WO2009117975A1 - Secuencias de ácido nucleico y aminoácidos para el control de agentes patógenos. - Google Patents

Secuencias de ácido nucleico y aminoácidos para el control de agentes patógenos. Download PDF

Info

Publication number
WO2009117975A1
WO2009117975A1 PCT/CU2009/000003 CU2009000003W WO2009117975A1 WO 2009117975 A1 WO2009117975 A1 WO 2009117975A1 CU 2009000003 W CU2009000003 W CU 2009000003W WO 2009117975 A1 WO2009117975 A1 WO 2009117975A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
polypeptide
pathogens
nucleic acid
bioproduct
Prior art date
Application number
PCT/CU2009/000003
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Orlando Borras Hidalgo
Roxana Caridad PORTIELES ÁLVAKEZ
Merardo Pujol Ferrer
Gil Alberto ENRÍQUEZ OBREGÓN
Ernesto Manuel GONZÁLEZ RAMOS
Camilo Ayra Pardo
Carlos Guillermo Borroto Nordelo
Original Assignee
Centro De Ingeniería Genética Y Biotecnología
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=40796170&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=WO2009117975(A1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Centro De Ingeniería Genética Y Biotecnología filed Critical Centro De Ingeniería Genética Y Biotecnología
Priority to EP09723850.5A priority Critical patent/EP2298922B1/en
Priority to JP2011501095A priority patent/JP5466224B2/ja
Priority to US12/934,685 priority patent/US8450559B2/en
Priority to ES09723850.5T priority patent/ES2619512T3/es
Priority to CN2009801191643A priority patent/CN102046798B/zh
Priority to CA2719765A priority patent/CA2719765C/en
Priority to BRPI0910421-6A priority patent/BRPI0910421B1/pt
Publication of WO2009117975A1 publication Critical patent/WO2009117975A1/es
Priority to ZA2010/07140A priority patent/ZA201007140B/en
Priority to US13/865,437 priority patent/US9055744B2/en

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N37/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids
    • A01N37/18—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids containing the group —CO—N<, e.g. carboxylic acid amides or imides; Thio analogues thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8282—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for fungal resistance

Definitions

  • the present invention is related to the field of agricultural biotechnology, specifically with the use of an antipathogenic protein in the control of pathogens.
  • an antipathogenic protein in the control of pathogens.
  • the antipathogenic protein is applied, either by means of its expression in genetically modified plants, as well as by a bioproduct, high levels of control of diseases caused by plant pathogens are obtained.
  • Plant antipathogenic proteins have been isolated from leaves, pods, roots, tubers, stems, fruits and flowers, from crops such as radish, onion, alfalfa, chili, potato and soy. Antipathogenic proteins have been studied both biochemically and structurally, which is why they are known to be small peptides, approximately 5 KDa, composed of 45 to 54 amino acids, rich in cysteines, highly basic, and positively charged. The family of plant antipathogenic proteins is diverse with respect to the amino acid composition, since only the eight cysteines that stabilize the structure seem to be conserved. This characteristic reflects the diverse biological activities exhibited by the different plant antipathogenic proteins (Broekaert et al. (1995) Plant Physiol. 108: 1353-8).
  • Plant antipathogenic proteins can be divided into two groups, according to the structure of the precursor protein; In the first group, the precursor protein is composed of a signal peptide from the endoplasmic reticulum and a mature protein domain. This protein enters secretory pathways and has no obvious signals for post-transcriptional processes. In the second group Ia antipathogenic protein is formed by a long precursor that contains in addition to the signal peptide and the mature domain a C-terminal predominance of approximately 33 amino acids. To date, these antipathogenic proteins have been found only in Solanaceae species (Lay and Anderson (2005) Curr Protein Pept Sci. 6: 85-101).
  • the model that explains the activity of most of the antipathogenic proteins is the Shai-Matsuzaki-Huang Model, which explains the interaction of the peptide with the plasma membrane followed by a lipid displacement, which causes the formation of multimeric pores within the Plasma membrane due to the insertion of the positively charged protein in the cell membrane after its interaction with the negatively charged phospholipids of the surface of the white cell occurs, these multimeric pores constitute voltage-dependent ion-permeable channels (Thomma et al. (2002) Plant 216: 193-202).
  • Another model is based on the theory that many antipathogenic proteins exert their action not only by the permeabilization of the cytoplasmic membrane but also by cytoplasmic targets, these proteins once inside the white cell affect the synthesis of deoxyribonucleic acid (DNA), acid Ribonucleic (RNA) and proteins. This suggests that the ability of cationic proteins to cause permeabilization of the cytoplasmic membrane may not be the main cause of the mode of action, but a search path for an intracellular target (Thomma et al. (2003) Curr Drug Targets Infeci Disord. 3: 1-8).
  • alfalfa antipathogenic proteins provides a high resistance to the fungus of great agronomic importance Verticillium dahliae in the cultivation of the potato even in field conditions (Gao et al. (2000) Na ⁇ . Biotechnol. 18: 1307-1310 ).
  • rice plants that constiutively expressed the an ⁇ ipa ⁇ genic prolein genes of the species Brassica olerácea and B. campestr ⁇ s were modified to replace amino acids in different positions, and were introduced individually in rice plants for the search for resistance to the fungus Magnapothe gr ⁇ sea and the bacterium Xanthomonas oryzae, diseases of great importance in subtropical and tropical countries. These antipathogenic proteins conferred an effective resistance in both diseases and the modification of the genes of these led to an increase in the resistance of broad spectrum in the transgenic rice (Kawata et al. (2003) JARQ 37: 71-76).
  • plant antipathogenic proteins are derived from seeds, roots and tubers, so they constitute natural products that are not toxic to the host plant and not to the people who consume the products of these plants.
  • Plant antipathogenic proteins can also be used for the development of antifungal drugs, since the control of eukaryotic pathogens has always been one of the biggest problems in medicine, increasing in recent decades due to the increase in immunosuppressed patients due to diseases such as AIDS, cancer and organ transplants, in addition to the emergence of multi-drug resistant strains and the emergence of new species of both filamentous fungi and yeasts that are recognized as opportunistic pathogens (Thomma et al. (2003) Curr Drug Targets Infect Disord. 3: 1-8).
  • the antifungal compounds must point to molecules that are not or are rarely present in mammalian cells, such as components of the cell wall and virulence factors, and they must also be as natural products as possible, with a broad spectrum of action, easy to produce and not induce resistance (Walsh et al. (2000) Medical Mycology, 38: 335-347).
  • the fungal cell membranes are attractive targets for the development of these agents, because the components of the fungal membrane such as the fingolipids are structurally different in mammalian cells.
  • Plant antipathogens do not have as target the biosynthesis of the phingolipids, but act totally in reverse because their target constitutes the fingolipids themselves causing the permeabilization of the fungal membrane. This provides high selectivity and therefore interesting perspectives for the treatment of fungal infections.
  • Some plant antipathogenic proteins have been found such as: Dm-AMPI, Hs-AFPI and Rs-AFP2 that are active at micromolar concentrations against Candida albicans, a pathogen of great clinical interest in humans, which is an example of the potential of this type of plant proteins for the development of therapeutics (Thomma et al. (2003) Curr Drug Targets Infect Disord. 3: 1-8).
  • An important problem to solve is to achieve antipathogenic products of a protein nature capable of efficiently controlling a wide range of fungi and pathogenic bacteria, an aspect of great importance in agriculture and medicine.
  • This invention contributes to solving the aforementioned problem, by providing both the coding nucleotide sequence (nucleic acid of SEQ ID No. 1) and the amino acid (SEQ ID No. 6) of a new antipathogenic protein isolated from Nicotiana megalosiphon.
  • the nucleotide sequence of the invention codes for the small protein rich in tanks, which has a marked effect on several pathogens.
  • the subject of the present invention is also a nucleic acid that encodes a polypeptide comprising a) the amino acid sequence identified as SEQ ID No. 6, or b) an amino acid sequence where one or more amino acid residues have been removed, substituted and added to the amino acid sequence identified as SEQ ID No. 6, and that maintains its properties of controlling the infection by pathogens.
  • the gene coding for the antipathogenic protein of the present invention is used to improve the levels of resistance and defense of plants against various pathogens. Therefore, the present invention includes a method to increase the resistance to plant diseases produced by pathogens, by means of the genetic transformation of the plant with a nucleic acid sequence comprising the sequence of nucleic acid of SEQ ID No. 1, which leads to the constitutive or induced expression of the antipathogenic protein comprising SEQ ID No. 6.
  • the nucleic acid molecule object of the present invention can be used for plant transformation.
  • the DNA sequence coding for the antipathogenic protein can be used for the transformation of the following plant species: Zea mays, Brassica sp., Medicago sativa, Oryza sativa, Sorghum bicolor, Sorghum vulgare, Pennisetum glaucum, Helianthus annuus, Triticum aestivum, Glycine max, Nicotiana tabacum, Solanum tuberosum, Ipomoea batatas, Manihot esculenta, Coffea spp., Coconuts nucifera, Ananas comos ⁇ s, Citrus spp., Theobroma cacao, Camellia sinensis, Musa sppus, Persea Ficica, cassea ficica, Persea Psidium guajava, Mangifera indica, Carica papaya, Beta vulgaris, Saccharum spp., Lycopersicon esculentum, Lactuca s
  • the present invention can be used in a variety of methods that allow obtaining plants of agricultural interest that express the antipathogenic protein.
  • the nucleic acid sequence (SEQ ID No. 1) that codes for the antipathogenic protein can be used in combination with a promoter that is introduced into a plant of agricultural interest.
  • a constitutive promoter that expresses high levels and produces high levels of expression of the antipathogenic protein can be used.
  • the sequence coding for the antipathogenic protein can be manipulated and linked to a specific tissue promoter to direct the expression to a particular tissue of a plant susceptible to a pathogen.
  • Another object of the invention is a polypeptide comprising the amino acid sequence identified as SEQ ID No. 6 or SEQ ID No. 7.
  • polypeptides has biological activity against pathogens, which is why in this invention they are called antipathogenic proteins.
  • Another object of the invention is a polypeptide comprising in its polypeptide chain an amino acid sequence with at least 60% homology with the SEQ. ID No.6.
  • the polypeptides or antipathogenic proteins of the invention are obtained by recombinant route or by chemical synthesis.
  • the antipathogenic proteins of the invention can be expressed by means of the recombinant DNA technology in different host systems, and isolated from them. In a materialization of the invention, the antipathogenic protein can be expressed in yeasts In a preferred embodiment, the expression by the recombinant DNA route is performed in Pichia pastoris, preferably in the culture supernatant.
  • the polypeptides of the invention can be obtained by applying protein isolation techniques.
  • the purification process can be achieved using immunoenzymatic, chromatographic, washing of the cell precipitate, and others known in the state of the art techniques.
  • Variants of amino acid sequences that result from the fusion of the sequence SEQ ID No. 6 with stabilizing peptides or that direct the expression to certain compartments of the host, and maintain the biological activity demonstrated for that molecule are also object of the present invention.
  • An example of this is the fused protein whose sequence appears as SEQ ID No. 7.
  • Fragments of the antipathogenic protein, such as those identified in the Sequence Listing as SEQ ID No. 8 and SEQ ID No, are also subject of the present invention. 9, which retain the control activity on pathogens.
  • bioproduct for the control of pathogens comprising the polypeptide identified as SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7 or a polypeptide with at least 60% homology with the SEQ. ID No. 6.
  • the product that comes from a living organism is called bioproduct.
  • these antipathogenic proteins are used, for the first time, in bioproducts that confer high levels of protection against the main diseases caused by pathogens, with high stability and low contamination rates, so that their use presents better public perception and less requirements regulate us.
  • the bioproduct containing the antipathogenic protein of the present invention produces high levels of protection against fungi and bacteria, not previously reported.
  • the antipathogenic protein can be formulated through a suspension, solution, emulsion, powder, granule, emulsifiable concentrate, aerosol, impregnated granule, adjuvant, paste or through encapsulations.
  • the bioproduct contains the purified polypeptide from a genetically transformed host, or directly used in the supernatant of a culture of said host.
  • the host is P. pastoris.
  • the antipathogenic proteins whose sequences are claimed can be used, as well as the bioproducts that contain them, for the first time, for the control of a wide variety of pathogens such as: Aspergillus, Penicilium, Alternaria (Alternar ⁇ a brassicola ; Alternar ⁇ a solani; Alternar ⁇ a alternata); Bipolaris sacchar ⁇ ; Cinematic botrytis; Cercospora (Cercospora kikuchii; Cercospora zaea-maydis; Cercospora medicaginis; Cercospora sojina; Cercospora sorghi); Cladospor ⁇ um fulvun; Colletotrichum (Colletotrichum lindemuthianum; Colletotrichum dematium; Colletotrichum graminicola), Diplodia maydis; Erysiphe (Erysiphe graminis f.sp.
  • pathogens such as: Aspergillus, Penicilium
  • the bioproduct is useful for the control of phytopathogenic fungi.
  • the polypeptide that is included in the bioproduct is in the concentration range between 1 to 9 ⁇ g / ml.
  • Also part of the present invention is a method for the control of plant pathogens that is characterized by the application to the bioproduct plants comprising a polypeptide identified as SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7 or a polypeptide with at minus 60% homology with the SEQ. ID No. 6.
  • the method for the control of plant pathogens is characterized by the application of the bioproduct of the invention in conjunction with biopesticides.
  • FIG. 1A Cloning strategy of the antipathogenic protein of interest in the expression vectors in plants (Fig. 1A) and in yeast (Fig. 1 B).
  • Figure 2 Expression of the antipathogenic protein in Pichia pastor ⁇ s, by means of the pPIC9K vector, linked to the signal peptide of the Saccharomyces cerevisiae alpha factor. Production of the antipathogenic protein in the P. pastor ⁇ s supernatant (A) and fraction resulting from the purification (B).
  • Figure 3 Experiment of constitutive expression of the antipathogenic protein in transgenic plants and evaluation of disease resistance. The graph represents the percentage of leaves and stems with symptoms of the diseases in the control samples and the transgenic clones expressing the antipathogenic protein.
  • Figure 3A Effect of Peronospora hyoscyami f. sp tabacina on tobacco leaves.
  • FIG. 3B Effect of Alternar ⁇ a solani on potato leaves.
  • Figure 3C Effect of parasitic Phytophthora on tobacco stalks.
  • Figure 3D Effect of Phytophthora infestans on potato leaves.
  • the bars represent: a. inoculated control, b. control not inoculated, c. clone 1.1, d. clone 1.2, e. clone 1.3.
  • Figure 4. Experiment of activity of the antipathogenic protein against several plant pathogens at different concentrations.
  • the graph represents the percentage of growth inhibition in liquid medium of the pathogens treated at different concentrations of the antipathogenic protein bound to the signal peptide of the alpha factor (A) and synthesized without the signal peptide (B).
  • A the concentration of the antipathogenic protein bound to the signal peptide of the alpha factor
  • B synthesized without the signal peptide
  • the N. megalosiphon species was grown in 6-inch pots containing black peat and rice husk in a proportion (4: 1) and were kept in farmhouses at 23 ° C.
  • An isolate of Peronospora hyoscyami f. sp. Tabacina collected from a tobacco field in Havana was used for inoculations. The inoculations were carried out in plants of this species, 6 weeks old, placing several drops of 10 ⁇ l with 5 x 10 3 spores per ml (determined with a hemocytometer). The plants were placed in black plastic bags with high humidity (moisture was achieved by atomizing water inside the bags) for a period of 12 hours, to promote infection. Total RNA was extracted from leaves of N.
  • cDNA complementary double stranded DNA
  • the cDNA library was constructed by subtractive hybridization using the subtractive hybridization system with the polymerase chain reaction (in English Polymerase Chain Reaction, abbreviated PCR) (Clontech, Palo Alto, AC, USA).
  • the subtracted library was cloned into the pGEM-T Easy vector (Promega) according to the manufacturer's instructions.
  • the cDNA sequencing was developed using an automatic sequencer. After the sequence analysis, a DNA sequence was selected that had low levels of homology with proteins reported in databases, which was used in subsequent experiments.
  • the culture media that served as the basis for the regeneration and transformation experiments were SC (Sales MS, vitamin B1 0.4 mg / L, myo-inositol 100 mg / L, sucrose 20 g / L, BAP 3.5 mg / L, ANA 0.01 mg / L, phytoagar 6 g / L), SB (Sales MS, myo-inositol 100 mg / L, sucrose 20 g / L, AG 3 3.5 mg / L, phytoagar 6 g / L) and PP (Sales MS, vitamin B1 0.4mg / L, myo-inositol 100 mg / L, calcium pantothenate 2 mg / L, sucrose 30g / L, phytoagar 6g / L, activated carbon 5g / L and Silver Nitrate- Sodium Thiosulfate 1mg / L (STS).
  • SC Sales MS, vitamin B1 0.4 mg / L, myo-inositol 100 mg / L,
  • the Agrobacterium At2260 and LBA 4404 strains were used.
  • the bacteria were cultured in a medium with 1 g / L yeast extract, 1 g / L bacto-peptone, 5 g / L sucrose and Lab-lemco powder 5 g / L, at 28 0 C in the dark until an optical density (OD) 620 of 0.7-0.9 is reached.
  • OD optical density
  • the transformation procedure regeneration was developed in two stages, in the following way: segments of stems of in vitro culture 4 weeks plants were incubated on MS medium during 12-16 hours at 25 0 C in darkness Ia, then the infection with A.
  • tumefaciens was developed by the incubation of the explants for 7 minutes with 1 mL of the bacterial suspension per 2OmI MS, they were co-cultured 48 hours in SC medium at 22 0 C in Ia darkness and the explants were placed on a sterile filter paper. Washing of the explants in MS medium and drying with sterile filter paper was done carefully. In a first stage they were cultivated for 15 days in the light in selective medium SC, 500mg / L of claptan and 5 mg / L Phosphinothricin (PPT) and in a second stage they were grown in light in selective medium SB, 500mg / L of Claptan and 5mg / L PPT. Finally, the shoots were individualized to the selective medium PP, with 500mg / L of claptan and selected in 5mg / L of PPT.
  • PPT Phosphinothricin
  • Example 3 Evaluation of the effect of the NmDef-02 antipathogenic protein on disease resistance. Test of resistance to Peronospora hyoscyami f. sp. tobacco tabacina.
  • Rooted plants with resistance to the antibiotic kanamycin and with the gene of the antipathogenic protein were transplanted to pots for adaptation in green houses for 45 days. After that period a group of 100 clones 6-week-old transgenics were inoculated with P. hyoscyami f. sp. tabacina placing several drops of 10 ⁇ l with 5 x 10 3 spores / mi. The plants were placed in black and wet plastic bags for a period of 12 hours, to promote the infection. The susceptibility assessment was carried out by measuring the percentage of leaves with symptoms of the disease one week later (Figure 3A).
  • the P. parasitic fungus was grown in a petri dish containing the Papa Dextrose Agar medium (PDA) at a concentration of 39 g / L. It was incubated at a temperature of 27 ° C, for a period of 10 days.
  • PDA Papa Dextrose Agar medium
  • the Alternar ⁇ a solani fungus was inoculated into 100 transgenic potato plants 5 weeks old under controlled conditions of light, temperature and relative humidity.
  • the clones were sprayed with a suspension of 10 6 spores / ml.
  • the clones were kept under controlled conditions with a relative humidity between 85-95% and a temperature of 2O 0 C.
  • the percentage of leaves with symptoms was used as a measure of susceptibility to the pathogen one week after inoculations (Figure 3D).
  • the three clones analyzed showed high levels of resistance to this pathogen, which provides potential for the first time for the use of this protein for its control.
  • Example 4 Construction of the vector for the expression of the antipathogenic protein NmDef-02, extracellularly, in the culture supernatant of Pichia pastoris.
  • the gene coding for the N. megalosiphon antipathogenic protein was isolated using the specific oligonucleotides corresponding to SEQ ID No. 4 and SEQ ID No. 5 to obtain the complete sequence of the gene coding for the NmDef-02 antipathogenic protein, with Xho I / EcoR I enzyme restriction sites, necessary for cloning into the pPIC9k expression vector.
  • This cloning strategy adds to the protein of interest at the amino-terminal end the signal peptide of the Saccharomyces cerevisiae alpha factor ( Figure 1B), whereby the resulting protein corresponds to SEQ ID No. 7.
  • the plasmid was linearized with BgI Il before transforming the strain of GS115 from P. pastoris. The transformation was carried out by electroporation.
  • the GS115 strain is an auxotrophic mutant his3 Ia which acquires a HiS + phenotype after the transformation.
  • the HiS + transformants were selected in minimal medium with dextrose, the clones were cultured in minimal medium with glycerol and induced with methanol for 126 hours at 28 ° C.
  • Transforming clones were identified by Dot Blot. Using the Southern Blot technique, it was determined in which the integration had occurred due to replacement of the AOX1 gene of P. pastoris by the expression cassette of the recombinant plasmid, which corresponds to a Mut s phenotype (low methanol utilization) and HiS + . P. pastoris secretes low levels of own proteins and its culture medium does not need protein supplements, so it can be expected that a heterologous protein that is secreted to the extracellular medium, constitutes the majority of the total protein in the culture supernatant (more 80%) (Tschopp et al. (1987) Bio / Technology 5: 1305-1308). The expression of the antipathogenic protein in P.
  • pastoris was carried out in 5 liter air fresheners by adding methanol to the culture medium.
  • the expression of the recombinant antipatogenic protein and its integrity were checked by mass spectrometry.
  • Example 5 Purification and assay of the biological activity of the antipathogenic protein.
  • the antipathogenic protein bound to the alpha factor signal peptide (NmDef-Plus) was purified from the culture supernatant, by dialysis in 25 mM sodium acetate at pH 4.5; The dialysis product was passed through a CM-Sepharosa Fast-flow cation exchange resin equilibrated with 25 mM sodium acetate, pH 4.5; and the proteins were eluted with 1 M sodium chloride, 50 mM Tris pH 7.6. The fractions containing the protein were collected and concentrated using an ultracentrifugation system with a membrane with a pore size (cut-off) of 3 kDa. A wavelength of 254 nm was used for the detection.
  • the evaluation was carried out in 96-well plates, in which 50 ⁇ L of papa-dextrose liquid medium, 50 ⁇ L of the spore suspension of pathogenic fungi and 20 ⁇ L of partially purified antipathogenic protein were added.
  • the percentage of growth inhibition (PIC) of the pathogens was determined according to what was previously reported (Térras et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 14301-15309), by means of the following equation:
  • the antipathogenic protein without the alpha factor signal peptide was chemically synthesized, and its effect on the P. infestans fungus was evaluated at different concentrations as reported previously (Térras et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 14301- 15309) ( Figure 4B).
  • Figures 4A and 4B 1 the antipathogenic protein achieved high levels of growth inhibition against plant pathogenic fungi, either bound to the alpha factor signal peptide or chemically synthesized without the peptide. It was very interesting to observe, for the first time, how it achieves the inhibition of important plant pathogens, a result not achieved so far by other antifungal proteins reported so far.
  • Example 7 Biological activity of fragments of the antipathogenic protein NmDef-02.
  • Fragments of the antipathogenic protein NmDef-02 were obtained by chemical synthesis (SEQ ID No. 8 and SEQ ID No. 9). The effect on the P. infestans fungus was evaluated at different concentrations as reported (Térras et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 14301-15309), which is shown in Figure 6. The result obtained allows use of protein fractions to achieve control or inhibition of pathogens, especially when the protein fraction of SEQ ID No 9 is used.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

La presente invención revela una secuencia de ácido nucleico derivada de Nicotiana megalosiphon que codifica para una proteína antipatogénica. La invención contempla el uso de esta molécula de ácido nucleico en Ia obtención de plantas transgénicas de interés agrícola que muestran resistencia a patógenos. La invención también incluye un bioproducto, que comprenda esta proteína antipatogénica, para el control de agentes patógenos de plantas.

Description

SECUENCIAS DE ÁCIDO NUCLEICO Y AMINOÁCIDOS PARA EL CONTROL DE AGENTES PATÓGENOS.
Campo de Ia técnica La presente invención está relacionada con el campo de Ia biotecnología agropecuaria, específicamente con Ia utilización de una proteína antipatogénica en el control de agentes patógenos. Cuando se aplica Ia proteína antipatogénica, ya sea mediante Ia expresión de esta en plantas genéticamente modificadas, así como mediante un bioproducto, se obtienen altos niveles de control de enfermedades producidas por agentes patógenos de plantas.
Estado de Ia técnica anterior
Las proteínas antipatogénicas de plantas han sido aisladas de hojas, vainas, raíces, tubérculos, tallos, frutos y flores, de cultivos tales como el rábano, cebolla, alfalfa, ají, papa y soya. Las proteínas antipatogénicas se han estudiado tanto a nivel bioquímico como estructural, por Io que se conoce que son péptidos pequeños, de aproximadamente 5 KDa, compuestos de 45 a 54 aminoácidos, ricos en cisteínas, altamente básicos, y que se encuentran cargados positivamente. La familia de las proteínas antipatogénicas de plantas es diversa con respecto a Ia composición de aminoácidos, ya que solamente las ocho cisteínas que estabilizan Ia estructura parecen ser conservadas. Esta característica refleja las diversas actividades biológicas exhibidas por las diferentes proteínas antipatogénicas de plantas (Broekaert et al. (1995) Plant Physiol. 108:1353-8). Las proteínas antipatogénicas de plantas pueden dividirse en dos grupos, de acuerdo a Ia estructura de Ia proteína precursora; en el primer grupo Ia proteína precursora está compuesta por un péptido señal procedente del retículo endoplasmático y un dominio de proteína madura. Esta proteína entra en vías secretoras y no tiene señales obvias para los procesos post-transcripcionales. En el segundo grupo Ia proteína antipatogénica se encuentra formada por un largo precursor que contiene además del péptido señal y del dominio maduro un predominio C-terminal de 33 aminoácidos aproximadamente. Hasta Ia fecha estas proteínas antipatogénicas han sido encontradas solo en especies de solanáceas (Lay y Anderson (2005) Curr Protein Pept Sci. 6:85-101). No todas las proteínas antipatogénicas de plantas tienen el mismo modo de acción, algunas exhiben una potente actividad in vitro contra un amplio espectro de hongos filamentosos, aún en concentraciones micromolares, otras no inhiben el crecimiento fúngico, pero inhiben Ia actividad de Ia α-amilasa y de proteínas de síntesis (Colilla et al (1990) FEBS Lett. 270: 191-194). El modelo que explica Ia actividad de Ia mayoría de las proteínas antipatogénicas es el Modelo Shai-Matsuzaki-Huang, el cual explica Ia interacción del péptido con Ia membrana plasmática seguido por un desplazamiento lipídico, Io que provoca Ia formación de poros multiméricos dentro de Ia membrana plasmática debido a Ia inserción de Ia proteína cargada positivamente en Ia membrana celular después que se produce Ia interacción de este con los fosfolípidos negativamente cargados de Ia superficie de Ia célula blanco, estos poros multiméricos constituyen canales ión- permeable dependientes de voltaje (Thomma et al. (2002) Planta 216:193-202). Otro modelo se basa en Ia teoría de que muchas proteínas antipatogénicas ejercen su acción no solo mediante Ia permeabilización de Ia membrana citoplasmática sino también mediante blancos citoplasmáticos, estas proteínas una vez dentro de Ia célula blanco afectan Ia síntesis de ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN) y proteínas. Esto sugiere que Ia habilidad de las proteínas catiónicas de causar permeabilización de Ia membrana citoplasmática pudiera no ser Ia causa principal del modo de acción, sino una vía de búsqueda de un blanco intracelular (Thomma et al. (2003) Curr Drug Targets Infecí Disord. 3:1-8).
Hasta Ia fecha muchos tipos de proteínas antimicrobianas han sido identificadas y caracterizadas, cuyas posibles aplicaciones son diversas, pues Ia ingeniería genética provee una estrategia de resistencia a enfermedades en las plantas a través de herramientas celulares y moleculares (Thomma et al. (2003) Curr Drug Targets Infecí Disord. 3:1-8). Se ha demostrado que Ia expresión consíiluíiva de proleínas anlipatogénicas de rábano incrementa Ia resisíencia de plañías de íabaco al hongo patógeno de hojas Alternaría longipes, (Terra eí al. (1995) Plañí CeII 7: 573-588), de igual forma ocurre en íomale con Alternaría solani. También, Ia expresión constitutiva de proteínas antipatogénicas de alfalfa proveen una alta resistencia al hongo de gran importancia agronómica Verticillium dahliae en el cultivo de Ia papa aún en condiciones de campo (Gao et al. (2000) Naí. Biotechnol. 18: 1307-1310).
Por otra parte, plantas de arroz que expresaron constiíutivamente los genes de proleínas aníipaíogénicas de las especies Brassica olerácea y B. campestrís fueron modificadas para sustituir aminoácidos en diferentes posiciones, y fueron introducidas individualmente en plantas de arroz para Ia búsqueda de resistencia al hongo Magnapothe grísea y Ia bacteria Xanthomonas oryzae, enfermedades de gran importancia en países subtropicales y tropicales. Estas proteínas antipatogénicas confirieron una resistencia eficaz en ambas enfermedades y Ia modificación de los genes de estas condujo a un aumento de Ia resistencia de amplio espectro en el arroz transgénico (Kawata et al. (2003) JARQ 37: 71 - 76). La aplicación de las proteínas antipatogénicas de plantas como alternativa para reducir Ia pérdida de cosechas debido al ataque de hongos patógenos constituye una ventaja con respecto a Ia aplicación de los funguicidas químicos. Primero: proteínas antipatogénicas de plantas son derivadas de semillas, raíces y tubérculos, por Io que constituyen productos naturales que no son tóxicos a Ia planta hospedante y tampoco a las personas que consumen los productos de estas plantas. Segundo: como cualquier otra proteína, las proteínas antipatogénicas como productos naturales se degradan rápidamente, no dejando ningún residuo después que expira su eficacia (Thomma et al. (2003) Curr Drug Targets Infect Disord. 3:1-8). Las proteínas antipatogénicas de plantas también pueden ser usadas para el desarrollo de medicamentos antifúngicos, pues el control de patógenos eucariotas siempre ha constituido uno de los mayores problemas en Ia medicina, aumentando en las últimas décadas por el incremento de pacientes inmunodeprimidos debido a enfermedades tales como el SIDA, el cáncer y a los transplantes de órganos, además del surgimiento de cepas multi-resistentes a drogas y a Ia aparición de nuevas especies tanto de hongos filamentosos como de levaduras que son reconocidos como patógenos oportunistas (Thomma et al. (2003) Curr Drug Targets Infect Disord. 3:1-8).
Debido a Ia similitud entre las células de los mamíferos y Ia de los patógenos, los compuestos antifúngicos deben apuntar a las moléculas que no están o raramente están presente en células de mamíferos, como pueden ser componentes de Ia pared celular y los factores de virulencia, y además deben ser productos Io más naturales posible, con un amplio espectro de acción, fáciles de producir y que no induzcan resistencia (Walsh et al. (2000) Medical Mycology, 38: 335-347). Por otra parte, las membranas celulares fúngicas son blancos atractivos para el desarrollo de estos agentes, porque los componentes de Ia membrana fúngica como los fingolípidos son estructuralmente diferentes en células de mamíferos. Las proteínas antipatogénicas de planta no tienen como blanco Ia biosíntesis de los fingolípidos, sino que actúan totalmente a Ia inversa pues su blanco Io constituyen los propios fingolípidos provocando con su actuar Ia permeabilización de Ia membrana fúngica. Esto Ie proporciona una alta selectividad y por Io tanto, perspectivas interesantes para el tratamiento de infecciones fúngicas. Han sido encontradas algunas proteínas antipatogénicas de plantas como: Dm-AMPI , Hs-AFPI y Rs-AFP2 que son activas a concentraciones micromolares contra Candida albicans, un patógeno de gran interés clínico en humanos, Io que constituye un ejemplo del potencial de este tipo de proteínas de plantas para el desarrollo de Ia terapéutica (Thomma et al. (2003) Curr Drug Targets Infect Disord. 3:1-8).
Un importante problema a solucionar es lograr productos antipatogénicos de carácter proteico capaces de controlar eficientemente una amplia gama de hongos y bacterias patógenas, aspecto de mucha importancia en Ia agricultura y Ia medicina.
Explicación de Ia invención
Esta invención contribuye a resolver el problema antes mencionado, al proporcionar tanto Ia secuencia nucleotídica codificante (ácido nucleico de Ia SEQ ID No. 1 ) como Ia aminoacídica (SEQ ID No. 6) de una nueva proteína antipatogénica aislada de Nicotiana megalosiphon. La secuencia nucleotídica de Ia invención codifica para Ia pequeña proteína rica en cisternas, Ia que posee un efecto marcado sobre varios agentes patógenos.
Es también objeto de Ia presente invención un ácido nucleico que codifica para un polipéptido que comprende a) Ia secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID No. 6, ó b) una secuencia de aminoácidos donde uno o varios residuos aminoacídicos se han eliminado, sustituido y añadido a Ia secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID No. 6, y que mantiene sus propiedades de controlar Ia infección por agentes patógenos.
En una realización de Ia invención, el gen que codifica para Ia proteína antipatogénica de Ia presente invención se emplea para mejorar los niveles de resistencia y defensa de las plantas frente a varios agentes patógenos. Por tanto, Ia presente invención incluye un método para aumentar Ia resistencia a enfermedades de plantas producidas por agentes patógenos, mediante Ia transformación genética de Ia planta con una secuencia de ácido nucleico que comprende Ia secuencia de ácido nucleico de Ia SEQ ID No. 1 , que conduce a Ia expresión constitutiva o inducida de Ia proteína antipatogénica que comprende Ia SEQ ID No. 6. La molécula de ácido nucleico objeto de Ia presente invención puede ser usada para Ia transformación de plantas. En una realización preferida, Ia secuencia de ADN que codifica para Ia proteína antipatogénica puede emplearse para Ia transformación de las siguientes especies de plantas: Zea mays, Brassica sp., Medicago sativa, Oryza sativa, Sorghum bicolor, Sorghum vulgare, Pennisetum glaucum, Helianthus annuus, Triticum aestivum, Glycine max, Nicotiana tabacum, Solanum tuberosum, Ipomoea batatas, Manihot esculenta, Coffea spp., Cocos nucífera, Ananas comosυs, Citrus spp., Theobroma cacao, Camellia sinensis, Musa spp., Persea americana, Ficus casica, Psidium guajava, Mangifera indica, Carica papaya, Beta vulgaris, Saccharum spp., Lycopersicon esculentum, Lactuca sativa, Phaseolus vulgaris, Cucumis sativus, Cucumis meló, Hibiscus rosasanensis, Rosa spp., Tulipa spp., Pinus taeda, Pinus elliotii, Pinus ponderosa, Pinus contorta, Pinus radiata. La presente invención puede emplearse en una variedad de métodos que permitan Ia obtención de plantas de interés agrícola que expresen Ia proteína antipatogénica. De esta manera, Ia secuencia de ácido nucleico (SEQ ID No. 1 ) que codifica para Ia proteína antipatogénica puede usarse en combinación con un promotor que se introduce en una planta de interés agrícola. Puede utilizarse un promotor constitutivo que exprese altos niveles y produzca elevados niveles de expresión de Ia proteína antipatogénica. En otras formas, Ia secuencia que codifica para Ia proteína antipatogénica puede ser manipulada y unida a un promotor tejido específico para dirigir Ia expresión a un tejido en particular de una planta susceptible a un patógeno. Otro objeto de Ia invención es un polipéptido que comprende Ia secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID No. 6 o SEQ ID No. 7. Cualquiera de estos polipéptidos tiene actividad biológica frente a agentes patógenos, por Io que en esta invención se denominan proteínas antipatogénicas. Otro objeto de Ia invención es un polipéptido que comprende en su cadena polipeptídica una secuencia de aminoácidos con al menos un 60% de homología con Ia SEQ. ID No.6. En una realización preferida los polipéptidos o proteínas antipatogénicas de Ia invención se obtienen por vía recombinante o por síntesis química. Las proteínas antipatogénicas de Ia invención pueden expresarse mediante Ia tecnología del ADN recombinante en diferentes sistemas hospederos, y aislarse a partir de ellos. En una materialización de Ia invención Ia proteína antipatogénica se puede expresar en levaduras. En una realización preferida, Ia expresión por Ia vía del ADN recombinante se realiza en Pichia pastoris, preferentemente en el sobrenadante de cultivo. A partir de los hospederos, los polipéptidos de Ia invención pueden obtenerse aplicando las técnicas de aislamiento de proteínas. El proceso de purificación puede lograrse usando técnicas immunoenzimáticas, cromatográficas, de lavado del precipitado celular, y otras conocidas en el estado del arte. Variantes de secuencias aminoacídicas que resulten de Ia fusión de Ia secuencia SEQ ID No. 6 con péptidos estabilizadores o que dirijan Ia expresión a determinados compartimentos del hospedero, y mantengan Ia actividad biológica demostrada para esa molécula también son objeto de Ia presente invención. Un ejemplo de ello es Ia proteína fusionada cuya secuencia aparece como Ia SEQ ID No. 7. También son objeto de Ia presente invención fragmentos de Ia proteína antipatógenica, como los identificados en el Listado de Secuencias como SEQ ID No. 8 y SEQ ID No. 9, que retengan Ia actividad de control sobre agentes patógenos. Otro aspecto de Ia presente invención es un bioproducto para el control de agentes patógenos que comprende el polipéptido identificado como SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7 o un polipéptido con al menos un 60% de homología con Ia SEQ. ID No. 6. En el contexto de Ia siguiente invención, se denomina bioproducto a aquel producto que proviene de un organismo vivo. En esta invención se emplean estas proteínas antipatogénicas, por primera vez, en bioproductos que confieren altos niveles de protección frente a las principales enfermedades producidas por agentes patógenos, con alta estabilidad y bajos índices de contaminación, por Io que su utilización presenta mejor percepción pública y menos requerimientos regúlatenos. El bioproducto que contiene Ia proteína antipatogénica de Ia presente invención produce altos niveles de protección frente a hongos y bacterias, no reportados anteriormente. Para lograr el bioproducto, Ia proteína antipatogénica se puede formular a través de una suspensión, solución, emulsión, polvo, granulo, emulsionable concentrado, aerosol, granulo impregnado, adyuvante, pasta o a través de encapsulaciones. En una realización de Ia invención, el bioproducto contiene el polipéptido purificado a partir de un hospedero transformado genéticamente, o se emplea directamente contenido en el sobrenadante de un cultivo de dicho hospedero. En una realización preferida el hospedero es P. pastoris. En una materialización de Ia invención, las proteínas antipatogénicas cuya secuencias se reivindican puede ser empleadas, al igual que los bioproductos que las contienen, por primera vez, para el control de una amplia variedad de patógenos como: Aspergillus, Penicilium, Alternaría (Alternaría brassicola; Alternaría solani; Alternaría alternata); Bipolaris saccharí; Botrytis cinérea; Cercospora (Cercospora kikuchii; Cercospora zaea-maydis; Cercospora medicaginis; Cercospora sojina; Cercospora sorghi); Cladosporíum fulvun; Colletotrichum (Colletotrichum lindemuthianum; Colletotrichum dematium; Colletotrichum graminicola), Diplodia maydis; Erysiphe (Erysiphe graminis f.sp. graminis; Erysiphe graminis f.sp. hordei); Fusaríum (Fusarium nivale; Fusaríum oxysporum; Fusarium graminearum; Fusarium culmorum; Fusaríum solani; Fusarium moniliforme; Fusarium roseum); Helminthosporium (Helminthosporium turcicum; Helminthosporium carbonum; Helminthosporium maydis); Maganaporthe grísea; Mycosphaerella figensis; Peronospora (Peronospora manshurica; Peronospora tabacina); Phoma betae; Phytophthora (Phytophthora cinnamomi; Phytophthora cactorum; Phytophthora phaseoli; Phytophthora parasítica; Phytophthora citrophthora, Phytophthora megasperma f.sp. soyae; Phytophthora infestans), Puccinia {Puccinia sorghi; Puccinia striiformis; Puccinia graminis f.sp. tritici; Puccinia asparagi; Puccinia recóndita; Puccinia arachidis; Puccinia melanocephala), Pythium (Pythium aphanidermatum; Pythium ultimum); Pyricularia oryzae; Rhizoctonia {Rhizoctonia solani; Rhizoctonia cerealis); Scerotium rolfsii; Sclerotinia sclerotiorum; Septoria (Septoria lycopersici; Septoria glycines; Septoria nodorum; Septoria tritici); Thielaviopsis basicola; Ustilago (Ustilago maydis; Ustilago scitaminea); Verticillium (Verticillium dahliae; Verticillium alboatrum); Pseudomonas syringae p.v. glycinea; Xanthomonas campestrís p.v. phaseoli; Xanthomonas campestris p.v. alfalfae; Xanthomonas campestris p.v. translucens; Pseudomonas syringae p.v. syringae; Erwinia carotovorum p.v. carotovora; Erwinia stewartii; Clavibacter michiganense subsp. Nebraskense; Pseudomonas avenae; Erwinia chrysanthemi p.v. zea; Erwinia carotovora; Xanthomonas campestris p.v. holcicola, Pseudomonas andropogonis y Pseudomonas avenae. En una realización preferida el bioproducto es útil para el control de hongos fitopatógenos. En una materialización de Ia invención el polipéptido que se incluye en el bioproducto está en el rango de concentración entre 1 a 9 μg / mi. Es también parte de Ia presente invención un método para el control de agentes patógenos de plantas que se caracteriza por Ia aplicación a las plantas del bioproducto que comprende un polipéptido identificado como SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7 o un polipéptido con al menos un 60% de homología con Ia SEQ. ID No. 6. En otra materialización de Ia invención, el método para el control de agentes patógenos de plantas se caracteriza por Ia aplicación del bioproducto de Ia invención en unión con bioplaguicidas.
Plantas modificadas genéticamente con Ia secuencia de ácido nucleico de Ia SEQ ID No. 1, o una secuencia de ácido nucleico que comprenda Ia SEQ ID No. 1 (plantas transgénicas), para aumentar su resistencia a enfermedades de plantas producidas por agentes patógenos, forman parte también de Ia presente invención.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Estrategia de clonaje de Ia proteína antipatogénica de interés en los vectores de expresión en plantas (Fig. 1A) y en levadura (Fig. 1 B).
Figura 2. Expresión de Ia proteína antipatogénica en Pichia pastorís, mediante el vector pPIC9K, unida al péptido señal del factor alfa de Saccharomyces cerevisiae. Producción de Ia proteína antipatogénica en el sobrenadante de P. pastorís (A) y fracción resultante de Ia purificación (B). Figura 3. Experimento de expresión constitutiva de Ia proteína antipatogénica en plantas transgénicas y evaluación de Ia resistencia a enfermedades. La gráfica representa el porcentaje de hojas y tallos con síntomas de las enfermedades en las muestras controles y los clones transgénicos expresando Ia proteína antipatogénica. (Figura 3A) Efecto de Peronospora hyoscyami f. sp tabacina sobre hojas de tabaco. (Figura 3B) Efecto de Alternaría solani sobre hojas de papa. (Figura 3C) Efecto de Phytophthora parasítica sobre tallos de tabaco. (Figura 3D) Efecto de Phytophthora infestans sobre hojas de papa. En las figuras las barras representan: a. control inoculado, b. control no inoculado, c. clon 1.1 , d. clon 1.2, e. clon 1.3. Figura 4. Experimento de actividad de Ia proteína antipatogénica frente a varios patógenos de plantas a diferentes concentraciones. La gráfica representa el porcentaje de inhibición del crecimiento en medio líquido de los patógenos tratados a diferentes concentraciones de Ia proteína antipatogénica unida al péptido señal del factor alfa (A) y sintetizada sin el péptido señal (B). Leyenda de Ia Figura 4B: D efecto de Ia proteína unida al péptido señal del factor alfa sobre Phytophthora infestans, * efecto de Ia proteína sin el péptido señal del factor alfa sobre Phytophthora infestans, u control.
Figura 5. Experimento del efecto control sobre hongos del suelo (A) y aéreos (B) de Ia formulación de Ia proteína antipatogénica NmDef-02. En Ia Figura las barras representan: u plantas controles, D plantas tratadas con fungicidas, 4 plantas tratadas con Ia formulación de Ia proteína antipatogénica.
Figura 6. Actividad biológica de fragmentos de Ia proteína antipatogénica NmDef-02 sobre Phytophthora infestans. π efecto del péptido SEQ ID. No 8 sobre Phytophthora infestans, * efecto del péptido SEQ ID. No 9 sobre Phytophthora infestans
Exposición detallada de modos de realización / Ejemplos de realización Ejemplo 1. Preparación del material vegetal, aislamiento y clonación del ADN que codifica para Ia proteína antipatogénica NmDef-02 de Nicotiana megalosiphon.
La especie N. megalosiphon se creció en potes de 6 pulgadas que contenían turba negra y cascara de arroz en una proporción (4:1 ) y fueron mantenidas en casas de cultivo a 23°C. Un aislado de Peronospora hyoscyami f. sp. tabacina colectado de un campo de tabaco en La Habana fue usado para las inoculaciones. Las inoculaciones se llevaron a cabo en plantas de esta especie, de 6 semanas de edad, colocando varias gotas de 10 μl con 5 x 103 esporas por mi (determinada con un hemocitómetro). Las plantas fueron colocadas en bolsas plásticas negras con alta humedad (Ia humedad se logró atomizando agua en el interior de Ia bolsas) durante un período de 12 horas, para promover Ia infección. El ARN total fue extraído de hojas de plantas de N. megalosiphon inoculadas 6 días después, utilizando el sistema de extracción de ARN total por centrifugación (Promega, Madison, Wl, USA). Finalmente fue sintetizado el ADN complementario doble cadena (ADNc), utilizando el sistema de síntesis de ADNc de Ia firma Promega. La librería de ADNc fue construida por hibridación sustractiva usando el sistema de hibridación sustractiva con Ia reacción en cadena de Ia polimerasa (del inglés Polymerase Chain Reaction, abreviado PCR) selectivo (Clontech, Palo Alto, AC, USA). El ADNc obtenido de plantas de N. megalosiphon inoculadas con P. hyoscyami y cosechada 6 días después de Ia inoculación, fue usado como muestra para Ia sustracción. La librería sustraída fue clonada en el vector pGEM - T Easy (Promega) de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
La secuenciación de los ADNc se desarrolló utilizando un secuenciador automático. Tras el análisis de las secuencias se seleccionó una secuencia de ADN que tenía bajos niveles de homología con proteínas reportadas en bases de datos, Ia cual fue utilizada en los experimentos posteriores.
Ejemplo 2. Transformación de plantas con el gen de Ia proteína antipatogénica NmDef-02. Producción de plantas transgénicas de tabaco: construcción de los vectores binarios.
En este ensayo el ADNc completo del gen que codifica para Ia proteína antipatogénica fue aislado con los oligonucleótidos SEQ ID No. 2 y SEQ ID No. 3 clonado en el vector de transformación pCambia 2300 en los sitios de restricción Hind III / Pst I (Figura 1A). La transformación genética de plantas de Nicotiana tabacum se llevó a cabo por el método de Zambryski et al. (1983) EMBO Journal, 2: 2143-2150. Para ello se transformó Ia cepa AT 2260 de Agrobacterium tumefaciens por el método del nitrógeno líquido (Hofgen and Willmitzer (1988) Nucí. Acids Res. 16: 9877) con el plásmido binario desarrollado. Se transformaron discos de hojas de plantas de N. tabacum de Ia variedad Petit Havana SR 1 , cultivadas in vitro. Se empleó kanamicina (100 mg/L) como marcador de selección del evento de transformación. Los discos de hojas se co-cultivaron con Ia bacteria recombinante Agrobacterium por 48 horas en medio Murashige y Skoog (MS) líquido. La regeneración de los brotes de tabaco (4-6 semanas) se efectuó en el medio MS que contenía: sacarosa 25 g/L, 6-Bencil amino purina (BAP) 1 mg/L, ácido naftalén acético (ANA) 0.1 mg/L, kanamicina 100 mg/L y claforán (Claf) 500 mg/L. El enraizamiento de los brotes (1-3 semanas) se realizó en medio MS que contenía: sacarosa 30 g/L, kanamicina 100 mg/L y Claf 500 mg/L.
Producción de plantas transgénicas de papa: construcción de los vectores binarios. En este ensayo el ADNc completo del gen que codifica para Ia proteína antipatogénica fue aislado con los oligonucleótidos de las SEQ ID No. 2 y SEQ ID No. 3 y clonado en el vector de transformación pCambia 3300 en los sitios de restricción Hind III / Pst I (Figura 1A). El material vegetal que se utilizó en los experimentos de cultivo de tejidos y transformación fue tomado de plántulas in vitro del cultivar de papa "Désirée". Las plantas fueron crecidas en tubos de ensayos en medio MS. El pH en los medios de cultivo fue ajustado a 5,7. Se utilizaron plantas de cuatro semanas de cultivo, mantenidas en cuartos con 25 0C y una iluminación de 2000 Lux. Los medios de cultivo que sirvieron de base para los experimentos de regeneración y transformación fueron el SC (Sales MS, vitamina B1 0.4 mg/L, myo- inositol 100 mg/L, sacarosa 20 g/L, BAP 3.5 mg/L, ANA 0.01 mg/L, fitoagar 6 g/L), el SB (Sales MS, myo-inositol 100 mg/L, sacarosa 20 g/L, AG33.5 mg/L, fitoagar 6 g/L) y el PP (Sales MS, vitamina B1 0.4mg/L, myo-inositol 100 mg/L, pantotenato de calcio 2 mg/L, sacarosa 30g/L, fitoagar 6g/L, carbón activado 5g/L y Nitrato de Plata- Tiosulfato de Sodio 1mg/L (STS).
Para Ia transformación se utilizaron las cepas de Agrobacterium At2260 y LBA 4404. La bacteria se cultivó en un medio con extracto de levadura 1 g/L, bacto-peptona 1 g/L, sacarosa 5 g/L y Lab-lemco en polvo 5 g/L, a 28 0C en Ia oscuridad hasta alcanzar una densidad óptica (DO)620 de 0.7-0.9. El procedimiento de transformación regeneración se desarrolló en dos etapas, de Ia siguiente forma: segmentos de tallos de plantas in vitro de 4 semanas de cultivo fueron incubadas en medio MS durante 12-16 horas a 25 0C en Ia oscuridad, luego Ia infección con A. tumefaciens se desarrolló mediante Ia incubación de los explantes durante 7 minutos con 1 mL de Ia suspensión bacteriana por cada 2OmI de MS, se co-cultivaron 48 horas en medio SC a 220C en Ia oscuridad y se colocaron los explantes sobre un papel de filtro estéril. El lavado de los explantes en medio MS y secado con papel de filtro estéril se realizó con cuidado. En una primera etapa se cultivaron durante 15 días a Ia luz en medio selectivo SC, 500mg/L de claforán y 5 mg/L Fosfinotricina (PPT) y en una segunda etapa se cultivaron a Ia luz en medio selectivo SB, 500mg/L de claforán y 5mg/L PPT. Finalmente los brotes fueron individualizados al medio selectivo PP, con 500mg/L de claforán y seleccionados en 5mg/L de PPT.
Ejemplo 3. Evaluación del efecto de Ia proteína antipatogénica NmDef-02 sobre Ia resistencia a enfermedades. Ensayo de Ia resistencia a Peronospora hyoscyami f. sp. tabacina en tabaco.
Plantas enraizadas con resistencia al antibiótico kanamicina y con el gen de Ia proteína antipatogénica, fueron transplantadas a macetas para su adaptación en casa verdes durante 45 días. Luego de ese período un grupo de 100 clones transgénicos de 6 semanas de edad fueron inoculados con P. hyoscyami f. sp. tabacina colocando varias gotas de 10 μl con 5 x 103 esporas / mi. Las plantas fueron colocadas en bolsas plásticas negras y húmedas durante un período de 12 horas, para promover Ia infección. La evaluación de Ia susceptibilidad se llevó a cabo midiendo el porcentaje de hojas con síntomas de Ia enfermedad una semana después (Figura 3A). Como se puede apreciar en Ia Figura se lograron altos niveles de resistencia a este patógeno, cuando comparamos el porcentaje de hojas con síntomas entre el control inoculado y los diferentes clones, Io cual muestra Ia utilidad de Ia proteína antipatogénica usada para el control de este importante patógeno. Ensayo de Ia resistencia a Phytophthora parasítica en tabaco.
Plantas enraizadas con resistencia al antibiótico kanamicina y con el gen de Ia proteína antipatogénica, fueron transplantadas a macetas para su adaptación en casa verdes durante 45 días. Un grupo de 100 clones transgénicos fueron inoculados con P. parasítica y se evaluó el porcentaje de tallos con síntomas de Ia enfermedad un mes después. Para el procedimiento de evaluación el hongo P. parasítica fue crecido en una placa petri que contenía el medio Papa Dextrosa Agar (PDA) a una concentración de 39 g/L. El mismo fue incubado a una temperatura de 27°C, durante un período de 10 días. Para Ia inoculación de las plantas de tabaco se colocó un disco (de diámetro: 1 cm) de PDA, que contenía el hongo en Ia base del tallo y se incubó a una temperatura de 28°C, con alta humedad (Figura 3B). Como se puede apreciar en Ia Figura los clones expresando Ia proteína antípatogénica lograron altos niveles de resistencia nunca antes vistos frente a este patógeno del suelo que ocasiona grandes pérdidas en Ia fase de semillero de este cultivo. Este resultado demuestra que es factible el uso de esta proteína para el control de este hongo.
Ensayo de Ia resistencia a Phytophthora infestans en papa.
Esta prueba consistió en inocular el hongo Phytophthora infestans en plantas de papa transgénicas de 5 semanas de edad bajo condiciones controladas de luz, temperatura y humedad relativa. Se asperjaron 100 clones de 5 semanas, que expresan Ia proteína antipatogénica, con una suspensión de 106 zoosporas /mi. Los clones fueron mantenidos en condiciones controladas con una humedad relativa entre 85 - 95% y una temperatura de 230C. El porcentaje de hojas con síntomas fue utilizado como medida de susceptibilidad al patógeno una semana después de las inoculaciones (Figura 3C). Este fue un resultado inesperado, ya que este patógeno es extremadamente difícil de controlar. Como se puede ver en Ia figura, los clones expresando Ia proteína antípatogéníca mostraron altos niveles de resistencia, al compararlos con los controles utilizados. Este resultado señala el potencial para el uso de esta proteína en el control de este patógeno en particular, por su importancia a nivel mundial.
Ensayo de Ia resistencia a Alternaría solani en papa.
Se inoculó el hongo Alternaría solani en 100 plantas de papa transgénicas de 5 semanas de edad bajo condiciones controladas de luz, temperatura y humedad relativa. Los clones fueron asperjados con una suspensión de 106 esporas/ml. Los clones fueron mantenidos en condiciones controladas con una humedad relativa entre 85 - 95 % y una temperatura de 2O0C. El porcentaje de hojas con síntomas fue utilizado como medida de susceptibilidad al patógeno una semana después de las inoculaciones (Figura 3D). Los tres clones analizados mostraron altos niveles de resistencia a este patógeno Io cual brinda un potencial por primera vez para el uso de esta proteína para su control.
Ejemplo 4. Construcción del vector para Ia expresión de Ia proteína antipatogénica NmDef-02, de forma extracelular, en el sobrenadante de cultivo de Pichia pastoris. El gen que codifica para Ia proteína antipatogénica de N. megalosiphon fue aislado utilizando los oligonucleótidos específicos correspondientes a las SEQ ID No. 4 y SEQ ID No. 5 para obtener Ia secuencia completa del gen que codifica para Ia proteína antipatogénica NmDef-02, con los sitios de restricción enzimática Xho I / EcoR I, necesarios para su clonaje en el vector de expresión pPIC9k. Esta estrategia de clonaje adiciona a Ia proteína de interés en el extremo amino-terminal el peptido señal del factor alfa de Saccharomyces cerevisiae (Figura 1B), por Io que Ia proteína resultante se corresponde con Ia SEQ ID No. 7. El plásmido fue linealizado con BgI Il antes de transformar Ia cepa de GS115 de P. pastoris. La transformación se llevó a cabo por electroporación. La cepa GS115 es un muíante auxotrófico his3 Ia cual adquiere un fenotipo HiS+ después de Ia transformación. Los transformantes HiS+ fueron seleccionados en medio mínimo con dextrosa, los clones fueron cultivados en medio mínimo con glicerol e inducidos con metanol durante 126 horas a 280C.
Los clones transformantes se identificaron mediante Dot Blot. Utilizando Ia técnica de Southern Blot se determinó en cuales Ia integración había ocurrido por sustitución del gen AOX1 de P. pastoris por el cásete de expresión del plásmido recombinante, Io cual se corresponde con un fenotipo Muts (baja utilización de metanol) e HiS+. P. pastoris secreta bajos niveles de proteínas propias y su medio de cultivo no necesita suplementos proteicos, por Io que se puede esperar que una proteína heteróloga que se secreta al medio extracelular, constituya Ia mayoría del total de proteínas en el sobrenadante de cultivo (más de un 80%) (Tschopp et al. (1987) Bio/Technology 5:1305-1308). La expresión de Ia proteína antipatogénica en P. pastoris se llevó a cabo en termentadores de 5 litros mediante Ia adición de metanol al medio de cultivo. La expresión de Ia proteína antipatogénica recombinante y su integridad se chequearon mediante espectrometría de masas. Ejemplo 5. Purificación y ensayo de Ia actividad biológica de Ia proteína antipatogénica.
La proteína antipatogénica unida al péptido señal del factor alfa (NmDef-Plus) se purificó a partir del sobrenadante del cultivo, mediante diálisis en 25 mM de acetato de sodio a pH 4,5; el producto de Ia diálisis se pasó a través de una resina de intercambio catiónico CM-Sepharosa Fast-flow equilibrada con 25 mM de acetato de sodio, pH 4,5; y las proteínas se eluyeron con 1 M de cloruro de sodio, 50 mM de Tris pH 7,6. Las fracciones que contenían Ia proteína se colectaron y se concentraron utilizando un sistema de ultracentrifugación con una membrana con un tamaño de poros (cut-off) de 3 kDa. Para Ia detección se empleó una longitud de onda de 254 nm. La purificación se chequeó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con Dodecilo sulfato de sodio (abreviado SDS-PAGE, del inglés Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide GeI Electrophoresis) (Tris-Glicina) al 15% y las proteínas se visualizaron por tinción con plata (Figura 2). La actividad antifúngica de Ia proteína antipatogénica se cuantificó a través del método espectrofotométrico y del análisis del micelio mediante tinción con lactofenol azul a través de microscopía óptica (Térras et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 14301- 15309). La evaluación se llevó a cabo en placas de 96 pozos, en los cuales se añadieron 50 μL de medio líquido papa-dextrosa, 50 μL de Ia suspensión de esporas de los hongos patógenos y 20 μL de Ia proteína antipatogénica parcialmente purificada. El porcentaje de inhibición del crecimiento (PIC) de los patógenos fue determinado según Io reportado anteriormente (Térras et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 14301- 15309), mediante Ia siguiente ecuación:
DO595 nm control - DO595 nm tratamiento PIC = x 100
DO595 nm control
La relación entre los porcentajes de inhibición proviene de Ia aplicación de Ia ecuación anterior a las lecturas realizadas (a 595 nm) de los controles y de las muestras tratadas, a las 48 horas después de iniciado el ensayo (Figura 4A).
La proteína antipatogénica sin el péptido señal del factor alfa fue sintetizada químicamente, y se evaluó su efecto sobre el hongo P. infestans a diferentes concentraciones según Io reportado anteriormente (Térras et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 14301-15309) (Figura 4B). Como se puede apreciar en las figuras 4A y 4B1 Ia proteína antipatogénica logró altos niveles de inhibición del crecimiento frente a hongos fitopatógenos de plantas, ya sea unida al péptido señal del factor alfa o sintetizada químicamente sin el péptido. Fue muy interesante observar, por primera vez, como logra Ia inhibición de importantes patógenos de las plantas, resultado no logrado hasta el momento por otras proteínas antifúngicas reportadas hasta el momento.
Otro resultado no esperado y que permite el empleo de esta proteína antipatogénica con un amplio espectro de acción, fueron los grandes niveles de inhibición que mostró frente a bacterias fitopatógenas (Tabla 1 ). Tabla 1. Efecto de Ia proteína antipatogénica NmDef-02 sobre bacterias fitopatógenas.
Especies de bacterias IC50 (μM)
Xanthomonas campestris p.v. phaseoli 40 ± 3
Pseudomonas syringae p.v. syringae 26 ± 6
Erwinia carotovorum p.v. carotovora 86 ± 8
Pseudomonas avenae 17 ± 5
Erwinia chrysanthemi p.v. zea 11 ± 8 i bacteria es inhibido en un 50 %. ± Desviación estándar de Ia media. Ejemplo 6. Demostración del control de una formulación de Ia proteína antipatogénica NmDef-02 sobre hongos del suelo y aéreos.
Semillas de Ia especie N. tabacum fueron tratadas con Ia formulación de Ia proteína antipatogénica (9 μg / mi) y alginato de sodio al 5 %, luego germinadas en potes de 6 pulgadas que contenían turba negra y cascara de arroz en una proporción (4:1 ) y mantenidas en casas de cultivo a 23°C. Como controles se utilizaron tratamientos con hipoclorito de sodio al 10 % y otras sin ningún tipo de tratamiento. Las evaluaciones se realizaron a los 30 días y se determinó el porcentaje de plantas muertas producto de Ia infección natural (Figura 5A). Por otra parte, 100 plantas en casas verdes fueron asperjadas con Ia formulación de Ia proteína antipatogénica a una concentración del principio activo de 5 μg / mi y alginato de sodio al 5 %. Como controles se utilizaron aspersiones con el fungicida Benomil a una concentración de 40 g / L y agua. Se evaluó el porcentaje de hojas con síntomas, producto de Ia infección natural, a los 45 días de aplicado los tratamientos (Figura 5B).
Como se puede apreciar en las figuras 5A y 5B Ia formulación de Ia proteína antipatogénica logró el control de hongos del suelo y de hojas en comparación con los controles utilizados, resultados no reportados hasta el momento, Io que permite el uso de esta proteína como un bioproducto en el control de patógenos de las plantas.
Ejemplo 7. Actividad biológica de fragmentos de Ia proteína antipatogénica NmDef-02.
Fragmentos de Ia proteína antipatogénica NmDef-02 fueron obtenidos por síntesis química (SEQ ID No. 8 y SEQ ID No. 9). El efecto sobre el hongo P. infestans fue evaluado a diferentes concentraciones según Io reportado (Térras et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 14301-15309), Io cual se muestra en Figura 6. El resultado obtenido permite el uso de fracciones de Ia proteína para lograr el control o inhibición de patógenos sobre todo cuando se emplea Ia fracción de Ia proteína de Ia SEQ ID No 9.

Claims

REIVINDICACIONESSECUENCIAS DE ÁCIDO NUCLEICO Y AMINOÁCIDOS PARA EL CONTROL DE AGENTES PATÓGENOS.
1. Un ácido nucleico que comprende Ia secuencia de ácido nucleico de Ia SEQ ID No. 1.
2. Un ácido nucleico que codifica para un polipéptido que comprende a) Ia secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID No. 6, ó b) una secuencia de aminoácidos donde uno o varios residuos aminoacídicos se han eliminado, sustituido y añadido a Ia secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID No. 6, y que mantiene sus propiedades de controlar Ia infección por agentes patógenos.
3. Método para aumentar Ia resistencia a enfermedades de plantas producidas por agentes patógenos, mediante Ia transformación genética de Ia planta con una secuencia de ácido nucleico que comprende Ia secuencia de ácido nucleico de Ia SEQ ID No. 1 , que conduce a Ia expresión constitutiva o inducida de Ia proteína antipatogénica que comprende Ia SEQ ID No. 6.
4. Un polipéptido que comprende Ia secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID No. 6 o SEQ ID No. 7.
5. Un polipéptido que comprende en su cadena polipeptídica una secuencia de aminoácidos con al menos un 60% de homología con Ia SEQ. ID No.6.
6. Un polipéptido según las reivindicaciones 4 y 5, que se obtiene por vía recombinante o por síntesis química.
7. Un polipéptido según Ia reivindicación 6, donde Ia expresión por Ia vía del ADN recombinante se realiza en Pichia pastoris, preferentemente en el sobrenadante de cultivo.
8. Un bioproducto para el control de agentes patógenos que comprende un polipéptido identificado como SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7 o un polipéptido con al menos un 60% de homología con Ia SEQ. ID No. 6.
9. Un bioproducto según Ia reivindicación 8, donde el polipéptido es purificado a partir de un hospedero transformado genéticamente, o se emplea directamente contenido en el sobrenadante de un cultivo de dicho hospedero.
10. Un bioproducto según Ia reivindicación 9, donde el hospedero es P. pastorís.
11. Un bioproducto según Ia reivindicación 8, donde el agente patógeno es un hongo fitopatógeno.
12. Un bioproducto según Ia reivindicación 8, donde el polipéptido está en el rango de concentración entre 1 a 9 μg / mi.
13. Un bioproducto para el control de agentes patógenos que comprende un fragmento del polipéptido identificado como SEQ ID No. 6 o SEQ ID No. 7 14. Método para el control de agentes patógenos de plantas que se caracteriza por Ia aplicación del bioproducto de Ia reivindicación 8 a las plantas. 15. Método para el control de agentes patógenos de plantas que se caracteriza por Ia aplicación del bioproducto de Ia reivindicación 8 en unión con bioplaguicidas. 16. Una planta modificada genéticamente con Ia secuencia de ácido nucleico de
Ia SEQ ID No. 1 para aumentar su resistencia a enfermedades de plantas producidas por agentes patógenos.
PCT/CU2009/000003 2008-03-28 2009-03-27 Secuencias de ácido nucleico y aminoácidos para el control de agentes patógenos. WO2009117975A1 (es)

Priority Applications (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP09723850.5A EP2298922B1 (en) 2008-03-28 2009-03-27 Amino acid and nucleic acid sequences for controlling pathogens
JP2011501095A JP5466224B2 (ja) 2008-03-28 2009-03-27 病原体を制御するためのアミノ酸及び核酸配列
US12/934,685 US8450559B2 (en) 2008-03-28 2009-03-27 Nucleic and amino acid sequences for the control of pathogen agents
ES09723850.5T ES2619512T3 (es) 2008-03-28 2009-03-27 Secuencias de ácido nucleico y aminoácidos para el control de agentes patógenos
CN2009801191643A CN102046798B (zh) 2008-03-28 2009-03-27 用于控制致病体的核酸序列和氨基酸序列
CA2719765A CA2719765C (en) 2008-03-28 2009-03-27 Nucleic and amino acid sequences for the control of pathogen agents.
BRPI0910421-6A BRPI0910421B1 (pt) 2008-03-28 2009-03-27 Método para aumentar resistência a doenças de plantas,polipeptídeo, bem como composição e método para controlar agentes patogênicos de plantas
ZA2010/07140A ZA201007140B (en) 2008-03-28 2010-10-06 Amino acid nucleic acid sequences for controlling pathogens
US13/865,437 US9055744B2 (en) 2008-03-28 2013-04-18 Nucleic and amino acid sequences for the control of pathogen agents

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CU2008-0045 2008-03-28
CU20080045A CU23688A1 (es) 2008-03-28 2008-03-28 Secuencias de ácido nucleico y aminoácidos para el control de agentes patógenos

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US12/934,685 A-371-Of-International US8450559B2 (en) 2008-03-28 2009-03-27 Nucleic and amino acid sequences for the control of pathogen agents
US13/865,437 Division US9055744B2 (en) 2008-03-28 2013-04-18 Nucleic and amino acid sequences for the control of pathogen agents

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2009117975A1 true WO2009117975A1 (es) 2009-10-01

Family

ID=40796170

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/CU2009/000003 WO2009117975A1 (es) 2008-03-28 2009-03-27 Secuencias de ácido nucleico y aminoácidos para el control de agentes patógenos.

Country Status (13)

Country Link
US (2) US8450559B2 (es)
EP (1) EP2298922B1 (es)
JP (1) JP5466224B2 (es)
KR (1) KR101598030B1 (es)
CN (1) CN102046798B (es)
AR (2) AR071085A1 (es)
CA (1) CA2719765C (es)
CL (1) CL2009000770A1 (es)
CU (1) CU23688A1 (es)
ES (1) ES2619512T3 (es)
PL (1) PL2298922T3 (es)
WO (1) WO2009117975A1 (es)
ZA (1) ZA201007140B (es)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6388917B2 (ja) 2013-04-29 2018-09-12 アグロサーフエ・エン・フエー ポリペプチドからなる農薬組成物
EP3215624B1 (en) 2014-11-05 2023-11-29 Biotalys NV Transgenic plant comprising a polynucleotide encoding a variable domain of heavy-chain antibody

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997037024A2 (en) * 1996-03-29 1997-10-09 Monsanto Company Antifungal polypeptide and methods for controlling plant pathogenic fungi
WO2006085965A2 (en) * 2004-06-30 2006-08-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods of protecting plants from pathogenic fungi
WO2008080014A2 (en) * 2006-12-22 2008-07-03 Donald Danforth Plant Science Center Antifungal plant proteins and methods of their use

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997037024A2 (en) * 1996-03-29 1997-10-09 Monsanto Company Antifungal polypeptide and methods for controlling plant pathogenic fungi
WO2006085965A2 (en) * 2004-06-30 2006-08-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods of protecting plants from pathogenic fungi
WO2008080014A2 (en) * 2006-12-22 2008-07-03 Donald Danforth Plant Science Center Antifungal plant proteins and methods of their use

Non-Patent Citations (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BROEKAERT ET AL., PLANT PHYSIOL., vol. 108, 1995, pages 1353 - 8
COLILLA ET AL., FEBS LETT., vol. 270, 1990, pages 191 - 194
FANT F ET AL: "The three-dimensional solution structure of Aesculus hippocastanum antimicrobial protein 1 determined by <1>H nuclear magnetic resonance", PROTEINS: STRUCTURE, FUNCTION AND GENETICS, JOHN WILEY & SONS, INC, US, vol. 37, no. 3, 1 January 1999 (1999-01-01), pages 388 - 403, XP002404870, ISSN: 0887-3585 *
GAO AI-GUO ET AL: "Fungal pathogen protection in potato by expression of a plant defensin peptide", NATURE BIOTECHNOLOGY, NATURE PUBLISHING GROUP, NEW YORK, NY, US, vol. 18, no. 12, 1 December 2000 (2000-12-01), pages 1307 - 1310, XP002404684, ISSN: 1087-0156 *
GAO ET AL., NAT. BIOTECHNOL., vol. 18, 2000, pages 1307 - 1310
HOFGEN; WILLMITZER, NUCL. ACIDS RES., vol. 16, 1988, pages 9877
KAWATA ET AL., JARQ, vol. 37, 2003, pages 71 - 76
LAY F T ET AL: "Defensins - Components of the innate immune system in plants", CURRENT PROTEIN AND PEPTIDE SCIENCE, BENTHAM SCIENCE PULBISHERS, NL, vol. 6, no. 1, 1 February 2005 (2005-02-01), pages 85 - 101, XP009119234, ISSN: 1389-2037 *
LAY Y ANDERSON, CURR PROTEIN PEPT SCI., vol. 6, 2005, pages 85 - 101
ODINTSOVA ET AL: "Seed defensins from T. kiharae and related species: Genome localization of defensin-encoding genes", BIOCHIMIE, MASSON, PARIS, FR, vol. 89, no. 5, 3 May 2007 (2007-05-03), pages 605 - 612, XP022059555, ISSN: 0300-9084 *
TERRA ET AL., PLANT CELL, vol. 7, 1995, pages 573 - 588
TERRAS ET AL., J. BIOL. CHEM., vol. 267, 1992, pages 14301 - 15309
THOMMA B P H J ET AL: "Plant defensins", PLANTA, SPRINGER VERLAG, DE, vol. 216, no. 2, 1 December 2002 (2002-12-01), pages 193 - 202, XP002404682, ISSN: 0032-0935 *
THOMMA ET AL., CURR DRUG TARGETS INFECT DISORD., vol. 3, 2003, pages 1 - 8
THOMMA ET AL., PLANTA, vol. 216, 2002, pages 193 - 202
TSCHOPP ET AL., BIO/TECHNOLOGY, vol. 5, 1987, pages 1305 - 1308
WALSH ET AL., MEDICAL MYCOLOGY, vol. 38, 2000, pages 335 - 347
ZAMBRYSKI ET AL., EMBO JOURNAL, vol. 2, 1983, pages 2143 - 2150

Also Published As

Publication number Publication date
BRPI0910421A2 (pt) 2015-08-18
AR107435A2 (es) 2018-05-02
US9055744B2 (en) 2015-06-16
ZA201007140B (en) 2011-06-29
US8450559B2 (en) 2013-05-28
PL2298922T3 (pl) 2017-06-30
US20130217618A1 (en) 2013-08-22
EP2298922B1 (en) 2016-12-21
CU23688A1 (es) 2011-07-11
JP5466224B2 (ja) 2014-04-09
US20110124581A1 (en) 2011-05-26
ES2619512T3 (es) 2017-06-26
CA2719765A1 (en) 2009-10-01
KR20110053401A (ko) 2011-05-23
CA2719765C (en) 2019-09-17
AR071085A1 (es) 2010-05-26
JP2011515092A (ja) 2011-05-19
CL2009000770A1 (es) 2010-05-07
CN102046798A (zh) 2011-05-04
KR101598030B1 (ko) 2016-02-29
CN102046798B (zh) 2013-05-01
EP2298922A1 (en) 2011-03-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105861517B (zh) 一种三七抗菌肽基因PnSN1及其应用
JP2000502891A (ja) 抗真菌性タンパク質
KR101957550B1 (ko) 항진균성 식물 단백질, 펩티드 및 사용 방법
ES2225835T3 (es) Proteinas antimicrobianas.
Qiu et al. Panax notoginseng snakin gene increases resistance to Fusarium solani in transgenic tobacco
ES2619512T3 (es) Secuencias de ácido nucleico y aminoácidos para el control de agentes patógenos
CA2296046A1 (fr) Gene chimere codant pour la drosomicine, vecteur le contenant et obtention des plantes transgeniques resistantes aux maladies
US20210054034A1 (en) Compositions and methods for protecting hosts against pathogen infections
CN114875040A (zh) 花生AhDef2.2基因及其鉴定方法和应用
BRPI0910421B1 (pt) Método para aumentar resistência a doenças de plantas,polipeptídeo, bem como composição e método para controlar agentes patogênicos de plantas
BRPI0808895A2 (pt) Proteína de resistência a insetos derivadas de uma planta, gene de resistência a insetos, vetor recombinante, célula hospedeira, c~elula de planta, transformante, método para produzir um transformante, proteína e agente de resistência a insetos
CA2391128C (en) A method of making transgenic plants expressing a cecropin-mellitin hybrid cationic peptide imparting broad-spectrum pathogen resistance
Hidalgo kk Ciudad de la Habana Hoen ef gkkS “Storage of Competent Cells for Agrobacterium Trans
Stephen In vitro evaluation of linear plant host defense peptides Shepherin 2, Skh-AMP1, Cn-AMP1, and Cr-ACP1 for cytotoxicity and antimicrobial activities against potato pathogens
WO1999009189A1 (fr) Gene codant pour l&#39;androctonine, vecteur le contenant et plantes transformees obtenues resistantes aux maladies
Prokchorchik Molecular analysis of plant innate immunity triggered by secreted effectors from bacterial and fungal pathogens of apple
CN114480484A (zh) 番茄转录因子基因SlNAC2的应用
Prokchorchik Molecular analysis of plant innate immunity triggered by secreted effectors from bacterial and fungal pathogens of apple: a thesis presented in partial fulfilment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy (PhD) in Plant Science, Institute of Agriculture and Environment, Massey University, New Zealand
Nidadavolu Characterization and functional analysis of virulence factor Snod1 from Botrytis cinerea
Jalloh The Salicylic Acid Pathway is Involved in Arabidopsis thaliana Non-host Resistance to Phytophthora capsici
MXPA97009049A (es) Control de gusano de raiz de maiz a traves de la formacion de limoneno en plantas transgenicas

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200980119164.3

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 09723850

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2027/MUMNP/2010

Country of ref document: IN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 12934685

Country of ref document: US

Ref document number: 2719765

Country of ref document: CA

Ref document number: 2011501095

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2009723850

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2009723850

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20107024296

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: PI0910421

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20100928