WO2009142018A1 - ベシクルの製造方法、この製造方法によって得られるベシクルおよびベシクルを製造するためのｗ／ｏ／ｗエマルション - Google Patents

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University of Tsukuba NUC
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    • B01J13/02—Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/06—Making microcapsules or microballoons by phase separation
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    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing vesicles and the like, and in particular, using a W / O / W emulsion produced using a W / O emulsion as a starting material, the aqueous phase inside the vesicle (hereinafter referred to as "inner aqueous phase") is desired.
  • ner aqueous phase the aqueous phase inside the vesicle
  • it relates to the W / O / W emulsion obtained by this manufacturing method.
  • a vesicle is also called a liposome, and is a closed endoplasmic reticulum consisting of a lipid bilayer formed of amphiphilic lipid molecules and an inner aqueous phase. It is a model cell membrane for research, DDS (drug delivery system) preparation, food It is expected to be used for various applications such as capsules and microreactors.
  • a vesicle can be prepared by forming a lipid thin film on a glass substrate, adding thereto an aqueous solution containing a substance to be encapsulated in a vesicle (hereinafter referred to as "encapsulated substance") and vigorously shaking.
  • encapsulated substance an aqueous solution containing a substance to be encapsulated in a vesicle
  • the particle size of vesicles obtained by this method is generally nonuniform, and the entrapment efficiency of the desired inclusion substance in the vesicles (hereinafter referred to as "entrapment rate”) is extremely low.
  • the “inclusion ratio” refers to the proportion of the inclusion substance contained in the vesicle among the inclusion substances contained in the whole of the finally obtained vesicle suspension, represented by weight percent.
  • An emulsion can be used to increase the inclusion rate of a desired substance in a vesicle, and a method called "reverse phase evaporation method" disclosed in Non-Patent Document 1, for example, is known.
  • a method called "reverse phase evaporation method" disclosed in Non-Patent Document 1, for example, is known.
  • an aqueous phase containing a desired inclusion substance is dispersed in a volatile organic solvent such as chloroform or ether containing an amphipathic lipid to prepare a W / O emulsion, from which only the solvent is removed by evaporation.
  • An aqueous solution is added to form vesicles having a particle diameter of about 200 to 1,000 nm.
  • a W / O emulsion is prepared by dispersing an aqueous phase containing a desired inclusion substance in a volatile organic solvent such as chloroform or ether containing an amphiphilic lipid. Then, a W / O / W emulsion is prepared by the stirring emulsification method using water or a buffer solution as the external aqueous phase solution, and a method of preparing a vesicle having a particle diameter of about several hundred nm by removing the organic solvent therefrom is also possible. Proposed.
  • Non-Patent Document 3 reports on the inclusion rate of a hydrophilic substance.
  • Non-Patent Document 1 and Non-Patent Document 2 chloroform, benzene and the like harmful to the human body are used as volatile solvents, and the use of vesicles produced by these methods for food etc. Limited
  • both of these methods it is difficult to control the size of the vesicles obtained.
  • the present invention proposes a vesicle manufacturing method capable of simultaneously achieving high inclusion rate and control of particle diameter as in the vesicle manufacturing method of Patent Document 1 mentioned above.
  • the method for producing a vesicle of the present invention is characterized by including the following steps (1) to (3).
  • the substance to be contained is a water-soluble substance, it is possible to produce vesicles having a high inclusion rate.
  • the substance to be contained at least one substance selected from pharmaceutical, food, supplement, or cosmetic substance can be adopted.
  • a hydrophobic substance can be contained in the organic solvent phase, and this hydrophobic substance is also selected from at least one substance selected from pharmaceutical, food, supplement, or cosmetic substances. Can.
  • the W / O / W emulsion be emulsified by microchannel emulsification from the viewpoint of not adding an excess share to the material to be handled.
  • the method for producing a W / O / W emulsion for producing a vesicle is characterized by comprising the following steps (1) to (2).
  • an aqueous solution containing a substance to be encapsulated in a dissolved or suspended state, and a lipid species having an emulsifying ability which functions as an emulsifier and can constitute vesicles for example, phosphorus such as phosphatidylcholine
  • the W / O emulsion is prepared from an organic solvent phase containing lipids etc., and then the W / O emulsion is dispersed in an aqueous solution containing an emulsifier which does not break the vesicle lipid membrane to make a W / O / W emulsion.
  • a lipid thin film can be formed around the water droplet inside the W / O / W emulsion containing the substance to be contained, and a vesicle containing the desired inclusion substance inside can be formed.
  • the solvent used as the organic solvent phase of the W / O emulsion and the W / O / W emulsion may be a volatile organic solvent which can dissolve vesicle-constituting lipids and is not miscible with water.
  • the emulsifier contained in the external-water-phase solution of the said W / O / W emulsion will not be restrict
  • a hydrophilic emulsifying agent capable of stabilizing emulsion droplets is added to the external aqueous phase solution, and in the present invention, a micro-channel emulsification is carried out with a minimal mechanical shear force during the emulsifying operation.
  • the emulsification method such as the method, it is possible to prevent the leakage of the inclusion substance from the W / O / W emulsion and the collapse of the lipid thin film of the vesicle obtained through the subsequent steps, and the improvement of the inclusion rate can be achieved. .
  • a vesicle capable of achieving a high inclusion rate with respect to a desired inclusion substance while controlling desired physical properties such as particle diameter of the vesicle, and safety usable as a medicine or food material
  • desired physical properties such as particle diameter of the vesicle, and safety usable as a medicine or food material
  • vesicles by combining highly functional chemicals, and also to manufacture vesicles with sufficient strength (shape retention) required as model cell membranes for research, DDS preparations and microreactors. can do.
  • the effects of the present invention which can be specifically mentioned are, for example, as follows.
  • the substance can be contained in a vesicle with a high inclusion rate. Moreover, any substance that can be dissolved or dispersed in the dispersed aqueous phase of the W / O emulsion can be contained in the vesicle regardless of the type of the contained substance. Therefore, the vesicles produced according to the present invention may be used in DDS formulations as carriers of hydrophilic and hydrophobic drugs, or in screening of useful components as microreactors for performing reactions on genes and proteins useful in vesicles. Can.
  • the production method of the present invention it is possible to stably provide a vesicle having a desired average particle diameter in the range of about 0.05 ⁇ m to 100 ⁇ m, which is difficult in the conventional vesicle production method.
  • the "average particle diameter” refers to a particle diameter calculated as a geometric average on a number basis in a number distribution of vesicle particle diameters.
  • the vesicle of the present invention is suitable as a carrier of food related components and cosmetic related components which can not be applied by the existing method, in addition to drugs such as DDS drugs which have been conventionally contemplated, for example, various vitamins Used for enhancing food function as a carrier that can promote or suppress absorption of nutritional components, or applied to functional lotions using vesicles containing moisturizing components and whitening components It is possible.
  • FIG. 1 Flow chart showing an example of the method of manufacturing vesicles of the present invention
  • FIG. 1 is a conceptual diagram showing an example of a vesicle manufacturing apparatus
  • FIG. 1 is a diagram showing a configuration example of a flow.
  • FIG. 1 is a photomicrograph of the W / O emulsion of Example 1
  • (b) is a photomicrograph of the W / O / W emulsion of Example 1
  • (c) is a photomicrograph of the vesicle of Example 1
  • A) is a figure which shows particle size distribution of the vesicle of Example 1
  • (b) is a figure which shows particle size distribution of the vesicle of Example 2
  • Photomicrograph of W / O emulsion of Example 2 Photomicrograph of W / O / W emulsion of Example 2
  • the vesicle of the present invention is characterized in that various substances such as a water-soluble substance, solid particles or cells are contained in the inner aqueous phase, and the average particle diameter is several tens nm to several tens ⁇ m. Further, in the vesicle of the present invention, in addition to the vesicle composed of the above-mentioned lipid bilayer membrane, a microbe having a layer composed of lipid molecules which can constitute the vesicle (the membrane does not have to have the molecular membrane structure necessarily) Also included are particles having a capsule structure.
  • vesicle-constituting lipids may be any lipid having an emulsifying ability capable of forming vesicles, that is, amphiphilic lipids, phosphatidylcholine Phospholipids such as phosphatidyl glycerol, phosphatidyl inositol, phosphatidic acid, phosphatidyl serine, and sphingolipids, food emulsifiers such as sorbitan fatty acid esters and polyglycerin fatty acid esters, fatty acids such as oleic acid Can be illustrated.
  • amphiphilic lipids such as phosphatidylcholine Phospholipids such as phosphatidyl glycerol, phosphatidyl inositol, phosphatidic acid, phosphatidyl serine, and sphingolipids
  • food emulsifiers such as sorbitan fatty acid esters and polyglycerin
  • lipid that functions as a stabilizer that stabilizes an emulsion or a vesicle may be included as long as the effects of the present invention are not impaired.
  • sterols such as cholesterol and ergosterol
  • charged lipids such as stearylamine
  • long chain fatty acids such as oleic acid, stearic acid and palmitic acid, and the like.
  • peptides and carbohydrates that can interact with the lipid bilayer can be used in combination.
  • FIG. 1 is a flow chart showing an example of the method for producing a vesicle of the present invention.
  • an aqueous phase solution containing an inclusion substance and an organic solvent phase containing an amphiphilic lipid are mixed, and a W 1 / O emulsion having a desired droplet diameter is produced using an existing emulsification device.
  • this step is referred to as "primary emulsification step"
  • the aqueous phase of the W 1 / O emulsion pure water or a solution of salts or saccharides, or a buffer solution containing these can be used, and the substance to be encapsulated can be dissolved or dispersed in it.
  • an organic solvent immiscible with water such as n-hexane (hereinafter simply referred to as hexane) can be used.
  • the emulsifying amphiphilic lipid described above is contained in the organic solvent phase.
  • the droplet diameter of the emulsion to be produced from an existing emulsifying device such as an ultrasonic emulsifying machine, a stirring emulsifying machine, a membrane emulsifying machine, a microchannel emulsifying device, or a high pressure homogenizer It can be selected as appropriate.
  • a W 1 / O / W 2 emulsion is prepared by using the above W 1 / O emulsion as a dispersed phase and using an external aqueous phase solution containing a water-soluble emulsifier that does not destroy the vesicle lipid membrane as a continuous phase (hereinafter referred to as this)
  • the process is called "secondary emulsification process").
  • the composition of the outer aqueous phase may be the same as or different from the composition of the inner aqueous phase containing the inclusion substance, and the composition is not limited as long as it does not prevent the formation of vesicles in the subsequent step.
  • an external aqueous phase solution having the same or similar osmotic pressure as the aqueous phase solution containing the inclusion substance.
  • a hydrophilic emulsifier to be contained in the external aqueous phase solution one which does not interfere with the formation of a lipid membrane of vesicles can be used in the subsequent step, and the use of a protein emulsifier such as sodium casein is effective.
  • a microchannel emulsification device module comprising (a) a microchannel substrate made of silicon and (b) a glass plate covering the upper part of the substrate.
  • the outer aqueous phase solution is filled in the outlet side of the grooved microchannel formed by (a) and (b), or the outlet side of the through-hole type microchannel processed on (a)
  • a W 1 / O / W 2 emulsion can be produced by pressing the above W 1 / O emulsion containing an inclusion substance from the inlet side of the microchannel.
  • the microchannel substrate those of various forms such as dead end type, cross flow type and through hole type can be used.
  • the produced W 1 / O / W 2 emulsion is recovered and transferred into an open container and left in an open vessel to evaporate and remove the organic solvent phase in the W 1 / O / W 2 emulsion.
  • a lipid thin film is formed around the internal aqueous phase droplets containing the inclusion substance by the amphiphilic lipid dissolved in the organic solvent phase, and it is possible to obtain vesicles.
  • FIG. 2 is a conceptual diagram which shows an example of (a) vesicle manufacturing apparatus, and (b) is a structural example of the flow.
  • Example 1 Amphiphilic lipids that constitute vesicles
  • PC Phosphatidylcholine
  • Chol cholesterol
  • OA oleic acid
  • calcein was dissolved as the inclusion substance so as to have a concentration of 0.4 mmol / L.
  • the average particle diameter of the water droplets contained in the manufactured W / O emulsion is about 2 ⁇ m (measured by a laser diffraction particle size distribution analyzer), and it is a microscope image that the water droplets contain calcein which is an inclusion substance. Confirmed by. This microscope image is shown in FIG. 3 (a).
  • a W / O / W emulsion was produced by a microchannel emulsification method.
  • An experimental dead-end microchannel emulsifier module was used to produce the W / O / W emulsion.
  • the microchannel substrate of this module was made of silicon, and the terrace length, channel depth and channel width of the microchannel substrate were about 60 ⁇ m, about 11 ⁇ m and about 16 ⁇ m, respectively.
  • a glass plate is pressure-bonded to the microchannel substrate to form a channel, and the outlet side of the channel is filled with Tris-HCl buffer solution (pH 9, 50 mmol / L) containing 3% casein sodium, which is an external aqueous phase solution.
  • the W / O emulsion was supplied from the inlet side of the channel to produce a W / O / W emulsion.
  • the average droplet size of the produced W / O / W emulsion is approximately 30 ⁇ m according to the observation by the microscope image shown in FIG. 3 (b), and the droplets of the W / O emulsion have water droplets It was confirmed that water droplets having the same size and containing calcein as the inclusion substance are contained.
  • the water droplets contained inside the W / O / W emulsion are hereinafter referred to as "internal water phase droplets”.
  • Example 2 By using a rotor-stator type homogenizer in place of the ultrasonic water tank of Example 1 in the primary emulsification step, W / O emulsions having different average water droplet diameters are produced and used to obtain vesicles finally obtained. We tried to change the particle size.
  • vesicles were produced from the W / O / W emulsion.
  • the average particle size of the vesicles measured by a laser diffraction particle size distribution analyzer was about 2 ⁇ m. That is, a larger vesicle is obtained by preparing a W / O emulsion having a large average water droplet diameter in the above primary emulsification step, and using it for the subsequent secondary emulsification step and subsequent removal of the organic solvent phase to produce vesicles. It was possible.
  • Example 3 Using Tris-HCl buffer solution (50 mmol / L, pH 9) containing 500 mmol / L sucrose or sodium chloride in place of the dispersed phase in the primary emulsification step and the external aqueous phase solution in the secondary emulsification step in Example 1 A vesicle was produced in the same manner as in Example 1.
  • the average particle size of the obtained vesicles was about 1 ⁇ m.
  • the inclusion rate of calcein measured in the same manner as in Example 1 was about 64% and 46% when sucrose was added and when sodium chloride was added, as shown in the graph of FIG.
  • Non-Patent Document 1 is used even under difficult conditions using an aqueous solution containing highly hydrophilic inclusion substances such as sugars and salts. It has been found that vesicles are produced with a higher or similar degree of inclusion as compared to the existing methods as shown in and 2.
  • vesicle in which a water-soluble substance, which was difficult in the existing vesicle production method, is efficiently encapsulated.
  • vesicles are already used in the industry as carriers of hydrophobic drugs, vesicles produced according to the present invention can be applied to drug delivery systems as carriers of water-soluble drugs and are effective in the pharmaceutical industry It is expected to be used.
  • the hydrophilic drug is a vesicle
  • hydrophobic drugs can be simultaneously retained on the lipid membrane of the vesicles. This is expected to be applied to the development of a new medicine that simultaneously acts on affected areas simultaneously with hydrophilic and hydrophobic drugs, which have conventionally been difficult to deliver simultaneously to affected areas.
  • the vesicles produced according to the present invention can be used for food, supplements, cosmetics, and oral administration since the present invention can produce vesicles using only ingredients that can be used in the food industry, unlike the existing production methods. It can also be used for medicinal products. For example, if an enzyme that helps digest food is contained in a vesicle and this vesicle is added to a food that contains a large amount of components that can be degraded by the enzyme, the vesicle is broken in the body after food intake and the enzyme is released. An effect such as promoting digestion of ingredients can be expected. In the cosmetic field as well, since the hydrophobic whitening component and the hydrophilic moisturizing component can be simultaneously held in the vesicle, it is expected to be used as a cosmetic having a new function.

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Abstract

【課題】　有効成分の高い内包率と、粒子径の制御とを同時に達成することができるベシクルの製造方法を提供する。 【解決手段】　内包させる物質を溶解あるいは懸濁状態で含む水溶液と、ベシクルを構成することができる乳化能を有する脂質を含む有機溶媒相とからＷ／Ｏエマルションを製造する工程と、前記Ｗ／Ｏエマルションと、ベシクル脂質膜を破壊しない水溶性乳化剤の外水相液からＷ／Ｏ／Ｗエマルションを製造する工程と、前記Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションから有機溶媒相を除去してベシクルを形成させる工程とによってベシクルを製造する。

Description

ベシクルの製造方法、この製造方法によって得られるベシクルおよびベシクルを製造するためのＷ／Ｏ／Ｗエマルション
　本発明はベシクルの製造方法等に関し、特にＷ／Ｏエマルションを出発物質として製造されたＷ／Ｏ／Ｗエマルションを用い、ベシクル内部の水相部分（以下、「内水相」という。）に所望の水溶性物質を内包し、粒子径が数十ｎｍ～数十μｍのベシクルを製造する方法および、この製造方法によって得られるベシクル、ならびにベシクルを製造するためのＷ／Ｏ／Ｗエマルションの製造方法および、この製造方法によって得られるＷ／Ｏ／Ｗエマルションに関する。
　ベシクルはリポソームとも言われ、両親媒性の脂質分子により形成される脂質二分子膜と、内水相とからなる閉鎖小胞体であり、研究用のモデル細胞膜やＤＤＳ（ドラッグデリバリーシステム）製剤、食品カプセル、マイクロリアクターなどの様々な用途への利用が期待されている。
　従来のベシクル作製法の一例として固体表面上に形成した脂質薄膜を水和する方法がある。例えば、ガラス基材上に脂質薄膜を形成し、これにベシクルに内包させる物質（以下、「内包物質」という。）を含む水溶液を加えて激しく振盪することでベシクルを調製することができる。しかし、この方法で得られるベシクルの粒径は一般に不均一であり、また所望の内包物質のベシクル内への内包効率（以下、「内包率」という）は極めて低い。ここで、「内包率」とは、最終的に得られたベシクル懸濁液全体に含まれる内包物質のうち、ベシクルに内包されたものの割合を重量パーセントで表したもの」を指す。また、粒径がマイクロメートルスケールの比較的大きなベシクルを大量に得ることも困難であった。
　ベシクルへの所望の物質の内包率を高めるためにエマルションを利用することができ、例えば、非特許文献１に開示される「逆相蒸発法」と呼ばれる方法が知られている。この方法では、所望の内包物質を含む水相を両親媒性脂質を含むクロロホルムやエーテルなどの揮発性有機溶媒中に分散させてＷ／Ｏエマルションを作製し、ここから溶媒のみを蒸発除去した後、水溶液を添加して粒子径２００～１，０００ｎｍ程度のベシクルを形成させる。
　また、非特許文献２に開示されるように、所望の内包物質を含む水相を、両親媒性脂質を含むクロロホルムやエーテルなどの揮発性有機溶媒中に分散させてＷ／Ｏエマルションを作製し、次に、水や緩衝溶液を外水相溶液として撹拌乳化法によりＷ／Ｏ／Ｗエマルションを作製し、ここから有機溶媒を除去することで粒子径数百ｎｍ程度のベシクルを作製する方法も提案されている。これらの方法によれば、３０～６０％という比較的高い内包率を達成できる場合があり、現在、ベシクルに物質を内包するための有効な方法として利用されている。また、非特許文献３には親水性物質の内包率についての報告がなされている。
　なお、本発明者らによる特許文献１には、内包物質を含む水相と乳化剤を含む油相とによってＷ／Ｏエマルションを作製した後に内水相のみを凍結させ、次に上記乳化剤を脂質に置換することでベシクルを製造する、本発明とは異なる有効な方法が開示されている。
特許第４００９７３３号公報
Szoka　et　al.：Proc.Natl.Acad.Sci.USA、vol.75、No.9、4194－4198、1978. Ishii　et　al.：J．Dispersion　Sci．Technol．、vol．9、No．1，1－15、1988． Nii and Ishii. Int. J. Phermaceutics, vol. 298, 198-195,2005
　非特許文献１および非特許文献２に開示される方法では、揮発性の溶媒として人体に有害なクロロホルム、ベンゼンなどが用いられており、これらの方法で製造されるベシクルの食品などへの利用は制限される。また、これらの方法を用いても、高い内包率を安定的に得ることは困難であり、依然としておよそ４０～７０％程度の内包物質はベシクル内に内包されずにベシクルの外部水相に溶解した状態で存在する。さらに、これら両方法では、得られるベシクルのサイズを制御することが難しい。
　したがって高い内包率と粒子径の制御を同時に達成するベシクル製造方法の開発が望まれている。これに対し、本発明は、前記特許文献１のベシクル製造方法と同様、高い内包率と粒子径の制御を同時に達成することができるベシクル製造方法を提案するものである。
　上記の課題を解決するため、本発明のベシクルの製造方法は以下の（１）～（３）の工程を含むことを特徴とする。
（１）内包させる物質を溶解あるいは懸濁状態で含む水溶液と、ベシクルを構成することができる乳化能を有する脂質を含む有機溶媒相とからＷ／Ｏエマルションを製造する工程。
（２）前記Ｗ／Ｏエマルションと、ベシクル脂質膜を破壊しない水溶性乳化剤の外水相液からＷ／Ｏ／Ｗエマルションを製造する工程。
（３）前記Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションから有機溶媒相を除去してベシクルを形成させる工程。
　前記内包させる物質が水溶性物質であっても、本発明の方法によれば内包率の高いベシクルを製造することが可能である。内包させる物質としては医薬用、食品用、サプリメント用、または化粧品用物質から選ばれる少なくとも一種類の物質を採用することができる。
　一方、前記有機溶媒相中には疎水性物質を含有させることができ、この疎水性物質としても医薬用、食品用、サプリメント用、または化粧品用物質から選ばれる少なくとも一種類の物質から選択することができる。
　前記Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションはマイクロチャネル乳化法によりエマルション化されることが扱う物質に過剰のシェアを加えない点から望ましい。
　また、本発明に係るベシクルを製造するためのＷ／Ｏ／Ｗエマルションの製造方法は、以下の（１）～（２）の工程からなることを特徴とする。
（１）内包させる物質を溶解あるいは懸濁状態で含む水溶液と、ベシクルを構成することができる乳化能を有する脂質を含む有機溶媒相とからＷ／Ｏエマルションを製造する工程。
（２）前記Ｗ／Ｏエマルションと、ベシクル脂質膜を破壊しない水溶性乳化剤の外水相液からＷ／Ｏ／Ｗエマルションを製造する工程。
　本発明に係るベシクルの製造方法では、内包させる物質を溶解あるいは懸濁状態で含む水溶液と、乳化剤として機能し、かつベシクルを構成し得る乳化能を有する脂質種（例えばフォスファチジルコリンなどのリン脂質など）を含む有機溶媒相からＷ／Ｏエマルションを作製し、次いで前記Ｗ／Ｏエマルションを、ベシクル脂質膜を破壊しない乳化剤を含む水溶液中に分散させてＷ／Ｏ／Ｗエマルションを作製した後、このＷ／Ｏ／Ｗエマルションから有機溶媒相を除去する。この方法により、内包させる物質を含むＷ／Ｏ／Ｗエマルション内部の水滴の周囲に脂質薄膜を形成させ、所望の内包物質を内部に含むベシクルを形成することができる。
　前記Ｗ／ＯエマルションおよびＷ／Ｏ／Ｗエマルションの有機溶媒相として用いる溶媒は、ベシクル構成脂質を溶解させることができ、かつ水と混和しない揮発性の有機溶媒であればよい。また、前記Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションの外水相溶液中に含ませる乳化剤は、有機溶媒除去後の脂質薄膜の形成を妨げないものであれば制限はない。
　従来提案されているＷ／Ｏ／Ｗエマルションを利用したベシクル製造法では、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションの外水相溶液として水や緩衝溶液が用いられ、撹拌乳化法によりＷ／Ｏ／Ｗエマルションを作製していたが、本発明では、外水相溶液中にエマルション液滴を安定化させることができる親水性の乳化剤を添加し、さらに乳化操作時の機械的剪断力が極力小さい、マイクロチャネル乳化法のような乳化方法を採用することで、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションからの内包物質の漏洩や続く工程を経て得られるベシクルの脂質薄膜の崩壊を防ぐことができ、内包率の向上を達成できる。
　本発明によれば、ベシクルの粒径など所望の物性を制御しつつ、所望の内包物質に対して高い内包率が達成できるベシクルを製造することができ、また医薬や食品素材として利用可能な安全性の高い化学物質の組み合わせでベシクルを作製することが可能であり、さらに、研究用のモデル細胞膜やＤＤＳ製剤およびマイクロリアクターとして要求される強度（形状維持性）をも十分に備えたベシクルを製造することができる。具体的に挙げることができる本発明の効果は、例えば以下の通りである。
（１）高い内包率で物質をベシクル内に内包化できる。しかも、Ｗ／Ｏエマルションの分散水相内に溶解または分散可能な物質であれば、内包物質の種類を問わず、ベシクル内に内包することができる。従って、本発明により製造したベシクルは、親水性および疎水性薬物のキャリアーとしてＤＤＳ製剤に用いたり、ベシクル内で有用な遺伝子やタンパク質に係る反応を行うマイクロリアクターとして有用成分のスクリーニングに用いたりすることができる。
（２）本発明の製造方法によれば、従来のベシクル製造法では困難であった、０．０５μｍ～１００μｍ程度の範囲で所望する平均粒径をもったベシクルを安定的に提供できる。ここで、「平均粒径」とは、ベシクル粒径の数分布において、個数基準の幾何平均として算出される粒径を指す。
（３）Ｗ／ＯおよびＷ／Ｏ／Ｗエマルションの有機溶媒相に溶解する両親媒性脂質種を選択することで、種々の脂質組成のベシクルを比較的容易に調製できる。
　上記の通り、製造工程で使用する原材料として、すべて食品用途に利用できる安全性の高いものを用いることが可能であるため、得られたベシクルは高い安全性を有することが期待できる。
　従って、本発明のベシクルは、従来から企図されてきたＤＤＳ薬剤等の薬物のほか、既存の方法では適用できなかった食品関連成分、および化粧品関連成分のキャリアーとしても好適であり、たとえば、各種ビタミン類を含む食品用カプセル素材や、栄養成分の吸収を促進または抑制できるキャリアーとして食品の機能強化に用いたり、保湿成分、美白成分を内包したベシクルを利用した機能性化粧水などに応用したりすることが可能である。
本発明のベシクルの製造方法の一例を示す流れ図 （ａ）はベシクル製造装置の一例を示す概念図、（ｂ）はフローの構成例を示す図 （ａ）は実施例１のＷ／Ｏエマルションの顕微鏡写真、（ｂ）は実施例１のＷ／Ｏ／Ｗエマルションの顕微鏡写真、（ｃ）は実施例１のベシクルの顕微鏡写真 （ａ）は実施例１のベシクルの粒子径分布を示す図、（ｂ）は実施例２のベシクルの粒子径分布を示す図 実施例２のＷ／Ｏエマルションの顕微鏡写真 実施例２のＷ／Ｏ／Ｗエマルションの顕微鏡写真 緩衝液のみ、ショ糖添加及び塩添加の場合のベシクルへの親水性物質の内包率を示すグラフ 親水性物質の内包率について既存の方法と本発明とを比較したグラフ
　本発明のベシクルは、その内水相に水溶性物質、固体粒子、あるいは細胞など種々の物質を内包し、平均粒径が数十ｎｍ～数十μｍであることを特徴とする。また、本発明のベシクルには、前記脂質二分子膜により構成されるベシクルのほか、ベシクルを構成しうる脂質分子からなる層（必ずしも分子膜構造をとらなくてもよい）を壁材料とするマイクロカプセル構造をもつ粒子も含まれる。
　本発明のベシクルを構成する脂質種（以下、「ベシクル構成脂質」という。）は、ベシクルを形成することができる乳化能を有する脂質、すなわち両親媒性の脂質であれば良く、フォスファチジルコリン、フォスファチジルグリセロール、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジン酸、フォスファチジルセリンのようなリン脂質やスフィンゴ脂質類、ソルビタン脂肪酸エステルおよびポリグリセリン脂肪酸エステルなどの食品用乳化剤、オレイン酸などの脂肪酸等を例示することができる。
　また、本発明の効果を妨げない範囲で、エマルションまたはベシクルを安定化させる安定剤として機能する脂質等の他の成分を含ませても良い。例えば、コレステロールおよびエルゴステロールなどのステロール類、ステアリルアミンのような荷電性脂質、オレイン酸、ステアリン酸およびパルミチン酸などの長鎖脂肪酸類等である。また、脂質二分子膜と相互作用しうるペプチド類や糖質なども併用できる。
　図１は、本発明のベシクルの製造方法の一例を示す流れ図である。図に示す通り、内包物質を含む水相溶液と、両親媒性脂質を含む有機溶媒相とを混合し、既存の乳化装置を用いて所望の液滴径を持つＷ１／Ｏエマルションを作製する（以下、本工程を「一次乳化工程」という）。Ｗ１／Ｏエマルションの水相としては、純水もしくは塩類や糖類の溶液、またはこれらを含む緩衝液を用いることができ、これに内包物質を溶解または分散させて用いることができる。Ｗ１／Ｏエマルションの有機溶媒相には、ｎ－ヘキサン（以下、単にヘキサンと記す。）など、水と混和しない有機溶媒を用いることができる。
　有機溶媒相中には、既述の乳化性の両親媒性脂質を含ませておく。Ｗ１／Ｏエマルションのための乳化装置としては、超音波乳化機、撹拌乳化機、膜乳化機、マイクロチャネル乳化装置、高圧ホモジナイザー等の既存の乳化装置から、作製しようとするエマルションの液滴径にあわせて適宜選択することができる。
　次の工程では、上記Ｗ１／Ｏエマルションを分散相とし、ベシクル脂質膜を破壊しない水溶性乳化剤を含む外水相溶液を連続相としてＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを作製する（以下、本工程を「二次乳化工程」という）。Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの作製には既存の種々の乳化方法を用いることができるが、乳化操作時の液滴の崩壊および液滴からの内包物質の漏出を抑えるため、乳化処理に大きな機械的剪断力を必要としないマイクロチャネル乳化法を用いるのが最も効果的である。
　上記外水相の組成は、前記内包物質を含む内水相の組成と同一であっても異なっていても良く、続く工程でのベシクル形成を妨げないものであればその組成は制限されない。ただし、内包率向上のためには、内包物質を含む水相溶液と同じまたは近い浸透圧を持つ外水相溶液を用いることが望ましい。外水相溶液中に含ませる親水性乳化剤としては、続く工程でベシクルの脂質膜の形成を妨げないものが使用でき、例えばカゼインナトリウムのようなタンパク質乳化剤の利用が効果的である。
　前記マイクロチャネル乳化法によりＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを作製する場合には、例えば（ａ）シリコン製マイクロチャネル基板、この基板上部を覆う（ｂ）ガラス板から構成されるマイクロチャネル乳化装置モジュールを使用する。そして、（ａ）および（ｂ）により形成される溝型マイクロチャネルの出口側、あるいは（ａ）上に加工された貫通孔型マイクロチャネルの出口側には上記外水相溶液を満たしておき、マイクロチャネルの入口側からは内包物質を含む上記Ｗ１／Ｏエマルションを圧入することで、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを作製できる。マイクロチャネル基板としては、デッドエンド型、クロスフロー型、貫通孔型など、種々の形態のものを用いることができる。
　続いて、作製した前記Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを回収し、開放容器中に移し静置することで、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルション中の有機溶媒相を蒸発除去する。これにより、有機溶媒相中に溶解していた両親媒性脂質により内包物質を含む内部水相滴の周囲に脂質薄膜が形成されベシクルを得ることができる。
　上記工程を統合することで、各種成分を装置内に導入するだけで半自動的にベシクルを作製できる装置を作製することができる。図２は、（ａ）ベシクル製造装置の一例を示す概念図、および（ｂ）そのフローの構成例である。
　従来の技術では、数十ｎｍから数十μｍ程度の任意の粒径のベシクルに物質を効率よく内包させ、かつ同時に多数の同様なベシクルを製造することは困難であった。本発明の製造方法および装置によれば、加熱、冷却、減圧などの煩雑な条件を設定することなく、数十％程度の高い内包率で所望の物質を内包したベシクルを一度に大量に得ることができる。
　以下に具体的な実施例を説明する。なお、本発明は、これらの実施例に限定されない。実施例中の「％」は「重量パーセント濃度」を示す。
実施例１
（ベシクルを構成する両親媒性脂質）
　中性リン脂質である卵黄由来のフォスファチジルコリン（以下、「ＰＣ」と記す。）、代表的なステロール類であるコレステロール（以下、「Ｃｈｏｌ」と記す。）および長鎖脂肪酸であるオレイン酸（以下、「ＯＡ」と記す。）からなる混合物を、ベシクルを構成する両親媒性脂質として用いた。
（一次乳化工程によるＷ／Ｏエマルションの製造）
　３％のＰＣおよびこれと等モル量に相当するＣｈｏｌおよびＯＡを含むヘキサンを有機溶媒相として、また、ｐＨ９のトリス－塩酸緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ）を内水相用の水分散相として超音波処理による乳化を行った。詳細には、分散相体積分率が２５％となるように連続相となる有機溶媒相と分散相を混合し、超音波水槽（出力３００Ｗ）中で５分間緩やかに振盪することによりＷ／Ｏエマルションを作製した。なお、水分散相中には、内包物質としてカルセインを０．４ｍｍｏｌ／Ｌの濃度になるように溶解させておいた。
　製造されたＷ／Ｏエマルションに含まれている水滴の平均粒径はおよそ２μｍ（レーザー回折粒度分布計により測定）であり、水滴中には内包物質であるカルセインが含まれていることが顕微鏡画像により確認された。図３（ａ）に、この顕微鏡画像を示す。
（二次乳化工程によるＷ／Ｏ／Ｗエマルションの製造）
　続いて、上記Ｗ／Ｏエマルションを分散相として、マイクロチャネル乳化法によるＷ／Ｏ／Ｗエマルションの製造を行った。Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションの製造には、実験用デッドエンド型マイクロチャネル乳化装置モジュールを使用した。このモジュールのマイクロチャネル基板はシリコン製であり、マイクロチャネル基板のテラス長、チャネル深さおよびチャネル幅はそれぞれ約６０μｍ、約１１μｍおよび約１６μｍであった。
　上記マイクロチャネル基板にガラス板を圧着させてチャネルを形成し、このチャネルの出口側に外水相溶液である３％のカゼインナトリウムを含むトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ９、５０ｍｍｏｌ／Ｌ）を満たしておき、チャネルの入り口側から前記Ｗ／Ｏエマルションを供給してＷ／Ｏ／Ｗエマルションを製造した。
　製造されたＷ／Ｏ／Ｗエマルションの平均液滴径は、図３（ｂ）に示す顕微鏡画像による観測により、およそ３０μｍであり、その液滴の内部には、前記Ｗ／Ｏエマルションの水滴と同程度の大きさで、かつ内包物質であるカルセインを含む水滴が含まれていることが確認された。なお、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションの内部に含まれる水滴を以後、「内部水相滴」という。
（有機溶媒相の除去によるベシクルの製造）
　次に、前記Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションを蓋のない開放ガラス製容器に移し替え、室温下で約２０時間静置した。この操作により、図３（ｃ）に示す蛍光顕微鏡画像から、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルション中のヘキサンが消失して微細なベシクル粒子の懸濁液が得られ、この粒子内にはカルセインが含まれていることが確認された。
　また、図４に示したレーザー回折粒度分布計によるグラフの曲線（ａ）から、このベシクルの平均粒径が約１μｍであることが判明した。また、Ｏｋｕらの方法（Ｏｋｕ　ｅｔ　ａｌ．：　Ｂｉｏｃｈｉｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ，　ｖｏｌ．　６９１，　３３２－３４０，　１９８２）に基づき測定したカルセインの内包率は、図７のグラフに示すように約７６％であった。
実施例２
　一次乳化工程において、実施例１の超音波水槽に代えてローター・ステーター型ホモジナイザーを使用することで、平均水滴径の異なるＷ／Ｏエマルションを作製し、これを用いて最終的に得られるベシクルの粒子サイズを変えることを試みた。
（一次乳化工程によるＷ／Ｏエマルションの製造）
　実施例１と同様の連続相および分散相を用いて、分散相体積分率が２５％になるように連続相と分散相を混合し、ローター・ステーター型ホモジナイザーの回転速度１８，０００ｒｐｍで５分間乳化を行いＷ／Ｏエマルションを作製した。図５に、得られたＷ／Ｏエマルションの顕微鏡画像を示す。レーザー回折粒度分布計による測定から、このＷ／Ｏエマルションに含まれる水滴の平均粒径はおよそ５μｍであることが判明した。
（二次乳化工程によるＷ／Ｏ／Ｗエマルションの製造）
　前記Ｗ／Ｏエマルションを用い、実施例１と同様の装置および手順により、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションを製造した。図６に示す顕微鏡画像から、このＷ／Ｏ／Ｗエマルションの平均液滴径はおよそ２２μｍであり、前記Ｗ／Ｏエマルションの水滴と同程度の大きさの内部水相滴を含んでいることが判った。
（有機溶媒相の除去によるベシクルの製造）
　実施例１と同様の手順で、前記Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションからベシクルを作製した。図４の曲線（ｂ）に示すように、レーザー回折粒度分布計により測定したこのベシクルの平均粒子径は約２μｍであった。すなわち、上記一次乳化工程で平均水滴径の大きなＷ／Ｏエマルションを製造し、これをつづく二次乳化工程およびさらにつづく有機溶媒相の除去によるベシクルの製造に用いることで、より大きなベシクルを得ることができた。
実施例３
　実施例１における一次乳化工程の分散相および二次乳化工程の外水相溶液に代えて、５００ｍｍｏｌ／Ｌのスクロース、または塩化ナトリウムを含むトリス－塩酸緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ９）を用いて実施例１と同様の手順でベシクルを製造した。
　得られたベシクルの平均粒子径はいずれも約１μｍであった。実施例１と同様にして測定したカルセインの内包率は、図７のグラフに示すように、スクロースを添加した場合および塩化ナトリウムを添加した場合においてそれぞれ約６４％および４６％であった。
　すなわち、図８のグラフ（非特許文献３を元に作図）に示すように、糖や塩のような高親水性内包物質を含む水溶液を使用した困難な条件であっても、非特許文献１および２に示すような既存の方法に比べて高いもしくは同程度の内包率でベシクルが製造されることが判明した。
　本発明の製造方法によれば、既存のベシクル製造法では困難であった水溶性物質を効率的に内包化したベシクルを製造できる。ベシクルは既に、疎水性薬物のキャリアーとして産業で利用されているが、本発明により製造されるベシクルは、水溶性薬物のキャリアーとしてドラッグデリバリーシステムに適用することができ、医薬品産業での効果的な利用が期待される。
　例えば、一次乳化工程において、分散相に親水性薬物を、有機溶媒相に疎水性薬物をそれぞれ溶解して、上記実施例に示すような手順によりベシクルを作製すれば、親水性の薬物はベシクルの内部水相に、疎水性の薬物はベシクルの脂質膜に同時に保持させることができる。これにより、従来は同時に患部に送達することが困難であった親水性・疎水性の両薬物を同時に患部に作用させる新規な医薬品の開発への応用が期待される。
　さらに、本発明では、既存の製造法とは異なり、食品産業でも利用可能な成分のみを使用してベシクルを製造できるため、本発明により製造されるベシクルは、食品、サプリメント、化粧品、および経口投与用医薬品などにも利用可能である。例えば、食品の消化を助ける酵素をベシクルに内包させ、このベシクルを当該酵素が分解する成分を多く含む食品中に添加すれば、食品を摂取した後に体内でベシクルが壊れて酵素が放出され、食品成分の消化を促進するなどの効果が期待できる。
　また、化粧品分野においても、疎水性の美白成分と親水性の保湿成分を同時にベシクルに保持させることができるため、新たな機能を有する化粧水などへの利用が期待される。

Claims (9)

  1. 以下の（１）～（３）の工程を含むことを特徴とするベシクルの製造方法。
    （１）内包させる物質を溶解あるいは懸濁状態で含む水溶液と、ベシクルを構成することができる乳化能を有する脂質を含む有機溶媒相とからＷ／Ｏエマルションを製造する工程。
    （２）前記Ｗ／Ｏエマルションと、ベシクル脂質膜を破壊しない水溶性乳化剤の外水相液からＷ／Ｏ／Ｗエマルションを製造する工程。
    （３）前記Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションから有機溶媒相を除去してベシクルを形成させる工程。
  2. 前記内包させる物質が水溶性物質である請求項１に記載のベシクルの製造方法。
  3. 前記内包させる物質が医薬用、食品用、サプリメント用、または化粧品用物質から選ばれる少なくとも一種類の物質である請求項１または請求項２に記載のベシクルの製造方法。
  4. 前記有機溶媒相中に疎水性物質を含有させることを特徴とする請求項１に記載のベシクルの製造方法。
  5. 前記疎水性物質が医薬用、食品用、サプリメント用、または化粧品用物質から選ばれる少なくとも一種類の物質である請求項４に記載のベシクルの製造方法。
  6. 前記Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションがマイクロチャネル乳化法によりエマルション化されることを特徴とする請求項１に記載のベシクルの製造方法。
  7. 請求項１～６に記載のベシクルの製造方法によって製造されたことを特徴とするベシクル。
  8. 以下の（１）～（２）の工程からなることを特徴とする、ベシクルを製造するためのＷ／Ｏ／Ｗエマルションの製造方法。
    （１）内包させる物質を溶解あるいは懸濁状態で含む水溶液と、ベシクルを構成することができる乳化能を有する脂質を含む有機溶媒相とからＷ／Ｏエマルションを製造する工程。
    （２）前記Ｗ／Ｏエマルションと、ベシクル脂質膜を破壊しない水溶性乳化剤の外水相液からＷ／Ｏ／Ｗエマルションを製造する工程。
  9. 請求項８に記載のＷ／Ｏ／Ｗエマルションの製造方法によって製造されたことを特徴とするＷ／Ｏ／Ｗエマルション。
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