WO2010027008A1 - 歯根・歯周組織ユニット形成方法、及び再生歯 - Google Patents

歯根・歯周組織ユニット形成方法、及び再生歯 Download PDF

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WO2010027008A1
WO2010027008A1 PCT/JP2009/065388 JP2009065388W WO2010027008A1 WO 2010027008 A1 WO2010027008 A1 WO 2010027008A1 JP 2009065388 W JP2009065388 W JP 2009065388W WO 2010027008 A1 WO2010027008 A1 WO 2010027008A1
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culture
tooth
root
cell
derived cells
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PCT/JP2009/065388
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English (en)
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貴 中原
石川　博
佐藤　聡
太田　正人
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学校法人 日本歯科大学
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    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
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    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3839—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by the site of application in the body
    • A61L27/3843—Connective tissue
    • A61L27/3865—Dental/periodontal tissues

Definitions

  • the present invention relates to an organ formation method for forming a mammalian organ, and particularly to a method for forming a mammalian root, periodontal tissue, or a complex (unit) thereof.
  • a dental root that has a function of fixing the tooth to the jawbone and supporting the crown rather than a crown that can be reconstructed with a prosthesis using modern dental clinical technology. It is desired to provide a periodontal tissue (periodontal ligament, alveolar bone, cementum, gingiva) that supports this tooth root. In particular, it is desired to provide a tooth root provided with periodontal ligament and alveolar bone.
  • the periodontal ligament is a soft tissue (connective tissue) that is interposed between the cementum of the root and the alveolar bone, and the periodontal ligament is used to mitigate the impact during mastication and perceptual response.
  • Non-Patent Document 1 describes biodegradable absorption obtained by shaping a cell suspension containing many types of cells derived from tooth germ obtained from an undeveloped third molar tooth of a 6-month-old pig. Seed the polymer to make artificial tooth germ. Disclosed is a technique based on in vivo culture by xenotransplanting this artificial tooth germ into the greater omentum (a fat membrane in the abdominal cavity) of a rat that is rich in blood flow and has a sufficient supply of nutrients and oxygen. . 25 to 30 weeks after transplantation, small tooth-like tissues such as enamel, dentin and dental pulp are confirmed in the transplant.
  • Non-Patent Document 2 discloses a technique for reproducing the process of tooth generation by paying attention to the epithelial-mesenchymal interaction.
  • an artificial tooth germ is prepared by combining a tooth germ epithelium collected from a mouse fetus at 10 days of gestation and three types of stem cells not derived from a tooth germ as a substitute for a tooth germ mesenchyme. . Following the preparation, artificial tooth germs are allografted under the kidney capsule of adult mice and grown in vivo for 12 days to form teeth.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 above only the tooth regeneration technique that requires xenogeneic / allograft (in vivo culture) has been known so far.
  • Non-Patent Document 3 in vitro culture did not form sufficient teeth, and formation of bones such as alveolar bone was not recognized, so periodontal tissue could not be obtained. For this reason, in order to form teeth, it has been necessary to rely on xenogeneic and allogeneic transplantation (in vivo culture). There have been no reports of attempts to regenerate human teeth, and clinically, only dental roots (artificial roots) were replaced with metal (titanium) root functions.
  • the present invention provides a method capable of forming at least a root in a tooth having at least a crown in vitro (in vitro culture) without using a xenogeneic / allograft technique (in vivo culture), and
  • An object is to provide a regenerated tooth formed by the method.
  • the present inventors have made extensive studies and obtained the following findings. That is, the present inventors include at least a tooth having a dental crown, a cell containing at least one of periodontal ligament-derived cells, bone marrow-derived cells, dental follicle-derived cells, dental pulp-derived cells, and tooth papilla-derived cells.
  • a culture core that is wrapped in a base material and wrapped in the cell-containing base material is included in a conditioned medium of a serum-free growth strain of a human cervical squamous cell carcinoma cell line Components, and IL-1 ⁇ , IL-6, IL-8, IL-9, EGF, IGF-I, GH, PDGF-AB, VEGF, LIF, HGF, FGF-2, FGF-1, BMP-2,
  • root / periodontal tissue unit of the present invention clearly shows its characteristics because the root and periodontal tissue are simultaneously formed by the method of the present invention and can be formed as one complex (unit). It was named as root / periodontal tissue unit.
  • the present invention is based on the above findings of the present inventors, and means for solving the above problems are as follows. That is, ⁇ 1> A method of forming at least a root of a tooth having at least a crown, Culture that forms a culture core in which the tooth is wrapped with a cell-containing substrate containing at least one of periodontal ligament-derived cells, bone marrow-derived cells, dental follicle-derived cells, dental pulp-derived cells, and tooth papilla-derived cells.
  • the culture medium is a component contained in an conditioned culture medium of a serum-free proliferating strain of human cervical squamous cell carcinoma cell line, and IL-1 ⁇ , IL-6, IL-8, IL-9, EGF, IGF-I, GH, PDGF-AB, VEGF, LIF, HGF, FGF-2, FGF-1, BMP-2, BMP-4, It is a method characterized by comprising at least one of a culture fluid additive having at least one of M-CSF, dexamethasone, insulin, thyroxine, silocalcitonin, ascorbic acid, and ⁇ -glycerophosphate.
  • ⁇ 2> The method according to ⁇ 1>, wherein the periodontal tissue is further formed in the step of culturing the culture core in a culture solution and forming at least a root of a tooth in the culture core.
  • the cell-containing substrate is at least one of a cell sheet and a cell-containing porous substrate.
  • the culture core is further wrapped with a porous substrate not containing cells.
  • teeth are pre-cultured on a cell sheet.
  • a regenerated tooth having at least a root which is formed by the method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 5>.
  • the above-mentioned conventional problems can be solved and the above-mentioned object can be achieved, and at least teeth can be obtained in vitro (in vitro culture) without using a xenogeneic / allograft technique (in vivo culture).
  • a method capable of forming at least a root of a tooth having a crown, and a regenerated tooth formed by the method can be provided.
  • FIG. 1 is an explanatory diagram (a stereomicrograph) of a mouse dental crown used in Example 1.
  • FIG. 2 is an explanatory diagram of subculture of periodontal ligament-derived cells of Example 1.
  • FIG. 3 is an explanatory diagram of the preculture (preculture) of Example 1.
  • 4 is an explanatory view of a cross section of the culture core of Example 1.
  • FIG. 5 is an explanatory diagram (a stereomicrograph) showing a state of the mouse crown after one week of culture in Example 1.
  • FIG. 6 is an explanatory diagram (a stereomicrograph) showing a state of a mouse dental crown after 2 weeks of culture in Example 1.
  • FIG. 7 is an explanatory diagram (stereomicrograph) showing the state of the mouse crown after 4 weeks of culture in Example 1.
  • FIG. 8 is a soft X-ray photograph of the teeth of Example 1 after 4 weeks of culture.
  • FIG. 9 is an explanatory diagram showing the results of HE staining of the tooth flakes after 4 weeks of culture in Example 1.
  • FIG. 10 is an explanatory view showing an encircled portion a in FIG. 9 in an enlarged manner.
  • FIG. 11 is an explanatory view showing an encircled portion b in FIG. 9 in an enlarged manner.
  • FIG. 12 is an explanatory diagram showing the encircled portion c in FIG. 9 in an enlarged manner.
  • FIG. 13 is an explanatory view (HE-stained image) showing an enlarged view of the tissue around the periodontal ligament of the tooth after 4 weeks of culture in Example 1.
  • FIG. 14 is an explanatory diagram showing the result of the in situ hybridization method using the Periodin of Example 1.
  • FIG. 15 is an explanatory diagram showing the results of the in situ hybridization method using the BSP of Example 1.
  • FIG. 16 is an explanatory diagram showing a dental X-ray image of a transplanted tooth 4 weeks after transplantation in Example 1.
  • FIG. 17 is an explanatory view showing a micro CT image of a transplanted tooth 4 weeks after transplantation in Example 1.
  • FIG. 18A is an explanatory view showing a fluorescence observation image of a transplanted tooth in the mouse skull of Example 1.
  • FIG. 18B is an explanatory diagram showing a fluorescence observation image of the transplanted tooth in the mouse skull of Example 1.
  • FIG. 19 is an explanatory diagram (a stereomicrograph) of the human dental crown used in Example 2.
  • FIG. 20 is an explanatory diagram (a stereomicrograph) of the pre-culture of Example 2.
  • FIG. 21 is an explanatory diagram (stereomicrograph) of culturing of the culturing core of Example 2.
  • FIG. 22 is an explanatory diagram (stereomicrograph) showing the state of the teeth immediately after removal from the culture core after 24 weeks of culture in Example 2.
  • FIG. 23 is an explanatory view showing a stereoscopic microscope image of teeth after 24 weeks of culture in Example 2.
  • FIG. 24 is a view showing a stereoscopic microscope image obtained by photographing the teeth of Example 2 after 24 weeks of culture from the oblique direction of the apex.
  • FIG. 25 is a view showing a stereoscopic microscope image obtained by photographing the teeth of Example 2 after 24 weeks of culture from the apical direction.
  • FIG. 26 is an explanatory view showing a soft X-ray image of a tooth after 24 weeks of culture in Example 2.
  • FIG. 27A is an explanatory view showing a micro CT image of a side surface of a tooth after 24 weeks of culture in Example 2.
  • FIG. 27B is an explanatory view showing a micro CT image of the side surface of the tooth after 24 weeks of culture in Example 2.
  • FIG. 27C is an explanatory view showing a micro CT image of a side cross section of a tooth after 24 weeks of culture in Example 2.
  • FIG. 28A is an explanatory diagram showing a micro CT image of a root cross section from the apical direction of a tooth after 24 weeks of culture in Example 2.
  • FIG. 28B is an explanatory diagram showing a micro CT image of the root cross section from the apical direction of the tooth after 24 weeks of culture in Example 2.
  • FIG. 28C is an explanatory diagram showing a micro CT image of the root cross section from the apical direction of the tooth after 24 weeks of culture in Example 2.
  • FIG. 29 is an explanatory diagram showing a stereoscopic microscope image of the soft tissue peeled from the teeth of Example 2.
  • FIG. 30 is an explanatory diagram showing a soft X-ray image of the soft tissue peeled from the teeth of Example 2.
  • FIG. 31A is an explanatory diagram showing a micro CT image of the boxed portion of FIG.
  • FIG. 31B is an explanatory diagram showing a micro CT image of the boxed portion of FIG.
  • FIG. 32 is an explanatory diagram (stereomicrograph) showing the state of the mouse dental crown after 4 weeks of culture in Example 3.
  • FIG. 33 is an explanatory view showing a soft X-ray image of a tooth after 4 weeks of culture in Example 3.
  • FIG. 34 is an explanatory diagram (stereomicrograph) showing the state of the mouse dental crown after 4 weeks of culture in Example 4.
  • FIG. 35 is an explanatory diagram showing a soft X-ray image of a tooth after 4 weeks of culture in Example 4.
  • FIG. 36 is an explanatory diagram (stereomicrograph) showing the state of the mouse dental crown after 4 weeks of culture in Example 5.
  • FIG. 37 is an explanatory view showing a soft X-ray image of a tooth after 4 weeks of culture in Example 5.
  • FIG. 38 is an explanatory diagram (stereomicrograph) showing the state of the mouse dental crown after 4 weeks of culture in Example 6.
  • FIG. 39 is an explanatory view showing a soft X-ray image of the teeth of Example 6 after 4 weeks of culture.
  • FIG. 40 is an explanatory diagram (stereomicrograph) showing the state of the mouse dental crown after 4 weeks of culture in Example 7.
  • FIG. 41 is an explanatory view showing a soft X-ray image of a tooth after 4 weeks of culture in Example 7.
  • FIG. 42 is an explanatory diagram (stereomicrograph) showing the state of the mouse dental crown after 4 weeks of culture in Example 8.
  • FIG. 43 is an explanatory view showing a soft X-ray image of a tooth after 4 weeks of culture in Example 8.
  • FIG. 44 is an explanatory diagram (stereomicrograph) showing the state of the mouse dental crown after 4 weeks of culture in Example 9.
  • FIG. 45 is an explanatory view showing a soft X-ray image of teeth after 4 weeks of culture in Example 9.
  • FIG. 46 is an explanatory diagram (stereomicrograph) showing the state of the mouse dental crown after 4 weeks of culture in Example 10.
  • FIG. 47 is an explanatory diagram showing a soft X-ray image of the teeth of Example 10 after 4 weeks of culture.
  • FIG. 48 is an explanatory diagram (stereomicrograph) showing the state of the mouse dental crown after 4 weeks of culture in Example 11.
  • FIG. 49 is an explanatory diagram showing a soft X-ray image of the teeth of Example 11
  • the method of forming at least a root of a tooth having at least a crown according to the present invention includes at least a core forming step for culturing and a step of forming at least a root of a tooth in the culturing core, and further if necessary. Including other processes. In the step of culturing the culturing core in a culture solution and forming at least roots on teeth in the culturing core, it is preferable to further form periodontal tissue.
  • the method relates to a method of forming at least a root of a tooth having at least a crown of a mammal such as a human or a mouse, and is particularly useful as a method of forming at least a root of a tooth having at least a crown of a human.
  • the culturing core formation step includes at least a tooth having a crown, which contains at least one of periodontal ligament-derived cells, bone marrow-derived cells, dental follicle-derived cells, dental pulp-derived cells, and tooth papilla-derived cells. It is a step of wrapping with a base material to form a culture core.
  • the culture core has at least a tooth having a crown and a cell-containing base material, and further includes a porous base material that does not contain cells, if necessary.
  • the tooth having at least a crown is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose.
  • a tooth having only a crown (a tooth without a root), an unfinished root (a root being formed) Teeth on the way).
  • a crown extracted from a mammal such as a human or a mouse is used.
  • a crown of a natural tooth such as a third molar tooth (wisdom tooth) with an incomplete root can be used.
  • an artificial dental crown made of artificially produced enamel, dentin, various biological materials, or the like may be used as the tooth having at least the dental crown.
  • the cell-containing substrate contains at least one of periodontal ligament-derived cells, bone marrow-derived cells, dental follicle-derived cells, dental pulp-derived cells, and tooth papilla-derived cells.
  • a cell sheet, a cell-containing porous base material, etc. are mentioned.
  • the said cell containing base material may be used individually by 1 type, and may use 2 or more types together.
  • an embodiment in which the tooth having at least the crown is wrapped with a cell sheet and further wrapped with a cell-containing porous substrate is preferable.
  • the aspect in which the tooth having at least a crown is wrapped with a cell sheet and further wrapped with a cell-containing porous base material is advantageous in that the root formation period is short and the formation of alveolar bone is good.
  • Periodontal ligament cell- The periodontal ligament-derived cells are not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose. Examples thereof include periodontal ligament fibroblasts, periodontal ligament epithelial cells (malasse epithelial residue-derived cells), periodontal tissue stem cells. Etc.
  • the origin of the periodontal ligament-derived cells is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. Those derived from mammals such as humans and mice can be used.
  • the periodontal ligament-derived cells may be derived from the same species as the teeth having at least the crown, or may be derived from different species. There is no restriction
  • bone marrow-derived cells-- There is no restriction
  • the origin of the bone marrow-derived cells is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. Those derived from mammals such as humans and mice can be used.
  • the bone marrow-derived cells may be derived from the same species as the teeth having at least the crown, or may be derived from different species.
  • Dental follicle-derived cells There is no restriction
  • the origin of the dental follicle-derived cells is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. Those derived from mammals such as humans and mice can be used.
  • the dental follicle-derived cells may be derived from the same species as the teeth having at least the crown, or may be derived from different species.
  • dental follicle-derived cells can be collected from tissues surrounding unfinished human extracted teeth.
  • dental pulp origin cell there is no restriction
  • the origin of the dental pulp-derived cells is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. Those derived from mammals such as humans and mice can be used.
  • the pulp-derived cells may be derived from the same species as the teeth having at least the crown, or may be derived from different species.
  • pulp-derived cells can be collected from human extracted teeth or deciduous teeth in the mixed dentition period (exchange period).
  • tooth papilla origin cell there is no restriction
  • the origin of the tooth papilla-derived cells is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. Those derived from mammals such as humans and mice can be used.
  • the tooth papilla-derived cells may be derived from the same species as the teeth having at least the crown, or may be derived from different species.
  • the collection method of the said tooth papilla origin cell According to the objective, it can select suitably. For example, dermal papilla-derived cells can be collected from an extracted tooth with an incomplete human root.
  • Cell sheet-- The cell sheet is obtained by culturing at least one of periodontal ligament-derived cells, bone marrow-derived cells, dental follicle-derived cells, dental pulp-derived cells, and tooth papilla-derived cells in a predetermined culture solution and reaching confluence. At least one week has passed. Periodontal ligament-derived cells, bone marrow-derived cells, dental follicle-derived cells, dental pulp-derived cells, and tooth papilla-derived cells that have passed at least one week after reaching the confluence are still in sheet form after being detached from the incubator. In order to exhibit an aspect, in this specification, it describes with a "cell sheet" for convenience.
  • the number of passages of cells used in the cell sheet is not particularly limited as long as it is a normal diploid cell, and can be appropriately selected according to the purpose, but is preferably up to the third passage, and the second passage. Is more preferable. If the passage is 4th generation or more, aneuploid cells (cells having abnormal chromosomes) may be generated. On the other hand, when the passage is the second passage, almost all cells are normal diploid, which is advantageous in terms of safety.
  • the cell sheet after culturing at least one of periodontal ligament-derived cells, bone marrow-derived cells, dental follicle-derived cells, dental pulp-derived cells, and tooth papilla-derived cells, and reaching confluence, it may take one week or more. As long as it has passed, there is no particular limitation, and it can be appropriately selected according to the purpose. However, it is preferably 1 week to 4 weeks after reaching confluence.
  • the predetermined culture solution is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • DMEM / F12, HAM F12, ⁇ -MEM and the like can be used.
  • the component contained in the culture solution is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include FBS (fetal bovine serum), non-essential amino acid solution, penicillin, streptomycin, and fungizone.
  • FBS fetal bovine serum
  • the cell-containing porous substrate contains at least one of periodontal ligament-derived cells, bone marrow-derived cells, dental follicle-derived cells, dental pulp-derived cells, and tooth papilla-derived cells.
  • periodontal ligament-derived cells There is no restriction
  • tel plug trademark, Olympus Terumo Biomaterials company
  • collagen sponge
  • the porous substrate can locally arrange a large number of cells in a three-dimensional manner, and can effectively extract the functions of individual cells and the interaction between the cells.
  • the root, cementum, periodontal membrane It is preferable in that a periodontal tissue composed of various tissues such as alveolar bone and gingiva can be formed three-dimensionally.
  • a periodontal tissue composed of various tissues such as alveolar bone and gingiva can be formed three-dimensionally.
  • a method of seeding and culturing a suspension of the cell on a porous substrate, placing the porous substrate on the cultured cell, and moving the cultured cell The method of aiming at is mentioned.
  • the concentration of the cell suspension in the method of seeding and culturing the cell suspension on the porous substrate is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose. 10 6 cells / ml, 2 ⁇ 10 7 cells / ml, and the like.
  • the culture period in the method of seeding and culturing the cell suspension on the porous substrate is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose, but is preferably 72 hours or more, 72 hours to 1 week is more preferable.
  • porous base material used for the porous base material which does not contain the said cell
  • it can select suitably, It is the same as the porous base material described by the cell containing porous base material. Things can be used.
  • the culturing core formation step may include a pre-culture step.
  • the pre-culturing step is a step in which the teeth having at least the crown are cultured on the cell sheet.
  • the preculture period is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose. It is preferably 0.5 to 7 days, more preferably 1 to 2 days.
  • the tooth having at least the crown is fixed on the cell sheet and cannot move, the operation of wrapping the tooth having at least the crown with the cell sheet is facilitated, and the cell sheet is facilitated, and the cell sheet is Depending on the humoral factors produced, various types of cells (dental papillary cells (dental pulp cells), enamel epithelial cells, Hertwig epithelial sheath cells, and dental follicle cells) that can be present in at least the tooth having the crown are added to the root and periodontal tissues. This is advantageous in that differentiation can be induced into forming cells.
  • the tooth having at least the crown is made of at least one of the periodontal ligament-derived cells, bone marrow-derived cells, dental follicle-derived cells, dental pulp-derived cells, and tooth papilla-derived cells. It can also be immersed for several hours in a conditioned medium.
  • the step of forming at least roots on the teeth in the culture core is a step of culturing the culture core in a culture solution and forming at least roots on the teeth in the culture core. In the step, it is preferable to further form periodontal tissue.
  • the culture medium of the culture core may be referred to as a component of a conditioned medium of a serum-free proliferating strain of human cervical squamous cell carcinoma cell line (hereinafter referred to as “natural TFs” (Embryotropic factor)).
  • synthetic ETFs hereinafter synthetic human organs
  • rhOEFs Regenerative human Organ Engineering Fact rs
  • the culture solution for the culture core is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include DMEM / F12, Ham F12, ⁇ -MEM and the like.
  • the culture solution only needs to have at least one of the natural ETFs and the rhOEFs, but it is preferable to use the rhOEFs alone in that no unknown infectious substance is present.
  • the natural ETFs are components contained in a conditioned medium of a serum-free proliferating strain (SKG-II-SF) of a squamous cell carcinoma cell line (SKG-II) of the human cervix.
  • the method for preparing the natural ETFs is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. For example, there is a method in which the SKG-II-SF is cultured, the culture solution is desalted and then lyophilized. Can be mentioned.
  • the culture period of the SKG-II-SF is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include culturing for 4 days in a confluent state.
  • the natural ETFs include IL-1 ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12, EGF, TNF- ⁇ . , TGF- ⁇ , IGF-I, GH, PDGF-AB, IGF-BP-3, FGF-2, VEGF, LIF, and HGF, and other components (components derived from the conditioned medium)
  • TGF- ⁇ TGF- ⁇
  • IGF-I IGF-I
  • GH GH
  • PDGF-AB IGF-BP-3
  • FGF-2 VEGF
  • LIF vascular endothelial growth factor
  • HGF HGF
  • ⁇ 5.0 pg / mL IL-6 (Interleukin-6): 50 pg / mL to 150 pg / mL IL-9 (Interleukin-9): 400 pg / mL to 500 pg / mL IL-10 (Interleukin-10) ... ⁇ 5.0 pg / mL IL-12 (Interleukin-12) ... ⁇ 7.8pg / mL EGF (Epidmal growth factor): 0.5 ng / mL to 2.0 ng / mL TNF- ⁇ (Tumor necrosis factor- ⁇ ) ... ⁇ 5.0 pg / mL TGF- ⁇ (Transforming growth factor- ⁇ ) ...
  • IGF-I Insulin-like growth factor-I
  • GH Greenhouse Hormone
  • 0.1 ng / mL to 0.5 ng / mL PDGF-AB Platinum-derived growth factor-AB: 450 pg / mL to 550 pg / mL IGF-BP-3 (Insulin-like growth factor-binding protein-3) ...
  • FGF-2 Fibroblast growth factor: 35 pg / mL to 45 pg / mL VEGF (Vascular endothelial growth factor): 1 ng / mL to 10 ng / mL LIF (Leukemia inhibitory factor): 25 pg / mL to 35 pg / mL HGF (Hepatocyte growth factor): 0.5 ng / mL to 1.5 ng / mL
  • the content of the natural ETFs in the culture medium for culturing the culture core is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. It is preferably 1% by volume to 12% by volume, and 5% by volume. More preferred is 10% by volume. If the content of the natural ETFs in the culture solution is less than 1% by volume or greater than 12% by volume, it may be difficult to form a tooth root, periodontal tissue, or a complex thereof. On the other hand, when the content of the natural ETFs is within the more preferable range, it is advantageous in that the formation efficiency of a tooth root, periodontal tissue, or a complex thereof is good.
  • the rhOEFs are IL-1 ⁇ , IL-6, IL-8, IL-9, EGF, IGF-I, GH, PDGF-AB, VEGF, LIF, HGF, FGF-2, FGF-1, BMP-2, It has at least one of BMP-4, M-CSF, dexamethasone, insulin, thyroxine, silocalcitonin, ascorbic acid, and ⁇ -glycerophosphoric acid, and further contains other components as necessary.
  • Each component of rhOEFs is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. However, it is preferable to use a commercially available product in that it does not contain an unknown infectious substance.
  • IL-1 ⁇ Interleukin-1 ⁇
  • IL-6 Interleukin-6
  • 100pg / mL IL-8 Interleukin-8
  • 1.0 ng / mL IL-9 Interleukin-9)
  • EGF Epidermal growth factor
  • IGF-I Insulin-like growth factor-I
  • 20 ng / mL GH Gibreth Hometone
  • 2.5 ng / mL PDGF-AB Platinum-derived growth factor-AB
  • VEGF Vascular endothelial growth factor
  • 3.2 ng / mL LIF Leukemia inhibitory factor
  • 35 pg / mL HGF Hepatocyte growth factor
  • 1.0 ng / mL FGF-2 (Fibroblast growth factor-2): 20 ng / mL FGF-1 (Fibroblast growth factor-1) ...
  • a method for adding the rhOEFs to the culture solution is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose. For example, a method of adding all of the above components to the culture solution, The method of adding to a culture solution in combination is mentioned.
  • the ⁇ -glycerophosphate added to the culture medium for culturing the culture core is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but 10 mM is particularly preferable. If the ⁇ -glycerophosphate concentration in the culture solution is less than 10 mM, the formation of tooth roots and periodontal tissue or a complex thereof may be insufficient. A tissue or complex thereof may not be formed. On the other hand, it is preferable in the said especially preferable range at the point which can form a hard tissue (dentin, cementum, alveolar bone) efficiently.
  • the culture period can be appropriately selected according to the formation of a tooth root, periodontal tissue, or a complex thereof. For example, when static culture is used, 3 to 4 weeks are preferable for mice, and 24 weeks are preferable for humans. When perfusion culture is used, the culture period can be further shortened.
  • the replacement time of the culture medium in the culture (stationary culture) is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose, but is preferably every 4 to 5 days, more preferably every 3 to 4 days, Particularly preferred is every 2 to 3 days.
  • the regenerated tooth of the present invention can be obtained by the method of the present invention described above.
  • the first aspect of the regenerated tooth of the present invention has at least a crown and a root.
  • gear of this invention has a dental crown, a tooth root, and a periodontal tissue at least.
  • the periodontium includes periodontal ligament, alveolar bone, cementum and gingiva.
  • the regenerated tooth of the present invention may be used for transplantation as it is, or may be transplanted after processing such as shaping. Further, the periodontal tissue can be removed and used individually for transplantation to a transplant bed.
  • Example 1 (Formation of tooth root and periodontal tissue using mouse crown and periodontal ligament cell sheet) ⁇ Formation of culture core> -Preparation of crown- The first lower molars of the newborn mouse 6 days after birth were removed. As shown in FIG. 1, this molar tooth (hereinafter sometimes referred to as “mouse crown”) has completed the formation of the crown, but the root has not yet been formed.
  • Periodontal ligament tissue was collected from a human adult extracted tooth with a single blade razor. The collected periodontal ligament tissue pieces were further minced with a double-blade razor, and the minced periodontal ligament tissue was washed at 37 ° C. in 0.1% trypsin-0.02% EDTA / PBS ( ⁇ ) solution. The mixture was warmed for 30 minutes and strongly pipetted to dissociate periodontal ligament-derived cells.
  • the solution containing the periodontal ligament-derived cells was spun down at 300 ⁇ g for 5 minutes, and the supernatant was removed by suction, and then the basic medium (DMEM / F12 (manufactured by Invitrogen) + 15% FBS (manufactured by Moregate) was added to the sediment.
  • DMEM / F12 manufactured by Invitrogen
  • FBS manufactured by Moregate
  • FIG. 2 is an explanatory diagram of subculture of periodontal ligament-derived cells.
  • FIG. 3 is an explanatory diagram of preculture. By this preculture, the mouse dental crown was fixed on the human periodontal ligament-derived cell sheet.
  • the human periodontal ligament-derived cell sheet on which the mouse crown is placed is cut into a predetermined size using a sterilized razor, peeled off from the petri dish using a rubber policeman (manufactured by TPP), and the mouse crown Was wrapped with a human periodontal ligament cell sheet. Thereafter, the mouse crown encapsulated with the human periodontal ligament cell sheet was further encapsulated with Teldermis (registered trademark) (manufactured by Olympus Terumo Biomaterials). As described above, a mouse dental crown (31 in FIG. 4) was embedded in a human periodontal ligament-derived cell sheet (32 in FIG. 4) and Teldermis (41 in FIG. 4) to obtain a culture core.
  • FIG. 4 is an explanatory view of a cross section of the culture core.
  • the culture core was cultured in a culture solution obtained by adding 0.1 mL / mL of natural ETFs to a DMEM / F12 culture solution containing 15% FBS.
  • the culture medium was changed every few days.
  • the natural ETFs were prepared as follows.
  • ETFs Serum-free proliferating cell line (SKG-II-SF, RIKEN BioResource Center Cell Bank, Registration No. RCB0685) of human cervical squamous cell carcinoma cell line (SKG-II), DMEM / F12, or Ham F12
  • SKG-II human cervical squamous cell carcinoma cell line
  • DMEM / F12 human cervical squamous cell carcinoma cell line
  • Ham F12 Ham F12
  • ETFs were found to contain the following components by immunological analysis by ELISA (enzyme immunoassay) and radioimmunoassay.
  • FIG. 5 is an explanatory diagram (stereomicrograph) showing the state of the mouse dental crown after one week in culture. As shown in FIG. 5, it was confirmed that the root branching portion was closed and the two roots were branched.
  • FIG. 6 is an explanatory diagram (stereomicrograph) showing the state of the mouse dental crown after 2 weeks in culture. As shown in FIG. 6, it was confirmed that the two roots further extended.
  • FIG. 7 is an explanatory view (a stereomicrograph) showing a state of a mouse dental crown after 4 weeks of culture. As shown in FIG. 7, it was confirmed that alveolar bone was formed at the root equivalent portion.
  • FIG. 8 is a soft X-ray photograph of the teeth after 4 weeks. As shown in FIG. 8, alveolar bone was formed together with the tooth root, and a periodontal cavity (a space indicating formation of a periodontal ligament which is a soft tissue) was confirmed between the root and the alveolar bone.
  • a periodontal cavity a space indicating formation of a periodontal ligament which is a soft tissue
  • FIG. 9 is an explanatory diagram showing the results of HE staining of tooth flakes after 4 weeks of culture.
  • “91” indicates a dental crown
  • “92” indicates “tooth root”.
  • FIG. 10 is an explanatory view showing an encircled portion a in FIG. 9 in an enlarged manner.
  • a box “a” represents a part of the tissue around the crown. As shown in FIG. 10, it was confirmed that gingiva 101 and muscle tissue 102 were formed around the crown.
  • FIG. 11 is an explanatory diagram showing the encircled portion b in FIG. 9 in an enlarged manner.
  • the box b represents the part of the bone tissue between the two roots.
  • a large number of erythroblasts were observed in the bone marrow of the new alveolar bone, confirming findings suggesting hematopoiesis.
  • a portion indicated by a symbol * is a bone marrow cavity.
  • FIG. 12 is an explanatory diagram showing the encircled portion c in FIG. 9 in an enlarged manner.
  • An encircling c portion represents a part of the root pulp.
  • angiogenesis with erythrocytes was confirmed in the pulp of the root (arrow part).
  • the part indicated by the symbol * is a blood vessel cavity.
  • FIG. 13 is an explanatory diagram (HE-stained image) showing an enlarged view of the tissue around the periodontal ligament of the tooth after 4 weeks in culture.
  • the periodontal ligament (PDL; corresponding to the periodontal ligament in the soft X photograph of FIG. 8) is located between the alveolar bone (B) and the cementum (C) and dentin (D). It was confirmed that it was formed.
  • FIG. 14 is an explanatory diagram showing the result of the in situ hybridization method using Periodin.
  • FIG. 15 is an explanatory diagram showing the result of the in situ hybridization method using BSP. As shown in FIG. 14 and FIG. 15, it was confirmed at the gene expression level that the regenerated tissue was definitely periodontal tissue by using markers specific to the periodontal ligament, bone, and cementum. Thereby, it was confirmed that periodontal tissue was also formed around the roots formed by culture.
  • FIG. 16 is an explanatory view showing a dental X-ray image of a transplanted tooth 4 weeks after transplantation.
  • FIG. 17 is an explanatory view showing a micro CT image of a transplanted tooth 4 weeks after transplantation.
  • 161 indicates a transplanted tooth
  • 162 indicates a normal incisor (opposite side incisor)
  • FIG. 161 indicates a transplanted tooth
  • 171 of the transplanted tooth indicates a crown
  • 172 indicates a root (two roots)
  • 173 indicates a periodontal ligament. Indicates cavity. As shown in FIGS. 16 and 17, it was confirmed that the implant was maintained in the jawbone and engrafted.
  • ⁇ Transplantation test 2> Confirmation of blood vessel invasion- Teeth after 10 weeks in culture were transplanted into the skulls of mice.
  • the mice were perfused with fluorescently labeled liquid gelatin from the heart to prepare tissue sections, and then the presence or absence of blood vessels in the transplanted teeth was confirmed using a confocal laser microscope.
  • 18A and 18B are explanatory views showing fluorescence observation images of the transplanted teeth in the mouse skull.
  • 181 indicates a skull wall and 182 indicates a transplanted tooth.
  • FIG. 18A and FIG. 18B it was confirmed that the host-derived capillaries (arrow portions) entered the dental pulp of the transplanted tooth, and the transplanted tooth was engrafted.
  • FIG. 19 is an explanatory diagram (a stereomicrograph) of the human dental crown.
  • reference numeral 231 denotes a crown
  • 191 denotes a tooth papilla. As shown in FIG. 19, the formation of the crown was completed, but the root was not formed.
  • FIG. 20 is an explanatory diagram (photomicrograph) of pre-culture.
  • Example 2 After preculture, in the same manner as in Example 1, the human dental crown was wrapped with a human periodontal ligament-derived cell sheet and Teldermis (registered trademark) to obtain a culture core.
  • Teldermis registered trademark
  • FIG. 21 is an explanatory diagram (photomicrograph) of the culture of the culture core. Natural ETFs were prepared in the same manner as in Example 1.
  • FIG. 22 is an explanatory view (a stereomicrograph) showing a state immediately after the teeth are taken out from the culture core. In FIG. 22, it was confirmed that the soft tissue (* part) mainly covered the tooth root.
  • FIG. 23 is an explanatory view showing a stereomicroscopic image of the tooth after 24 weeks of culturing, and it was confirmed that a tooth root 232 was formed from the crown 231.
  • FIG. 24 is a view showing a stereoscopic microscope image of the teeth after 24 weeks in culture, taken from the oblique direction of the apex.
  • FIG. 25 is a view showing a stereoscopic microscope image of the teeth after 24 weeks in the culture taken from the apical direction.
  • the arrow part in FIG.24 and FIG.25 shows a root apex pulp. As shown in FIGS. 23 to 25, the formation of roots was confirmed.
  • FIG. 26 is an explanatory view showing a soft X-ray image of the tooth after 24 weeks of culture. As shown in FIG. 26, it was confirmed that a dental pulp cavity (* portion) was formed.
  • FIGS. 27A to 27B are explanatory diagrams showing micro CT images of the side surfaces of the teeth after 24 weeks of culture.
  • FIG. 27C is an explanatory view showing a micro CT image of a side cross section of the tooth after 24 weeks of culturing.
  • FIG. 28A to FIG. 28C are explanatory views showing micro CT images of root cross sections from the apical direction of the teeth after 24 weeks of culturing. As shown in FIGS. 27A to 28C, it was confirmed that the roots were elongated. In the figure, “arrow” indicates the apex pulp and “*” indicates the pulp cavity.
  • FIG. 29 is an explanatory view showing a stereoscopic microscope image of the soft tissue peeled from the tooth. “*” In the drawing indicates a portion corresponding to “*” in FIG.
  • FIG. 30 is an explanatory view showing a soft X-ray image of the soft tissue peeled from the teeth.
  • the encircled portion in the figure is a huge alveolar bone showing a portion corresponding to the encircled portion in FIG. 29, and the arrow indicates a small mass of the alveolar bone.
  • 31A and 31B are explanatory views showing micro CT images of the huge alveolar bone in the encircled portion of FIG. As a result of the above analysis, formation of connective tissue and alveolar bone was confirmed.
  • Example 3 Formation of roots and periodontal tissues using mouse crowns and bone marrow-derived cell sheets
  • a bone marrow-derived cell sheet was used, and a tooth root, periodontal tissue, or a complex thereof was formed in the same manner as in Example 1.
  • the culture medium When the culture medium was changed several days after the start of the culture, adhesive cells appeared in the petri dish and floating cells were removed. The adherent cells were continuously cultured, and after reaching confluence, the bone marrow-derived cells were subcultured into three petri dishes (first generation). After the first generation reached confluence, the bone marrow-derived cells were subcultured into two petri dishes from the petri dish after the first subculture (second generation). The bone marrow-derived cells in which the second generation reached confluence and became a sheet were used as the bone marrow-derived cell sheet.
  • FIG. 32 is an explanatory diagram (stereomicrograph) showing the state of the mouse dental crown after 4 weeks in culture. As shown in FIG. 32, it was confirmed that alveolar bone was formed in the root equivalent portion.
  • FIG. 33 is an explanatory view showing a soft X-ray image of the tooth after 4 weeks. As shown in FIG. 33, alveolar bone was formed together with the tooth root, and a periodontal cavity was confirmed between the tooth root and the alveolar bone.
  • Example 4 Formation of tooth roots and periodontal tissues using mouse crowns and cell sheets derived from dental follicles
  • a tooth root, periodontal tissue, or a complex thereof was formed in the same manner as in Example 1 except that a dental follicle-derived cell sheet was used.
  • dental follicle-derived cell sheet- Soft tissue (called a dental follicle, which is a fibrous connective tissue around the unfinished tooth) attached around the unfinished human extracted tooth is sampled and chopped with a razor knife.
  • the cut dental follicle tissue was warmed in 0.1% trypsin-0.02% EDTA / PBS ( ⁇ ) solution at 37 ° C. for 30 minutes and strongly pipetted. Was dissociated. Subsequently, the solution containing the dental follicle-derived cells was spun down at 300 ⁇ g for 5 minutes, and the supernatant was removed by aspiration.
  • DMEM / F12 manufactured by Invitrogen
  • FBS FBS
  • 1% non-essential amino acids solution (Invitrogen) +50 U / mL Penicillin (Invitrogen) +50 ⁇ g / mL Streptomycin (Invitrogen) +0.25 ⁇ g Funzone (Invitrogen)
  • the primary culture was performed in a culture petri dish. Alternatively, the tissue chopped with a razorme was first cultured on the culture dish using the basal medium.
  • the cells derived from dental follicles were subcultured into three petri dishes (first generation). After the first generation reached confluence, the dental follicle-derived cells were subcultured into two petri dishes from the petri dish after the first subculture (second generation). The tooth follicle-derived cells that reached the confluence of the second generation and became sheet-like were used as the tooth follicle-derived cell sheet.
  • FIG. 34 is an explanatory diagram (stereomicrograph) showing the state of the mouse dental crown after 4 weeks in culture. As shown in FIG. 34, it was confirmed that alveolar bone was formed in the root equivalent portion.
  • FIG. 35 is an explanatory view showing a soft X-ray image of the tooth after 4 weeks. As shown in FIG. 35, an alveolar bone was formed together with the root, and a periodontal cavity was confirmed between the root and the alveolar bone.
  • Example 5 Formation of tooth root and periodontal tissue using mouse crown and pulp-derived cell sheet
  • a tooth root, periodontium, or a complex thereof was formed in the same manner as in Example 1 except that a dental pulp-derived cell sheet was used.
  • the solution containing the dental pulp-derived cells was spun down at 300 ⁇ g for 5 minutes, and the supernatant was removed by suction, and then the basic medium (DMEM / F12 (manufactured by Invitrogen) + 15% FBS (manufactured by Moregate, Lot number 24300113) + 1% non-essential amino acids solution (Invitrogen) +50 U / mL Penicillin (Invitrogen) +50 ⁇ g / mL Streptomycin (Invitrogen) +0.25 ⁇ g Fungizone (Invitrogen)) was added and cultured. Primary culture was performed in a petri dish.
  • the tissue chopped with a razorme was first cultured on the culture dish using the basal medium. After the primary culture reached confluence by both methods, the dental pulp-derived cells were subcultured into the three petri dishes (first generation). After the first generation reached confluence, the pulp derived from the petri dish after the first subculture was further subdivided into three petri dishes, and the pulp derived cells were subcultured (second generation). The pulp-derived cells that reached the confluence of the second generation and became a sheet were used as the pulp-derived cell sheet.
  • FIG. 36 is an explanatory diagram (stereomicrograph) showing the state of the mouse dental crown after 4 weeks in culture. As shown in FIG. 36, it was confirmed that alveolar bone was formed in the root equivalent portion.
  • FIG. 37 is an explanatory view showing a soft X-ray image of the tooth after 4 weeks. As shown in FIG. 37, an alveolar bone was formed together with the root, and a periodontal cavity was confirmed between the root and the alveolar bone.
  • Example 6 Formation of tooth root and periodontal tissue using mouse crown and tooth papilla-derived cell sheet
  • a tooth root, periodontal tissue, or a complex thereof was formed in the same manner as in Example 1 except that a tooth papilla-derived cell sheet was used.
  • tooth papilla The pulp tissue at the tip of the root of an unextracted human extracted tooth (referred to as the tooth papilla) is collected and minced with a razor, and the minced tooth papilla tissue is 0.1% trypsin- In a 0.02% EDTA / PBS ( ⁇ ) solution, the mixture was heated at 37 ° C. for 30 minutes and strongly pipetted to dissociate the tooth papilla-derived cells. Next, the solution containing the tooth papilla-derived cells was spun down at 300 ⁇ g for 5 minutes, and the supernatant was removed by suction.
  • the basic medium (DMEM / F12 (manufactured by Invitrogen) + 15% FBS (manufactured by Moregate) was added to the sediment. , Lot number 24300113) + 1% non-essential amino acids solution (manufactured by Invitrogen) +50 U / mL Penicillin (manufactured by Invitrogen) +50 ⁇ g / mL Streptomycin (manufactured by Invitrogen) +0.25 ⁇ g Fungizone (manufactured by Invitrogen)) Primary culture was performed in a culture dish. Alternatively, the tissue chopped with a razorme was first cultured on the culture dish using the basal medium.
  • the tooth papilla-derived cells were subcultured into three petri dishes (first generation). After the first generation reached confluence, the tooth papilla-derived cells were subcultured into two petri dishes from the petri dish after the first subculture (second generation). The tooth papilla-derived cells in which the second generation reached confluence and became a sheet were used as the tooth papilla-derived cell sheet.
  • FIG. 38 is an explanatory diagram (stereomicrograph) showing the state of the mouse dental crown after 4 weeks in culture. As shown in FIG. 38, it was confirmed that alveolar bone was formed in the root equivalent portion.
  • FIG. 39 is an explanatory view showing a soft X-ray image of the tooth after 4 weeks. As shown in FIG. 39, alveolar bone was formed together with the tooth root, and a periodontal cavity was confirmed between the root and the alveolar bone.
  • Example 7 (Formation of tooth roots and periodontal tissues using mouse crowns and periodontal ligament-derived porous substrates) ⁇ Formation of culture core> -Preparation of crown- A mouse dental crown was prepared in the same manner as in Example 1.
  • Periodontal ligament tissue was collected from a human adult extracted tooth with a single blade razor. The collected periodontal ligament tissue pieces were further minced with a razorme, and the minced periodontal ligament tissue was conditioned at 37 ° C. in 0.1% trypsin-0.02% EDTA / PBS ( ⁇ ) solution. The mixture was warmed for 30 minutes and strongly pipetted to dissociate periodontal ligament-derived cells.
  • the solution containing the periodontal ligament-derived cells was spun down at 300 ⁇ g for 5 minutes, and the supernatant was removed by suction, and then the basic medium (DMEM / F12 (manufactured by Invitrogen) + 15% FBS (manufactured by Moregate) was added to the sediment.
  • DMEM / F12 manufactured by Invitrogen
  • FBS manufactured by Moregate
  • periodontal ligament cell-containing porous substrate- Teldermis (registered trademark) (manufactured by Olympus Terumo Biomaterials) was used as the porous substrate. After seeding the periodontal ligament cells (2 ⁇ 10 7 cells / mL) on the porous base material (4 cm ⁇ 4 cm large sheet-like base material) impregnated in the basic medium, at 37 ° C., By culturing for 72 hours, a periodontal ligament-derived cell-containing porous substrate was prepared.
  • the mouse dental crown is wrapped with a porous substrate containing the periodontal ligament-derived cells, and the mouse dental crown is embedded in a porous substrate containing human periodontal ligament-derived cells to obtain a culture core. It was.
  • the culture core was cultured in a culture solution in which 0.1 mL / mL of natural ETFs was added to a DMEM / F12 culture solution containing 15% FBS. The culture medium was changed every few days. Natural ETFs were prepared in the same manner as in Example 1.
  • FIG. 40 is an explanatory view (a stereomicrograph) showing a state of a mouse dental crown after 4 weeks of culture. As shown in FIG. 40, it was confirmed that alveolar bone was formed in the root equivalent portion.
  • FIG. 41 is an explanatory view showing a soft X-ray image of the tooth after 4 weeks. As shown in FIG. 41, an alveolar bone was formed together with the root, and a periodontal cavity was confirmed between the root and the alveolar bone.
  • Example 8 (Formation of tooth root and periodontal tissue using mouse dental crown, periodontal ligament-derived cell sheet, and periodontal ligament-derived cell-containing porous substrate) ⁇ Formation of culture core> -Preparation of crown- A mouse dental crown was prepared in the same manner as in Example 1.
  • Example 2 Pre-culture- Pre-culture was carried out in the same manner as in Example 1, and the mouse dental crown was fixed on a human periodontal ligament-derived cell sheet.
  • Example 1 In Example 1, except that the teldermis that does not contain cells was replaced with the periodontal ligament-derived cell-containing porous substrate, the mouse dental crown was replaced with the human periodontal ligament-derived cell sheet, and the tooth root in the same manner as in Example 1.
  • the membrane-derived cell-containing porous substrate was embedded to obtain a culture core.
  • the culture core was cultured in a culture solution in which 0.1 mL / mL of natural ETFs was added to a DMEM / F12 culture solution containing 15% FBS. The culture medium was changed every few days. Natural ETFs were prepared in the same manner as in Example 1.
  • FIG. 42 is an explanatory diagram (stereomicrograph) showing the state of the mouse dental crown after 4 weeks in culture. As shown in FIG. 42, it was confirmed that alveolar bone was formed in the root equivalent portion.
  • FIG. 43 is an explanatory diagram showing a soft X-ray image of the tooth after 4 weeks. As shown in FIG. 43, an alveolar bone was formed together with the root, and a periodontal cavity was confirmed between the root and the alveolar bone.
  • Example 9 Formation of tooth root and periodontal tissue using mouse crown and periodontal ligament cell sheet
  • tooth roots and periodontal tissues were formed in the same manner as Example 1 except that natural ETFs were changed to the following rhOEFs.
  • IL-1 ⁇ (trade name: IL-1 ⁇ , manufactured by Acris Antibodies) ... 150 pg / mL IL-6 (trade name: IL-6, manufactured by PeproTech) ... 100 pg / mL IL-8 (trade name: IL-8, manufactured by PeproTech) ... 1.0 ng / mL IL-9 (trade name: IL-9, manufactured by R & D systems) ... 450 pg / mL EGF (trade name: EGF, manufactured by Acris Antibodies) ...
  • IGF-I (trade name: IGF-1, manufactured by Biomedical Technology) ... 20 ng / mL GH (trade name: hGH, manufactured by Novo Nordisk) ... 2.5 ng / mL PDGF-AB (trade name: PDGF-AB, manufactured by PeproTech) ... 0.6 ng / mL VEGF (trade name: VEGF, manufactured by Bachem Feinche-Mikalian AG) ... 3.2 ng / mL LIF (trade name: LIF, manufactured by Chemicon International) ... 35 pg / mL HGF (trade name: HGF, manufactured by R & D systems) ...
  • Insulin (trade name: Insulin, manufactured by Chemicon International): 7.5 ng / mL Thyroxine (trade name: Thyroxine, manufactured by SIGMA) ... 5.5 ng / mL Silo calcitonin (trade name: calcitonin (human), manufactured by Biogenesis) ... 10 ng / mL Ascorbic acid (trade name: ascorbic acid, manufactured by SIGMA) ... 50 ⁇ g / mL ⁇ -glycerophosphoric acid (trade name: ⁇ -glycerophosphoric acid, manufactured by SIGMA) ... 10 mM
  • FIG. 44 is an explanatory diagram (stereomicrograph) showing the state of the mouse dental crown after 4 weeks of culture. As shown in FIG. 44, it was confirmed that alveolar bone was formed at the root equivalent portion.
  • FIG. 45 is an explanatory view showing a soft X-ray image of the teeth after 4 weeks. As shown in FIG. 45, an alveolar bone was formed together with the root, and a periodontal cavity was confirmed between the root and the alveolar bone.
  • Example 10 Formation of tooth root and periodontal tissue using mouse crown and periodontal ligament cell sheet
  • tooth roots and periodontal tissues were formed in the same manner as in Example 7, except that natural ETFs was changed to rhOEFs in Example 9.
  • FIG. 46 is an explanatory diagram (stereomicrograph) showing the state of the mouse dental crown after 4 weeks in culture. As shown in FIG. 46, it was confirmed that alveolar bone was formed in the root equivalent portion.
  • FIG. 47 is an explanatory view showing a soft X-ray image of the teeth after 4 weeks. As shown in FIG. 47, an alveolar bone was formed together with the root, and a periodontal cavity was confirmed between the root and the alveolar bone.
  • Example 11 Formation of tooth root and periodontal tissue using mouse crown and periodontal ligament cell sheet
  • tooth roots and periodontal tissues were formed in the same manner as in Example 8, except that the natural ETFs was rhOEFs of Example 9.
  • FIG. 48 is an explanatory diagram (a stereomicrograph) showing a state of a mouse dental crown after 4 weeks in culture. As shown in FIG. 48, it was confirmed that alveolar bone was formed in the root equivalent portion.
  • FIG. 49 is an explanatory view showing a soft X-ray image of the tooth after 4 weeks. As shown in FIG. 49, an alveolar bone was formed together with the root, and a periodontal cavity was confirmed between the root and the alveolar bone.
  • regenerated teeth with roots can be obtained from mouse crowns and human crowns in vitro (in vitro culture) without using xenotransplantation techniques (in vivo culture). It was confirmed that a root having a periodontal tissue can be formed and a regenerated tooth having a root and a periodontal tissue can be obtained.
  • the technique of the present invention can be applied not only to teeth but also to other tissues / organs formed in vitro.
  • the method of the present invention can form a tooth root having periodontal tissue in vitro (in vitro culture) without using a xenotransplantation technique (in vivo culture).
  • Regenerative teeth can be formed without the risk of infection.
  • the regenerated tooth of the present invention can be obtained by the method of the present invention, it can be suitably used even in a case where transplantation to a lost part of a tooth and furthermore, alveolar bone is lost.
  • the present invention is not limited to teeth and can be suitably used for regeneration of other tissues / organs.

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Abstract

　異種・同種移植技術（生体内培養）を使用することなく、インビトロ（生体外培養）において、少なくとも歯冠を有する歯に、少なくとも歯根を形成することができる方法、及び該方法により形成された再生歯の提供。 　少なくとも歯冠を有する歯に、少なくとも歯根を形成する方法であって、前記歯を、歯根膜由来細胞、骨髄由来細胞、歯小嚢由来細胞、歯髄由来細胞、及び歯乳頭由来細胞の少なくともいずれかの細胞を含む細胞含有基材で包んだ培養用コアを形成する培養用コア形成工程と、前記培養用コアを、培養液中で培養し、前記培養用コア中の歯に少なくとも歯根を形成する工程とを含み、前記培養液が、所定の成分を有する。

Description

歯根・歯周組織ユニット形成方法、及び再生歯
　本発明は、哺乳動物の器官を形成する器官形成方法等に関し、特に、哺乳動物の歯根や、歯周組織、又はその複合体（ユニット）を形成する方法等に関する。
　近年、組織欠損、機能障害又は機能不全に陥った器官の形態と機能を回復させることを目的とした、再生医療技術が注目されている。この技術分野では、機能障害等を有する器官と代替可能な、再生器官の提供が望まれている。この種の再生器官には、正常な形態と機能を備えることと共に、インビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）（生体内培養）を介さない技術によって形成されることが求められる。何故ならば、異種・同種移植を介して形成された器官には、免疫拒絶やウイルス等の感染の危険性があるからである。
　そのため、そのような感染等の問題のない、インビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）（生体外培養）において、器官再生することが求められている。
　例えば、歯の再生が望まれている歯科領域においては、現代の歯科臨床技術で補綴物により再建可能な歯冠よりも、歯を顎骨に固定し、歯冠を支える機能等を備えた歯根の提供、ならびに、この歯根を支える歯周組織（歯根膜・歯槽骨・セメント質・歯肉）の提供が望まれている。特に、歯根膜や歯槽骨を備えた歯根の提供が望まれている。歯根膜は、歯根のセメント質と歯槽骨との間に介在している軟組織（結合組織）であり、この歯根膜により咀嚼時の衝撃の緩和や知覚応答が為されている。
　非特許文献１は、生後６ヶ月齢のブタの未萌出の第３大臼歯から得られた、歯胚由来の多種類の細胞を含む細胞懸濁液を、歯の形に整形した生分解吸収ポリマーに播種して、人工歯胚を作製する。この人工歯胚を、血流が豊富で、栄養及び酸素の供給が十分得られるラットの大網（腹腔内にある脂肪の膜）に異種移植することによって、生体内培養に基づく技術を開示する。移植から２５～３０週間後に、エナメル質、象牙質、歯髄等の小さな歯牙様組織が移植体中で確認されている。
　非特許文献２は、上皮－間葉相互作用に着目して、歯の発生のプロセスを再現する手法を開示する。この非特許文献２では、胎齢１０日目のマウス胎仔から採取した歯胚上皮と、歯胚由来ではない３種類の幹細胞を、歯胚間葉の代わりとして組み合わせて人工歯胚を作製している。その作製に続いて、人工歯胚を成体マウスの腎臓の被膜下に同種移植し、生体内培養により１２日間成長させて、歯を形成している。
　上記非特許文献１及び２に示されるように、これまでは、異種・同種移植（生体内培養）を必要とする歯の再生技術のみが知られていた。それは、非特許文献３に示されるように、生体外培養では、十分な歯は形成されず、歯槽骨などの骨の形成が認められないため、歯周組織を得ることができなかった。そのため、歯を形成するためには、異種・同種移植（生体内培養）に頼らざるを得ないのが現状であった。そして、ヒト歯の再生を試みた報告はまったく存在せず、臨床的には歯科用インプラント（人工歯根）によって、金属（チタン）で歯根の機能を代替するのみであった。
Ｙｏｕｎｇ　ＣＳ，Ｔｅｒａｄａ　Ｓ，　Ｖａｃａｎｔｉ　ＪＰ，　Ｈｏｎｄａ　Ｍ，　Ｂａｒｔｌｅｔｔ　ＪＤ，　Ｙｅｌｉｃｋ　ＰＣ，　Ｔｉｓｓｕｅ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｏｆ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｔｏｏｔｈ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ　ｏｎ　ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ　ｐｏｌｙｍｅｒ　ｓｃａｆｆｏｌｄｓ；Ｊ　Ｄｅｎｔ　Ｒｅｓ，８１，６９５－７００，２００２ Ｍｏｄｉｎｏ　ＳＡ，Ｓｈａｒｐｅ　ＰＴ；　Ｔｉｓｓｕｅ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｒｉｎｇ　ｏｆ　ｔｅｅｔｈ　ｕｓｉｎｇ　ａｄｕｌｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ；　Ａｒｃｈ　Ｏｒａｌ　Ｂｉｏｌ，５０，２５５－２５８，２００５ 日本歯科医師会雑誌、Ｖｏｌ．　６０、Ｎｏ．　７、２００７－１０、６５７－６７４
　本発明は、前記従来の諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、異種・同種移植技術（生体内培養）を使用することなく、インビトロ（生体外培養）において、少なくとも歯冠を有する歯に、少なくとも歯根を形成することができる方法、及び該方法により形成された再生歯を提供することを目的とする。
　前記課題を解決するため、本発明者らは、鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、本発明者らは、少なくとも歯冠を有する歯を、歯根膜由来細胞、骨髄由来細胞、歯小嚢由来細胞、歯髄由来細胞、及び歯乳頭由来細胞の少なくともいずれかの細胞を含む細胞含有基材などで包み、かつ、その細胞含有基材などで包まれてなる培養用コアを、ヒト子宮頸部扁平上皮癌細胞株の無血清増殖株の順化培養液（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ　ｍｅｄｉｕｍ）に含まれる成分、並びに、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＥＧＦ、ＩＧＦ－Ｉ、ＧＨ、ＰＤＧＦ－ＡＢ、ＶＥＧＦ、ＬＩＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ－２、ＦＧＦ－１、ＢＭＰ－２、ＢＭＰ－４、Ｍ－ＣＳＦ、デキサメタゾン、インスリン、サイロキシン、サイロカルシトニン、アスコルビン酸、及びβ－グリセロリン酸の少なくともいずれかを有する培養液添加物の少なくともいずれかを有する培養液中で培養することにより、歯冠に歯根や歯周組織（歯根膜・歯槽骨・セメント質・歯肉）、又はその複合体を形成できることを知見し、本発明の完成に至った。
　本発明の「歯根・歯周組織ユニット」とは、本発明の方法により歯根と歯周組織の形成が同時に為され、ひとつの複合体（ユニット）として形成できるために、その特徴を明確に示す呼称として、歯根・歯周組織ユニットと命名した。
　本発明は、本発明者らの前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
　＜１＞　少なくとも歯冠を有する歯に、少なくとも歯根を形成する方法であって、
　前記歯を、歯根膜由来細胞、骨髄由来細胞、歯小嚢由来細胞、歯髄由来細胞、及び歯乳頭由来細胞の少なくともいずれかの細胞を含む細胞含有基材で包んだ培養用コアを形成する培養用コア形成工程と、
　前記培養用コアを、培養液中で培養し、前記培養用コア中の歯に少なくとも歯根を形成する工程とを含み、
　前記培養液が、ヒト子宮頸部扁平上皮癌細胞株の無血清増殖株の順化培養液に含まれる成分、並びに、
ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＥＧＦ、ＩＧＦ－Ｉ、ＧＨ、ＰＤＧＦ－ＡＢ、ＶＥＧＦ、ＬＩＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ－２、ＦＧＦ－１、ＢＭＰ－２、ＢＭＰ－４、Ｍ－ＣＳＦ、デキサメタゾン、インスリン、サイロキシン、サイロカルシトニン、アスコルビン酸、及びβ－グリセロリン酸の少なくともいずれかを有する培養液添加物
の少なくともいずれかを有することを特徴とする方法である。
　＜２＞　培養用コアを、培養液中で培養し、前記培養用コア中の歯に少なくとも歯根を形成する工程において、更に、歯周組織を形成する前記＜１＞に記載の方法である。
　＜３＞　細胞含有基材が、細胞シート、及び細胞含有多孔性基材の少なくともいずれかである前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の方法である。
　＜４＞　培養用コアが、更に、細胞を含有しない多孔性基材で包まれた前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の方法である。
　＜５＞　培養用コア形成工程において、歯が、細胞シート上で前培養される前記＜３＞から＜４＞のいずれかに記載の方法である。
　＜６＞　前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の方法によって形成されたことを特徴とする少なくとも歯根を有する再生歯である。
　＜７＞　再生歯が、更に、歯周組織を有する前記＜６＞に記載の再生歯である。
　本発明によれば、前記従来の諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、異種・同種移植技術（生体内培養）を使用することなく、インビトロ（生体外培養）において、少なくとも歯冠を有する歯に、少なくとも歯根を形成することができる方法、及び該方法により形成された再生歯を提供することができる。
図１は、実施例１で用いたマウス歯冠の説明図（実体顕微鏡写真）である。 図２は、実施例１の歯根膜由来細胞の継代培養の説明図である。 図３は、実施例１の前培養（プレカルチャー）の説明図である。 図４は、実施例１の培養用コアの断面の説明図である。 図５は、実施例１の培養１週間後のマウス歯冠の状態を示す説明図（実体顕微鏡写真）である。 図６は、実施例１の培養２週間後のマウス歯冠の状態を示す説明図（実体顕微鏡写真）である。 図７は、実施例１の培養４週間後のマウス歯冠の状態を示す説明図（実体顕微鏡写真）である。 図８は、実施例１の培養４週間後の歯の軟エックス線写真である。 図９は、実施例１の培養４週間後の歯の薄片をＨＥ染色した結果を示す説明図である。 図１０は、図９における囲みａ部分を拡大して示した説明図である。 図１１は、図９における囲みｂ部分を拡大して示した説明図である。 図１２は、図９における囲みｃ部分を拡大して示した説明図である。 図１３は、実施例１の培養４週間後の歯の歯根膜周辺の組織を拡大して示した説明図（ＨＥ染色像）である。 図１４は、実施例１のＰｅｒｉｏｓｔｉｎを用いた、Ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法の結果を示す説明図である。 図１５は、実施例１のＢＳＰを用いた、Ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法の結果を示す説明図である。 図１６は、実施例１の移植４週間後の移植歯の歯科用エックス線像を示す説明図である。 図１７は、実施例１の移植４週間後の移植歯のマイクロＣＴ像を示す説明図である。 図１８Ａは、実施例１のマウス頭蓋骨中の移植歯の蛍光観察像を示す説明図である。 図１８Ｂは、実施例１のマウス頭蓋骨中の移植歯の蛍光観察像を示す説明図である。 図１９は、実施例２で用いたヒト歯冠の説明図（実体顕微鏡写真）である。 図２０は、実施例２の前培養の説明図（実体顕微鏡写真）である。 図２１は、実施例２の培養用コアの培養の説明図（実体顕微鏡写真）である。 図２２は、実施例２の培養２４週間後に培養用コアから取り出した直後の歯の状態を示す説明図（実体顕微鏡写真）である。 図２３は、実施例２の培養２４週間後の歯の実体顕微鏡像を示す説明図である。 図２４は、実施例２の培養２４週間後の歯を根尖斜め方向から撮影した実体顕微鏡像を示す図である。 図２５は、実施例２の培養２４週間後の歯を根尖方向から撮影した実体顕微鏡像を示す図である。 図２６は、実施例２の培養２４週間後の歯の軟エックス線像を示す説明図である。 図２７Ａは、実施例２の培養２４週間後の歯の側面のマイクロＣＴ像を示す説明図である。 図２７Ｂは、実施例２の培養２４週間後の歯の側面のマイクロＣＴ像を示す説明図である。 図２７Ｃは、実施例２の培養２４週間後の歯の側面断面のマイクロＣＴ像を示す説明図である。 図２８Ａは、実施例２の培養２４週間後の歯の根尖方向からの歯根断面のマイクロＣＴ像を示す説明図である。 図２８Ｂは、実施例２の培養２４週間後の歯の根尖方向からの歯根断面のマイクロＣＴ像を示す説明図である。 図２８Ｃは、実施例２の培養２４週間後の歯の根尖方向からの歯根断面のマイクロＣＴ像を示す説明図である。 図２９は、実施例２の歯から剥がした軟組織の実体顕微鏡像を示す説明図である。 図３０は、実施例２の歯から剥がした軟組織の軟エックス線像を示す説明図である。 図３１Ａは、図３０の囲み部のマイクロＣＴ像を示す説明図である。 図３１Ｂは、図３０の囲み部のマイクロＣＴ像を示す説明図である。 図３２は、実施例３の培養４週間後のマウス歯冠の状態を示す説明図（実体顕微鏡写真）である。 図３３は、実施例３の培養４週間後の歯の軟エックス線像を示す説明図である。 図３４は、実施例４の培養４週間後のマウス歯冠の状態を示す説明図（実体顕微鏡写真）である。 図３５は、実施例４の培養４週間後の歯の軟エックス線像を示す説明図である。 図３６は、実施例５の培養４週間後のマウス歯冠の状態を示す説明図（実体顕微鏡写真）である。 図３７は、実施例５の培養４週間後の歯の軟エックス線像を示す説明図である。 図３８は、実施例６の培養４週間後のマウス歯冠の状態を示す説明図（実体顕微鏡写真）である。 図３９は、実施例６の培養４週間後の歯の軟エックス線像を示す説明図である。 図４０は、実施例７の培養４週間後のマウス歯冠の状態を示す説明図（実体顕微鏡写真）である。 図４１は、実施例７の培養４週間後の歯の軟エックス線像を示す説明図である。 図４２は、実施例８の培養４週間後のマウス歯冠の状態を示す説明図（実体顕微鏡写真）である。 図４３は、実施例８の培養４週間後の歯の軟エックス線像を示す説明図である。 図４４は、実施例９の培養４週間後のマウス歯冠の状態を示す説明図（実体顕微鏡写真）である。 図４５は、実施例９の培養４週間後の歯の軟エックス線像を示す説明図である。 図４６は、実施例１０の培養４週間後のマウス歯冠の状態を示す説明図（実体顕微鏡写真）である。 図４７は、実施例１０の培養４週間後の歯の軟エックス線像を示す説明図である。 図４８は、実施例１１の培養４週間後のマウス歯冠の状態を示す説明図（実体顕微鏡写真）である。 図４９は、実施例１１の培養４週間後の歯の軟エックス線像を示す説明図である。
〔少なくとも歯冠を有する歯に、少なくとも歯根を形成する方法〕
　本発明の、少なくとも歯冠を有する歯に少なくとも歯根を形成する方法は、培養用コア形成工程と、前記培養用コア中の歯に少なくとも歯根を形成する工程とを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。前記培養用コアを、培養液中で培養し、前記培養用コア中の歯に少なくとも歯根を形成する工程において、更に、歯周組織を形成することが好ましい。
　前記方法は、ヒトやマウスなどの哺乳類の少なくとも歯冠を有する歯に、少なくとも歯根を形成する方法に関し、特に、ヒトの少なくとも歯冠を有する歯に、少なくとも歯根を形成する方法として有用である。
（培養用コア形成工程）
　前記培養用コア形成工程は、少なくとも歯冠を有する歯を、歯根膜由来細胞、骨髄由来細胞、歯小嚢由来細胞、歯髄由来細胞、及び歯乳頭由来細胞の少なくともいずれかの細胞を含む細胞含有基材で包んで培養用コアを形成する工程である。
＜培養用コア＞
　前記培養用コアは、少なくとも歯冠を有する歯と、細胞含有基材とを少なくとも有し、必要に応じて、さらに細胞を含有しない多孔性基材などを有する。
－少なくとも歯冠を有する歯－
　前記少なくとも歯冠を有する歯としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、歯冠のみの歯（歯根が未形成の歯）、根未完成歯（歯根が形成途上の歯）などが挙げられる。
　前記少なくとも歯冠を有する歯としては、例えば、ヒト、マウスなどの哺乳動物から摘出された歯冠などが用いられる。例えば、ヒトの場合、歯根未完成の第３大臼歯（智歯）等の天然歯の歯冠を用いることができる。
　また、前記少なくとも歯冠を有する歯としては、前記天然歯以外に、人工的に製造されたエナメル質、象牙質、各種生体材料等からなる人工歯冠を用いてもよい。
－細胞含有基材－
　前記細胞含有基材は、歯根膜由来細胞、骨髄由来細胞、歯小嚢由来細胞、歯髄由来細胞、及び歯乳頭由来細胞の少なくともいずれかの細胞を含む。
　前記細胞含有基材としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、細胞シート、細胞含有多孔性基材などが挙げられる。前記細胞含有基材は、１種単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。中でも、前記少なくとも歯冠を有する歯を、細胞シートで包み、更に、細胞含有多孔性基材で包む態様が好ましい。
　前記少なくとも歯冠を有する歯を、細胞シートで包み、更に、細胞含有多孔性基材で包む態様では、歯根の形成期間が短く、歯槽骨の形成が良好である点で有利である。
－－歯根膜由来細胞－－
　前記歯根膜由来細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、歯根膜線維芽細胞、歯根膜上皮細胞（マラッセの上皮残遺由来細胞）、歯周組織幹細胞などが挙げられる。
　前記歯根膜由来細胞の由来としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、ヒト、マウスなどの哺乳動物由来のものを用いることができる。なお、前記歯根膜由来細胞は、前記少なくとも歯冠を有する歯と同種由来のものであってもよく、異種由来のものであってもよい。
　前記歯根膜由来細胞の採取方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、ヒト成人の抜去歯や、混合歯列期（交換期）の乳歯から歯根膜由来細胞を採取することができる。
－－骨髄由来細胞－－
　前記骨髄由来細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、骨髄間質細胞、間葉系幹細胞などが挙げられる。
　前記骨髄由来細胞の由来としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、ヒト、マウスなどの哺乳動物由来のものを用いることができる。なお、前記骨髄由来細胞は、前記少なくとも歯冠を有する歯と同種由来のものであってもよく、異種由来のものであってもよい。
　前記骨髄由来細胞の採取方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、骨髄穿刺によって骨髄由来細胞を採取することができる。
－－歯小嚢由来細胞－－
　前記歯小嚢由来細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、歯小嚢線維芽細胞、歯小嚢幹細胞などが挙げられる。
　前記歯小嚢由来細胞の由来としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、ヒト、マウスなどの哺乳動物由来のものを用いることができる。なお、前記歯小嚢由来細胞は、前記少なくとも歯冠を有する歯と同種由来のものであってもよく、異種由来のものであってもよい。
　前記歯小嚢由来細胞の採取方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、ヒトの未完成の抜去歯の周囲組織から歯小嚢由来細胞を採取することができる。
－－歯髄由来細胞－－
　前記歯髄由来細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、歯髄線維芽細胞、歯髄幹細胞などが挙げられる。
　前記歯髄由来細胞の由来としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、ヒト、マウスなどの哺乳動物由来のものを用いることができる。なお、前記歯髄由来細胞は、前記少なくとも歯冠を有する歯と同種由来のものであってもよく、異種由来のものであってもよい。
　前記歯髄由来細胞の採取方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、ヒトの抜去歯や、混合歯列期（交換期）の乳歯から歯髄由来細胞を採取することができる。
－－歯乳頭由来細胞－－
　前記歯乳頭由来細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、歯乳頭線維芽細胞、歯乳頭幹細胞などが挙げられる。
　前記歯乳頭由来細胞の由来としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、ヒト、マウスなどの哺乳動物由来のものを用いることができる。なお、前記歯乳頭由来細胞は、前記少なくとも歯冠を有する歯と同種由来のものであってもよく、異種由来のものであってもよい。
　前記歯乳頭由来細胞の採取方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、ヒトの歯根未完成の抜去歯から歯乳頭由来細胞を採取することができる。
－－細胞シート－－
　前記細胞シートは、歯根膜由来細胞、骨髄由来細胞、歯小嚢由来細胞、歯髄由来細胞、及び歯乳頭由来細胞の少なくともいずれかの細胞を所定の培養液で培養し、コンフルエントに達した後で、少なくとも１週間が経過したものである。前記コンフルエントに達した後で、少なくとも１週間が経過した歯根膜由来細胞、骨髄由来細胞、歯小嚢由来細胞、歯髄由来細胞、及び歯乳頭由来細胞は、培養器から剥離した後にもシート状の様相を呈するため、本明細書の中では、便宜上「細胞シート」と表記する。
　前記細胞シートに用いる細胞の継代数としては、正常２倍体の細胞であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、継代３代目までが好ましく、継代２代目がより好ましい。前記継代が４代目以上であると、異数体の細胞（異常な染色体を有する細胞）が生ずることがある。一方、前記継代が２代目であると、ほぼ全ての細胞が正常２倍体であるため、安全性の点で有利である。
　前記細胞シートとしては、歯根膜由来細胞、骨髄由来細胞、歯小嚢由来細胞、歯髄由来細胞、及び歯乳頭由来細胞の少なくともいずれかの細胞を培養し、コンフルエントに達した後、１週間以上が経過したものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、コンフルエントに達した後、１週間～４週間が好ましい。
　前記所定の培養液としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＨＡＭ　Ｆ１２、α－ＭＥＭなどを用いることができる。
　前記培養液に含まれる成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ）、非必須アミノ酸溶液、ペニシリン、ストレプトマイシン、ファンギゾンなどが挙げられる。
　前記培養の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
－－細胞含有多孔性基材－－
　前記細胞含有多孔性基材は、歯根膜由来細胞、骨髄由来細胞、歯小嚢由来細胞、歯髄由来細胞、及び歯乳頭由来細胞の少なくともいずれかの細胞を含む。
　前記多孔性基材としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、テルダーミス、テルプラグ（登録商標、オリンパス　テルモ　バイオマテリアル社製）、コラーゲンスポンジ（コーケン社製）、コラーゲンスポンジ（新田ゼラチン社製）、セルマトリックス（登録商標、組織培養用コラーゲンゲル、新田ゼラチン社製）、ＢＤマトリゲル（登録商標、Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）シート（Ａｌｂａｎｙ　ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）、ポリＤＬ－ラクチド－コ－グリコシド（ＰＬＧＡ、シグマ社製）などが挙げられる。
　前記多孔性基材は、局所に多数の細胞を３次元的に配置できて、個々の細胞の機能や細胞同士の相互作用を効果的に引き出すことができ、歯根や、セメント質、歯根膜、歯槽骨、歯肉といった多様な組織から成る歯周組織を３次元的に形成することができる点で好ましい。
　前記多孔性基材に歯根膜由来細胞、骨髄由来細胞、歯小嚢由来細胞、歯髄由来細胞、及び歯乳頭由来細胞の少なくともいずれかの細胞を含ませる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、多孔性基材に前記細胞の懸濁液を播種して培養する方法、培養した前記細胞上に多孔性基材を置いて、培養した前記細胞の移動を図る方法などが挙げられる。
　前記多孔性基材に前記細胞の懸濁液を播種して培養する方法における細胞の懸濁液の濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌなどが挙げられる。
　また、前記多孔性基材に前記細胞の懸濁液を播種して培養する方法における培養期間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、７２時間以上が好ましく、７２時間～１週間ほどがより好ましい。
－細胞を含有しない多孔性基材－
　前記細胞を含有しない多孔性基材に用いる多孔性基材としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、細胞含有多孔性基材で記載した多孔性基材と同様のものを用いることができる。
－包み方－
　前記少なくとも歯冠を有する歯を前記細胞含有基材で包む方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、前記細胞含有基材として、前記細胞シートを用いる場合、細胞シートを滅菌メス刃で切り出して、前記少なくとも歯冠を有する歯を包む方法が挙げられる。
　また、前記細胞シートで包まれた前記少なくとも歯冠を有する歯を前記細胞含有多孔性基材、もしくは、前記細胞を含有しない多孔性基材で包む方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
＜前培養工程＞
　前記培養用コア形成工程は、前培養（プレカルチャー）工程を含んでもよい。
　前記前培養工程は、前記少なくとも歯冠を有する歯が、前記細胞シート上で培養される工程である。
　前記前培養の期間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、０．５日～７日が好ましく、１日～２日がより好ましい。
　前記前培養を行うことで、前記少なくとも歯冠を有する歯が細胞シート上に固定されて動かなくなるため、前記少なくとも歯冠を有する歯を細胞シートで包む操作が容易となり、また、前記細胞シートが産生する液性因子によって、前記少なくとも歯冠を有する歯に存在しうる各種細胞（歯乳頭細胞（歯髄細胞）、エナメル上皮細胞、ヘルトヴィッヒ上皮鞘細胞、歯小嚢細胞）に、歯根や歯周組織形成細胞への分化誘導を図ることができる点で有利である。
　なお、前記前培養工程に代えて、前記少なくとも歯冠を有する歯を前記歯根膜由来細胞、骨髄由来細胞、歯小嚢由来細胞、歯髄由来細胞、及び歯乳頭由来細胞の少なくともいずれかの細胞の順化培養液（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ　ｍｅｄｉｕｍ）に数時間浸漬することもできる。
（培養用コア中の歯に少なくとも歯根を形成する工程）
　前記培養用コア中の歯に少なくとも歯根を形成する工程は、培養用コアを、培養液中で培養し、前記培養用コア中の歯に少なくとも歯根を形成する工程である。前記工程において、更に、歯周組織を形成することが好ましい。
＜培養液＞
　前記培養用コアの培養液は、ヒト子宮頸部扁平上皮癌細胞株の無血清増殖株の順化培養液（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ　ｍｅｄｉｕｍ）の成分（以下、「天然ＥＴＦｓ」（Ｅｍｂｒｙｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｆａｃｔｏｒｓ）と称することがある。）、並びに、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＥＧＦ、ＩＧＦ－Ｉ、ＧＨ、ＰＤＧＦ－ＡＢ、ＶＥＧＦ、ＬＩＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ－２、ＦＧＦ－１、ＢＭＰ－２、ＢＭＰ－４、Ｍ－ＣＳＦ、デキサメタゾン、インスリン、サイロキシン、サイロカルシトニン、アスコルビン酸、及びβ－グリセロリン酸の少なくともいずれかを有する培養液添加物（「合成ＥＴＦｓ」に相当し、以下、合成ヒト器官再生因子（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｈｕｍａｎ　Ｏｒｇａｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒｓ：ｒｈＯＥＦｓ）と称することがある。）の少なくともいずれかを有し、必要に応じてさらにその他の成分を有してなる。
　前記培養用コアの培養液としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｈａｍ　Ｆ１２、α－ＭＥＭなどが挙げられる。
　前記培養液は、前記天然ＥＴＦｓ、及び前記ｒｈＯＥＦｓの少なくともいずれかを有していればよいが、未知の感染物質が存在しない点で、前記ｒｈＯＥＦｓを単独で用いることが好ましい。
－天然ＥＴＦｓ－
　前記天然ＥＴＦｓとは、ヒト子宮頸部の扁平上皮癌細胞株（ＳＫＧ－ＩＩ）の無血清増殖株（ＳＫＧ－ＩＩ－ＳＦ）の順化培養液（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ　ｍｅｄｉｕｍ）に含まれる成分である。
　前記天然ＥＴＦｓの調製方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ＳＫＧ－ＩＩ－ＳＦを培養し、その培養液を脱塩後、凍結乾燥する方法が挙げられる。
　前記ＳＫＧ－ＩＩ－ＳＦの培養期間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、コンフルエントの状態で４日間培養する、などが挙げられる。
　前記天然ＥＴＦｓは、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＥＧＦ、ＴＮＦ－α、ＴＧＦ－α、ＩＧＦ－Ｉ、ＧＨ、ＰＤＧＦ－ＡＢ、ＩＧＦ－ＢＰ－３、ＦＧＦ－２、ＶＥＧＦ、ＬＩＦ、及びＨＧＦを少なくとも有し、さらにその他の成分（前記順化培養液由来の成分）を有する。
　前記各成分の天然ＥＴＦｓ中における各成分の一般的な含有量としては、例えば、以下が挙げられる。
　　ＩＬ－１α（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１α）・・・≦３．０ｐｇ／ｍＬ
　　ＩＬ－１β（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１β）・・・１００ｐｇ／ｍＬ～２００ｐｇ／ｍＬ
　　ＩＬ－２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２）・・・≦５．０ｐｇ／ｍＬ
　　ＩＬ－３（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－３）・・・≦３１ｐｇ／ｍＬ
　　ＩＬ－４（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－４）・・・≦２．０ｐｇ／ｍＬ
　　ＩＬ－５（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－５）・・・≦５．０ｐｇ／ｍＬ
　　ＩＬ－６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６）・・・５０ｐｇ／ｍＬ～１５０ｐｇ／ｍＬ
　　ＩＬ－９（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－９）・・・４００ｐｇ／ｍＬ～５００ｐｇ／ｍＬ
　　ＩＬ－１０（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１０）・・・≦５．０ｐｇ／ｍＬ
　　ＩＬ－１２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１２）・・・≦７．８ｐｇ／ｍＬ
　　ＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）・・・０．５ｎｇ／ｍＬ～２．０ｎｇ／ｍＬ
　　ＴＮＦ－α（Ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ－α）・・・≦５．０ｐｇ／ｍＬ
　　ＴＧＦ－α（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ－α）・・・≦５．０ｐｇ／ｍＬ
　　ＩＧＦ－Ｉ（Ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ－Ｉ）・・・≦６．３ｎｇ／ｍＬ
　　ＧＨ（Ｇｒｏｗｔｈ　Ｈｏｒｍｏｎｅ）・・・０．１ｎｇ／ｍＬ～０．５ｎｇ／ｍＬ
　　ＰＤＧＦ－ＡＢ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ－ＡＢ）・・・４５０ｐｇ／ｍＬ～５５０ｐｇ／ｍＬ
　　ＩＧＦ－ＢＰ－３（Ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ－３）・・・≦０．２μｇ／ｍＬ
　　ＦＧＦ－２（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）・・・３５ｐｇ／ｍＬ～４５ｐｇ／ｍＬ
　　ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）・・・１ｎｇ／ｍＬ～１０ｎｇ／ｍＬ
　　ＬＩＦ（Ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｆａｃｔｏｒ）・・・２５ｐｇ／ｍＬ～３５ｐｇ／ｍＬ
　　ＨＧＦ（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）・・・０．５ｎｇ／ｍＬ～１．５ｎｇ／ｍＬ
　前記培養用コアを培養する培養液中における前記天然ＥＴＦｓの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１体積％～１２体積％が好ましく、５体積％～１０体積％がより好ましい。前記培養液中における前記天然ＥＴＦｓの含有量が、１体積％未満、又は、１２体積％より大きいと歯根や歯周組織、又はその複合体の形成が困難となることがある。一方、前記天然ＥＴＦｓの含有量が、前記より好ましい範囲内であると、歯根や歯周組織、又はその複合体の形成効率が良い点で有利である。
－ｒｈＯＥＦｓ－
　前記ｒｈＯＥＦｓは、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＥＧＦ、ＩＧＦ－Ｉ、ＧＨ、ＰＤＧＦ－ＡＢ、ＶＥＧＦ、ＬＩＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ－２、ＦＧＦ－１、ＢＭＰ－２、ＢＭＰ－４、Ｍ－ＣＳＦ、デキサメタゾン、インスリン、サイロキシン、サイロカルシトニン、アスコルビン酸、及びβ－グリセロリン酸の少なくともいずれかを少なくとも有し、必要に応じてさらにその他の成分を有する。
　前記ｒｈＯＥＦｓの各成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、未知の感染物質を含まない点で、市販品を用いることが好ましい。
　前記培養用コアを培養する培養液中における前記ｒｈＯＥＦｓの各成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、以下の含有量以上であることが好ましい。
　　ＩＬ－１β（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１β）・・・１５０ｐｇ／ｍＬ
　　ＩＬ－６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６）・・・１００ｐｇ／ｍＬ
　　ＩＬ－８（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－８）・・・１．０ｎｇ／ｍＬ
　　ＩＬ－９（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－９）・・・４５０ｐｇ／ｍＬ
　　ＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）・・・１．５ｎｇ／ｍＬ
　　ＩＧＦ－Ｉ（Ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ－Ｉ）・・・２０ｎｇ／ｍＬ
　　ＧＨ（Ｇｒｏｗｔｈ　Ｈｏｒｍｏｎｅ）・・・２．５ｎｇ／ｍＬ
　　ＰＤＧＦ－ＡＢ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ－ＡＢ）・・・０．６ｎｇ／ｍＬ
　　ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）・・・３．２ｎｇ／ｍＬ
　　ＬＩＦ（Ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｆａｃｔｏｒ）・・・３５ｐｇ／ｍＬ
　　ＨＧＦ（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）・・・１．０ｎｇ／ｍＬ
　　ＦＧＦ－２（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ－２）・・・２０ｎｇ／ｍＬ
　　ＦＧＦ－１（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ－１）・・・５．０ｎｇ／ｍＬ
　　ＢＭＰ－２（Ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ－２）・・・１０ｎｇ／ｍＬ
　　ＢＭＰ－４（Ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ－４）・・・１５ｎｇ／ｍＬ
　　Ｍ－ＣＳＦ（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ－ｃｏｌｏｎｙ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ）・・・１０μｇ／ｍＬ
　　デキサメタゾン（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）・・・５μＭ
　　インスリン（Ｉｎｓｕｌｉｎ）・・・７．５ｎｇ／ｍＬ
　　サイロキシン（Ｔｈｙｒｏｘｉｎｅ）・・・５．５ｎｇ／ｍＬ
　　サイロカルシトニン（Ｔｈｙｒｏｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ）・・・１０ｎｇ／ｍＬ
　　アスコルビン酸（Ａｓｃｏｒｂｉｃ　ａｃｉｄ）・・・５０μｇ／ｍＬ
　　β－グリセロリン酸（β－ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）・・・１０ｍＭ
　培養液中における前記ｒｈＯＥＦｓの各成分の含有量が、上記含有量未満であると歯根や歯周組織、又はその複合体の形成が困難となることがある。
　前記ｒｈＯＥＦｓを培養液に添加する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記各成分の全てを培養液に添加する方法や、上記各成分を種々の組み合わせで培養液に添加する方法などが挙げられる。
－その他の成分－
　前記培養用コアを培養する培養液に含まれるその他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＦＢＳなどが挙げられる。
－β－グリセロリン酸濃度－
　前記培養用コアを培養する培養液に添加するβ－グリセロリン酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１０ｍＭが特に好ましい。
　前記培養液中のβ－グリセロリン酸濃度が、１０ｍＭ未満であると、歯根や歯周組織、又はその複合体の形成が不十分となることがあり、３倍量を超えると、歯根や歯周組織、又はその複合体が形成されないことがある。一方、前記特に好ましい範囲内であると、硬組織（象牙質、セメント質、歯槽骨）を効率よく形成させることができる点で好ましい。
＜培養＞
　前記培養用コアを培養する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、静置培養や灌流培養などが好適に挙げられる。
　前記培養の期間としては、歯根や歯周組織、又はその複合体の形成に応じて適宜選択することができる。例えば、静置培養を用いた場合、マウスの場合は３週間～４週間が好ましく、ヒトの場合は２４週間が好ましい。灌流培養を用いた場合は、さらに培養期間の短縮が可能である。
　前記培養（静置培養）における培養液の交換時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、４日～５日毎が好ましく、３日～４日毎がより好ましく、２日～３日毎が特に好ましい。
〔再生歯〕
　本発明の再生歯は、上述した本発明の方法によって得ることができる。本発明の再生歯の第１の態様は、歯冠と、歯根とを少なくとも有する。また、本発明の再生歯の第２の態様は、歯冠と、歯根と、歯周組織とを少なくとも有する。
　前記歯周組織には、歯根膜、歯槽骨、セメント質、歯肉が含まれる。
　本発明の再生歯は、そのまま移植に用いてもよいし、整形などの加工をしたうえで移植してもよい。また、前記歯周組織を取り外して、個別に移植床への移植に用いることもできる。
　以下に本発明の実施例について説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
〔実施例１〕
（マウス歯冠、及び歯根膜由来細胞シートを用いた歯根や歯周組織の形成）
＜培養用コアの形成＞
－歯冠の準備－
　生後６日目の新生仔マウスの下顎第１臼歯を摘出した。図１に示されるように、この臼歯（以下、「マウス歯冠」と称することがある。）は、歯冠形成が完了しているが、未だ歯根は形成されていなかった。
－歯根膜由来細胞シートの調製－
　ヒト成人の抜去歯から歯根膜組織を片刃カミソリで採取した。採取した歯根膜組織の細片を更に両刃カミソリで細切し、その細切された歯根膜組織を、０．１％トリプシン－０．０２％ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（－）液中で、３７℃、３０分間、加温し、強くピペッティングして、歯根膜由来細胞を解離させた。次いで、該歯根膜由来細胞を含む溶液を、３００×ｇで５分間遠沈し、上澄みを吸引除去した後、沈渣に、基本培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２（インビトロジェン社製）＋１５％ＦＢＳ（Ｍｏｒｅｇａｔｅ社製、ロット番号　２４３００１１３）＋１％ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ液（インビトロジェン社製）＋５０Ｕ／ｍＬ　Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（インビトロジェン社製）＋５０μｇ／ｍＬ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（インビトロジェン社製）＋０．２５μｇ　Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（インビトロジェン社製））を加えて、培養シャーレで初代培養（図２の２１）した。初代培養がコンフルエントに達した後、３つのシャーレに分けて歯根膜由来細胞を継代培養（１代目、図２の２２）した。１代目がコンフルエントに達した後、１代目の継代培養後のシャーレから、更に３つのシャーレに分けて歯根膜由来細胞を継代培養（２代目、図２の２３）した。２代目がコンフルエントに達して、シート状となった歯根膜由来細胞を、歯根膜由来細胞シートとした。図２は、歯根膜由来細胞の継代培養の説明図である。
－前培養－
　前記のようにして培養したヒト歯根膜由来細胞シート（図３の３２）の上に、前記マウス歯冠（図３の３１）を置き（１シャーレあたり、歯冠４個）、その状態で２日間培養（前培養）した。図３は、前培養（プレカルチャー）の説明図である。
　この前培養により、マウス歯冠が、ヒト歯根膜由来細胞シート上に固定された。
－培養用コア－
　前培養後、マウス歯冠を乗せたヒト歯根膜由来細胞シートを、滅菌したカミソリを用いて所定の大きさに切り出し、ラバーポリスマン（ＴＰＰ社製）を用いてシャーレから剥離して、マウス歯冠をヒト歯根膜由来細胞シートで包み込んだ。その後、ヒト歯根膜由来細胞シートで包み込んだマウス歯冠を、更に、テルダーミス（登録商標）（オリンパス　テルモ　バイオマテリアル社製）で包み込んだ。以上のように、マウス歯冠（図４の３１）を、ヒト歯根膜由来細胞シート（図４の３２）及びテルダーミス（図４の４１）内に埋入させ、培養用コアを得た。図４は、前記培養用コアの断面の説明図である。
＜歯根や歯周組織の形成＞
　前記培養用コアを、１５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液に天然ＥＴＦｓを０．１ｍＬ／ｍＬ添加した培養液中で、培養した。培養液は、数日おきに交換した。なお、前記天然ＥＴＦｓは、以下のようにして調製した。
－天然ＥＴＦｓの調製－
　ヒト子宮頸部の扁平上皮癌細胞株（ＳＫＧ－ＩＩ）の無血清増殖株（ＳＫＧ－ＩＩ－ＳＦ、理化学研究所バイオリソースセンター細胞銀行、登録番号ＲＣＢ０６８５）を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、あるいはＨａｍ　Ｆ１２を培養液に用いて、４日間培養し、その順化培養液（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ　ｍｅｄｉｕｍ）を回収して、脱塩後、凍結乾燥することによって天然ＥＴＦｓを調製した。
　前記天然ＥＴＦｓを、ＥＬＩＳＡ法（酵素免疫測定法）、及びラジオイムノアッセイ法による免疫学的解析により、次の成分が含まれていることがわかった。
　　ＩＬ－１α　　　　・・・　≦３．０ｐｇ／ｍＬ
　　ＩＬ－１β　　　　・・・　１６３ｐｇ／ｍＬ
　　ＩＬ－２　　　　　・・・　≦５．０ｐｇ／ｍＬ
　　ＩＬ－３　　　　　・・・　≦３１ｐｇ／ｍＬ
　　ＩＬ－４　　　　　・・・　≦２．０ｐｇ／ｍＬ
　　ＩＬ－５　　　　　・・・　≦５．０ｐｇ／ｍＬ
　　ＩＬ－６　　　　　・・・　１０４ｐｇ／ｍＬ
　　ＩＬ－９　　　　　・・・　４５３ｐｇ／ｍＬ
　　ＩＬ－１０　　　　・・・　≦５．０ｐｇ／ｍＬ
　　ＩＬ－１２　　　　・・・　≦７．８ｐｇ／ｍＬ
　　ＥＧＦ　　　　　　・・・　１．３ｎｇ／ｍＬ
　　ＴＮＦ－α　　　　・・・　≦５．０ｐｇ／ｍＬ
　　ＴＧＦ－α　　　　・・・　≦５．０ｐｇ／ｍＬ
　　ＩＧＦ－Ｉ　　　　・・・　≦６．３ｎｇ／ｍＬ
　　ＧＨ　　　　　　　・・・　０．１７ｎｇ／ｍＬ
　　ＰＤＧＦ－ＡＢ　　・・・　５１０ｐｇ／ｍＬ
　　ＩＧＦ－ＢＰ－３　・・・　≦０．２μｇ／ｍＬ
　　ＦＧＦ－２　　　　・・・　３７ｐｇ／ｍＬ
　　ＶＥＧＦ　　　　　・・・　≧１，０００ｐｇ／ｍＬ
　　ＬＩＦ　　　　　　・・・　３１ｐｇ／ｍＬ
　　ＨＧＦ　　　　　　・・・　１．１ｎｇ／ｍＬ
－培養１週間後－
　培養開始から１週間後、歯を取り出して、歯根の確認を行った。図５は、培養１週間後のマウス歯冠の状態を示す説明図（実体顕微鏡写真）である。図５に示されるように、根分岐部が閉じ、２つの歯根が分岐したことが確認された。
－培養２週間後－
　培養開始から２週間後、歯を取り出して、歯根の確認を行った。図６は、培養２週間後のマウス歯冠の状態を示す説明図（実体顕微鏡写真）である。
　図６に示されるように、２つの歯根が更に伸長したことが確認された。
－培養４週間後－
　培養開始から４週間後、歯を取り出して、歯根の確認を行った。図７は、培養４週間後のマウス歯冠の状態を示す説明図（実体顕微鏡写真）である。
　図７に示されるように、歯根相当部に、歯槽骨が形成されていることが確認された。
－－軟エックス線像－－
　図８は、前記４週間後の歯の軟エックス線写真である。図８に示されるように、歯根とともに歯槽骨が形成され、歯根と歯槽骨の間には、歯根膜腔（軟組織である歯根膜の形成を示す空隙）が確認された。
－－ＨＥ（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ－ｅｏｓｉｎ）染色－－
　図９は、培養４週間後の歯の薄片をＨＥ染色した結果を示す説明図である。図９中、「９１」は歯冠を、「９２」は「歯根」を示す。
　図１０は、図９における囲みａ部分を拡大して示した説明図である。囲みａ部分は、歯冠の周りの組織の一部を表す。図１０に示されるように、歯冠の周囲に、歯肉１０１、及び筋組織１０２が形成されていることが確かめられた。
　図１１は、図９における囲みｂ部分を拡大して示した説明図である。囲みｂ部分は、２つの歯根の間の骨組織の一部を表す。図１１に示されるように、新生歯槽骨の骨髄内において、多数の赤芽球が観察され、造血を示唆する所見が確認された。図１１において、符号＊で示される箇所が、骨髄腔である。
　図１２は、図９における囲みｃ部分を拡大して示した説明図である。囲みｃ部分は、歯根部歯髄の一部を表す。図１２に示されるように、歯根部の歯髄内において赤血球を伴う血管新生が確認された（矢印部）。図１２において、符号＊で示される箇所は、血管腔である。
　図１３は、培養４週間後の歯の歯根膜周辺の組織を拡大して示した説明図（ＨＥ染色像）である。図１３に示されるように、歯槽骨（Ｂ）と、セメント質（Ｃ）及び象牙質（Ｄ）との間に、歯根膜（ＰＤＬ；図８の軟エックス写真における歯根膜腔に相当）が形成されていることが確かめられた。
－－Ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ－－
　Ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法を用いて、再生組織の遺伝子発現の確認を行った。歯根膜マーカーとして、Ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ、及び骨・セメント質マーカーとして、Ｂｏｎｅ　ｓｉａｌｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＳＰ）を用いた。
　図１４は、Ｐｅｒｉｏｓｔｉｎを用いた、Ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法の結果を示す説明図である。図１５は、ＢＳＰを用いた、Ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法の結果を示す説明図である。図１４及び図１５に示されるように、これらの歯根膜・骨・セメント質に特異的なマーカーによって、再生組織が間違いなく歯周組織であることが、遺伝子発現レベルで確かめられた。これにより、培養により形成された歯根の周囲に、歯周組織も形成されていることが確かめられた。
＜移植試験１＞
－生着確認試験－
　培養４週間後の歯を、マウス上顎切歯の抜歯窩に移植した。
　移植から４週間後、上顎切歯部の歯科用エックス線像、及びマイクロＣＴ像を撮影した。図１６は、移植４週間後の移植歯の歯科用エックス線像を示す説明図である。図１７は、移植４週間後の移植歯のマイクロＣＴ像を示す説明図である。図１６中、１６１は移植歯を、１６２は正常切歯（反対側切歯）を示し、図１７中、移植歯の１７１は歯冠を、１７２は歯根（２根）を、１７３は歯根膜腔を示す。
　図１６及び図１７に示されるように、移植歯は、顎骨内で維持され、生着していることが確かめられた。
＜移植試験２＞
－血管侵入の確認－
　培養１０週間後の歯を、マウスの頭蓋骨に移植した。移植から９週間後、前記マウスに蛍光標識した液状ゼラチンを心臓から灌流して、組織切片を作製した後、共焦点レーザー顕微鏡を用いて移植歯内の血管の有無を確認した。
　図１８Ａ、及び図１８Ｂは、マウス頭蓋骨中の移植歯の蛍光観察像を示す説明図である。図１８Ｂ中、１８１は頭蓋骨壁を、１８２は移植歯を示す。
　図１８Ａ、及び図１８Ｂに示されるように、移植歯の歯髄内にホスト由来の毛細血管（矢印部）が侵入しており、移植歯が生着していることが確かめられた。
〔実施例２〕
（ヒト歯冠、及び歯根膜由来細胞シートを用いた歯根や歯周組織の形成）
＜培養用コアの形成＞
－歯冠の準備－
　ヒト歯冠として、１３歳女性患者の歯根未形成の第３大臼歯（智歯）を用いた。図１９は、前記ヒト歯冠の説明図（実体顕微鏡写真）である。図１９中、２３１は歯冠を示し、１９１は歯乳頭を示す。図１９に示すように、歯冠の形成は完了しているが、歯根は未形成であった。
－歯根膜由来細胞シートの調製－
　実施例１と同様にして、歯根膜由来細胞シートを調製した。
－前培養－
　前記歯根膜由来細胞シートの上に、前記ヒト歯冠を置き、その状態で、２日間培養（前培養）した。図２０は、前培養の説明図（実体顕微鏡写真）である。
－包み－
　前培養後、実施例１と同様にして、ヒト歯冠を、ヒト歯根膜由来細胞シート、及びテルダーミス（登録商標）で包み込み、培養用コアを得た。
＜歯根や歯周組織の形成＞
　前記培養用コアを、１５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液に、天然ＥＴＦｓを０．１ｍＬ／ｍＬ添加した培養液中で、培養した。培養液は、数日おきに交換した。図２１は、前記培養用コアの培養の説明図（実体顕微鏡写真）である。なお、天然ＥＴＦｓは、実施例１と同様にして調製した。
－培養２４週間後－
　培養開始から２４週間後、歯を取り出して、歯根の確認を行った。図２２は、培養用コアから歯を取り出した直後の状態を示す説明図（実体顕微鏡写真）である。図２２では、主に歯根周囲を軟組織（＊部分）が覆っていることが確認された。
－－実体顕微鏡像－－
　前記取り出した歯を実体顕微鏡で撮影した。なお、撮影の際に、ピンセットで触れると前記軟組織は、容易に剥がれ、伸長した歯根が露出した。図２３は、前記培養２４週間後の歯の実体顕微鏡像を示す説明図であり、歯冠２３１から歯根２３２が形成されたことが確認された。図２４は、前記培養２４週間後の歯を根尖斜め方向から撮影した実体顕微鏡像を示す図である。図２５は、前記培養２４週間後の歯を根尖方向から撮影した実体顕微鏡像を示す図である。図２４、及び図２５中の矢印部分は、根尖部歯髄を示す。図２３から図２５に示されるように、歯根の形成が確認された。
－－軟エックス線像－－
　図２６は、前記培養２４週間後の歯の軟エックス線像を示す説明図である。図２６に示されるように、歯髄腔（＊部分）が形成されていることが確認された。
－－マイクロＣＴ像－－
　図２７Ａから図２７Ｂは、前記培養２４週間後の歯の側面のマイクロＣＴ像を示す説明図である。図２７Ｃは、前記培養２４週間後の歯の側面断面のマイクロＣＴ像を示す説明図である。図２８Ａから図２８Ｃは、前記培養２４週間後の歯の根尖方向からの歯根断面のマイクロＣＴ像を示す説明図である。図２７Ａから図２８Ｃに示されるように歯根が伸長されていることが確認された。図中、「矢印」は、根尖部歯髄を示し、「＊」は、歯髄腔を示す。
－－軟組織の分析－－
　前記培養２４週間後の歯の周囲を覆っていた軟組織（図２２の＊部分）を分析した。
　図２９は、歯から剥がした軟組織の実体顕微鏡像を示す説明図である。図中の「＊」は、図２２の「＊」に対応する部分を示す。
　図３０は、歯から剥がした軟組織の軟エックス線像を示す説明図である。図の囲み部は、図２９の囲み部に対応する部分を示した巨大な歯槽骨であり、矢印は、歯槽骨の小塊を示す。
　図３１Ａ、及び図３１Ｂは、図３０の囲み部の巨大な歯槽骨のマイクロＣＴ像を示す説明図である。
　上記分析の結果、結合組織と歯槽骨の形成が確認された。
〔実施例３〕
（マウス歯冠、及び骨髄由来細胞シートを用いた歯根や歯周組織の形成）
　実施例１の歯根膜由来細胞シートに代えて、骨髄由来細胞シートを用いた以外は、実施例１と同様にして、歯根や歯周組織、又はその複合体の形成を行った。
－骨髄由来細胞シートの調製－
　骨髄輸血の際の余剰骨髄を採取して、基本培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２（インビトロジェン社製）＋１５％ＦＢＳ（Ｍｏｒｅｇａｔｅ社製、ロット番号　２４３００１１３）＋１％ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ液（インビトロジェン社製）＋５０Ｕ／ｍＬ　Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（インビトロジェン社製）＋５０μｇ／ｍＬ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（インビトロジェン社製）＋０．２５μｇ　Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（インビトロジェン社製））にて、初代培養した。培養開始数日後に培養液の交換を行うと、シャーレには接着性の細胞が出現し、浮遊性の細胞は除去された。この接着性細胞の培養を続け、コンフルエントに達した後、３つのシャーレに分けて骨髄由来細胞を継代培養（１代目）した。１代目がコンフルエントに達した後、１代目の継代培養後のシャーレから、更に３つのシャーレに分けて骨髄由来細胞を継代培養（２代目）した。２代目がコンフルエントに達し、シート状となった骨髄由来細胞を、骨髄由来細胞シートとした。
－培養４週間後－
　培養開始から４週間後、歯を取り出して、歯根や歯周組織の確認を行った。図３２は、培養４週間後のマウス歯冠の状態を示す説明図（実体顕微鏡写真）である。
　図３２に示されるように、歯根相当部に、歯槽骨が形成されていることが確認された。
－－軟エックス線像－－
　図３３は、前記４週間後の歯の軟エックス線像を示す説明図である。図３３に示されるように、歯根とともに歯槽骨が形成され、歯根と歯槽骨の間には、歯根膜腔が確認された。
〔実施例４〕
（マウス歯冠、及び歯小嚢由来細胞シートを用いた歯根や歯周組織の形成）
　実施例１の歯根膜由来細胞シートに代えて、歯小嚢由来細胞シートを用いた以外は、実施例１と同様にして、歯根や歯周組織、又はその複合体の形成を行った。
－歯小嚢由来細胞シートの調製－
　未完成のヒト抜去歯の周囲に付着した軟組織（これを歯小嚢と呼ぶ。未完成歯の周囲に存在する線維性結合組織である。）を採取してカミソリメスで細切し、その細切された歯小嚢組織を、０．１％トリプシン－０．０２％ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（－）液中で、３７℃、３０分間、加温し、強くピペッティングして、歯小嚢由来細胞を解離させた。次いで、該歯小嚢由来細胞を含む溶液を、３００×ｇで５分間遠沈し、上澄みを吸引除去した後、沈渣に、基本培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２（インビトロジェン社製）＋１５％ＦＢＳ（Ｍｏｒｅｇａｔｅ社製、ロット番号　２４３００１１３）＋１％ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ液（インビトロジェン社製）＋５０Ｕ／ｍＬ　Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（インビトロジェン社製）＋５０μｇ／ｍＬ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（インビトロジェン社製）＋０．２５μｇ　Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（インビトロジェン社製））を加えて、培養シャーレで初代培養した。あるいは、カミソリメスで細切した組織を培養シャーレ上で前記基本培地を用いて初代培養した。両者の方法によって初代培養がコンフルエントに達した後、３つのシャーレに分けて歯小嚢由来細胞を継代培養（１代目）した。１代目がコンフルエントに達した後、１代目の継代培養後のシャーレから、更に３つのシャーレに分けて歯小嚢由来細胞を継代培養（２代目）した。２代目がコンフルエントに達し、シート状となった歯小嚢由来細胞を、歯小嚢由来細胞シートとした。
－培養４週間後－
　培養開始から４週間後、歯を取り出して、歯根や歯周組織の確認を行った。図３４は、培養４週間後のマウス歯冠の状態を示す説明図（実体顕微鏡写真）である。
　図３４に示されるように、歯根相当部に、歯槽骨が形成されていることが確認された。
－－軟エックス線像－－
　図３５は、前記４週間後の歯の軟エックス線像を示す説明図である。図３５に示されるように、歯根とともに歯槽骨が形成され、歯根と歯槽骨の間には、歯根膜腔が確認された。
〔実施例５〕
（マウス歯冠、及び歯髄由来細胞シートを用いた歯根や歯周組織の形成）
　実施例１の歯根膜由来細胞シートに代えて、歯髄由来細胞シートを用いた以外は、実施例１と同様にして、歯根や歯周組織、又はその複合体の形成を行った。
－歯髄由来細胞シートの調製－
　歯科用のスチールバーを用いて、ヒトの抜去歯の歯頸部（エナメル質とセメント質の境界部）でＨａｎｋｓ液（ニッスイ社製）で冷却しながら歯を切断した。続いて、歯冠部と歯根部の歯髄組織を採取して、カミソリメスで組織を細切し、その細切した歯髄組織を、０．１％トリプシン－０．０２％ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（－）液中で、３７℃、３０分間、加温し、強くピペッティングして、歯髄由来細胞を解離させた。次いで、該歯髄由来細胞を含む溶液を、３００×ｇで５分間遠沈し、上澄みを吸引除去した後、沈渣に、基本培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２（インビトロジェン社製）＋１５％ＦＢＳ（Ｍｏｒｅｇａｔｅ社製、ロット番号　２４３００１１３）＋１％ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ液（インビトロジェン社製）＋５０Ｕ／ｍＬ　Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（インビトロジェン社製）＋５０μｇ／ｍＬ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（インビトロジェン社製）＋０．２５μｇ　Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（インビトロジェン社製））を加えて、培養シャーレで初代培養した。あるいは、カミソリメスで細切した組織を培養シャーレ上で前記基本培地を用いて初代培養した。両者の方法によって初代培養がコンフルエントに達した後、３つのシャーレに分けて歯髄由来細胞を継代培養（１代目）した。１代目がコンフルエントに達した後、１代目の継代培養後のシャーレから、更に３つのシャーレに分けて歯髄由来細胞を継代培養（２代目）した。２代目がコンフルエントに達し、シート状となった歯髄由来細胞を、歯髄由来細胞シートとした。
－培養４週間後－
　培養開始から４週間後、歯を取り出して、歯根や歯周組織の確認を行った。図３６は、培養４週間後のマウス歯冠の状態を示す説明図（実体顕微鏡写真）である。
　図３６に示されるように、歯根相当部に、歯槽骨が形成されていることが確認された。
－－軟エックス線像－－
　図３７は、前記４週間後の歯の軟エックス線像を示す説明図である。図３７に示されるように、歯根とともに歯槽骨が形成され、歯根と歯槽骨の間には、歯根膜腔が確認された。
〔実施例６〕
（マウス歯冠、及び歯乳頭由来細胞シートを用いた歯根や歯周組織の形成）
　実施例１の歯根膜由来細胞シートに代えて、歯乳頭由来細胞シートを用いた以外は、実施例１と同様にして、歯根や歯周組織、又はその複合体の形成を行った。
－歯乳頭由来細胞シートの調製－
　歯根未完成のヒト抜去歯の歯根先端部の歯髄組織（これを歯乳頭と呼ぶ。）を採取してカミソリメスで細切し、その細切された歯乳頭組織を、０．１％トリプシン－０．０２％ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（－）液中で、３７℃、３０分間、加温し、強くピペッティングして、歯乳頭由来細胞を解離させた。次いで、該歯乳頭由来細胞を含む溶液を、３００×ｇで５分間遠沈し、上澄みを吸引除去した後、沈渣に、基本培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２（インビトロジェン社製）＋１５％ＦＢＳ（Ｍｏｒｅｇａｔｅ社製、ロット番号　２４３００１１３）＋１％ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ液（インビトロジェン社製）＋５０Ｕ／ｍＬ　Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（インビトロジェン社製）＋５０μｇ／ｍＬ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（インビトロジェン社製）＋０．２５μｇ　Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（インビトロジェン社製））を加えて、培養シャーレで初代培養した。あるいは、カミソリメスで細切した組織を培養シャーレ上で前記基本培地を用いて初代培養した。両者の方法によって初代培養がコンフルエントに達した後、３つのシャーレに分けて歯乳頭由来細胞を継代培養（１代目）した。１代目がコンフルエントに達した後、１代目の継代培養後のシャーレから、更に３つのシャーレに分けて歯乳頭由来細胞を継代培養（２代目）した。２代目がコンフルエントに達し、シート状となった歯乳頭由来細胞を、歯乳頭由来細胞シートとした。
－培養４週間後－
　培養開始から４週間後、歯を取り出して、歯根や歯周組織の確認を行った。図３８は、培養４週間後のマウス歯冠の状態を示す説明図（実体顕微鏡写真）である。
　図３８に示されるように、歯根相当部に、歯槽骨が形成されていることが確認された。
－－軟エックス線像－－
　図３９は、前記４週間後の歯の軟エックス線像を示す説明図である。図３９に示されるように、歯根とともに歯槽骨が形成され、歯根と歯槽骨の間には、歯根膜腔が確認された。
〔実施例７〕
（マウス歯冠、及び歯根膜由来細胞含有多孔性基材を用いた歯根や歯周組織の形成）
＜培養用コアの形成＞
－歯冠の準備－
　実施例１と同様にして、マウス歯冠を用意した。
－歯根膜由来細胞の調製－
　ヒト成人の抜去歯から歯根膜組織を片刃カミソリで採取した。採取した歯根膜組織の細片を更にカミソリメスで細切し、その細切された歯根膜組織を、０．１％トリプシン－０．０２％ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（－）液中で、３７℃、３０分間、加温し、強くピペッティングして、歯根膜由来細胞を解離させた。次いで、該歯根膜由来細胞を含む溶液を、３００×ｇで５分間遠沈し、上澄みを吸引除去した後、沈渣に、基本培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２（インビトロジェン社製）＋１５％ＦＢＳ（Ｍｏｒｅｇａｔｅ社製、ロット番号　２４３００１１３）＋１％ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ液（インビトロジェン社製）＋５０Ｕ／ｍＬ　Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（インビトロジェン社製）＋５０μｇ／ｍＬ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（インビトロジェン社製）＋０．２５μｇ　Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（インビトロジェン社製））を加えて、培養シャーレで培養し、歯根膜由来細胞を調製した。
－歯根膜由来細胞含有多孔性基材の調製－
　多孔性基材として、テルダーミス（登録商標）（オリンパス　テルモ　バイオマテリアル社製）を使用した。前記基本培地に含浸させた前記多孔性基材（４ｃｍ×４ｃｍ大のシート状基材）に、前記歯根膜由来細胞（２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を播種した後、３７℃の条件で、７２時間培養して、歯根膜由来細胞含有多孔性基材を調製した。
－培養用コア－
　前記マウス歯冠を、前記歯根膜由来細胞を含有させた多孔性基材で包み込み、マウス歯冠を、ヒト歯根膜由来細胞を含有する多孔性基材内に埋入させ、培養用コアを得た。
＜歯根や歯周組織の形成＞
　前記培養用コアを、１５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液に、天然ＥＴＦｓを０．１ｍＬ／ｍＬ添加した培養液中で、培養した。培養液は、数日おきに交換した。なお、天然ＥＴＦｓは、実施例１と同様にして調製した。
－培養４週間後－
　培養開始から４週間後、歯を取り出して、歯根や歯周組織の確認を行った。図４０は、培養４週間後のマウス歯冠の状態を示す説明図（実体顕微鏡写真）である。
　図４０に示されるように、歯根相当部に、歯槽骨が形成されていることが確認された。
－－軟エックス線像－－
　図４１は、前記４週間後の歯の軟エックス線像を示す説明図である。図４１に示されるように、歯根とともに歯槽骨が形成され、歯根と歯槽骨の間には、歯根膜腔が確認された。
〔実施例８〕
（マウス歯冠、歯根膜由来細胞シート、及び歯根膜由来細胞含有多孔性基材を用いた歯根や歯周組織の形成）
＜培養用コアの形成＞
－歯冠の準備－
　実施例１と同様にして、マウス歯冠を用意した。
－歯根膜由来細胞シートの調製－
　実施例１と同様にして、歯根膜由来細胞シートを調製した。
－前培養－
　実施例１と同様にして、前培養を行い、マウス歯冠をヒト歯根膜由来細胞シート上に固定した。
－歯根膜由来細胞含有多孔性基材の調製－
　実施例４と同様にして、歯根膜由来細胞含有多孔性基材を調製した。
－培養用コア－
　実施例１において、細胞を含有しないテルダーミスを、前記歯根膜由来細胞含有多孔性基材に代えた以外は、実施例１と同様にして、マウス歯冠を、ヒト歯根膜由来細胞シート、及び歯根膜由来細胞含有多孔性基材内に埋入させ、培養用コアを得た。
＜歯根や歯周組織の形成＞
　前記培養用コアを、１５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液に、天然ＥＴＦｓを０．１ｍＬ／ｍＬ添加した培養液中で、培養した。培養液は、数日おきに交換した。なお、天然ＥＴＦｓは、実施例１と同様にして調製した。
－培養４週間後－
　培養開始から４週間後、歯を取り出して、歯根や歯周組織の確認を行った。図４２は、培養４週間後のマウス歯冠の状態を示す説明図（実体顕微鏡写真）である。
　図４２に示されるように、歯根相当部に、歯槽骨が形成されていることが確認された。
－－軟エックス線像－－
　図４３は、前記４週間後の歯の軟エックス線像を示す説明図である。図４３に示されるように、歯根とともに歯槽骨が形成され、歯根と歯槽骨の間には、歯根膜腔が確認された。
〔実施例９〕
（マウス歯冠、及び歯根膜由来細胞シートを用いた歯根や歯周組織の形成）
　前記実施例１において、天然ＥＴＦｓを以下のｒｈＯＥＦｓとした以外は、実施例１と同様にして、歯根や歯周組織の形成を行った。
　前記培養用コアを培養する培養液中における前記ｒｈＯＥＦｓの各成分の含有量は、以下の通りである。
　　ＩＬ－１β（商品名：ＩＬ－１β、Ａｃｒｉｓ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社製）・・・１５０ｐｇ／ｍＬ
　　ＩＬ－６（商品名：ＩＬ－６、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社製）・・・１００ｐｇ／ｍＬ
　　ＩＬ－８（商品名：ＩＬ－８、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社製）・・・１．０ｎｇ／ｍＬ
　　ＩＬ－９（商品名：ＩＬ－９、Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ社製）・・・４５０ｐｇ／ｍＬ
　　ＥＧＦ（商品名：ＥＧＦ、Ａｃｒｉｓ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社製）・・・１．５ｎｇ／ｍＬ
　　ＩＧＦ－Ｉ（商品名：ＩＧＦ－１、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）・・・２０ｎｇ／ｍＬ
　　ＧＨ（商品名：ｈＧＨ、ノボ・ノルディスク社製）・・・２．５ｎｇ／ｍＬ
　　ＰＤＧＦ－ＡＢ（商品名：ＰＤＧＦ－ＡＢ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社製）・・・０．６ｎｇ／ｍＬ
　　ＶＥＧＦ（商品名：ＶＥＧＦ、Ｂａｃｈｅｍ　Ｆｅｉｎｃｈｅ－ｍｉｋａｌｉｅｎ　ＡＧ社製）・・・３．２ｎｇ／ｍＬ
　　ＬＩＦ（商品名：ＬＩＦ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）・・・３５ｐｇ／ｍＬ
　　ＨＧＦ（商品名：ＨＧＦ、Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ社製）・・・１．０ｎｇ／ｍＬ
　　ＦＧＦ－２（商品名：ＦＧＦ－２、ＰｒｏＳｐｅｃ－Ｔａｎｙ　Ｔｅｃｈｎｏｇｅｎｅ社製）・・・２０ｎｇ／ｍＬ
　　ＦＧＦ－１（商品名：ＦＧＦ－１、ＰｒｏＳｐｅｃ－Ｔａｎｙ　Ｔｅｃｈｎｏｇｅｎｅ社製）・・・５．０ｎｇ／ｍＬ
　　ＢＭＰ－２（商品名：ＢＭＰ－２、Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ社製）・・・１０ｎｇ／ｍＬ
　　ＢＭＰ－４（商品名：ＢＭＰ－４、Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ社製）・・・１５ｎｇ／ｍＬ
　　Ｍ－ＣＳＦ（商品名：Ｍ－ＣＳＦ、Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ社製）・・・１０μｇ／ｍＬ
　　デキサメタゾン（商品名：デキサメタゾン、ＢＩＯＭＯＬ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，　ＬＰ社製）・・・５μＭ
　　インスリン（商品名：インスリン、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）・・・７．５ｎｇ／ｍＬ
　　サイロキシン（商品名：サイロキシン、ＳＩＧＭＡ社製）・・・５．５ｎｇ／ｍＬ
　　サイロカルシトニン（商品名：カルシトニン（ｈｕｍａｎ）、Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ社製）・・・１０ｎｇ／ｍＬ
　　アスコルビン酸（商品名：アスコルビン酸、ＳＩＧＭＡ社製）・・・５０μｇ／ｍＬ
　　β－グリセロリン酸（商品名：β－グリセロリン酸、ＳＩＧＭＡ社製）・・・１０ｍＭ
－培養４週間後－
　培養開始から４週間後、歯を取り出して、歯根や歯周組織の確認を行った。図４４は、培養４週間後のマウス歯冠の状態を示す説明図（実体顕微鏡写真）である。
　図４４に示されるように、歯根相当部に、歯槽骨が形成されていることが確認された。
－－軟エックス線像－－
　図４５は、前記４週間後の歯の軟エックス線像を示す説明図である。図４５に示されるように、歯根とともに歯槽骨が形成され、歯根と歯槽骨の間には、歯根膜腔が確認された。
〔実施例１０〕
（マウス歯冠、及び歯根膜由来細胞シートを用いた歯根や歯周組織の形成）
　前記実施例７において、天然ＥＴＦｓを前記実施例９のｒｈＯＥＦｓとした以外は、実施例７と同様にして、歯根や歯周組織の形成を行った。
－培養４週間後－
　培養開始から４週間後、歯を取り出して、歯根や歯周組織の確認を行った。図４６は、培養４週間後のマウス歯冠の状態を示す説明図（実体顕微鏡写真）である。
　図４６に示されるように、歯根相当部に、歯槽骨が形成されていることが確認された。
－－軟エックス線像－－
　図４７は、前記４週間後の歯の軟エックス線像を示す説明図である。図４７に示されるように、歯根とともに歯槽骨が形成され、歯根と歯槽骨の間には、歯根膜腔が確認された。
〔実施例１１〕
（マウス歯冠、及び歯根膜由来細胞シートを用いた歯根や歯周組織の形成）
　前記実施例８において、天然ＥＴＦｓを前記実施例９のｒｈＯＥＦｓとした以外は、実施例８と同様にして、歯根や歯周組織の形成を行った。
－培養４週間後－
　培養開始から４週間後、歯を取り出して、歯根や歯周組織の確認を行った。図４８は、培養４週間後のマウス歯冠の状態を示す説明図（実体顕微鏡写真）である。
　図４８に示されるように、歯根相当部に、歯槽骨が形成されていることが確認された。
－－軟エックス線像－－
　図４９は、前記４週間後の歯の軟エックス線像を示す説明図である。図４９に示されるように、歯根とともに歯槽骨が形成され、歯根と歯槽骨の間には、歯根膜腔が確認された。
　上記に示したように、異種・同種移植技術（生体内培養）を使用することなく、インビトロ（生体外培養）において、マウス歯冠、及びヒト歯冠から、歯根を有する再生歯が得られること、及び、歯周組織を有する歯根を形成することができ、歯根と、歯周組織とを有する再生歯が得られることが確認された。なお、本発明の技術は、歯に限らず、他の組織・臓器のインビトロでの形成にも応用可能であると考えられる。
　本発明の方法は、異種・同種移植技術（生体内培養）を使用することなく、インビトロ（生体外培養）において、歯周組織を有する歯根を形成することができるので、免疫拒絶やウイルス等の感染のおそれのない再生歯の形成が可能となる。
　また、本発明の再生歯は、本発明の方法により得ることができるので、歯の喪失部への移植、さらに歯槽骨が失われている症例においても、好適に用いることができる。
　そして、本発明は、歯に限らず、他の組織・臓器の再生に好適に利用可能である。
　　２１　　初代培養
　　２２　　継代１代目
　　２３　　継代２代目
　　３１　　マウス歯冠
　　３２　　歯根膜由来細胞シート
　　４１　　多孔性基材
　　９１　　歯冠
　　９２　　歯根
　１０１　　歯肉
　１０２　　筋組織
　１６１　　移植歯
　１６２　　正常切歯
　１７１　　歯冠
　１７２　　歯根
　１７３　　歯根膜腔
　１８１　　頭蓋骨壁
　１８２　　移植歯
　１９１　　歯乳頭
　２３１　　歯冠
　２３２　　歯根
　　　Ｂ　　歯槽骨
　　　Ｃ　　セメント質
　　　Ｄ　　象牙質
　ＰＤＬ　　歯根膜

Claims (7)

  1. 　少なくとも歯冠を有する歯に、少なくとも歯根を形成する方法であって、
    　前記歯を、歯根膜由来細胞、骨髄由来細胞、歯小嚢由来細胞、歯髄由来細胞、及び歯乳頭由来細胞の少なくともいずれかの細胞を含む細胞含有基材で包んだ培養用コアを形成する培養用コア形成工程と、
    　前記培養用コアを、培養液中で培養し、前記培養用コア中の歯に少なくとも歯根を形成する工程とを含み、
    　前記培養液が、ヒト子宮頸部扁平上皮癌細胞株の無血清増殖株の順化培養液に含まれる成分、並びに、
    ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＥＧＦ、ＩＧＦ－Ｉ、ＧＨ、ＰＤＧＦ－ＡＢ、ＶＥＧＦ、ＬＩＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ－２、ＦＧＦ－１、ＢＭＰ－２、ＢＭＰ－４、Ｍ－ＣＳＦ、デキサメタゾン、インスリン、サイロキシン、サイロカルシトニン、アスコルビン酸、及びβ－グリセロリン酸の少なくともいずれかを有する培養液添加物
    の少なくともいずれかを有することを特徴とする方法。
  2. 　培養用コアを、培養液中で培養し、前記培養用コア中の歯に少なくとも歯根を形成する工程において、更に、歯周組織を形成する請求の範囲第１項に記載の方法。
  3. 　細胞含有基材が、細胞シート、及び細胞含有多孔性基材の少なくともいずれかである請求の範囲第１項から第２項のいずれかに記載の方法。
  4. 　培養用コアが、更に、細胞を含有しない多孔性基材で包まれた請求の範囲第１項から第３項のいずれかに記載の方法。
  5. 　培養用コア形成工程において、歯が、細胞シート上で前培養される請求の範囲第３項から第４項のいずれかに記載の方法。
  6. 　請求の範囲第１項から第５項のいずれかに記載の方法によって形成されたことを特徴とする少なくとも歯根を有する再生歯。
  7. 　再生歯が、更に、歯周組織を有する請求の範囲第６項に記載の再生歯。
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