WO2009129798A2 - Di- und triphosphat-prodrugs, insbesondere nukleosiddi- und -triphosphat-prodrugs - Google Patents

Di- und triphosphat-prodrugs, insbesondere nukleosiddi- und -triphosphat-prodrugs Download PDF

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WO2009129798A2
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Henning Jessen
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Definitions

  • Di- and triphosphate prodrugs in particular nucleoside di- and triphosphate prodrugs
  • the invention relates to compounds which can be used as prodrugs, medicaments and pharmaceutical compositions obtainable therefrom, as well as pharmaceutical dosage forms and a process for the preparation of the compounds according to the invention.
  • nucleoside analogues that can be incorporated into the DNA.
  • AIDS immunodeficiency Syndrome
  • HI virus which belongs to the group of retroviruses.
  • forms of therapy are known which suppress the proliferation of the virus.
  • not a single drug is known that could completely eliminate the virus from the body.
  • the medication leads in some patients to unpleasant side effects [D. Richman, M.A. Fischl, M.H. Grieco, M.S. Gott Kunststoff, P.A. Volberding, O.L. Laskin, J.M. Leedom, J. Groopman, D.Mildvan, M.S. Hirsch, G.G. Jackson, DT. Durack, D. Phil, S.
  • Natural nucleosides as well as antivirally active nucleoside analogs must first be converted into their triphosphates by certain, more or less specific enzymes when they are incorporated into the DNA strand for chain extension.
  • the structure of the NTP from the corresponding nucleoside analogue is carried out by kinases via three individual steps (nucleoside-> nucleoside monophosphate (NMP) ->NDP-> NTP), each of which inhibited or not expire because of the structural variation of the nucleoside analog compared to the parent nucleoside can.
  • NMP nucleoside monophosphate
  • NTP nucleoside triphosphate
  • the antivirally active nucleoside analogs act as chain terminators, ie there is no further elongation in the 3 'direction [J. Baizarini, P. Herdewijn, E. De Clercq; Differential Patterns of intracellular Metabolism of 2 ', 3'-didehydro-2', 3'-dideoxythymidine and 3, 3 '-dideoxythymidine' -azido-2 ', two potent anti-human immunodeficiency virus Compounds; J. Biol. Chem. 1989, 264, 6127-6133].
  • BBB blood-brain barrier
  • prodrug systems One way to increase the lipophilicity of known drugs is the use of prodrug systems.
  • Prodrugs or "prodrugs” are prodrugs which release the actual active ingredient later with elimination of masking groups.
  • Prerequisites for such a prodrug, in this case a pronucleotide are increased lipophilicity in order to be able to penetrate the cell membranes and the blood-brain barrier, sufficient stability in the extracellular medium and the release of non-toxic masks.
  • NMP prodrugs A disadvantage of the use of NMP prodrugs is further that the required further phosphorylation to the di- and triphosphates in the cell can be inhibited or completely prevented.
  • DP diphosphate
  • DP diphosphate
  • DP diphosphate
  • MP monophosphate
  • NDP and NTP In contrast to NMP prodrugs, there is currently no functioning system for masking NDP and NTP.
  • the application of the concepts developed for NMP prodrugs is described as not possible in the prior art [s. Chu and Tan 1999 (Advanced Drug Delivery Reviews)].
  • the problem is that in the case of NDP and NTP, in contrast to NMP, no simple phosphate group, but rather a high-energy phosphoric anhydride bond in the form of the pyrophosphate unit has to be reversibly masked without the anhydride bond (s) breaking.
  • anhydride bond s
  • NDP and NTP prodrugs essentially from their NMP relatives.
  • hydrolysis reactions can take place on the phosphorus atom. Since masking of a pyrophosphate bridge always results in one more charge than for a monophosphate, it is not expected that enzymatic cleavage of NDP or NTP prodrugs could be efficient. Rather, considering the prior art [C. Meier, U. Muus, J. Renze, L. Naesens, E. De Clercq, J.
  • the object of the present invention is to provide improved di- and / or triphosphate prodrugs, in particular nucleoside or nucleoside analog prodrugs, which do not have the disadvantages known from the prior art.
  • the invention relates in a first aspect to a compound of general formula (I)
  • R 1 , R 4 , R 7 and R 8 independently of one another are H, OCR or HN-C-R, R is alkyl, aryl or O-acyl,
  • R 2 , R 3 , R 5 and R 6 are independently H, alkyl, aryl or O-acyl, R 9 is a nucleoside, nucleoside analog or alcohol residue, and Kat + is a cation, provided that R 1 , R 4 , R 7 and R 8 are not all H.
  • nucleoside is understood as meaning organic molecules which consist of a sugar residue and an organic base, in particular a nitrogen-containing heterocyclic base (nucleobase).
  • the sugar residue is usually a pentose, e.g. Deoxyribose or ribose.
  • the nucleobases are often purines (R) and pyrimidines (Y). Examples of purines are guanine (G) and adenine (A), examples of pyrimidines are cytosine (C), thymine (T) and uracil (U).
  • Phosphorylated nucleosides for example nucleoside monophosphates (NMP), nucleoside diphosphates (NDP) and nucleoside triphosphates (NTP), are also referred to as nucleotides.
  • NMP nucleoside monophosphates
  • NDP nucleoside diphosphates
  • NTP nucleoside triphosphates
  • the phosphate, diphosphate (pyrophosphate) or triphosphate group is usually linked to the 5'-C atom of the sugar component of the nucleoside.
  • a nucleoside analog is here understood to mean a nucleoside which naturally does not occur in the human body but resembles a naturally occurring nucleoside in the human body in such a way that it is processed by the cell in accordance with the natural nucleoside, for example phosphorylated and incorporated into a DNA strand
  • alkyl includes saturated aliphatic groups including straight-chain alkyl groups (eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, pentyl, hexyl, heptyl, and octyl), branched chain alkyl groups (eg, isopropyl, tert-butyl, isobutyl), cycloalkyl (eg, alicyclic ) Groups (eg cyclopropyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl), alkyl-substituted cycloal
  • Alkyl further includes alkyl groups having oxygen, nitrogen, sulfur or phosphorus atoms which replace one or more carbon atoms of the hydrocarbon backbone.
  • alkyl also includes both unsubstituted alkyls and substituted alkyls, the latter referring to alkyl groups having substituents replacing a hydrogen atom on one or more carbon atoms of the hydrocarbon backbone.
  • substituents may include, for example, alkyl, alkenyl, alkynyl, halogen, hydroxyl, alkylcarbonyloxy, arylcarbonyloxy, alkoxycarbonyloxy, aryloxycarbonyloxy, carboxylate, alkylcarbonyl, arylcarbonyl, alkoxycarbonyl, aminocarbonyl, alkylaminocarbonyl, dialkylaminocarbonyl, alkylthiocarbonyl, alkoxyl, phosphate, phosphonato, phosphinato, cyano , Amino (including alkylamino, dialkylamino,
  • Arylamino, diarylamino and alkylarylamino may be acylamino (including alkylcarbonylamino, arylcarbonylamino, carbamoyl and ureido), amidino, imino, sulfhydryl, alkylthio, arylthio, thiocarboxylate, sulfates, alkylsulfinyl, sulfonato, sulfamoyl, sulfonamido, nitro, trifluoromethyl, cyano, azido, heterocyclyl , Alkylaryl or an aromatic or heteroaromatic radical.
  • Cycloalkyls may be further substituted, eg with the substituents given above.
  • An "alkylaryl” or “aralkyl” radical is an alkyl substituted with an aryl (e.g., phenylmethyl (benzyl)).
  • “Alkyl” also includes the side chains of natural and unnatural amino acids.
  • aryl is meant groups having aromaticity, including 5- and 6-membered single-ring aromatic groups which may include from zero to four heteroatoms, as well as multi-cyclic systems having at least one aromatic ring.
  • aryl groups include benzene, phenyl, pyrrole, furan, thiophene, thiazole, isothiazole, imidazole, triazole, tetrazole, pyrazole, oxazole, isooxazole, pyridine, pyrazine, pyridazine and pyrimidine, and the like.
  • aryl includes multicyclic aryl groups, eg tricyclic, bicyclic, eg naphthalene, benzoxazole, benzodioxazole, benzothiazole, benzoimidazole, benzothiophene, methylenedioxyphenyl, quinoline, isoquinoline, napthridine, indole, benzofuran, purine, benzofuran, deazapurine or indolizine ,
  • aryl are also meant aryl groups which have heteroatoms in the ring structure (“heteroaryls").
  • the aromatic ring may be substituted at one or more ring positions.
  • Aryl groups may also contain alicyclic or heterocyclic rings that are not aromatic are fused or bridged to form a multicyclic system (eg tetralin, methylenedioxyphenyl).
  • alcohol radical is understood here to mean any organic carbon compound in which a hydrogen atom on the carbon skeleton is replaced by a hydroxyl group.
  • alcohols include sugars such as glucose, fructose, mannose etc, but also other compounds such as e.g. Geraniol.
  • the compounds of the invention can be used in an advantageous manner as prodrugs (prodrugs). They allow for the first time the introduction of nucleosides and nucleoside analogs and other organic compounds having a hydroxyl group, e.g. of sugars or alcohols, at the level of di- and triphosphates in the cell. This makes it possible for the first time, for example, to introduce the nucleoside triphosphates used by the cell directly into the cell so that any further intracellular phosphorylation steps that are otherwise required are no longer needed. As a result, not only can the actual use of the introduced nucleosides by the cell be made better possible, but also side effects, which are caused, for example, by monophosphates, can now be avoided.
  • the compounds according to the invention can find advantageous use as medicaments both as antiviral and as antitumor agents. They are particularly suitable as medicines for
  • Non-nucleosidic alcohols can also be transported into the cell in the form of their di- or triphosphates and released there.
  • the lipophilicity of the compounds according to the invention can be varied and adjusted. In this way it is possible to tailor the connections for different applications.
  • the skilled worker knows of methods by which he can introduce the corresponding residues and determine the lipophilicity.
  • R 1 , R 4 , R 7 and R 8 are simultaneously hydrogen atoms. However, this does not exclude that, for example, R 1 , R 4 and R 7 or R 1 , R 7 and R 8 or R 4 , R 7 and R 8 are all H. In a preferred embodiment, in the compound of the invention R 1 and
  • R 4 both OCR or HN-C-R and R 7 and R 8 are both H.
  • R 9 in the compound of the invention is a nucleoside or nucleoside analog.
  • R 9 can also be any alcohol radical, the alcohol particularly preferably being an alcohol which is used in the cell in the form of a diphosphate or triphosphate.
  • An example of such an alcohol is geraniol, which occurs in the biosynthesis of pheromones in the form of its diphosphate.
  • Exemplary compounds according to the invention are bis (4-acyloxybenzyl) -nucleoside diphosphate (BAB-NDP) and bis (4-acyloxybenzyl) -nucleoside triphosphate (BAB-NTP) and the corresponding OAf ⁇ o isomers bis- (2-acyloxybenzyl) -nucleoside diphosphate (BAB-NDP) and bis (2-acyloxybenzyl) -nucleoside triphosphate:
  • the compounds according to the invention are converted into bis (4-acylaminobenzyl) -nucleoside diphosphate, bis- ( ⁇ / -acylaminobenzyl) -nucleoside diphosphate, bis - ( ⁇ / -acylaminobenzyl) -nucleoside triphosphate and bis- (N-acylaminobenzyl) -nucleoside triphosphate:
  • acyl radical R can be used to control the stability in various media and at the same time adjust the polarity of the compound so that effective passive transport across the cell membrane can be achieved. Masking of the non-terminal phosphates is omitted.
  • the prodrugs according to the invention show a high stability to chemical hydrolysis in aqueous buffer systems and a clear tendency to enzymatic hydrolysis and thus release of the active ingredient in human cell extracts. They fulfill important requirements for use as pharmaceuticals.
  • the hydrolysis mechanism of the BAB-N DP prodrug according to the invention is shown below:
  • the invention also relates in a further aspect to a pharmaceutical
  • a composition comprising a compound of the invention and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers are known to those skilled in the art and include one or more liquid, semi-solid or solid fillers, diluents or other substances suitable for administration to mammals, including humans.
  • carrier in the context of the present invention refers to any organic or inorganic, natural or synthetic substance which can be combined with the active ingredient to simplify the administration. Examples of such carriers include, but are not limited to, organic or inorganic solvents, starch, lactose, mannitol, methylcellulose, talc, gelatin, agar-agar, calcium phosphate, magnesium stearate, animal and vegetable fats, higher molecular weight fatty acids, or higher molecular weight polymers.
  • “Pharmaceutically acceptable” means any non-toxic material for mammals, particularly humans, that does not substantially affect the effectiveness of the biological activity of the active ingredient. Such materials may include pharmaceutically acceptable levels of salts, buffers, preservatives, or the like.
  • Non-limiting examples of pharmaceutically acceptable carriers include magnesium carbonate, magnesium stearate, talc, sugars, lactose, ethanol, glycerine, water, etc.
  • the pharmaceutical composition may also comprise adjuvants and / or diluents.
  • the invention also relates to a pharmaceutical
  • Dosage form comprising a compound of the invention and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a dosage form for oral administration for example a tablet or capsule.
  • the present invention relates to a process for the preparation of a compound of the general formula (I)
  • R 1 , R 4 , R 7 and R 8 independently of one another are H, OCR or HN-C-R, R is alkyl, aryl or O-alkyl,
  • R 2 , R 3 , R 5 and R 6 are independently H, alkyl, aryl or Oalkyl, R 9 is nucleoside, nucleoside analog or alcohol residue, and Kat + is a cation, provided that R 1 , R 4 , R 7 and R 8 are not all H, comprising the steps of a) reacting a phenyl ester of the general formula (III)
  • R 4 is chosen so that both are O-CR or HN-C-R and R and R 8 are chosen so that both are H.
  • R 7 and R 8 are chosen such that both are O-CR or HN-C-R and R 1 and R 4 are chosen so that both are H.
  • R 9 is a nucleoside or nucleoside analog.
  • Fig. 4 Stability of the prodrugs of the invention in human blood plasma.
  • Phenylester IM are reacted with Dichlorophosphoramidit 194, preferably under inert gas (eg nitrogen), with cooling (eg -78 0 C) and in abs. Triethylamine (TEA) dissolved in abs. Tetrahydrofuran (THF).
  • THF Tetrahydrofuran
  • the resulting phosphoramidite IV is then reacted with a corresponding nucleoside monophosphate (NucIMP) or nucleoside diphosphate (NucIDP) to form the corresponding nucleoside di (Ia) and triphosphates (IIa), respectively.
  • the corresponding NTP prodrugs can be prepared by using the corresponding nucleoside diphosphates instead of the nucleoside monophosphates (NucIMP).
  • the synthesis of all compounds I and II according to the invention can be carried out according to the method described on the example of the BAB-NDP prodrugs.
  • 4-hydroxybenzyl alcohol 21 is selectively acylated with the corresponding acid chlorides.
  • the reactions are carried out under nitrogen as an inert gas. It will be 1.0 eq. p-hydroxybenzyl alcohol and 1.0 eq. Section. Triethylamine (TEA) in abs. Dissolved tetrahydrofuran (THF) and cooled to 0 0 C. For 20 minutes, the respective acid chlorides (1.1 eq.), Dissolved in abs. THF, dripped. After 1-2 h reaction time at 0 0 C triethylammonium chloride is removed by filtration and condensed off the solvent in vacuo.
  • TFA Triethylamine
  • Phosphorus trichloride is reacted with diisopropylamine DIPA in diethyl ether. This is followed by Schlenk filtration. The result is dichlorophosphoramidite (194).
  • Variant B The reactions are carried out under nitrogen as an inert gas. It will be 4.4 eq. POCI 3 in abs. Dissolved acetonitrile and cooled to 0 ° C. This solution will be 4.4 eq. Section. Pyridine and 2.2 eq. carefully added distilled water. After 5-10 min, 1.0 eq. the relevant nucleoside added as a solid. After 4 h at RT (room temperature) temperature), the reaction is terminated by adding ice water and stirred for a further hour in the refrigerator. By careful addition of solid ammonium hydrogen carbonate, a pH of 8 is set. The solvents are removed by freeze-drying. The residue is dissolved in water and purified on an RP-18 phase with water and an acetonitrile gradient.
  • Variant A The NMPs are eluted through a protonated ion exchange column Dowex 50WX8.
  • the protonated form of the NMP is titrated with the respective cationic hydroxide solution to the neutral point or by direct addition of 2.0 eq. neutralized the respective solutions and the solvent removed by lyophilization.
  • Variant B The diammonium salts of NMPs are dissolved in water. It will be 2.0 eq. Tetra-n-butylammonium hydroxide solution (40% in H 2 O 1 m / m) was added and the solvent removed by freeze-drying.
  • the Solution is cooled to -25 0 C and oxidized with 51 ul f-BuOOH (5.5 M in n-decane, 0:28 mmol, 1.4 eq.). After 15 min at -25 0 C is warmed to RT and the solvent removed in vacuo.
  • the crude product is purified on a RP-18 column, first with water / methanol 2: 1, then 1: 1.
  • the product is lyophilized.
  • the counterions are exchanged (Dowex 50WX8, NH 4 + ).
  • the eluate is lyophilized.
  • the product is again chromatographed RP-18, first with water / methanol 2: 1, then 1: 1.
  • the product is again freeze-dried. Yield: 14 mg (20 ⁇ mol, 10%) of a colorless, hygroscopic solid.
  • the mixture is then cooled to -25 0 C and quenched by addition of 46 ⁇ l_ f-BuOOH (5.5 M in ⁇ -decane, 0:25 mmol, 1.0 eq.) Was oxidized. After 15 min at -25 0 C is warmed to RT and the solvent removed in vacuo.
  • the crude product was purified via an RP-18 reversed phase (water / methanol, initially 2: 1, then 1: 1, then pure methanol). The product fractions are lyophilized.
  • the crude product undergoes ion exchange (Dowex 50WX8, NH 4 + ).
  • the eluate is lyophilized.
  • a final purification is performed on an RP-18 reverse phase (water / methanol 1: 2). The product is freeze-dried.
  • the reaction is carried out under nitrogen as an inert gas.
  • 115 mg of bis (tetra-n-butylammonium) AZTMP (139 ⁇ mol, 1.0 eq.) are initially suspended for 2 h over molecular sieve 0.3 nm in 3 mL abs.
  • Dried acetonitrile The dried solution is transferred to a reaction flask and the solvent removed in vacuo.
  • the molecular sieve is washed twice with abs. Washed acetonitrile and the wash solution also transferred to the reaction flask.
  • the educt is still three times with a few mL of abs.
  • Acetonitrile coevaporated to give a colorless foam. This is in 1.5 mL abs.
  • Composition NBu 4 ZNH 4 1: 3 is obtained.
  • the NMR data are given. Renewed ion exchange is dispensed with since about 7% decomposition product occurred in the previously pure product with a single ion exchange.
  • Variant A The reaction is carried out under nitrogen as an inert gas. 146 mg of bis (tetra-n-butylammonium) AZTMP (176 ⁇ mol, 1.0 eq.) Are initially suspended for 2 h over molecular sieve 0.3 nm in 3 mL abs. Dried acetonitrile. The dried solution is transferred to a reaction flask and the solvent removed in vacuo. The molecular sieve is washed twice with abs. Washed acetonitrile and the wash solution also transferred to the reaction flask. The educt is still three times with a few mL of abs. Acetonitrile coevaporated to give a colorless foam. This is in 2 mL abs.
  • the resulting fractions are always lyophilized on the lyophil.
  • the pure product obtained is re-salted on an ion exchanger (Dowex 50WX8, NH 4 + ) and lyophilized. A proportionate decomposition (about 7%) of the product occurred.
  • Variant B The reaction is carried out under nitrogen as an inert gas. There are 26 mg of di-ammonium AZTMP (68 .mu.mol, 1.0 eq.) Twice with abs. Acetonitrile coevaporated, the residue in 3 ml abs. DMF was added and a few beads of molecular sieve 0.4 nm added.
  • the oxidation was performed by adding 22 .mu.l NBuOOH (5.5 M in n-decane, 0:12 mmol, 1.8 eq.) At -30 0 C.
  • the solvents are removed in vacuo, the residue taken up in water / acetonitrile and lyophilized. From the crude product, a 31 P-NMR spectrum is recorded. Although the product was formed, it was found that variant A gave significantly better yields with fewer by-products. On a separation of the crude mixture is therefore omitted.
  • reaction is carried out under nitrogen as an inert gas.
  • 160 mg of bis (tetra-n-butylammonium) d4TMP (203 ⁇ mol, 1.0 eq.) are initially suspended for 2 h over molecular sieve 0.3 nm in 3 mL abs.
  • Dried acetonitrile The dried solution is transferred to a reaction flask and the solvent removed in vacuo.
  • the molecular sieve is washed twice with abs. Washed acetonitrile and the wash solution also transferred to the reaction flask.
  • the educt is still three times with a few mL of abs. Acetonitrile coevaporated to give a colorless foam. This is in 2 mL abs.
  • the crude product is dissolved in a little methanol and separated on a RP-18 phase, first isocratically with water / methanol 1: 1 to remove unreacted starting material and DCI, then isocratically with water / methanol 5: 1.
  • the product fractions are lyophilized and the crude product is added via an ion exchanger (Dowex 50WX8, NH 4 + , 30% acetonitrile in water).
  • the eluate is lyophilized again and the residue is re-separated with water / methanol 1: 4 on an RP-18 phase.
  • the product is finally lyophilized.
  • the work-up is carried out as follows: After completion of the reaction, the solvent is removed in vacuo and the residue is dissolved in a little acetonitrile. This solution is chromatographed isocratically on a RP-18 phase with water / methanol 1: 1 until educt and DCI have been removed. Now is eluted isocratically with water / methanol 3: 1 and then 4: 1. For both mixtures, the product could be detected.
  • the clean fractions (F1) are combined and freed from methanol on a rotary evaporator at low temperature, made up with water and freeze-dried. There are obtained 58 mg of the clean fractions (F1) as tetra-n-butylammonium salt.
  • the contaminated fractions (F2) are added twice via an ion exchanger (Dowex 50WX8, NH 4 + , 30% acetonitrile in water), lyophilized and rechromatographed RP-18 (acetonitrile / water 2: 1).
  • the resulting crude product (F2) is chromatographed on preparative HPLC (water / acetonitrile 1: 1, 10 mL / min, RP-18). With an applied amount of 5 mg, the product could be kept pure. With a larger amount, however, the breakup failed.
  • the reaction is carried out under nitrogen as an inert gas.
  • the drying of the nucleotide and the reaction procedure were carried out as described in the preceding experiments.
  • the reaction is carried out under nitrogen as an inert gas.
  • the drying of the nucleotide and the reaction procedure were carried out as described in the preceding experiments.
  • the oxidation was performed by adding 42.0 .mu.l f-BuOOH (5.5 M in n-decane, 232 .mu.mol, 2.0 eq.) After 15 min at -25 0 C. the solvent was removed in vacuo. The residue is dissolved in a little acetonitrile and chromatographed on an RP-18 phase, first with methanol / water 1: 1, then 4: 1. Methanol is removed on a rotary evaporator, made up with water and lyophilized. The crude product is again separated via a RP-18 phase with methanol / water 2.5: 1.0. The product is lyophilized and chromatographed on preparative HPLC (40 mM ammonium formate in H 2 O / acetonitrile 1: 1, flow rate 10 ml / min, RP-18).
  • the reaction is carried out under nitrogen as an inert gas.
  • the drying of the nucleoside and the reaction were carried out as described in the preceding experiments.
  • 50 mM stock solutions of the target compounds in DMSO are prepared. 11 ⁇ l of these stock solutions are diluted in each case with 189 ⁇ l of deionized water and a further 100 ⁇ l of DMSO, so that 1.9 mM hydrolysis stock solutions are obtained.
  • the samples are incubated in a thermomixer at 37 ° C. After a period of time, aliquots of the kinetics solution are taken (Qe 60 ⁇ L) and immediately frozen in liquid nitrogen. The samples are thawed individually and analyzed immediately.
  • 547 mg disodium hydrogen phosphate and 155 mg potassium dihydrogen phosphate are made up to 100 ml total volume with deionized water.
  • the pH is controlled and optionally adjusted with phosphoric acid or NaOH.
  • 30 ⁇ l of the 50 mM stock DMSO solution of the compounds are diluted to a concentration of 6.0 mM with 220 ⁇ l of DMSO.
  • 100 ⁇ l of cell extract CEM / 0 for d4T, P3HR1 for BVdU and ACV, mouse liver extract for various compounds
  • 20 ⁇ l of 70 mM magnesium chloride solution For each measurement, such a solution is used and incubated at 37 0 C in the thermomixer.
  • the hydrolyses are quenched by the addition of 300 ⁇ L of methanol and stored at 0 ° C. for 5 min.
  • the hydrolysis kinetics in culture medium were analogous to the kinetics in cell extracts. In contrast, however, no MgCl 2 solution is added. Instead of the cell extract, culture medium (RPMI) with 10% heat-inactivated fetal calf serum (FCS) is added.
  • RPMI culture medium
  • FCS heat-inactivated fetal calf serum
  • AZT stands for the nucleoside analogue 3'-azido-2 ', 3'-dideoxythymidine, also known as retrovir.
  • the NMR spectroscopic monitoring of the hydrolysis clearly shows the preferential formation of 186 from 185a. If any cleavage of the anhydride bond to AZTMP occurs, then in a minor degree.
  • the assignment of the individual signals can be achieved for 185a by 31 P- 1 H correlation spectroscopy.

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Abstract

Die Erfindung betrifft als Propharmaka einsetzbare Verbindungen, daraus herstellbare Arzneimittel und pharmazeutische Zusammensetzungen sowie pharmazeutische Darreichungsformen und ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen. Die Erfindung stellt bioreversible maskierte Di- und Triphosphate, insbesondere Nukleosiddiphosphate (NDP) und Nukleosidtriphosphate (NTP) sowie entsprechende Analoga bereit, die beispielsweise zur Behandlung von Viruserkrankungen wie AIDS geeignet sind.

Description

Di- und Triphosphat-Prodrugs, insbesondere Nukleosiddi- und -triphosphat-Prodrugs
Die Erfindung betrifft als Propharmaka einsetzbare Verbindungen, daraus herstellbare Arzneimittel und pharmazeutische Zusammensetzungen sowie pharmazeutische Darreichungsformen und ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen.
In der Behandlung von viralen Infektionskrankheiten und Krebsleiden ist es vielversprechend, Nukleosidanaloga einzusetzen, welche in die DNA eingebaut werden können.
Zu den besonders bedrohlichen Infektionskrankheiten zählt die Immunschwächekrankheit AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrome). Verantwortlich für AIDS ist das HI-Virus, welches zur Gruppe der Retroviren gehört. Inzwischen sind Therapieformen bekannt, welche die Proliferation des Virus unterdrücken. Tatsächlich ist aber kein einziges Medikament bekannt, welches das Virus vollständig aus dem Körper beseitigen könnte. Auch führt die Medikation bei einigen Patienten zu unangenehmen Nebenwirkungen [D. D. Richman, M. A. Fischl, M. H. Grieco, M.S. Gottlieb, P. A. Volberding, O. L. Laskin, J. M. Leedom, J. Groopman, D. Mildvan, M. S. Hirsch, G. G. Jackson, DT. Durack, D. Phil, S. Nusinoff- Lehrman; The toxicity of AZT in the treatment of patients with AIDS and AIDS-related complex; New Engl. J. Med. 1987, 317, 192-197.]. Es besteht daher ein Interesse daran, neue Wirkstoffe zu finden und bekannte hinsichtlich ihrer Wirksamkeit und Verträglichkeit zu verbessern. Insbesondere die Optimierung bereits vorhandener Wirkstoffe bringt einige Vorteile mit sich, da diese bereits ausführlich untersucht werden. Gelingt es, ein Medikament durch Optimierung der Eigenschaften niedriger dosieren zu können, sollten auch die Nebenwirkungen nur noch in abgeschwächter Form auftreten.
Natürliche Nukleoside wie auch antiviral aktive Nukleosidanaloga müssen zunächst durch bestimmte, mehr oder minder spezifische Enzyme in ihre Triphosphate überführt werden, wenn sie zur Kettenverlängerung in den DNA-Strang eingebaut werden. Der Aufbau des NTP aus dem entsprechenden Nukleosidanalogon erfolgt durch Kinasen über drei Einzelschritte (Nukleosid-> Nukleosidmonophosphat (NMP)->NDP->NTP), von denen jeder wegen der strukturellen Variation des Nukleosidanalogons im Vergleich zum Stamm- Nukleosid gehemmt oder gar nicht ablaufen kann. Das Nukleosidtriphosphat (NTP) stellt somit die aktive Verbindung dar. Nach dem Einbau wirken die antiviral aktiven Nukleosidanaloga als Kettenterminatoren, d.h. es findet keine weitere Elongation in 3'-Richtung statt [J. Baizarini, P. Herdewijn, E. De Clercq; Differential Patterns of intracellular Metabolism of 2',3'-Didehydro-2',3'- dideoxythymidine and 3'-Azido-2',3'-dideoxythymidine, two potent Anti-human Immunodeficiency Virus Compounds; J. Biol. Chem. 1989, 264, 6127-6133]. Im Folgenden sind einige Beispiele für anti-HIV-aktive Nukleosidanaloga aufgeführt. Ihnen allen ist das Fehlen der 3'-OH Gruppe gemein.
Figure imgf000003_0001
2 ,3'-Didesoxy-2',3'-
3'-Azido-2',3'-didesoxythymidin 2',3'-Didesoxyinosin didehydrothymidin (AZT, Zidovudin, Retrovir^' ) 1 (ddl, Didanosin, Videx<R> ) 2 (d4T, Stavudin, Cerit(R) ) 3
Figure imgf000003_0002
2',3'-Didesoxycytidin ABC, Abacavir, Ziagen(R) 5 2'-Desoxy-3'-thiacytidin
(ddC, Zalticabin, Hivid(R) ) 4 (3TC, Lamuvidin, Epivir<R) ) 6
Das Passieren der Blut-Hirn-Schranke (BBB; blood brain barrier) stellt bei Erkrankungen, die auch das Gehirn betreffen, eine besondere Herausforderung dar. Es ist daher wichtig, Wirkstoffe so zu gestalten oder dahingehend zu modifizieren, dass sie in der Lage sind, die BBB zu passieren. Einige Untersuchungen zeigten, dass die Diffusion über die BBB mit steigender Lipophilie der Medikamente zunimmt [R. J. Sawchuk, Z. Yang; Investigation of distribution, transport and uptake of anti-HIV drugs to the central nervous System; Advanced Drug Delivery Reviews 1999, 39, 5-31].
Eine Möglichkeit, die Lipophilie bekannter Medikamente zu erhöhen, liegt in der Verwendung von Propharmaka-Systemen. Propharmaka oder „Prodrugs" sind Wirkstoffvorläufer, welche den eigentlichen Wirkstoff erst später unter Abspaltung von Maskierungsgruppen freisetzen. Voraussetzungen für ein solches Prodrug, in diesem Fall ein Pronukleotid, sind eine erhöhte Lipophilie, um die Zellmembranen und die Blut-Hirn-Schranke durchdringen zu können, eine ausreichende Stabilität im extrazellulären Medium und die Freisetzung nicht toxischer Masken.
Für NMP existieren bereits einige Ansätze für enzymatisch-aktivierbare Prodrug-Systeme [A. Pompon, I. Lefebvre, J. -L. Imbach, S. Khan, D. Farquhar; Decomposition Pathways of the Mono-(Pivaloyloxymethyl) and Bis-(Pivaloyloxymethyl) Esters of Azidothymidine-51- Monophosphate in Cell Extract and in Tissue-Culture Medium - An Application of the Online Isrp-Cleaning HPLC Technique; Antiviral Chem. Chemother. 1994, 5, 91-98; I. Lefebvre, C. Perigaud, A. Pompon, A.-M. Aubertin, J.-L. Girardet, A. Kim, G. Gosselin, J.-L. Imbach; MonoNukleoside Phosphotriester Derivates with S-Acyl-2-thioethyl Bioreversible Phosphate- Protecting Groups: Intracellular Delivery of S'-Azido^'.S'-dideoxythymidine-δ'- monophosphate; J. Med. Chem. 1995, 38, 3941-3950; W. Thomson, D. Nicholls, W. J. Irwin, J. S. Al-Mushadani, S. Freeman, A. Karpas, J.Petrik, N. Mahmood, A. J. Hay, Synthesis, Bioactivation and Anti-HIV Activity of the Bis(4-acyloxybenzyl) and Mono(4-acyloxybenzyl) Esters of the 5'-Monophosphate of AZT, J. Chem. Soc, Perkin Trans., 1993, 1, 1239-1245]
Bis-(4-Acyloxybenzyl)(AB)-Nukleotide wurden von S. Freeman et al. beschrieben
[ W. Thomson, D. Nicholls, W. J. Irwin, J. S. Al-Mushadani, S. Freeman, A. Karpas, J.Petrik, N. Mahmood, A. J. Hay, Synthesis, Bioactivation and Anti-HIV Activity of the Bis(4- acyloxybenzyl) and Mono(4-acyloxybenzyl) Esters of the δ'-Monophosphate of AZT, J. Chem. Soc, Perkin Trans., 1993, 1 , 1239-1245; A. Routledge, I. Walker, S. Freeman, A. Hay, N. Mahmood, Synthesis, Bioactivation and Anti-HIV Activity of 4-Acyloxybenzyl
Bis(Nucleosid-5-yl) Phosphates; Nucl. Nucl., 1995, 14(7), 1545-1558]. Um eine hinreichende Substrataffinität von Carboxyesterasen gegenüber dem intermediär auftretenden Phosphatdiester zu erhalten, wird als Spacer ein aromatisches System eingeführt. Die Hydrolysekaskade wird durch Spaltung der Acylgruppe von 17 eingeleitet. Dadurch findet eine Umpolung des zur Benzylgruppe para-ständigen Restes vom Elektronenakzeptor zu einem Elektronendonator statt. Diese Umpolung labilisiert die Benzylesterbindung und führt zu einem spontanen Zerfall des Intermediats 18 in den AB-Diester 19 und ein mesomeriestabilisiertes 4-Chinonmethid 20. Eine Wiederholung der Kaskade setzt das NMP frei. Der Spaltungsmechanismus von Bis-(AB)-Nukleotiden ist im Folgenden dargestellt (Nucl = Nukleosid): - A -
Figure imgf000005_0001
Im Fall von NMP müssen zwei negativ geladene Sauerstoffatome lipophil maskiert werden. Es zeigt sich, dass die Spaltung der Acylreste durch Esterasen für die Abspaltung der zweiten Maske deutlich verlangsamt ist. Dies wird auf die entstehende negative Ladung nach Abspaltung der ersten Maske zurückgeführt.
Nachteilig am Einsatz von NMP-Prodrugs ist weiterhin, dass die erforderliche weitere Phosphorylierung zu den Di- und Triphosphaten in der Zelle gehemmt oder vollständig unterbunden sein kann. So ist beispielsweise im Falle des AZT, einem bekannten Anti-HIV- Medikament, die Phosphorylierung zum AZTDP (DP = Diphosphat) gehemmt. Darüber hinaus werden zahlreiche Nebenwirkungen dem entsprechenden Monophosphat AZTMP (MP = Monophosphat) zugeschrieben.
Im Gegensatz zu NMP-Prodrugs existiert für die Maskierung von NDP und NTP bislang kein funktionierendes System. Die Anwendung der für NMP-Prodrugs entwickelten Konzepte ist im Stand der Technik als nicht möglich beschrieben [s. Chu und Tan 1999 (Advanced Drug Delivery Reviews)]. Das Problem besteht darin, dass im Fall von NDP und NTP im Gegensatz zu NMP keine einfache Phosphatgruppe, sondern vielmehr eine energiereiche Phosphorsäureanhydridbinding in Form der Pyrophosphateinheit reversibel maskiert werden muss, ohne dass es zu einem Bruch der Anhydrid-Bindung(en) kommt. Bei der Demaskierung der Pyrophosphateinheit darf keine Reaktion am Phosphoratom stattfinden, da dies zu einem Bruch der Pyrophosphatbrücke führen kann. Dies unterscheidet NDP-und NTP-Prodrugs essentiell von ihren NMP Verwandten. Hier können auch Hydrolysereaktionen am Phosphoratom stattfinden. Da bei der Maskierung einer Pyrophosphatbrücke stets eine Ladung mehr auftritt, als bei einem Monophosphat, ist nicht zu erwarten, dass die enzymatische Spaltung an NDP oder NTP-Prodrugs effizient verlaufen könnte. Vielmehr ist bei Betrachtung des Standes der Technik [C. Meier, U. Muus, J. Renze, L. Naesens, E. De Clercq, J. Baizarini; Comparative study of bis(benzyl)phosphate triesters of 2',3'-dideoxy-2',3'-didehydrothymidine (d4T) and cyc/oSal-d4TMP- hydrolysis, mechanistic insights and anti-HIV activity; Antiviral Chem. Chemother. 2002, 13, 101-114] zu erwarten, dass die negative Ladung durch eine repulsive Wechselwirkung mit dem Enzym zu einer Verlangsamung der Hydrolyse führt.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, verbesserte Di- und/oder Triphosphat-Pro- pharmaka, insbesondere Nukleosid- bzw. Nukleosidanalogon-Propharmaka, bereitzustellen, die die aus dem Stand der Technik bekannten Nachteile nicht aufweisen.
Überraschenderweise gelingt die Lösung dieses Problems durch geeignete Maskierung von Di- und Triphosphatverbindungen, insbesondere von Nukleosiddiphosphaten und Nukleosid- triphosphaten bzw. deren Analoga, wobei die Maskierung nur am endständigen Phosphat durchgeführt wird, während auf die Maskierung des innenständigen Phosphats verzichtet wird. Mit der Erfindung wird erstmals die bioreversible Maskierung von Nukleosiddiphosphaten (NDP) und Nukleosidtriphosphaten (NTP) sowie deren Nukleosidanaloga erreicht.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung betrifft in einem ersten Aspekt eine Verbindung der allgemeinen Formel (I)
Figure imgf000006_0001
oder der allgemeinen Formel (II)
Figure imgf000007_0001
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon,
O O
Il wobei R1, R4, R7 und R8 unabhängig voneinander H, O-C-R oder HN- C— R sind, R Alkyl, Aryl oder OAikyl ist,
R2, R3, R5 und R6 unabhängig voneinander H, Alkyl, Aryl oder OAikyl sind, R9 ein Nukleosid, Nukleosidanalogon oder Alkoholrest ist, und Kat+ ein Kation ist, mit der Maßgabe, dass R1, R4, R7 und R8 nicht alle H sind.
Unter einem Nukleosid werden hier organische Moleküle verstanden, die aus einem Zuckerrest und einer organischen Base, insbesondere einer stickstoffhaltigen heterozyklischen Base (Nukleobase) bestehen. Der Zuckerrest ist in der Regel eine Pentose, z.B. Desoxyribose oder Ribose. Bei den Nukleobasen handelt es sich häufig um Purine (R) und Pyrimidine (Y). Beispiele für Purine sind Guanin (G) und Adenin (A), Beispiele für Py- rimidine sind Cytosin (C), Thymin (T) und Uracil (U). Phosphorylierte Nukleoside, beispielsweise Nukleosidmonophosphate (NMP), Nukleosiddiphosphate (NDP) und Nukleosidtriphosphate (NTP), werden auch als Nukleotide bezeichnet. Die Phosphat-, Diphosphat- (Pyrophosphat-) bzw. Triphosphatgruppe ist in der Regel mit dem 5'-C-Atom der Zuckerkomponente des Nukleosids verknüpft.
Unter einem Nukleosidanalogon wird hier ein Nukleosid verstanden, das im menschlichen Körper natürlicherweise nicht vorkommt, einem natürlicherweise im menschlichen Körper vorkommenden Nukleosid aber so ähnelt, dass es beispielsweise von der Zelle entsprechend dem natürlichen Nukleosid verarbeitet, beispielsweise phosphoryliert und in einen DNA-Strang eingebaut wird. Der Begriff "Alkyl" beinhaltet gesättigte aliphatische Gruppen, einschließlich geradkettiger Alkylgruppen (z.B. Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Pentyl, Hexyl, Heptyl und Octyl), verzweigtkettiger Alkylgruppen (z.B. Isopropyl, tert-Butyl, Isobutyl), Cycloalkyl- (z.B. alizyklische) Gruppen (z.B. Cyclopropyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Cycloheptyl, Cyclooctyl), alkylsubstituierte Cycloalkylgruppen und cycloalkylsubstituierter Alkylgruppen. "Alkyl" beinhaltet ferner Alkylgruppen, die Sauerstoff-, Stickstoff-, Schwefel- oder Phosphoratom aufweisen, die ein oder mehrere Kohlenstoffatome des Kohlenwasserstoffgerüsts ersetzen. Der Begriff "Alkyl" beinhaltet ebenfalls sowohl unsubstituierte Alkyle als auch substituierte Alkyle, wobei sich das letztere auf Alkylreste bezieht, die Substituenten aufweisen, die ein Wasserstoffatom an einem oder mehreren Kohlenstoffatomen des Kohlenwasserstoffgerüsts ersetzen. Solche Substituenten können zum Beispiel beinhalten: Alkyl, Alkenyl, Alkynyl, Halogen, Hydroxyl, Alkylcarbonyloxy, Arylcarbonyloxy, Alkoxycarbonyloxy, Aryloxycarbonyloxy, Carboxylat, Alkylcarbonyl, Arylcarbonyl, Alkoxycarbonyl, Aminocarbonyl, Alkylaminocarbonyl, Dialkylaminocarbonyl, Alkylthiocarbonyl, Alkoxyl, Phosphat, Phosphonato, Phosphinato, Cyano, Amino (einschließlich Alkylamino, Dialkylamino,
Arylamino, Diarylamino und Alkylarylamino), Acylamino (einschließlich Alkylcarbonylamino, Arylcarbonylamino, Carbamoyl und Ureido), Amidino, Imino, Sulfhydryl, Alkylthio, Arylthio, Thiocarboxylat, Sulfate, Alkylsulfinyl, Sulfonato, Sulfamoyl, Sulfonamido, Nitro, Trifluoromethyl, Cyano, Azido, Heterocyclyl, Alkylaryl oder ein aromatischer oder heteroaromatischer Rest. Cycloalkyle können weiter substituiert sein, z.B. mit den oben angegebenen Substituenten. Ein "Alkylaryl"- oder ein "Aralkyl"-Rest ist ein Alkyl, das mit einem Aryl substituiert ist (z.B. Phenylmethyl (Benzyl)). "Alkyl" beinhaltet auch die Seitenketten von natürlichen und unnatürlichen Aminosäuren.
Unter "Aryl" werden Gruppen mit Aromatizität verstanden, einschließlich 5- und 6-gliedrigen aromatischen Einzelringgruppen, die null bis vier Heteroatome beinhalten können, sowie multizyklischen Systemen mit mindestens einem aromatischen Ring. Beispiele für Aryl- Gruppen beinhalten Benzol, Phenyl, Pyrrol, Furan, Thiophen, Thiazol, Isothiazol, Imidazol, Triazol, Tetrazol, Pyrazol, Oxazol, Isooxazol, Pyridin, Pyrazin, Pyridazin und Pyrimidin, und dergleichen. Darüber hinaus beinhaltet der Begriff "Aryl" multizyklische Aryl-Gruppen, z.B. trizyklische, bizyklische, z.B. Naphthalen, Benzoxazol, Benzodioxazol, Benzothiazol, Benzoimidazol, Benzothiophen, Methylenedioxyphenyl, Quinolin, Isoquinolin, Napthridin, Indol, Benzofuran, Purin, Benzofuran, Deazapurin oder Indolizin. Unter "Aryl" werden auch Aryl-Gruppen verstanden, die Heteroatome in der Ringstruktur aufweisen ("Heteroaryle"). Der aromatische Ring kann an ein oder mehreren Ringpositionen substituiert sein. Aryl- Gruppen können auch mit alizyklischen oder heterozyklischen Ringen, die nicht aromatisch sind, fusioniert oder verbrückt sein, so dass ein multizyklisches System gebildet wird (z.B. Tetralin, Methylenedioxyphenyl).
Unter einem "Alkoholrest" wird hier jede organische Kohlenstoffverbindung verstanden, bei der ein Wasserstoffatom am Kohlenstoffgerüst durch eine Hydroxylgruppe ersetzt ist. Beispiele für Alkohole umfassen Zucker wie Glukose, Fruktose, Mannose etc, aber auch andere Verbindungen wie z.B. Geraniol.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in vorteilhafter Weise als Propharmaka (Prodrugs) eingesetzt werden. Sie ermöglichen erstmals die Einschleusung von Nukleosiden und Nukleosidanaloga sowie anderer organischer Verbindungen mit einer Hydroxylgruppe, z.B. von Zuckern oder Alkoholen, auf dem Niveau von Di- und Triphosphaten in die Zelle. Dadurch wird es beispielsweise erstmals möglich, die von der Zelle verwendeten Nukleosidtriphosphate direkt in die Zelle einzuführen, so dass ansonsten erforderliche weitere intrazelluläre Phosphorylierungsschritte nicht mehr benötigt werden. Dadurch kann nicht nur die tatsächliche Verwendung der eingeschleusten Nukleoside durch die Zelle besser ermöglicht werden, sondern auch Nebenwirkungen, die beispielsweise durch Monophosphate hervorgerufen werden, sind nunmehr vermeidbar. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können sowohl als antivirale als auch als Antitumor-Mittel vorteilhafte Verwendung als Arzneimittel finden. Sie eignen sich besonders als Arzneimittel zur
Behandlung von Infektionen durch Viren, insbesondere Retroviren wie den HI-Virus. Die Verbindungen eignen sich aber auch für analytische Zwecke bei biochemischen Untersuchungen, da die phosphorylierten Metaboliten intrazellulär freigesetzt werden. Dadurch werden Untersuchungen ermöglicht, die bislang noch nicht durchgeführt werden konnten. Auch nicht-nukleosidische Alkohole können in Form ihrer Di- oder Triphosphate in die Zelle transportiert und dort freigesetzt werden.
Mit Hilfe der Reste R2, R3, R5, R6 kann die Lipophilie der erfindungsgemäßen Verbindungen variiert und eingestellt werden. Auf diese Weise ist es möglich, die Verbindungen für verschiedene Einsatzgebiete maßzuschneidern. Dem Fachmann sind Verfahren bekannt, mit deren Hilfe er die entsprechenden Reste einführen und die Lipophilie bestimmen kann.
In einer erfindungsgemäßen Verbindung sind nicht sämtliche Reste R1, R4, R7 und R8 gleichzeitig Wasserstoffatome. Dies schließt jedoch nicht aus, dass beispielsweise R1, R4 und R7 oder R1, R7 und R8 oder R4, R7 und R8 alle H sind. In einer bevorzugten Ausführungsform sind bei der erfindungsgemäßen Verbindung R1 und
O O
Il
R4 beide O-C-R oder HN- C— R und R7 und R8 sind beide H.
In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform sind bei der erfindungsgemäßen
Verbindung R7 und R8 beide
Figure imgf000010_0001
R4 sind H.
Besonders bevorzugt ist R9 bei der erfindungsgemäßen Verbindung ein Nukleosid oder Nukleosidanalogon. R9 kann aber auch ein beliebiger Alkoholrest sein, wobei der Alkohol besonders bevorzugt ein Alkohol ist, der in der Zelle in Form eines Diphosphats oder Triphosphats verwendet wird. Ein Beispiel für einen solchen Alkohol ist Geraniol, das bei der Biosynthese von Pheromonen in Form seines Diphosphates auftritt.
Beispielhafte erfindungsgemäße Verbindungen sind Bis-(4-Acyloxybenzyl)-Nukleosid- diphosphat (BAB-NDP) und Bis-(4-Acyloxybenzyl)-Nukleosidtriphosphat (BAB-NTP) sowie die entsprechenden OAfΛo-lsomere Bis-(2-Acyloxybenzyl)-Nukleosiddiphosphat (BAB-NDP) und Bis-(2-Acyloxybenzyl)-Nukleosidtriphosphat:
Figure imgf000010_0002
ONucl
Figure imgf000011_0001
Wenn man bei den oben wiedergegebenen Verbindungen statt eines Acyloxy-Restes der entsprechende Amid-Rest eingesetzt wird, gelangt man zu den erfindungsgemäßen Verbindungen Bis-(4-Acylaminobenzyl)-Nukleosiddiphosphat, Bis-(Λ/-Acylamino- benzyl)-Nukleosiddiphosphat, Bis-( Λ/-Acylaminobenzyl)-Nukleosidtriphosphat und Bis-( N- Acylaminobenzyl)-Nukleosidtriphosphat:
ONucl
Figure imgf000011_0002
Über den Acylrest R lässt sich die Stabilität in verschiedenen Medien steuern und zugleich die Polarität der Verbindung einstellen, so dass ein effektiver passiver Transport über die Zellmembran erreicht werden kann. Auf eine Maskierung der nicht-endständigen Phosphate wird verzichtet.
Die erfindungsgemäßen Prodrugs zeigen eine hohe Stabilität gegenüber chemischer Hydrolyse in wässrigen Puffersystemen sowie eine deutliche Tendenz zur enzymatischen Hydrolyse und damit Freisetzung des Wirkstoffes in humanen Zellextrakten. Damit erfüllen sie wichtige Voraussetzungen für einen Einsatz als Arzneimittel. Der Hydrolysemechanismus des erfindungsgemäßen BAB-N DP-Prodrugs ist im Folgenden dargestellt:
Figure imgf000012_0001
NDP
Die Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt auch eine pharmazeutische
Zusammensetzung, die eine erfindungsgemäße Verbindung und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst. Pharmazeutisch annehmbare Träger sind dem Fachmann bekannt und umfassen einen oder mehrere flüssige, halbfeste oder feste Füllstoffe, Verdünnungsmittel oder andere Substanzen, welche für eine Verabreichung an Säuger, einschließlich den Menschen, geeignet sind. Der Ausdruck "Träger" im Sinne der vorliegenden Erfindung bezeichnet dabei jeglichen organischen oder anorganischen, natürlichen oder synthetischen Stoff, welcher zur Vereinfachung der Applikation mit dem Wirkstoff kombiniert werden kann. Beispiele für derartige Träger umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, organische oder anorganische Lösungsmittel, Stärke, Laktose, Mannitol, Methylcellulose, Talk, Gelatine, Agar-Agar, Calciumphosphat, Magnesiumstearat, tierische und pflanzliche Fette, höhermolekulare Fettsäuren, oder höhermolekulare Polymere. Der Ausdruck "pharmazeutisch annehmbar" bezeichnet jegliches für Säuger, insbesondere den Menschen, nichttoxische Material, welches die Wirksamkeit der biologischen Aktivität des Wirkstoffes im Wesentlichen nicht beeinträchtigt. Derartige Materialien können pharmazeutisch annehmbare Konzentrationen an Salzen, Puffern, Konservierungsstoffen, oder dergleichen umfassen. Nicht-Iimitierende Beispiele pharmazeutisch annehmbarer Träger schließen Magnesiumcarbonat, Magnesiumstearat, Talk, Zucker, Laktose, Ethanol, Glycerin, Wasser usw ein. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann darüber hinaus auch noch Hilfs- und/oder Verdünnungsmittel umfassen.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung auch eine pharmazeutische
Darreichungsform, die eine erfindungsgemäße Verbindung und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst. Besonders bevorzugt handelt es sich dabei um eine Darreichungsform zur oralen Verabreichung, beispielsweise eine Tablette oder Kapsel.
In noch einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der allgemeinen Formel (I)
Figure imgf000013_0001
oder der allgemeinen Formel (II)
Figure imgf000014_0001
oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon,
O O wobei R1, R4, R7 und R8 unabhängig voneinander H, O-C-R oder HN- C— R sind, R Alkyl, Aryl oder OAlkyl ist,
R2, R3, R5 und R6 unabhängig voneinander H, Alkyl, Aryl oder OAlkyl sind, R9 ein Nukleosid, Nukleosidanalogon oder Alkoholrest ist, und Kat+ ein Kation ist, mit der Maßgabe, dass R1, R4, R7 und R8 nicht alle H sind, umfassend die Schritte des a) Inreaktionbringens eines Phenylesters der allgemeinen Formel (IM)
Figure imgf000014_0002
mit Dichlorophosphoramidit
Cl
\
P-N(ZPr)2
/
Cl , und b) Inreaktionbringens des in Schritt a) erhaltenen Phosphoramidits der allgemeinen Formel (IV)
Figure imgf000015_0001
mit einer Verbindung gemäß der allgemeinen Formel (V)
I l q
HO— P-OR9
I O" (V)
oder mit einer Verbindung der allgemeinen Formel (VI)
O O
II H s
HO— P— O— P— OR
I I
O' O" (VI).
Es resultieren die entsprechenden Diphosphatverbindungen (I) oder Triphosphatverbindungen (II).
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden R1 und
O O
M Il
R4 so gewählt, dass beide O— C-R oder HN- C— R sind und R und R8 werden so gewählt, dass beide H sind. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden
O O
R7 und R8 so gewählt, dass beide O— C-R oder HN- C— R sind und R1 und R4 werden so gewählt, dass beide H sind.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist R9 ein Nukleosid oder Nukleosidanalogon.
Allein zu Veranschaulichungszwecken wird die Erfindung im Folgenden anhand von Ausführungsbeispielen und den begleitenden Figuren näher erläutert.
Fig. 1 Chemische Hydrolyse von BAB-AZTDP 185a zu AB-AZTDP 186 (oben nach 12 h, unten nach 4 d); Ausschnitte aus den 31P-NMR-Spektren (1H-entkoppelt). AcO = Acyloxy.
Fig. 2 Ausschnitt aus dem 31P-NMR-Spektrum (1H-entkoppelt) der Hydrolyse von 186 nach 8 Tagen zu 222.
Fig. 3 Vergleich der Hydrolysehalbwertszeiten.
Fig. 4 Stabilität der erfindungsgemäßen Prodrugs in humanem Blutplasma.
Ausführungsbeispiele
Allgemein kann die Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen (I) und (II) am Beispiel von Nukleosiddi- und Nukleosidtriphosphaten (R9 = Nukleosid) nach folgendem Schema erfolgen:
Figure imgf000016_0001
194 IV
Figure imgf000017_0001
IV
Figure imgf000017_0002
Ia IIa
Phenylester IM werden mit Dichlorophosphoramidit 194 zur Reaktion gebracht, vorzugsweise unter Inertgas (z.B. Stickstoff), unter Kühlung (z.B. -78 0C) und in abs. Triethylamin (TEA), gelöst in abs. Tetrahydrofuran (THF). Das resultierende Phosphoramidit IV wird dann mit einem entsprechenden Nukleosidmonophosphat (NucIMP) oder Nukleosiddiphosphat (NucIDP) zu den entsprechenden Nukleosiddi- (Ia) bzw. -triphosphaten (IIa) umgesetzt. Darstellung von BAB-NDP-Prodrugs
Die grundsätzliche Darstellung von erfindungsgemäßen BAB-NDP-Prodrugs (181) ist im folgenden beispielhaft in Form einer retrosynthetischen Analyse von BAB-NDP-Prodrugs 181 veranschaulicht (NucIMP = Nukleosidmonophosphat, Nucl = Nukleosid):
Figure imgf000018_0001
Die entsprechenden NTP-Prodrugs können hergestellt werden, indem statt der Nukleosidmonophosphate (NucIMP) die entsprechenden Nukleosiddiphosphate verwendet werden. Die Synthese aller erfindungsgemäßen Verbindungen I und Il kann gemäß dem am Beispiel der BAB-NDP-Prodrugs beschriebenen Verfahren erfolgen.
Die Synthese der Phenylester 193 durch Acylierung ist im Folgenden schematisch dargestellt:
57%
Figure imgf000018_0002
4-Hydroxybenzylalkohol 21 wird mit den entsprechenden Säurechloriden selektiv acyliert. Die Reaktionen werden unter Stickstoff als Inertgas durchgeführt. Es werden 1.0 Äq. p- Hydroxybenzylalkohol und 1.0 Äq. abs. Triethylamin (TEA) in abs. Tetrahydrofuran (THF) gelöst und auf 0 0C gekühlt. Zu dieser Lösung werden über 20 min die jeweiligen Säurechloride (1.1 Äq.), gelöst in abs. THF, getropft. Nach 1-2 h Reaktionsdauer bei 0 0C wird Triethylammoniumchlorid durch Filtration entfernt und das Lösungsmittel im Vakuum abkondensiert. Der Rückstand wird in Dichlormethan (DCM) aufgenommen, zweimal mit gesättigter Natriumcarbonatlösung und einmal mit H2O gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Die Produkte werden entweder durch Kristallisation oder Chromatographie abschließend gereinigt.
Synthese des Dichlorophosphoramidit
Phosphortrichlorid wird mit Diisopropylamin DIPA in Diethylether umgesetzt. Anschließend folgt Schlenkfiltration. Es resultiert Dichlorophosphoramidit (194).
Figure imgf000019_0001
Synthese der Phosphoramidite:
52%
Figure imgf000019_0002
Die Reaktionen werden unter Stickstoff als Inertgas durchgeführt. Zu 1.0 Äq. Dichloro-Λ/,Λ/- di/sopropylaminophosphoramidit, gelöst in abs. THF und auf -78 0C gekühlt, werden 2.2 Äq. des jeweiligen Esters sowie 2.3 Äq. abs. Triethylamin (TEA), gelöst in THF, über 1 h getropft. Nach beendeter Zugabe wird noch 16-20 h bei RT gerührt. Triethylammoniumchlorid wird unter Inertgas abfiltriert, mit THF gewaschen und das Filtrat im Vakuum vom Lösungsmittel befreit. Es ist u.U. nötig, die Filtration zu wiederholen. Die Rohprodukte werden am Chromatotron mit PE und einem Ethylacetat-Gradienten gereinigt.
Synthese von Nukleosidmonophosphaten (NMP):
Figure imgf000020_0001
R = Me, 203a; 8% R = /Pr, 204a; 43%
Variante A: Die Reaktion wird unter Stickstoff als Inertgas durchgeführt. Es werden 2.0 Äq. POCI3 in Trimethylphosphat gelöst und auf 0 0C gekühlt. Dazu werden 1.0 Äq. des entsprechenden Nukleosids gegeben und weitere 2h bei 00C gerührt. Die Reaktionslösung wird dann mit gesättigter Ammoniumhydrogencarbonatlösung auf pH = 8 eingestellt und weitere 10 min gerührt. Die Lösung wird eingefroren und gefriergetrocknet. Abschließend wird über eine RP-18 Phase mit reinem Wasser mehrfach chromatographiert.
Variante B: Die Reaktionen werden unter Stickstoff als Inertgas durchgeführt. Es werden 4.4 Äq. POCI3 in abs. Acetonitril gelöst und auf 0 °C gekühlt. Dieser Lösung werden 4.4 Äq. abs. Pyridin und 2.2 Äq. destilliertes Wasser vorsichtig hinzugefügt. Nach 5-10 min werden 1.0 Äq. des betreffenden Nukleosides als Feststoff zugegeben. Nach 4 h bei RT (Raum- temperatur) wird die Reaktion durch Zugabe von Eiswasser beendet und eine weitere Stunde im Kühlschrank gerührt. Durch vorsichtige Zugabe von festem Ammonium- hydrogencarbonat wird ein pH-Wert von 8 eingestellt. Die Lösungsmittel werden durch Gefriertrocknung entfernt. Der Rückstand wird in Wasser gelöst und über eine RP-18 Phase mit Wasser und einem Acetonitril-Gradienten gereinigt.
lonenaustausch an Nukleosidmonophosphaten (NMP)
Variante A: Die NMP werden über eine protonierte lonenaustauschersäule Dowex 50WX8 eluiert. Die protonierte Form des NMPs wird mit der jeweiligen Kationenhydroxidlösung bis zum Neutralpunkt titriert oder durch direkte Zugabe von 2.0 Äq. der jeweiligen Lösungen neutralisiert und das Lösungsmittel durch Gefriertrocknung entfernt.
Variante B: Die Diammoniumsalze der NMPs werden in Wasser gelöst. Es werden 2.0 Äq. Tetra-n-butylammoniumhydroxidlösung (40% in H2O1 m/m) zugegeben und das Lösungsmittel durch Gefriertrocknung entfernt.
Synthese exemplarischer Bis(4-acyloxybenzyl)-diphosphat-Prodrugs
Ammonium-ß-bis-(4-acetoxybenzyl)d4TDP; (BAB-d4TDP)
Figure imgf000021_0001
Die Reaktion wird unter Stickstoff als Inertgas durchgeführt. Es werden 0.16 g Bis-(tetra-n- butylammonium) d4TMP (0.20 mmol, 1.0 Äq.) und 94 mg Bis-(4-acetoxybenzyl)Λ/,Λ/- di/sopropylaminophosphoramidit (0.20 mmol, 1.0 Äq.) in 3 mL abs. Acetonitril gelöst. Zu der Lösung werden 36 mg DCI (0.30 mmol, 1.5 Äq.) gegeben und 0.5 h bei RT gerührt. Die Lösung wird auf -25 0C gekühlt und mit 51 μL f-BuOOH (5.5 M in n-Decan, 0.28 mmol, 1.4 Äq.) oxidiert. Nach 15 min bei -25 0C wird auf RT erwärmt und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Das Rohprodukt wird über eine RP-18 Säule gereinigt, erst mit Wasser/Methanol 2:1, dann 1:1. Das Produkt wird lyophilisiert. Die Gegenionen werden ausgetauscht (Dowex 50WX8, NH4 +). Das Eluat wird lyophilisiert. Das Produkt wird erneut RP-18 chroma- tographiert, zunächst mit Wasser/Methanol 2:1 , dann 1 :1. Das Produkt wird erneut gefriergetrocknet. Ausbeute: 14 mg (20 μmol, 10%) eines farblosen, hygroskopischen Feststoffes.
1H-NMR (400 MHz, MeOD)δ/ppm= 7.63 (q, 1 H, J= 0.5 Hz, Hhet-6), 7.40-7.34 (m, 4H, H-2), 7.08-7.02 (m, 4H, H-3), 6.94 (ddd, 1 H, J= 1.5 Hz, J= 1.5 Hz1 J= 3.3 Hz, H-1 '), 6.38-6.34 (m, 1 H, H-3'), 5.83 (ddd, 1 H, J=2.0 Hz, J= 3.5 Hz, J= 6.0 Hz, H-2'), 5.09 (dd, 4H, J= 6.2 Hz, J= 8.3 Hz, H-Bn), 4.96-4.92 (m, 1 H, H-4'), 4.23-4.11 (m, 2H, H-5'), 2.27 (s, 6H, Ac), 1.89 (d, 3H, J= 1.0 Hz, Mehet); 13C-NMR (101 MHz, MeOD)δ/ppm= 171.1 (2xC=O-Ac), 166.6 (Che»-4), 152.9 (Che,-2), 152.4 (2xC-4), 138.7 (Che,-6), 135.3 (C-3'), 134.9 (dd, J= 1.4 Hz, J= 7.1 Hz, 2xC-1), 130.4 (d, J= 2.9 Hz, 4xC-2), 127.6 (C-2'), 123.0 (4xC-3), 112.1 (Che,-5), 90.9 (C-1 '), 86.9 (d, J= 9.2 Hz, C-4'), 70.3 (dd, J= 1.7 Hz, J= 5.9 Hz, 2xC-Bn), 68.1 (dd, J= 6.8 Hz, J= 6.8 Hz, C-5'), 21.0 (2xCH3), 12.5 (Mehet); 31P-NMR (162 MHz, 1H-entkoppelt, MeOD)δ/ppm= - 12.20 (d, 1P, J= 19.6 Hz, P-α), -12.96 (d, 1P, J= 19.6 Hz, P-ß); IR (KBr): v [cm"1] = 3435, 2930, 1762, 1701 , 1266, 1220, 1190, 1044, 1009, 912; UV (HPLC): λmax= 265 nm; HPLC, Methode 1 : tR [min]= 9.41 ; Rf (EE/MeOH 3:2 v/v)= 0.59; MS (HR-ESI ): berechn. 679.13 (M ); gefunden 679.11 ; C28H33N3O14P2; Mol.-Gew.: 697.52
Es konnte ein Nebenprodukt isoliert werden. Dies entsteht vermutlich schon während der Kupplung bei unvollständiger Trocknung des Nukleosides.
Figure imgf000022_0001
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ/ppm= 7.39-7.34 (m, 4H, H-2), 7.10-7.06 (m, 4H, H-3), 4.82 (d, 4H1 J= 7.3 Hz, H-Bn), 2.26 (s, 6H, Ac); 13C-NMR (101 MHz, DMSO-d6)δ/ppm= 169.2 (2xC=0), 149.9 (2xC-4), 135.6 (2xC-1), 128.5 (4xC-2), 121.6 (4xC-3), 66.1 (d, J= 5.3 Hz, 2xC-Bn), 20.9 (2xCH3); 31P-NMR (162 MHz, 1H-entkoppelt, DMSO-d6)δ/ppm= -1.42; 31P- NMR (162 MHz, DMSO-d6)δ/ppm= -1.20- (-1.60) (m); C18H18O8P'; Mol.-Gew.: 393.31
Ammonium-ß-bis-(4-acetoxybenzyl)AZTDP; (BAB-AZTDP)
Figure imgf000023_0001
Die Reaktion wird unter Stickstoff als Inertgas durchgeführt. Es werden 213 mg Bis-(tetra-n- butylammonium)AZTMP (0.26 mmol, 1.0 Äq.) in 3 ml_ abs. Acetonitril gelöst: Nun werden 0.16 g Bis-(4-acetoxybenzyl)Λ/,Λ/-di/sopropylaminophosphor-amidit (0.35 mmol, 1.4 Äq.) und 44 mg DCI (0.38 mmol, 1.5 Äq.) zugegeben und 1.5 h bei RT gerührt. Anschließend wird auf -25 0C gekühlt und durch Zugabe von 46 μl_ f-BuOOH (5.5 M in π-Decan, 0.25 mmol, 1.0 Äq.) oxidiert. Nach 15 min bei -25 0C wird auf RT erwärmt und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Die Reinigung des Rohproduktes erfolgte über eine RP-18 Umkehrphase (Wasser/Methanol, zunächst 2:1 , dann 1 :1 , dann reiner Methanol). Die Produktfraktionen werden lyophillisiert. An dem Rohprodukt wird ein lonenaustausch vollzogen (Dowex 50WX8, NH4 +). Das Eluat wird lyophillisiert. Es wird eine abschließende Reinigung an einer RP-18 Umkehrphase vollzogen (Wasser/Methanol 1 :2). Das Produkt wird gefriergetrocknet.
Ausbeute: 56 mg (76 μmol, 29%) eines farblosen, hygroskopischen Feststoffes.
1H-NMR (400 MHz1 MeOD)δ/ppm= 7.71 (q, 1H1 J= 1.2 Hz1 Hhet-6), 7.45-7.37 (m, 4H1 H-2), 7.10-7.05 (m, 4H1 H-3), 6.20 (dd, 1 H, J= 6.3 Hz, J= 6.0 Hz, H-1 '), 5.18-5.08 (m, 4H, H-Bn), 4.40 (ddd, 1 H, J= 3.5 Hz, J= 3.5 Hz1 J= 7.1 Hz, H-3'), 4.20 (ddd, 1 H1 J= 3.0 Hz1 J= 4.9 Hz1 J= 11.5 Hz, H-5'), 4.12 (ddd, 1 H, J= 2.7 Hz, J= 5.5 Hz, J= 11.6 Hz, H-5'), 4.03 (ddd, 1 H1 J= 2.8 Hz, J= 2.8 Hz, J= 6.0 Hz, H-4'), 2.40-2.23 (m, 2H, H-2'), 2.27 (s, 6H, CH3), 1.89 (d, 3H, J= 1.1 Hz, Mehet); 13C-NMR (101 MHz, MeOD)δ/ppm= 171.0 (2xC=0), 166.4 (Chet-4), 152.6 (2xC-4), 152.5 (Chet-2), 137.8 (Chet-6), 134.9 (dd, J= 1.9 Hz, J= 7.5 Hz, 2xC-1), 130.5 (d, J= 2.0 Hz, 4xC-2), 123.0 (4xC-3), 112.2 (Chet-5), 85.8 (C-V), 84.4 (d, J= 9.0 Hz, C-4'), 70.4 (d, J= 5.6 Hz, 2xC-Bn), 67.3 (d, J= 6.0 Hz, C-5'), 62.5 (C-3'), 38.1 (C-2'), 20.1 (2xCH3), 12.7 (Mehet); 31P-NMR (162 MHz, 1H-entkoppelt, MeOD)δ/ppm= -12.17 (d, 1 P, J= 21.1 Hz, P-α), - 12.80 (d, 1 P, J= 20.6 Hz, P-ß); IR (KBr): v [cm 1] = 3431 , 3196, 3071 , 1760, 1699, 1509, 1469, 1274, 1220, 1010, 967; UV (HPLC): λmax= 265 nm; HPLC, Methode 1 : tR [min]= 10.32; mp= 90-92 0C; Rf (H2O/MeOH 1 :2 v/v, RP-18)= 0.63; MS (HR-ESI ): berechn. 722.126 (M ); gefunden 722.126; C28H34N6Oi4P2; Mol.-Gew.: 740.55
Ammonium-ß-bis-(4-/sobutyryloxybenzyl)AZTDP; (BIB-AZTDP)
Figure imgf000024_0001
Die Reaktion wird unter Stickstoff als Inertgas durchgeführt. 115 mg Bis-(tetra-n- butylammonium)AZTMP (139 μmol, 1.0 Äq.) werden zunächst 2 h über Molekularsieb 0.3 nm in 3 mL abs. Acetonitril getrocknet. Die getrocknete Lösung wird in einen Reaktionskolben überführt und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Das Molsieb wird noch zweimal mit abs. Acetonitril gewaschen und die Waschlösung ebenfalls in den Reaktionskolben überführt. Das Edukt wird noch dreimal mit wenigen mL abs. Acetonitril coevaporiert, so dass ein farbloser Schaum entstand. Dieser wird in 1.5 mL abs. Acetonitril aufgenommen. Zu dieser Lösung werden 109 mg Bis-(4-/sobutyryloxybenzyl)Λ/,Λ/-di/sopropylamino- phosphoramidit (211 μmol, 1.5 Äq.) gegeben und die Reaktion durch Zufügen von 26 mg DCI (0.22 mmol, 1.6 Äq.) gestartet. Nach 1.5 h bei RT wird die Reaktionslösung auf -25 0C gekühlt und durch Zugabe von 38 μl_ f-BuOOH (5.5 M in n-Decan, 0.21 mmol, 1.5 Äq.) oxidiert. Nach 15 min bei -25 0C wird auf RT erwärmt und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Es werden zunächst durch RP-18 Chromatographie mit Wasser/Methanol 1 : 1 restliches Edukt und DCI aus dem Rohprodukt entfernt und dann das Produkt mit reinem Methanol von der RP-18 Phase gewaschen. Teile des Methanols werden am Rotationsverdampfer bei niedriger Temperatur entfernt, dann wird mit dest. Wasser aufgefüllt und gefriergetrocknet. Die auf diese Weise erhaltenen 144 mg Rohprodukt werden über einen lonentauscher gegeben (Dowex 50WX8, NH4 +, dem Wasser werden 10% Acetonitril zugesetzt, um das Rohprodukt zu lösen). Das Eluat wird lyophilisiert. Mit den erhaltenen 102 mg Rohprodukt wird erneut eine RP-18 Chromatographie durchgeführt, diesmal mit Methanol/Wasser 3:1. Das Produkt wird abschließend lyophilisiert.
Ausbeute: 53 mg (67 μmol, 48%) eines farblosen Feststoffes.
1H-NMR (400 MHz, MeOD)δ/ppm= 7.72 (q, 1 H, J= 1.2 Hz, H-6), 7.46-7.34 (m, 4H, H-2), 7.10-7.00 (m, 4H, H-3), 6.21 (dd, 1H, J= 6.2 Hz, J= 6.0 Hz, H-1 '), 5.18-5.10 (m, 4H, H-Bn), 4.40 (ddd, 1 H, J= 3.2 Hz, J= 3.5 Hz, J= 6.4 Hz, H-3'), 4.26-4.08 (m, 2H, H-5'), 4.04 (ddd, 1 H, J= 2.8 Hz, J= 2.8 Hz, J= 5.8 Hz, H-4'), 2.82 (sept., 2H, J= 7.0 Hz, CH-/-bu), 2.38-2.20 (m, 2H1 H-2') 1.91 (d, 3H, J= 1.1 Hz, Mehet), 1.30 (d, 12H, J= 7.0 Hz, CH3-/-bu); 13C-NMR (101 MHz, MeOD)δ/ppm= 177.1 (2xC=O), 165.0 (Chet-4), 152.6 (2xC-4), 152.4 (Chet-2), 137.8 (Chet-6), 134.9 (m, 2xC-1), 130.5 (4xC-2), 122.9 (4xC-3), 112.2 (Chet-5), 85.8 (C-1 '), 84.4 (d, J= 9.2 Hz, C-4'), 70.4 (d, J= 5.6 Hz, 2xC-Bn), 67.3 (d, J= 5.9 Hz, C-5'), 62.5 (C-3'), 38.1 (C- T), 35.3 (2xCH-/-bu), 19.3 (4xCH3-/-bu), 12.7 (Mehet); 31P-NMR (162 MHz, 1H-entkoppelt, MeOD)δ/ppm= -12.16 (d, 1 P, J= 21.1 Hz, P-a), -12.77 (d, 1 P, J= 20.9 Hz, P-/3); IR (KBr): v [cm"1] = 3431 , 3194, 3069, 2976, 2109, 1757, 1700, 1470, 1273, 1112, 1011 ; UV (HPLC): λmax= 265 nm; HPLC, Methode 2: tR [min]= 17.65; mp= 79 0C; Rf (EE/MeOH 7:3 v/v)= 0.47; Rf (H2CVMeOH 1 :3 v/v, RP-18)= 0.64; MS (HR-ESI ): berechn. 778.189 (M ); gefunden 778.195; C32H42N6Oi4P2; Mol.-Gew.: 796.66 Ammonium-ß-bis-(4-pivaloyloxybenzyl)AZTDP; (BPB-AZTDP)
Figure imgf000026_0001
Anmerkung: In der Überschrift ist von Ammonium als Gegenion die Rede. Das trifft nur teilweise zu, da das Produkt am Ende mit gemischten Gegenionen in etwa der
Zusammensetzung NBu4ZNH4 1 :3 erhalten wird. In dieser Form sind dann auch die NMR- Daten angegeben. Auf einen erneuten lonenaustausch wird verzichtet, da bei einmaligem lonenaustausch ca. 7% Zersetzungsprodukt in dem vormals reinen Produkt auftraten.
Variante A: Die Reaktion wird unter Stickstoff als Inertgas durchgeführt. 146 mg Bis-(tetra-n- butylammonium)AZTMP (176 μmol, 1.0 Äq.) werden zunächst 2 h über Molekularsieb 0.3 nm in 3 mL abs. Acetonitril getrocknet. Die getrocknete Lösung wird in einen Reaktionskolben überführt und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Das Molsieb wird noch zweimal mit abs. Acetonitril gewaschen und die Waschlösung ebenfalls in den Reaktionskolben überführt. Das Edukt wird noch dreimal mit wenigen mL abs. Acetonitril coevaporiert, so dass ein farbloser Schaum entstand. Dieser wird in 2 mL abs. Acetonitril aufgenommen. Zu der Lösung werden 0.15 g Bis-(4-/sobutyryloxybenzyl)Λ/,Λ/-di/sopropylaminophosphoramidit (0.28 mmol, 1.6 Äq.) gegeben und die Reaktion durch Zufügen von 36 mg DCI (0.30 mmol, 1.7 Äq.) gestartet. Nach 1.75 h bei RT werden der Reaktionslösung weitere 50 mg Bis-(4- /sobutyryloxybenzyl)Λ/,Λ/-di/sopropylaminophosphoramidit (88 μmol, 0.5 Äq.) und 10 mg DCI (88 μmol, 0.5 Äq.) zugefügt und 2 h bei RT gerührt. Die Reaktionslösung auf -25 0C gekühlt und durch Zugabe von 64 μL NBuOOH (5.5 M in n-Decan, 0.35 mmol, 2.0 Äq.) oxidiert. Nach 15 min bei -25 0C wird auf RT erwärmt und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Das Rohprodukt wird über eine RP-18 Phase angereichert. Hierzu werden zunächst Edukt und DCI mit Wasser/Methanol 1 :1 eluiert, dann wird isokratisch nacheinander zunächst mit Wasser/Methanol 2:1 , 3:1 und 5:1 eluiert. Ein Großteil des Produktes wird mit dem letzten Laufmittelgemisch von der Säule eluiert (F2, 105 mg). Anteilig wird das Produkt jedoch auch schon in den Fraktionen erhalten, die mit Wasser/Methanol 2:1 eluiert worden waren. Interessanterweise waren dies die reineren Fraktionen (F1 , 67 mg). F1 und F2 werden getrennt über einen lonentauscher in das Ammoniumsalz überführt. F1 wird erneut an einer RP-18 Phase getrennt, diesmal mit Methanol/Wasser 2:1 , dann 3:1. Es konnten 29 mg des reinen Produktes isoliert werden sowie 20 mg einer Mischfraktion. F2 wird über eine Sephadex G10 Phase eluiert, konnte auf diese Weise aber nicht sauber erhalten werden. Auch eine Trennung über die präparative HPLC (Acetonitril/Wasser 1.5:1 , RP-18, 10 mL/min) misslang. Erneute Chromatographie über RP-18 Kieselgel mit Wasser/Methanol 1.00:2.25, dann 1 :2.5, dann 1:3 lieferte nicht das reine Produkt.
Die erhaltenen Fraktionen werden stets an der Lyophille gefriergetrocknet. Das erhaltene reine Produkt wird nochmals an einem lonentauscher umgesalzen (Dowex 50WX8, NH4 +) und lyophilisiert. Dabei trat eine anteilige Zersetzung (ca. 7%) des Produktes auf.
Ausbeute:29 mg (35 μmol, 20%) eines farblosen Feststoffes, sowie erhebliche Mengen Produkt in Mischfraktionen.
Variante B: Die Reaktion wird unter Stickstoff als Inertgas durchgeführt. Es werden 26 mg Di- ammonium-AZTMP (68 μmol, 1.0 Äq.) zweimal mit abs. Acetonitril coevaporiert, der Rückstand in 3 ml_ abs. DMF aufgenommen und einige Kügelchen Molsieb 0.4 nm zugegeben. Zu der Lösung werden 52 mg Bis-(4-/sobutyryloxybenzyl)Λ/,Λ/- di/sopropylaminophosphoramidit (95 μmol, 1.4 Äq.) und 13 mg DCI (0.11 mmol, 1.6 Äq.) gegeben und 1 h bei RT gerührt. Es werden weitere 15 mg Bis-(4-/sobutyryloxybenzyl)Λ/,Λ/- di/sopropylaminophosphoramidit (27 μmol, 0.4 Äq.) und 5 mg DCI (42 μmol, 0.6 Äq.) zugegeben und 3 h bei RT gerührt. Die Oxidation erfolgte durch Zugabe von 22 μL NBuOOH (5.5 M in n-Decan, 0.12 mmol, 1.8 Äq.) bei -30 0C. Die Lösungsmittel werden im Vakuum entfernt, der Rückstand in Wasser/Acetonitril aufgenommen und lyophillisiert. Von dem Rohprodukt wird ein 31P-NMR-Spektrum aufgenommen. Obwohl das Produkt entstanden war, zeigte sich, dass Variante A deutlich bessere Ausbeuten bei weniger Nebenprodukten lieferte. Auf eine Trennung des Rohgemisches wird daher verzichtet.
1H-NMR (400 MHz, MeOD)δ/ppm= 7.72 (q, 1 H, J= 1.2 Hz, H-6), 7.45-7.36 (m, 4H, H-2), 7.06-7.00 (m, 4H, H-3), 6.21 (dd, 1 H, J= 6.8 Hz, J= 6.8 Hz, H-1 '), 5.20-5.08 (m, 4H, H-Bn), 4.42-4.36 (m, 1 H, H-3'), 4.20 (ddd, 1 H, J= 11.5 Hz, J= 3.0 Hz, J= 4.8 Hz, H-5'), 4.12 (ddd, 1 H, J= 11.5 Hz, J= 2.7 Hz, J= 5.3 Hz, H-5'), 4.04 (ddd, 1H, J= 2.7 Hz, J= 2.7 Hz, J= 5.6 Hz, H-4'), 3.26-3.18 (m, 3.2H, NBu4), 2.39-2.23 (m, 2H, H-2'), 1.91 (d, 3H1 J= 1.1 Hz1 Mehet), 1.70-1.60 (m, 3.2H, NBu4), 1.46-1.36 (m, 3.2H1 NBu4), 1.35 (s, 18H1 t-Bu), 1.02 (t, 4.9H1 J= 7.3 Hz, NBu4); 13C-NMR (101 MHz, MeOD)δ/ppm= 178.5 (2xC=0), 166.4 (Chet-4), 152.8 (2xC-4), 152.4 (Che,-2), 137.8 (Cher6), 135.0-134.8 (m, 2xC-1), 130.5 (d, J= 2.1 Hz, 4xC-2), 122.9 (4xC-3), 112.2 (Chet-5), 85.8 (C-1 '), 84.4 (d, J= 9.1 Hz1 C-4'), 70.4 (d, J= 5.7 Hz1 2xC- Bn)1 67.3 (d, J= 5.8 Hz, C-5'), 62.5 (C-3'), 59.6-59.5 (m, NBu4), 40.1 (2xC-töu), 38.0 (C-2'), 27.5 (6XCH3-NBu)1 24.8, 20.8, 13.9 (NBu4), 12.7 (Mehet); 31P-NMR (162 MHz1 1H-entkoppelt, MeOD)δ/ppm= -12.18 (d, 1 P1 J= 20.3 Hz, P-a), -12.76 (d, 1 P1 J= 20.2 Hz1 P-ß); IR (KBr): v [cm 1] = 3423, 3186, 2975, 2108, 1751 , 1701 , 1479, 1277, 1119, 1012, 968; UV (HPLC): 265 nm; HPLC, Methode 2: tR [min]= 18.08; mp= 98-101 0C; Rf (EE/MeOH 7:3 v/v)= 0.70; MS (HR-ESr): berechn. 806.221 (M ); gefunden 806.222; C34H46N6O14P2; Mol.-Gew.: 824.71
Ammonium-ß-bis-(4-octanoyloxybenzyl)d4TDP; (BOB-d4TDP)
Figure imgf000028_0001
Die Reaktion wird unter Stickstoff als Inertgas durchgeführt. 160 mg Bis-(tetra-n- butylammonium)d4TMP (203 μmol, 1.0 Äq.) werden zunächst 2 h über Molekularsieb 0.3 nm in 3 mL abs. Acetonitril getrocknet. Die getrocknete Lösung wird in einen Reaktionskolben überführt und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Das Molsieb wird noch zweimal mit abs. Acetonitril gewaschen und die Waschlösung ebenfalls in den Reaktionskolben überführt. Das Edukt wird noch dreimal mit wenigen mL abs. Acetonitril coevaporiert, so dass ein farbloser Schaum entstand. Dieser wird in 2 mL abs. Acetonitril aufgenommen. Zu der Lösung werden 0.22 g Bis-(4-octanoyloxybenzyl)Λ/,Λ/-di/sopropylaminophosphoramidit (0.35 mmol, 1.7 Äq.) gegeben und die Reaktion durch Zufügen von 43 mg DCI (0.37 mmol, 1.8 Äq.) gestartet. Nach 3 h bei RT wird durch Zugabe von 63 μl_ f-BuOOH (5.5 M in n-Decan, 0.35 mmol, 1.7 Äq.) bei -25 0C oxidiert. Nach 15 min wird das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, der Rückstand in Wasser/Acetonitril aufgenommen und gefriergetrocknet. Das Rohprodukt wird in wenig Methanol gelöst und über eine RP-18 Phase chromatographiert, jeweils isokratisch mit Methanol/Wasser 1 :1 , 2:1 , 5:1 und schließlich 6: 1. Bei dem 1 : 1 Gemisch konnten verbliebenes Edukt und DCI abgetrennt werden. Die Produktfraktionen werden vereint und der Methanol am Rotationsverdampfer bei niedriger Temperatur bis auf einige ml_ entfernt. Es wird mit Wasser aufgefüllt und die Lösung lyophillisiert. Die erhaltenen 150 mg werden über einen lonentauscher (Dowex 50WX8, NH4 +, 30% Acetonitril in Wasser) gegeben und das Eluat lyophillisiert. Eine weitere RP-18 Chromatographie mit
Methanol/Wasser 5:1 lieferte das reine Produkt. Dieses wird erneut gefriergetrocknet. Ausbeute: 114 mg (132 μmol, 65%) eines farblosen Feststoffes.
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ/ppm= 11.21 (s, 1H, NH), 7.65 (q, 1 H, J= 1.2 Hz, Hhet-6 ), 7.44-7.35 (m, 4H, H-2), 7.10-7.03 (m, 4H, H-3), 6.82 (ddd, 1H, J= 1.7 Hz, J= 1.7 Hz, J= 3.4 Hz, H-1 '), 6.34 (ddd, 1 H, J= 1.6 Hz, J= 1.6 Hz, J= 6.0 Hz, H-3'), 5.86 (ddd, 1 H, J=2.0 Hz, J= 3.1 Hz, J= 6.0 Hz, H-2'), 5.02 (dd, 4H, J= 3.8 Hz, J= 6.5 Hz, H-Bn), 4.88-4.84 (m, 1H, H-4'), 4.10-3.88 (m, 2H, H-5'), 2.56 (t, 4H, J= 7.4 Hz, H-b), 1.78 (d, 3H, J= 1.0 Hz, Mehet), 1.65 (tt, 4H, J= 7.3 Hz, J= 7.3 Hz, H-c), 1.40-1.20 (m, 16H, H-d, H-e, H-f, H-g), 0.87 (t, 6H, J= 6.8 Hz, H-h); 13C-NMR (101 MHz, MeOD)δ/ppm= 173.8 (2xC-a), 166.6 (Cher4), 152.9 (Chet-2), 152.4 (2xC-4), 138.7 (Cher6), 135.3 (C-3'), 134.9 (d, J= 7.0 Hz, 2xC-1), 130.4 (d, J=2.7 Hz, 4xC-2), 127.6 (C-2'), 122.9 (4xC-3), 112.1 (Che,-5), 90.9 (C-T)1 87.0 (d, J= 9.3 Hz, C-4'), 70.3 (dd, J= 1.8 Hz, J= 5.6 Hz, 2xC-Bn), 68.2 (dd, J= 6.2 Hz, J= 6.2 Hz, C-5'), 35.1 (2xC-b), 32.9, 30.2, 30.1 , 23.7 (2xC-d, 2xC-e, 2xC-f, 2xC-g), 26.0 (2xC-c), 14.4 (2xC-h), 12.5 (Mehet); 31P-NMR (162 MHz, 1H-entkoppelt, MeOD)δ/ppm= -12.11 (d, 1 P, J= 20.6 Hz, P-α), -12.92 (d, 1P, J= 20.3 Hz, P-ß); IR (KBr): v [cm 1] = 3188, 3071 , 2956, 2927, 2856, 1756, 1701 , 1467, 1263, 1112, 1010; UV (HPLC): λmax= 264 nm; HPLC, Methode 2: tR [min]= 21.52; mp= 73-75 0C; Rf (EE/MeOH 7:3 v/v)= 0.40; Rf (H2O/MeOH 1 :5 v/v, RP-18)= 0.40; MS (HR-ESI ): berechn. 847.297 (M ); gefunden 847.296; C40H57N3O14P2; Mol.-Gew.: 865.84 Ammonium-ß-bis-(4-benzoyloxybenzyl)d4TDP; (BBB-d4TDP)
Figure imgf000030_0001
Die Reaktion wird unter Stickstoff als Inertgas durchgeführt. 178 mg Bis-(tetra-n- butylammonium)d4TMP (226 μmol, 1.0 Äq.) werden zunächst 2 h über Molekularsieb 0.3 nm in 3 ml_ abs. Acetonitril getrocknet. Die getrocknete Lösung wird in einen Reaktionskolben überführt und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Das Molsieb wird noch zweimal mit abs. Acetonitril gewaschen und die Waschlösung ebenfalls in den Reaktionskolben überführt. Das Edukt wird noch dreimal mit wenigen mL abs. Acetonitril coevaporiert, so dass ein farbloser Schaum entstand. Dieser wird in 2.0 mL abs. Acetonitril aufgenommen. Zu dieser Lösung werden 216 mg Bis-(4-benzoyloxybenzyl)Λ/,Λ/-di/sopropylamino- phosphoramidit (369 μmol, 1.6 Äq.) gegeben und die Reaktion durch Zufügen von 46 mg DCI (0.39 mmol, 1.7 Äq.) gestartet. Nach 1.5 h bei RT wird die Reaktionslösung auf -25 0C gekühlt und durch Zugabe von 64 μL f-BuOOH (5.5 M in n-Decan, 0.35 mmol, 1.5 Äq.) oxidiert. Nach 15 min bei -25 0C wird auf RT erwärmt und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Das Rohprodukt wird in wenig Methanol gelöst und an einer RP-18 Phase getrennt, zunächst isokratisch mit Wasser/Methanol 1 :1 , um nicht umgesetztes Edukt und DCI zu entfernen, dann isokratisch mit Wasser/Methanol 5:1. Die Produktfraktionen werden lyophillisiert und das Rohprodukt über einen lonentauscher gegeben (Dowex 50WX8, NH4 +, 30% Acetonitril in Wasser). Das Eluat wird erneut lyophillisiert und der Rückstand mit Wasser/Methanol 1 :4 erneut an einer RP-18 Phase getrennt. Das Produkt wird abschließend lyophilisiert.
Ausbeute: 62 mg (75 μmol, 33%) eines farblosen Feststoffes. 1H-NMR (400 MHz1 MeOD)δ/ppm= 8.19-8.13 (m, 4H, H-ortho), 7.70-7.64 (m, 3H, H-6, H- para), 7.56-7.50 (m, 4H, H-meta), 7.50-7.42 (m, 4H, H-2), 7.25-7.19 (m, 4H, H-3), 6.97 (ddd, 1H, J= 1.8 Hz, J= 1.8 Hz, J= 3.6 Hz, H-1 '), 6.42 (ddd, 1 H, J= 1.7 Hz, J= 1.7 Hz, J= 6.0 Hz, H- 3'), 5.86 (ddd, 1 H, J=2.2 Hz, J= 3.6 Hz, J= 6.0 Hz, H-2'), 5.16 (dd, 4H, J= 5.6 Hz, J= 8.5 Hz, H-Bn), 5.01-4.95 (m, 1 H, H-4'), 4.28-4.17 (m, 2H, H-5'), 1 92 (d, 3H, J= 1.2 Hz, Me); 13C- NMR (101 MHz, MeOD)δ/ppm= 166.6 (Chet-4), 166.5 (2x C=O), 152.9 (Chet-2), 152.6 (2xC-4), 138.8 (Chet-6), 135.4 (C-3'), 135.2 (d, J= 7.0 Hz1 2xC-1), 134.9 (2xC-para), 131.1 (4xC- oriho), 130.8 (2xC-/pso), 130.6 (4xC-2), 130.5 (4xC-mete), 127.7 (C-2'), 123.1 (4xC-3), 112.1 (Chet-5), 90.9 (C-1 '), 87.0 (d, J= 9.2 Hz, C-4'), 70.3 (dd, J= 2.3 Hz, J= 5.6 Hz, 2xC-Bn), 68.2 (d, J= 6.2 Hz, C-5'), 12.5 (Me); 31P-NMR (162 MHz, 1H-entkoppelt, MeOD)δ/ppm= - 12.07 (d, 1 P, J= 20.5 Hz, P-α), -12.86 (d, 1P, J= 20.5 Hz, P-ß); IR (KBr): v [crτV1] = 3435, 3199, 1734, 1692, 1452, 1268, 1202, 1063, 1025, 704; UV (HPLC): λmax= 263 nm, 231 nm; HPLC, Methode 2: tR [min]= 17.71 ; mp= 92 0C; Rf (EE/MeOH 7:3 v/v)= 0.38; MS (HR-ESI ): berechn. 803.141 (M ); gefunden 803.139; C38H37N3O14P2; Mol.-Gew.: 821.66
Ammonium-ß-bis-(4-benzoyloxybenzyl)AZTDP; (BBB-AZTDP)
Figure imgf000031_0001
Die Reaktion wird wie für BBB-d4TDP beschrieben durchgeführt. Es werden folgende Mengen eingesetzt: 96.0 mg Bis-(tetra-/?-butylammonium)AZTMP (116 μmol, 1.0 Äq.), 108 mg Bis-(4-benzoyloxybenzyl)Λ/,Λ/-di/sopropylaminophosphor-amidit (184 μmol, 1.6 Äq.) und 25 mg DCI (0.21 mmol, 1.8 Äq.). Oxidiert wird durch Zugabe von 36 μl_ f-BuOOH (5.5 M in n- Decan, 0.20 mmol, 1.7 Äq.).
Die Aufarbeitung wird folgendermaßen durchgeführt: Nach beendeter Reaktion wird das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Rückstand in wenig Acetonitril gelöst. Diese Lösung wird an einer RP-18 Phase isokratisch mit Wasser/Methanol 1 :1 chromatographiert, bis Edukt und DCI entfernt waren. Nun wird isokratisch mit Wasser/Methanol 3:1 und dann 4:1 eluiert. Bei beiden Mischungen konnte das Produkt nachgewiesen werden. Die sauberen Fraktionen (F1) werden vereint und am Rotationsverdampfer bei niedriger Temperatur vom Methanol befreit, mit Wasser aufgefüllt und gefriergetrocknet. Es werden 58 mg aus den sauberen Fraktionen (F1) als Tetra-n-butylammoniumsalz erhalten. Die verunreinigten Fraktionen (F2) werden zweimal über einen lonentauscher gegeben (Dowex 50WX8, NH4 +, 30% Acetonitril in Wasser), lyophillisiert und erneut RP-18 chromatographiert (Acetonitril/Wasser 2:1). Das erhaltene Rohprodukt (F2) wird an der präparativen HPLC chromatographiert (Wasser/Acetonitril 1 :1 , 10 mL/min, RP-18). Bei einer aufgetragenen Menge von 5 mg konnte das Produkt rein erhalten werden. Bei einer größeren Menge versagte die Trennung jedoch.
Ausbeute: 58 mg (53 μmol, 46%) eines farblosen Feststoffes als Tetra-n-butylammonium- salz; 3 mg (3 μmol, 3%) eines farblosen Feststoffes als Ammoniumsalz. Die NMR-Daten sind für das Ammoniumsalz angegeben.
1H-NMR (400 MHz, MeOD)δ/ppm= 8.18-8.13 (m, 4H, H-ortho), 7.74 (q, 1 H, J= 0.5 Hz, H-6), 7.67 (tt, 2H, J= 7.3 Hz, J= 2.5 Hz, H-para), 7.57-7.45 (m, 8H, H-2, H-meta), 7.25-7.19 (m, 4H, H-3), 6.23 (dd, 1 H, J= 6.8 Hz, J= 6.8 Hz, H-V)1 5.25-5.10 (m, 4H, H-Bn), 4.46-4.40 (m, 1 H, H-3'), 4.30-4.11 (m, 2H, H-5'), 4.10-4.02 (m, 1 H, H-4'), 2.44-2.26 (m, 2H, H-2'), 1.91 (d, 3H, J= 0.9 Hz, Mehet); 13C-NMR (101 MHz, MeOD)δ/ppm= 166.5 (Chet-4), 166.4 (2xC=O), 152.6 (Chet-2, 2xC-4), 137.8 (Cher6), 135.1 (d, J= 5.6 Hz, 2xC-1), 134.9 (2xC-para), 131.1 (4xC-ort/Jθ), 130.8 (2xC-/pso), 130.6 (d, J= 1.6 Hz, 4xC-2), 129.9 (4xC-mete), 123.1 (4xC-3), 112.2 (Chβrδ), 85.9 (C-1 '), 84.4 (d, J= 9.1 Hz, C-4'), 70.4 (d, J= 5.4 Hz, 2xC-Bn), 67.3 (d, J= 5.8 Hz, C-5'), 62.5 (C-3'), 38.1 (C-2'), 12.7 (Mehet); 31P-NMR (162 MHz, 1H-entkoppelt, MeOD)δ/ppm= -12.18 (d, 1 P1 J= 19.4 Hz, P-α), -12.59 (d, 1P, J= 19.5 Hz, P-ß); IR (KBr): v [cm 1] = 3432, 3191 , 3065, 2108, 1736, 1700, 1452, 1268, 1202, 1062, 1011 , 707; UV (HPLC): λmax= 261 nm, 231 nm; HPLC, Methode 2: tR [min]= 17.79; mp= 98 0C; R, (EE/MeOH 7:3 v/v)= 0.61 ; MS (HR-ESI ): berechn. 846.158 (M ); gefunden 846.157; C38H38N6O14P2; Mol.-Gew.: 864.69 Ammonium-ß-bis-(4-benzoyloxybenzyl)3'-O-acetyl-BVdUDP
Figure imgf000033_0001
C4IH36BrN2O16P2 "; Mol.-Gew.: 954.58
Die Reaktion wird unter Stickstoff als Inertgas durchgeführt. Die Trocknung des Nukleotides und die Reaktionsdurchführung erfolgten wie in den vorangehenden Versuchen beschrieben. Es werden 50 mg Bis-(tetra-n-butylammonium)3'-O-acetyl-BVdUMP (53 μmol, 1.0 Äq., in time für die Reaktion) mit 48 mg Bis-(4-benzoyloxybenzyl)Λ/,Λ/-di/sopropylamino- phosphoramidit (85 μmol, 1.6 Äq.) und 12 mg DCI (102 μmol, 1.9 Äq.) umgesetzt. Später werden noch einmal 10 mg Amidit (0.4 Äq.) und 4 mg DCI (0.5 Äq.) zugegeben. Die Oxidation erfolgte durch Zugabe von 16 μL f-BuOOH (5.5 M in π-Decan, 0.90 μmol, 1.7 Äq.) bei -25 0C. Das DC zeigte eindeutig Produktbildung an. Das Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt.
Die Reinigung des Rohgemisches wird an einer RP-18 Phase durchgeführt: zunächst isokratisch mit Wasser/Methanol 1 :1 , dann 1 :3. Die Produktfraktionen werden vereint und lyophillisiert. Im 31P-NMR-Spektrum konnte das Produkt identifiziert werden. Es war jedoch immer noch verunreinigt. Nach einer weiteren Umkehrphasenchromatographie konnte das Produkt nicht mehr identifiziert werden. Tetra-π-butylammonium-ß-bis-(4-benzoyloxybenzyl)3'-O-/so-butyryl-BVdUDP; (ibu- BBB-BVdUDP)
Figure imgf000034_0001
Die Reaktion wird unter Stickstoff als Inertgas durchgeführt. Die Trocknung des Nukleotides und die Reaktionsdurchführung erfolgten wie in den vorangehenden Versuchen beschrieben. Es werden 134 mg [NBu4J1 66[H]034-BVdUMP (gewichtete Molmasse ca. 926 g/mol, 145 μmol, 1.0 Äq.) in 2 ml_ abs. Acetonitril mit 136 mg Bis-(4-benzoyloxybenzyl)Λ/,Λ/-di/sopropylamino- phosphoramidit (232 μmol, 1.6 Äq.) und 30.0 mg DCI (247 μmol, 1.7 Äq.) bei 0° C zusammengegeben und dann auf RT erwärmt. Nach 40 min werden weitere 6.0 mg DCI (51 μmol, 0.4 Äq.) und 26 mg Amidit (44 μmol, 0.3 Äq.) zugegeben und 1 h gerührt. Die Oxidation erfolgte durch Zugabe von 50.0 μl_ f-BuOOH (5.5 M in n-Decan, 276 μmol, 1.9 Äq.) bei -25 0C. Nach 15 min wird das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der Rückstand wird in wenig Acetonitril gelöst und an einer RP-18 Phase chromatographiert, zunächst mit Methanol/Wasser 1:1 , dann 6:1. Methanol wird am Rotationsverdampfer entfernt, mit Wasser aufgefüllt und lyophillisiert. Das Rohprodukt wird erneut über eine RP-18 Phase mit Methanol/Wasser 5:1 getrennt. Das Produkt wird abschließend lyophillisiert. Eine sehr gute Reinigung wird durch zusätzliche Chromatographie unter Verwendung von 0.25 M Ammoniumformiat-Puffer anstelle von Wasser erzielt.
Ausbeute: 128 mg (104 μmol, 72%) eines farblosen Feststoffes.
1H-NMR (400 MHz, MeOD)δ/ppm= 8.17-8.12 (m, 4H, H-orthö), 8.02 (s, 1H, H-6), 7.67 (tt, 2H, J= 7.0 Hz, J= 1.3 Hz, H-para), 7.56-7.41 (m, 9H, H-2, H-meta, BVU-H-8), 7.25-7.17 (m, 4H, H-3), 7.05 (d, 1 H, J= 13.5 Hz1 BVU-H-7), 6.33 (dd, 1 H1 J= 5.7 Hz, J= 9.0 Hz1 H-1 '), 5.40-5.36 (m, 1H1 H-3'), 5.25-5.15 (m, 4H, H-Bn)1 4.32-4.22 (m, 2H1 H-5'), 4.22-4.17 (m, 1 H1 H-4'), 3.25-3.16 (m, 7H, H-a), 2.59 (sept, 1H1 J= 7.0 Hz1 CH-/bu), 2.41-2.25 (m, 2H1 H-2'), 1.70- 1.58 (m, 7H, H-b), 1.40 (tq, 7H1 J= 7.5 Hz1 J= 7.5 Hz1 H-c), 1.16 (d, 6H1 J= 7.1 Hz1 CH3-/bu), 1.00 (t, 11 H, J= 7.4 Hz1 H-d); 13C-NMR (101 MHz1 MeOD)δ/ppm= 177.8 (C=O-/bu), 166.4 (2xC=O-Bz), 163.6 (Chet-4), 152.5 (2xC-4), 151.4 (Cher2), 140.0 (Chet-6), 135.1 (dd, J= 3.2 Hz, J= 7.1 Hz1 2xC-1), 134.9 (2xC-para), 131.1 (4xC-ortho), 130.8 (BVU-C-7), 130.7 (2xC- ipso), 130.6 (d, J= 2.1 Hz1 4xC-2), 129.8 (4xC-mete), 123.0 (4xC-3), 112.8 (Chet-5), 109.4 (BVU-C-8), 86.3 (C-1 '), 85.2 (d, J= 9.0 Hz1 C-4'), 76.8 (C-3'), 70.4 (dd , J= 2.7 Hz, J= 5.7 Hz1 2xC-Bn), 67.6 (d, J= 6.1 Hz1 C-5'), 59.6-59.5 (m, 4xC-a), 38.5 (C-2'), 35.0 (CH-/bu), 24.8 (C- b), 20.8-20.7 (m, 4xC-c), 19.2 (2xCH3-/bu), 14.0 (C-d); 31P-NMR (162 MHz, 1H-entkoppelt, MeOD)δ/ppm= -12.02 (d, 1 P1 J= 20.2 Hz, P-α), -12.64 (d, 1 P, J= 20.4 Hz1 P-ß); IR (KBr): v [cm"1] = 3434, 3063, 2964, 1876, 1736, 1712, 1682, 1465, 1267, 1200, 968; UV (HPLC): λmax= 284 nm, 234 nm; HPLC, Methode 1 : tR [min]= 15.01 ; Rf (EE/MeOH 4:1 v/v)= 0.70; Rf (H2CVMeOH 1 :6 v/v, RP-18)= 0.45; MS (HR-ESI ): berechn. 981.104 (M ); gefunden 981.105; C59H76BrN3O16P2; Mol.-Gew.: 1225.10
Ammonium-Ä-bis-(4-benzoyloxybenzyl)carba-/so-ddADP; (BBB-car/>a-/so-ddADP)
Figure imgf000035_0001
Die Reaktion wird unter Stickstoff als Inertgas durchgeführt. Die Trocknung des Nukleotides und die Reaktionsdurchführung erfolgten wie in den vorangehenden Versuchen beschrieben. Es werden 85.0 mg [NBu4J1 5[H]05-BVdUMP (gewichtete Molmasse ca. 736 g/mol, 115 μmol, 1.0 Äq.) in 2 mL abs. Acetonitril und 2 mL abs. DMF mit 109 mg Bis-(4-benzoyloxy- benzyl)Λ/,Λ/-di/sopropylaminophosphoramidit (186 μmol, 1.6 Äq.) und 24.0 mg DCI (203 μmol, 1.8 Äq.) bei 00C zusammengegeben und dann auf RT erwärmt. Nach 40 min werden weitere 6.0 mg DCI (51 μmol, 0.4 Äq.) und 28 mg Amidit (48 μmol, 0.4 Äq.) zugegeben und 1 h gerührt. Die Oxidation erfolgte durch Zugabe von 42.0 μL f-BuOOH (5.5 M in n-Decan, 232 μmol, 2.0 Äq.) bei -25 0C. Nach 15 min wird das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der Rückstand wird in wenig Acetonitril gelöst und an einer RP-18 Phase chromatographiert, zunächst mit Methanol/Wasser 1 :1 , dann 4:1. Methanol wird am Rotationsverdampfer entfernt, mit Wasser aufgefüllt und lyophillisiert. Das Rohprodukt wird erneut über eine RP- 18 Phase mit Methanol/Wasser 2.5:1.0 getrennt. Das Produkt wird lyophillisiert und an der präparativen HPLC chromatographiert (40 mM Ammoniumformiat in H2O/Acetonitril 1 :1 , Flussrate 10 ml_/min, RP-18).
Anmerkung: Unter den Bedingungen an der präparativen HPLC wird das Gegenion ausgetauscht. Man erspart sich so einen lonenaustausch über Dowex. Das Produkt konnte dennoch niemals vollständig rein isoliert werden. Wegen der geringen Mengen, die an der HPLC isoliert werden, ist das 13C-NMR für das Tetra-n-butylammoniumsalz angegeben. Die anderen Daten gelten für das Ammoniumsalz.
Ausbeute: 36 mg (29 μmol, 25%, NBu4-SaIz) eines farblosen Feststoffes.
1H-NMR (400 MHz, MeOD)δ/ppm= 8.48 (s, 1H, Hhet-6), 8.21 (s, 1 H, Hhet-8), 8.17-8.09 (m, 4H, H-orthό), 7.70-7.63 (m, 2H, H-para), 7.57-7.40 (m, 8H, H-2, H-meta), 7.24-7.15 (m, 4H, H-3), 5.17 (d, 4H, J= 8.5 Hz1 H-Bn), 4.83-4.73 (m, 1 H, H-1 '), 4.10-3.95 (m, 2H, H-6'), 2.50-2.27 (m, 2H, H-5', H-4'), 2.25-2.05 (m, 2H1 H-2'), 2.04-1.76 (m, 3H, H-3', H-5'); 13C-NMR (101 MHz, MeOD)δ/ppm= 166.5 (2xC=O-Bz), 161.6 (Cher2), 152.6 (Chet-4), 151.9 (2xC-4), 149.4 (Che,- 6), 142.3 (Che,-8), 135.3 (d, J= 7.2 Hz, C-1), 134.9 (2xC-para), 131.1 (4xC-ort/Jθ), 130.8 (2xC- ipso), 130.6 (4xC-2), 129.8 (4xC-mete), 128.6 (Che,-5), 123.0 (4xC-3), 71.0 (d, J= 6.5 Hz1 C- 6'), 70.3 (d, J= 5.8 Hz, 2xC-Bn), 59.7-59.5 (m, C-NBu4), 57.1 (C-1 '), 39.7 (d, J= 8.3 Hz, C- 4'), 35.8 (C-5'), 32.1 (C-2'), 27.6 (C-3'), 24.8 (C-NBu4), 20.8 (C-NBu4), 14.0 (C-NBu4); 31P- NMR (162 MHz, 1H-entkoppelt, MeOD) δ/ppm = -11.18 (d, 1 P1 J= 21.8 Hz, P-α), -13.00 (d, 1P, J= 20.9 Hz, P-ß); IR (KBr): v [cm 1] = 3423, 3210, 2955, 1733, 1617, 1510, 1426, 1268, 1202, 1063, 964, 700; UV (HPLC): λmax= 305 nm, 225 nm; HPLC, Methode 4: tR [min]= 12.53; mp= 102 0C; Rf (EE/MeOH 7:3 v/v)= 0.22; MS (HR-ESI ): berechn. 812.189 (M"); gefunden 812.184; C39H40N6OnP2; Mol.-Gew.: 830.72 Tetra-n-buty lammon i um-ß-bis-(4-/sobutyry loxy benzyl)PM EAM P
Figure imgf000037_0001
C30H36N5OnP2 '; Mol.-Gew.: 704.58
Die Reaktion wird unter Stickstoff als Inertgas durchgeführt. Die Trocknung des Nukleosides und die Reaktionsdurchführung erfolgten, wie in den vorangehenden Versuchen beschrieben. Es werden 0.29 g [N Bu4J2PM EΞA (0.38 mmol, 1.0 Äq.) in 4 ml_ abs. Acetonitril und 3 mL abs. DMF mit 0.25 g Bis-(4-/sobutyryloxybenzyl)Λ/,Λ/-di/sopropylamino- phosphoramidit (0.49 mmol, 1.3 Äq.) und 63 mg DCI (0.53 mmol, 1.4 Äq.) zusammengegeben und dann auf RT erwärmt. Nach 45 min wird bei -20 0C mit 89 μL t- BuOOH (5.5 M in π-Decan, 0.49 mmol, 1.3 Äq.) oxidiert. Die Lösungsmittel werden im Vakuum entfernt, der Rückstand in Acetonitril/Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Das 31P-NMR-Spektrum enthielt keine Produktsignale.
Charakterisierung von BAB-NDP-Prodrugs
Generell wird für jedes BAB-NDP-Prodrug auf folgende Weise vorgegangen:
1. Bestimmung der Hydrolysehalbwertszeiten Ui2 bei verschiedenen pH-Werten (2.0, 6.8, 7.3 und 8.7) in unterschiedlichen Puffersystemen durch HPLC-Analytik.
2. Bestimmung der Hydrolyseprodukte, die bei der chemischen Hydrolyse entstanden, durch 31P-NMR-Spektroskopie und durch Auswertung der HPL-Chromatogramme unter Verwendung der synthetisierten Referenzverbindungen. 3. Bestimmung der Hydrolysehalbwertszeiten t1/2 in verschiedenen biologischen Medien (CEM/0, Blutplasma, P3HR1 , RPMI-Nährmedium, FCS).
4. Bestimmung der Hydrolyseprodukte, die bei der enzymatischen Hydrolyse entstanden, hauptsächlich durch Auswertung der HPL-Chromatogramme und in einem Fall durch Massenspektrometrie.
Hydrolysestudien
pH-abhängige Hydrolysekinetiken
Es werden 50 mM Stammlösungen der Zielverbindungen in DMSO angesetzt. Von diesen Stammlösungen werden je 11 μl_ mit 189 μl_ deionisiertem Wasser und weiteren 100 μL DMSO verdünnt, so dass 1.9 mM Hydrolyse-Stammlösungen erhalten werden. Die Hydrolyse wird durch Zugabe von 300 μl_ Phosphatpufferlösung (PBS, 50 mM, pH=7.3, 37 0C) gestartet. Auf die Zugabe von internem Standard wird verzichtet. Die Proben werden in einem Thermomixer bei 37 0C inkubiert. Es werden nun nach verschiedenen Zeiträumen Aliquote der Kinetiklösung entnommen Qe 60 μL) und sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Proben werden einzeln aufgetaut und sofort analysiert. Hierzu werden 40 μL in die analytische RP-HPLC injiziert. Zur Auswertung der Kinetiken werden die Chromatogramme bei verschiedenen UV-Wellenlängen ausgewertet. Die Peakflächen werden gegen die Hydrolysedauer graphisch aufgetragen. Zur Auswertung werden mit Hilfe eines Tabellenkalkulationsprogramms exponentielle Ausgleichskurven durch die einzelnen Messpunkte gelegt, so dass die Geschwindigkeitskonstanten k der Hydrolysen ermittelt werden konnten. Die Hydrolysehalbwertszeiten konnten nun mit der Formel
ermittelt werden, da es sich durch den großen Wasserüberschuss um Kinetiken pseudo- erster Ordnung handelte.
Diese Versuche werden analog für die Ermittlung der Hydrolysehalbwertszeiten bei anderen pH-Werten durchgeführt.
50 mM Phosphatpuffer (pH= 6.8, pH= 7.3, pH= 7.5, pH= 8.7 nach Sörensen): Es werden 547 mg Dinatriumhydrogenphosphat und 155 mg Kaliumdihydrogenphosphat mit deionisiertem Wasser auf 100 ml_ Gesamtvolumen aufgefüllt. Der pH-Wert wird kontrolliert und gegebenenfalls mit Phosphorsäure bzw. NaOH eingestellt.
50 mM Citrat-HCI-Puffer (pH= 2.0):
Es werden 1.22 g Ammoniumeitrat in 100 ml_ deionisiertem Wasser gelöst und mit konz. HCl auf pH= 2.0 eingestellt.
Hydrolysekinetiken in Zellextrakten
Es werden 30 μl_ der 50 mM DMSO-Stammlösung der Verbindungen mit 220 μl_ DMSO auf eine Konzentration von 6.0 mM verdünnt. Im Folgenden werden 100 μl_ Zellextrakt (CEM/0 für d4T, P3HR1 für BVdU und ACV, Mausleberextrakt für verschiedene Verbindungen) mit 20 μL 70 mM Magnesiumchloridlösung versetzt und 20 μl_ der 6.0 mM Stammlösung hinzu pipettiert. Für jeden Messwert wird eine solche Lösung angesetzt und bei 37 0C im Thermomixer inkubiert. Nach den entsprechenden für eine Messung gewählten Zeiträumen werden die Hydrolysen durch Zugabe von 300 μL Methanol abgebrochen und für 5 min bei 0 0C gelagert. Anschließend erfolgte Zentrifugation für 10 min bei 13000 rpm. Der Überstand wird in Spritzen aufgenommen und filtriert (Schleicher & Schuell Spartan 13/30, 0.2 μm) und in flüssigem Stickstoff eingefroren (-196 0C). Die Proben werden an der analytischen RP- HPLC in ihre Bestandteile gespalten (Injektion: 90 μL). Die Auswertung erfolgte ohne Normierung der Peakflächen.
Hydrolysekinetiken in humanem Blutplasma
Die Hydrolysekinetiken in humanem Blutplasma erfolgten analog den Kinetiken in Zellextrakten. Im Unterschied wird jedoch keine MgCI2-Lösung zugegeben. Anstelle des Zellextraktes wird verdünntes Blutserum (20% oder 50% in 50 mM PBS pH 6.8, bei den einzelnen Experimenten angegeben) zu den Proben gegeben.
Hydrolysekinetiken in Kulturmedium
Die Hydrolysekinetiken in Kulturmedium erfolgten analog den Kinetiken in Zellextrakten. Im Unterschied wird jedoch keine MgCI2-Lösung zugegeben. Anstelle des Zellextraktes wird Kulturmedium (RPMI) mit 10% hitzedeaktiviertem fötalem Kälberserum (FCS) zugegeben. Chemische Hydrolyse am Beispiel des erfindungsgemäßen BAB-NDP-Prodrugs BAB- AZTDP 185a.
AZT steht für das Nucleosidanalogon 3'-Azido-2',3'-didesoxythymidin, auch unter dem Namen Retrovir bekannt.
Die NMR-spektroskopische Verfolgung der Hydrolyse (s. Fig. 1) zeigt eindeutig die präferentielle Entstehung von 186 aus 185a. Wenn überhaupt eine Spaltung der Anhydridbindung zu AZTMP eintritt, dann in einem nur untergeordneten Maß. Die Zuweisung der einzelnen Signale kann für 185a durch 31P-1H-Korrelationsspektroskopie erreicht werden.
Dabei tritt ausgehend von 186 ausschließlich AZTDP 222 als Hydrolyseprodukt auf (s. Fig. 2).
Diese Hydrolyse verläuft selektiv. Es wird ausschließlich AZTDP 222 freigesetzt (Fig. 2). Da sie langsamer verläuft, als die erste Hydrolyse, kann auch das Intermediat gut nachgewiesen werden. Mit diesen Ergebnissen lässt sich folgendes feststellen: Die chemische Hydrolyse von BAB-AZTDP 185a verläuft annähernd ausschließlich über das Intermediat AB-AZTDP 186 unter abschließender quantitativer Freisetzung des Nucleotids AZTDP 222.
Vergleich zwischen chemischer und enzymatischer Hydrolyse
Durch HPLC-Analytik wurden die Hydrolysehalbwertszeiten der Verbindungen bestimmt.
Die Ergebnisse der Hydrolysestudien in Phosphatpuffer bzw. Zellextrakten sind in Fig. 3 zusammengefasst.
Aus Fig. 3 wird der große Unterschied zwischen chemischer und enzymatischer Hydrolyse deutlich. Auch erkennt man die Zunahme der Stabilität durch Verzweigung der Estermodifikation. Weiterhin steigt die chemische Stabilität, wenn schon eine Maske abgespalten wurde.
Von zusätzlichem Interesse ist die Stabilität der Verbindungen in humanem Blutplasma, um abschätzen zu können, ob ein Transport des intakten Prodrugs zum Wirkort stattfinden kann. Obwohl die untersuchten Verbindungen im Vergleich zur pH-abhängigen Hydrolyse an Stabilität verloren, waren sie dennoch über mehrere Stunden in Inkubationsstudien nachzuweisen, wie Fig. 4 verdeutlicht. Damit sollte eine systemische Verteilung möglich sein.

Claims

Patentansprüche
1. Verbindung der allgemeinen Formel (I)
Figure imgf000041_0001
oder der allgemeinen Formel (II)
Figure imgf000041_0002
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, wobei R 1 R 1 R und R unabhängig voneinander H,
Figure imgf000041_0003
C— R sind, R Alkyl, Aryl oder OAlkyl ist,
R2, R3, R5 und R6 unabhängig voneinander H, Alkyl, Aryl oder OAlkyl sind,
R9 ein Nukleosid, Nukleosidanalogon oder Alkoholrest ist, und
Kat+ ein Kation ist, mit der Maßgabe, dass R1, R4, R7 und R8 nicht alle H sind.
O
2. Verbindung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass R1 und R4 beide O— C— R
O oder HN- C— R sind und R7 und R8 H sind.
O
3. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R7 und R8 beide O— C— R
O oder HN- C— R sind und R1 und R4 H sind.
4. Verbindung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass R9 ein Nukleosid oder Nukleosidanalogon ist.
5. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Verwendung als Arzneimittel.
6. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Verwendung als antivirales Arzneimittel, bevorzugt als Arzneimittel zur Behandlung einer HIV-Infektion.
7. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung eines Arzneimittels, bevorzugt eines antiviralen Arzneimittels, besonders bevorzugt eines Arzneimittels zur Behandlung einer HIV-Infektion.
8. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
9. Pharmazeutische Darreichungsform, insbesondere orale Darreichungsform, umfassend eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
10. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der allgemeinen Formel (I)
Figure imgf000043_0001
oder der allgemeinen Formel (II)
Figure imgf000043_0002
oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon,
O O wobei R1, R4, R7 und R8 unabhängig voneinander H, O— C-R oder HN- C— R sind, R Alkyl, Aryl oder OAlkyl ist,
R2, R3, R5 und R6 unabhängig voneinander H, Alkyl, Aryl oder OAlkyl sind, R9 ein Nukleosid, Nukleosidanalogon oder Alkoholrest ist, und Kat+ ein Kation ist, mit der Maßgabe, dass R1, R4, R7 und R8 nicht alle H sind, umfassend die Schritte des a) Inreaktionbringens eines Phenylesters der allgemeinen Formel (III)
Figure imgf000044_0001
mit Dichlorophosphoramidit
Cl
\
P-N(ZPr)2
/
Cl , und
b) Inreaktionbringens des in Schritt a) erhaltenen Phosphoramidits der allgemeinen Formel (IV)
Figure imgf000044_0002
mit einer Verbindung gemäß der allgemeinen Formel (V) O HO— P-OR9
O- (V)
oder mit einer Verbindung der allgemeinen Formel (VI)
HO— P— O— P— OR I - I - O O (VI).
O
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass R1 und R4 beide O— C— R O oder HN- C— R sind und R7 und R8 H sind.
O
12. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass R7 und R8 beide O— C— R
O oder HN- C— R sind und R1 und R4 H sind.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass R9 ein Nukleosid oder Nukleosidanalogon ist.
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