CN104830962A - 用于活体外测定致肥胖风险的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于活体外测定致肥胖风险的方法,包括下列步骤:齐备一含核酸的样品,检测该样品的过氧化体增殖剂活化受体(Peroxisome proliferator-activated receptor,PPARG)与多配体蛋白聚糖3(syndecan3,SDC3)的对偶基因的基因型;以及,鉴别该样品的PPARG与SDC3对偶基因的基因型,取得一鉴别结果,该鉴别结果是PPARG与SDC3对偶基因同时变异,该样品为源自于一具有增加的致肥胖的风险的个体。所述的方法是利用PPARG与SDC3基因的基因型判定致肥胖的风险,而具有相比于单一基因的基因型,可增加预测的准确度,以降低不同个体仅由相同的特定单一基因判定致肥胖风险的产生错误的可能性,并可供用于作为提供对应保健对策的依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测致肥胖风险的方法,尤指利用多个特定基因的单一核苷酸多型性于活体外测定致肥胖的风险的方法。
背景技术
脂肪细胞在生物体一开始会以前趋脂肪细胞(pre-adipocyte)的形式存在,在体内能量过多时,会促使前趋脂肪细胞分化成成熟脂肪细胞(mature adipocyte),并将油脂储存在脂肪细胞内。当能量持续过剩时,脂肪细胞会不断累积油脂,造成脂肪细胞肥大,演变成肥胖。
过氧化体增殖剂活化受体(Peroxisome proliferator-activatedreceptors,PPARs)是细胞核内受体蛋白的一类,主要作为转录因子调控核内基因的表达。PPARs基因家族成员包含PPARA、PPARB及PPARG,其中PPARG有2种异构体(isoform):PPARG1及PPARG2。PPARG1在大部分组织都会存在(肌肉组织除外),PPARG2则仅表现在脂肪组织及肠组织中。PPARG2基因其中一项主要功能便是调控脂肪生成的过程,尤其在前趋脂肪细胞分化成成熟脂肪细胞的阶段。在PPARG2基因小鼠剔除实验中,可以发现即使喂食高油脂饲料,小鼠无法产生脂肪细胞。
PPARG基因多形性的研究中,SNP rs1801282(C→G)是许多学者热门研究的位点,其变异会导致产生出来的PPARG2转录因子在第12号的氨基酸由脯氨酸(Proline)改变成丙氨酸(Alanine)。此变异的已经改变PPARG2本身的蛋白结构,影响调控下游基因转录的活性,然而rs1801282与肥胖的关联性目前有正反两面的看法。有一部分学者认为第12号的丙氨酸会降低PPARG调控下游基因转录的活性,使脂肪组织较不易累积在体内降低,较不易肥胖。但有另一部分的学者却从流行病学的调查中发现第12号氨基酸位置带有丙氨酸的人,其BMI显著高于带脯氨酸的人。rs1801282与肥胖的关联性推测可能因人种间的差异性而有所不同。
多配体蛋白聚糖(syndecan,SDC)是一种硫酸肝素蛋白聚糖(heparansulfate proteoglycan,HSPG),主要由核心蛋白(core protein)及硫酸肝素聚糖链(heparin sulfate chain)两个部分所组成。SDC基因家族主要存在于细胞膜上,由4个成员组成(SDC1~SDC4),其中多配体蛋白聚糖3(syndecan3,SDC3)主要表现于神经系统,包含控制食欲的下视丘。在正常小鼠禁食实验中,发现禁食状态下大脑下视丘神经细胞SDC3基因表有显著上升,推测此时SDC3可能是Agouti相关肽(Agouti-relatedpeptide,AGRP)的共同受体,并通过AGRP结合褪黑素受体(melanocortin receptor)传递增加食欲的信号,促进摄食行为。当给予喂食时,SDC3膜外结构(ectodomain)会脱离细胞膜使α黑色素刺激荷尔蒙(α-MSH)可与褪黑素受体结合传递抑制食欲的信号。观察SDC3基因剔除小鼠(SDC3null mice)的性状也发现其脂肪量低于正常小鼠,且摄食量下降,能量消耗上升,推论SDC3基因可以调节体重及身体能量的平衡。然而,在针对欧洲人种的研究结果发现SDC3的变异与肥胖发生无显著相关,再者,各个SDC3的SNP位点与肥胖发生的关联性有所不同。
基于上述可见,若欲单独以PPARG或SDC3基因多型性作为肥胖基因指标恐仍有争议之处,特定而言,单独利用PPARG或SDC3基因多型性检测致肥胖风险恐仍有不准确的疑虑。
发明内容
有鉴于现有技术检测致肥胖风险的方法,仍有检测结果不准确的问题,本发明的目的在于提供一种具有提高准确率的检测致肥胖风险的方法。
为了达上述目的,本发明提供一种用于活体外测定致肥胖风险的方法,其利用PPARG与SDC3基因的基因型组合判定致肥胖的风险,而具有相比于单一基因的基因型,可增加预测的准确度,以降低不同个体仅由相同的特定单一基因判定致肥胖风险的产生错误的可能性,并可供用于作为提供对应保健对策的依据。
在一方面,本发明提供一种用于活体外测定致肥胖风险的方法包括下列步骤:
齐备一含核酸的样品,
侦测该样品的过氧化体增殖剂活化受体(Peroxisomeproliferator-activated receptor,PPARG)与多配体蛋白聚糖3(syndecan3,SDC3)的对偶基因的基因型,以及,
鉴别该样品的PPARG与SDC3对偶基因的基因型,取得一鉴别结果,该鉴别结果是PPARG与SDC3对偶基因同时变异,则该样品为源自于一具有增加的致肥胖风险的个体。
另一方面,本发明提供一种测定致肥胖风险的基因多型性标记,其是由PPARG与SDC3基因型所形成的组合。
依据本发明,所述的变异是例如,但不限于:核苷酸重复、核苷酸插入、核苷酸缺失、复本变异或单一核苷酸多型性(single nucleotidepolymorphism,SNP),所述的变异造成插入子(intron)的序列变异、无义突变(nonsense mutation)或阅读框架位移(reading frame shift)。
依据本发明,该含核酸的样品来自于一为亚洲人种的族群的个体;特定的,该个体系汉人(Han Chinese)。
依据本发明,所述的核酸是脱氧核糖核酸或核糖核酸,优选的为基因组脱氧核糖核酸(genomic DNA)。总所周知,当所述的核酸是核糖核酸时,齐备一含核酸的样品的步骤包括,提供一核糖核酸,并且形成互补脱氧核糖核酸。
依据本发明,所述的侦测PPARG与SDC3的对偶基因的基因型的步骤包括利用本领域所知的任何以一般遗传工程、生物化学等方法鉴别PARG与SDC3的对偶基因的基因型的技术,例如,但不限于:聚合酶链锁反应配合定序分析(PCR and Sequencing)、即时聚合酶链锁反应(Real-time PCR)、限制性片段长度多型性(restriction fragment lengthpolymorphism,RFLP)、质谱仪分析(Mass Spectrometry);或者,任何其他合适的分析基因型的高通量筛选方法(high-throughput screeningmethod),诸如配合连接子聚合酶链锁反应(Linker-PCR)的生物晶片(Biochip)或次世代定序(Next generation sequencing,NGS)。
依据本发明,所述的PPARG对偶基因的变异发生于外显子(exon)及内显子(intron)区域内,所述的鉴别该样品的PPARG与SDC3对偶基因的基因型包括:分析PPARG与SDC3对偶基因的变异,以取得该鉴别结果,其中PPARG对偶基因的变异发生于选自于由下列者所构成的群组的位置:rs1801282(外显子4)、rs1805192(外显子3)、rs1800571(外显子2)、rs1822825(内显子6);特别是发生于具有如SEQ ID NO.1所示序列的区域,该SNP rs1801282C→G对偶基因变异位在PPARG基因外显子区域内,使该基因转译后第12号氨基酸由脯氨酸(Proline)变异成丙氨酸(Alanine),改变蛋白质构形,影响PPARG转录活化功能,或是发生于具有如SEQ ID NO.3所示序列的区域。
依据本发明,所述的SDC3对偶基因的变异发生于外显子区域内,其中SDC3的变异发生于选自于由下列者所构成的群组的位置:rs2282440、rs2491132以及rs4949184;特别是具有如SEQ ID NO.2所示序列的区域内,该SNP rs2282440C→T对偶基因变异位在SDC3基因外显子区域上,使该基因转译后第329号氨基酸由苏氨酸(Threonine)变异成异亮氨酸(Isoleucine)。
依据本发明,所述的测定致肥胖风险的基因多型性标记,其是由PPARG的SNP rs1801282、rs1805192、rs1822825和/或rs1800571;与SDC3的SNP rs2282440、rs2491132和/或rs4949184所形成的组合。
更佳的,侦测该样品的PPARG与SDC3对偶基因的基因型的步骤包含:将该样品与两不同专一性探针相结合,所述专一性探针是分别针对PPARG的SNP rs1801282,以及SDC3的SNP rs2282440;以及,其中该鉴别结果是PPARG的rs1801282为G同时SDC3的rs2282440为T,则该样品为源自于具有增加的致肥胖的风险的个体。
更佳的,侦测该样品的PPARG与SDC3对偶基因的基因型的步骤包含:将该样品与两不同专一性探针相结合,所述专一性探针是分别针对PPARG的SNP rs1822825,和针对SDC3的SNP rs2282440;以及,其中该鉴别结果是PPARG的rs1822825为G同时SDC3的rs2282440为T,则该样品为源自于具有增加的致肥胖的风险的个体。
所述的PPARG对偶基因的变异发生于具有如SEQ ID NO.1所示序列的区域,优选的,该序列的第26碱基位置为G。
所述的PPARG对偶基因的变异发生于具有如SEQ ID NO.3所示序列的区域,优选的,该序列的第26碱基位置为G。
所述的SDC3对偶基因的变异发生于具有如SEQ ID NO.2所示序列,优选的,该序列的第26碱基位置为T。
依据本发明,所述的肥胖以选自于下列所构成的群组的数值为指标:个体的身体质量指数(body mass index,BMI)、腰围、腰臀比、体脂率,以及血液中三酸甘油酯含量。
依据本发明,所述的个体的身体质量指数,如本领域所知的,是体重(公斤)/身高2(公尺2)。
依据本发明,所述的腰围为任何本领域所接受的方式进行量测所得到的数值,优选的是指除去腰部覆盖的衣物,轻松站立,双手自然下垂,将皮尺绕过腰部,调整高度,让皮尺能通过左右两侧骨盆上缘(肠骨上缘)至肋骨下缘的中间,注意皮尺与地面保持平行,并紧贴、不挤压皮肤,维持正常呼吸,在吐气结束时,量取的腰围数值。
依据本发明,所述的腰臀比(Waist to Hip Ratio,WHR)是指腰围和臀围的比例,数值等于腰围除以臀围,其中腰围如前所述,而臀围指在双腿并拢时以水平最大宽度处的量度值。一般而言,腰围反映脂肪总量和脂肪分布的综合指标,臀围反映髋部骨胳和肌肉的发育情况。腰臀比越大时,表示倾向于肥胖。
依据本发明,前述的指标可以以一般正常人为基准,定义所述的肥胖,优选的,当个体的身体质量指数(body mass index,BMI)≧27公斤/公尺2、腰围男性≧90公分,女性≧80公分、腰臀比男性≧0.9,女性≧0.85、体脂率男性≧30%,女性≧35%,为所认定的肥胖。
依据本发明的方法其进一步包括:记录该鉴别结果于一记录媒体中。所述的方法可以包括应用于与一记录媒体相配合,该记录媒体可为一云端硬盘、DVD、随身存取记忆体、行动装置或任何其他可记录资讯或连结一运算软件或工作站的媒介。
基于上述,本发明的方法与标记,可通过同时检测SDC3与PPARG的基因型相比于单纯仅试验SDC3或PPARG更能确认受试者致肥胖的风险程度,且当两者皆为中、高风险基因型时,其致肥胖的风险大幅提高。
附图说明
图1是不同PPARG与SDC3单一核苷酸多型性基因型的受试者,其BMI的平均值柱状图。
图2是不同PPARG与SDC3单一核苷酸多型性基因型的受试者,其腰围的平均值的柱状图。
图3是不同PPARG与SDC3单一核苷酸多型性基因型的受试者,其腰臀比的平均值的柱状图。
图4是不同PPARG与SDC3单一核苷酸多型性基因型的受试者,其体脂率的平均值的柱状图。
图5是不同PPARG与SDC3单一核苷酸多型性基因型的受试者,其三酸甘油酯的平均值的柱状图。
图6是不同PPARG与SDC3单一核苷酸多型性基因型的受试者,其BMI的平均值柱状图。
图7是不同PPARG与SDC3单一核苷酸多型性基因型的受试者,其腰围的平均值的柱状图。
图8是不同PPARG与SDC3单一核苷酸多型性基因型的受试者,其体脂率的平均值的柱状图。
具体实施方式
依据本发明的方法,其中该样品来自一个选自于由血液、头发、皮肤、唾液、精液、尿液、粪便物质、汗液,及颊粘膜样品所构成的群组的生物样品。
本发明通过以下实施例作为例示说明,本发明优选的实施方式,但其具体实施的手段并不作为解读申请专利范围的限制。依据本发明的方法,其利用SDC3_rs2282440及PPARG_rs1801282的基因型组合可用来检视其与受测者生理与生化分析数值高低的关联性,结果发现SDC3_rs2282440_T对偶基因及PPARG_rs1801282_G对偶基因与增加的BMI、腰围、腰臀比、体脂率及三酸甘油酯具有高度相关性,由此可知作为利用SDC3_rs2282440及PPARG_rs1801282的基因型组合的类型可以准确评估受测者产生肥胖的风险。
在本发明的一优选的实施例中,所述的侦测PPARG与SDC3的对偶基因的基因型的步骤是侦测PPARG与SDC3的对偶基因的单一核苷酸多型性,其包括任何已知的方式进行的试验,诸如于多功能核酸质谱分析仪上进行SNP定型的分析方法,包含三个反应步骤:首先以PCR针对标的单一核甘酸多型性位置(target SNP site)进行增幅反应,接着进行单一碱基延伸反应后,最后再将反应产物使用质谱技术分析产物分子量,由于单一碱基延伸出四种碱基A、T、C、G的分子量均不相同,将产物点样至晶片上,以核酸质谱仪撷取信号,再由软件自动分析SNP基因型。具体的是,所述的分析方法为诸如针对SNP基因型的Gold试验(iPLEX Gold Assay for SNP Genotyping)又或于即时定量PCR仪进行SNP定型,乃针对标的单一核甘酸多型性位置设计水解探针(hydrolysis probe),进行PCR增幅反应后侦测荧光光信号,并由软件分析后判读SNP的基因型。具体的是,所述的分析方法为诸如SNP基因型鉴定试验(SNP genptypingassay)。
实施例
材料与方法
<受试者招募>
本试验通过马偕纪念医院家庭医学科及社区医学中心邀请台湾成年人参与,并排除目前有怀孕、癌症、次级肥胖、先天性染色体异常引起的肥胖(如Prader-Willi Syndrome)、服用减重药物者或曾接受过减重手术者。参与试验的587位受试者,根据台湾行政院卫生署成人肥胖定义,将受试者分成正常组(323人,BMI<27kg/m2)及肥胖组(264人,BMI≧27kg/m2)。所有受试者皆需同意签署人体试验同意书,并记录其年龄、性别、身高、体重、腰臀围、体脂率、血压、心跳等数据。试验内容皆经过马偕医院人体试验委员会(IRB)审核通过后执行。
<检体采集>
受试者空腹8小时后采集周边静脉血(约3~5c.c)进行血液生化分析,检验项目包括总胆固醇(total cholesterol)、三酸甘油酯(triglyceride)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、空腹血糖(fasting blood sugar)、血清胰岛素(serum insulin)及高敏感C反应蛋白(hs-CRP)。另外,口腔采检刷采集口腔颊粘膜细胞进行DNA萃取及基因型鉴定。
<DNA萃取及SNP基因型鉴定>
口腔颊粘膜细胞采用gSYNCTM DNA萃取试剂组(Geneaid)进行DNA萃取,并以超微量分光光度计(Nanodrop Spectrophotometer,Thermo)测量DNA浓度及纯度。SNP基因型鉴定(SNP genotyping)采用TaqMan基因型鉴定试验(TaqMan SNP genotyping assay,ABI;试验编号Assay ID:C___1129864_10、C__15878257_10、C___1129818_10)配合即时定量PCR仪(StepOne Plus real-time PCR system,ABI)进行分析,取25ng DNA与基因型鉴定试剂及定量PCR试剂混合液(probe fast qPCRKit Master Mix,Kapa Biosystems)在微量管混合均匀后,放入即时定量PCR仪执行快速模式。单一核苷酸多型性(single nucleotidepolymorphism,SNP)基因型鉴定结果以StepOne software v2.2.2进行分析。
<统计分析>
正常组与肥胖组之间连续变项平均数的差异以独立样本t检定(independent t-test)分析,两组间SNP基因型频率的差异以卡方检定(chi-square test)分析。共变数分析(analysis of covariance,ANCOVA)在校正年龄与性别后来评估单一SNP基因型或组合SNP基因型连续变项平均数的差异,并以LSD法进行事后检定(post hoc analysis)。单一SNP基因型或组合SNP基因型对肥胖的风险以逻辑回归(logistic regression)校正年龄与性别后计算出的胜算比(odds ratio,OR)来评估。所有统计方法以统计软件SPSS16.0执行,p值<0.05视为有统计上显著差异。
本实施例中正常组与肥胖组受试者的临床数据经由问卷、理学检查及血液生化分析取得受试者年龄、性别、身高、体重、腰臀围、体脂率、血压、心跳、血脂、血糖等数据,并由口腔颊粘膜细胞经过DNA萃取及SNP基因型鉴定,针对SDC3_rs2282440及PPARG_rs1801282、PPARG_rs1822825的SNP基因型进行鉴定,当受试者鉴定分析结果显示其SDC3_rs2282440有一对偶基因为C时,属于SDC3_rs2282440C携带者(包括SDC3_rs2282440为C/C与C/T基因型);当受试者鉴定分析结果显示其PPARG_rs1801282有一对偶基因为G时,属于PPARG_rs1801282G携带者;当受试者鉴定分析结果显示其PPARG_rs1822825有一对偶基因为A时,属于PPARG_rs1822825A携带者。
受试者基因型与各生化分析结果的数值经共变数分析与事后比较的结果如下表1、2所示。
表1受试者基因型的组合效应分析结果
表2受试者基因型的组合效应分析结果
其中,SDC3_rs2282440C携带者、SDC3_rs2282440_T/T与PPARG_rs1801282_C/C基因型以及PPARG_rs1801282_G携带者(C/G+G/G)同时为SDC3_rs2282440_T/T基因型者,其BMI、腰围、腰臀比、体脂率、三酸甘油酯的平均值的柱状图与胜算比分别如下述表3以及图1至5所示。
表3受试者基因型的组合效应风险分析
#逻辑回归(Logistic regression)校正年龄性别
结果显示,受试者当SDC3rs2282440位点为T与PPARG rs1801282位点为G基因型,其无论BMI、腰围、腰臀比、体脂率以及三酸甘油酯组别的胜算比(Odds ratio)皆相对于SDC3rs2282440位点为正常者高,分别为6.77、5.40、4.08、4.65以及3.52,因此同时检测SDC3与PPARG的SNP基因型相比于单纯仅试验SDC3或PPARG更能确认受试者致肥胖的风险程度,且当两者皆为中、高风险基因型时,其致肥胖的风险大幅提高。
其中,SDC3_rs2282440C携带者、SDC3_rs2282440_T/T与PPARG_rs1822825_A/A基因型以及PPARG_rs1822825_G带原者(A/G+G/G)同时为SDC3_rs2282440_T/T基因型者,其BMI、腰围、腰臀比、体脂率、三酸甘油酯的平均值的柱状图与胜算比分别如下述表4以及图6至8所示。
表4受试者基因型的组合效应风险分析
结果显示,受试者当SDC3rs2282440位点为T与PPARG rs1822825位点为G基因型,其无论BMI、腰围、体脂率组别的胜算比(Odds ratio)皆相对于SDC3rs2282440位点为正常者高,分别为2.74、2.73以及2.92,因此同时检测SDC3与PPARG的SNP基因型相比于单纯仅试验SDC3或PPARG更能确认受试者致肥胖的风险程度,且当两者皆为中、高风险基因型时,其致肥胖的风险大幅提高。
Claims (10)
1.一种用于活体外测定致肥胖风险的方法,其包括:
齐备一含核酸的样品;
侦测该样品的过氧化体增殖剂活化受体与多配体蛋白聚糖3的对偶基因的基因型;以及
鉴别该样品的PPARG与SDC3对偶基因的基因型,取得一鉴别结果,该鉴别结果是PPARG与SDC3对偶基因同时变异,则该样品为源自于一具有增加的致肥胖的风险的个体。
2.根据权利要求1所述的用于活体外测定致肥胖风险的方法,其中该变异包括核苷酸重复、核苷酸插入、核苷酸缺失或复本变异。
3.根据权利要求1所述的用于活体外测定致肥胖风险的方法,其中鉴别该样品的PPARG与SDC3对偶基因的基因型包括:分析PPARG与SDC3对偶基因的变异,以取得该鉴别结果,其中PPARG对偶基因的变异发生于选自于由下列者所构成的群组的位置:rs1801282、rs1805192、rs1822825以及rs1800571。
4.根据权利要求1所述的用于活体外测定致肥胖风险的方法,其中SDC3的变异发生于选自于由下列者所构成的群组的位置:rs2282440、rs2491132以及rs4949184。
5.根据权利要求3所述的用于活体外测定致肥胖风险的方法,其中侦测该样品的PPARG与SDC3对偶基因的基因型的步骤包含:
将该样品与两不同专一性探针相结合,所述专一性探针是分别针对PPARG的SNP rs1801282或rs1822825,和针对SDC3的SNPrs2282440;以及,
其中该鉴别结果是PPARG的rs1801282或rs1822825为G同时SDC3的rs2282440为T,则该样品来自于一具有大约1.5至6倍的致肥胖风险的个体。
6.根据权利要求1至5任一项所述的用于活体外测定致肥胖风险的方法,其中所述的肥胖以选自于下列所构成的群组的数值为指标:个体的身体质量指数、腰围、腰臀比、体脂率,以及血液中三酸甘油酯含量。
7.根据权利要求1至5任一项所述的用于活体外测定致肥胖风险的方法,其中该含核酸的样品来自于一为汉人的个体。
8.根据权利要求1至5任一项所述的用于活体外测定致肥胖风险的方法,其进一步包括:记录该鉴别结果于一记录媒体中。
9.一种测定致肥胖风险的基因多型性标记,其是由PPARG与SDC3基因型所形成的组合。
10.根据权利要求9所述的测定致肥胖风险的基因多型性标记,其是由PPARG的SNP rs1801282、rs1805192、rs1822825和/或rs1800571;与SDC3的SNP rs2282440、rs2491132和/或rs4949184所形成的组合。
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CN107660236A (zh) * | 2015-04-30 | 2018-02-02 | 利波日特标记公司 | 基于脂肪组织样本,预测和/或诊断疾病的方法及方法套件 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN104830962B (zh) | 2017-12-05 |
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