WO2009152928A2 - Verfahren zur quantitativen analyse von nukleinsäuren, marker dafür und deren verwendung - Google Patents

Verfahren zur quantitativen analyse von nukleinsäuren, marker dafür und deren verwendung Download PDF

Info

Publication number
WO2009152928A2
WO2009152928A2 PCT/EP2009/003709 EP2009003709W WO2009152928A2 WO 2009152928 A2 WO2009152928 A2 WO 2009152928A2 EP 2009003709 W EP2009003709 W EP 2009003709W WO 2009152928 A2 WO2009152928 A2 WO 2009152928A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
rat
tag
tes
council
day
Prior art date
Application number
PCT/EP2009/003709
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2009152928A3 (de
Inventor
Björn ROTTER
Original Assignee
Genxpro Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genxpro Gmbh filed Critical Genxpro Gmbh
Publication of WO2009152928A2 publication Critical patent/WO2009152928A2/de
Publication of WO2009152928A3 publication Critical patent/WO2009152928A3/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the invention relates to a method for the quantitative determination of nucleic acids in a sample, in particular for the quantitative determination of gene transcripts, genomic DNA or genomic nucleic acid segments, such as e.g. DNA, RNA, mRNA, cDNA, microRNA, non-coding RNA, aptamer DNA and RNA, as well as the
  • nucleic acids The quantification of nucleic acids has great scientific and commercial significance in all areas of the life sciences. Thus, it is important to know which gene products (e.g., proteins encoding and non-coding RNA) are abundant (gene expression studies) and how transcription is regulated, e.g. by epigenetic properties of the genomic DNA. In addition, the determination of the frequency of copies of gene sections for karyotyping is an important diagnostic tool for diseases such as e.g. Cancer.
  • gene products e.g., proteins encoding and non-coding RNA
  • the first group form methods that can quantify already known or otherwise characterized sequences. They are usually based on the binding of the nucleic acids to be quantified to known or otherwise characterized
  • Sequences bound to a solid surface are all forms of Southem blots, Northern blots or so-called DNA or RNA micro-arrays (chips).
  • BESTATIGUNGSKOPIE The second group are methods based on the quantification of the nucleic acids by sequencing as many individual nucleic acid molecules as possible and counting the sequenced molecules in the mixture. Since more nucleic acid molecules are generally present in the mixture than are sequenced, the relative abundance of a nucleic acid of specific sequence in the mixture is thus obtained.
  • the invention presented herein improves the safety and accuracy of quantification of nucleic acids by virtually all methods based on sequencing and enumeration. These include both so-called “tag” -based methods, where the tag is as representative as possible of the nucleic acid
  • Section represents, by which the nucleic acid can be identified, as well as methods in which the number of complete DNA and RNA molecules such as that of viruses is determined.
  • RNA-seq RNA fragments
  • SAGE Serial analysis of gene expression
  • ⁇ smFI type II restriction enzyme
  • the tags represent the parent mRNA molecules from which the cDNA was generated. Therefore, the amount of sequenced tags is a measure of the relative abundance with which the mRNA was present in the mRNA mixture.
  • the ditags can be sequenced directly by PCR with highly parallel sequencing techniques (eg, Nielsen KL, Hogh AL, Emmersen J., Nucleic Acids Res. 2006, 34 (19): e133, DeepSAGE Digital transcriptomics with high sensitivity, simple experimental protocol and multiplexing of samples and Gowda M. et al., Nucleic Acid Research, 2006, Vol. 34, No.
  • the tags available with the SuperSAGE method can also be used to study gene expression using arrays (US 2007/0172854) "Cap analysis gene expression" (CAGE 1 T. Shiraki et al., Cap analysis gene expression for high-throughput analysis of transcriptional starting point and identification of promoter usage, Proc. Natl. Acad., USA 100 (2003), pp. 15776-15781) was developed to identify transcript initiation sequences and promoters. The process isolates and sequences 21 bp fragments that directly attach to the 5 'CAP sequence of an mRNA.
  • Methylation-specific digital karyotyping Nature Protocols 1, 1621-1636 (2006) applies the principle of digital karyotyping for the quantitative determination of different methylation states of two samples.
  • “Paired-end ditag” (CL Wei et al., A global map of p53 transcription-factor binding sites in the human genome, Cell 124 (2006), pp. 207-219) aims to provide protein binding sequences in the art To identify genome.
  • the principle of GIS is used to isolate and quantify tags from both ends of a DNA fragment bound to a particular protein (eg, a transcription factor) that together with the bound DNA by immunoprecipitation specifically from the protein DNA mixture is precipitated. Paired-end ditag was used to identify p53 sites in the human genome.
  • - Metagenomic analyzes aim to determine the composition of a complex mixture of organisms using the same procedures as Digital Karyotyping. Krause et al., Phylogenetic Classification of Short environmental DNA fragments, Nucleic Acids Res. 2008 Apr; 36 (7): 2230-2239.
  • US 2008/0108804 describes a method for the 5'-modification of RNAs and for the production of DNAs thereof, whereby a sequence information is introduced which can serve for the qualitative identification of the origin of a sample or for the immobilization of an RNA or DNA by hybridization. Furthermore, a special method for generating 5'-chimeric cDNAs has been described, which are particularly suitable for the investigation of global gene or protein expression (WO 2004/015085).
  • Nucleic acids of a sample are usually not sufficient for all subsequent analyzes. Therefore, before the analysis almost always an increase of the material is necessary.
  • highly parallel sequencing methods are required in the various high-throughput sequencing machines (e.g., the "454" picoliter method of Roche Diagnostics, Germany, or the company's Solexa pyrosequencing method
  • PCR polymerase chain reaction
  • Oligonucleotides which are complementary to the adapter sequences are used as primers. Also for a cloning of the fragments often their previous amplification is necessary.
  • Nucleic acids are preferentially propagated. Thus, shorter nucleic acids are preferably amplified, but also the individual base sequence, the efficiency of the Affect amplification. As a result, the relative abundance of a nucleic acid in a nucleic acid population before and after amplification may differ greatly, as in RNA analysis by RNA seq (Transcript length bias in RNA-seq data confounds Systems biology; Alicia Oshlack * and Matthew J Wakefield, Biology Direct 2009, 4:14 doi: 10.1186 / 1745-6150-4-14).
  • nucleic acid compositions are frequently used, for example in the quantification of Expressed-Sequenced Tags (ESTs), even without prior PCR amplification, e.g. carried out after cloning of the nucleic acids.
  • ESTs Expressed-Sequenced Tags
  • the object is achieved by providing all nucleic acids of a nucleic acid mixture, whether double-stranded or single-stranded, with a "Random Tag” (RAT) prior to amplification, which originates from a mixture of synthetic oligonucleotides, the mixture having sufficient RATs with different sequences.
  • RAT-NS Random Tag nucleic acid
  • RAT- nucleic acid combinations that occur more than once or at least more frequently than statistically likely are therefore recognizable as copies. If all copies are eliminated from the data set, the original composition of the nucleic acid mixture before the amplification results. Thus, the reliable quantitative determination of nucleic acids in a sample becomes possible.
  • the subject of the present invention is a method for the quantitative determination of nucleic acids (nucleic acid population) in a sample in which
  • nucleic acid constructs containing - at least one characteristic polynucleotide domain (TAG) of a nucleic acid present in a sample which is to be quantified and - at least one artificial polynucleotide domain having a random sequence
  • TAG characteristic polynucleotide domain
  • Random tag or abbreviated RAT
  • PB primer or polymerase binding site
  • TAG characteristic polynucleotide domain
  • RAT random sequence polynucleotide domain
  • TAG-RAT combination characteristic domain combination flanked by at least one polymerase or primer binding site (PB), amplified in the presence of a polymerase
  • At least the sequence of random sequence polynucleotide domains (RAT) and at least a part of the characteristic polynucleotide domain (TAG) are determined, wherein for the quantitative determination of the nucleic acid present in the sample are sequence-identical and optionally additionally sequence-like combinations of a characteristic Polynucleotide domain (TAG) and a random sequence polynucleotide (RAT) domain as copies of a characteristic polynucleotide domain (TAG) of the nucleic acid originally present in the sample.
  • Each TAG-RAT combination thus represents a nucleic acid strand present in the sample prior to amplification, no matter how frequently this combination is after the amplification, e.g. is found by sequencing.
  • Combinations with the same TAG and divergent RATs are accordingly each for a further strand of the same nucleic acid in the sample prior to amplification.
  • nucleic acid refers to the nucleic acids to be quantitatively determined which are present in a sample
  • the nucleic acids to be determined can be present in the sample both as single-stranded and double-stranded DNAs and RNAs, in particular mRNAs , microRNAs, rRNA and non-coding RNAs and their reverse-transcribed cDNAs that can be used for gene expression analysis and analysis of non-coding RNAs, and the term “nucleic acid” also includes aptamer DNA and RNA or fragments genomic DNA, which may also be methylated in particular.
  • the invention is directed to the quantitation of immunoprecipitated DNA fragments and fragments quantified by Digital Karyotyping and Methylation-Specific Digital Karyotyping. Likewise, the invention improves the quantification of DNA fragments for metagenomic analysis as well as for the analysis of fragments from subtractive DNA libraries. Also included within the term “nucleic acids” are single or double stranded polynucleotides of artificial (synthetic) origin, including those whose phosphate groups have been replaced by other atoms, or whose bases have been modified, and which
  • a "primer or polymerase binding site (PB)” refers to a nucleic acid of known sequence, which can preferably serve as a binding site for a primer, for example for PCR, the amplification taking place using the corresponding primers and polymerases by enzymatic polymerization Sequences for polymerase attachment may be used to initiate enzymatic amplification, such as those already contained in known plasmids or other vectors, etc. In such a case, incorporation of the RAT-TAG combinations into a vector may be accomplished using an insertion sequence A nucleic acid construct according to the present invention is produced that can be multiplied by cloning
  • Polymerase binding site may be e.g. be a promoter sequence for an RNA polymerase, such as SP6 or T7 RNA polymerase, wherein from the binding site from a linear amplification of the nucleic acid construct can be carried out by the corresponding polymerase.
  • RNA polymerase such as SP6 or T7 RNA polymerase
  • a “characteristic polynucleotide domain” is understood to be a so-called “TAG", namely a nucleic acid domain whose sequence is characteristic of a nucleic acid occurring in the sample and to be quantitatively determined. Which part of a nucleic acid is selected as a characteristic polynucleotide domain is in principle freely selectable, as long as the individual TAGs can be assigned to a specific nucleic acid present in the sample. If this association is not unique, other methods can be used to ensure this uniqueness, e.g. with real time PCR with specific primers. As TAG, e.g. conserved parts of a gene sequence can be used. Preferred polynucleotide domains with a sufficient
  • the characteristic polynucleotide domains should have a sequence length of at least 8 nucleotides, more preferably at least 12 nucleotides, more preferably at least 15 nucleotides.
  • a characteristic polynucleotide domain may also be the entire nucleic acid to be determined. However, the domain should preferably not exceed a length of 50 nucleotides, more preferably of 35 nucleotides, in particular of 27 nucleotides. It can also longer, characteristic Polynucleotide domains are incorporated into a nucleic acid construct, but it is often sufficient to determine only a portion of this sequence following amplification of the constructs.
  • the invention is a synthetically produced (random) tag (RAT) whose sequence allows for unique labeling of the polynucleotide tagging domain
  • RATs are usually made commercially by a "random" linkage of the individual nucleotides. A mixture of RATs is obtained, whereby the probability of the presence of RATs with the same
  • RATs can be prepared from a mixture of known, different sequences.
  • Single-stranded RATs can be made or purchased as oligonucleotides.
  • Single-stranded oligonucleotides having a random sequence (RAT) and a known sequence portion are preferably used for the preparation of double-stranded RATs, the known sequence portion being at the 3 'end of the single-stranded oligonucleotide.
  • Oligonucleotides with complementary sequence are hybridized to the known sequence portion as primers and converted by means of a polymerase (for example with the so-called Klenow fragment of DNA polymerase I) into a double-stranded oligonucleotide containing a double-stranded RAT.
  • Pure double-stranded RATs without further domains can be generated by integration of a tagging enzyme site and a primer binding site, whereby after second strand synthesis using the tagging enzyme of the
  • the single-stranded RAT is split off. Furthermore, the single-stranded RAT can preferably be provided at one end with a known sequence, the particular Polynucleotide domains such as a tagging enzyme site, restriction site, ligation site, etc. At the other end of the RAT then preferably a primer binding site is inserted, which can also be used for the synthesis of the double strand with the Klenow fragment.
  • LS ligation sites
  • oligonucleotides containing a primer binding site followed by a RAT and the corresponding restriction site followed by another RAT and another primer binding site can be prepared.
  • a construct is obtained having the following structure: PB-RAT restriction cleavage site RAT-PB.
  • the oligonucleotides are digested with the appropriate restriction enzyme, there will be obtained from an oligonucleotide two RATs which are modified with protruding ends for ligation.
  • the RATs can be prepared by hybridization of two random single-stranded oligonucleotides that are hybridized under stringent conditions. For RATs constructed from known sequences, this is the preferred method.
  • Nucleic acid constructs are polynucleotides which have at least one identifying polynucleotide domain which is characteristic of a nucleic acid contained in the sample and to be quantitatively determined (TAG), a polynucleotide domain with a random sequence (RAT) and at least one
  • Primer or polymerase binding site included.
  • other polynucleotide domains may be included in the nucleic acid constructs, such as sequences for labeling various samples, linker sequences, ligation sites (LS), restriction enzyme sites, or tagging enzyme binding sites (TES).
  • the tagging polynucleotide domain (TAG) and the random sequence polynucleotide domain (RAT) are covalently linked together.
  • the link can by direct ligation of the individual domains.
  • the individual domains can also be linked together via linker sequences, the linker sequence resulting from the ligation of corresponding, overhanging ends.
  • the interlinked TAG and RAT domains are eventually terminated by at least one primer or polymerase binding site
  • PB polynucleotide tag
  • RAT random sequence
  • Particularly preferred embodiment directly suitable for use in high-throughput sequencing machines.
  • a linkage via a polynucleotide linker can also be considered.
  • PBs Polymerase binding sites
  • TAGs but in particular RATs can be used, which are already provided in advance with a Primerrithsstelle (PB).
  • the nucleic acid fragments prepared for enzymatic amplification may contain, in addition to at least one characteristic polynucleotide domain (TAG), also two or more random sequence polynucleotide domains (RATs).
  • TAG characteristic polynucleotide domain
  • RATs random sequence polynucleotide domains
  • One, two or more combinations of a TAG and a RAT can be contained in a nucleic acid construct.
  • the orientation of the TAG-RAT combinations in the construct does not matter.
  • individual TAG-RAT combinations may be independently flanked by a primer or polymerase binding site (PB).
  • PBs primer binding sites
  • two primer binding sites (PBs) include all TAG-RAT combinations in a nucleic acid construct or a
  • nucleic acid constructs having the following polynucleotide domain sequence are of particular interest:
  • Nucleic acid constructs according to embodiments a), b), c), e), g) and h) are particularly preferred in the context of the present invention.
  • Nucleic acid constructs can be single-stranded or double-stranded, with single-stranded nucleic acid constructs under a primer binding site also being understood as meaning a sequence which corresponds to a primer binding site on the complementary strand, while in a double-stranded nucleic acid construct both the primer binding site and its corresponding sequence on the primer binding site Contra strand is included.
  • the nucleic acid constructs serve as templates for their enzymatic amplification by a polymerase.
  • the nucleic acid construct or precursors of this construct contains one or more binding sites for a tagging enzyme (TE).
  • a tagging enzyme site is a binding site for a type II or type III restriction enzyme cleaving away from its recognition site, preferably for EcoP15I, Mmel or Bsmfl.
  • Enzyme (TES) at the distal end to the PB sequence of the RAT the integration of the TES into a nucleic acid construct or into a corresponding construct precursor is thus preferably carried out in the domain sequence "PB-RAT-TES-nucleic acid.”
  • the product of the later cleavage of the nucleic acid construct with the TE is therefore a polynucleotide with the domain sequence PB-RAT-TES-TAG
  • the TAG can be generated first with the aid of the tagging enzyme and then the RAT at any end of the TES-TAG domain sequence
  • EcoP15l when EcoP15l is used as a tagging enzyme, it requires the presence of two head-to-tail tagging enzyme sites with the sequence CAGCAG, which include the tagging enzyme site, and preferably at a distance of less than 3,000
  • the preferred domain sequence is therefore in the case of using a type IM
  • RAT-TES constructs provided.
  • the cleavage of the construct with the tagging enzyme then results in two molecules with the domain sequence PB-RAT-TES-TAG, where the PB and TES domains may have the same or different sequence.
  • two PB-RAT-TES-T AG constructs can be used to characterize the nucleic acid molecule.
  • polynucleotide domains such as: RATs and PBs
  • RATs and PBs can then be attached to the resulting TAG to give the following particularly preferred domain sequences in the resulting nucleic acid constructs: a 1 ) PB-TES-TAG -RAT a ") PB-TAG-TES-RAT b ') PB-RAT-TAG-TES b") PB-RAT-TES-TAG c') PB - TAG - TES - RAT - PB 'c ") PB- TES-TAG-RAT-PB 'd 1 ) PB-RAT-TAG-TES-RAT d ") PB-RAT-TES-TAG-RAT e') PB - RAT - TAG - TES - RAT - PB 'e") PB-RAT-TES-TAG-RAT-PB 'f) PB -RAT-TES-TAG-RAT-PB 'f) PB - RAT
  • Primer binding sites preferably have different sequences but may also have the same sequence.
  • the preparation of the nucleic acid constructs can be carried out via circular Nukleinklare- construct precursors, wherein preferably at least one end of a nucleic acid with a marker and optionally the other end are also modified with a marker or adapter and then the circularization takes place.
  • at least one of the existing markers or adapters also has one
  • Tagging enzyme binding site particularly preferably two TES are present, in particular for the tagging enzyme EcoP15l, which cuts off a TAG on both sides of the circular construct whereby a linear nucleic acid construct according to the present invention is formed that contains two TAGs at both ends ,
  • nucleic acid constructs e.g. can be generated from circular precursors and are of particular interest for the simultaneous quantitation of both ends of nucleic acid molecules because they allow one to recognize the origin of the TAGs from the same molecule
  • Nucleic acid constructs may contain, in addition to the domain sequences according to the invention, further sequence segments, such as e.g. Linker, restriction sites, ligation sites, etc. possess, however, which are usually not explicitly mentioned in the domain sequence of the constructs.
  • RAT random sequence polynucleotide domains
  • TAGs characteristic polynucleotide domains
  • a "marker” is understood to mean polynucleotides that contain a primer binding site and a RAT, but not a tag, and markers may contain other oligonucleotide domains, such as tagging enzyme binding sites (TES) and linker and ligation sites (LS) a ligation provided end of the marker, which is located distal to the PB.
  • TES tagging enzyme binding sites
  • LS linker and ligation sites
  • Adapters in the sense of the present invention are always provided with a primer binding site and can contain further oligonucleotide domains, in particular tagging enzyme binding sites, linkers or Ligation sites, but no RATs or TAGs included.
  • the markers and adapters preferably contain different primer binding sites, which should preferably be used in the highly parallel sequencing methods according to the manufacturer's instructions. These are located at the ends of the markers or adapters distal to the TAG.
  • the individual oligonucleotide domains, such as, for example, PB, TAG and RAT, or the markers or adapters, can also be provided with further known modifications using the methods customary in the prior art, for example
  • binding to a solid phase such as by biotinylating the oligonucleotides and binding to a streptavidin-containing solid phase, or
  • capture nucleotide sequences can be used, e.g. are bound to a solid phase and can hybridize with their corresponding counter strands which are in solution, - prevent ligation to one side of an oligonucleotide, e.g. Amino-C7
  • oligonucleotide e.g. by phosphorylating the 5 'end of the corresponding oligonucleotide, or e.g. by generating sticky ends
  • Adapters can be hybridized with complementary oligonucleotides to double-stranded oligonucleotides.
  • markers can likewise be prepared, but the marker is preferably prepared by the use of a polymerase, in particular by the Klenow fragment of DNA polymerase I, as described above, in double-stranded form.
  • nucleic acid fragments having a sequence indicative of a nucleic acid occurring in the sample can be clearly identified, i.
  • Each RAT-TAG combination is high
  • the random sequence nucleic acid domain should be used. preferably be long enough to provide an excess of labels with different RATs relative to the number of nucleic acids present in the sample.
  • RAT-containing markers are used with more than twice the amount based on the nucleic acid fragments or nucleic acids to be labeled. In individual cases, however, a number of markers corresponding to the nucleic acid number to be determined may be sufficient, in particular if all RATs are guaranteed to differ in their sequence.
  • Preferred sequence lengths for the RATs contained in the nucleic acid fragments are between 2 and 100 nucleotides, more preferably between 4 and 50 nucleotides, particularly preferred RATs have a total length between 6 and 15 nucleotides.
  • the entire random sequence can be contained in a marker domain or can be divided into several marker domains or domains of different markers in a nucleic acid construct. With the described total lengths of the random sequence nucleic acid domains (RATs), theoretically a large number of markers with different RATs can be generated, whereby the marker ensemble used usually only contains a small part of the conceivable RATs resulting from the sequence length, so that the probability that random sequence-identical RATs occur in two markers is very low.
  • sequence length of the RATs can be tailored to the number of identifying nucleic acid fragments to be labeled.
  • marker mixtures with more than 10 2 markers, more preferably between 10 4 and 10 8 markers, are preferably used.
  • Amplification-prepared mixture with very high probability only once exist can be identical to a characteristic sequence-identical combinations
  • Polynucleotide domain (TAG) and a random sequence polynucleotide domain (RAT) are thus identified as copies of a distinctive polynucleotide domain of a nucleic acid originally present in the sample.
  • Polymerization errors may occur or the determination of the nucleic acid sequence is not free of errors, it is advantageous to eliminate even sequence-like RAT-T AG combinations in the evaluation. In principle, what is considered to be "sequence-like" combinations can be freely determined. How often such errors occur depends on the length of the TAGs and RATs
  • sequence-like copies are RAT-TAG sequences which have a maximum of one (1) deviation for every 10 nucleotides, preferably a sequence-like copy of RAT-T AG combinations which is not more than one deviation on 15 or 20 nucleotides
  • sequence-like RAT-TAG combinations having a sequence length of 40 base pairs should have a maximum of 4 sequence deviations if working under fault-tolerant conditions If amplification errors and sequencing errors can be largely eliminated, it is advantageous to have the error limit for "sequence-like" RAT-TAG To reduce combinations.
  • Figure 1 shows an example of four RAT-TAG combinations with a same TAG.
  • the combinations 1, 2 and 3 are different, the combination 4 is a copy of 3.
  • the TAG thus occurs three times in the sample.
  • For quantification, only one of the two same combinations will be counted, e.g. Combination 3, while Combination 4 is eliminated from the record.
  • the nucleic acid containing the TAG is preferably double-stranded, for example as cDNA or DNA, and is subsequently ligated to the double-stranded construct (s) (markers, adapters).
  • the nucleic acid to be amplified may also be single-stranded.
  • single RNA can be labeled with ligands such as T4 RNA ligase prior to amplification.
  • adapters and labels may be single-stranded or double-stranded and ligated with the ligands of the single-stranded nucleotides using appropriate ligases.
  • Double-stranded markers or adapters may be provided with a poly-N overhang (Christian Clepet et al., Improved full-length cDNA production based on RNA tagging by T4 DNA ligase; Nucleic Acids Res., 32: 6-, 2004).
  • RNA fragments are generated mechanically or with the aid of bivalent cations such as Mg 2+ and Zn 2+ , and these are ligated with markers and adapters.
  • nucleic acid constructs with other domain sequences can also be generated analogously, or the same nucleic acid constructs can be obtained with an alternative sequence of process steps.
  • double-stranded nucleic acid constructs containing eg TAGs from cDNA or Genomic DNA the double-stranded nucleic acids are provided with a marker or adapter, which can be bound to a solid phase.
  • Binding to a solid phase has the advantage that e.g. Unlabeled or unneeded nucleic acids can be removed after restriction digestion or required nucleic acids can be removed from the solid phase.
  • the binding of the nucleic acids to a solid phase is, however, dispensable for some methods.
  • markers or adapters are biotinylated and can be attached to a
  • Biotin-glycated markers or adapters can preferably also be made by using biotinylated, single-stranded oligonucleotides which have a poly-T-sequence at the 3 'end and are integrated by first and second strand synthesis beginning at the 3' end of the cDNA (as 3 The end of the cDNA is understood to correspond to the end corresponding to the 3 'end of the mRNA and is characterized by an Oligo A / T domain).
  • the digestion of the nucleic acid is carried out with one or more frequently cutting restriction enzymes.
  • frequently cutting restriction enzymes are, for example, NIaIII, Hsp92II, Fatl, Bfal, Mael, Xspl, HpyCH4IV, Maell, Tail, Tscl, AluI, Taql, BfuCl, Bsp143l, BstENII, DpnII, Kzo9l, Mbol, Ndell, Sau3AI, BstKT ⁇ or Csp ⁇ l.
  • These enzymes produce nucleic acid fragments with an average length of 200 to 300 base pairs.
  • the nucleic acids of the mixture to be quantitatively determined can be bound to a solid phase before or after this digestion, eg after ligation with biotinylated markers or adapters.
  • Alternative to digestion For example, the nucleic acids to be determined of the mixture can be comminuted by shearing before binding to the solid phase.
  • Non-solid phase bound fragments can be removed by washing.
  • the bound fragments may preferably be re-ligated with a marker or adapter that should not be biotinylated.
  • markers or adapters may be provided with the ends corresponding to the restriction site and ligated with the digested, quantitatively determined nucleic acids.
  • the other end of the adapters or markers can be protected from ligation e.g. by incorporating an amino C7 modification in the end of the marker or adapter distal to the LS.
  • nucleic acids of the mixture to be quantitatively determined are hereafter preferably in the form:
  • TAGs For quantitative analysis of gene expression, it is generally sufficient to use the cDNA ends (Torres TT, et al., Gene expression profiling by massively parallel sequencing, Genome Res. 2008 18: 172-177) as TAGs.
  • PB2 PB'-RAT marker containing a second primer binding site (PB2), wherein the distal end of the ligation site is protected from ligation.
  • PB2 primer binding site
  • the resulting nucleic acid construct is thus PB2-RAT-TAG-PB1.
  • the resulting nucleic acid constructs are amplified by means of PCR and subsequently sequenced.
  • markers or adapters Another possibility for highly parallel sequencing methods to obtain particularly suitable nucleic acid constructs is the use of biotinylated markers or adapters, their binding to a strepdavidin solid phase and the recovery of single-stranded constructs after denaturation.
  • Adapters are 5 '-posphorylated distal to the primer binding site and at the end of which the primer binding site is protected from ligation, e.g. with an amino C7
  • constructs c, d and e which are particularly suitable for pyrosequencing are obtained by subjecting the TAG, e.g. a cDNA or a genomic DNA
  • one of the single strands of the single-stranded label e.g. PB-RAT-LS or adapters, e.g. PB'-LS
  • PB-RAT-LS e.g. PB-RAT-LS
  • PB'-LS PB-RAT-LS
  • the unwanted by-products PB'-TAG-PB 'and PB-RAT-TAG-RAT-PB additionally arise.
  • the unbound fragments are first removed by washing. If the double-stranded constructs are now denatured, the fragments with two biotinylated adapters remain attached to the solid
  • nucleic acids of a mixture to be quantitatively determined are, as described above, provided with nucleic acid fragments (markers and adapters) which contain a tagging enzyme binding site (TES) and are bound at one end to a biotin molecule (eg TES).
  • TES tagging enzyme binding site
  • the nucleic acids can now be attached to a solid phase, e.g. Streptavidin-coupled magnetic particles "magnetic beads” or “beads” bind.
  • a solid phase e.g. Streptavidin-coupled magnetic particles "magnetic beads” or “beads”
  • the construct can be linked to a tagging enzyme after binding to a solid phase, e.g. BsmFI or Mmel cut.
  • fragments which are cleaved off by a tagging enzyme have the same length, provided that the markers and adapters used were likewise of equal length and the same for all molecules
  • nucleic acid fragments cleaved by the tagging enzyme can be readily determined by size, e.g. electrophoretically or by HPLC, separated and isolated. Even after ligation with a marker or adapter of a certain size, the nucleic acid fragments cleaved by the tagging enzyme can be readily determined by size, e.g. electrophoretically or by HPLC, separated and isolated. Even after ligation with a marker or adapter of a certain size, the
  • Ligation products are isolated by size. Also, the corresponding specific amplification products can be isolated.
  • End of the fixed to the solid phase nucleic acid strands are ligated.
  • any protruding ends can be filled eg with the Klenow fragment, or cleaved with a single strand-specific exonuclease, so that the tagging enzyme interface blunt ends Markers or adapters may then be attached to the fixed strand of nucleic acid, or "sticky ends" adapters or markers complementary to the end produced by the tagging enzyme may be used.
  • Nucleic acid constructs can be prepared using both a solid phase and in solution.
  • the nucleic acids or nucleic acid fragments contained in a sample are ligated at both ends with markers or adapters for this purpose.
  • the ends may be previously defined by a restriction enzyme and provided with appropriate markers or adapters.
  • the construct obtained has the following domain sequence:
  • nucleic acid fragments containing one TAG can be cleaved from the nucleic acid strands obtained after digestion with the tagging enzyme.
  • a marker or adapter is attached to the interfaces of the tagging enzymes.
  • nucleic acid constructs which, by their size, e.g. by means of
  • the nucleic acid constructs required for the amplification which contain the characteristic TAG-RAT combinations, are produced in a variety of ways can be.
  • the structure of the nucleic acid constructs can be carried out in a modular manner, for example, the individual process steps for binding or generating individual polynucleotides with the different functional domains (TAG, RAT, PB, TES) can be easily combined to obtain the desired nucleic acid constructs.
  • the method according to the invention can be used in a variety of ways and is not restricted to a specific processing of the nucleic acids contained in the sample.
  • RNA-containing sample for the production of cDNA TAGs:
  • Trizol reagent Invitrogen Corp., Carlsbad, USA
  • total RNA is recovered from a biological sample. From the total RNA is extracted with a commercial kit, e.g. "Oligtex-Midi-Kit" (Qiagen
  • the cDNA is prepared by reverse transcription using a 5'-biotinylated poly-T oligonucleotide, e.g. with the "cDNA synthesis system” (Invitrogen Corp.)
  • the product is converted to a double-stranded DNA ("cDNA synthesis system", Invitrogen Corp.) and dissolved in a suitable buffer.
  • cDNA synthesis system Invitrogen Corp.
  • the poly-T oligonucleotide used should contain the recognition sequence for EcoP151 CAGCAG or CTGCTG, e.g. 5'-biotin-TEG-PB-CAGCAGT ⁇ TTT-3 '(SEQ ID No. 1).
  • Double-stranded DNA is digested in buffered solution in a reaction solution containing a frequently cleaving restriction enzyme ("anchoring enzyme"), e.g., NIaIII After digestion, the resulting DNA is extracted, precipitated with alcohol, and taken up in a suitable buffer.
  • anchoring enzyme e.g., NIaIII
  • Biotinylated nucleic acid solution can be mixed with streptavidin-coated particles or a streptavidin-coated solid phase become.
  • the particles are incubated at room temperature in a suitable buffer to allow binding of the biotinylated DNA with the strepatvidin-coated magnetic particles.
  • the DNA bound to the particles is washed and taken up in a suitable buffer.
  • Adapters are assembled from two complementary single-stranded oligonucleotides.
  • the two single-stranded oligonucleotides are dissolved in a suitable buffer and hybridized together to form a double strand.
  • the marker containing the RAT is also first synthesized in single-stranded form and a duplex is synthesized from this template as described above using the Klenow fragment.
  • Adapters and markers are protected from unwanted ligation on the side distal to the LS by the incorporation of e.g.
  • the double-stranded marker or adapter can now be ligated with a ligase, e.g. T4 ligase (Invitrogen Corp.) in a suitable buffer covalently linked to a 3 'end of another polynucleotide or nucleic acid from the sample or fragment thereof containing the TAG and bound to a solid phase.
  • a ligase e.g. T4 ligase (Invitrogen Corp.) in a suitable buffer covalently linked to a 3 'end of another polynucleotide or nucleic acid from the sample or fragment thereof containing the TAG and bound to a solid phase.
  • markers and adapters are to be ligated, they are preferably added in a sufficiently large amount so that all free ends of the nucleic acid strands to be constructed are also ligated with the polynucleotides.
  • the nucleotides to be quantified are provided with a tagging enzyme, eg BsmFI, Mmel, EcoP151, incubated with an adapter or marker containing a TES.
  • a tagging enzyme eg BsmFI, Mmel, EcoP151
  • the cleaved nucleic acid fragments are either isolated by electrophoresis or HPLC, or are bound (using appropriate markers or adapters) to a solid phase. If additional markers or adapters are to be connected to the tagging enzyme interface, the interface is not smooth Interface, the overhanging end can be filled in or cleaved off with an exonuclease.
  • the Klenow fragment of DNA polymerase I can be used.
  • PCR-based amplification methods are used for amplification of the nucleic acid constructs.
  • one-directional amplification or cloning methods for amplifying the nucleic acid constructs can also be used.
  • sequence of individual nucleic acid fragments obtained by amplification in a mixture is preferably determined by suitable sequencing methods.
  • suitable sequencing methods are commercially available, e.g. "454" -Picoliter method, with the GSFLX system (Roche Diagnostics, Germany), Solexa method, (Illumina
  • the part of the construct to be sequenced in a preferred embodiment should not exceed a length of 800, better 400 nucleotides.
  • Preferred nucleic acid constructs have a length between 15 and 150 base pairs, more preferably between 25 and 75 base pairs.
  • sequence data can be sequenced down to the entire nucleic acid sequences.
  • the RAT and TAG sequence of the amplified nucleic acid constructs are determined and the determined sequences of the TAG-RAT combination are compared with one another. Sequence-identical or sequence-like TAG-RAT combinations are counted only once to determine the nucleic acid composition of the sample.
  • the sequence data can be recorded and evaluated very efficiently with a suitable computer program.
  • Figure 1 shows an example of four RAT-TAG combinations with a same TAG.
  • Fig. 2 shows schematically the preparation of nucleic acid constructs from mRNA for the quantitative study of gene expression. In Fig. 2, steps 1.1 to 1.3, the linear amplification using a
  • T7 promoter PB '
  • a marker with the domain sequence PB'-PB-RAT-Pol-T 1 where PB 1 contains the promoter sequence for a T7 or SP6 RNA polymerase is hybridized with the poly A end of the mRNAs in the sample .
  • the free 3 'end of the poly-T sequence then serves as a starting point for a reverse transcription (first-strand synthesis: Fig. 2, step 1.1).
  • first-strand synthesis Fig. 2, step 1.1
  • second-strand synthesis for example using oligohexamers
  • a double-stranded cDNA is produced therefrom (step 1.2).
  • From the cDNA can then be carried out using the T7 polymerase a linear amplification for the production of antisense RNA (aRNA) (step 1.3).
  • the obtained aRNA can then be transformed into the corresponding one by using "random hexamers" as a primer by reverse transcription
  • DNA first strand are rewritten (step 1.4), it is the corresponding amplified, single-stranded cDNA obtained.
  • the corresponding DNA first strand can then be amplified (step 1.6.1), wherein biotinylated primer binding sites can also be used (step 1.6.2).
  • the resulting double-stranded constructs can then be used e.g. as in Fig. 3
  • Step 3-5 (Step 3-5).
  • steps 2-4 an amplification of mRNA by the so-called SMART method is shown.
  • FIG. 3 schematically shows the production of nucleic acid constructs from genomic DNA using the example of digital karyotyping.
  • the present genomic DNA using a methylation-sensitive
  • the fragments obtained preferably have overhanging ends, so that can be ligated to the corresponding restriction sites of genomic DNA markers of the form biotin PB RAT, which have appropriate Ligationssstellen distal to the primer binding site (step 2 ).
  • the nucleic acid construct precursors obtained can then be digested with a further restriction enzyme (step 3).
  • an adapter containing a second primer binding site (PB ') can then be ligated to the bound fragments via the corresponding sticky ends
  • the nucleic acid constructs thus obtained can then be amplified and sequenced
  • the first enzyme is replaced by a methylation-sensitive enzyme
  • steps 5-8 tagging enzyme binding sites can also be used
  • markers which are biotinylated in the present case and adapters are used for the construction of the nucleic acid constructs, and then the nucleic acid constructs shown in step 5.
  • Short tag TAGs are then cut from the nucleic acid by adding the tagging enzyme (step 6). If these projecting ends have the obtained fragments, then e.g. filled with the Klenow fragment.
  • the adapter-containing fragments in solution can then be ligated with markers to the corresponding nucleic acid construct via its blunt ends (step 7.1) and then amplified.
  • the amplified nucleic acid construct can then be electrophoretically purified and sequenced, for example
  • the solid phase-bound fragment can be further processed into the desired nucleic acid construct by ligating the blunt end to an adapter containing a second primer binding site (step 7.2).
  • the bound nucleic acid construct can be directly amplified and subsequently sequenced.
  • Combinations for the reliable quantitative determination of a nucleic acid composition in a sample can be integrated into known methods, but it also enables new methods for the determination of the compositions of nucleic acid strands.
  • the methods are enriched by the possibility of accurately reproducing changes in the composition of the nucleic acid strands due to amplification.
  • linear amplification is to increase nucleic acids such that the relative composition of a sample of nucleic acid is altered less than is the case with exponential PCR amplification, but also in the "linear amplification" of RNA sequence-related
  • RNA polymerases such as T7, SP6, or T3
  • the marker may be e.g. single or double stranded RNA are ligated (US 6,916,633) e.g. to the 5 'end of the RNA. Thereafter, a first-strand synthesis may take place using a poly-T primer followed by the second-strand synthesis, e.g. with the help of the primer, matching the PB present in the marker.
  • the oligo-dT primer can be a marker of its PB from a polymerase binding site
  • the second strand synthesis can then for example, with oligohexamers (Dafforn et al., Biotechniques, 2004 Nov; 37 (5): 854-7).
  • the later, double-stranded cDNA then has the domain structure "cDNA oligo A / T promoter". Changes in the nucleic acid composition after amplification and sequencing can be detected if a RAT is integrated between the promoter and the DNA to be amplified. The resulting domain structure is in this case
  • promoter sequence can also serve as a primer binding site simultaneously.
  • it may also have a separate Primerrithsstelle (PB) in addition to the
  • Promoter polymerase binding site
  • a construct is chosen which, instead of the respective promoter, a primer binding site (PB) and / or for the use of Typlll restriction enzymes how Ecop15l contains a TES in later procedural steps.
  • PB primer binding site
  • Typlll restriction enzymes how Ecop15l contains a TES in later procedural steps.
  • a corresponding domain structure is then: cDNA Oligo-A / T-TES-RAT-PB
  • the following two preferred methods can also be used to quantify TAGs derived from the 3 'ends of a cDNA containing the poly A moiety.
  • mRNA is transcribed with a poly-T-containing marker poly-T-RAT-PB-biotin by first and second strand synthesis in cDNA.
  • the cDNA is then digested with one or more frequently cutting enzymes (anchoring enzymes).
  • Marker-containing fragments are then added to a streptavidin-modified matrix, e.g. bound magnetic particles. Unbound fragments are removed by washing. Following is ligation with an adapter containing a ligation site at the distal end of the primer binding site, e.g. is protected from ligation by an amino-C7 modification, and ligation is e.g. is favored by overhanging DNA ends of the ligation site. After removal of the non-ligated adapters, the resulting nucleic acid constructs can be amplified and sequenced. In the preferred variant of this method, a marker is used instead of the adapter in the method described above. In this case, it is not necessary to reconstitute the mRNA with a poly-T-containing RAT.
  • Rewrite oligonucleotide but with a conventional, for example, 5 'biotinylated poly-T oligonucleotide.
  • mRNA is synthesized using a 5'-biotinylated poly-T
  • Oligonucleotide with an EcoP15I binding site (EcoP15ITES) before the poly-T sequence, transcribed into cDNA. Thereafter, the digestion with a frequently cutting restriction enzyme (anchoring enzymes), eg with NIaIII.
  • anchoring enzymes eg with NIaIII.
  • the cut cDNA is bound by the biotin group to a streptavidin matrix, eg streptavidin-coated magnetic particles.
  • the oligo-dT may be bound to the matrix prior to cDNA synthesis or Digestion with the anchoring enzymes should take place only after binding to the particles. The unbound fragments are removed by washing.
  • ligation is performed with a double-stranded PB'-EcoP15ITES oligonucleotide (adapter).
  • the resulting nucleic acid strands are then digested with EcoP15l and the cleaved fragments after a
  • the adapter TAG constructs can now be ligated with a marker.
  • the resulting nucleic acid constructs have the following domain sequence:
  • a label containing a RAT domain is used and a primer attachment site (adapter) is ligated in place of the previously used marker.
  • the construct which is released after Ecop15l digestion then has e.g. the structure:
  • RATs can be attached to the 5' end of mRNA.
  • the 5 1 ends of eukaryotes are modified with a so-called CAP structure consisting of a guanine nucleotide that is characterized by an unusual 5'- to 5'-triphosphate binding is bound to the mRNA.
  • CAP structure consisting of a guanine nucleotide that is characterized by an unusual 5'- to 5'-triphosphate binding is bound to the mRNA.
  • methods for attaching a RAT can be used (Clepet et al., Improved full-length cDNA production based on RNA tagging by T4 DNA ligase, Nucleic Acids Research, 2004, Vol. 1 e6).
  • RNAs are first treated, for example, with alkaline phosphatase. "Transcripts with an intact 5" CAP sequence are not dephosphorylated by these enzymes. while broken mRNA molecules and noncoding RNAs lacking CAP- are dephosphorylated and terminate in place of the phosphate group with a 5'-OH group to which no RNA oligonucleotides can be ligated.
  • the CAP is then enzymatically removed, for example with the aid of "tobacco acid phosphatase", whereby the 5 'phosphate group is released, which is then released for the
  • RNA oligonucleotide Ligation of an RNA oligonucleotide is available.
  • This oligonucleotide of known sequence later serves as a primer binding site (PB) for the second-strand synthesis of the cDNA.
  • PB primer binding site
  • the sequence of the RNA oligonucleotide should be chosen such that the later RNA construct has the domain sequence 5'-PB-RAT-mRNA-3 '.
  • a (T7 polymerase) promoter sequence can be inserted into this construct which can then serve as a polymerase binding site and simultaneously as a primer binding site (PB). The corresponding domain structure is then
  • steps 2 to 4 This can be used as a binding site for an oligonucleotide primer, where, for example, to insert the RAT, an oligonucleotide having a primer binding site at the 5 'end, followed by a RAT which in turn has three consecutive guanine bases on the 3' 'End terminus used as primers for the second strand synthesis of the cDNA.
  • Nucleic acid construct containing at least one PB or a promoter sequence, such as of SP6, T3 or T7
  • a RAT and optionally a TES to those according to Dephosphorylation and removal of CAP-site released ⁇ 'phosphate group bound.
  • the corresponding single-stranded RNA construct then preferably has the form
  • Second strand synthesis with a 5 'biotinylated primer matching the primer binding site results in the construct:
  • the product can be cut immediately. While the unbound portion of the cDNA can be washed away, the solid-phase construct remains in a domain-order construct
  • a TAG in the context of the invention by mechanical comminution of the cDNA or treatment with a non-specific endo- or
  • PB primer binding site
  • adapter or marker can be bound to the 3 'ends released after digestion or comminution.
  • This construct which has a defined length in the case of using a tagging enzyme, can then be amplified and sequenced by amplification from the two PBs contained therein.
  • the restriction enzyme site or the free end which is distal to the biotin group, and which is formed by the non-specific endonuclease or mechanical comminution is preferred.
  • Such constructs can be amplified by PCR, identified by their defined size, and isolated (e.g., by gel electrophoresis, HPLC), and after sequencing and detection of the multiple TAG-RAT combinations, the original composition of the TAG mixture can be determined.
  • streptavidin-coated magnetic particles are preferably used as the solid phase.
  • Streptavidin-coated reaction vessels are also preferred.
  • PB and PB 1 preferably do not have the same sequence.
  • PCR linear amplification with only one primer or by "rolling circle amplification” (Demidov, Nat. Genet. 1998, 19 (3), 225-232)., Starting from the PB domains. To determine population using RATs, at least one end can be provided with a marker containing a PB domain.
  • PB and PB can have both complementary, overhanging single-stranded ends, which are particularly suitable for circularization as well as blunt ends.
  • the ligation for circularization of the molecules is preferably carried out in sufficiently high dilution, so that the probability that an end of the same From the molecules thus circularized, either enzymatically or by mechanical comminution, constructs can be obtained which contain one TAG from each end of the molecule form:
  • size selection may e.g. by HPLC or gel electrophoresis, or one or more tagging
  • the TES is preferably part of an adapter together with the PB.
  • RNA molecules in eukaryotic cells as well as almost all bacterial and viral RNAs, unlike protein-encoding eukaryotic mRNAs, none
  • S'-poly-A sequence are preferably first ligated with a single- or double-stranded RNA or DNA oligonucleotide of known sequence, which can later serve as a primer binding site.
  • a first step e.g. non-phosphorylated oligonucleotides using various ligases, e.g. with the T4 RNA ligase targeted to the phosphorylated
  • an oligonucleotide (marker and adapter) containing a RAT and a PB can be specifically ligated to both ends of an RNA.
  • RATs can be ligated to non-protein coding RNA and subsequently transcribed into DNA, amplified and sequenced.
  • Corresponding constructs have the domain sequence:
  • RNA can be artificially provided with a poly (A) polymerase at the 3 'end of the RNA using a poly (A) polymerase.
  • RNAs that do not encode proteins generally do not have a CAP structure, it is not possible to differentiate between full-length RNAs and fractional molecules in terms of process technology.
  • a method for the quantitative determination of DNA-protein bonds is based on a preparation of the sample by immunoprecipitation. Such methods are often used for the determination of binding sites for transcription factors (eg, "chip-seq” methods) in which, for example, genomic DNA that is not deprotected is digested enzymatically with a restriction enzyme or a non-specifically-cutting endonuclease, or otherwise (eg by ultrasound) .
  • the DNA / protein complexes are separated by immuno-
  • Precipitation with an antibody to a specific protein precipitated.
  • the co-precipitated DNA bound to the protein is freed from all proteins and brought into a quantifiable form by RATs with or without tagging enzyme.
  • markers and optionally adapters are ligated with the ends of the precipitated DNA fragments, the nucleic acid constructs contained are amplified and subsequently sequenced. As a result, the amount of copies of a particular genomic DNA sequence, eg in a tissue sample, to which or in the vicinity of which the protein was bound is obtained.
  • DK Digital karyotyping
  • the DNA to be examined is first digested with a (methylationinsensitive) restriction enzyme. Now biotinylated markers or adapters can be ligated. The sample is then digested with a second, frequently cutting (methylation-insensitive) restriction enzyme and ligated to the resulting interface marker or adapter.
  • the resulting constructs must be provided with at least one marker and can thus be amplified and sequenced.
  • markers or adapters are equipped with TES, a tagging enzyme can be used and, after binding to a solid phase, either the bound or unbound Marker-TAG or Adapter-TAG combination can be purified and fitted with another marker or adapter, as described above that each marker with an adapter (or marker) includes a tag.
  • markers and adapters are provided with a TES, in particular for EcoP15l, as provided in a preferred version, bound and unbound marker TAG and adapter TAG combinations can also be ligated together, so that two tags are enclosed by marker and / or adapter become.
  • genomic DNA The following is a particularly preferred variant of the analysis of genomic DNA, which describes the use of the tagging enzyme EcoP15l to prepare nucleic acid constructs for the quantitative determination of genomic DNA according to the method of the invention.
  • the DNA is in a preferred method as previously described first with one or more
  • Digested restriction enzymes For the analysis of DNA derived from immunoprecipitated material, it may also be e.g. mechanically sheared by shearing or ultrasound.
  • Oligonucleotide 1 (adapter or marker) ligated, which has a distal sequence to the biotinylated end a cut sequence for a restriction enzyme, wherein after the restriction digestion with the corresponding enzyme ligation site (LS1) is formed with an overhanging Einzeslstrangende.
  • LS1 restriction digestion with the corresponding enzyme ligation site
  • oligonucleotides (markers or adapters) are used. The ends of the minced DNA are also blunted prior to ligation with the Klenow fragment.
  • the adapter contains a primer binding site (PB1) at the biotinylated end.
  • the oligonucleotide 1 For the use of EcoP15l as a tagging enzyme, the oligonucleotide 1 must also carry the sequence 5'-CAGCAG'-3 '(TES) in front of the ligation site. After binding to a streptavidin-modified solid phase and washing to remove unbound fragments is digested with another enzyme.
  • Preferred are restriction enzymes which have as many restriction sites as possible in the DNA to be analyzed, e.g. NIaIII, Dpnll, Taq1, Fatl, Sau3A, Mbol etc. are used.
  • another oligonucleotide is ligated to the bound DNA.
  • Oligonucleotide 2 contains a further recognition sequence for the restriction enzyme EcoP15I (5'-CTGCTG-3 '(TES)) followed by a restriction enzyme cleavage site, which after restriction digestion yields a ligation site (LS2). Ligation takes place with those produced by digestion with the corresponding frequently cutting restriction enzyme
  • Oligonucleotide 2 is also protected from ligation at the distal end of the LS, eg by an amino-C7 modification.
  • the described process results in the following product:
  • oligonucleotide 3 After digestion with the tagging enzyme EcoP15l, 25-27 bp TAGs are generated. These can now be ligated with another oligonucleotide 3.
  • This oligonucleotide has the construction RAT-PB2, with ligation only via the free end of the RAT, since the free end of the PB2 is preceded by a ligation, e.g. protected by an amino-C7 modification.
  • the bound nucleic acid constructs After washing the solid phase, the bound nucleic acid constructs are detached from the solid phase, resulting in the following construct which is particularly suitable for high-throughput sequencing:
  • the RAT can also be integrated in the oligonucleotide 1 containing PB1, giving rise to the product PB2-TAG-LS1-CAGCAG-RAT-PB1 or PB2-RAT-TAG-LS1-CAGCAG-RAT-PB1.
  • MSDK Methylation-specific digital karyotyping
  • the DNA regions of the organisms which are suitable for the analysis can optionally be enriched (for example via a
  • Hybridization with specific oligonucleotides and provided with a RAT as previously described.
  • the amplification of the circular molecule starts from the primer binding sites (PB), whereby in (1) the primers are at least partially complementary to one another and are each a strand of PB. In (2), there are two different primer binding sites, and the amplification from the primers that bind to them occurs in opposite directions. In both cases, circular molecules are formed, which after intersection with the TE, the domain sequence
  • Binding primer binding site (s) such that, for example, constructs with the sequence of domains shown in cc) to ff) are formed: cc) PB "-TAG-TES-RAT-PB-RAT-TAG dd) PB" -TAG -TES-RAT-PB-RAT-TAG-PB "ee) PB" -TAG-TES-RAT-PB-PB 1 -RAT-TAG-PB "and ff) PB ⁇ TAG-TES-RAT-PB-PB ⁇ RAT-TAG-PB 1 "
  • Another object of the present invention is a marker ensemble for the quantitative determination of nucleic acids, wherein the marker contained in each case comprise an artificial polynucleotide domain with mutually different random sequence and a primer binding site.
  • Preferred marker ensembles include markers which additionally contain a binding site for a tagging enzyme, wherein the tagging enzyme binding site lies at the distal end to the primer binding site of the marker.
  • Example 1 Use of RATs for Quantification of mRNAs.
  • the use of the RATs for the quantification of mRNAs in a preferred method is described by way of example.
  • the mRNA is first transcribed into a cDNA. Then, from virtually every cDNA
  • the resulting nucleic acid construct is then amplified and sequenced.
  • RNA synthesis with an oligo-dT primer (PolyT oligonucleotide): Using a commercial Trizol reagent kit (Invitrogen Inc.), approximately 1 mg total RNA is recovered from a biological sample (an MW leukemia cell line). From the total RNA, with a commercially available kit ("Oligotex
  • CDNA synthesis system (Invitrogen Corp.) prepared using the following, at the 5 'end biotinylated oligonucleotide, which contains the
  • the product is then converted to a double-stranded DNA (cDNA synthesis system, Invitrogen Corp.) and into 20 ⁇ l of LoTE buffer (3 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.2 mM
  • the double-stranded cDNA (20 ⁇ l) is digested in a 200 ⁇ l reaction solution containing 50 units of DpnII (New England BioLabs Ine, Ipswich, UK; NEB) at 37 ° C for 90 minutes.
  • DpnII New England BioLabs Ine, Ipswich, UK; NEB
  • an adapter containing the recognition sequence for the tagging enzyme This is composed of the following single-stranded oligonucleotides A and B: Oligonucleotide B contains an amino C7 modification at the 3 'end to prevent unwanted ligation at this site and is phosphorylated at the 5' end to facilitate ligation on this side enable.
  • the linker contains the recognition sequence for the tagging enzyme EcoP151 (CAGCAG). The result is a double-stranded linker with a 5 'GATC overhang that can be ligated to the DpnII restriction site.
  • the MP are carefully mixed, heated to 5O 0 C for 2 minutes and cooled at room temperature for 15 minutes.
  • 2 ⁇ l of T4 ligase (5 U / ⁇ l, Invitrogen, Corp.) are added to the ligation mix and the sample is incubated at 16 ° C for 2 hours, every 20 minutes we gently mix the sample.
  • the unbound linkers are removed from the MP by washing 4 times with 300 ⁇ l of 1X B & W.
  • the MPs are transferred to a new tube and washed once more with 300 ⁇ l 1X B & W and then 2x with 1x NEB3 buffer (New England Biolabs, Inc., NEB) and taken up in 300 ⁇ l NEB3 buffer.
  • reaction preparation 10 ⁇ l 10X buffer NEB3 10 ⁇ l 10 mM ATP (NEB) 2 ⁇ l EcoP15I (NEB) 1 ⁇ l 100X BSA (NEB) 77 ⁇ l H 2 O
  • the 300 ⁇ l of NEB3 buffer of the MP + cDNA + linker mixture is replaced in the MPC by the 100 ⁇ l reaction mixture.
  • the sample is incubated at 37 ° C. for one hour with repeated careful mixing.
  • the MPs are held to the vessel wall, while the supernatant can be removed and transferred to a new vessel.
  • the supernatant contains the linker TAGs of 50 bp in length (linker + TAG).
  • the single-stranded marker with the following sequence:
  • the double-stranded F ⁇ AT-containing marker is equilibrated by TE
  • ethanol precipitated and dissolved in 50 ⁇ l of LoTE.
  • the batch is incubated at 16 ° C for 2 hours.
  • a 25-cycle PCR is performed to determine the most suitable concentration for amplification.
  • the 20 ⁇ l PCR reactions are added for initial denaturation of the template DNA for 2 minutes
  • the PCR products are applied to an 8% polyacrylamide gel.
  • the products of the preparative PCR are reapplied to an 8% polyacrylamide gel and the gel piece with the 79 base pair (bp) band excised with a scalpel.
  • the gel piece is comminuted with a pestle in a 1.5 ml Eppendorf tube and dissolved in 500 ⁇ l of an eluting solution (0.5%).
  • the concentration and quality of the PCR product is determined by gel electrophoresis.
  • an aliquot of the purified RAT-linker-tag construct into the pGEM ® -T Easy vector (Promega) is ligated into the E. co // - strain DH ⁇ alpha transformed, white colonies selected and 5-10 RAT-Linker-TAG constructs containing plasmids sequenced by the Sanger method. Seven of the typical sequences obtained with different PB-RAT-TAG-LS-TES-PB 'constructs are listed below. Each TAG is clearly marked with a RAT. The RAT domains of the constructs are marked bold, the TAG
  • Table 1 Tabular summary of the results of the BLAST search

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Nukleinsäuren in einer Probe, insbesondere zur quantitativen Bestimmung von Gen-Transkripten, wie z.B. mRNA, cDNA, microRNA, non-codingRNA sowie die Bereitstellung von Markern zur Durchführung der Analyseverfahren.

Description

Verfahren zur quantitativen Analyse von Nukleinsäuren, Marker dafür und deren Verwendung
Beschreibung:
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Nukleinsäuren in einer Probe, insbesondere zur quantitativen Bestimmung von Gentranskripten, genomischer DNA oder genomischen Nukleinsäureabschnitten, wie z.B. DNA, RNA, mRNA, cDNA, microRNA, non-codingRNA, Aptamer-DNA und -RNA, sowie die
Bereitstellung von Markern zur Durchführung der Analyseverfahren.
Die Quantifizierung von Nukleinsäuren hat große wissenschaftliche und kommerzielle Bedeutung in allen Bereichen der Lebenswissenschaften. So ist zum einen wichtig zu wissen, welche Genprodukte (z.B. für Proteine kodierende und nicht-kodierende RNA) wie häufig vorkommen (Genexpression-Studien), zum anderen wie die Transkription reguliert wird, z.B. durch epigenetische Eigenschaften der genomischen DNA. Zudem ist die Bestimmung der Häufigkeit von Kopien von Genabschnitten zur Karyotypisierung eine wichtige Diagnosemöglichkeit von Krankheiten wie z.B. Krebs.
Dieser Bedarf hat zur Entwicklung verschiedener Verfahren geführt, die in der Regel entweder auf der unspezifischen Messung der Gesamtmenge aller oder bestimmter Nukleinsäuren durch z.B. photometrische Methoden (Gesamt-RNA oder DNA) beruhen, oder es sollen eine Vielzahl verschiedener Nukleinsäure-Moleküle bestimmter Sequenz individuell quantifiziert werden. Die dazu verwendeten Methoden können grundsätzlich in zwei Gruppen eingeteilt werden: Die erste Gruppe bilden Verfahren, die schon bekannte oder anderweitig charakterisierte Sequenzen quantifizieren können. Sie basieren in der Regel auf der Bindung der zu quantifizierenden Nukleinsäuren an bekannte oder anderweitig charakterisierte
Sequenzen, die an eine feste Oberfläche gebunden sind. Beispiele sind alle Formen des Southem-Blots, Northern-Blots oder sogenannte DNA- oder RNA-Micro-Arrays (Chips).
BESTATIGUNGSKOPIE Die zweite Gruppe bilden Verfahren, die auf der Quantifizierung der Nukleinsäuren durch Sequenzierung möglichst vieler individueller Nukleinsäure-Moleküle und Auszählen der sequenzierten Moleküle im Gemisch beruhen. Da in der Regel mehr Nukleinsäuremoleküle im Gemisch vorhanden sind, als sequenziert werden, wird so die relative Häufigkeit einer Nukleinsäure bestimmter Sequenz im Gemisch erhalten.
Die hier vorgestellte Erfindung verbessert die Sicherheit und Genauigkeit der Quantifizierung von Nukleinsäuren durch nahezu alle auf Sequenzierung und Auszählung basierenden Verfahren. Darunter fallen sowohl so genannte „Tag"- basierte Verfahren, wobei der Tag ein für die Nukleinsäure möglichst repräsentatives
Teilstück darstellt, anhand dessen die Nukleinsäure identifiziert werden kann, als auch Verfahren, bei der die Anzahl kompletter DNA- und RNA-Moleküle wie etwa die von Viren bestimmt wird.
Sequenz-basierte, quantitative Verfahren finden aufgrund der Entwicklung von
Techniken zur gleichzeitigen Sequenzierung von Hunderttausenden bis Millionen von Nukleinsäure-Molekülen, immer breitere Anwendung und ersetzten qualitative, Array-basierten Verfahren in vielen Bereichen. Deshalb wird die Sequenz-basierte Quantifizierung in Zukunft einen immer höheren Stellenwert erhalten. So findet z.B. die Analyse von RNA-Bruchstücken („RNA-seq" und „mRNA-seq") zunehmend
Anwendung (z.B. N. Cloonan and S. M. Grimmond: 2008, Transcriptome content and dynamics at single-nucleotide resolution, Genome Biology 2008, 9:234). Eine Liste weiterer Sequenz-basierten Quantifizierungsmethoden für Nukleinsäuren findet sich in S. M. Wang (2007) Understanding SAGE data, Trends in Genetics 23: 42-50. Im Einzelnen gehören dazu:
- "Serial analysis of gene expression" (SAGE, V.E. Velculescu et al., Serial analysis of gene expression, Science 270 (1995), pp. 484-487, US-Patent 5,695,937): SAGE erleichtert die globale, quantitative Charakterisierung eines Transcriptoms indem es ein Typ-Il Restriktionsenzym (ßsmFI) als "Tagging Enzym" verwendet, um aus einer cDNA ein 14-Bp langes Fragment, den sogenannten "Tag" hinter der am weitesten zum 3'-Ende gelegenen Schnittstelle für ein häufigschneidendes Restriktionsenzym (meist hinter der Malll-Schnittstelle CATG) herauszuschneiden. Bei SAGE werden jeweils 2 Tags Kopf-an Kopf zu so genannten Ditags zusammenligiert, die dann zu längeren Ketten ("Konkatemere") verbunden ("konkatemerisiert") werden. Diese Konkatemere werden dann kloniert und sequenziert. Die Tags repräsentieren die Ausgangs-mRNA-Moleküle.von denen die cDNA generiert wurde. Daher stellt die Menge der sequenzierten Tags ein Maß für die relative Häufigkeit dar, mit der die mRNA im mRNA-Gemisch vertreten war. Heute kann man auf Konkatemer-Bildung und Klonierung verzichten, weil die Ditags nach einer PCR direkt mit hochparallelen Sequenziertechniken sequenziert werden können (z.B. Nielsen KL, Hogh AL, Emmersen J., Nucleic Acids Res. 2006; 34(19): e133. DeepSAGE-digital transcriptomics with high sensitivity, simple experimental protocol and multiplexing of samples bzw. Gowda M. et al., Nucleic Acid Research, 2006, Vol. 34, No. 19, e126, Robust analysis of 5'-transcript ends (5'-RATE): a novel technique for transcriptom analysis and genome annotation). - "LongSAGE" (S. Saha et al., Using the transcriptome to annotate the genome, Nat. Biotechnol. 20 (2002), pp. 508-512) wurde entwickelt um die Spezifität der nur 14
Bp langen SAGE-tags zu erhöhen, indem hier durch Verwendendung eines anderen Typ-Il-Restriktionsenzyms (Mmel) 21 Bp lange tags generiert werden. Dadurch wird die Zuordnung zu genomischen oder EST-Sequenzen verbessert. Die Quantifizierung mit dem SAGE-Verfahren und insbesondere mit der LongSAGE ist problematisch, so ist es z.B. oft nötig vermehrungsbedingte Verfälschungen der
Quantifizierung durch biostatistische Analyseverfahren (z.B. Emmersen, J. et al., BMC Bioinformatics 2007, 8:92) zu beheben. Diese Verfahren beruhen jedoch auf statistischen Annahmen und können daher die tatsächliche relative Häufigkeit derTags in einer Probe nur ungefähr abschätzen. - "SuperSAGE" (H. Matsumura et al., Gene expression analysis of plant host- pathogen interactions by SuperSAGE, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 100 (2003), pp. 15718-15723; H. Matsamura et al., Celular Microbiology (2005) 7(1 ), 11-18) bringt durch Verwendung des Typ-Ill-Restriktionsenzyms EcoP15l als Tagging-Enzyme 25- 27Bp lange Tags hervor, die neben der weiter verbesserten Zuordnung zu anderen Sequenzen weitere Vorteile besitzen. Die mit dem SuperSAGE Verfahren erhältlichen Tags können auch zur Untersuchung der Genexpression unter Verwendung von Arrays verwendet werden (US 2007/0172854) - "Cap analysis gene expression" (CAGE1 T. Shiraki et al., Cap analysis gene expression for high-throughput analysis of transcriptional starting point and identification of promoter usage, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 100 (2003), pp. 15776-15781 ) wurde entwickelt, um Transcript-Initiationssequenzen und Promotoren zu identifizieren. Bei dem Verfahren werden 21 Bp lange Fragmente isoliert und sequenziert, die direkt an die 5'-CAP-Sequenz einer mRNA anschließen.
- "Gene identification signature" (GIS, CL. Wei et al., 5' Long serial analysis of gene expression (LongSAGE) and 3' LongSAGE for transcriptome characterization and genome annotation, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 101 (2004), pp. 11701-11706) dient dazu, gleichzeitig die 5'-und 3'-Enden von mRNAs zu bestimmen. GIS-Tags sind 20 Bp lang und können dazu verwendet werden, die Enden eines Gens im Genom zu identifizieren.
-„Digitale Karyotypisierung" DK; (T.L. Wang et al., Digital karyotyping, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 99 (2002), pp. 16156-16161 ) adaptiert das LongSAGE-Protokoll um 21 Bp-tags aus genomischer DNA zu gewinnen. Damit lässt sich die krankhafte
'Vermehrung oder der Verlust bestimmter Chromosomenabschnitte sowie Insertionen und Fremd-DNA z.B. in Krebszellen genau bestimmen (J.T. Park et al., Notch3 gene amplification in ovarian cancer, Cancer Res. 66 (2006), pp. 6312- 6318). - „Methylierungsspezifisches Digitales Karyotypisieren"(MSDK) (Min Hu et al.,
Methylation-specific digital karyotyping Nature Protocols 1 , - 1621 - 1636 (2006)) wendet das Prinzip des Digital Karyotyping für die quantitative Bestimmung unterschiedlicher Methylierungszustände zweier Proben an.
- "Paired-end ditag" (CL. Wei et al., A global map of p53 transcription-factor binding sites in the human genome, Cell. 124 (2006), pp. 207-219) zielt darauf ab, Proteinbindende Sequenzen im Genom zu identifizieren. Dabei wird das Prinzip von GIS dazu verwendet, Tags von beiden Enden eines DNA-Fragments zu isolieren und zu quantifizieren, die an ein bestimmtes Protein (z.B. einen Transkriptionsfaktor) gebunden sind, das zusammen mit der gebundenen DNA durch Immuno- Präzipitation spezifisch aus dem Protein-DNA-Gemisch gefällt wird. Paired-end ditag wurde verwendet, um p53-Biπdestellen im Menschgenom zu identifizieren. - Metagenomische Analysen verfolgen das Ziel, die Zusammensetzung einer komplexen Mischung von Organsimen zu ermitteln Dabei werden dieselben Verfahren wie bei der Digitalen Karyotypisierung verwendet. Krause et al., Phylogenetic Classification of Short environmental DNA fragments, Nucleic Acids Res. 2008 April; 36(7): 2230-2239.
In US 2008/0108804 wird ein Verfahren zur 5'-Modifizierung von RNAs und zur Herstellung von DNAs daraus beschrieben, wodurch eine Sequenzinformation eingeführt wird, die zur qualitativen Identifizierung der Herkunft einer Probe oder zur Immobiliserung einer RNA bzw. DNA durch Hybridisierung dienen kann. Weiterhin wurde ein spezielles Verfahren zur Erzeugung von 5'-chimären cDNAs beschrieben, die insbesondere zur Untersuchung der globalen Gen- bzw. Proteinexpression geeignet sind (WO 2004/015085)
In allen beschriebenen Verfahren reicht die zur Verfügung stehende Menge an
Nukleinsäuren einer Probe meist nicht für alle nachfolgenden Analysen aus. Darum ist vor der Analyse fast immer eine Vermehrung des Materials notwendig. Beispielsweise benötigen hochparallele Sequenzierverfahren in den verschiedenen Hochdurchsatz-Sequenziermaschinen (z.B. das „454" Picoliter Verfahren von Roche Diagnostics, Deutschland, oder das Solexa-Pyrosequenzierverfahren der Firma
Illumina, Inc., San Diego, USA) 5-3000 ng DNA. Zudem benötigen die Verfahren spezifische Sequenzen (Adapter) an beiden Enden der zu sequenzierenden Nukleinsäure, die als Primerbindungsstelle dienen. Um das Vorhandensein dieser spezifischen Sequenzen an allen zu sequenzierenden Molekülen zu gewährleisten, wird in der Regel die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) benutzt, wobei
Oligonukleotide die den Adaptersequenzen komplementär sind, als Primer Verwendung finden. Auch für eine Klonierung der Fragmente ist oft ihre vorhergehende Amplifikation notwendig.
Die Amplifikation, z.B. mittels PCR, birgt jedoch die Gefahr, dass bestimmte
Nukleinsäuren präferentiell vermehrt werden. So werden kürzere Nukleinsäuren bevorzugt amplifiziert, aber auch die individuelle Basenabfolge kann die Effizienz der Amplifikation beeinflussen. Dadurch kann die relative Häufigkeit einer Nukleinsäure in einer Nukleinsäurepopulation vor und nach der Amplifikation stark voneinander abweichen wie z.B. bei der RNA Anaylse mittels RNA seq (Transcript length bias in RNA-seq data confounds Systems biology; Alicia Oshlack* and Matthew J Wakefield, Biology Direct 2009, 4:14 doi:10.1186/1745-6150-4-14).
Die Quantifizierung von Nukleinsäure-Zusammensetzungen wird zudem häufig, etwa bei der Quantifizierung von Expressed-Sequenced Tags (ESTs), auch ohne vorherige PCR-Amplifikation z.B. nach einer Klonierung der Nukleinsäuren durchgeführt. Auch hierbei kann aufgrund unterschiedlicher Fitness individueller
Bakterien und aufgrund von Effekten der Nukleinsäuren auf das Wachstum der transformierten Zellen, eine Verfälschung der ursprünglichen Zusammensetzung der Nukleinsäurepopulation entstehen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es nun, ein einfaches Verfahren zur
Verfügung zu stellen, bei dem die während der Vermehrung der zu quantifizierenden Nukleinsäuren in einer Probe auftretenden Verfälschungen der Nukleinsäure- zusammensetzung besser erkannt und bei einer quantitativen Auswertung korrigiert werden können.
Die Aufgabe wird dadurch gelöst, dass alle Nukleinsäuren eines Nukleinsäuregemischs, egal ob doppelsträngige oder einzelsträngige, vor der Amplifikation mit einem „Random Tag" (RAT) versehen werden, der aus einem Gemisch aus synthetischen Oligonukleotiden stammt, wobei das Gemisch genügend RATs mit unterschiedlichen Sequenzen enthält, um zu gewährleisten, dass die entstehenden Random-Tag-Nukleinsäuren (RAT-NS)-Kombinationen praktisch einzigartig sind. Die Methoden, wie die Nukleinsäuren vor der Amplifikation mit einem RAT versehen werden können, können sehr unterschiedlich sein. Nach einer Sequenzierung können die RAT-Nukleinsäure-Kombinationen ermittelt werden, es entsteht ein Datensatz mit den individuellen Sequenzinformationen der RAT-NS. Die
Aufzeichnung und Auswertung der Sequenzierdaten kann z.B. mit einem geeigneten Computerprogramm erfolgen. RAT- Nukleinsäure-Kombinationen, die mehr als einmal oder mindestens häufiger als statistisch wahrscheinlich vorkommen sind somit als Kopien erkennbar. Eliminiert man alle Kopien aus dem Datensatz, so ergibt sich die ursprüngliche Zusammensetzung des Nukleinsäuregemischs vor der Amplifikation. Es wird somit die zuverlässige quantitative Bestimmung von Nukleinsäuren in einer Probe möglich.
Insbesondere Veränderungen der Mengenrelationen, der in der Probe vorhandenen Nukleinsäuren durch die Amplifizierung können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erkannt und eliminiert werden.
Folglich ist der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur quantitativen Bestimmungen von Nukleinsäuren (Nukleinsäurepopulation) in einer Probe bei dem
a) Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend - mindestens eine kennzeichnende Polynukleotiddomäne (TAG) einer, in einer Probe vorhandenen Nukleinsäure, die quantitativ bestimmt werden soll und - mindestens eine artifizielle Polynukleotiddomäne mit zufälliger Sequenz
(„Random- Tag" oder abgekürzt RAT) und - mindestens einer Primer- oder Polymerasebindungsstelle (PB), wobei jeweils eine kennzeichnende Polynukleotiddomäne (TAG) und mindestens eine Polynukleotiddomäne mit zufälliger Sequenz (RAT) eine charakteristische Domänenkombination (TAG-RAT-Kombination) bilden, die von mindestens einer Polymerase- oder Primerbindungstelle (PB) flankiert wird, in Anwesenheit einer Polymerase amplifiziert werden und
b) nach der Amplifikation zumindest die Sequenz der Polynukleotiddomänen mit zufälliger Sequenz (RAT) und zumindest eines Teils der kennzeichnenden Polynukleotiddomäne (TAG) ermittelt werden, wobei zur quantitativen Bestimmung der in der Probe vorhandenen Nukleinsäure sequenzidentische und gegebenenfalls zusätzlich sequenzähnliche Kombinationen einer kennzeichnenden Polynukleotiddomäne (TAG) und einer Polynukleotiddomäne mit zufälliger Sequenz (RAT) als Kopien einer kennzeichnenden Polynukleotiddomäne (TAG) der ursprünglich in der Probe vorhandenen Nukleinsäure identifiziert werden können.
Durch die Eliminierung der identifizierten Kopien ergibt sich die vor der Amplifikation in der Probe vorhandene quantitative Zusammensetzung an Nukleinsäuren. Jede TAG-RAT-Kombination steht also für einen vor der Amplifikation in der Probe vorhandenen Nukleinsäurestrang, egal wie häufig diese Kombination nach der Amplifikation z.B. durch Sequenzierung aufgefunden wird. Kombinationen mit dem gleichen TAG und voneinander abweichenden RATs stehen dementsprechend jeweils für einen weiteren Strang der gleichen Nukleinsäure in der Probe vor der Amplifikation.
Als „Nukleinsäure" im Sinne der vorliegenden Erfindung werden die quantitativ zu bestimmenden Nukleinsäuren verstanden, die in einer Probe vorliegen. Die zu bestimmenden Nukleinsäuren können in der Probe sowohl einzelsträngig als auch doppelsträngig vorliegen. Dabei handelt es sich um DNAs und RNAs, insbesondere um mRNAs, microRNAs, rRNA und nicht kodierende RNAs sowie deren, durch reverse Transkription erzeugte cDNAs, die für eine Genexpressionsanalyse und eine Analyse der nicht-codierenden RNAs herangezogen werden können. Zudem umfasst der Begriff „Nukleinsäure" auch Aptamer-DNA und -RNA bzw. Fragmente genomischer DNA, die insbesondere auch methyliert sein kann. Weiter zielt die Erfindung auf die Quantifizierung von durch Immunpräzipitation gewonnenen DNA Fragmenten und von Fragmenten, die durch Digital Karyotyping und Methylation- Specific Digital Karyotyping quantifiziert werden. Ebenso verbessert die Erfindung die Quantifizierung von DNA-Fragmenten für metagenomische Analysen sowie zur Analyse von Fragmenten aus subtraktiven DNA-Bibliotheken. Ebenfalls fallen unter den Begriff „Nukleinsäuren" einzel- oder doppelsträngige Polynukleotide künstlichen (synthetischen) Ursprungs, darunter auch solche, deren Phosphat-Gruppen durch andere Atome ersetzt bzw. deren Basen modifiziert wurden und die mittels
Polymerisation amplifizierbar und die sequenzierbar sind. Als „Primer- oder Polymerasebindungsstelle (PB)" wird eine Nukleinsäure bekannter Sequenz bezeichnet, die bevorzugt als Bindestelle für einen Primer z.B. für die PCR dienen kann, wobei die Amplifikation unter Verwendung der entsprechenden Primer und Polymerasen durch enzymatische Polymerisation erfolgt. Weiterhin können auch bekannte Sequenzen für eine Polymeraseanbindung zur Initiation einer enzymatischen Amplifikation benutzt werden, wie sie z.B. in bekannten Plasmiden oder anderen Vektoren bereits enthalten sind. In einem solchen Fall kann, unter Verwendung einer Insertionssequenz, der Einbau der RAT-TAG-Kombinationen in einen Vektor erfolgen, wodurch ein Nukleinsäurekonstrukt im Sinne der vorliegenden Erfindung entsteht, dass durch Klonierung vermehrt werden kann. Bei der
Polymerasebindungsstelle kann es sich z.B. um eine Promotorsequenz für eine RNA-Polymerase, etwa um SP6 oder T7-RNA-Polymerase handeln, wobei von der Bindungsstelle aus eine lineare Amplifikation des Nukleinsäure-Konstrukts durch die entsprechende Polymerase erfolgen kann.
Unter einer „kennzeichnenden Polynukleotiddomäne", wird ein sogenannter „TAG" verstanden, nämlich eine Nukleinsäuredomäne deren Sequenz kennzeichnend für eine in der Probe vorkommende und quantitativ zu bestimmende Nukleinsäure ist. Welcher Teil einer Nukleinsäure als kennzeichnende Polynukleotiddomäne ausgewählt wird ist prinzipiell frei wählbar, solange die einzelnen TAGs einer bestimmten, in der Probe vorliegenden Nukleinsäure zugeordnet werden können. Ist diese Zuordnung nicht eindeutig, können weitere Verfahren angewendet werden, um diese Eindeutigkeit zu gewährleisten, z.B. mit Real time PCR mit spezifischen Primern. Als TAG können z.B. konservierte Teile einer Gensequenz genutzt werden. Bevorzugt werden kennzeichnende Polynukleotiddomänen mit einer ausreichenden
Sequenzlänge benutzt. Bevorzugt sollten die kennzeichnenden Polynukleotiddomänen eine Sequenzlänge von mindestens 8 Nukleotiden, besser von mindestens 12 Nukleotiden, besonders bevorzugt von mindestens 15 Nukleotiden besitzen. Eine kennzeichnende Polynukleotiddomäne kann dabei auch die gesamte zu bestimmende Nukleinsäure sein. Bevorzugt sollte die Domäne allerdings eine Länge von 50 Nukleotiden, besonders bevorzugt von 35 Nukleotiden, insbesondere von 27 Nukleotiden nicht übersteigen. Dabei können auch längere, kennzeichnende Polynukleotiddomänen in ein Nukleinsäurekonstrukt eingebaut werden, wobei es allerdings häufig ausreicht, nur einen Teil dieser Sequenz im Anschluss an eine Amplifizierung der Konstrukte zu bestimmen.
Eine „Polynukleotiddomäne mit zufälliger Sequenz" im Sinne der vorliegenden
Erfindung ist ein synthetisch hergestellter (artifizieller) „Random Tag" (RAT), dessen Sequenz eine eindeutige Markierung der kennzeichnenden Polynukleotiddomäne zulässt. Die RATs werden üblicherweise kommerziell durch eine „statistische" Verknüpfung der einzelnen Nukleotide hergestellt. Es wird dabei eine Mischung aus RATs erhalten, wobei die Wahrscheinlichkeit des Vorliegens von RATs mit gleicher
Sequenz bei steigender Sequenzlänge und mit abnehmender Anzahl an RAT- Molekülen in der Mischung sinkt. Die so hergestellten Polynukleotiddomänen besitzen eine zufällige Sequenz im Sinne der Erfindung. Aufwendiger ist die Herstellung von RATs mit einer bekannten Sequenz, wobei so RATs hergestellt werden können, deren Sequenz garantiert einmalig ist. Auch solche RATs stellen eine „zufällige Sequenz" im Sinne der vorliegenden Erfindung dar. Auch können RATs aus einer Mischung bekannter, unterschiedlicher Sequenzen hergestellt werden.
Einzelsträngige RATs können als Oligonukletide hergestellt oder erworben werden.
Zur Herstellung von doppelsträngigen RATs werden bevorzugt einzelsträngige Oligonukleotide mit einer zufälligen Sequenz (RAT) und einem bekannten Sequenzanteil verwendet, wobei der bekannte Sequenzanteil am 3'-Ende des einzelsträngigen Oligonukleotides liegt. An den bekannten Sequenzanteil werden Oligonukleotide mit komplementärer Sequenz als Primer hybridisiert und mit Hilfe einer Polymerase (z.B. mit dem so genannten Klenow-Fragment der DNA- Polymerase I) in ein doppelsträngiges Olignukleotid überführt, dass einen doppelträngigen RAT enthält. Reine doppelstränge RATs ohne weitere Domänen können durch Integration einer Tagging-Enzym-Site und einer Primerbindungsstelle erzeugt werden, wobei nach Zweitstrangsynthese mit Hilfe des Tagging-Enzyms der
RAT abgespalten wird. Weiterhin kann der einzelsträngige RAT bevorzugt an einem Ende mit einer bekannten Sequenz versehen werden, die bestimmte Polynukleotiddomänen wie eine Tagging-Enzym-Site, Restriktionssite, Ligationsstelle etc. enthalten kann. Am anderen Ende des RAT wird dann bevorzugt eine Primerbindungsstelle eingefügt, die auch zur Synthese des Doppelstranges mit dem Klenow Fragment herangezogen werden kann. Um RATs mit geeigneten Ligationsstellen (LS) zu versehen, die zu überhängenden
Restriktiosschnittstellen komplementär sind, können Oligonukleotide die eine Primerbindungsstelle gefolgt von einem RAT und der entsprechenden Restriktionsschnittstelle gefolgt von einem weiteren RAT und einer weiteren Primerbindungsstelle enthalten, hergestellt werden. Es wird ein Konstrukt mit folgendem Aufbau erhalten: PB-RAT-Restriktionsschnittstelle-RAT-PB.
Nach der Erzeugung des doppelsträngigen Konstruktes werden die Oligonukleotide mit dem entsprechenden Restriktionsenzym verdaut, es werden aus einem Oligonukleotid jeweils zwei RATs erhalten die mit überstehenden Enden für die Ligation modifiziert sind.
Außerdem können die RATs durch Hybridisierung zweier aus einer Zufallskombination bestehenden einzelsträngigen Oligonukleotiden hergestellt werden, die unter stringenten Bedingungen miteinander hybridisiert werden. Bei RATs die aus bekannten Sequenzen aufgebaut sind, ist dies die bevorzugte Methode.
Als „Nukleinsäurekonstrukte" werden Polynukleotide verstanden, die zumindest eine kennzeichenende Polynukleotiddomäne, die für eine in der Probe enthaltene und quantitativ zu bestimmende Nukleinsäure kennzeichnend ist (TAG), eine Polynukleotiddomäne, mit einer zufälligen Sequenz (RAT) und mindestens einer
Primer- oder Polymerase-Bindungsstelle (PB) enthalten. Darüber hinaus können weitere Polynukleotiddomänen in den Nukleinsäurekonstrukten enthalten sein, wie z.B. Sequenzen zur Markierung verschiedener Proben, Linkersequenzen, Ligationsstellen (LS), Restriktionsenzymschnittstellen oder Tagging-Enzym- Bindungsstellen (TES). In einer bevorzugten Abfolge der Polynukleotiddomänen sind die kennzeichnende Polynukleotiddomäne (TAG) und die Polynukleotiddomäne mit zufälliger Sequenz (RAT) kovalent miteinander verknüpft. Die Verknüpfung kann durch direkte Ligation der einzelnen Domänen erfolgen. Alternativ können die einzelnen Domänen auch über Linkersequenzen miteinander verbunden werden, wobei sich die Linkersequenz durch die Ligation von korrespondierenden, überhängenden Enden ergibt. Die miteinander verknüpften TAG- und RAT-Domänen werden schließlich durch mindestens eine Primer- oder PolymeraseBindungsstelle
(PB) ergänzt, die bevorzugt kovalent, entweder an die kennzeichnende Polynukleotiddomäne (TAG) oder an die Polynukleotiddomäne mit zufälliger Sequenz (RAT) gebunden ist. In einer bevorzugten Ausführungsform liegen die TAG-Domäne und die RAT-Domäne flankiert von zwei verschiedenen Primerbindungsstellen (PB, PB') vor. Die Primerbindungsstellen sind in einer
Besonders bevorzugten Ausführungsform direkt für die Verwendung in Hochdurchsatzsequenziermaschinen geeignet. Neben einer direkten Verknüpfung der Primer- oder Polymerasebindungsstellen mit den jeweiligen Enden der TAG- RAT-Domänenkombination kann auch eine Verknüpfung über einen Polynukleotidlinker in Frage kommen. Auch die Primer- oder
Polymerasebindungsstellen (PBs) können durch Ligation in die Nukleinsäurekonstrukte eingebunden werden. Alternativ können TAGs aber insbesondere auch RATs eingesetzt werden, die schon im Vorfeld mit einer Primerbindungsstelle (PB) versehen sind.
In einer alternativen Ausführungsform können die zur enzymatischen Amplifikation vorbereiteten Nukleinsäurefragmente neben mindestens einer kennzeichnenden Polynukleotiddomäne (TAG) auch zwei oder mehr Polynukleotiddomänen mit zufälliger Sequenz (RATs) enthalten. Dabei können ein, zwei oder mehr Kombinationen aus einem TAG und einem RAT in einem Nukleinsäurekonstrukt enthalten sein. Die Orientierung der TAG-RAT-Kombinationen im Konstrukt spielt dabei keine Rolle. Weiterhin können einzelne TAG-RAT-Kombinationen unabhängig voneinander von einer Primer- oder Polymerase-Bindungsstelle (PB) flankiert vorliegen. Möglich ist allerdings auch, dass zwei Primer-Bindungsstellen (PBs) alle TAG-RAT-Kombinationen in einem Nukleinsäurekonstrukt einschließen bzw. eine
Primer- oder Polymerase-Bindungsstelle (PB) an einem Ende der TAG-RAT- Kombinationen liegt. So sind insbesondere Nukleinsäurekonstrukte mit folgender Polynukleotid- domänenabfolge von besonderem Interesse:
a) PB - TAG - RAT b) PB - RAT - TAG c) PB - TAG - RAT - PB' d) PB - RAT - TAG - RAT e) PB - RAT - TAG - RAT - PB1 f) PB-RAT-TAG-TAG-RAT g) PB - RAT - (TAG)n - PB ; mit n = 2 bis 50, bevorzugt mit n = 2 bis 10 h) PB - RAT - (TAG)n - RAT - PB ; mit n = 2 bis 50, bevorzugt mit n = 2 bis 10 i) PB - RAT - (TAG)n ; mit n = 2 bis 50, bevorzugt mit n = 2 bis 10 j) PB - RAT - TAG - RAT - TAG k) PB - TAG - RAT - TAG - RAT
I) PB - RAT - TAG - RAT - TAG - PB' m) PB - (RAT - TAG)n - PB' ; mit n = 3 bis 50, bevorzugt mit n = 3 bis 10 n) PB - RAT - TAG - PB' - PB" - RAT - TAG - PB'" o) PB - RAT - TAG - PB' - PB" - RAT - TAG - PB'" - PB"" - RAT - TAG - PB'"" p) PB - RAT - TAG - PB' - (PB - RAT - TAG - PB')n - PB - TAG - RAT - PB'
; mit n = 0 bis 10
(PB1 PB', PB", PB'", PB"", PB'"" = Primerbindungsstellen, wobei die Primerbindungsstellen bevorzugt unterschiedliche Sequenzen haben aber auch die gleiche Sequenz besitzen können.) Primerbindungstellen, die direkt in Hochdurchsatzsequenziermaschinen verwendet werden können, sind besonders bevorzugt.
Dabei sind Nukleinsäurekonstrukte gemäß den Ausführungsformen a), b), c), e), g) und h) besonders bevorzugt im Sinne der vorliegenden Erfindung. Nukleinsäurekonstrukte können einzel- oder doppelsträngig vorliegen, wobei bei einzelsträngigen Nukleinsäurekonstrukten unter einer Primer-Bindungsstelle auch eine Sequenz verstanden wird, die einer Primer-Bindungsstelle auf dem Gegenstrang entspricht, während in einem doppelsträngigen Nukleinsäurekonstrukt sowohl die Primer-Bindungsstelle als auch deren korrespondierende Sequenz auf dem Gegenstrang enthalten ist.
Die Nukleinsäurekonstrukte dienen als Matrizen (Templates) für deren enzymatische Amplifikation durch eine Polymerase.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält das Nukleinsäurekonstrukt oder Vorstufen diese Konstruktes eine oder mehrere Bindungsstellen für ein Tagging-Enzym (TE). Eine Tagging-Enzym-Site (TES) stellt eine Bindungsstelle für ein entfernt von seiner Erkennungstelle schneidendes Typ-Il oder Typ-Ill Restriktionsenzym, bevorzugt für EcoP15l, Mmel oder Bsmfl, dar. Durch Einsatz eines Tagging-Enzyms können insbesondere Nukleinsäurefragmente mit einer definierten Länge erzeugt werden, die als kennzeichnende Nukleotid-Domäne (TAG) dient. Die Tagging-Enzym-Site (TES) ist so einzubauen, dass der benötigte TAG auch nach der enzymatischen Spaltung im Nukleinsäurekonstrukt bzw. in einer Konstruktvorstufe enthalten ist. Bevorzugt liegt die Bindungsstelle für ein Tagging-
Enzym (TES) am distalen Ende zur PB-Sequenz des RAT, die Einbindung der TES in ein Nukleinsäurekonstrukt bzw. in eine entsprechende Konstruktvorstufe erfolgt somit bevorzugt in der Domänenabfolge „PB - RAT - TES - Nukleinsäure". Das Produkt der späteren Spaltung des Nukleinsäurekonstrukts mit dem TE ist daher ein Polynukleotid mit der Domänen-Abfolge PB - RAT - TES - TAG. Alternativ kann aber auch zuerst der TAG mit Hilfe des Tagging-Enzyms erzeugt werden und danach wird der RAT an einem beliebigen Ende der TES-TAG-Domänenabfolge angebunden. Wird z.B. EcoP15l als Tagging-Enzym verwendet, ist die Anwesenheit zweier Kopf an Kopf orientierter Erkennungsstellen (Tagging-Enzym-Sites) mit der Sequenz CAGCAG nötig, welche die Schnittstelle des Tagging-Enzyms einschließen und bevorzugt in einem Abstand von weniger als 3000 Bp liegen. Die bevorzugte Domänen-Abfolge ist daher im Falle der Verwendung eines Typ IM Restriktionsenzyms, wie EcoP15l, „PB-RAT-TES-Nukleinsäure-TES". Das Produkt der späteren Spaltung des Nukleinsäurekonstrukts mit EcoP15l als Tagging-Enzym sind daher ein Polynukleotid mit der Domänen-Abfolge PB - RAT - TES - TAG, und ein Polynukleotid mit der Domänen-Abfolge TES-Tag, von denen das PB-RAT-TES- TAG-Konstrukt bevorzugt für die Charakterisierung der Nukleinsäure verwendet wird. Ein großer Vorteil bei der Verwendung von EcoP15l ist, dass besonders lange TAGs mit 25-27 Basenpaaren erhalten werden.
In einer anderen, bevorzugten Anwendungsform werden beide Enden des zu charakterisierenden Nukleinsäuremoleküls mit gleichen oder verschiedenen PB-
RAT-TES-Konstrukten versehen. Die Spaltung des Konstrukts mit dem Tagging- Enzym resultiert dann in zwei Molekülen mit der Domänen-Abfolge PB-RAT-TES- TAG, wobei die PB und TES-Domänen gleiche oder unterschiedliche Sequenz haben können. In diesem Fall können zwei PB-RAT-TES-T AG-Konstrukte zur Charakterisierung des Nukleinsäuremoleküls verwendet werden.
Nach Schneiden mit dem entsprechenden Tagging-Enzym können dann weitere Polynukleotiddomänen, wie z.B.: RATs und PBs, an den erhaltenen TAG angebunden werden, so dass sich in den resultierenden Nukleinsäurekonstrukten, die folgenden besonders bevorzugten Domänenabfolgen ergeben: a1) PB-TES-TAG-RAT a") PB-TAG-TES-RAT b') PB-RAT-TAG-TES b") PB-RAT-TES-TAG c') PB - TAG - TES - RAT - PB' c") PB-TES-TAG-RAT-PB' d1) PB-RAT-TAG-TES-RAT d") PB-RAT-TES-TAG-RAT e') PB - RAT - TAG - TES - RAT - PB' e") PB-RAT-TES-TAG-RAT-PB' f) PB - RAT - (TES)m - TAG - TAG - (TES)m - RAT ; mit m = 0 oder 1 unabhängig voneinander für jedes m, wobei mindestens ein m =1 ist g1) PB - RAT - TES - TAG - RAT - TAG g") PB - RAT - TAG - TES - RAT - TAG k') PB-TES-TAG-RAT-TAG-RAT k") PB - TAG - TES - RAT - TAG - RAT k'") PB - TAG - RAT - TES - TAG - RAT k"") PB - TAG - RAT - TAG - TES - RAT I') PB - RAT - TES - TAG - RAT - TAG - PB1 I") PB-RAT-TAG-TES-RAT-TAG-PB' I"") PB - RAT - TAG - RAT - TES - TAG - PB1 I"") PB - RAT - TAG - RAT - TAG - TES - PB' m') PB - (RAT - (TES)m - TAG)n - PB' ; mit n = 3 bis 50, bevorzugt mit n = 3 bis 10 und m = 0 oder 1 unabhängig voneinander für jedes m, n') PB - RAT - (TES)m - TAG - (TES)m - PB' - PB" - RAT - (TES)n, - TAG -
(TES)m - PB1" ; mit m = 0 oder 1 für jedes m unabhängig voneinander, wobei mindestens ein m = 1 ist, o') PB - RAT - (TES)m - TAG - (TES)m - PB' - PB" - RAT - (TES)n, - TAG - (TES)m - PB'" - PB"" - RAT - (TES)n, - TAG - (TES)n, - PB'"" ; mit m = 0 oder 1 für jedes m unabhängig voneinander, wobei mindestens ein m = 1 ist, p') PB - RAT - (TES)m - TAG - (TES)n, - PB' - (PB - RAT - (TES)n, - TAG -(TES)n,
- PB')n - PB - (TES)n, - TAG -(TES)n, - RAT - PB' mit n = 0 bis 10 und mit m = 0 oder 1 für jedes m unabhängig voneinander, wobei mindestens ein m = 1 ist,
(PB, PB', PB", PB'", PB"", PB = Primerbindungsstellen, wobei die
Primerbindungsstellen bevorzugt unterschiedliche Sequenzen haben aber auch die gleiche Sequenz besitzen können.) Die Herstellung der Nukleinsäurekonstrukte kann über zirkuläre Nukleinsäure- konstruktvorstufen erfolgen, wobei bevorzugt mindestens ein Ende einer Nukleinsäure mit einem Marker und gegebenenfalls das andere Ende ebenfalls mit einem Marker bzw. Adapter modifiziert werden und dann die Zirkularisierung erfolgt. Bevorzugt besitzt mindestens einer der vorhandenen Marker oder Adapter auch eine
Tagging-Enzymbindungsstelle (TES), besonders bevorzugt sind zwei TES vorhanden, insbesondere für das Tagging-Enzym EcoP15l, das auf beiden Seiten des zirkulären Konstruktes einen TAG abschneidet wodurch ein lineares Nukleinsäurekonstrukt im Sinne der vorliegenden Erfindung entsteht, dass zwei TAGs an beiden Enden enthält.
Weitere bevorzugte Nukleinsäurekonstrukte, die z.B. aus zirkulären Konstruktvorstufen erzeugt werden können und die insbesondere für die gleichzeitige Quantifizierung beider Enden von Nukleinsäuremolekülen von Interesse sind, weil sie es erlauben, die Herkunft der TAGs vom gleichen Molekül zu erkennen, sind
q) TAG - TES - RAT - PB - RAT - TES r) TAG - TES - RAT - PB - PB1 - RAT - TES s) PB"-TAG-TES-RAT-PB-RAT-TAG t) PBI1-TAG-TES-RAT-PB-RAT-TAG-PBI oder u)PB"-TAG-TES-RAT-PB-PB'-RAT-TAG-PBm v) TAG - RAT - PB - RAT w) TAG - RAT - PB - PB' - RAT x) PB" - TAG - RAT - PB - RAT - TAG y) PB" - TAG - RAT - PB - RAT - TAG - PB1 z) PB" - TAG - RAT - PB - PB1 - RAT - TAG - PB"1 aa) PB - TAG - RAT - TAG bb) PB- TAG - RAT - TAG - PB' (PB, PB', PB", PB'" = Primerbindungsstellen, wobei die Primerbindungsstellen bevorzugt unterschiedliche Sequenzen haben aber auch die gleiche Sequenz besitzen können.)
Alle in der vorliegenden Erfindungsbeschreibung dargestellten
Nukleinsäurekonstrukte können neben den erfindungsgemäßen Domänenabfolgen weitere Sequenzabschnitte, wie z.B. Linker, Restriktionssites, Ligationsstellen etc. besitzen, die allerdings in der Regel nicht explizit in der Domänenabfolge der Konstrukte genannt werden.
Die Polynukleotiddomänen mit zufälliger Sequenz (RAT) sind zur Markierung von kennzeichnenden Polynukleotiddomänen (TAGs) geeignet. Unter einem „Marker" werden folglich Polynukleotide verstanden, die eine Primerbindungsstelle und einen RAT enthalten, aber keinen TAG. Zudem können Marker weitere Oligonukleotiddomänen enthalten wie z.B. Tagging-Enzymbindungsstellen (TES) und Linker- und Ligationsstellen (LS). Eine Ligationsstelle ist das für eine Ligation vorgesehene Ende des Markers, das sich distal zur PB befindet.
Für die Herstellung der zur Amplifikation vorgesehenen Nukleinsäurekonstrukte ist es weiterhin sinnvoll, neben den Markern auch bestimmte Olignukleotiddomänen in einem „Adapter" zusammenzufassen. Adapter im Sinne der vorliegenden Erfindung sind immer mit einer Primerbindungsstelle versehen und können weitere Oligonukleotiddomänen insbesondere Tagging-Enzymbindungsstellen, Linker bzw. Ligationsstellen, aber keine RATs oder TAGs enthalten.
Die Marker und Adapter enthalten bevorzugt unterschiedliche Primerbindungsstellen, die bei den hochparallelen Sequenzierverfahren nach den Herstellerangaben bevorzugt verwendet werden sollen. Diese liegen an den distal zum TAG gelegenen Enden der Marker oder Adapter. Die einzelnen Oligonukleotiddomänen, wie z.B. PB, TAG und RAT, bzw. die Marker oder Adapter können mit den nach dem Stand der Technik üblichen Verfahren zudem mit weiteren bekannten Modifikationen versehen sein, die z.B.
- das Binden an eine feste Phase ermöglichen, etwa durch Biotinylierung der Oligonukleotide und Bindung an eine mit Streptavidin versehene feste Phase, oder
„Fänger-Sequenzen" enthalten. Als „Fänger-Nukleotidsequenzen" können Sequenzen genutzt werden, die z.B. an einer festen Phase gebunden sind und mit ihren korrespondierenden Gegensträngen, die sich in Lösung befinden, hybridisieren können, - die Ligation an einer Seite eines Oligonukleotids verhindern, wie z.B. Amino-C7
Modifikationen oder „Reverse Nukleotide" (Nukleotide, mit 3'-5-Orientierung anstatt 5'-3'-Orientierung), wobei das vor Ligation zu schützende Ende das distal zum TAG gelegene Ende des Markers oder Adapters ist,
- die Ligation an einer Seite eines Oligonukleotids ermöglichen oder erleichtern, z.B. durch Phosphorylierung des 5' Endes des entsprechenden Oligonukleotids, oder z.B. durch die Erzeugung von überhängenden Restriktionsschnittstellen („sticky ends"),
- die Hybridisierung erleichtern bzw. die Dehybridisierung des Doppelstrangs erschweren, z.B. durch die Verwendung von „Locked nucleotide acids". -Restriktionsschnittstellen beinhalten
Diese Modifikationen können in die einzelstränigen Oligonukleotide integriert werden. Adapter können mit komplementären Oligonukleotiden zu doppelsträngigen Oligonukleotiden hybrdisiert werden. Marker können gegebenenfalls ebenso hergestellt werden, bevorzugt wird der Marker jedoch durch den Einsatz einer Polymerase, insbesondere durch das Klenow Fragment der DNA-Polymerase I wie zuvor beschrieben doppelsträngig hergestellt.
Mit Hilfe von Markern können Nukleinsäurefragmente mit einer Sequenz, die für eine in der Probe vorkommenden Nukleinsäure kennzeichnend ist (TAG), eindeutig gekennzeichnet werden, d.h. jede RAT-TAG Kombination ist mit hoher
Wahrscheinlichkeit einzigartig. Um eine solche eindeutige Kennzeichnung vorzunehmen, sollte die Nukleinsäuredomäne mit zufälliger Sequenz (RAT) bevorzugt lang genug sein, um im Verhältnis zur Anzahl der in der Probe vorkommenden Nukleinsäuren, einen Überschuss an Markern mit unterschiedlichen RATs bereitstellen zu können. Bevorzugt werden RATs enthaltende Marker mit mehr als der doppelten Menge bezogen auf die zu markierenden Nukleinsäurefragmente oder Nukleinsäuren eingesetzt. Im Einzellfall kann aber auch eine Markeranzahl ausreichen, die der zu bestimmenden Nukleinsäureanzahl entspricht, insbesondere wenn sich alle RATs garantiert in ihrer Sequenz unterscheiden. Bevorzugte Sequenzlängen für die in den Nukleinsäurefragmenten enthaltenen RATs sind zwischen 2 und 100 Nukleotiden, besser zwischen 4 und 50 Nukleotiden, besonders bevorzugte RATs besitzen eine Gesamtlänge zwischen 6 und 15 Nukleotiden. Die gesamte zufällige Sequenz kann dabei in einer Markerdomäne enthalten sein oder sich auf mehrere Markerdomänen bzw. auf Domänen unterschiedlicher Marker in einem Nukleinsäurekonstrukt aufteilen. Mit den beschriebenen Gesamtlängen der Nukleinsäuredomänen mit zufälliger Sequenz (RATs) lässt sich theoretisch eine große Anzahl von Markern mit unterschiedlichen RATs erzeugen, wobei das verwendete Markerensemble üblicherweise nur einen kleinen Teil der sich aus der Sequenzlänge ergebenden denkbaren RATs enthält, so dass die Wahrscheinlichkeit, dass zufällig sequenzidentische RATs in zwei Markern auftreten, sehr gering ist. Folglich kann die Sequenzlänge der RATs der Anzahl der zu markierenden, kennzeichnenden Nukleinsäurefragmente individuell angepasst werden. So werden z.B. für eine Genexpressionsanalysen, bei der die in einer Gewebeprobe enthaltenen mRNAs quantitativ bestimmt werden sollen, bevorzugt Markermischungen mit über 102 Markern, besonders bevorzugt zwischen 104 und 108 Markern eingesetzt.
Selbst wenn einzelne Marker tatsächlich identische RATs enthalten sollten, würde diese die quantitative Bestimmung nur verfälschen, wenn sie mit einem sequenzgleichen oder sequenzähnlichen TAG verknüpft werden sollten. Da alle individuellen TAG-RAT-Kombination für die individuellen, in der Probe vorkommenden und quantitativ zu bestimmenden Nukleinsäuren in einer zur
Amplifikation vorbereiteten Mischung mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit nur einmal vorhanden sind, können sequenzidentische Kombinationen einer kennzeichnenden Polynukleotiddomäne (TAG) und einer Polynukleotiddomäne mit zufälliger Sequenz (RAT) folglich als Kopien einer kennzeichnenden Polynukleotiddomäne einer ursprünglich in der Probe vorhandenen Nukleinsäure identifiziert werden.
Da während der Amplifikation der Nukleinsäurekonstrukte auch
Polymerisationsfehler auftreten können bzw. auch die Bestimmung der Nukleinsäuresequenz nicht frei von Fehlern ist, ist es vorteilhaft auch sequenzähnliche RAT-T AG-Kombinationen bei der Auswertung zu eliminieren. Was als „sequenzähnliche" Kombinationen gilt, kann im Prinzip frei festgelegt werden. Wie häufig solche Fehler auftreten hängt von der Länge der TAGs und RATs, der
Behandlung der Nukleinsäuren, den Amplifikationsbedingungen und der Sequenzierungsmethode ab. Als „sequenzähnliche" Kopien werden bevorzugt RAT- TAG-Sequenzen gesehen, die auf 10 Nukleotide maximal eine (1 ) Abweichung aufweisen, bevorzugt werden als sequenzähnliche Kopie RAT-T AG-Kombinationen definiert, die auf 15 oder 20 Nukleotide nicht mehr als eine Abweichung besitzen. So sollten z.B. sequenzähnliche RAT-TAG-Kombinationen mit einer Sequenzlänge von 40 Basenpaaren maximal 4 Sequenzabweichungen besitzen sofern unter fehlertolerierenden Bedingungen gearbeitet wird. Sofern Amplifikationsfehler und Sequenzierungsfehler weitgehend eliminiert werden können, ist es vorteilhaft, die Fehlergrenze für „sequenzähnliche" RAT-TAG-Kombinationen zu senken.
Abb. 1 zeigt ein Beispiel von vier RAT-TAG-Kombinationen mit einem gleichen TAG. Die Kombinationen 1, 2 und 3 sind unterschiedlich, die Kombination 4 ist eine Kopie von 3. Der TAG kommt in der Probe somit dreimal vor. Für eine Quantifizierung wird nur eine der beiden gleichen Kombinationen gezählt werden, z.B. Kombination 3, während Kombination 4 aus dem Datensatz eliminiert wird.
Die den TAG enthaltende Nukleinsäure liegt bevorzugt doppelsträngig, z.B. als cDNA oder DNA, vor und wird im Anschluss an das oder die doppelsträngigen Konstrukt(e) (Marker, Adapter) ligiert. Für eine Amplifikation von RNA, kann die zu amplifizierende Nukleinsäure jedoch auch einzelsträngig vorliegen. Einzelsträngige RNA kann mithilfe von Ligasen z.B. der T4 RNA-Ligase vor einer Amplifikation mit Markem versehen werden.
Für die Ligation von RNA oder einzelsträngiger DNA können Adapter und Marker einzelsträngig oder doppelsträngig vorliegen und mit geeigneten Ligasen mit den einzelsträngigen Nukleotiden ligiert werden. Doppelsträngige Marker oder Adapter können mit einem PoIy-N Überhang versehen werden (Christian Clepet et al. Improved full-length cDNA production based on RNA tagging by T4 DNA ligase; Nucleic Acids Res. 32:6-, 2004).
In einer bevorzugten Variante zur Analyse von RNA (RNA-seq, mRNA-seq) werden RNA Bruchstücke mechanisch oder Mithilfe bivalenter Kationen wie Mg2+ und Zn2+ erzeugt, und diese mit Markern und Adaptern ligiert.
Im Folgenden werden einige Strategien zur Herstellung der Nukleinsäurekonstrukte aus doppelsträngiger DNA beschrieben. Aufgrund des modularen Charakters der einzelnen Verfahrensschritte zur Herstellung der Konstrukte, können analog auch Nukleinsäurekonstrukte mit anderen Domänenabfolgen erzeugt, bzw. gleiche Nukleinsäurekonstrukte mit einer alternativen Abfolge von Verfahrensschritten erhalten werden.
Die einzelnen Verfahrensschritte, die zur Herstellung der Nukleinsäurekonstrukte vorteilhaft sind, sind
- die Anbindung von einzel- oder doppelsträngigen Oligonukleotiden, insbesondere von Markern und Adaptern, oder der Nukleinsäuren an eine feste Phase, sowie deren Abspaltung
- die Ligation der einzelnen Marker, Adapter und der Nukleinsäuren und
- der Verdau von Nukleinsäuresträngen mit einem Restriktions- und/oder Tagging- Enzym
In einer bevorzugten Ausführungsform zur Erzeugung quantitativ zu bestimmender, doppelsträngiger Nukleinsäurekonstrukte enthaltend z.B. TAGs aus cDNA bzw. genomischer DNA, werden die doppelsträngigen Nukleinsäuren mit einem Marker oder Adapter versehen, der an eine feste Phase gebunden werden kann.
Das Binden an eine feste Phase hat den Vorteil, dass z.B. nicht ligierte oder nicht benötigte Nukleinsäuren nach einem Restriktionsverdau entfernt werden können oder benötigte Nukleinsäuren von der festen Phase abgenommen werden können. Die Bindung der Nukleinsäuren an eine feste Phase ist für manche Verfahren allerdings auch verzichtbar.
Bevorzugt sind Marker oder Adapter hierzu biotinyliert und können an eine
Streptavidin-gekoppelte feste Phase gebunden werden. Die zu untersuchenden Nukleinsäuren eines Gemischs können mit solchen Markern oder Adaptern ligiert werden, die am entgegengesetzten Ende des zur Ligation vorgesehenen Endes (Ligationsstelle = LS) biotinyliert sind. Dies kann z.B. nach Verdau der zu quantifizierenden DNA, mit einem Restriktionsenzym an eine
Restriktionsschnittstelle oder auch an glatte Enden der Nukleinsäure geschehen. Biotinlylierte Marker oder Adapter können bei cDNA bevorzugt auch durch die Verwendung biotinylierter, einzelsträngiger Oligonukleotide geschehen, die am 3'- Ende eine Poly-T-Sequenz besitzen und durch Erst- und Zweitstrangsynthese, beginnend am 3' Ende der cDNA integriert werden (als 3'-Ende der cDNA wird das dem 3'-Ende der mRNA entsprechende Ende verstanden. Es ist durch eine Oligo- A/T-Domäne charakterisiert).
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt der Verdau der Nukleinsäure (cDNA, DNA) mit einem oder mehreren häufig schneidenden Restriktionsenzymen. Häufig schneidende Restriktionsenzyme sind z.B. NIaIII, Hsp92ll, Fatl, Bfal, Mael, Xspl, HpyCH4IV, Maell, Tail, Tscl, AIuI, Taql, BfuCI, Bsp143l, BstENII, Dpnll, Kzo9l, Mbol, Ndell, Sau3AI, BstKTΪ oder Cspθl. Diese Enzyme erzeugen Nukleinsäurefragmente mit einer durchschnittlichen Länge von 200 bis 300 Basenpaaren. Die quantitativ zu bestimmenden Nukleinsäuren des Gemischs können vor oder nach diesem Verdau z.B. nach Ligation mit biotinylierten Markern oder Adaptern an eine feste Phase gebunden werden. Alternativ zum Verdau können die zu bestimmenden Nukleinsäuren des Gemischs vor Binden an die feste Phase durch Scheren zerkleinert werden.
Nicht an die feste Phase gebundene Fragmente können durch Waschen entfernt werden.
Die gebundenen Fragmente können bevorzugt durch Ligation erneut mit einem Marker oder Adapter, der nicht biotinyliert sein sollte, versehen werden. Wurden die quantitativ zu bestimmenden Nukleinsäuren zuvor mit einem Restriktionsenzym verdaut, so können Marker oder Adapter mit den der Restriktionsschnittstelle entsprechenden Enden versehen werden und mit den verdauten, quantitativ zu bestimmenden Nukleinsäuren ligiert werden. Prinzipiell kann durch Einführung von Restriktionsschnittstellen über eine Linkersequenz, die zur Erzeugung von überhängenden Schnittstellen dienen, der Einbau von Polynukleotiden in die Nukleinsäurekonstrukte in der gewünschten Orientierung erreicht werden. Das andere Ende der Adapter oder Marker kann vor Ligation geschützt werden z.B. durch den Einbau einer Amino C7-Modifikation im distal zur LS befindlichen Ende des Markers oder Adapters. Nach mechanischem Scheren können die quantitativ zu bestimmenden Nukleinsäuren nach Auffüllen oder Entfernen von überstehenden Einzelstrangenden („sticky ends"), z.B. mit dem Klenow Fragment, ebenfalls mit nicht-biotinylierten, passenden Markern oder Adaptern versehen werden.
Die quantitativ zu bestimmenden Nukleinsäuren des Gemischs liegen hiernach bevorzugt in der Form:
PB - TAG - RAT - PB1 , PB - RAT - TAG - RAT oder
PB - RAT - TAG - RAT - PB'
vor und können z.B. mit PCR amplifizert und z.B. mit hochparallelen Sequenziermethoden sequenziert werden.
Zur quantitativen Analyse der Genexpression reicht es in der Regel aus, die cDNA- Enden (Torres TT. et al., Gene expression profiling by massively parallel sequencing, Genome Res. 2008 18: 172-177) als TAGs zu verwenden. Dazu werden mRNAs z.B. unter Verwendung eines biotinylierten Poly-T-Primers (PB1=Adapter) in eine cDNA umgewandelt und an eine feste Phase gebunden. Danach erfolgt der Verdau mit einem oder mehreren häufig schneidenden Restriktionsenzym (Anchoring Enzyme). Im Anschluss erfolgt die Ligation mit einem
PB'-RAT-Marker enthaltend eine zweite Primerbindungsstelle (PB2), worin das distal zur Ligationsstelle befindliche Ende vor Ligation geschützt ist. Das erhaltene Nukleinsäurekonstrukt ist folglich PB2-RAT-TAG-PB1. Die erhaltenen Nukleinsäurekonstrukte werden mittels PCR amplifiziert und im Anschluss sequenziert.
Eine weitere Möglichkeit für hochparallele Sequenzierverfahren besonders geeignete Nukleinsäurekonstrukte zu erhalten, ist die Verwendung von biotinylierten Markern oder Adaptern, deren Bindung an eine feste Strepdavidin-Phase und die Gewinnung einzelsträngiger Konstrukte nach Denaturierung. Die Marker oder
Adapter sind distal zur Primerbindungsstelle 5' -posphoryliert und am Ende an dem die Primerbindungsstelle liegt vor Ligation geschützt, z.B. mit einer Amino-C7-
Modifikation.
Die für die Pyrosequenzierung besonders geeigneten Konstrukte c, d und e werden dadurch erhalten, dass der TAG, der z.B. eine cDNA bzw. ein genomisches DNA-
Fragment sein kann, mit Markern und Adaptern ligiert wird, z.B. über spezifische Restriktionsschnittstellen oder glatte Enden (blunt-ends), wobei einer der Einzelstränge des aus zwei Einzelsträngen aufgebauten Markers, z.B. PB-RAT-LS oder Adapters, z.B. PB'-LS, biotinyliert ist. Nach einer Ligation entstehen zusätzlich die unerwünschten Nebenprodukte PB'-TAG-PB' sowie PB-RAT-TAG-RAT-PB.
Diese sind nun entweder an beiden Strängen biotinyliert oder überhaupt nicht biotinyliert.
Nach Binden an eine Streptavidin-Phase werden zunächst die ungebundenen Fragmente durch Waschen entfernt. Denaturiert man nun die doppelsträngigen Konstrukte, so bleiben die Fragmente mit zwei biotinylierten Adaptern an der festen
Phase. Lediglich diejenigen Nukleinsäurekonstrukte, mit der gewünschten Formation gehen als Einzelstrang in Lösung und können so gewonnen werden. Die einzelsträngigen Konstrukte können mit Hilfe einer Polymerase wieder doppelsträngig erzeugt werden. Dieses Verfahren ist vielseitig einsetzbar und kann im Prinzip für alle doppelsträngigen DNA-Nukleotide verwendet werden.
Gewinnung von TAGs durch Verwendung eines Tagging Enzyms:
In einer weiteren Ausführungsform werden die quantitativ zu bestimmenenden Nukleinsäuren eines Gemischs wie zuvor beschrieben mit Nukleinsäurefragmente versehen (Markern und Adaptern), die eine Tagging-Enzym-Bindungsstelle (TES) enthalten und an einem Ende an ein Biotin-Molekül gebunden sind (z.B. TES-RAT-
PB-Biotin). Damit lassen sich die Nukleinsäuren nun an eine feste Phase, z.B. Streptavidin-gekoppelte magnetische Partikel "magnetic beads" oder "beads", binden. Nach dem Verdau mit einem oder mehreren häufig schneidenden Restriktionsenzymen oder Scheren kann das Konstrukt nachdem es an eine feste Phase gebunden wurde mit einem Tagging-Enzym, wie z.B. BsmFI oder Mmel geschnitten werden.
An dieser Stelle sei erwähnt, dass Fragmente, die durch ein Tagging-Enzym abgespalten werden eine gleiche Länge haben, sofern die verwendeten Marker und Adapter ebenfalls von gleicher Länge waren und bei allen Molekülen die gleiche
Abfolge von Domänen vorliegt, wie dies gemäß der vorliegenden Erfindung bevorzugt der Fall ist. Die durch das Tagging-Enzym abgespaltenen Nukleinsäurefragmente können somit einfach anhand der Größe, z.B. elektrophoretisch oder per HPLC, getrennt und isoliert werden. Auch nach einer Ligation mit einem Marker oder Adapter von bestimmter Größe können die
Ligationsprodukte anhand der Größe isoliert werden. Auch die entsprechenden spezifischen Amplifikationsprodukte können so isoliert werden.
Sofern ein Typlll-Enzym wie etwa EcoP15l als Tagging-Enzym verwendet wird, muss vorher noch ein Adapter oder Marker enthaltend eine zweite TES an das freie
Ende der an die feste Phase fixierten Nukleinsäurestränge ligiert werden. Nach dem Verdau mit dem Tagging-Enzym und dem Entfernen der abgespaltenen, nicht an die feste Phase gebundenen Produkte können etwaige überstehende Enden z.B. mit dem Klenow Fragment, aufgefüllt bzw. mit einer Einzelstrangspezifischen Exonuklease abgespalten werden, damit die Tagging-Enzym- Schnittstelle glatte Enden („blunt ends") besitzt. Dann können Marker oder Adapter an den fixierten Nukleinsäurestrang gebunden werden. Alternativ dazu können mit „sticky ends" versehene Adapter oder Marker verwendet werden, die dem durch das Tagging-Enzym entstehenden Ende komplementär sind.
Es entstehen bevorzugt, je nach Positionierung des Markers oder Adapters die
Produkte
PB - TAG - TES - RAT - PB' oder
PB - RAT - TAG - TES - RAT - PB'
Nukleinsäurekonstrukte können sowohl unter Verwendung einer festen Phase als auch in Lösung hergestellt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden dazu die in einer Probe enthaltenen Nukleinsäuren oder Nukleinsäurefragmente an beiden Enden mit Markern oder Adaptern ligiert. Die Enden können vorher durch ein Restriktionsenzym definiert werden und mit passenden Markern oder Adaptern versehen werden. Das erhaltene Konstrukt weist die folgende Domänenabfolge auf:
PB -Nukleinsäure- PB oder: PB - RAT - Nukleinsäure - RAT - PB
Verdaut man dieses Konstrukt mit einem häufig schneidenden Enzym, entstehen in vielen Fällen weitere Schnittstellen in der Nukleinsäure. Diese können für die Ligation eines weitern Adapters oder Markers verwendet werden. Es entstehen die Produkte:
PB - RAT - TAG - PB oder
PB -TAG - RAT - PB
Werden im ersten Schritt Adpater oder Marker eingesetzt, die Tagging-Enzym Erkennungsstellen enthalten, entsteht:
PB - RAT - TES - Nukleinsäure - TES - RAT - PB' oder:
PB - TES - Nukleinsäure - TES - PB'
Danach können von den erhaltenen Nukleinsäuresträngen nach Verdau mit dem Tagging-Enzym jeweils zwei Nukleinsäurefragmente enthaltend einen TAG aus der Nukleinsäure abgespalten werden. Bevorzugt werden an die Schnittstellen der Tagging-Enzyme ein Marker oder Adapter angebunden. Es werden neben anderen folgende Nukleinsäurekonstrukte entstehen, die anhand ihrer Größe z.B. mittels
Gelelektrophorese oder HPLC isoliert werden können:
PB - RAT - TES - TAG - PB' und PB' - RAT - TES - TAG - PB
oder:
PB - TES - TAG -RAT- PB' und PB' - TES - TAG -RAT- PB
Durch das Entstehen jeweils zweier Nukleinsäurekonstrukte je in der Probe enthaltener Nukleinsäure wird eine interne Kontrolle bei der quantitativen Bestimmung der Nukleinsäuren möglich.
Man erkennt, dass die zur Amplifikation benötigten Nukleinsäurekonstrukte, die die charakteristischen TAG-RAT-Kombinationen enthalten, auf vielfältige Weise erzeugt werden können. Der Aufbau der Nukleinsäurekonstrukte kann dabei in modularer Weise erfolgen, so können z.B. die einzelnen Verfahrensschritte zur Anbindung bzw. Erzeugung einzelner Polynukleotide mit den unterschiedlichen funktionellen Domänen (TAG, RAT, PB, TES) einfach kombiniert werden, um die gewünschten Nukleinsäurekonstrukte zu erhalten. Dadurch ist das erfindungsgemäße Verfahren vielfältig einsetzbar und nicht auf eine bestimmte Prozessierung der in der Probe enthaltenen Nukleinsäuren beschränkt.
Die einzelnen, modular anwendbaren Verfahrensschritte werden im Folgenden beispielhaft näher erläutert.
1 ) Vorbereitung einer RNA-haltigen Probe zur Herstellung von cDNA-TAGs: Mit Hilfe eines handelsüblichen Kits z.B. mit Trizol reagent (Invitrogen Corp., Carlsbad, USA) wird Gesamt-RNA aus einer biologischen Probe gewonnen. Aus der Gesamt-RNA wird mit einem handelsüblichen Kit, z.B. "Oligtex-Midi-Kit" (Qiagen
N.V., Venlo, Niederlande) die mRNA isoliert. Die cDNA wird durch reverse Transkription unter Verwendung eines 5'-biotinylierten Poly-T-Oligonukleotides, z.B. mit dem „cDNA synthesis System", (Invitrogen Corp.), hergestellt. Das Produkt wird zu einer doppelsträngigen DNA konvertiert („cDNA synthesis System", Invitrogen Corp.) und in einem geeigneten Puffer gelöst. In einer besonders bevorzugten
Variante des Verfahrens soll der verwendete Poly-T-Oligonukleotid die Erkennungssequenz für EcoP15l CAGCAG bzw. CTGCTG enthalten z.B. 5'-Biotin-TEG-PB-CAGCAGTππτππππTTT-3' (SEQ ID No. 1).
2) Enzymatischer Verdau von in der Probe vorhanden Nukleinsäuren:
Doppelsträngige DNA wird in einer Reaktionslösung mit einem häufig schneidenden Restriktionsenzym („Anchoring-Enzym"), z.B. NIaIII, in gepufferter Lösung verdaut. Nach dem Verdau wird die erhaltene DNA extrahiert, mit Alkohol präzipitiert und in einem geeigneten Puffer aufgenommen.
3) Binden an feste Phase: Biotinylierte Nukleinsäure-Lösung kann mit Streptavidin- beschichteten Partikeln bzw. einer Streptavidin-beschichteten festen Phase versetzt werden. Die Partikel werden bei Raumtemperatur in geeignetem Puffer inkubiert, um eine Bindung der biotinylierten DNA mit den Strepatvidin-beschichteten magnetischen Partikeln zu ermöglichen. Die an die Partikel gebundene DNA wird gewaschen und in einem geeigneten Puffer aufgenommen.
4) Herstellung und Ligation von Polynukleotid-Domänen, Adaptern und Markern: Adapter werden aus zwei komplementären einzelsträngigen Oligonukleotiden zusammengesetzt. Die beiden einzelsträngigen Oligonukleotide werden in einem geeigneten Puffer gelöst und miteinander zu einem Doppelstrang hybridisiert. Der Marker, enthaltend den RAT, wird ebenfalls zunächst einzelsträngig synthetisiert und von dieser Matrize wie zuvor beschrieben mit Hilfe des Klenow Fragments ein Doppelstrang synthetisiert. Adapter und Marker sind vor einer ungewollten Ligation auf der distal zur LS befindlichen Seite durch den Einbau von z.B. einer Amino-C7- Modifikation der 3' Seite des entsprechenden Oligos geschützt, während an der ügationsstelle durch 5'-Phosphorylierung die Ligation ermöglicht wird. Der doppelsträngige Marker oder Adapter kann nun mit einer Ligase, z.B. T4-Ligase (Invitrogen Corp.) in einem geeigneten Puffer kovalent mit einem 3'-Ende eines anderen Polynukleotids bzw. einer Nukleinsäure aus der Probe oder eines Fragmentes davon, das den TAG enthält und an eine feste Phase gebunden sein kann, verknüpft werden.
Sofern Marker und Adapter ligiert werden sollen, werden diese bevorzugt in einer ausreichend großen Menge zugegeben, so dass alle freien Enden der aufzubauenden Nukleinsäurestränge auch mit den Polynukleotiden ligiert werden.
5) Schneiden mit dem Tagging Enzym:
In einem geeigneten Puffer werden die mit einem eine TES enthaltenden Adapter oder Marker versehenen, zu quantifizierenden Nukleotide mit einem Tagging-Enzym, z.B. BsmFI, Mmel, EcoP15l, inkubiert. Die abgespaltenen Nukleinsäurefragmente werden entweder nach Elektrophorese oder HPLC isoliert, oder sind (bei Einsatz entsprechender Marker oder Adapter) an eine feste Phase gebunden. Sollen an die Tagging-Enzym-Schnittstelle weitere Marker bzw. Adapter angebunden werden und ist die Schnittstelle keine glatte Schnittstelle, kann das überhängende Ende aufgefüllt bzw. mit einer Exonuklease abgespalten werden. Dazu kann z.B. das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I verwendet werden.
6) Amplifikation:
Zur Vervielfältigung der Nukleinsäurekonstrukte werden bevorzugt PCR-basierte Amplifizierungsverfahren verwendet. Alternativ können auch eindirektionale Amplifizierungs- oder Klonierungsverfahren zur Vervielfältigung der Nukleinsäurekonstrukte eingesetzt werden.
7) Sequenzierung:
Die Sequenz individueller, durch Amplifikation erhaltener Nukleinsäurefragmente in einer Mischung wird bevorzugt durch geeignete Sequenzierverfahren bestimmt. Solche Verfahren werden kommerziell angeboten, z.B. „454"-Picoliter Verfahren, mit dem GSFLX-System (Roche Diagnostics, Deutschland,), Solexa-Verfahren, (Illumina
Inc., San Diego USA); SOLid-Verfahren (Applied Biosystems Ine, Foster City; USA); HeliScope™ Single Molecule Sequencer, (Helicos Corp., Cambridge, USA). Mit diesen Methoden können heute schon bis zu mehreren Millionen Sequenzen parallel sequenziert werden. Dabei kann eine Mischung aus amplifizierten Nukleinsäurekonstrukten ohne weitere Auftrennung bzw. ohne zwischengeschalteten Klonierungsschritt parallel sequenziert werden. Allerdings ist auch möglich, die erhaltenen Nukleinsäurefragmente zu Konkatemeren zusammenzufügen, die im Anschluss kloniert, aufgearbeitet und mit herkömmlichen Verfahren (z.B. nach Sanger) sequenziert werden können.
Da die quantitative Auswertung der erzeugten Nukleinsäurekonstrukte durch Sequenzierung erfolgt, sollte der zu sequenzierende Teil der Konstrukte in einer bevorzugten Ausführungsform eine Länge von 800, besser 400 Nukleotiden nicht übersteigen. Bevorzugte Nukleinsäurekonstrukte besitzen eine Länge zwischen 15 und 150 Basenpaaren, besonders bevorzugt zwischen 25 und 75 Basenpaaren.
Allerdings können auch längere Sequenzen bis hin zu den gesamten Nukleinsäuresequenzen sequenziert werden. Zur Auswertung der Sequenzdaten wird die RAT und TAG Sequenz der amplifizierten Nukleinsäurekonstrukte bestimmt und es werden die ermittelten Sequenzen der TAG-RAT Kombination miteinander verglichen. Sequenzidentische bzw. sequenzähnliche TAG-RAT Kombinationen werden nur einmal zur Bestimmung der Nukleinsäurezusammensetzung der Probe gezählt. Die Sequenzdaten können natürlich sehr effizient mit einem geeigneten Computerprogramm aufgezeichnet und ausgewertet werden.
Kurze Beschreibung der Abbildungen, die beispielhaft einzelne mögliche
Ausführungsformen der Erfindung verdeutlichen:
Abb. 1 zeigt ein Beispiel von vier RAT-TAG-Kombinationen mit einem gleichen TAG. Abb. 2 zeigt schematisch die Herstellung von Nukleinsäurekonstrukten aus mRNA zur quantitativen Untersuchung der Genexpression. In Abb. 2, Schritt 1.1 bis 1.3 wird die lineare Amplifikation unter Verwendung eines
T7-Promotors (PB') gezeigt. Dazu wird ein Marker mit der Domänenabfolge PB'-PB- RAT-PoIy-T1 wobei PB1 die Promotor-Sequenz für eine T7- oder SP6-RNA- Polymerase enthält, mit dem Poly-A-Ende der mRNAs in der Probe hybridisiert. Das freie 3'-Ende der Poly-T-Sequenz dient dann als Startpunkt für eine reverse Transkription (Erststrangsynthese: Abb. 2, Schritt 1.1 ). Durch Zweitstrangsynthese z.B. unter Verwendung von Oligohexameren wird daraus eine doppelsträngige cDNA hergestellt (Schritt 1.2). Aus der cDNA kann dann unter Verwendung der T7- Polymerase eine lineare Amplifikation zur Herstellung von antisense RNA (aRNA) erfolgen (Schritt 1.3). Die erhaltene aRNA kann dann unter Verwendung von „random Hexamers" als Primer durch reverse Trankription in den entsprechenden
DNA-Erststrang umgeschrieben werden (Schritt 1.4), es wird die entsprechende amplifizierte, einzelsträngige cDNA erhalten. Mit Hilfe der Primerbindungsstelle (PB) kann dann der entsprechende DNA-Erststrang amplifiziert werden (Schritt 1.6.1 ), wobei auch biotinylierte Primerbindungsstellen verwendet werden können (Schritt 1.6.2). Die erhaltenen doppelsträngigen Konstrukte können dann z.B. wie in Abb. 3
(Schritt 3-5) gezeigt weiter analysiert werden. In Abb. 2, Schritte 2-4, wird eine Amplifikation von mRNA mit dem sogenannten SMART-Verfahren gezeigt.
Abb. 3 zeigt schematisch die Herstellung von Nukleinsäurekonstrukten aus genomischer DNA am Beispiel des Digital Karyotyping. Dazu wird in einer Probe die vorliegende genomische DNA unter Verwendung eines methylierungsinsensitiven
Restriktionsenzyms verdaut (Abb. 3, Schritt 1 ), die gewonnenen Fragmente besitzen bevorzugt überhängende Enden, so dass an die entsprechenden Restriktionsschnittstellen der genomischen DNA Marker der Form Biotin-PB-RAT ligiert werden können, welche passende Ligationssstellen distal zur Primerbindungsstelle aufweisen (Schritt 2). Die erhaltenen Nukleinsäure- konstruktvorstufen können dann mit einem weiteren Restriktionsenzym verdaut werden (Schritt 3). Nach Anbindung der Marker-haltigen Fragmente an eine Streptavidin-Matrix (z.B. Streptavidin-beschichtete magnetische Partikel), kann dann ein Adapter enthaltend eine zweite Primerbindsungsstelle (PB') an die gebundenen Fragmente über die entsprechenden überhängenden Enden („sticky ends") ligiert werden. Die so erhaltenen Nukleinsäurekonstrukte können dann amplifiziert und sequenziert werden. Beim methylierungsspezifischen DK wird das erste Enzym durch ein methyiierungssensitives Enzym ersetzt. In einer alternativen Ausführungsform, die in Abb. 4, Schritt 5-8 gezeigt wird, können auch Tagging-Enzym-Bindungsstellen enthaltende Marker, die im vorliegenden Fall biotinyliert sind, und Adapter für den Aufbau der Nukleinsäurekonstrukte verwendet werden. Es werden dann die in Schritt 5 gezeigten Nukleinsäurekonstrukte enthalten. Durch Zugabe des Tagging-Enzyms werden dann kurze TAGs aus der Nukleinsäure geschnitten (Schritt 6). Sofern diese überstehende Enden aufweisen werden die erhaltenen Fragmente , dann z.B. mit dem Klenow-Fragment aufgefüllt.
Nun können die in Lösung befindlichen adapterhaltigen Fragmente mit Markern zu dem entsprechenden Nukleinsäurekonstrukt über dessen glatte Enden („blunt-ends") ligiert (Schritt 7.1 ) und im Anschluss amplifiziert werden. Das amplifizierte Nukleinsäurekonstrukt kann dann z.B. elektrophoretisch gereinigt und sequenziert werden. Auch das an der festen Phase gebundene Fragment kann zu dem gewünschten Nukleinsäurekonstrukt weiterverarbeitet werden, indem man das glatte Ende mit einem Adapter enthaltend eine zweite Primerbindungsstelle ligiert (Schritt 7.2). Das gebundene Nukleinsäurekonstrukt kann direkt amplifiziert und im Anschluss sequenziert werden. Es können aber auch die in Lösung befindlichen Fragmente enthaltend den Adapter und einen TAG und die gebundenen Fragmente enthaltend den Marker und einen TAG miteinander zu Ditags ligiert werden (Schritt 6.2) bevor die Amplifizierung und Sequenzierung des erhaltenen
Nukleinsäurekonstruktes erfolgt.
Die im Folgenden beschriebenen Anwendungen der Erfindung belegen die vielfältigen Verwendungsmöglichkeiten der Erfindung.
Alle Anwendungen haben zum Ziel, ein Gemisch aus Nukleinsäuresträngen vor der Amplifikation und Sequenzierung mit einem RAT zu versehen. Durch Ermittlung und Eliminierung der mehrfach vorkommenden TAG-RAT Kombinationen aus dem Datensatz, kann die Ursprüngliche Zusammensetzung des TAG- und damit des Nukleinsäuregemischs ermittelt werden. Die Verwendung von RAT-TAG
Kombinationen zur sicheren quantitativen Bestimmung einer Nukleinsäure- zusammensetzung in einer Probe, kann in bekannte Verfahren integriert werden es ermöglicht aber auch neue Verfahren zur Bestimmung der Zusammensetzungen von Nukleinsäuresträngen. Durch die Verwendung des RATs sind die Verfahren um die Möglichkeit bereichert, amplifikationsbedinge Änderungen der Zusammensetzung der Nukleinsäurestränge genau nachzuvollziehen.
1 ) RAT-Markierung von Nukleinsäuren vor ihrer Vermehrung durch Lineare Amplifikation:
2) Konstrukte für die Quantifizierung von cDNA,
2.1.) Konstrukte für die Quantifizierung von 3-Enden von cDNA, 2.2.) Konstrukte für die Quantifizierung von 5'-Enden von cDNA, 2.3.) Konstrukte für die gleichzeitige Quantifizierung von 5'-und 3'-Enden von cDNAs,
2.4.) Konstrukte für die gleichzeitige Quantifizierung von 3'-und 5 -Enden der gleichen cDNA mit Hilfe einer Zirkularisierungsmethode, 3) Konstrukte für die Quantifizierung von cDNA, die nicht aus Poly-A-haltiger RNA hergestellt wurde,
4) Konstrukte für die Quantifizierung von Fragmenten genomischer DNA: 4.1.) Aus Chromatin-Immuno-Precipitation, 4.2.) Für Digitales Karyotyping,
4.3.) Für Methylation-Spezific Digital Karyotyping, 4.4.) Von Bisulfit umgesetzer DNA, 4.5.) Für Metagenomics-Analysen,
4.6.) Konstrukte für die Quantifizierung beider Enden von Fragmenten genomischer DNA mit Hilfe einer Zirkularisierungsmethode.
Allen beschriebenen Methoden ist gemein, dass die verwendeten PBs bevorzugt direkt für die Verwendung in Hochdurchsatzsequenziermaschinen genutzt werden können. 1 ) RAT-Markierung von Nukleinsäuren vor ihrer Vermehrung durch lineare
Amplifikation:
Ziel der „linearen Amplifikation" ist es, Nukleinsäuren so zu vermehren, dass die verhältnismäßige Zusammensetzung einer Nukleinsäure-Probe weniger stark verändert wird, als dies bei der exponentiellen Amplifikation mittels PCR der Fall ist. Jedoch treten auch bei der „linearen Amplifikation" von RNA sequenzbedingte
Abweichungen der Kopienzahl auf (e.g. Caretti et al 2008, J. Cellular Biochemistry 103:556-563), die durch Einbindung eines einzelsträngigen RAT erkannt werden können. Der RAT kann hierbei zwischen der Primerbindungsstelle oder einer Polymerasebindungsstelle (z.B. für RNA-Polymerasen wie T7, SP6 oder T3) und dem TAG platziert werden.
Der Marker kann hierbei z.B. einzel- oder doppelsträngig an RNA ligiert werden (US 6,916,633) z.B. an das 5' Ende der RNA. Hiernach kann eine Erststrangsynthese mit Hilfe eines PoIy-T Primers stattfinden und danach die Zweitstrangsyntehse, z.B. mit Hilfe des Primers, passend zur im Marker vorhandenen PB. Alternativ dazu kann der Oligo-dT- Primer einen Marker dessen PB aus einer Polymerasebindungsstelle
(z.B. T7, Sp6 oder T3 Promotor) bestehen kann, die Zweitstrangsynthese kann dann z.B. mit Oligohexameren stattfinden (Dafforn et al., Biotechniques. 2004 Nov ;37 (5):854-7).
2) Konstrukte zur Quantifizierung von cDNA
2.1. Konstrukte für die Quantifizierung von 3'-Enden von cDNA Zur Amplifikation wird die mRNA zunächst mit Hilfe eines Oligo-dT- Primers mittels Erst- und Zweitstrangsynthese in cDNA umgeschrieben. Für die spätere Amplifikation mit einer Polymerase, wie z.B. der SP6-, T3- oder T7-RNA- Polymerase, enthält dieser Primer auch die Promotorsequenz für die entsprechende
Polymerase. Die spätere, doppelsträngige cDNA hat dann die Domänenstruktur "cDNA - Oligo-A/T - Promotor". Veränderungen der Nukleinsäure-Zusammensetzung nach Amplifikation und Sequenzierung können erkannt werden, wenn zwischen dem Promotor und der zu amplifizierenden DNA ein RAT integriert wird. Die resultierende Domänenstruktur ist in diesem Fall
"cDNA - Oligo-A/T - RAT - Promotor",
wobei die Promotor-Sequenz auch gleichzeitig als Primerbindungsstelle dienen kann. Es kann allerdings auch eine separate Primerbindungsstelle (PB) neben dem
Promoter (Polymerasebindungsstelle) eingebaut werden, so dass die folgende Domänenstruktur erhalten wird:
"cDNA - Oligo-A/T - RAT - PB - Promotor",
Für die Quantifizierung ohne vorhergehende direkte Amplifikation z.B. mit Hilfe einer Polymerase, wie z.B. der SP6-, T3 oder T7-Polymerase wird ein Konstrukt gewählt, das statt des jeweiligen Promotors eine Primer-Bindungsstelle (PB) und /oder für die Verwendung von Typlll Restriktionsenzymen wie Ecop15l in späteren Verfahrensschritten eine TES enthält. Eine entsprechende Domänenstrukture ist dann: cDNA - Oligo-A/T- TES - RAT - PB
Die beiden folgenden bevorzugten Verfahren können ebenfalls verwendet werden, um TAGs zu quantifizieren, die von den 3'-Enden einer cDNA gewonnen wurden, die den Poly-A-Teil enthalten.
Für die Quantifizierung von 3' cDNA-Enden in einem bevorzugten Verfahren wird mRNA mit einem PoIy-T enthaltenden Marker Poly-T-RAT-PB-Biotin mittels Erstund Zweitstrangsynthese in cDNA umgeschrieben. Die cDNA wird danach mit einem oder mehreren häufig schneidenden Enzymen (Anchoring Enzyme) verdaut. Die
Marker-haltigen Fragmente werden dann an eine Streptavidin-modifizierte Matrix wie z.B. magnetische Partikel gebunden. Nichtgebundene Fragmente werden durch Waschen entfernt. Es folgt die Ligation mit einem Adapter enthaltend eine Ligationsstelle am distal zur Primerbindungsstelle gelegenen Ende, die z.B. durch eine Amino-C7-Modifikation vor Ligation geschützt ist, und die Ligation z.B. mittels überhängende DNA-Enden der Ligationsstelle begünstigt wird. Nach Entfernen der nicht ligierten Adapter können die erhaltenen Nukleinsäurekonstrukte amplifiziert und sequenziert werden. In der bevorzugten Variante diese Verfahrens wird in dem oben beschriebenen Verfahren anstelle des Adapters ein Marker verwendet. In diesem Fall ist es nicht notwendig, die mRNA mit einem RAT enthaltenden PoIy-T-
Oligonukleotid umzuschreiben, sondern mit einem gewöhnlichen, beispielsweise 5' biotinlyierten PoIy-T Oligonukleotid.
In einem weiteren bevorzugten Verfahren zur quantitativen Untersuchung der Genexpression wird mRNA unter Verwendung eines 5' biotinylierten PoIy-T
Oligonukleotids, mit einer EcoP15l-Bindungsstelle (EcoP15ITES) vor der PoIy-T Sequenz, in cDNA umgeschrieben. Danach erfolgt der Verdau mit einem häufig schneidenden Restriktionsenzym (Anchoring Enzyme), z.B. mit NIaIII. Die geschnittene cDNA wird durch die Biotin-Gruppe an eine Streptavidinmatrix gebunden, z.B. an streptavidinbeschichtete, magnetische Partikel. Alternativ können die Oligo-dT bereits vor der cDNA-Synthese an die Matrix gebunden sein oder der Verdau mit dem Anchoring Enzyme erst nach Binden an die Partikel stattfinden. Die nicht gebundenen Fragmente werden durch Waschen entfernt. Im nächsten Schritt erfolgt die Ligation mit einem doppelsträngigen PB'- EcoP15ITES Oligonukleotid (Adapter). Die erhaltenen Nukleinsäurestränge werden dann mit EcoP15l verdaut und die abgespaltenen Fragmente nach einer
Gelelektrophorese isoliert .Die Adapter-TAG Konstrukte können nun mit einem Marker ligiert werden. Die erhaltenen Nukleinsäurekonstrukte besitzen die folgende Domänenabfolge:
PB'-EcoP15ITES-TAG-RAT-PB.
Im Anschluss erfolgen eine PCR-Amplifikation und die Sequenzierung der amplifizierten Konstrukte und die Ermittlung der TAG-RAT- Kombinationen und Auszählung wie zuvor beschreiben.
Alternativ dazu wird anstelle des Adapters ein Marker enthaltend eine RAT-Domäne verwendet, und anstelle des zuvor verwendeten Markers eine Primerbinungsstelle (Adapter) ligiert werden. Das Konstrukt welches nach dem Ecop15l Verdau freigesetzt wird hat dann z.B. die Struktur:
Pb'RAT-EcoP15ITES-TAG-PB
2.2. Konstrukte für die Quantifizierung von 5-Enden von cDNA
Für die genaue Quantifizierung der 5'-Enden von cDNAs können RATs an der 5' Ende von mRNA angebracht werden, Die 51 Enden von Eukaryonten sind mit einer sog. CAP-Struktur modifiziert, bestehend aus einem Guanin-Nukleotid, das durch eine ungewöhnliche 5'- zu 5'-Triphosphat-Bindung an die mRNA gebunden ist. Zur Anbindung eines RAT kann z.B analog zur Herstellung von Voll-Längen-cDNA Verfahren werden (Clepet et al. Improved full-length cDNA production based on RNA tagging by T4 DNA -Ligase. Nucleic Acids Research, 2004, Vol. 32, No. 1 e6). Dabei werden RNAs zunächst z.B. mit alkaliner Phosphatase" behandelt. Transkripte mit intakter 5"-CAP-Sequenz werden von diesen Enzymen nicht dephosphoryliert, während gebrochene mRNA-Moleküle und nicht-codierende RNA, die keine CAP- besitzen, dephosphoryliert werden und statt der Phosphat-Gruppe mit einer 5'-OH Gruppe enden, an welche keine RNA-Oligonukleotide ligiert werden können. Im zweiten Schritt wird dann die CAP z.B. mit Hilfe der „tobacco acid Phosphatase" enzymatisch entfernt, wobei die 5'-Phosphatgruppe frei wird, die dann für die
Ligation eines RNA-Oligonukleotids zur Verfügung steht. Dieses Oligonukleotid bekannter Sequenz dient später als Primerbindungsstelle (PB) für die Zweitstrang- Synthese der cDNA. Um in dieses Konstrukt einen RAT einzufügen, sollte die Sequenz des RNA-Oligonukleotids so gewählt werden, dass das spätere RNA- Konstrukt die Domänenfolge 5'-PB - RAT - mRNA-3' besitzt. Wahlweise kann in dieses Konstrukt eine (T7-Polymerase-) Promotorsequenz eingefügt werden, die dann als Polymerasebindungsstelle und gleichzeitig als Primer-Bindestelle (PB) dienen kann, Die entsprechende Domänenstruktur ist dann
'5'-(T7)Promotor - RAT - mRNA-31
Eine andere Methode um das 5' Ende einer RNA mit einem Marker (PB und RAT) zu versehen, ist die Verwendung des „Switch Mechanism At the 5'-end of Reverse Iranscript" (SMART, TAKARA, Seta Otsu, Japan). Hierbei entsteht bei der Erststrang-Synthese der cDNA ein von der Reversen Transkiptase gebildeter, aus mehreren (meist drei) Cytosin-Basen bestehender Überhang auf der 3'-Seite des neu entstandenen DNA-Strangs (siehe dazu auch Abb. 2, Schritte 2 bis 4). Dieser steht als Bindestelle für einen Oligonukleotid-Primer zur Verfügung. Hier kann z.B., um den RAT einzufügen, ein Oligonukleotid, das am 5'-Ende eine Primerbindestelle besitzt, gefolgt von einem RAT der wiederum mit drei aufeinanderfolgenden Guanin- Basen am 3'-Ende abschließt, als Primer für die Zweitstrangsynthese der cDNA verwendet werden.
Um einen TAG vom 5'-Ende einer cDNA zu gewinnen, der zur Quantifizierung der ursprünglichen mRNA dienen kann, wird wie oben beschrieben ein
Nukleinsäurekonstrukt enthaltend zumindest eine PB (oder eine Promotorsequenz, wie z.B. von SP6, T3 oder T7), einen RAT und optional eine TES an die nach der Dephosphorylierung und Entfernung der CAP-site frei werdende δ'-Phosphatgruppe gebunden. Das entsprechende einzelsträngige RNA-Konstrukt hat dann bevorzugt die Form
5' PB/Promotor - RAT - mRNA 3' oder
5' PB/Promotor - RAT - TES - mRNA 3'
Nach Erststrangsynthese mit Hilfe von PoIy-T Oligonukleotiden und nach
Zweitstrangsynthese mit einem zur Primerbindungsstelle passenden, 5' biotinylierten Primer entsteht das Konstrukt:
51- Biotin-PB/Promotor - RAT - TES - cDNA - Oligo-A/T-31.
Dieses kann über die Biotin-Gruppe an eine feste Phase gebunden werden. Wenn die TES die Erkennungssequenz eines Typ-Il-Restriktionsenzyms handelt, kann das Produkt sofort damit geschnitten werden. Während der nicht gebundene Teil der cDNA weggewaschen werden kann, bleibt an die feste Phase ein Konstrukt mit der Domänen-Abfolge
51- Biotin-PB/Promotor - RAT - TES - TAG.- 3'.
Alternativ dazu kann ein TAG auch im Sinne der Erfindung durch mechanische Zerkleinerung der cDNA oder Behandlung mit einer unspezifischen Endo- oder
Exonuklease gewonnen werden. Er besitzt dann allerdings nicht per Definition eine definierte Länge. In diesem Fall entfällt die Notwendigkeit, eine TES-Domäne in das Konstrukt einzuführen. Es reicht die Domänen-Abfolge
5"-Biotin-PB/Promotor - RAT - TAG,
um die cDNA zu markieren. An die nach Verdau oder Zerkleinerung frei werdenden 3'-Enden kann eine weitere Primerbindungsstelle (PB), ein Adapter oder Marker gebunden werden. Dieses Konstrukt, das im Falle der Verwendung eines Tagging-Enzyms eine definierte Länge hat, kann dann durch Amplifikation, ausgehend von den beiden darin enthaltenen PBs, amplifiziert und sequenziert werden.
Wenn es sich bei dem Tagging-Enzym um eine Typlll-Endonuklease wie etwa EcoP15l handelt, wird an die Schnittstelle des Restriktionsenzyms bzw. an das durch die unspezifische Endonuklease oder die mechanische Zerkleinerung entstehende freie Ende, das distal zur Biotin-Gruppe liegt, bevorzugt ein Konstrukt, das eine PB einen RAT und eine TES enthält so angefügt, dass ein Konstrukt der Form
δ'-Biotin-PB/Promotor - TAG - TES - RAT- PB - 3'
Solche Konstrukte können mittels PCR amplifiziert, anhand ihrer definierten Größe identifiziert und isoliert werden (z.B. mit Gelektrophorese, HPLC), nach Sequenzierung und Ermittlung der mehrfach vorkommenden TAG-RAT Kombinationen kann die Ursprüngliche Zusammensetzung des TAG-Gemischs ermittelt werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Herstellungsverfahrens werden als feste Phase bevorzugt Streptavidin-beschichtete, magnetische Partikel verwendet. Auch Streptavidin-beschichtete Reaktionsgefäße sind eine bevorzugte
Alternative.
2.3.) Konstrukte für die gleichzeitige Quantifizierung von 5'-und 3'-Enden von cDNAs Oben beschrieben Konstrukte von der Form: 5'- Biotin-PB/T7-Promotor - RAT - TES - cDNA - Oligo-A/T-3' oder andere, schon beschriebene Konstrukte erlauben es prinzipiell, lediglich einen TAG von einem der cDNA-Enden zu gewinnen. In speziellen Fällen wird jedoch die Gewinnung zweier TAGs vom 5'- und 3'-Ende der gleichen cDNA gewünscht. Dazu wird bevorzugt ein zirkuläres Produkt der Form
δ'-PB-cDNA-Gϊigo-A/T-PB'-S1
hergestellt, wobei PB und PB1 bevorzugt nicht die gleiche Sequenz haben. Nachdem die Enden der cDNA analog zu oben beschriebenen Verfahren mit PB und PB' versehen wurden, können die so mit bekannten Sequenzen versehenen cDNA- Enden durch Ligation ihrer PB-Enden unter geeigneten Bedingungen zu einem zirkulären Molekül umgestaltet werden. Diese zirkulären Moleküle können jetzt durch
PCR, lineare Amplifikation mit nur einem Primer oder mittels „rolling circle Amplifikation" (Demidov, Nat. Genet. 1998, 19 (3), 225-232.) ausgehend von den PB-Domänen vermehrt werden. Um die ursprüngliche Zusammensetzung der cDNA- Population mit Hilfe von RATs ermitteln zu können, kann mindestens ein Ende mit einem Marker versehen werden der eine PB-Domäne enthält.
PB und PB" können dabei sowohl komplementäre, überhängende Einzelstrangenden haben, die sich besonders für eine Zirkularisation eigenen, als auch glatte Enden besitzen. Die Ligation zur Zirkularisierung der Moleküle erfolgt bevorzugt in genügend großer Verdünnung, so dass die Wahrscheinlichkeit, dass ein Ende des gleichen cDNA-Moleküls dem anderen Ende näher ist als ein beliebiges Ende eines anderen Moleküls, ausreichend groß ist. Aus den so zirkularisierten Molekülen können dann entweder enzymatisch oder durch mechanische Zerkleinerung Konstrukte gewonnen werden, die einen TAG von jedem Ende des Moleküls enthalten. Sie haben dann die Form:
5'-TAG - RAT - PB - PB1 - RAT1 - TAG-31
Durch Anfügen zweier weiterer Primerbindungsstellen an die Enden dieses Konstrukts entstehen Konstrukte der Form
1 ) 5'-PB"- TAG - RAT - PB - PB1 - RAT- TAG - PB"1^', oder, je nachdem welches 3'-Konstrukt verwendet wurde
2) 5'-PB11- TAG - RAT - PB - PB1 - TAG - PB1M-3\
das ausgehend von PB" und PB1" amplifiziert und dann sequenziert werden kann, wobei PB" und PB"1 bevorzugt aber nicht notwendigerweise ungleiche Sequenzen haben.
Um Konstrukte definierter Länge zu erhalten, kann eine Größenselektion z.B. über HPLC oder Gelelektrophorese erfolgen, oder es können ein oder mehrere Tagging-
Enzyme verwendet werden.
Für die Verwendung von Typ-Il-Enzymen wird das 5'-Ende der cDNA mit einem Konstrukt der Form
51- TES - (CAP-Site)-cDNA-3' oder
5'- PB - TES - (CAP-Site)-cDNA-3'
versehen, wobei die TES bevorzugt zusammen mit der PB Teil eines Adapters ist.
3) Konstrukte für die Quantifizierung von cDNA, die nicht aus Poly-A-haltiger RNA hergestellt wurden
Viele RNA-Moleküle in eukaryotischen Zellen sowie nahezu alle bakteriellen und viralen RNAs enthalten, anders als Protein-codierende eukaryotische mRNAs, keine
S'-Poly-A-Sequenz. Um sie zu quantifizieren, werden sie bevorzugt zunächst mit einem einzel- oder doppelsträngigen RNA-oder DNA-Oligonukleotid bekannter Sequenz ligiert, das später als Primerbindestelle dienen kann. Hierzu können in einem ersten Schritt z.B. nicht- phosphorylierte Oligonkleotide mit Hilfe von verschiedenen Ligasen, z.B. mit der T4-RNA-Ligase gezielt an das phosphorylierte
5'- Ende einer RNA ligiert werden und im Anschluss daran 5' phosphorylierte Oligos an das e 3'-Ende einer einzelsträngigen Nukleinsäure ligiert werden Somit kann ein einen RAT und eine PB enthaltendes Oligonukleotid (Marker und Adapter) gezielt an beide Enden einer RNA ligiert werden So können RATs z.B. an nicht-proteincodierende RNA ligiert werden und diese im Anschluss daran in DNA umgeschrieben, amplifiziert und sequenziert werden. Entsprechende Konstrukte haben die Domänenabfolge:
5'-PB - RAT - RNA - PB-Amino-C7-3\ oder
5"-PB - RNA - RAT-PB-Amino-C7-3\
wobei alle Moleküle einzelsträngig sind, bzw. PBs auch als doppelsträngige RNA vorliegen können. Alternativ zur Ligation mittels RNA Ligasen kann die RNA mit Hilfe einer PoIy (A)-Polymerase künstlich mit einem Poly-A-Strang am 3' Ende der RNA versehen werden.
Nach Einfügen der Poly-A-Sequenz und Umwandlung in eine doppelsträngige cDNA können auch solche RNAs mit den gleichen Konstrukten wie oben für die mRNAs beschrieben, quantifiziert werden. Da nicht für Proteine codierende RNAs in der Regel keine CAP-Struktur besitzen, kann allerdings nicht schon verfahrenstechnisch zwischen Voll-Längen-RNAs und gebrochenen Molekülen unterschieden werden.
4) Konstrukte für die Quantifizierung von Fragmenten genomischer DNA
4.1.) Ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von DNA-Proteinbindungen basiert auf einer Vorbereitung der Probe durch Immuno-Präzipitation. Solche Verfahren werden häufig für die Bestimmung der Bindestellen für Transkriptionsfaktoren verwendet (z.B. ,,Chip-seq"-Verfahren). Dabei wird z.B. genomische DNA, die nicht von gebundenen Proteinen befreit ist, enzymatisch mit einem Restriktionsenzym oder einer unspezifisch schneidenden Endonuklease verdaut oder anderweitig (z.B. durch Ultraschall) zerkleinert. Die DNA/Protein Komplexe werden durch Immuno-
Präzipitation mit einem Antikörper gegen ein bestimmtes Protein (e.g. einen Transkriptionsfaktor) ausgefällt. Die mit-präzipitierte, an das Protein gebundene DNA wird von allen Proteinen befreit und mit oder ohne Tagging Enzym in eine mittels RATs quantifizierbare Form gebracht. Dazu werden Marker und gegebenenfalls Adapter mit den Enden der präzipitierten DNA-Fragmente ligiert, die enthaltenen Nukleinsäurekonstrukte werden amplifiziert und im Anschluss sequenziert. Als Ergebnis wird die Menge an Kopien einer bestimmten genomischen DNA-Sequenz, z.B. in einer Gewebeprobe, erhalten, an die oder in deren Nähe das Protein gebunden war.
4.2.) Das „Digitale Karyotypisieren" (DK) ermöglicht die Quantifizierung von kurzen DNA-Abschnitten im Genom. Die Technik dient dazu, chromosomale
Veränderungen, Vervielfältigungen und Deletionen zu untersuchen und die Anwesenheit von Fremd-DNA festzustellen. Hierbei wird die zu untersuchende DNA zunächst mit einem (methylierungsinsensitiven) Restriktionsenzym verdaut. Nun können biotinylierte Marker oder Adapter ligiert werden. Die Probe wird hiernach mit einem zweiten, häufig schneidenden (methylierungsinsensitiven) Restriktionsenzym verdaut und an die entstehenden Schnittstellen Marker oder Adapter ligiert. Die entstehenden Konstrukten müssen mit mindestens einem Marker versehen sein und können so amplifiziert und sequenziert werden.
Sind Marker oder Adapter mit TES ausgestattet, kann ein Tagging Enzym verwendet werden und nach Binden an eine feste Phase entweder die gebundene oder die nicht gebundene Marker-TAG bzw. Adapter-TAG Kombination gereinigt werden und mit einem weiteren Marker oder Adapter versehen werden, so dass je ein Marker mit einem Adapter (oder einem Marker) einen TAG einschließt. Sind Marker und Adapter mit einer TES, insbesondere für EcoP15l versehen wie dies in einer bevorzugen Version vorgesehen ist, so können zudem gebundene und nichtgebundene Marker-TAG und Adapter-TAG Kombinationen miteinander ligiert werden, so dass zwei TAGs von Marker und/oder Adapter eingeschlossen werden.
Im Folgenden wird eine besonders bevorzugte Variante der Analyse von genomischer DNA beschrieben, die den Einsatz des Tagging-Enzyms EcoP15l einschließt, um Nukleinsäurekonstrukte zur quantitativen Bestimmung von genomischer DNA gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren herzustellen.
Zur Analyse von genomischen DNA-Fragmenten wird in einer bevorzugten Methode die DNA wie zuvor beschrieben zunächst mit einem oder mehreren
Restriktionsenzymen verdaut. Für die Analyse von aus Immuno-präzipitiertem Material stammender DNA kann diese auch z.B. durch Scherung oder Ultraschall mechanisch zerkleinert werden.
Die erhaltenen DNA-Fragmente werden hiernach mit einem biotinylierten
Oligonukleotid 1 (Adapter oder Marker) ligiert, das distal zum biotinylierten Ende eine Schnittsequenz für ein Restriktionsenzym besitzt, wobei nach dem Restriktionsverdau mit dem entsprechenden Enzym Ligationsstelle (LS1 ) mit einem überhängenden Einzeslstrangende entsteht. Für eine Ligation mit mechanisch zerkleinerter DNA werden Oligonukleotide (Marker oder Adapter) mit glatten Enden verwendet. Die Enden der zerkleinerten DNA werden vor der Ligation mit dem Klenow Fragment ebenfalls geglättet. Weiterhin enthält der Adapter am biotinylierten Ende eine Primerbindungsstelle (PB1 ). Für den Einsatz von EcoP15l als Tagging- Enzym muss das Oligonukleotid 1 zudem die Sequenz 5'-CAGCAG'-3' (TES) vor der Ligationsstelle tragen. Nach Binden an eine Streptavidin-modifizierte feste Phase und Waschen zur Entfernung von ungebundenen Fragmenten wird mit einem weiteren Enzym verdaut. Bevorzugt werden dazu Restriktionsenzyme, die möglichst viele Restriktionsschnittstellen in der zu analysierenden DNA aufweisen, wie z.B. NIaIII, Dpnll, Taq1 , Fatl, Sau3A, Mbol etc. verwendet. An die neue Restriktionsschnittstelle wird ein weiteres Oligonukleotid (Oligonukleotid 2) mit an die gebundene DNA ligiert. Das Oligonukleotid 2 enthält eine weitere Erkennungssequenz für das Restriktionsenzym EcoP15l (5'-CTGCTG-3' (TES)) gefolgt von einer Restriktionsenzymschnittstelle, aus der nach Restriktionsverdau eine Ligationsstelle (LS2) hervorgeht. Die Ligation erfolgt mit den, durch den Verdau mit dem entsprechenden häufig schneidenden Restriktionsenzym entstehenden
Ligationsstellen der DNA. Oligonukleotid 2 ist zudem am distal zur LS befindlichen Ende vor Ligation geschützt, z.B. durch eine Amino-C7 Modifikation. Durch die beschriebenen Verfahrensschritte entsteht das folgende Produkt:
5'-CTGCTG-LS2-Nukleinsäure-LS1 -CAGCAG-PB1 -3'-(feste Phase)
Nach Verdau mit dem Tagging-Enzym EcoP15l entstehen 25-27 Bp lange TAGs. Diese können nun mit einem weiteren Oligonukleotid 3 ligiert werden. Dieses Oligonukleotid hat den Aufbau RAT-PB2, wobei eine Ligation nur über das freie Ende des RAT erfolgt, da das freie Ende des PB2 vor einer Ligation, z.B. durch eine Amino-C7 Modifikation, geschützt ist. Nach Waschen der festen Phase werden die gebundenen Nukleinsäurekonstrukte von der festen Phase abgelöst, es entsteht folgendes zur Hochdurchsatz-Sequenzierung besonders geeignete Konstrukt:
PB2-RAT-TAG-LS1 -CAGCAG-PB1.
Alternativ oder zusätzlich kann der RAT auch im PB1 enthaltenden Oligonukleotid 1 integriert werden, es entsteht das Produkt PB2- TAG-LS1-CAGCAG-RAT-PB1 bzw. PB2-RAT-TAG-LS1-CAGCAG-RAT-PB1.
4.3.) Methylierungsspezifische digitale Karyotypisierung (MSDK): Diese Technik dient dazu, den Methylierungszustand einer genomischen DNA zu untersuchen. Hierzu wird das bei DK verwendete erste Enzym mit einem methylierungssensitiven Enzym ersetzt. Dieses kann nur nicht-methylierte Erkennungssequenzen schneiden. Die restlichen Schritte sind analog zum DK. Je nach Methylierungszustand der genomischen DNA entstehen so unterschiedliche TAGs aus verschiedenen Proben.
4.4.) Zur Analyse des Methylierungszustandes einer genomischen DNA wird zudem oft ein Vergleich zwischen Proben Bisulfit behandelter und gegebenenfalls auch nicht-behandelter DNA angestellt. Die Bisulfit Behandlung bewirkt die Umwandlung on unmethyliertem Cyctosin nach Uracil, methyliertes Cytosin bleibt jedoch unverändert. Das Uracil wird in nachfolgenden Polymerisationsreaktionen zu Thymin und so sequenziert (z.B. Techniques used in studies of epigenome dysregulation due to aberrant DNA methylation: an emphasis on fetal-based adult diseases Shuk-mei Ho and Wan-yee Tang, Reprod Toxicol. 2007; 23(3): 267-282).
Die so behandelten Fragmente können analog zur den beschriebenn Methoden mit
Markern und Adaptern versehen, sequenziert und ausgewertet werden.
4.5.) Für die Analyse der Zusammensetzung der Organismen einer biologischen Probe („Metagenomics") können die DNA-Bereiche der Organismen, die für die Analyse geeignet sind, gegebenenfalls angereichert werden (z.B. über eine
Hybridisierung mit spezifischen Oligonukleotiden) und wie zuvor beschrieben mit einem RAT versehen werden.
4.6.) Konstrukte für die Quantifizierung beider Enden von Fragmenten genomischer DNA mit Hilfe einer Zirkularisierungsmethode
Oft ist es vorteilhaft, von beiden Enden eines Nukleinsäuremoleküls einer genomischen DNA je einen TAG zu gewinnen, um beide Enden zu quantifizieren. Zur Fragmentierung der genomischen DNA kann diese entweder mit Restriktionsenzymen, unspezifischen Endo- oder Exonukleasen oder durch mechanische Zerkleinerung in kleinere Fragmente beliebiger Größe zerlegt werden. Nach Bindung dieser linearen Moleküle an die bereits erwähnten Konstrukte der Form (1 ) TES-RAT-PB-RAT-TES oder (2) TES-RAT-PB-PB'-RAT-TES können die Moleküle zirkularisiert und danach amplifiziert werden, wenn die Fragmente eine bestimmte Größe nicht überschreiten.
Diese Reaktionen können an einer festen Phase oder bevorzugt in Lösung stattfinden. Für die Bindung an eine feste Phase bietet sich die Modifikation eines oder beider TES durch eine Biotin-Gruppe an.
Die Amplifikation des zirkulären Moleküls geht dabei von den Primerbindungsstellen (PB) aus, wobei bei (1 ) die Primer zumindest teilweise komplementär zueinander und zu je einem Strang der PB sind. Bei (2) handelt es sich um zwei verschiedene Primerbindungsstellen und die von den daran bindenden Primern ausgehende Amplifikation erfolgt gegenläufig. In beiden Fällen entstehen zirkuläre Moleküle, die nach dem Schnitt mit dem TE die Domänen-Abfolge
TAG-TES-RAT-PB-RAT-TAG bzw.
TAG-TES-RAT-PB-PB'-RAT-TAG
besitzen.
Es ist oft sinnvoll (z.B. für eine gerichtete Sequenzierung oder Klonierung), an eines oder beide Enden dieser Konstrukte eine oder zwei weitere Domänen bestehend aus einem oder zwei Adapter(n), ein oder zwei Linker(n) oder einer oder zwei
Primer-Bindungsstelle(n) zu binden, so dass dann z.B. Konstrukte mit der in cc) bis ff) dargestellten Domänen-Folge entstehen: cc) PB"-TAG-TES-RAT-PB-RAT-TAG dd) PB"-TAG-TES-RAT-PB-RAT-TAG-PB" ee) PB"-TAG-TES-RAT-PB-PB1-RAT-TAG-PB" und ff) PB^TAG-TES-RAT-PB-PB^RAT-TAG-PB1"
Dabei können die Domänen PB" und PB'" hier im Sinne der Erfindung durch die oben erwähnten Domänen (Adapter) ersetzt werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Markerensemble zur quantitativen Bestimmung von Nukleinsäuren, wobei die enthaltenen Marker jeweils eine artifizielle Polynukleotiddomäne mit voneinander unterschiedlicher zufälliger Sequenz und eine Primerbindungsstelle umfassen. Bevorzugte Markerensemble beinhalten Marker, die zusätzlich eine Bindungsstelle für ein Tagging-Enzym enthalten, wobei die Tagging-Enzym-Bindungsstelle am distalen Ende zur Primerbindungsstelle des Markers liegt. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind darüber hinaus Kits, enthaltend ein solches Markerensemble zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens.
Ausführungsbeispiele:
Beispiel 1 : Verwendung von RATs für die Quantifizierung von mRNAs. Im Folgenden wird die Verwendung der RATs für die Quantifizierung von mRNAs in einem bevorzugten Verfahren beispielhaft beschrieben. Dazu wird die mRNA zunächst in eine cDNA umgeschrieben. Dann wird von praktisch jedem cDNA-
Molekül ein TAG gewonnen, der mit einem Marker enthaltend einen RAT versehen ist. Das erhaltene Nukleinsäurekonstrukt wird dann amplifiziert und sequenziert.
cDNA-Synthese mit einem oligo-dT Primer (PolyT-Oligonukleotid): Mit Hilfe eines handelsüblichen Kits mit Trizol Reagenz (Invitrogen Inc.) wird etwa 1 mg Gesamt-RNA aus einer biologischen Probe (einer MW Leukämiezelllinie) gewonnen. Aus der Gesamt-RNA werden mit einem handelsüblichen Kit ("Oligotex-
Midi-Kit", Qiagen N.V.) 5μg mRNA isoliert. Die cDNA wird im Anschluss mit dem
„cDNA synthesis System", (Invitrogen Corp.) hergestellt, wobei das folgende, am 5' Ende biotinyliertes Oligonukleotid verwendet wird, dieses enthält die
Erkennungssequenz für EcoP15l CAGCAG:
Biotin-δ'-CTGATCTAGAGGTACCGGATCCCAGCAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT-S1
(SEQ ID No. 2)
Das Produkt wird dann zu einer doppelsträngigen DNA konvertiert (cDNA synthesis System", Invitrogen Corp.) und in 20μl LoTE Puffer (3 mM Tris-HCI, pH 7.5, 0.2 mM
EDTA) gelöst.
Verdau mit dem Anchoring Enzym Dpnll:
Die doppelsträngige cDNA (20 μl) wird in einer 200 μl Reaktionslösung mit 50 Units Dpnll (New England BioLabs Ine, Ipswich, UK; NEB) mitgelieferten Puffer bei 37°C für 90 Minuten verdaut, Nach dem Verdau wird die cDNA zur Entfernung des Enzyms mit TE-equilibriertem Phenol/Chlorophorm/Isoamylalkohol (25:24:1 , pH= 8,0) extrahiert und mittels „Ethanol Präzipitation" gefällt: Hierbei wird Ethanol (3,65- faches Volumen) und Ammoniumacetat, (0,56-faches Volumen, 7,5 M) und 1 μl Glycogen (NEB) zu 1 Volumen der DNA-haltigen Lösung gegeben und die DNA bei - 2O0C für 8 h gefällt, für 30 min bei 10.000 g zentrifugiert und das Pellet 2X mit 70% Ethanol gewaschen und für 30 Minuten getrocknet und in LoTE oder Wasser zurückgelöst, hier in 10 μl LoTE.
300 μl Streptavidin-beschichtete magnetische Partikel (MP; Dynabeads M279, Dynal Biotech GmbH, Hamburg, DE) werden mit 200 μl 1x B&W Lösung (5 mM Tris-HCI, pH 7.5, 0.5 mM EDTA, 1 M NaCI) gewaschen, wobei nach Zugabe der B&W Lösung der „Magnetic Particel Capturer (MPC; Promega GmbH, Mannheim DE) benutz wird, um die magnetischen Partikel an der Gefäßwand zu halten und die B&W-Lösung auszutauschen. Zur cDNA (100 μl) werden hiernach 100 μl 2x B&W Lösung (10 mM Tris-HCI, pH 7.5, 1 mM EDTA, 2M NaCI) gegeben und die 1x B&W-Lösung der MP mit der cDNA-Lösung ersetzt. Die MPs werden hiernach zur Bindung der biotinylierten cDNA mit den Strepatvidin-MPs unter Rotation für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Mit Hilfe des MPC werden die MPs, an die die Dpnll- verdaute cDNA gebunden ist 2 x mit 200 μl B&W-Lösung gewaschen und in 200 μl LoTE rückgelöst.
Adapter-Ligation:
An die gebundene DNA wird ein Adapter ligiert, der die Erkennungssequenz für das Tagging-Enzym enthält. Dieser ist aus den folgenden einzelsträngigen Oligonukleotiden A und B zusammengesetzt: Oligonukleotid B enthält eine Amino- C7-Modifikation am 3' Ende, um eine ungewollte Ligation an dieser Stelle zu verhindern und ist am 5' Ende phosphoryliert, um die Ligation auf dieser Seite zu ermöglichen.
Dazu werden die beiden Einzelstränge des Oligonukleotid-Adapters
A: 5' -Phosphat-GATCCTGCTGTAGAACTCTGAACCTGT [Amino-C7]-3' (SEQ ID No. 3) und
B: 51 -ACAGGTTCAGAGTTCTACAGCAG-S1 (SEQ ID No. 4)
in 0,2 mM Tris-EDTA in einer Konzentration von 100 μM gelöst, und miteinander zu einem Doppelstrang hybridisiert, indem beide Oligonukleotid-Lösungen im Verhältnis 1 :1 gemischt, auf 96°C erhitzt und danach langsam auf Raumtemperatur abgekühlt werden. Der Linker enthält die Erkennungssequenz für das Tagging-Enzym EcoP15l (CAGCAG). Es entsteht ein doppelsträngiger Linker mit einem 5' GATC-Überhang, der mit der Dpnll Restriktionsschnittstelle ligiert werden kann.
Ligase-Reaktion:
Folgender Ligationsansatz wird hergestellt:
5 μl 5X Ligase Buffer (Invitrogen, Corp.)
+3 μl Linker (100 μM) +17 μl H2O = 23 μl
Das LoTE des MP+cDNA-Ansatzes wird durch den 23 μl Ligations-Ansatz ersetzt.
Die MP werden vorsichtig gemischt, für 2 Minuten auf 5O0C erhitzt und 15 Minuten bei Raumtemperatur abgekühlt. 2 μl T4-Ligase (5U/μl, Invitrogen, Corp.) werden zu dem Ligationsansatz gegeben und die Probe bei 16°C für 2 Stunden inkubiert, alle 20 Minuten wir die Probe vorsichtig gemischt. Nach der Ligationsreaktion werden die nicht-gebundenen Linker von den MP durch 4-maliges waschen mit 300 μl 1 X B&W entfernt. Die MPs werden in ein neues Gefäß überführt und erneut 1x mit 300 μl 1 X B&W und anschließend 2x mit 1x NEB3-Puffer (New England Biolabs, Inc., NEB) gewaschen und in 300 μl NEB3Puffer aufgenommen.
Schneiden mit dem Tagging-Enzym:
Folgender Reaktionsansatz wird vorbereitet: 10 μl 10X Puffer NEB3 10 μl 1O mM ATP (NEB) 2 μl EcoP15l (NEB) 1 μl 100X BSA (NEB) 77 μl H2O
=100 μl
Die 300 μl NEB3-Puffer des MP+cDNA+Linker-Ansatzes wird im MPC durch den 100 μl Reaktionsansatz ersetzt. Die Probe wird bei 37 0C eine Stunde bei mehrmaligem vorsichtigem Mischen inkubiert. Mithilfe des MPC werden die MP an der Gefäßwand festgehalten, während der Überstand abgenommen und in ein neues Gefäß überführt werden kann. Der Überstand enthält die Linker-TAGs von 50 bp Länge (Linker+TAG). Die Linker-TAG-Fragmente im 100 μl Überstand werden im Verhältnis 1 zu 1 mit Phenol/Chlorophorm/Isoamylalkohol (25:24:1 , pH= 8,0) Lösung extrahiert, und wie zuvor beschrieben Ethanol-Präzipitiert und das Pellet in 20 μl
LoTE zurückgelöst.
Herstellung glatt-endender „blunting" der Adapter-TAG Fragmente: Durch Schnitt mit EcoP15l entstehen Adapter-TAG-Fragmente mit überstehenden 5'- Enden. Um daran später einen RAT-enthaltenden Marker mit glatten Enden zu ligieren, werden die Enden geglättet (blunting). Die blunting-Reaktion findet in 50 μl 1
X NEB Buffer 2 (New England Biolabs, Inc.) mit 33 μM dNTP, 5 units Polymerase I, Large (Klenow) Fragment (New England Biolabs Inc.), bei 25°C und mit einer 15 minütigen Inkubationszeit statt. Die Probe wird hiernach mit LoTE auf 200 μl aufgefüllt und mit Phenol/Chlorophorm/ Isoamylalkohol (25:24:1 , pH= 8,0) Lösung extrahiert, Ethanol-präzipitiert und in 10 μl LoTE gelöst.
Herstellung und Ligation mit dem RAT-enthaltenden Marker :
Der einzelsträngige Marker mit folgender Sequenz:
Phosphat 5' NNNNNNNNTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3'Amino-C7 (=RAT-A), wobei (N)8den einzelsträngigen RAT darstellt (SEQ ID No. 5) wird mit dem Primer mit folgender Sequenz
51 CAAGCAGAAGACGGCATACGA-S" (= RAT-B) (SEQ ID No. 6)
mithilfe des Klenow Fragments in folgender Lösung für 30 Minuten bei 37 0C, inkubiert, und somit doppelsträngig hergestellt:
5 μl RAT A (10 μM) 5 μl RAT B (10 μM) 1 μl dNTPs (IO mM each) 5 μMOX NEBuffer 2 (New England Biolabs Inc.)
1 μl Klenow Fragment (New England Biolabs Inc.) + 33 μl H2O = 50 μl
Der doppelsträngige, den F<AT-enthaltende Marker wird mittels TE-equilibriertem
Phenol/Chlorophorm/Isoamylalkohol (25:24:1 , pH= 8,0) extrahiert, Ethanol- präzipitiert und in 50 μl LoTE gelöst.
Die Ligation mit dem Adaper-TAG- Konstrukt findet unter folgenden Bedingungen statt:
10 μl TAG-Lösung in LoTE 1 μl 0,1 mM Marker
4 μl 5X Ligation Buffer (Invitrogen, Inc.) 2 μl T4-Ligase (Invitrogen, Inc.)
3 μl H2O =20 μl
Der Ansatz wird bei 16°C für 2 Stunden inkubiert. Die Probe wird hiernach auf 200 μl mit LoTE aufgefüllt und mit Phenol/Chlorophorm/Isoamylalkohol (25:24:1 , pH= 8,0)
Lösung extrahiert, Ethanol präzipitiert und das Pellet in 50 μl LoTE gelöst. PCR-Amplifikation:
Zunächst wird mit verschiedenen Verdünnungen der Linker-TAG-RAT- Ligationsansatz eine PCR mit 25 Zyklen durchgeführt, um die am besten für die Amplifikation geeignete Konzentration zu ermitteln. Die PCR-Reaktionsansätze zu je 20 μl werden für zur initialen Denaturierung der Templat-DNA für 2 Minuten bei
98°C inkubiert, es folgen 25 Zyklen mit: 98°C für 15 Sekunden, gefolgt von 15 Sekunden bei 600C und abschließend 15 Sekunden bei 72°C. Als Polymerase wird die Phusion-Polymerase (Finzymes, Finnland) benutzt.
Als Primer wurden verwendet
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGA 3' (SEQ ID No. 7) und
51 ACAGGTTCAGAGTTCTACAGCAG 3' (SEQ ID No. 8)
Die PCR-Produkte werden auf ein 8 % iges Polyacrylamidgel aufgetragen. Nach
Färben mit Ethidiumbromid und Visualisieren unter UV-Licht wird eine 79 Bp Marker- Adapter-TAG Bande im Gel sichtbar. Danach wird für präparative Zwecke ein 200 μl PCR-Ansatz mit derjenigen Verdünnung durchgeführt, welche die beste Amplifikation ergab.
Reinigung der Linker-TAG-RAT Fragmente:
Die Produkte der präparativen PCR werden erneut auf ein 8 % iges Polyacrylamidgel aufgetragen und das Gelstück mit der 79 Basenpaar (Bp) Bande mit einem Skalpell herausgeschnitten. In einem 1 ,5 ml Eppendorf-Gefäß wird das Gelstück mit einem Pistill zerkleinert und in 500 μl einer Elutionslösung (0,5 %
Ammoniumacetat, 2mM EDTA 0,1% SDS) über Nacht bei 37 0C inkubiert. Das eluierte RAT-Li nker-TAG-Konstrukt wird anschließend Ethanol-präzipitiert und in 10 μl LoTE rückgelöst.
Die Konzentration und Qualität des PCR Produktes wird mit einer Gelelektrophorese bestimmt. Zum Test wird ein Aliquot des gereinigten RAT-Linker-TAG-Konstrukts in den pGEM®-T Easy Vektor (Promega) ligiert, in den E. co//-Stamm DHδalpha transformiert, weiße-Kolonien selektiert und 5-10 RAT-Linker-TAG-Konstrukte enthaltende Plasmide mit dem Sanger-Verfahren sequenziert. Sieben der dabei erhaltenen, typischen Sequenzen mit unterschiedlichen PB-RAT-TAG-LS-TES-PB' -Konstrukten sind unten aufgelistet. Jeder TAG ist eindeutig mit einem RAT markiert. Die RAT-Domänen der Konstrukte sind dabei fett markiert, die TAG-
Domänen kursiv dargestellt.
Klon i
CAAGCAGAAGACGGCATACGATCTCGACGGCCΛG4 TCCTCGGTATGACAGGAG ^7CCTGCTGTAGAACTCTGAA (SEQ ID NO. 9)
Klon 2
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGTCAAGCGTGGGGGrGGGGG/4GACΛCΛΛ7TT GA TCCTGCTGTAGAACTCTGAA (SEQ ID NO. 10)
Klon 3
CAAGCAGAAGACGGCATACG AACTTACAATTCL4 TGG TA G TA CA CACA CACAG
G/irCCTGCTGTAGAACTCTGAA (SEQ ID No. 11)
Klon 4
CAAGCAGAAGACGGCATACGATTGATACCΓΓCΓCC/AGGGCTCΓGGTTACCΓG/A
TCCTGCTGTAGAACTCTGAA (SEQ ID NO. 12)
Klon 5 CAAGCAGAAGACGGCATACGACCCATCCCCCCAAGGCTGATATTTCCCTGGGA
TCCTGCTGTAGAACTCTGAA (SEQ ID No. 13)
Klon 6
CAAGCAGAAGACGGCATACGATGTATTTG>A7TLATΛ/A7TΓ/!\ΛΓGGC7TGC>AG>AΓC CTGCTGTAGAACTCTGAACCTGT (SEQ ID NO. 14) Klon 7
CAAGCAGAAGACGGCATACGATGATGTATCCΛΛ TGGTTCCAGTCA CA TA TTGA T
CCTGCTGTAGAACTCTGAACCTGT (SEQ ID NO. 15)
Mit Hilfe einer BLAST-Recherche mit dem RAT-TAG Konstrukt in NCBI-GenBank konnten die einzelnen TAGs jeweils einem bestimmten humanen Gen zugeordnet werden (Tabelle 1 ):
Tabelle 1 : Tabellarische Zusammenstellung der Ergebnisse der BLAST-Recherche
Klon Nr. Ergebnis der BLAST-Recherche
Kloni >gi I 14993673 I gb| AC010366.6 I Homo sapiens chromosome 5 clone CTD-2044J15, complete sequence
Length=115396
Score = 54.0 bits (27), Expect = 2e-05 Identities = 27/27 (100%) , Gaps = 0/27 (0%) Strand=Plus/Plus
Query GCCACATCCTCGGTATGACAGGAGATC 35
I I I M I I I I M I M I I M I M M I M I
Sbjct 6328 GCCACATCCTCGGTATGACAGGAGATC 6354 (SEQ ID No. 16)
Klon 2 >gi I 23272853 | gb [ BC035646.1 | Homo sapiens hypothetical protein LOC284356, mRNA (cDNA clone IMAGE: 5558805) , with apparent retained intron Length=1330
Score = 56.0 bits (28), Expect = 5e-06 Identities = 28/28 (100%) , Gaps = 0/28 (0%) Strand=Plus/Minus
Query 8 GTGGGGGTGGGGGAGACACAATTTGATC 35 Sbjct 1285 GTGGGGGTGGGGGAGACACAATTTGATC 1258
(SEQ ID NO. 17)
Klon 3 >gi I 10716633 |gb|AC009404.5 I Homo sapiens BAC clone RP11-28H22 from 2, complete sequence Length=112883 Score = 58.0 bits (29), Expect = le-06 Identities = 29/29 (100%) , Gaps = 0/29 (0%) Strand=Plus/Plus
Query 8 ATTCTATGGTAGTACACACACACAGGATC 36
Sbjct 98244 ATTCTATGGTAGTACACACACACAGGATC 98272 (SEQ ID No. 18)
Klon 4 >gi| 142381010 | ref |NM_002488.3 | Homo sapiens NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 alpha subcomplex, 2, 8kDa (NDUFA2) , mRNA Length=599
Score = 52.0 bits (26), Expect = 8e-05 Identities = 26/26 (100%) , Gaps = 0/26 (0%) Strand=Plus/Minus
Query 9 TTCTCCAGGGCTCTGGTTACCTGATC 34
Sbjct 350 TTCTCCAGGGCTCTGGTTACCTGATC 325 (SEQ ID No. 19)
Klon 5 >gi I 146147624 I gb I BC106894.2 I Homo sapiens cDNA clone IMAGE: 40030896 Length=673
Score = 52.0 bits (26), Expect = 8e-05 Identities = 26/26 (100%) , Gaps = 0/26 (0%) Strand=Plus/Plus
Query 9 CCCAAGGCTGATATTTCCCTGGGATC 34
Sbjct 48 CCCAAGGCTGATATTTCCCTGGGATC 73 (SEQ ID No. 20)
Klon 6 >gi I 34304121 I gb IAC106782.5 I Homo sapiens chromosome 16 clone RP11-347C12, complete sequence
Length=181001
Score = 32.5 bits (22), Expect = 0.018 Identities = 26/27 (96%), Gaps = 01/27 (0%) Strand=Plus/Plus
Query 10 ATTTATAATTTAATGGCT-TGCGATC 31 IMIII! Sbjct 1007 ATTTATAATTTAATGGCTGTGCGATC (SEQ ID No . 21/22 )
Klon 7 >gi 1164692865 I dbj |AK313066.l| Homo sapiens cDNA,
FLJ93545
Length=1860
Score = 52.0 bits (26), Expect = 8e-05 Identities = 26/26 (100%) , Gaps = 0/26 (0%) Strand=Plus/Plus
Query 1 GATCAATATGTGACTGGAACCATTGG 26
Sbjct 1555 GATCAATATGTGACTGGAACCATTGG 1580 (SEQ ID No. 23)

Claims

Patentansprüche:
1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Nukleinsäuren in einer Probe dadurch gekennzeichnet, dass
a) Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend
- mindestens eine kennzeichnende Polynukleotiddomäne einer, in einer Probe vorhandenen Nukleinsäure, die quantitativ bestimmt werden soll und
- mindestens eine artifizielle Polynukleotiddomäne mit zufälliger Sequenz und
- mindestens eine Primer- oder Polymerasebindungsstelle, wobei jeweils eine kennzeichnende Polynukleotiddomäne und mindestens eine Polynukleotiddomäne mit zufälliger Sequenz eine charakteristische
Domänenkombination bilden die von mindestens einer Primer- oder Polymerasebindungsstelle flankiert wird,
in Anwesenheit einer Polymerase amplifiziert werden und
b) nach der Amplifikation zumindest die Sequenz der Polynukleotiddomänen mit zufälliger Sequenz und eines Teils der kennzeichnenden Polynukleotiddomäne ermittelt werden, wobei zur quantitativen Bestimmung der in der Probe vorhandenen Nukleinsäure sequenzidentische oder sequenzidentische und sequenzähnliche Kombinationen einer kennzeichnenden Polynukleotiddomäne und einer Polynukleotiddomäne mit zufälliger Sequenz als Kopien einer kennzeichnenden Polynukleotiddomäne der ursprünglich in der Probe vorhandenen Nukleinsäure identifiziert werden können.
2. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Nukleinsäuren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Amplifizierung um eine PCR- Amplifizierung oder um eine Amplifizierung durch Klonierung handelt.
3. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Nukleinsäuren nach einem der Ansprüche 1 oder 2 dadurch gekennzeichnet, dass a) eine Probe enthaltend ein Polynukleotid mit einer kennzeichnenden Polynukleotiddomäne mit einer Lösung aus einem Polynukleotid enthaltend eine artifizielle Polynukleotiddomäne mit zufälliger Sequenz versetzt wird, wobei zumindest eine der beiden Polynukleotide eine Primerbindungsstelle besitzt, b) eine Ligation mindestens eines Endes der Polynukleotide enthaltend die kennzeichnenden Polynukleotiddomänen mit dem Polynukleotid enthaltend die Polynukleotiddomäne mit zufälliger Sequenz, so dass die Primerbindungsstelle nicht zwischen der kennzeichnenden Polynukleotiddomäne und der Polynukleotiddomäne mit zufälliger Sequenz liegt und c) die erhaltenen, mit einer Polynukleotiddomäne mit zufälliger Sequenz markierten Nukleinsäurekonstrukte durch Amplifikation mit einer Polymerase vervielfältigt und zumindest die zufällige Sequenz und die Sequenz der kennzeichnenden Polynukleotiddomäne ermittelt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass ein Ende der Polynukleotide enthaltend eine kennzeichnende Polynukleotiddomäne und/oder ein Ende der Polynukleotide enthaltend eine Polynukleotiddomäne mit zufälliger Sequenz vor Ligation und/oder enzymatischem Verdau geschützt werden, wobei, sofern eine Primerbindungsstelle in dem Polynukleotid enthalten ist, dieses Ende vor Ligation und/oder enzymatischen Abbau geschützt ist.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die an einem Ende vor Restriktionsverdau geschützten Polynukleotide, die eine kennzeichnende Polynukleotiddomäne enthalten, mit einem Restriktionsenzym verdaut werden bevor die Polynukleotide enthaltend eine Polynukleotiddomäne mit zufälliger Sequenz an das freie Ende des verbleibenden geschützten Polynukleotid- fragmentes ligiert wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Polynukleotide eine Bindungsstelle zur Anbindung eines Tagging-Enzyms enthalten und nach Ligation der Polynukleotide enthaltend die kennzeichnenden Polynukleotiddomänen mit den Polynukleotiden enthaltend eine Polynukleotiddomäne mit zufälliger Sequenz und nach Anbindung des
Tagging-Enzyms aus den erhaltenen ligierten Polynukleotiden durch das Tagging-Enzym Nukleinsäurekonstrukte abgespalten werden, die eine kennzeichnende Polynukleotiddomäne und die eine Polynukleotiddomäne mit zufälliger Sequenz enthalten.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das eingesetzte Tagging-Enzym ein Typ Il oder Typ Ill-Restriktionsenzym ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass das verwendete Tagging-Enzym EcoP15l, Mmel oder BsmFI ist.
9. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das verwendete Nukleinsäurekonstrukt eine der folgenden Domänenabfolgen aufweist:
PB - TAG - RAT, PB - RAT - TAG,
PB - TAG - RAT - PB',
PB - RAT - TAG - RAT,
PB - RAT - TAG - RAT - PB',
PB - RAT - TAG - TAG - RAT, PB - RAT - (TAG)n - PB ; mit n = 2 bis 50, bevorzugt mit n = 2 bis 10,
PB - RAT - (TAG)n - RAT - PB ; mit n = 2 bis 50, bevorzugt mit n = 2 bis 10,
PB - RAT - (TAG)n ; mit n = 2 bis 50, bevorzugt mit n = 2 bis 10,
PB - RAT - TAG - RAT - TAG,
PB - TAG - RAT - TAG - RAT, PB - RAT - TAG - RAT - TAG - PB',
PB - (RAT - TAG)n - PB' ; mit n = 3 bis 50, bevorzugt mit n = 3 bis 10,
PB - RAT - TAG - PB' - PB" - RAT - TAG - PB'", PB - RAT - TAG - PB1 - PB" - RAT - TAG - PB'" - PB"" - RAT - TAG - PB ,
PB - RAT - TAG - PB' - (PB - RAT - TAG - PB1Jn - PB - TAG - RAT - PB'
; mit n = 0 bis 10,
PB - TES - TAG - RAT, PB - TAG - TES - RAT,
PB - RAT - TAG - TES,
PB - RAT - TES - TAG,
PB - TAG - TES - RAT - PB',
PB - TES - TAG - RAT - PB', PB- RAT - TAG - TES - RAT,
PB - RAT - TES - TAG - RAT,
PB - RAT - TAG - TES - RAT - PB',
PB - RAT - TES - TAG - RAT - PB',
PB - RAT - (TES)m - TAG - TAG - (TES)m - RAT ; mit m = O oder 1 unabhängig voneinander für jedes m, wobei mindestens ein m =1 ist,
PB - RAT - TES - TAG - RAT - TAG,
PB - RAT - TAG - TES - RAT - TAG,
PB - TES - TAG - RAT - TAG - RAT, PB - TAG - TES - RAT - TAG - RAT,
PB - TAG - RAT - TES - TAG - RAT,
PB - TAG - RAT - TAG - TES - RAT,
PB - RAT - TES - TAG - RAT - TAG - PB',
PB - RAT - TAG - TES - RAT - TAG - PB', PB - RAT - TAG - RAT - TES - TAG - PB',
PB - RAT - TAG - RAT - TAG - TES - PB',
PB - (RAT - (TES)m - TAG)n - PB' ; mit n = 3 bis 50, bevorzugt mit n = 3 bis 10 und m = 0 oder 1 unabhängig voneinander für jedes m, PB - RAT - (TES)m - TAG - (TES)m - PB' - PB" - RAT - (TES)m - TAG -
(TES)n, - PB'" ; mit m = 0 oder 1 für jedes m unabhängig voneinander, wobei mindestens ein m = 1 ist, PB - RAT - (TES)m - TAG - (TES)m - PB1 - PB" - RAT - (TES)m - TAG -
(TES)m - PB1" - PB"" - RAT - (TES)m - TAG - (TES)m - PB""1 ; mit m = 0 oder 1 für jedes m unabhängig voneinander, wobei mindestens ein m = 1 ist, PB - RAT - (TES)m - TAG - (TES)m - PB1 - (PB - RAT - (TES)m - TAG -(TES)n,
- PB1Jn - PB - (TES)m - TAG -(TES)n, - RAT - PB1 mit n = 0 bis 10 und mit m = 0 oder 1 für jedes m unabhängig voneinander, wobei mindestens ein m = 1 ist,
TAG - TES - RAT - PB - RAT - TES, TAG - TES - RAT - PB - PB1 - RAT - TES,
PB"-TAG-TES-RAT-PB-RAT-TAG,
PBI1-TAG-TES-RAT-PB-RAT-TAG-PB1,
PB"-TAG-TES-RAT-PB-PB'-RAT-TAG-PB'"
TAG - RAT - PB - RAT, TAG - RAT - PB - PB1 - RAT,
PB" - TAG - RAT - PB - RAT - TAG,
PB" - TAG - RAT - PB - RAT - TAG - PB1
PB" - TAG - RAT - PB - PB1 - RAT - TAG - PB111
PB - TAG - RAT - TAG oder PB- TAG - RAT - TAG - PB', wobei
PB, PB1, PB", PB1", PB"", PB1"" Primerbindungsstellen sind die gleiche oder unterschiedliche Sequenzen besitzen können, RAT für eine Polynukleotiddomäne mit zufälliger Sequenz steht, TAG für eine Polynukleotiddomäne mit kennzeichnender Sequenz steht und TES für eine
Tagging-Enzym-Bindungsstelle steht.
10. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das verwendete
Nukleinsäurekonstrukt eine der folgenden Domänenabfolgen aufweist:
cDNA - Oligo-A/T - RAT - Promotor", cDNA - Oligo-A/T - RAT - PB - Promotor", cDNA - Oligo-A/T- TES - RAT - PB1
51- Promotor - RAT - mRNA-31, δ'-Biotin-PB/Promotor - RAT - TES - mRNA,
5'- Biotin-PB/Promotor - RAT - TES - cDNA - Oligo-A/T-31, 51- Biotin-PB/Promotor - RAT - TES - TAG - 3\ δ'-Biotin-PB/Promotor - RAT - TAG,
5'-Biotin-PB/Promotor - TAG - TES - PB - 3',
5'-Biotin-PB/Promotor - TAG - TES - RAT- PB - 3", δ'-PB-cDNA-Oligo-A/T-PB'-S' 5'-PB-RAT-cDNA-3'
5'-cDNA- Oligo-A/T - PB'-3',
5'-cDNA- Oligo-A/T-RAT'-PB'-3'
5'-TAG - RAT - PB - PB1 - RAT* - TAG-3'
5'-PB"- TAG - RAT - PB - PB' - RAT- TAG - PB'"-3', 5'-PB"- TAG - RAT - PB - PB' - TAG - PB"'-3\
5'- TES - cDNA-3'
5'- PB - TES - cDNA-31
5'-PB - RAT - RNA - PB-Amino-C7-3\
5'-PB - RNA - RAT-PB-Amino-C7-3\ 5'-PB - RAT - RNA - PB-Amino-C7-3\
5'-PB - RNA - RAT-PB-Amino-C7-3\
TAG-TES-RAT-PB-RAT-TAG, oder
TAG-TES-RAT-PB-PB'-RAT-TAG.
11. Markerensemble zur quantitativen Bestimmung von Nukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass die enthaltenen Marker jeweils eine artifizielle Polynukleotiddomäne mit voneinander unterschiedlicher zufälliger Sequenz und eine Primerbindungsstelle umfassen.
12. Markerensemble nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, dass die Marker eine Bindungsstelle für ein Tagging-Enzym enthalten, wobei die Tagging- Enzym-Bindungsstelle am distalen Ende zur Primerbindungsstelle des Markers liegt.
13. Verwendung eines Ensembles aus Markern nach einem der Ansprüche 11 oder 12 zur quantitativen Bestimmung von Nukleinsäuren in einer Probe.
14. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur quantativen Bestimmung von mRNA, cDNA, Aptamer-DNA oder genomischer DNA, zur methylierungsspezifischen quantitaven Bestimmung von genomischer DNA, zur quantitativer Bestimmung von proteingebundener genomischer DNA.
15. Kits enthaltend ein Markerensemble nach einem der Ansprüche 11 und 12 zur Durchführung eines Verfahrens gemäß den Ansprüchen 1 bis 10.
PCT/EP2009/003709 2008-05-28 2009-05-26 Verfahren zur quantitativen analyse von nukleinsäuren, marker dafür und deren verwendung WO2009152928A2 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102008025656.0 2008-05-28
DE102008025656.0A DE102008025656B4 (de) 2008-05-28 2008-05-28 Verfahren zur quantitativen Analyse von Nukleinsäuren, Marker dafür und deren Verwendung

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2009152928A2 true WO2009152928A2 (de) 2009-12-23
WO2009152928A3 WO2009152928A3 (de) 2010-02-25

Family

ID=41253846

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2009/003709 WO2009152928A2 (de) 2008-05-28 2009-05-26 Verfahren zur quantitativen analyse von nukleinsäuren, marker dafür und deren verwendung

Country Status (2)

Country Link
DE (1) DE102008025656B4 (de)
WO (1) WO2009152928A2 (de)

Cited By (147)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012148477A1 (en) * 2010-12-15 2012-11-01 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse label-tags
EP2697397A2 (de) * 2011-04-15 2014-02-19 The Johns Hopkins University Sicheres sortierungssystem
US8685678B2 (en) 2010-09-21 2014-04-01 Population Genetics Technologies Ltd Increasing confidence of allele calls with molecular counting
WO2015083004A1 (en) * 2013-12-02 2015-06-11 Population Genetics Technologies Ltd. Method for evaluating minority variants in a sample
EP2850211A4 (de) * 2012-05-14 2016-01-13 Cb Biotechnologies Inc Verfahren zur verbesserung der genauigkeit beim quantitativen nachweis von polynukleotiden
US20160026758A1 (en) * 2012-02-27 2016-01-28 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and uses for molecular tags
US9315857B2 (en) 2009-12-15 2016-04-19 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse label-tags
US9371558B2 (en) 2012-05-08 2016-06-21 Adaptive Biotechnologies Corp. Compositions and method for measuring and calibrating amplification bias in multiplexed PCR reactions
US9506119B2 (en) 2008-11-07 2016-11-29 Adaptive Biotechnologies Corp. Method of sequence determination using sequence tags
US9567646B2 (en) 2013-08-28 2017-02-14 Cellular Research, Inc. Massively parallel single cell analysis
US9582877B2 (en) 2013-10-07 2017-02-28 Cellular Research, Inc. Methods and systems for digitally counting features on arrays
EP3017066A4 (de) * 2013-07-01 2017-03-15 Adaptive Biotechnologies Corporation Grossflächige biomolekulare analyse mit sequenz-tags
US9598731B2 (en) 2012-09-04 2017-03-21 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US9670529B2 (en) 2012-02-28 2017-06-06 Population Genetics Technologies Ltd. Method for attaching a counter sequence to a nucleic acid sample
US9727810B2 (en) 2015-02-27 2017-08-08 Cellular Research, Inc. Spatially addressable molecular barcoding
US9809813B2 (en) 2009-06-25 2017-11-07 Fred Hutchinson Cancer Research Center Method of measuring adaptive immunity
EP2970958B1 (de) * 2013-03-15 2017-12-06 Lineage Biosciences, Inc. Verfahren zur sequenzierung des immunrepertoirs
EP2814959B1 (de) 2012-02-17 2018-01-17 Fred Hutchinson Cancer Research Center Zusammensetzungen und verfahren zur genauen identifizierung von mutationen
US9902992B2 (en) 2012-09-04 2018-02-27 Guardant Helath, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US9920366B2 (en) 2013-12-28 2018-03-20 Guardant Health, Inc. Methods and systems for detecting genetic variants
US10000800B2 (en) 2009-04-30 2018-06-19 Prognosys Biosciences, Inc. Nucleic acid constructs and methods of use
US10066265B2 (en) 2014-04-01 2018-09-04 Adaptive Biotechnologies Corp. Determining antigen-specific t-cells
US10077478B2 (en) 2012-03-05 2018-09-18 Adaptive Biotechnologies Corp. Determining paired immune receptor chains from frequency matched subunits
US10150996B2 (en) 2012-10-19 2018-12-11 Adaptive Biotechnologies Corp. Quantification of adaptive immune cell genomes in a complex mixture of cells
US10155992B2 (en) 2008-11-07 2018-12-18 Adaptive Biotechnologies Corp. Monitoring health and disease status using clonotype profiles
US10202641B2 (en) 2016-05-31 2019-02-12 Cellular Research, Inc. Error correction in amplification of samples
US10246752B2 (en) 2008-11-07 2019-04-02 Adaptive Biotechnologies Corp. Methods of monitoring conditions by sequence analysis
US10246701B2 (en) 2014-11-14 2019-04-02 Adaptive Biotechnologies Corp. Multiplexed digital quantitation of rearranged lymphoid receptors in a complex mixture
US10301677B2 (en) 2016-05-25 2019-05-28 Cellular Research, Inc. Normalization of nucleic acid libraries
US10308982B2 (en) 2010-04-05 2019-06-04 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US10323276B2 (en) 2009-01-15 2019-06-18 Adaptive Biotechnologies Corporation Adaptive immunity profiling and methods for generation of monoclonal antibodies
US10338066B2 (en) 2016-09-26 2019-07-02 Cellular Research, Inc. Measurement of protein expression using reagents with barcoded oligonucleotide sequences
US10392663B2 (en) 2014-10-29 2019-08-27 Adaptive Biotechnologies Corp. Highly-multiplexed simultaneous detection of nucleic acids encoding paired adaptive immune receptor heterodimers from a large number of samples
US10428325B1 (en) 2016-09-21 2019-10-01 Adaptive Biotechnologies Corporation Identification of antigen-specific B cell receptors
US10550429B2 (en) 2016-12-22 2020-02-04 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
CN110804655A (zh) * 2019-11-15 2020-02-18 康美华大基因技术有限公司 一种宏基因组绝对定量的方法
US10619186B2 (en) 2015-09-11 2020-04-14 Cellular Research, Inc. Methods and compositions for library normalization
US10640763B2 (en) 2016-05-31 2020-05-05 Cellular Research, Inc. Molecular indexing of internal sequences
US10669570B2 (en) 2017-06-05 2020-06-02 Becton, Dickinson And Company Sample indexing for single cells
US10697010B2 (en) 2015-02-19 2020-06-30 Becton, Dickinson And Company High-throughput single-cell analysis combining proteomic and genomic information
US10704086B2 (en) 2014-03-05 2020-07-07 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US10725027B2 (en) 2018-02-12 2020-07-28 10X Genomics, Inc. Methods and systems for analysis of chromatin
US10722880B2 (en) 2017-01-13 2020-07-28 Cellular Research, Inc. Hydrophilic coating of fluidic channels
US10774374B2 (en) 2015-04-10 2020-09-15 Spatial Transcriptomics AB and Illumina, Inc. Spatially distinguished, multiplex nucleic acid analysis of biological specimens
US10774372B2 (en) 2013-06-25 2020-09-15 Prognosy s Biosciences, Inc. Methods and systems for determining spatial patterns of biological targets in a sample
US10787701B2 (en) 2010-04-05 2020-09-29 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US10815525B2 (en) 2016-12-22 2020-10-27 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10822643B2 (en) 2016-05-02 2020-11-03 Cellular Research, Inc. Accurate molecular barcoding
US10941396B2 (en) 2012-02-27 2021-03-09 Becton, Dickinson And Company Compositions and kits for molecular counting
US10995333B2 (en) 2017-02-06 2021-05-04 10X Genomics, Inc. Systems and methods for nucleic acid preparation
US11021749B2 (en) 2012-08-14 2021-06-01 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US11030276B2 (en) 2013-12-16 2021-06-08 10X Genomics, Inc. Methods and apparatus for sorting data
US11041202B2 (en) 2015-04-01 2021-06-22 Adaptive Biotechnologies Corporation Method of identifying human compatible T cell receptors specific for an antigenic target
US11047008B2 (en) 2015-02-24 2021-06-29 Adaptive Biotechnologies Corporation Methods for diagnosing infectious disease and determining HLA status using immune repertoire sequencing
US11081208B2 (en) 2016-02-11 2021-08-03 10X Genomics, Inc. Systems, methods, and media for de novo assembly of whole genome sequence data
US11078522B2 (en) 2012-08-14 2021-08-03 10X Genomics, Inc. Capsule array devices and methods of use
US11124823B2 (en) 2015-06-01 2021-09-21 Becton, Dickinson And Company Methods for RNA quantification
US11155881B2 (en) 2018-04-06 2021-10-26 10X Genomics, Inc. Systems and methods for quality control in single cell processing
US11164659B2 (en) 2016-11-08 2021-11-02 Becton, Dickinson And Company Methods for expression profile classification
US11193122B2 (en) 2017-01-30 2021-12-07 10X Genomics, Inc. Methods and systems for droplet-based single cell barcoding
US11193121B2 (en) 2013-02-08 2021-12-07 10X Genomics, Inc. Partitioning and processing of analytes and other species
US11242569B2 (en) 2015-12-17 2022-02-08 Guardant Health, Inc. Methods to determine tumor gene copy number by analysis of cell-free DNA
US11248253B2 (en) 2014-03-05 2022-02-15 Adaptive Biotechnologies Corporation Methods using randomer-containing synthetic molecules
US11254980B1 (en) 2017-11-29 2022-02-22 Adaptive Biotechnologies Corporation Methods of profiling targeted polynucleotides while mitigating sequencing depth requirements
US11286531B2 (en) 2015-08-11 2022-03-29 The Johns Hopkins University Assaying ovarian cyst fluid
US11319583B2 (en) 2017-02-01 2022-05-03 Becton, Dickinson And Company Selective amplification using blocking oligonucleotides
US11332790B2 (en) 2019-12-23 2022-05-17 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using RNA-templated ligation
US11352659B2 (en) 2011-04-13 2022-06-07 Spatial Transcriptomics Ab Methods of detecting analytes
US11365409B2 (en) 2018-05-03 2022-06-21 Becton, Dickinson And Company Molecular barcoding on opposite transcript ends
US11365438B2 (en) 2017-11-30 2022-06-21 10X Genomics, Inc. Systems and methods for nucleic acid preparation and analysis
US11371094B2 (en) 2015-11-19 2022-06-28 10X Genomics, Inc. Systems and methods for nucleic acid processing using degenerate nucleotides
US11371076B2 (en) 2019-01-16 2022-06-28 Becton, Dickinson And Company Polymerase chain reaction normalization through primer titration
US11390914B2 (en) 2015-04-23 2022-07-19 Becton, Dickinson And Company Methods and compositions for whole transcriptome amplification
US11397882B2 (en) 2016-05-26 2022-07-26 Becton, Dickinson And Company Molecular label counting adjustment methods
US11407992B2 (en) 2020-06-08 2022-08-09 10X Genomics, Inc. Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof
US11408029B2 (en) 2020-06-25 2022-08-09 10X Genomics, Inc. Spatial analysis of DNA methylation
US11414688B2 (en) 2015-01-12 2022-08-16 10X Genomics, Inc. Processes and systems for preparation of nucleic acid sequencing libraries and libraries prepared using same
US11421274B2 (en) 2012-12-14 2022-08-23 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US11434524B2 (en) 2020-06-10 2022-09-06 10X Genomics, Inc. Methods for determining a location of an analyte in a biological sample
US11441179B2 (en) 2012-08-14 2022-09-13 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US11459607B1 (en) 2018-12-10 2022-10-04 10X Genomics, Inc. Systems and methods for processing-nucleic acid molecules from a single cell using sequential co-partitioning and composite barcodes
US11467153B2 (en) 2019-02-12 2022-10-11 10X Genomics, Inc. Methods for processing nucleic acid molecules
US11473138B2 (en) 2012-12-14 2022-10-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US11492660B2 (en) 2018-12-13 2022-11-08 Becton, Dickinson And Company Selective extension in single cell whole transcriptome analysis
US11512308B2 (en) 2020-06-02 2022-11-29 10X Genomics, Inc. Nucleic acid library methods
US11519033B2 (en) 2018-08-28 2022-12-06 10X Genomics, Inc. Method for transposase-mediated spatial tagging and analyzing genomic DNA in a biological sample
US11525163B2 (en) 2012-10-29 2022-12-13 The Johns Hopkins University Papanicolaou test for ovarian and endometrial cancers
US11535882B2 (en) 2015-03-30 2022-12-27 Becton, Dickinson And Company Methods and compositions for combinatorial barcoding
US11535887B2 (en) 2020-04-22 2022-12-27 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using targeted RNA depletion
US11560592B2 (en) 2020-05-26 2023-01-24 10X Genomics, Inc. Method for resetting an array
US11584958B2 (en) 2017-03-31 2023-02-21 Grail, Llc Library preparation and use thereof for sequencing based error correction and/or variant identification
US11584953B2 (en) 2019-02-12 2023-02-21 10X Genomics, Inc. Methods for processing nucleic acid molecules
US11592447B2 (en) 2019-11-08 2023-02-28 10X Genomics, Inc. Spatially-tagged analyte capture agents for analyte multiplexing
US11591637B2 (en) 2012-08-14 2023-02-28 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US11608497B2 (en) 2016-11-08 2023-03-21 Becton, Dickinson And Company Methods for cell label classification
US11608520B2 (en) 2020-05-22 2023-03-21 10X Genomics, Inc. Spatial analysis to detect sequence variants
US11618897B2 (en) 2020-12-21 2023-04-04 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes
US11624086B2 (en) 2020-05-22 2023-04-11 10X Genomics, Inc. Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity
US11629344B2 (en) 2014-06-26 2023-04-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US11639928B2 (en) 2018-02-22 2023-05-02 10X Genomics, Inc. Methods and systems for characterizing analytes from individual cells or cell populations
US11639517B2 (en) 2018-10-01 2023-05-02 Becton, Dickinson And Company Determining 5′ transcript sequences
US11649485B2 (en) 2019-01-06 2023-05-16 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US11649497B2 (en) 2020-01-13 2023-05-16 Becton, Dickinson And Company Methods and compositions for quantitation of proteins and RNA
US11655499B1 (en) 2019-02-25 2023-05-23 10X Genomics, Inc. Detection of sequence elements in nucleic acid molecules
US11661625B2 (en) 2020-05-14 2023-05-30 Becton, Dickinson And Company Primers for immune repertoire profiling
US11661631B2 (en) 2019-01-23 2023-05-30 Becton, Dickinson And Company Oligonucleotides associated with antibodies
US11692218B2 (en) 2020-06-02 2023-07-04 10X Genomics, Inc. Spatial transcriptomics for antigen-receptors
US11703427B2 (en) 2018-06-25 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for cell and bead processing
US11702693B2 (en) 2020-01-21 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods for printing cells and generating arrays of barcoded cells
US11702698B2 (en) 2019-11-08 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Enhancing specificity of analyte binding
US11725231B2 (en) 2017-10-26 2023-08-15 10X Genomics, Inc. Methods and systems for nucleic acid preparation and chromatin analysis
US11733238B2 (en) 2010-04-05 2023-08-22 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US11732299B2 (en) 2020-01-21 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Spatial assays with perturbed cells
US11732300B2 (en) 2020-02-05 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Increasing efficiency of spatial analysis in a biological sample
US11739443B2 (en) 2020-11-20 2023-08-29 Becton, Dickinson And Company Profiling of highly expressed and lowly expressed proteins
US11739381B2 (en) 2021-03-18 2023-08-29 10X Genomics, Inc. Multiplex capture of gene and protein expression from a biological sample
US11753673B2 (en) 2021-09-01 2023-09-12 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and kits for blocking a capture probe on a spatial array
US11761038B1 (en) 2020-07-06 2023-09-19 10X Genomics, Inc. Methods for identifying a location of an RNA in a biological sample
US11768175B1 (en) 2020-03-04 2023-09-26 10X Genomics, Inc. Electrophoretic methods for spatial analysis
US11773436B2 (en) 2019-11-08 2023-10-03 Becton, Dickinson And Company Using random priming to obtain full-length V(D)J information for immune repertoire sequencing
US11773441B2 (en) 2018-05-03 2023-10-03 Becton, Dickinson And Company High throughput multiomics sample analysis
US11821035B1 (en) 2020-01-29 2023-11-21 10X Genomics, Inc. Compositions and methods of making gene expression libraries
US11827935B1 (en) 2020-11-19 2023-11-28 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using rolling circle amplification and detection probes
US11835462B2 (en) 2020-02-11 2023-12-05 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for partitioning a biological sample
US11845983B1 (en) 2019-01-09 2023-12-19 10X Genomics, Inc. Methods and systems for multiplexing of droplet based assays
US11851700B1 (en) 2020-05-13 2023-12-26 10X Genomics, Inc. Methods, kits, and compositions for processing extracellular molecules
US11851683B1 (en) 2019-02-12 2023-12-26 10X Genomics, Inc. Methods and systems for selective analysis of cellular samples
US11873530B1 (en) 2018-07-27 2024-01-16 10X Genomics, Inc. Systems and methods for metabolome analysis
US11884964B2 (en) 2017-10-04 2024-01-30 10X Genomics, Inc. Compositions, methods, and systems for bead formation using improved polymers
US11884962B2 (en) 2017-11-15 2024-01-30 10X Genomics, Inc. Functionalized gel beads
US11891654B2 (en) 2020-02-24 2024-02-06 10X Genomics, Inc. Methods of making gene expression libraries
US11898205B2 (en) 2020-02-03 2024-02-13 10X Genomics, Inc. Increasing capture efficiency of spatial assays
US11913065B2 (en) 2012-09-04 2024-02-27 Guardent Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US11920183B2 (en) 2019-03-11 2024-03-05 10X Genomics, Inc. Systems and methods for processing optically tagged beads
US11929145B2 (en) 2017-01-20 2024-03-12 Sequenom, Inc Methods for non-invasive assessment of genetic alterations
US11926822B1 (en) 2020-09-23 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial analysis
US11926863B1 (en) 2020-02-27 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Solid state single cell method for analyzing fixed biological cells
US11926867B2 (en) 2019-01-06 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US11932899B2 (en) 2018-06-07 2024-03-19 10X Genomics, Inc. Methods and systems for characterizing nucleic acid molecules
US11932849B2 (en) 2018-11-08 2024-03-19 Becton, Dickinson And Company Whole transcriptome analysis of single cells using random priming
US11932901B2 (en) 2020-07-13 2024-03-19 Becton, Dickinson And Company Target enrichment using nucleic acid probes for scRNAseq
US11939622B2 (en) 2019-07-22 2024-03-26 Becton, Dickinson And Company Single cell chromatin immunoprecipitation sequencing assay
US11946095B2 (en) 2017-12-19 2024-04-02 Becton, Dickinson And Company Particles associated with oligonucleotides
US11952626B2 (en) 2021-02-23 2024-04-09 10X Genomics, Inc. Probe-based analysis of nucleic acids and proteins
US11965208B2 (en) 2019-04-19 2024-04-23 Becton, Dickinson And Company Methods of associating phenotypical data and single cell sequencing data
US11965213B2 (en) 2019-05-30 2024-04-23 10X Genomics, Inc. Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample
US11970739B2 (en) 2023-07-06 2024-04-30 10X Genomics, Inc. Multiplex capture of gene and protein expression from a biological sample

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012042374A2 (en) * 2010-10-01 2012-04-05 Anssi Jussi Nikolai Taipale Method of determining number or concentration of molecules
CA2815076C (en) 2010-10-22 2021-01-12 Cold Spring Harbor Laboratory Varietal counting of nucleic acids for obtaining genomic copy number information
CN105121664B (zh) * 2013-02-20 2018-11-02 埃默里大学 混合物及其相关组合物中的核酸的测序方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005111242A2 (en) * 2004-05-10 2005-11-24 Parallele Bioscience, Inc. Digital profiling of polynucleotide populations
WO2006003721A1 (en) * 2004-07-02 2006-01-12 Kabushiki Kaisha Dnaform Method for preparing sequence tags
US20070172854A1 (en) * 2005-12-13 2007-07-26 Iwate Prefectural Government Gene expression analysis using array with immobilized tags of more than 25 bp (SuperSAGE-Array)
US20070172873A1 (en) * 2006-01-23 2007-07-26 Sydney Brenner Molecular counting

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5695937A (en) 1995-09-12 1997-12-09 The Johns Hopkins University School Of Medicine Method for serial analysis of gene expression
US6132997A (en) 1999-05-28 2000-10-17 Agilent Technologies Method for linear mRNA amplification
WO2004015085A2 (en) * 2002-08-09 2004-02-19 California Institute Of Technology Method and compositions relating to 5’-chimeric ribonucleic acids
US20080108804A1 (en) * 2006-11-02 2008-05-08 Kabushiki Kaisha Dnaform Method for modifying RNAS and preparing DNAS from RNAS

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005111242A2 (en) * 2004-05-10 2005-11-24 Parallele Bioscience, Inc. Digital profiling of polynucleotide populations
WO2006003721A1 (en) * 2004-07-02 2006-01-12 Kabushiki Kaisha Dnaform Method for preparing sequence tags
US20070172854A1 (en) * 2005-12-13 2007-07-26 Iwate Prefectural Government Gene expression analysis using array with immobilized tags of more than 25 bp (SuperSAGE-Array)
US20070172873A1 (en) * 2006-01-23 2007-07-26 Sydney Brenner Molecular counting

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MEYER MATTHIAS ET AL: "Parallel tagged sequencing on the 454 platform." NATURE PROTOCOLS 2008, Bd. 3, Nr. 2, 31. Januar 2008 (2008-01-31) , Seiten 267-278, XP002560261 ISSN: 1750-2799 *

Cited By (374)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10246752B2 (en) 2008-11-07 2019-04-02 Adaptive Biotechnologies Corp. Methods of monitoring conditions by sequence analysis
US9506119B2 (en) 2008-11-07 2016-11-29 Adaptive Biotechnologies Corp. Method of sequence determination using sequence tags
US10155992B2 (en) 2008-11-07 2018-12-18 Adaptive Biotechnologies Corp. Monitoring health and disease status using clonotype profiles
US10519511B2 (en) 2008-11-07 2019-12-31 Adaptive Biotechnologies Corporation Monitoring health and disease status using clonotype profiles
US10266901B2 (en) 2008-11-07 2019-04-23 Adaptive Biotechnologies Corp. Methods of monitoring conditions by sequence analysis
US10760133B2 (en) 2008-11-07 2020-09-01 Adaptive Biotechnologies Corporation Monitoring health and disease status using clonotype profiles
US10323276B2 (en) 2009-01-15 2019-06-18 Adaptive Biotechnologies Corporation Adaptive immunity profiling and methods for generation of monoclonal antibodies
US10000800B2 (en) 2009-04-30 2018-06-19 Prognosys Biosciences, Inc. Nucleic acid constructs and methods of use
US10266883B2 (en) 2009-04-30 2019-04-23 Prognosys Biosciences, Inc. Nucleic acid constructs and methods of use
US11447822B2 (en) 2009-04-30 2022-09-20 Prognosys Biosciences, Inc. Nucleic acid constructs and methods of use
US10266884B2 (en) 2009-04-30 2019-04-23 Prognosys Biosciences, Inc. Nucleic acid constructs and methods of use
US11352665B2 (en) 2009-04-30 2022-06-07 Prognosys Biosciences, Inc. Nucleic acid constructs and methods of use
US11339432B2 (en) 2009-04-30 2022-05-24 Prognosys Biosciences, Inc. Nucleic acid constructs and methods of use
US11499187B2 (en) 2009-04-30 2022-11-15 Prognosys Biosciences, Inc. Nucleic acid constructs and methods of use
US10501793B2 (en) 2009-04-30 2019-12-10 Prognosys Biosciences, Inc. Nucleic acid constructs and methods of use
US10119165B2 (en) 2009-04-30 2018-11-06 Prognosys Biosciences, Inc. Nucleic acid constructs and methods of use
US11499188B2 (en) 2009-04-30 2022-11-15 Prognosys Biosciences, Inc. Nucleic acid constructs and methods of use
US11214793B2 (en) 2009-06-25 2022-01-04 Fred Hutchinson Cancer Research Center Method of measuring adaptive immunity
US9809813B2 (en) 2009-06-25 2017-11-07 Fred Hutchinson Cancer Research Center Method of measuring adaptive immunity
US10059991B2 (en) 2009-12-15 2018-08-28 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
US10392661B2 (en) 2009-12-15 2019-08-27 Becton, Dickinson And Company Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
US9708659B2 (en) 2009-12-15 2017-07-18 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
US10047394B2 (en) 2009-12-15 2018-08-14 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
US9845502B2 (en) 2009-12-15 2017-12-19 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
US8835358B2 (en) 2009-12-15 2014-09-16 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
US9315857B2 (en) 2009-12-15 2016-04-19 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse label-tags
US9290808B2 (en) 2009-12-15 2016-03-22 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
US9290809B2 (en) 2009-12-15 2016-03-22 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
US10202646B2 (en) 2009-12-15 2019-02-12 Becton, Dickinson And Company Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
US9816137B2 (en) 2009-12-15 2017-11-14 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
US10619203B2 (en) 2009-12-15 2020-04-14 Becton, Dickinson And Company Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
US11560587B2 (en) 2010-04-05 2023-01-24 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US10983113B2 (en) 2010-04-05 2021-04-20 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US11371086B2 (en) 2010-04-05 2022-06-28 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US11365442B2 (en) 2010-04-05 2022-06-21 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US10480022B2 (en) 2010-04-05 2019-11-19 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US11401545B2 (en) 2010-04-05 2022-08-02 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US11479810B1 (en) 2010-04-05 2022-10-25 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US11866770B2 (en) 2010-04-05 2024-01-09 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US10494667B2 (en) 2010-04-05 2019-12-03 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US11313856B2 (en) 2010-04-05 2022-04-26 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US11519022B2 (en) 2010-04-05 2022-12-06 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US11293917B2 (en) 2010-04-05 2022-04-05 Prognosys Biosciences, Inc. Systems for analyzing target biological molecules via sample imaging and delivery of probes to substrate wells
US11542543B2 (en) 2010-04-05 2023-01-03 Prognosys Biosciences, Inc. System for analyzing targets of a tissue section
US11208684B2 (en) 2010-04-05 2021-12-28 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US10308982B2 (en) 2010-04-05 2019-06-04 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US11156603B2 (en) 2010-04-05 2021-10-26 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US11067567B2 (en) 2010-04-05 2021-07-20 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US11549138B2 (en) 2010-04-05 2023-01-10 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US11008607B2 (en) 2010-04-05 2021-05-18 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US10612079B2 (en) 2010-04-05 2020-04-07 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US11001878B1 (en) 2010-04-05 2021-05-11 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US10472669B2 (en) 2010-04-05 2019-11-12 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US11001879B1 (en) 2010-04-05 2021-05-11 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US11634756B2 (en) 2010-04-05 2023-04-25 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US10996219B2 (en) 2010-04-05 2021-05-04 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US11384386B2 (en) 2010-04-05 2022-07-12 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US10982268B2 (en) 2010-04-05 2021-04-20 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US10619196B1 (en) 2010-04-05 2020-04-14 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US10962532B2 (en) 2010-04-05 2021-03-30 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US10961566B2 (en) 2010-04-05 2021-03-30 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US10914730B2 (en) 2010-04-05 2021-02-09 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US11733238B2 (en) 2010-04-05 2023-08-22 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US10787701B2 (en) 2010-04-05 2020-09-29 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US11732292B2 (en) 2010-04-05 2023-08-22 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays correlating target nucleic acid to tissue section location
US11761030B2 (en) 2010-04-05 2023-09-19 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US10662467B2 (en) 2010-04-05 2020-05-26 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US10662468B2 (en) 2010-04-05 2020-05-26 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US11767550B2 (en) 2010-04-05 2023-09-26 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US8715967B2 (en) 2010-09-21 2014-05-06 Population Genetics Technologies Ltd. Method for accurately counting starting molecules
US8741606B2 (en) 2010-09-21 2014-06-03 Population Genetics Technologies Ltd. Method of tagging using a split DBR
US8728766B2 (en) 2010-09-21 2014-05-20 Population Genetics Technologies Ltd. Method of adding a DBR by primer extension
US8722368B2 (en) 2010-09-21 2014-05-13 Population Genetics Technologies Ltd. Method for preparing a counter-tagged population of nucleic acid molecules
EP3115468B1 (de) 2010-09-21 2018-07-25 Agilent Technologies, Inc. Erhöhung der verlässlichkeit von allel-aufrufen mit molekülzählung
EP2623613B1 (de) 2010-09-21 2016-07-06 Population Genetics Technologies Ltd. Erhöhung der Verlässlichkeit von Allel-Aufrufen mit Molekülzählung
US8685678B2 (en) 2010-09-21 2014-04-01 Population Genetics Technologies Ltd Increasing confidence of allele calls with molecular counting
US9670536B2 (en) 2010-09-21 2017-06-06 Population Genetics Technologies Ltd. Increased confidence of allele calls with molecular counting
WO2012148477A1 (en) * 2010-12-15 2012-11-01 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse label-tags
US11788122B2 (en) 2011-04-13 2023-10-17 10X Genomics Sweden Ab Methods of detecting analytes
US11795498B2 (en) 2011-04-13 2023-10-24 10X Genomics Sweden Ab Methods of detecting analytes
US11479809B2 (en) 2011-04-13 2022-10-25 Spatial Transcriptomics Ab Methods of detecting analytes
US11352659B2 (en) 2011-04-13 2022-06-07 Spatial Transcriptomics Ab Methods of detecting analytes
US11180803B2 (en) 2011-04-15 2021-11-23 The Johns Hopkins University Safe sequencing system
EP2697397A2 (de) * 2011-04-15 2014-02-19 The Johns Hopkins University Sicheres sortierungssystem
EP2697397A4 (de) * 2011-04-15 2014-10-15 Univ Johns Hopkins Sicheres sortierungssystem
CN103748236A (zh) * 2011-04-15 2014-04-23 约翰·霍普金斯大学 安全测序系统
US9476095B2 (en) 2011-04-15 2016-10-25 The Johns Hopkins University Safe sequencing system
US9487829B2 (en) 2011-04-15 2016-11-08 The Johns Hopkins University Safe sequencing system
CN110016499A (zh) * 2011-04-15 2019-07-16 约翰·霍普金斯大学 安全测序系统
AU2012242847B2 (en) * 2011-04-15 2017-01-19 The Johns Hopkins University Safe sequencing system
EP3907299A1 (de) * 2011-04-15 2021-11-10 The Johns Hopkins University Sicheres sortierungssystem
EP3907297A1 (de) * 2011-04-15 2021-11-10 The Johns Hopkins University Sicheres sortierungssystem
CN110016499B (zh) * 2011-04-15 2023-11-14 约翰·霍普金斯大学 安全测序系统
US11773440B2 (en) 2011-04-15 2023-10-03 The Johns Hopkins University Safe sequencing system
US11459611B2 (en) 2011-04-15 2022-10-04 The Johns Hopkins University Safe sequencing system
CN103748236B (zh) * 2011-04-15 2018-12-25 约翰·霍普金斯大学 安全测序系统
EP3246416A1 (de) * 2011-04-15 2017-11-22 The Johns Hopkins University Sicheres sortierungssystem
US11453913B2 (en) 2011-04-15 2022-09-27 The Johns Hopkins University Safe sequencing system
EP2697397B1 (de) 2011-04-15 2017-04-05 The Johns Hopkins University Sicheres sortierungssystem
EP2814959B1 (de) 2012-02-17 2018-01-17 Fred Hutchinson Cancer Research Center Zusammensetzungen und verfahren zur genauen identifizierung von mutationen
EP3363901B1 (de) * 2012-02-17 2020-12-30 Fred Hutchinson Cancer Research Center Zusammensetzungen und verfahren zur genauen identifizierung von mutationen
US10011871B2 (en) 2012-02-17 2018-07-03 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for accurately identifying mutations
US10450606B2 (en) 2012-02-17 2019-10-22 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for accurately identifying mutations
US11441180B2 (en) 2012-02-17 2022-09-13 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for accurately identifying mutations
US20160026758A1 (en) * 2012-02-27 2016-01-28 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and uses for molecular tags
US11634708B2 (en) 2012-02-27 2023-04-25 Becton, Dickinson And Company Compositions and kits for molecular counting
US11177020B2 (en) 2012-02-27 2021-11-16 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and uses for molecular tags
US10941396B2 (en) 2012-02-27 2021-03-09 Becton, Dickinson And Company Compositions and kits for molecular counting
US9670529B2 (en) 2012-02-28 2017-06-06 Population Genetics Technologies Ltd. Method for attaching a counter sequence to a nucleic acid sample
US10077478B2 (en) 2012-03-05 2018-09-18 Adaptive Biotechnologies Corp. Determining paired immune receptor chains from frequency matched subunits
US9371558B2 (en) 2012-05-08 2016-06-21 Adaptive Biotechnologies Corp. Compositions and method for measuring and calibrating amplification bias in multiplexed PCR reactions
US10214770B2 (en) 2012-05-08 2019-02-26 Adaptive Biotechnologies Corp. Compositions and method for measuring and calibrating amplification bias in multiplexed PCR reactions
US10894977B2 (en) 2012-05-08 2021-01-19 Adaptive Biotechnologies Corporation Compositions and methods for measuring and calibrating amplification bias in multiplexed PCR reactions
EP2850211A4 (de) * 2012-05-14 2016-01-13 Cb Biotechnologies Inc Verfahren zur verbesserung der genauigkeit beim quantitativen nachweis von polynukleotiden
US11441179B2 (en) 2012-08-14 2022-09-13 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US11078522B2 (en) 2012-08-14 2021-08-03 10X Genomics, Inc. Capsule array devices and methods of use
US11591637B2 (en) 2012-08-14 2023-02-28 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US11035002B2 (en) 2012-08-14 2021-06-15 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US11021749B2 (en) 2012-08-14 2021-06-01 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US11359239B2 (en) 2012-08-14 2022-06-14 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10876172B2 (en) 2012-09-04 2020-12-29 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US10501810B2 (en) 2012-09-04 2019-12-10 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US11001899B1 (en) 2012-09-04 2021-05-11 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US10793916B2 (en) 2012-09-04 2020-10-06 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US10457995B2 (en) 2012-09-04 2019-10-29 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US10822663B2 (en) 2012-09-04 2020-11-03 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US9598731B2 (en) 2012-09-04 2017-03-21 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US10837063B2 (en) 2012-09-04 2020-11-17 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US9902992B2 (en) 2012-09-04 2018-02-27 Guardant Helath, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US10995376B1 (en) 2012-09-04 2021-05-04 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US10876171B2 (en) 2012-09-04 2020-12-29 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US11319598B2 (en) 2012-09-04 2022-05-03 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US10876152B2 (en) 2012-09-04 2020-12-29 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US11879158B2 (en) 2012-09-04 2024-01-23 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US11773453B2 (en) 2012-09-04 2023-10-03 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US10501808B2 (en) 2012-09-04 2019-12-10 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US9834822B2 (en) 2012-09-04 2017-12-05 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US10894974B2 (en) 2012-09-04 2021-01-19 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US11434523B2 (en) 2012-09-04 2022-09-06 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US10041127B2 (en) 2012-09-04 2018-08-07 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US10683556B2 (en) 2012-09-04 2020-06-16 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US11319597B2 (en) 2012-09-04 2022-05-03 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US9840743B2 (en) 2012-09-04 2017-12-12 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US10494678B2 (en) 2012-09-04 2019-12-03 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US10738364B2 (en) 2012-09-04 2020-08-11 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US10947600B2 (en) 2012-09-04 2021-03-16 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US11913065B2 (en) 2012-09-04 2024-02-27 Guardent Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US10961592B2 (en) 2012-09-04 2021-03-30 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US10150996B2 (en) 2012-10-19 2018-12-11 Adaptive Biotechnologies Corp. Quantification of adaptive immune cell genomes in a complex mixture of cells
US11525163B2 (en) 2012-10-29 2022-12-13 The Johns Hopkins University Papanicolaou test for ovarian and endometrial cancers
US11473138B2 (en) 2012-12-14 2022-10-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US11421274B2 (en) 2012-12-14 2022-08-23 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US11193121B2 (en) 2013-02-08 2021-12-07 10X Genomics, Inc. Partitioning and processing of analytes and other species
US10722858B2 (en) 2013-03-15 2020-07-28 Lineage Biosciences, Inc. Methods and compositions for tagging and analyzing samples
EP2970958B1 (de) * 2013-03-15 2017-12-06 Lineage Biosciences, Inc. Verfahren zur sequenzierung des immunrepertoirs
EP3327123A1 (de) * 2013-03-15 2018-05-30 Lineage Biosciences, Inc. Verfahren zur sequenzierung des immunrepertoirs
US11161087B2 (en) 2013-03-15 2021-11-02 Lineage Biosciences, Inc. Methods and compositions for tagging and analyzing samples
EP3611262A1 (de) * 2013-03-15 2020-02-19 Lineage Biosciences, Inc. Verfahren zur sequenzierung des immunrepertoirs
US10058839B2 (en) 2013-03-15 2018-08-28 Lineage Biosciences, Inc. Methods and compositions for tagging and analyzing samples
US11753674B2 (en) 2013-06-25 2023-09-12 Prognosys Biosciences, Inc. Methods and systems for determining spatial patterns of biological targets in a sample
US11046996B1 (en) 2013-06-25 2021-06-29 Prognosys Biosciences, Inc. Methods and systems for determining spatial patterns of biological targets in a sample
US10774372B2 (en) 2013-06-25 2020-09-15 Prognosy s Biosciences, Inc. Methods and systems for determining spatial patterns of biological targets in a sample
US11286515B2 (en) 2013-06-25 2022-03-29 Prognosys Biosciences, Inc. Methods and systems for determining spatial patterns of biological targets in a sample
US10927403B2 (en) 2013-06-25 2021-02-23 Prognosys Biosciences, Inc. Methods and systems for determining spatial patterns of biological targets in a sample
US11359228B2 (en) 2013-06-25 2022-06-14 Prognosys Biosciences, Inc. Methods and systems for determining spatial patterns of biological targets in a sample
US11821024B2 (en) 2013-06-25 2023-11-21 Prognosys Biosciences, Inc. Methods and systems for determining spatial patterns of biological targets in a sample
US11618918B2 (en) 2013-06-25 2023-04-04 Prognosys Biosciences, Inc. Methods and systems for determining spatial patterns of biological targets in a sample
CN112375816A (zh) * 2013-07-01 2021-02-19 适应生物技术公司 用序列标签进行大规模生物分子分析
US9708657B2 (en) 2013-07-01 2017-07-18 Adaptive Biotechnologies Corp. Method for generating clonotype profiles using sequence tags
EP3017066A4 (de) * 2013-07-01 2017-03-15 Adaptive Biotechnologies Corporation Grossflächige biomolekulare analyse mit sequenz-tags
US10526650B2 (en) 2013-07-01 2020-01-07 Adaptive Biotechnologies Corporation Method for genotyping clonotype profiles using sequence tags
AU2014284501B2 (en) * 2013-07-01 2020-05-28 Adaptive Biotechnologies Corp. Large-scale biomolecular analysis with sequence tags
US10077473B2 (en) 2013-07-01 2018-09-18 Adaptive Biotechnologies Corp. Method for genotyping clonotype profiles using sequence tags
EP3486327A1 (de) * 2013-07-01 2019-05-22 Adaptive Biotechnologies Corporation Grossflächige biomolekulare analyse mit sequenz-tags
US10131958B1 (en) 2013-08-28 2018-11-20 Cellular Research, Inc. Massively parallel single cell analysis
US9637799B2 (en) 2013-08-28 2017-05-02 Cellular Research, Inc. Massively parallel single cell analysis
US9567645B2 (en) 2013-08-28 2017-02-14 Cellular Research, Inc. Massively parallel single cell analysis
US9598736B2 (en) 2013-08-28 2017-03-21 Cellular Research, Inc. Massively parallel single cell analysis
US11702706B2 (en) 2013-08-28 2023-07-18 Becton, Dickinson And Company Massively parallel single cell analysis
US9567646B2 (en) 2013-08-28 2017-02-14 Cellular Research, Inc. Massively parallel single cell analysis
US10927419B2 (en) 2013-08-28 2021-02-23 Becton, Dickinson And Company Massively parallel single cell analysis
US11618929B2 (en) 2013-08-28 2023-04-04 Becton, Dickinson And Company Massively parallel single cell analysis
US10253375B1 (en) 2013-08-28 2019-04-09 Becton, Dickinson And Company Massively parallel single cell analysis
US10954570B2 (en) 2013-08-28 2021-03-23 Becton, Dickinson And Company Massively parallel single cell analysis
US10208356B1 (en) 2013-08-28 2019-02-19 Becton, Dickinson And Company Massively parallel single cell analysis
US10151003B2 (en) 2013-08-28 2018-12-11 Cellular Research, Inc. Massively Parallel single cell analysis
US9905005B2 (en) 2013-10-07 2018-02-27 Cellular Research, Inc. Methods and systems for digitally counting features on arrays
US9582877B2 (en) 2013-10-07 2017-02-28 Cellular Research, Inc. Methods and systems for digitally counting features on arrays
US10927408B2 (en) 2013-12-02 2021-02-23 Personal Genome Diagnostics, Inc. Method for evaluating minority variants in a sample
WO2015083004A1 (en) * 2013-12-02 2015-06-11 Population Genetics Technologies Ltd. Method for evaluating minority variants in a sample
US11030276B2 (en) 2013-12-16 2021-06-08 10X Genomics, Inc. Methods and apparatus for sorting data
US11853389B2 (en) 2013-12-16 2023-12-26 10X Genomics, Inc. Methods and apparatus for sorting data
US11118221B2 (en) 2013-12-28 2021-09-14 Guardant Health, Inc. Methods and systems for detecting genetic variants
US11649491B2 (en) 2013-12-28 2023-05-16 Guardant Health, Inc. Methods and systems for detecting genetic variants
US11959139B2 (en) 2013-12-28 2024-04-16 Guardant Health, Inc. Methods and systems for detecting genetic variants
US11639526B2 (en) 2013-12-28 2023-05-02 Guardant Health, Inc. Methods and systems for detecting genetic variants
US11639525B2 (en) 2013-12-28 2023-05-02 Guardant Health, Inc. Methods and systems for detecting genetic variants
US10801063B2 (en) 2013-12-28 2020-10-13 Guardant Health, Inc. Methods and systems for detecting genetic variants
US9920366B2 (en) 2013-12-28 2018-03-20 Guardant Health, Inc. Methods and systems for detecting genetic variants
US10883139B2 (en) 2013-12-28 2021-01-05 Guardant Health, Inc. Methods and systems for detecting genetic variants
US11667967B2 (en) 2013-12-28 2023-06-06 Guardant Health, Inc. Methods and systems for detecting genetic variants
US11434531B2 (en) 2013-12-28 2022-09-06 Guardant Health, Inc. Methods and systems for detecting genetic variants
US10889858B2 (en) 2013-12-28 2021-01-12 Guardant Health, Inc. Methods and systems for detecting genetic variants
US11767556B2 (en) 2013-12-28 2023-09-26 Guardant Health, Inc. Methods and systems for detecting genetic variants
US11767555B2 (en) 2013-12-28 2023-09-26 Guardant Health, Inc. Methods and systems for detecting genetic variants
US11149307B2 (en) 2013-12-28 2021-10-19 Guardant Health, Inc. Methods and systems for detecting genetic variants
US11149306B2 (en) 2013-12-28 2021-10-19 Guardant Health, Inc. Methods and systems for detecting genetic variants
US11667959B2 (en) 2014-03-05 2023-06-06 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US10704086B2 (en) 2014-03-05 2020-07-07 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US10704085B2 (en) 2014-03-05 2020-07-07 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US11447813B2 (en) 2014-03-05 2022-09-20 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US11248253B2 (en) 2014-03-05 2022-02-15 Adaptive Biotechnologies Corporation Methods using randomer-containing synthetic molecules
US11091797B2 (en) 2014-03-05 2021-08-17 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US11091796B2 (en) 2014-03-05 2021-08-17 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US10982265B2 (en) 2014-03-05 2021-04-20 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US10870880B2 (en) 2014-03-05 2020-12-22 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US11261490B2 (en) 2014-04-01 2022-03-01 Adaptive Biotechnologies Corporation Determining antigen-specific T-cells
US10435745B2 (en) 2014-04-01 2019-10-08 Adaptive Biotechnologies Corp. Determining antigen-specific T-cells
US10066265B2 (en) 2014-04-01 2018-09-04 Adaptive Biotechnologies Corp. Determining antigen-specific t-cells
US11713457B2 (en) 2014-06-26 2023-08-01 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US11629344B2 (en) 2014-06-26 2023-04-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10392663B2 (en) 2014-10-29 2019-08-27 Adaptive Biotechnologies Corp. Highly-multiplexed simultaneous detection of nucleic acids encoding paired adaptive immune receptor heterodimers from a large number of samples
US10246701B2 (en) 2014-11-14 2019-04-02 Adaptive Biotechnologies Corp. Multiplexed digital quantitation of rearranged lymphoid receptors in a complex mixture
US11414688B2 (en) 2015-01-12 2022-08-16 10X Genomics, Inc. Processes and systems for preparation of nucleic acid sequencing libraries and libraries prepared using same
US11098358B2 (en) 2015-02-19 2021-08-24 Becton, Dickinson And Company High-throughput single-cell analysis combining proteomic and genomic information
US10697010B2 (en) 2015-02-19 2020-06-30 Becton, Dickinson And Company High-throughput single-cell analysis combining proteomic and genomic information
US11047008B2 (en) 2015-02-24 2021-06-29 Adaptive Biotechnologies Corporation Methods for diagnosing infectious disease and determining HLA status using immune repertoire sequencing
US10002316B2 (en) 2015-02-27 2018-06-19 Cellular Research, Inc. Spatially addressable molecular barcoding
USRE48913E1 (en) 2015-02-27 2022-02-01 Becton, Dickinson And Company Spatially addressable molecular barcoding
US9727810B2 (en) 2015-02-27 2017-08-08 Cellular Research, Inc. Spatially addressable molecular barcoding
US11535882B2 (en) 2015-03-30 2022-12-27 Becton, Dickinson And Company Methods and compositions for combinatorial barcoding
US11041202B2 (en) 2015-04-01 2021-06-22 Adaptive Biotechnologies Corporation Method of identifying human compatible T cell receptors specific for an antigenic target
US10774374B2 (en) 2015-04-10 2020-09-15 Spatial Transcriptomics AB and Illumina, Inc. Spatially distinguished, multiplex nucleic acid analysis of biological specimens
US11390912B2 (en) 2015-04-10 2022-07-19 Spatial Transcriptomics Ab Spatially distinguished, multiplex nucleic acid analysis of biological specimens
US11299774B2 (en) 2015-04-10 2022-04-12 Spatial Transcriptomics Ab Spatially distinguished, multiplex nucleic acid analysis of biological specimens
US11613773B2 (en) 2015-04-10 2023-03-28 Spatial Transcriptomics Ab Spatially distinguished, multiplex nucleic acid analysis of biological specimens
US11739372B2 (en) 2015-04-10 2023-08-29 Spatial Transcriptomics Ab Spatially distinguished, multiplex nucleic acid analysis of biological specimens
US11162132B2 (en) 2015-04-10 2021-11-02 Spatial Transcriptomics Ab Spatially distinguished, multiplex nucleic acid analysis of biological specimens
US11390914B2 (en) 2015-04-23 2022-07-19 Becton, Dickinson And Company Methods and compositions for whole transcriptome amplification
US11124823B2 (en) 2015-06-01 2021-09-21 Becton, Dickinson And Company Methods for RNA quantification
US11286531B2 (en) 2015-08-11 2022-03-29 The Johns Hopkins University Assaying ovarian cyst fluid
US10619186B2 (en) 2015-09-11 2020-04-14 Cellular Research, Inc. Methods and compositions for library normalization
US11332776B2 (en) 2015-09-11 2022-05-17 Becton, Dickinson And Company Methods and compositions for library normalization
US11371094B2 (en) 2015-11-19 2022-06-28 10X Genomics, Inc. Systems and methods for nucleic acid processing using degenerate nucleotides
US11242569B2 (en) 2015-12-17 2022-02-08 Guardant Health, Inc. Methods to determine tumor gene copy number by analysis of cell-free DNA
US11081208B2 (en) 2016-02-11 2021-08-03 10X Genomics, Inc. Systems, methods, and media for de novo assembly of whole genome sequence data
US10822643B2 (en) 2016-05-02 2020-11-03 Cellular Research, Inc. Accurate molecular barcoding
US11845986B2 (en) 2016-05-25 2023-12-19 Becton, Dickinson And Company Normalization of nucleic acid libraries
US10301677B2 (en) 2016-05-25 2019-05-28 Cellular Research, Inc. Normalization of nucleic acid libraries
US11397882B2 (en) 2016-05-26 2022-07-26 Becton, Dickinson And Company Molecular label counting adjustment methods
US10202641B2 (en) 2016-05-31 2019-02-12 Cellular Research, Inc. Error correction in amplification of samples
US11525157B2 (en) 2016-05-31 2022-12-13 Becton, Dickinson And Company Error correction in amplification of samples
US11220685B2 (en) 2016-05-31 2022-01-11 Becton, Dickinson And Company Molecular indexing of internal sequences
US10640763B2 (en) 2016-05-31 2020-05-05 Cellular Research, Inc. Molecular indexing of internal sequences
US10428325B1 (en) 2016-09-21 2019-10-01 Adaptive Biotechnologies Corporation Identification of antigen-specific B cell receptors
US10338066B2 (en) 2016-09-26 2019-07-02 Cellular Research, Inc. Measurement of protein expression using reagents with barcoded oligonucleotide sequences
US11460468B2 (en) 2016-09-26 2022-10-04 Becton, Dickinson And Company Measurement of protein expression using reagents with barcoded oligonucleotide sequences
US11782059B2 (en) 2016-09-26 2023-10-10 Becton, Dickinson And Company Measurement of protein expression using reagents with barcoded oligonucleotide sequences
US11467157B2 (en) 2016-09-26 2022-10-11 Becton, Dickinson And Company Measurement of protein expression using reagents with barcoded oligonucleotide sequences
US11608497B2 (en) 2016-11-08 2023-03-21 Becton, Dickinson And Company Methods for cell label classification
US11164659B2 (en) 2016-11-08 2021-11-02 Becton, Dickinson And Company Methods for expression profile classification
US10815525B2 (en) 2016-12-22 2020-10-27 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US11180805B2 (en) 2016-12-22 2021-11-23 10X Genomics, Inc Methods and systems for processing polynucleotides
US11732302B2 (en) 2016-12-22 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US11248267B2 (en) 2016-12-22 2022-02-15 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10793905B2 (en) 2016-12-22 2020-10-06 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10858702B2 (en) 2016-12-22 2020-12-08 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10550429B2 (en) 2016-12-22 2020-02-04 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10954562B2 (en) 2016-12-22 2021-03-23 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10722880B2 (en) 2017-01-13 2020-07-28 Cellular Research, Inc. Hydrophilic coating of fluidic channels
US11929145B2 (en) 2017-01-20 2024-03-12 Sequenom, Inc Methods for non-invasive assessment of genetic alterations
US11193122B2 (en) 2017-01-30 2021-12-07 10X Genomics, Inc. Methods and systems for droplet-based single cell barcoding
US11319583B2 (en) 2017-02-01 2022-05-03 Becton, Dickinson And Company Selective amplification using blocking oligonucleotides
US10995333B2 (en) 2017-02-06 2021-05-04 10X Genomics, Inc. Systems and methods for nucleic acid preparation
US11584958B2 (en) 2017-03-31 2023-02-21 Grail, Llc Library preparation and use thereof for sequencing based error correction and/or variant identification
US10676779B2 (en) 2017-06-05 2020-06-09 Becton, Dickinson And Company Sample indexing for single cells
US10669570B2 (en) 2017-06-05 2020-06-02 Becton, Dickinson And Company Sample indexing for single cells
US11884964B2 (en) 2017-10-04 2024-01-30 10X Genomics, Inc. Compositions, methods, and systems for bead formation using improved polymers
US11725231B2 (en) 2017-10-26 2023-08-15 10X Genomics, Inc. Methods and systems for nucleic acid preparation and chromatin analysis
US11884962B2 (en) 2017-11-15 2024-01-30 10X Genomics, Inc. Functionalized gel beads
US11254980B1 (en) 2017-11-29 2022-02-22 Adaptive Biotechnologies Corporation Methods of profiling targeted polynucleotides while mitigating sequencing depth requirements
US11365438B2 (en) 2017-11-30 2022-06-21 10X Genomics, Inc. Systems and methods for nucleic acid preparation and analysis
US11946095B2 (en) 2017-12-19 2024-04-02 Becton, Dickinson And Company Particles associated with oligonucleotides
US11739440B2 (en) 2018-02-12 2023-08-29 10X Genomics, Inc. Methods and systems for analysis of chromatin
US10928386B2 (en) 2018-02-12 2021-02-23 10X Genomics, Inc. Methods and systems for characterizing multiple analytes from individual cells or cell populations
US11131664B2 (en) 2018-02-12 2021-09-28 10X Genomics, Inc. Methods and systems for macromolecule labeling
US10725027B2 (en) 2018-02-12 2020-07-28 10X Genomics, Inc. Methods and systems for analysis of chromatin
US11002731B2 (en) 2018-02-12 2021-05-11 10X Genomics, Inc. Methods and systems for antigen screening
US10816543B2 (en) 2018-02-12 2020-10-27 10X Genomics, Inc. Methods and systems for analysis of major histocompatability complex
US11255847B2 (en) 2018-02-12 2022-02-22 10X Genomics, Inc. Methods and systems for analysis of cell lineage
US11852628B2 (en) 2018-02-22 2023-12-26 10X Genomics, Inc. Methods and systems for characterizing analytes from individual cells or cell populations
US11639928B2 (en) 2018-02-22 2023-05-02 10X Genomics, Inc. Methods and systems for characterizing analytes from individual cells or cell populations
US11155881B2 (en) 2018-04-06 2021-10-26 10X Genomics, Inc. Systems and methods for quality control in single cell processing
US11773441B2 (en) 2018-05-03 2023-10-03 Becton, Dickinson And Company High throughput multiomics sample analysis
US11365409B2 (en) 2018-05-03 2022-06-21 Becton, Dickinson And Company Molecular barcoding on opposite transcript ends
US11932899B2 (en) 2018-06-07 2024-03-19 10X Genomics, Inc. Methods and systems for characterizing nucleic acid molecules
US11703427B2 (en) 2018-06-25 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for cell and bead processing
US11873530B1 (en) 2018-07-27 2024-01-16 10X Genomics, Inc. Systems and methods for metabolome analysis
US11519033B2 (en) 2018-08-28 2022-12-06 10X Genomics, Inc. Method for transposase-mediated spatial tagging and analyzing genomic DNA in a biological sample
US11639517B2 (en) 2018-10-01 2023-05-02 Becton, Dickinson And Company Determining 5′ transcript sequences
US11932849B2 (en) 2018-11-08 2024-03-19 Becton, Dickinson And Company Whole transcriptome analysis of single cells using random priming
US11459607B1 (en) 2018-12-10 2022-10-04 10X Genomics, Inc. Systems and methods for processing-nucleic acid molecules from a single cell using sequential co-partitioning and composite barcodes
US11492660B2 (en) 2018-12-13 2022-11-08 Becton, Dickinson And Company Selective extension in single cell whole transcriptome analysis
US11649485B2 (en) 2019-01-06 2023-05-16 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US11926867B2 (en) 2019-01-06 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US11753675B2 (en) 2019-01-06 2023-09-12 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US11845983B1 (en) 2019-01-09 2023-12-19 10X Genomics, Inc. Methods and systems for multiplexing of droplet based assays
US11371076B2 (en) 2019-01-16 2022-06-28 Becton, Dickinson And Company Polymerase chain reaction normalization through primer titration
US11661631B2 (en) 2019-01-23 2023-05-30 Becton, Dickinson And Company Oligonucleotides associated with antibodies
US11851683B1 (en) 2019-02-12 2023-12-26 10X Genomics, Inc. Methods and systems for selective analysis of cellular samples
US11584953B2 (en) 2019-02-12 2023-02-21 10X Genomics, Inc. Methods for processing nucleic acid molecules
US11467153B2 (en) 2019-02-12 2022-10-11 10X Genomics, Inc. Methods for processing nucleic acid molecules
US11655499B1 (en) 2019-02-25 2023-05-23 10X Genomics, Inc. Detection of sequence elements in nucleic acid molecules
US11920183B2 (en) 2019-03-11 2024-03-05 10X Genomics, Inc. Systems and methods for processing optically tagged beads
US11965208B2 (en) 2019-04-19 2024-04-23 Becton, Dickinson And Company Methods of associating phenotypical data and single cell sequencing data
US11965213B2 (en) 2019-05-30 2024-04-23 10X Genomics, Inc. Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample
US11939622B2 (en) 2019-07-22 2024-03-26 Becton, Dickinson And Company Single cell chromatin immunoprecipitation sequencing assay
US11970737B2 (en) 2019-08-26 2024-04-30 Becton, Dickinson And Company Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
US11702698B2 (en) 2019-11-08 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Enhancing specificity of analyte binding
US11592447B2 (en) 2019-11-08 2023-02-28 10X Genomics, Inc. Spatially-tagged analyte capture agents for analyte multiplexing
US11773436B2 (en) 2019-11-08 2023-10-03 Becton, Dickinson And Company Using random priming to obtain full-length V(D)J information for immune repertoire sequencing
US11808769B2 (en) 2019-11-08 2023-11-07 10X Genomics, Inc. Spatially-tagged analyte capture agents for analyte multiplexing
CN110804655A (zh) * 2019-11-15 2020-02-18 康美华大基因技术有限公司 一种宏基因组绝对定量的方法
US11560593B2 (en) 2019-12-23 2023-01-24 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using RNA-templated ligation
US11795507B2 (en) 2019-12-23 2023-10-24 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using RNA-templated ligation
US11505828B2 (en) 2019-12-23 2022-11-22 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using RNA-templated ligation
US11332790B2 (en) 2019-12-23 2022-05-17 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using RNA-templated ligation
US11649497B2 (en) 2020-01-13 2023-05-16 Becton, Dickinson And Company Methods and compositions for quantitation of proteins and RNA
US11702693B2 (en) 2020-01-21 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods for printing cells and generating arrays of barcoded cells
US11732299B2 (en) 2020-01-21 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Spatial assays with perturbed cells
US11821035B1 (en) 2020-01-29 2023-11-21 10X Genomics, Inc. Compositions and methods of making gene expression libraries
US11898205B2 (en) 2020-02-03 2024-02-13 10X Genomics, Inc. Increasing capture efficiency of spatial assays
US11732300B2 (en) 2020-02-05 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Increasing efficiency of spatial analysis in a biological sample
US11835462B2 (en) 2020-02-11 2023-12-05 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for partitioning a biological sample
US11891654B2 (en) 2020-02-24 2024-02-06 10X Genomics, Inc. Methods of making gene expression libraries
US11926863B1 (en) 2020-02-27 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Solid state single cell method for analyzing fixed biological cells
US11768175B1 (en) 2020-03-04 2023-09-26 10X Genomics, Inc. Electrophoretic methods for spatial analysis
US11535887B2 (en) 2020-04-22 2022-12-27 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using targeted RNA depletion
US11773433B2 (en) 2020-04-22 2023-10-03 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using targeted RNA depletion
US11851700B1 (en) 2020-05-13 2023-12-26 10X Genomics, Inc. Methods, kits, and compositions for processing extracellular molecules
US11661625B2 (en) 2020-05-14 2023-05-30 Becton, Dickinson And Company Primers for immune repertoire profiling
US11624086B2 (en) 2020-05-22 2023-04-11 10X Genomics, Inc. Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity
US11959130B2 (en) 2020-05-22 2024-04-16 10X Genomics, Inc. Spatial analysis to detect sequence variants
US11608520B2 (en) 2020-05-22 2023-03-21 10X Genomics, Inc. Spatial analysis to detect sequence variants
US11866767B2 (en) 2020-05-22 2024-01-09 10X Genomics, Inc. Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity
US11560592B2 (en) 2020-05-26 2023-01-24 10X Genomics, Inc. Method for resetting an array
US11608498B2 (en) 2020-06-02 2023-03-21 10X Genomics, Inc. Nucleic acid library methods
US11845979B2 (en) 2020-06-02 2023-12-19 10X Genomics, Inc. Spatial transcriptomics for antigen-receptors
US11512308B2 (en) 2020-06-02 2022-11-29 10X Genomics, Inc. Nucleic acid library methods
US11692218B2 (en) 2020-06-02 2023-07-04 10X Genomics, Inc. Spatial transcriptomics for antigen-receptors
US11859178B2 (en) 2020-06-02 2024-01-02 10X Genomics, Inc. Nucleic acid library methods
US11840687B2 (en) 2020-06-02 2023-12-12 10X Genomics, Inc. Nucleic acid library methods
US11624063B2 (en) 2020-06-08 2023-04-11 10X Genomics, Inc. Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof
US11407992B2 (en) 2020-06-08 2022-08-09 10X Genomics, Inc. Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof
US11492612B1 (en) 2020-06-08 2022-11-08 10X Genomics, Inc. Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof
US11781130B2 (en) 2020-06-08 2023-10-10 10X Genomics, Inc. Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof
US11434524B2 (en) 2020-06-10 2022-09-06 10X Genomics, Inc. Methods for determining a location of an analyte in a biological sample
US11661626B2 (en) 2020-06-25 2023-05-30 10X Genomics, Inc. Spatial analysis of DNA methylation
US11408029B2 (en) 2020-06-25 2022-08-09 10X Genomics, Inc. Spatial analysis of DNA methylation
US11761038B1 (en) 2020-07-06 2023-09-19 10X Genomics, Inc. Methods for identifying a location of an RNA in a biological sample
US11952627B2 (en) 2020-07-06 2024-04-09 10X Genomics, Inc. Methods for identifying a location of an RNA in a biological sample
US11932901B2 (en) 2020-07-13 2024-03-19 Becton, Dickinson And Company Target enrichment using nucleic acid probes for scRNAseq
US11926822B1 (en) 2020-09-23 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial analysis
US11827935B1 (en) 2020-11-19 2023-11-28 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using rolling circle amplification and detection probes
US11739443B2 (en) 2020-11-20 2023-08-29 Becton, Dickinson And Company Profiling of highly expressed and lowly expressed proteins
US11680260B2 (en) 2020-12-21 2023-06-20 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for spatial analysis of analytes in a biological sample
US11618897B2 (en) 2020-12-21 2023-04-04 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes
US11959076B2 (en) 2020-12-21 2024-04-16 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes
US11873482B2 (en) 2020-12-21 2024-01-16 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for spatial analysis of analytes in a biological sample
US11952626B2 (en) 2021-02-23 2024-04-09 10X Genomics, Inc. Probe-based analysis of nucleic acids and proteins
US11739381B2 (en) 2021-03-18 2023-08-29 10X Genomics, Inc. Multiplex capture of gene and protein expression from a biological sample
US11840724B2 (en) 2021-09-01 2023-12-12 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and kits for blocking a capture probe on a spatial array
US11753673B2 (en) 2021-09-01 2023-09-12 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and kits for blocking a capture probe on a spatial array
US11970739B2 (en) 2023-07-06 2024-04-30 10X Genomics, Inc. Multiplex capture of gene and protein expression from a biological sample

Also Published As

Publication number Publication date
DE102008025656A1 (de) 2009-12-03
DE102008025656B4 (de) 2016-07-28
WO2009152928A3 (de) 2010-02-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE102008025656B4 (de) Verfahren zur quantitativen Analyse von Nukleinsäuren, Marker dafür und deren Verwendung
DE60025850T2 (de) Verfahren zur erzeugung von oligonukleotiden, im besonderen zur detektion amplifizierter restriktionsfragmente, die durch aflp erhalten wurden
EP0743367B2 (de) Verfahren zur Genexpressionsanalyse
US9745614B2 (en) Reduced representation bisulfite sequencing with diversity adaptors
Shin et al. Decoding neural transcriptomes and epigenomes via high-throughput sequencing
DE10056802B4 (de) Verfahren zur Detektion von Methylierungszuständen zur toxikologischen Diagnostik
EP2531610B1 (de) Verfahren zur Komplexitätsminderung
EP1261740A1 (de) Ligase/polymerase-verfahren zur detektion von cytosin-methylierung in dna proben
AT502823A4 (de) Polynukleotid-amplifikation
DE102005034628B4 (de) Verfahren zur Untersuchung von Cytosin-Methylierungen in DNA
CA3158739A1 (en) Method for identifying gene fusions by circle cdna amplification
DE19920611A1 (de) Verfahren zur 5&#39;-Cap-abhängigen Anreicherung von cDNAs
WO2007068305A1 (de) Verfahren zur bestimmung des genotyps aus einer biologischen probe enthaltend nukleinsäuren unterschiedlicher individuen
US6670121B1 (en) Methods for characterizing mRNA molecules
US20210388427A1 (en) Liquid sample workflow for nanopore sequencing
WO2003022986A2 (de) Identifikation und quantifizierung von nukleinsäuren durch erzeugung und serielle sequenzierung von sequenz-tags einheitlicher länge
EP4332235A1 (de) Hochempfindliche verfahren zur genauen parallelen quantifizierung von varianten von nukleinsäuren
US20220372550A1 (en) A method to prepare personalized target-irrelevant guide rna pool for crispr
DE102005048503B4 (de) Verfahren zur Steuerung der abschnittsweisen enzymatischen Nukleinsäurevervielfältigung über inkomplette Komplementärstränge
DE60318315T2 (de) Nukleinsäure vervielfältigungsverfahren
EP1797198B1 (de) Verbessertes elektrophoretisches trennverfahren für die analyse der genexpression
WO2023150640A1 (en) Methods selectively depleting nucleic acid using rnase h
DE10246384A1 (de) Erzeugung nicht-redundanter Subpools von DNA-Fragmentmischungen
DE10049589A1 (de) Verfahren zur Mutationsanalyse
WO2002046457A2 (de) Verfahren zur codierung von hybriddisierungssonden

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 09765508

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 09765508

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2