 и Nr1d2 при взятии образцов по трем точкам профилей a-c и циркадными циклами (см. символы d1 и d2 на фиг.) при взятии образцов семь раз составила в среднем 0,75 часов.
Как видно из этого результата, при взятии образцов по трем точкам в отношении уровней экспрессии генов Per3 и Nr1d2 с разными фазами циркадного цикла изменений уровня экспрессии оказалось, что были рассчитаны циркадные циклы изменения уровней экспрессии, по которым с большой точностью можно определить биологический ритм субъекта.
Промышленная применимость
Способ определения биологического ритма по настоящему изобретению может применяться для осуществления медицинской службы времени, проявления своих способностей и похудания. Более того, способ может применяться для предупреждения различных заболеваний, вызванных смещением биологического ритма, и для улучшения такого плохого физического состояния, как синдром смены часовых поясов.

Claims (4)

1. Способ определения циркадного цикла у субъекта на основе временных рядов данных по уровням экспрессии, полученных при измерении уровней экспрессии двух часовых генов в биологических образцах, взятых у субъекта три раза в сутки, причем часовые гены имеют разные фазы циркадного цикла изменений уровня экспрессии, включающий:
(1) стадию взятия биологических образцов у субъекта три раза в сутки;
(2) стадию измерения уровней экспрессии двух часовых генов в биологических образцах, причем эти два часовых гена имеют разные фазы циркадных циклов изменения уровней экспрессии; и
(3) стадию вычисления циркадных циклов из временных рядов данных по уровням экспрессии, полученных на стадиях (1) и (2), в котором на стадии (3) циркадные циклы рассчитывают из временных рядов данных по уровням экспрессии по приведенным ниже формулам (I) и (II):
Figure 00000009

где в формуле (I): Ea(t), Aa, ω и Ca означают уровень экспрессии, амплитуду, начальную фазу и величину смещения одного из часовых генов в момент времени t; в формуле (II): Eb(t), Ab, и Cb означают уровень экспрессии, амплитуду и величину смещения другого часового гена в момент времени t; а θ означает разность фаз между двумя часовыми генами,
где интервал между взятием образцов выбран из:
8:08, 7:09, 9:08, 8:07, 9:07, 7:08, 8:09, 7:07, 7:10, 10:07, 9:06, 6:09, 9:09, 6:08, 10:06, 8:10, 8:06, 6:10, 10:08, 11:07, 6:11, 7:06, 11:06, 7:11, 6:07, 5:10, 9:10, 10:05, 5:09, 10:09, 9:05, 6:12, 6:06, 12:06, 5:11, 11:08, 8:05, 11:05, 8:11. 5:08, 7:12, 12:05, 5:07, 5:12, 12:07, 7:05, 5:13, 13:06, 6:05, 6:13,13:05, 5:06, 4:10, 10:10, 10:04, 9:04, 4:11, 11:09, 4:09, 9:11, 11:04, 12:08, 4:12, 8:04, 8:12, 4:08, 12:04, 5:05, 14:05, 5:14, 13:04, 7:13, 4:07, 4:13, 7:04, 13:07, 6:14, 14:04, 4:06, 6:04, 4:14, 14:06, 4:05, 5:15, 15:04, 5:04, 15:05, 4:15, 10:11, 3:10, 11:03, 3:11, 11:10, 10:03, 9:12, 3:09, 12:03, 12:09, 3:12, 9:03, 13:03, 8:13, 3:08, 13:08, 3:13, 8:03, 7:14, 14:03, 3:07, 3:14, 14:07, 7:03, 4:16, 4:04, 15:06, 6:03, 6:15, 15:03, 3:06, 17:04, 4:03, 3:17, 3:05, 16:03, 5:16, 3:16, 16:05, 5:03, 4:17, 3:04, 17:03, 3:03, 18:03, 3:18, 17:05, 16:06, 6:02, 2:16, 5:02, 2:17, 4:02, 2:18, 2:01, 18:04, 1:20, 3:01, 20:03, 2:03, 3:19, 19:02, 2:04, 18:02, 4:18, 18:05, 1:18, 5:01, 2:19, 3:02, 19:03, 2:11, 11:02, 11:11, 1:21, 16:02, 2:06, 6:16, 17:02, 5:17, 2:20, 14:02, 2:08, 8:14, 16:04, 3:15, 2:02, 20:02, 8:02, 2:05, 10:12, 2:10, 12:02, 7:02, 2:15, 15:07, 7:01, 16:07, 1:16, 2:12, 12:10, 10:02, 2:14, 14:08, 13:09, 2:13, 9:13, 2:09, 13:02, 9:02, 9:01, 14:09, 1:14, 15:02, 7:15, 2:07, 21:02, 22:01, 15:08, 1:15, 8:01, 6:17, 1:06, 17:01, 21:01, 8:15, 15:01, 1:08, 6:01, 17:06, 1:17, 1:22, 1:01, 20:01, 3:20, 1:03, 18:01, 1:05, 5:18, 19:01, 4:19, 1:13, 10:01, 2:21, 13:10, 1:09, 14:01, 9:14, 16:01, 1:07, 7:16, 1:02, 1:19, 19:04, 4:01, 1:04, 13:01, 1:10, 10:13, 1:12, 11:01, 12:11, 1:11, 12:01, 11:12.
2. Способ по п.1, включающий:
вычисление данных моделирования из графика, полученного путем аппроксимации косинусом временного ряда данных по уровням экспрессии, причем данные моделирования отражают изменения уровня экспрессии через каждый час;
вычисление выборочных данных по трем точкам из трех произвольных точек времени и уровней экспрессии в этих точках из данных моделирования по приведенным выше формулам (I) и (II);
вычисление разницы по времени между данными моделирования и выборочными данными по трем точкам в те моменты, в которые уровни экспрессии достигают максимума; и
вычисление трех точек времени, в которых среднее значение разницы по времени составляет менее 0,6, а стандартная ошибка разницы по времени составляет менее 0,4; и взятие биологических образцов три раза в сутки именно в эти три точки времени как точки взятия образцов.
3. Способ по п.2, в котором биологические образцы у субъекта отбирают три раза в сутки с интервалом в 8 часов.
4. Способ по п.1, в котором в качестве часовых генов используют ген Per3 и ген Nr1d2.
RU2011113819/10A 2008-10-16 2009-10-13 Способ определения биологического ритма RU2512069C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2008-267464 2008-10-16
JP2008267464A JP5560550B2 (ja) 2008-10-16 2008-10-16 生体リズム予測方法
PCT/JP2009/067966 WO2010044481A1 (ja) 2008-10-16 2009-10-13 生体リズム予測方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2011113819A RU2011113819A (ru) 2012-10-20
RU2512069C2 true RU2512069C2 (ru) 2014-04-10

Family

ID=42106642

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2011113819/10A RU2512069C2 (ru) 2008-10-16 2009-10-13 Способ определения биологического ритма

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20110196619A1 (ru)
EP (1) EP2336355B1 (ru)
JP (1) JP5560550B2 (ru)
CN (1) CN102177254A (ru)
BR (1) BRPI0920426A2 (ru)
RU (1) RU2512069C2 (ru)
WO (1) WO2010044481A1 (ru)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110145740A1 (en) * 2009-12-11 2011-06-16 Mccue Geoffrey Predictive Performance Calculator Apparatus and Method
JP5644231B2 (ja) * 2010-07-23 2014-12-24 ソニー株式会社 生体リズム推定装置、生体リズム推定方法およびプログラム
CN103436607B (zh) * 2013-08-02 2015-08-05 山东农业大学 鸡clock基因不同转录本的扩增方法及其引物
US20180060515A1 (en) * 2016-08-31 2018-03-01 Ronald Leslie Monarch AMS_BioRhythms computing program
CN112423648B (zh) * 2018-07-18 2024-03-22 苏州大学 一种筛选去同步化指标的方法
CN109600887A (zh) * 2019-01-28 2019-04-09 汇云时代科技(深圳)有限公司 一种日光模拟控制器
CN113506627B (zh) * 2020-11-25 2023-03-24 中国人民解放军陆军特种作战学院 一种夜间人体生理机能评估方法及系统
CN113176301B (zh) * 2021-04-30 2024-04-30 中国科学院地球化学研究所 一种基于电生理节律的植物健康活力的检测方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1542149A1 (en) * 2002-07-30 2005-06-15 Yamanouchi Pharmaceutical Co. Ltd. Apparatus for forming molecular timetable and appratus for estimating circadian clock
US20090202659A1 (en) * 2005-06-10 2009-08-13 Gimble Jeffrey M Modulation of Peripheral Clocks in Adipose Tissue
JP2007110912A (ja) * 2005-10-18 2007-05-10 Sony Corp ストレス評価方法
WO2008105476A1 (ja) * 2007-02-27 2008-09-04 Hiroshima University 概日リズム遺伝子および時計モチーフ
JP5320864B2 (ja) * 2007-07-06 2013-10-23 ソニー株式会社 生体リズム情報取得方法
JP4858344B2 (ja) 2007-07-25 2012-01-18 ソニー株式会社 毛を用いた生体リズム情報取得方法
JP4626700B2 (ja) * 2008-10-07 2011-02-09 ソニー株式会社 生体リズム情報取得方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAYES K.R. et al, Circadian clocks are seeing the systemsbiology light, Genome Biology, 2005, Vol.6, No.5, p.219. METZ RP et al., Circadian clock and cell cycle gene expression in mouse mammary epithelial cells and in the developing mouse mammary gland, Dev Dyn, 2006, 235(1), abstract *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2336355B1 (en) 2014-01-22
JP5560550B2 (ja) 2014-07-30
JP2010094072A (ja) 2010-04-30
RU2011113819A (ru) 2012-10-20
EP2336355A4 (en) 2012-06-06
US20110196619A1 (en) 2011-08-11
EP2336355A1 (en) 2011-06-22
BRPI0920426A2 (pt) 2018-10-23
CN102177254A (zh) 2011-09-07
WO2010044481A1 (ja) 2010-04-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2512069C2 (ru) Способ определения биологического ритма
Hoss et al. Factory-calibrated continuous glucose sensors: the science behind the technology
Parkinson et al. Clinical features of Friedreich's ataxia: classical and atypical phenotypes
Lai et al. Development of a novel frailty index to predict mortality in patients with end‐stage liver disease
Lee et al. Mitochondrial DNA copy number in peripheral blood is associated with cognitive function in apparently healthy elderly women
Dahele et al. Objective physical activity and self-reported quality of life in patients receiving palliative chemotherapy
Vetrano et al. Predictors of length of hospital stay among older adults admitted to acute care wards: a multicentre observational study
Yuan et al. Association between late-life blood pressure and the incidence of cognitive impairment: a community-based prospective cohort study
JP4626700B2 (ja) 生体リズム情報取得方法
EP2175035B1 (en) Method for obtaining information on biological rhythm by using hair
Heiberg et al. Exercise capacity and cardiac function after surgical closure of ventricular septal defect—is there unrecognized long-term morbidity?
Liu et al. Mitochondrial ND5 12338T> C variant is associated with maternally inherited hypertrophic cardiomyopathy in a Chinese pedigree
JP5320864B2 (ja) 生体リズム情報取得方法
Lindsey et al. Induction of tyrosinase gene transcription in human iris organ cultures exposed to latanoprost
Brunengraber et al. Relationship of serum C-reactive protein and blood glucose levels with injury severity and patient morbidity in a pediatric trauma population
US11643688B2 (en) Method for diagnosing mood disorder by using circadian rhythm
TW201913431A (zh) 對於類視色素之副作用之感受性之決定方法
Parkinson Clinical and genetic studies in autosomal recessive ataxias
JP2010115178A (ja) 皮膚の炎症の予測方法及びその用途
Tarlovskaya et al. [PP. 27.24] EFFECTS OF ASTHMA SEVERITY ON LEFT VENTRICLE OF CARDIAC REMODELING IN PATIENTS WITH ARTERIAL HYPERTENSION
JP2021175394A (ja) 月経周期マーカー
Sagliker et al. [PP. 27.26] FIRST MEDICAL WARNING. A REAL HARAKIRI. HYPERTENSIONOLOGIST'S HYPERTENSION. SAGLIKER EFFECT. CLASSICAL MANUAL BP MEASUREMENTS MUST BE BANNED BY LEGISLATIONS AND ESH AND WHO
Volkov et al. [PP. 27.25] SEASONAL DIFFERENCES OF BLOOD PRESSURE IN PATIENTS WITH ARTERIAL HYPERTENSION AND HIGH NORMAL BLOOD PRESSURE
Odegova et al. [PP. 27.27] CHARACTERS OF HEART REMODELING IN PATIENTS WITH BRONCHIAL ASTHMA COMBINED WITH ARTERIAL HYPERTENSION
Horlenko et al. GP31 Endothelial dysfunction as the main component of arterial hypertension in the children

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20151014