KR101598030B1 - 병원체 제어용 핵산 및 아미노산 서열 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항-병원성 단백질을 암호화하는 Nicotiana megalosiphon으로부터의 핵산 서열을 개시하고 있다. 본 발명은 변원체에 대한 내성을 부여하기 위해 목적하는 형질 전환 농작물에서 이러한 핵산 분자의 용도를 포함한다. 또한, 본 발명은 식물 병원체를 제어하기 위해 이러한 항-병원성 단백질을 포함하는 생물 소재를 포함한다.

Description

병원체 제어용 핵산 및 아미노산 서열{NUCLEIC AND AMINO ACID SEQUENCES FOR THE CONTROL OF PATHOGEN AGENTS}
본 발명은 농생물학 분야에 관한 것으로, 보다 상세하게는 병원체의 제어에서 항-병원성 단백질의 용도에 관한 것이다. 상기 항-병원성 단백질이 유전적으로 변형된 식물에서의 이의 발현에 의해, 또는 생물 소재로서 적용되는 경우 식물의 변원체에 의해 발병된 질환에 대한 높은 수준의 제어가 달성된다.
식물의 항-병원성 단백질은 나뭇잎, 엽초, 뿌리, 덩이줄기, 나무줄기, 열매 및 꽃으로부터 분리하였으며, 무, 양파, 거여목속(屬)의 식물(medic), 후추, 감자 및 야생콩(soja)과 같은 농작물로부터 분리하였다. 항-병원성 단백질은 생화학적 및 구조적 단계에서 연구가 이루어 졌으며, 이들은 45 내지 54개의 아미노산으로 이루어진 작은 펩티드로서 약 5 KDa의 분자량을 가지며, 시스테인이 풍부하며, 고도로 염기성이며, 양전하로 하전되어 있다. 상기 항-병원성 식물 단백질의 부류는 아미노산 조성에 있어서 다양한데, 이는 구조를 안정화시키는 8개의 시스테인이 보존되어 있기 때문이다. 이러한 특성은 다른 항-병원성 식물 단백질에 의해 나타나는 다양한 생물 활성을 보여준다.(문헌[Broekaert 등, (1995) Plant Physiol. 108:1353-8}).
상기 항-병원성 식물 단백질들은 단백질 전구체의 구조에 따라 2개의 그룹으로 나눌 수 있는데; 첫 번째 그룹에서는 상기 단백질 전구체는 소포체로부터의 단일 펩티드 및 성구한 단백질 도메인으로 구성된다. 이러한 단백질은 분비선 방식으로 진입하며, 전사후 공정을 위한 신호를 나타내지 않는다. 두 번째 그룹에서는 상기 항-병원성 단백질은 신호 펩티드 및 성숙한 도메인의 이면에 약 33개의 아미노산의 C-말단 프리도메인(pre-domain)을 포함하는 긴 전구체에 의해 형성된다. 현재까지, 이들 항-병원성 단백질들은 Solanaceae 종에서만 발견되었다(문헌[Lay y Anderson (2005) Curr Protein Pept Sci. 6:85-101)). 상기 항-병원성 식물 단백질 모두가 동이한 작용을 하는 것은 아니며, 일부는 생체내에서 마이크로몰 수준의 농도에서 광범위한 종류의 사상균(filamentous fungus)에 대해 강력한 활성을 나타내며, 다른 단백질은 상기 사상균의 성장을 억재하지 않지만, α-아밀라제 및 합성 단백질을 억제한다(문헌[Colilla 등, (1990) FEBS Lett. 270: 191-194]).
Shai-Matsuzaki-Huang 모델에서는 상기 항-병원성 단백질 대분의 활성을 설명하고 있으며, 이는 원형질막과 상기 펩티드의 상호작용을 설명하며, 지질 변위 이후에 표적 세포 표면의 음으로 하전된 인지질과의 상호작용의 발생 이후에 세포막에서 양으로 하전된 단백질의 삽입으로 인해 원형질 막 내부에 있는 다중결합성 공극을 형성한다. 그 결과, 이들 다중결합성 공극은 전압 의존성, 이온 투과성 채널을 구성하게 된다(문헌[Thomma 등, (2002) Planta 216:193-202]).
다른 모델은 많은 항-병원성 단백질들이 세포질 막의 투과에 의해서 뿐만 아니라 세포질 표적들에 의해서 이들 작용을 야기한다는 이론에 기반을 두고 있으며, 이들 표적 세포 내부의 단백질들은 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA) 및 단백질의 합성에 영향을 미친다. 이는, 양이온성 단백질이 세포질 막의 투과를 유도하는 능력이 작용 기작에서 주요 원인이 아니라, 세포내 표적의 조사를 위한 방법일 수 있다는 것을 암시한다(문헌[Thomma 등, (2003) Curr Drug Targets Infect Disord. 3:1-8]).
현재까지, 많은 유형의 항-병원성 단백질들이 동정되어, 가능한 응용분야가 다양한 것으로 특징화되었는데, 이는 유전공학이 세포성 및 분자 기구를 통한 식물 질병에 대한 저항 전략을 제공하기 때문이다(문헌[Thomma 등, (2003) Curr Drug Targets Infect Disord. 3:1-8]). 무의 항-병원성 단백질의 구조적 발현은 나뭇잎의 병원균인 Alternaria longipes에 대한 담배 저항성을 증가시키며,(문헌[Terra 등, (1995) Plant Cell 7: 573-588]), Alternariasolani를 포함한 토마토 식물에서도 동일한 방식으로 일어나는 것으로 증명되었다. 또한, 항-병원성 단백질의 구조적인 발현은 노지 조건하에서 감자 농작물에서 작물학적 중요성이 있는 진균인 erticillium dahliae에 대해 높은 내성을 제공한다(문헌[Gao 등 (2000) Nat. Biotechnol. 18: 1307-1310]).
한편, Brassica oleracea 및 B. campestris 종의 항-병원성 단백질 유전자를 발현하는 벼는 상이한 위치에 아미노산을 치환하기 위해 변형되어, 아열대 및 열대 국가에서 매우 주요한 의미를 갖는 Magnapothe grisea 및 Xanthomonas oryzae 질병에 대한 내성이 확인된 벼에 개별적으로 도입되고 있다. 이들 항-병원성 단백질들은 상기 질병 둘 모두에 효과적인 내성을 부여하며, 이들 유전자의 변형은 형질전환 벼에서 광범위한 내성을 증가시킨다(문헌[Kawata 등, (2003) JARQ 37: 71 - 76]).
병원균의 공격으로 인한 농작물 손실을 줄이기 위한 대안으로서 상기 항-병원성 식물 단백질의 적용은 화학 농약의 적용에 대한 이점을 갖는다. 먼저, 항-병원성 식물 단백질들은 씨앗, 뿌리 및 덩이줄기들로부터 유래하며, 이로 인해 이들은 숙주 식물뿐만 아니라, 이들 식물로부터의 생산품을 소비하는 인간에도 독성이 없는 천연 물질을 포함한다. 두 번째로, 기타 단백질로서 상기 항-병원성 단백질들은 자신의 효율성을 사라진 이후에 천연 물질처럼 신속하게 분해되어, 임의의 잔류물이 존재하지 않게 된다(문헌[Thomma 등, (2003) Curr Drug Targets Infect Disord. 3:1-8]).
또한 상기 항-병원성 식물 단백질은 항-진균 약물의 개발용으로 사용될 수 있는데, 이는, 기회 감염성 병원균(opportunist pathogen)으로서 인식되는 다중 약물 저항성 균주의 발생 및 효모와 같은 새로운 종의 사상균의 출현이 외에도, 항상 진핵성 병원균의 제어가 상기 약물에서의 주요 문제점들 중 하나를 이루고 있어, AIDS, 암 및 조직 이식과 같은 질병으로 인해 지난 수 십년 동안 면역-억제된 환자의 증가를 초래했다(문헌[Thomma 등, (2003) Curr Drug Targets Infect Disord. 3:1-8]).
동물 세포와 병원균 세포 사이의 유사성으로 인해 항-진균성 화합물은 세포벽의 성분 및 독성 인자와 같은 포유동물 세포에 존재하지 않거나 희귀하게 존재하는 분자에 대해 작용해야 한다. 그리고 이들은 광범위한 작용 스펙트럼을 가지면서 가능한 한 천연적인 생성물일 수 있으며, 생산하기 쉬우며, 저항성을 유도하지 않아야 한다(문헌[Walsh 등, (2000) Medical Mycology, 38: 335-347]). 한편, 스핑고지질(sphingolipid)과 같이 진균의 세포막의 성분은 포유동물 세포에서 구조적으로 상이하기 때문에 이들 세포막들은 이들 약제 개발을 위한 흥미로운 표적이다. 상기 항-병원성 식물 단백질들은 스핑고지질의 생합성을 표적으로 하지 않지만, 이들의 표적이 오히려 상기 진균의 막의 투과를 유도하는 스핑고지질 자신이기 때문에 전적으로 반대로 작용한다. 이는 높은 선택성을 제공하며, 따라서 진균 감염의 치료를 위한 흥미로운 전망을 제공한다. 몇몇 항-병원성 식물 단백질들은 Dm-AMP1, Hs-AFP1 및 Rs-AFP2로서 발견되었으며, 이들은 인간에 있어서 임상적으로 매우 중요한 병원균인 Candida albicans에 대한 마이크로몰 수준의 농도에서 활성을 나타내며, 이는 치료제 개발을 위한 이러한 유형의 식물 단백질의 잠재성을 일예로 구성하게 된다(문헌[Thomma 등, (2003) Curr Drug Targets Infect Disord. 3:1-8]).
해결되어야 할 중요한 문제점은, 농업 및 의약 분야에서 탁월한 중요성 측면에서 광범위한 진균성 병원균 및 세균성 병원균을 효과적으로 제어할 수 있는 단백질 기원의 항-병원성 생성물을 달성하는 것이다.
본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위해 구성된 것으로, Nicotiana megalosiphon로부터 단리된 신규한 항-병원성 단백질의 뉴클레오티드 염기서열(서열 번호: 1) 및 아미노산 서열(서열 번호: 6)을 제공한다. 본 발명의 뉴클레오티드 염기서열은 몇몇 병원체에 대해 현저한 효과를 나타내는, 작으면서도 시스테인이 풍부한 단백질을 암호화한다.
또한 본 발명의 목적은 a) 서열 번호: 6과 같은 동정된 아미노산 서열 또는 b) 하나 또는 일부 아미노산 잔기가 서열 번호: 6으로서 아미노산의 동정된 서열에서 제거, 치환 및 첨가된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 제공하는 것으로, 상기 서열 번호: 6의 아미노산 서열은 병원체에 의한 감염을 제어하는 특성을 유지한다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 항-병원성 단백질을 암호화하는 유전자는 몇몇 병원체에 대해 저항성 준위를 향상시키고 이들에 대한 식물의 방어를 증강시키기 위해 사용된다. 따라서 본 발명은 상기 서열 번호: 6의 항-병원성 단백질의 구조적 및 유도 발현을 야기하는 서열 번호: 1의 핵산 서열을 이용한 식물의 유전적 형질전환을 통해 병원체에 의해 야기된 식물 질병에 대한 저항성을 증가시키는 방법을 포함한다.
본 발명의 목적인 핵산 분자들은 식물의 형질전환용으로 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 항-병원성 단백질을 암호화하는 DNA 서열은 하기 식물 종의 형질전환용으로 사용될 수 있다: Zea mays, Brassica 종, Medicago sativa, Oryza sativa, bicolor Sorghum, Sorghum vulgare, Pennisetum glaucum, Helianthus annuus, Triticum aestivum, Glycine max, Nicotiana tabacum, Solanum tuberosum, Ipomoea 고구마, Manihot esculenta, Coffea spp., Coconuts nucifera, Pineapples comosus, Citrus spp., Theobroma cocoa, Camellia sinensis, Muse 아종, American Persea, Ficus casica, Psidium guajava, Mangifera indicates, Carica papaya, Beta vulgaris, Saccharum spp., Lycopersicon esculentum, Lactuca sativa, Phaseolus vulgaris, Cucumis sativus, Cucumis melo, Hibiscus rosasanensis, Rosa spp., Tulipa spp., Pinus taeda, Pinus elliotii, ponderous Pinus, Pinus contorta, 및 Pinus radiata.
본 발명은 상기 항-병원성 단백질을 생성하는 농업용으로 중요한 식물을 얻기 위해 다양한 방법에서 사용될 수 있다. 이러한 방식으로, 상기 항-병원성 단백질을 암호화하는 상기 핵산 서열(서열 번호: 1)은 농업용으로 중요한 식물에 도입되는 프로모터와 함께 사용될 수 있다. 구조 프로모터는 항-병원성 단백질로부터 높은 준위의 발현을 위해 사용될 수 있다. 다른 양태에서, 상기 항-병원성 단백질을 암호화하는 서열은 조작된 후, 특정 프로모터에 융합되어 병원균에 민감한 식물의 특정 조직 내로의 발현을 유도한다. 본 발명의 다른 목적은 서열 번호: 6 또는 서열 번호: 7로 표시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다. 이들 임의의 폴리펩티드들은 병원체에 대한 생물 활성을 갖는데, 본 발명에서는 이들에 대해 항-병원성 단백질로서 명명하였다. 본 발명의 다른 목적은 서열 번호:6과 60% 이상의 상동성을 갖는 폴리펩티드로부터 유래한 아미노산 서열이다.
바람직한 실시예에서, 본 발명의 폴리펩티드 또는 항-병원성 단백질들은 재조합 방법 또는 화학적 합성용으로 수득된다. 본 발명의 항-병원성 단백질들은 상이한 숙세 시스템에서 DNA 재조합 기법에 의해 발현될 수 있으며, 이들로부터 단리될 수 있다. 본 발명의 구현예에서, 상기 항-병원성 단백질은 효모에서 발현될 수 있다. 바람직한 구현예에서, DNA 재조합 방법용 발현은 Pichia pastoris에서 수행되며, 바람직하게는 배양 상층액에서 수행된다. 숙주로부터 출발하여, 본 발명의 폴리펩티드들은 단백질 단리 기법을 적용하여 수득될 수 있다. 정제 공정은 기술적 면역 효소학적 공정, 크로마토그래피 공정 및 세포 침전 및 기타 실제 공지된 공정을 이용하여 달성될 수 있다.
아미노산 서열(서열 번호: 6)의 변이체들은 펩티드와 융합되거나, 이들은 숙주의 특정 구역에 대한 발현을 유도하며, 이러한 분자에 대해 증명된 생물 활성을 유지하며, 또한 이들 변이체들은 본 발명의 목적이다. 일 예로는 서열 번호: 7로 표시되는 서열을 갖는 융합된 단백질이다. 상기 항-병원성 단백질의 단편들은 병원체에 대한 제어 활성을 보유하고 있는 서열 번호: 8 및 서열 번호: 9와 같은 서열목록에서 동정되었으며, 이들 또한 본 발명의 목적이다. 본 발명의 다른 양태는 서열 번호: 6 또는 서열 번호: 7로서 동정된 병원체 제어용 생물 소재, 또는 서열 번호: 6과 60% 이상의 상동성을 갖는 폴리펩티드이다.
본 발명에서 이들 항-병원성 단백질들이 생물 소재에 최초로 사용하였으며, 상기 생물 소재는 병원체에 의해 발생한 주요 식물 질병에 대한 높은 보호 준위를 제공하며, 안정성이 높으며 오염 발생이 낮아서, 이들을 이용하녀 대중 인식이 좋아지며, 조절적인 요건이 완화된다. 본 발명의 항-병원성 단백질을 포함하는 생물 소재는 이전에는 보고되지 않았지만 진균 및 박테리아에 대한 높은 보호 준위를 유도한다. 상기 생물 소재를 달성하기 위해 상기 항-병원성 단백질은 현탁제, 용제, 유제, 분말, 과립, 유화 농축액, 에어로졸, 함침형 과립, 과립 보조제, 파스퇴르 공정 및 과립 공정을 통해 제제화될 수 있다. 본 발명의 구현예에서, 상기 생물 소재는 유전적으로 형질 전환된 숙주로부터의 정제된 폴리펩티드를 포함하거나, 이러한 숙주의 배양 상층액에 직적 포함시켜 사용될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 상기 숙주는 P. pastoris이다.
본 발명의 구현예에서, 서열이 청구되어 있는 상기 항-병원성 단백질을 사용할 수 있으며, 또한 상기 단백질을 포함하는 생물 소재가 하기와 같은 매우 다양한 병원균의 제어를 위해 최초로 사용될 수 있다: Aspergillus, Penicilium, Alternaria (Alternaria brassicola Alternaria solani Alternaria alternata); Bipolaris sacchari Botrytis cinerea Cercospora (Cercospora kikuchii Cercospora zaea-maydis Cercospora medicaginis Cercospora sojina Cercospora sorghi); Cladosporium fulvun Colletotrichum (Colletotrichum lindemuthianum Colletotrichum dematium Colletotrichum graminicola), Diplodia maydis Erysiphe (Erysiphe graminis f.sp. graminis Erysiphe graminis f.sp. hordei); Fusarium (Fusarium nivale Fusarium oxysporum Fusarium graminearum Fusarium culmorum Fusarium solani Fusarium moniliforme Fusarium roseum); Helminthosporium (Helminthosporium turcicum Helminthosporium carbonum Helminthosporium maydis); Maganaporthe grisea Mycosphaerella figensis Peronospora (Peronospora manshurica Peronospora tabacina); Phoma betae Phytophthora (Phytophthora cinnamomi Phytophthora cactorum Phytophthora phaseoli Phytophthora parasitica Phytophthora citrophthora, Phytophthora megasperma f.sp. sojae Phytophthora infestans), Puccinia (Puccinia sorghi Puccinia striiformis Puccinia graminis f.sp. tritici Puccinia asparagi Puccinia recondita Puccinia arachidis Puccinia melanocephala), Pythium (Pythium aphanidermatum Pythium ultimum); Pyricularia oryzae Rhizoctonia (Rhizoctonia solani Rhizoctonia cerealis); Scerotium rolfsii Sclerotinia sclerotiorum Septoria (Septoria lycopersici Septoria glycines Septoria nodorum Septoria tritici); Thielaviopsis basicola Ustilago (Ustilago maydis Ustilago scitaminea) Verticillium (Verticillium dahliae Verticillium alboatrum); Pseudomonas syringae p.v. glycinea Xanthomonas campestris p.v. phaseoli Xanthomonas campestris p.v. alfalfae Xanthomonas campestris p.v. translucens Pseudomonas syringae p.v. syringae Erwinia carotovorum p.v. carotovora Erwinia stewartii Clavibacter michiganense subsp. Nebraskense Pseudomonas avenae Erwinia chrysanthemi p.v. zea Erwinia carotovora Xanthomonas campestris p.v. holcicola, Pseudomonas andropogonis y Pseudomonas avenae. 바람직한 실시예에서, 상기 생물 소재들은 식물 진균의 제어용으로 유용하다. 본 발명의 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 1 내지 9μg/ml의 농도 범위로 상기 생물 소재 내에 포함된다.
또한, 식물의 변원체를 제어하기 위한 방법이 본 발명의 일부로서, 상기 방법은 서열 번호: 6 또는 서열 번호: 7로 표시된 동정된 폴리펩티드 또는 서열 번호: 6과 60% 이상의 상동성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 식물에 상기 생물 소재를 적용하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 다른 구체예에서, 식물 병원체 제어 방법은 생물 농약과 함께 본 발명의 생물 소재를 적용하는 것을 특징으로 한다. 병원체에 의해 야기된 식물 질병에 대한 저항성을 증가시키기 위한 서열 번호: 1로 표시된 핵산 서열 또는 서열 번호: 1의 핵산 서열을 갖는 유전적으로 변형된 식물 (형질전화 식물)도 또한 본 발명의 일부이다.
도 1은 식물(도1A) 및 효모(도 1B)에서 발현 벡터에 목적하는 항-병원성 단백질의 클로닝 전략을 보여준다.
도 2는 accharomyces cerevisiae의 알파 인자로부터의 신호 펩티드에 융합된 pPIC9K 벡터를 이용하여 Pichia pastoris에서 항-병원성 단백질의 발현을 보여준다. (A): P. pastoris 상층액에서의 상기 항-병원성 단백질의 발현 및 (B) 정제된 분획에서의 상기 항-병원성 단백질의 발현.
도 3은 형질전환 식물에서의 항-병원성 단백질이 구조적 발현을 위한 실험 및 질병 저항성 평가를 보여준다. 본 도면은 대조군 및 상기 항-병원성 단백질을 발현하는 형질전환 클론에서 질병 증상을 갖는 나뭇잎 및 줄기의 비율을 나타낸다. (도 3A): 담배 잎에 대한 Peronospora hyoscyami f. sp tabacina의 효과.(도 3B): 감자 잎에 대한 Alternate solani의 효과. (도 3C): 담배 줄기에 대한 Phytophthora parasitica의 효과. (도 3D): 감자 잎에 대한 Phytophthora infestans의 효과. 상기 도면에서 막대그래프는 하기를 나타낸다: a: 접종 대조군, b. 비접종 대조군, c. 클론 1.1, d. 클론 1.2, 및 e. 클론 1.3.
도 4는 서로 상이한 농도에서 몇몇 식물 병원균에 대한 항-병원성 단백질의 활성 실험을 보여준다. 그래프는 알파 인자의 신호 펩티드에 융합된 상기 항-병원성 단백질(A) 및 상기 신호 펩티드 없이 합성된 상기 항-병원성 단백질(B)의 상이한 농도로 조작된 액체 배지에서의 병원균의 성장 억제율을 보여준다. 도 4B의 도표에서, □: 상기 알파 인자의 신호 펩티드에 융합된 단백질의 Phytophthora infestans에 대한 효과, ■: 상기 신호 펩티드가 없는 단백질의 Phytophthora infestans에 대한 효과, 및 ■: 대조군.
도 5는 항-병원성 단백질인 NmDef-02 제제의 토양(A) 병원균 및 공기(B) 병원균에 대한 대조군 효과 실험을 보여준다. 도면에서 막대그래프는 하기를 나타낸다: ■: 대조군 식물, □: 살충제로 처리된 식물, ■: 상기 항-병원성 단백질 제제로 처리된 식물.
도 6은 상기 항-병원성 단백질인 NmDef-02 단편의 Phytophthora infestans에 대한 생물 활성을 보여준다. □: 서열 번호: 8의 펩티드의 Phytophthora infestans에 대한 효과, 및 ■: 서열 번호: 9의 펩티드의 Phytophthora infestans에 대한 효과.
실시예
실시예 1 . 식물재료의 준비, 및 Nicotiana megalosiphon로부터 항-병원성 단백질인 NmDef-02를 암호화하는 DNA의 단리 및 클로닝
블랙 크라우드(black crowd) 및 쌀 껍질을 4:1의 비율로 함유하고 있는 6인치 크기의 용기에서 상기 N. megalosiphon 종을 배양하고, 23℃의 온실 조건에서 방치하였다. 하마나 소재의 담배 밭에서 수집된 Peronospora hyoscyami f. sp. tabacina의 단리체는 접종에 사용하였다. 상기 접종은 6주령의 이러한 종의 식물에서 수행하였으며, 밀리리터 당 5 x 103 개의 포자 농도로 10μl식 수회 접종하였다. 식물을 습도(높은 습도는 비닐 봉투 내부에 물을 분사함으로써 달성되었다.)가 높은 검은색 비닐 봉투에 12시간 동안 넣어 두어 감염을 유도하였다.
접종 6주 후에 스핀용 총 RNA 추출 시스템(미국 위스콘신 주의 메디슨 소재의 Promega)을 이용하여 N. megalosiphon의 나뭇잎에서 총 RNA를 추출하였다. 최종적으로 cDNA 합성 시스템(Promega)을 이용하여 cDNA 이중 사슬을 합성하였다(cDNA).
상기 cDNA 라이브러리는 억제-감쇠형/교배-선택형 시스템(미국 캘리포니아 주의 팰러앨토 소재의 Clontech)을 이용한 감쇠형 교배를 이용하여 제조하였다. P. hyoscyami로 접종하고 접종 6주 후에 수확된 N. megalosiphon 식물로부터 수득된 cDNA는 감쇠용 시료로서 사용하였다. 상기 감쇠 라이브러리는 지첨서에 따라 pGEM-T 이지 벡터(Promega)에 클로닝하였다.
상기 cDNA의 서열 분석은 자동 염기서열 분석 장치를 이용하여 진행하였다. 서열 분석 이후에, 데이터베이스에 보고된 단백질과 상동성이 낮은 DNA 서열을 선택하였으며, 이를 이후 실험에 사용하였다.
실시예 2 : NmDef-02 항-병원성 단백질 유전자의 식물 형질전환
담배 형질전환 식물의 제조: 이중 벡터(binary vectors)의 구축
본 실험에서, 항-병원성 단백질을 암호화하는 유전자의 완전 cDNA를 서열 번호: 2 및 서열 번호: 3의 올리고뉴클로오티드로서 단리하고, 형질전환 벡터 "pCambia 2300"의 제한효소 부위인 Hind III/Pst I에 클론닝하였다(도 1A). Nicotiana tabacum 식물의 유전적 형질전환은 Zambryski 등의 방법(문헌[Zambryski 등, (1983) EMBO Journal, 2: 2143-2150)에 따라 수행하였다. 이를 위해, Agrobacterium tumefaciens 균주 AT 2260을 액체질소법(문헌[Hofgen and Willmitzer (1988) Nucl. Acids Res. 16: 9877])을 이용하여 상기에서 개발된 이중 벡터를 이용하여 형질전환하였다. 시험과내에서 배양된 다양한 Petit Havana SR 1의 N. tabacum 식물의 나뭇잎 화반을 형질전화시켰다. 카나마이신(kanamycin)을 표지 인자로서 100mg/L의 양으로 사용하였다. 상기 나뭇잎 화반을 재조합 아그로박테리아(Agrobacterium)와 함께 48시간 동안 Murashige & Skoog(MS)액체 배지에서 공-배양하였다. 담배 식물의 재생(4 내지 6주)은 25g/L의 수크로즈, 1mg/L의 6-벤실 아미노퓨린(BAP), 0.1mg/L의 아세트 나프탈렌산(ANA), 100mg/L의 카나마이신 및 500mg/L의 클라포란(Claf)을 함유하는 MS 배지 상에서 수행되었다. 식물 뿌리 형성(1 내지 3주)은 30g/L의 수크로즈, 100mg/L의 카나마이신 및 500mg/L의 Claf을 함유하는 MS 배지 상에서 수행하였다.
감자 형질전환 식물의 제조: 이중 벡터의 구축
본 실험에서, 항-병원성 단백질을 암호화하는 유전자의 완전 cDNA를 서열 번호: 2 및 서열 번호: 3의 올리고뉴클로오티드로서 단리하고, 형질전환 벡터 "pCambia 3300"의 제한효소 부위인 Hind III/Pst I에 클론닝하였다(도 1A). 조직 배양 및 형질전환 실험에 사용된 식물 재료는 감자인 "Desiree" 품종으로부터 시험관내 실물에서 추출하였다. 상기 식물을 MS 배지가 들어 있는 시험관에서 배양하였다. 상기 배양 배지의 pH는 5.7로 조정하였다. 배양 4주된 식물을 이용하였으며, 25℃의 실온에서 2000 Lux의 조명하에 방치하였다. 재생 및 형질전환 실험용 기재로서 비축된 액체 배지는 SC 배지(MS 염, 0.4mg/L의 비타민 B1, 100mg/L의 마이오-이노시톨, 20g/L의 수크로즈, 3.5mg/L의 BAP, 0.01mg/L의 ANA, 6g/L의 피토아가(phytoagar)), SB 배지(MS 염, 100mg/L의 마이오-이노시톨, 20g/L의 수크로즈, 3.5mg/L 의 AG3, 6g/L의 피토아가) 및 PP 배지(MS 염, 0.4mg/L의 비타민 B1, 100mg/L의 마이오-이노시톨, 2mg/L의 칼슘판토텐산, 30g/L의 수크로즈, 6g/L의 피토아가, 5g/L의 활성 탄소 및 1mg/L의 은-티오설페이트 질산나트륨 (STS))였다.
형질전환용으로 아그로박테리아 균주 "At2260" 및 "LBA 4404"를 이용하였다. 상기 박테리아는 1g/L의 효모 추출액, 1g/L의 박토펩톤, 5g/L의 수크로즈 및 5g/L의 실험실용 렘코(Lab-lemco) 분말을 포함하는 배양 배지에서 28℃의 암실 조건에서 620에서의 광학 밀도가 0.7 내지 0.9에 도달할 때까지 배양하였다.
형질전한/재생 절차는 하기와 같이 2단계로 진행하였다. 4주간의 배양한 시험관내 식물 줄기의 단편을 MS 배지에서 12 내지 16시간 동안 25℃의 암실에서 배양한 후, A. tumefaciens에 의한 감염은 20ml의 MS 배지 각각에 대해 1mL의 세균 현탁액을 접종하여 7주 동안 외식편을 배양함으로써 진행하였다. 상기 외식편은 22℃의 암실에서 48시간 동안 SC 배지에서 공-배양하였으며, 상기 외식편은 멸균 필터지에 올려놓았다. MS 배지 상에서의 외식편의 세척 및 멸균 필터지의 건조는 조심스럽게 수행하였다. 첫 번째 단계에서, 상기 외식편은 선택형 SC 배지(500mg/L의 클라포란 및 5mg/L의 포스피노트리신(PPT)) 상에서 명조건하에서 15일 동안 배양하였으며, 두 번째 단계에서는 기 외식편은 선택형 SC 배지(500mg/L의 클라포란 및 5mg/L의 PPT) 상에서 명조건하에서 배양하였다. 최종적으로, 작은 식물을 선택형 PP 배지(500mg/L의 클라포란 함유) 상에서 개체화(individualization)하고, 5mg/L의 PPT에서 선별하였다.
실시예 3 . 질병 저항성에 대한 항-병원성 단백질 NmDef-02 효과의 평가
Peronospora hyoscyami f. sp. tabacina대한 질병 저항성 실험
카나마이신 항생제 내성을 갖고 상기 항-병원성 단백질의 유전자를 갖는 뿌리가 있는 식물을 45일 동안 온실 조건하에서 적응을 위해 용기에서 재배하였다. 그 이후에, 6주된 100개의 형질전환 클론 그룹을 5 x 103 포자/ml의 농도가 되도록 10μl의 분획을 수회 적하하여 제조한 P. hyoscyami f. sp. tabacina 현탁액으로 접종하였다. 식물을 검은색 비닐 봉투에 넣고, 12시간 동안 물로 분무하여 감염을 유도하였다. 감염 순응성(susceptibility) 평가는 일주일 후에 질병 증상을 갖는 나뭇잎의 비율을 측정함으로써 수행되었다(도 3A). 도 3A에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명자들이 접종 대조군 및 상이한 클론 사이의 병증을 갖는 나뭇잎의 비율을 비교했을 때 이들 병병원균에 대한 높은 저항성 준위가 달성되었으며, 이는 이렇게 중요한 병원균의 제어용으로 사용되는 항-병원성 단백질의 유용성을 보여준다.
Phytophthora parasitica에 대한 담배 질병 저항성 실험
카나마이신 항생제 내성을 갖고 상기 항-병원성 단백질의 유전자를 갖는 뿌리가 있는 식물을 45일 동안 온실 조건하에서 적응을 위해 용기에서 재배하였다. 그 이후에, 6주된 100개의 형질전환 클론 그룹을 5 x 103 포자/ml의 농도가 되도록 10μl의 분획을 수회 적하하여 제조한 P. parasitica로 접종하고, 한 달 이후에 질병 증상을 갖는 줄기의 비율을 측정하였다.
평가 절차에 있어서, 병원균인 P. parasitica는 감자 덱스트로즈 아가 배지(PDA)를 39g/L의 농도로 포함하는 페트리 배양플레이트에서 배양하였다. 상기 병원균은 27℃에서 10일 동안 배양하였다. 담배 식물의 접종을 위해, 병원균이 구비된 PDA 디스크(직경: 1cm)에 줄기 기재를 올려놓고, 28℃의 높은 습도에서 배양하였다(도 3B). 도 3B에서 알 수 있는 바와 같이, 상기 항-병원성 단백질을 발현하는 클론은 농작물의 파종 단계에서 상당한 손실을 야기하는 토양 병원균에 대해 이전에는 결코 알 수 없었던 높은 준위의 저항성을 달성하였다. 이러한 결과에 따르면, 이러한 병원균의 제어를 위한 상기 단백질의 사용이 가능함을 보여준다.
Phytophthora infestans에 대한 감자 질병 저항성 실험
본 실험은 명조건, 온도 및 상대습도의 제어된 조건하에서 5주된 감자 형질 전환 식물에 Phytophthora infestans의 접종하는 것을 포함한다. 상기 항-병원성 단백질을 발현하는 약 100개의 5주된 클론은 106 유주자/ml의 현탁액으로 도말하였다. 상기 클론은 85 내지 95%의 상대 습도 및 23℃의 온도와 같이 제어된 조건하에서 방치하였다. 병증을 갖는 나뭇잎의 비율은 접종 1주 후에 병원균의 감염 순응성의 척도로서 이용하였다(도 3C). 이러한 병원균은 제어하기가 극도로 어렵기 때문에 이는 예상치 못한 결과였다. 도 3C에서 상기 항-병원성 단백질을 발현하는 클론들은 대조군에 비해 높은 준위의 저항을 나타냈다. 이러한 결과는 전 세계적인 수준에서 매우 중요하기 때문에 이러한 병원균의 제어에 있어 상기 단백질의 이용 가능성을 강조하고 있다.
Alternaria solani에 대한 감자 질병 저항성 실험
상기 진균인 Alternaria solani를 조건, 온도 및 상대습도의 제어된 조건하에서 5주된 100개의 감자 형질 전환 식물에 접종하였다. 상기 클론은 106 포자/ml의 현탁액으로 도말하였다. 상기 클론은 85 내지 95%의 상대 습도 및 20℃의 온도와 같이 제어된 조건하에서 방치하였다. 병증을 갖는 나뭇잎의 비율은 접종 1주 후에 병원균의 감염 순응성의 척도로서 이용하였다(도 3D). 상기 3개의 분석된 클론은 이러한 병원균에 대한 높은 준위의 저항성을 나타냈으며, 이는 상기 병원균 제어용 단백질의 이용 가능성을 최초로 제공하는 것이다.
실시예 4 : Pichia pastoris 배약 상층액에서 세포외 방식으로 항-병원성 단백질 NmDef-02의 발현 벡터의 구축
N. megalosiphon에서 상기 항-병원성 단백질을 암호화하는 유전자를 서열 번호: 4 및 서열 번호: 5에 상응하는 특이적 올리고뉴클레오티드를 이용하여 단리하여, 발현 벡터 pPIC9k에 클로닝하기에 필수적인 제한 효소 부위 Xho I/EcoR I를 갖는 상기 항-병원성 단백질인 상기 항-병원성 단백질을 암호화하는 유전자의 완전한 서열을 수득하였다. 상기 클로닝 전략은 Saccharomyces cerevisiae의 알파 인자의 신호 펩티드를 목적하는 단백질의 아미노 말단에 부가하는 것으로(도 1B), 상기 얻어진 단백질은 상기 서열 번호: 7의 범주에 속한다. P. pastoris의 균주 GS115를 형질전환하기 전에 플라스미드를 Bgl II으로 선형화하였다. 형질전환은 전기천공법(electroporation)으로 수행하였다. 상기 균주 GS115는 형질전환 이후에 His+ 표현형을 수득한 영양 요구성 his3 변이체이다. 상기 His+ 클론은 글루코즈 최소 배지에서 선별하여, 상기 클론은 글리세롤 최적 배지에서 배양하였으며, 28℃에서 126시간 동안 메탄올로 유도하였다.
상기 형질전환된 클론은 Dot-Blot법에 의해 동정하였다. 서던블러팅 기법을 이용하여 Muts(낮은 메탄올 함량) 및 His+ 표현형과 일치하는 재조합 플라스미드의 발현을 위해 P. pastoris에서 AOX1 유전자의 치환을 위한 통합(integration)이 일어났는지를 결정하였다. P. pastoris는 자신의 단백질을 낮은 준위로 분비하였으며, 이의 세포이하 배지로 분비되는 단백질이 배지 내의 총 단백질 중 대부분(8% 이상)을 구성한다는 기대할 수 있기 때문에 배양 배지는 단백질 보충이 필요치 않았다(문헌[Tschopp 등, (1987) Bio/Technology 5:1305-1308]). P. pastoris에서 상기 항-병원성 단백질의 발현은 배양 배지에 메탄올을 첨가함으로써 5L의 배쉬(bash)에서 수행하였다. 상기 항-병원성 단백질의 발현 및 이의 온전성은 질량 분석법을 이용하여 검토하였다.
실시예 5 : 항-병원성 단백질의 정제 및 생물 활성 분석
상기 알파 인자의 신호 펩티드에 융합된 상기 항-병원성 단백질 (NmDef-Plus)을 배양 배지의 상층액에서 25mm의 아세트산 나트륨(pH 4,5)에서 투석을 이용하여 정제하였으며, 양이온 교환 CM-세파로즈 수지를 통과한 투석 생성물은 25mm의 아세트산 나트륨(pH 4,5)으로 유속을 밸런싱(balancing)하였고, 단백질은 1M 염화나트륨 및 50mm의 트리스(pH 7,6)로 용출하였다. 상기 단백질을 포함하고 있는 분획을 수집하고, 3kDa의 공극 크기(차단)를 갖는 막이 구비된 울트라-스핀 시스템(ultra-spin system)을 이용하여 농축하였다. 검출을 위해 254nm의 파장을 이용하였다. 정제는 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 전기영동(SDS-PAGE, 15% ris-Glicne)의 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동으로 확인하였으며, 상기 단백질은 실버 염색에 의해 시각화하였다(도 2).
상기 항-병원성 단백질의 항균 활성은 분광광도법을 통해 정량화하였으며, 광학 현미경을 이용하여 락토페놀에 의한 염색으로 균사체를 분석하였다(문헌[Terras 등, (1992) J. Biol. Chem. 267: 14301-15309]). 평가는 50μL의 감자-글루코즈 액체 배지, 50μL의 병원균 포자 현탁액 및 20μL의 부분 정제된 항-병원성 단백질이 첨가된 96 웰 플레이트에서 수행하였다.
상기 병원균의 성장억제 비율(PIC)은 하기 수학식에 따라 앞서 보고된 바에 따라 결정하였다(문헌[Terras 등, (1992) J. Biol. Chem. 267: 14301-15309[).
Figure 112010070227014-pct00001
억제 비율 사이의 관계는 대조군의 실현 판독(595nm)에 대한 이전 식의 적용에 의해 유추되었으며, 처리 시료는 분석 48시간 이후에 시작하였다(도 4A).
상기 알파 인자의 신호 펩티드가 없는 항-병원성 단백질은 화학적으로 합성하였으며, 이의효과는 이전 보고에 따라 상이한 농도로 병원균 P. infestans상에서 평가하였다(문헌Terras 등, (1992) J. Biol. Chem. 267: 14301-15309)(도 4B).
도 4A 및 도 4B에서, 상기 항-병원성 단백질은 높은 준위의 식물 병원균의 성장 억제를 달성하였으며, 이때 상기 항-병원성 단백질은 알파 인자의 신호 펩티드와 융합되거나, 신호 펩티드 없이 화학적으로 합성되었다. 중요한 식물 병원균의 억제는 보고된 기타 항균 단백질에 의해서는 현재까지 달성되지 않았으며 이는 최초로 관측된 것으로 매우 흥미로웠다. 다른 전망이 없는 결과이면서 광범위한 작용 스펙트럼을 갖는 이러한 항-병원성 단백질의 이용을 가능케 한 결과는 세균성 병원균에서 나타났던 높은 준위의 억제였다(표 1).
세균성 병원균에 대한 항-병원성 단백질 NmDef-02 의 효과
세균 종류 IC 50 (μM)
Xanthomonas campestris p.v. phaseoli 40 ㅁ 3
Pseudomonas syringae p.v. syringae 26 ㅁ 6
Erwinia carotovorum p.v. carotovora 86 ㅁ 8
Pseudomonas avenae 17 ㅁ 5
Erwinia chrysanthemi p.v. zea 11 ㅁ 8
IC50: 세균 성장이 50% 억제되는 NmDef-02의 농도
ㅁ: 배지 표준 편차
실시예 6 :
상기 항-병원성 단백질 NmDef-02 제제의 토양 및 공기 진균성 병원균의 제어 측정
상기 N. tabacum 종의 종자를 블랙 크라우드 및 쌀을 4:1의 비율로 함유하고 있는 6인치 크기의 용기에서 배양하고 23℃의 온실 조건에서 방치한 후, 상기 항-병원성 단백질(9μg/ml) 및 5% 알긴산나트륨의 제제로 처리하였다. 처리 대조군으로서 10% 하이포아염소산나트륨 및 임의의 처리 유형이 없이 기타 제제로 처리한 종자를 이용하였다. 평가는 30일 동안 수행하였으며, 자연적인 감염으로 인해 사멸한 식물의 비율을 측정하였다(도 5A).
한편, 온실에서 배양한 100종의 식물은 항-병원성 단백질을 5μg/ml의 활성성분 농도로 포함하며 % 알긴산나트륨을 갖는 제제로 분무하였다. 대조를 위해 40g/L의 농도의 진균 Benomil 및 물을 포함하는 분산액을 이용하였다. 병증이 나타난 나뭇잎의 비율은 처리의 적용 이후 45일 후에 자연 감염을 통해 평가하였다(도 5B).
도 5A 및 도 5B에서, 상기 항-병원성 단백질 제제는 사용된 대조군과 비교하여 토양 및 공기 진균성 병원균의 제어를 달성할 수 있으며, 이러한 결과는 현재까지 보고된 바가 없어, 식물 병원균의 제어에서 생물 소재로서 이러한 단백질의 사용을 가능케 한다.
실시예 7: 항-병원성 단백질 NmDef-02 단편의 생물 활성
상기 항-병원성 단백질 NmDef-02 단편은 화학 합성(서열 번호: 8 및 서열 번호: 9)을 이용하여 수득하였다. 병원균 P. infestans에 대한 효과는 보고된 정보에 따라 상이한 농도로 평가하였으며(문헌[Terras 등, (1992) J. Biol. Chem. 267: 14301-15309]), 이는 도 6에 도시되어 있다. 상기 수득된 결과는 상기 서열 번호: 9의 단백질 분획을 사용하는 경우 병원균의 제어 및 억제를 달성하기 위해 상기 단백질의 분획의 이용을 가능케 하였다.
<110> Center for Genetic Engineering and Biotechnology <120> NUCLEIC AND AMINO ACID SEQUENCES FOR THE CONTROL OF PATHOGEN AGENTS <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nicotiana megalosiphon <400> 1 atgcgtgagt gcaaggctca gggccgtcac actacgtgtt ttcgtgacgc gaactgcgtc 60 caagtctgtg aaaaacaggc tggctggtca cacggggact gccgagcaca gttcaagtgc 120 aaatgtatat tcgagtgcta a 141 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description: Oligonucleotide <400> 2 aagcttatgc gtgagtgcaa ggctc 25 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description: Oligonucleotide <400> 3 ctgcagttag cactcgaata tac 23 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description: Oligonucleotide <400> 4 ctcgagatgc gtgagtgcaa ggctc 25 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description: Oligonucleotide <400> 5 gaattcttag cactcgaata tac 23 <210> 6 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nicotiana megalosiphon <400> 6 Arg Glu Cys Lys Ala Gln Gly Arg His Thr Thr Cys Phe Arg Asp Ala 1 5 10 15 Asn Cys Val Gln Val Cys Glu Lys Gln Ala Gly Trp Ser His Gly Asp 20 25 30 Cys Arg Ala Gln Phe Lys Cys Lys Cys Ile Phe Glu Cys 35 40 45 <210> 7 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description:Fusion Protein <400> 7 Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln Ile Pro Ala 1 5 10 15 Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe Asp Val Ala 20 25 30 Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu Phe Ile Asn 35 40 45 Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val Ser Arg Glu 50 55 60 Cys Lys Ala Gln Gly Arg His Thr Thr Cys Phe Arg Asp Ala Asn Cys 65 70 75 80 Val Gln Val Cys Glu Lys Gln Ala Gly Trp Ser His Gly Asp Cys Arg 85 90 95 Ala Gln Phe Lys Cys Lys Cys Ile Phe Glu Cys 100 105 <210> 8 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nicotiana megalosiphon <400> 8 Arg Glu Cys Lys Ala Gln Gly Arg His Thr Thr Cys Phe Arg Asp Ala 1 5 10 15 Asn Cys Val Gln Val Cys Glu Lys 20 <210> 9 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nicotiana megalosiphon <400> 9 Gln Ala Gly Trp Ser His Gly Asp Cys Arg Ala Gln Phe Lys Cys Lys 1 5 10 15 Cys Ile Phe Glu Cys 20

Claims (16)

  1. 서열 번호: 1로 표시된 핵산 서열로 이루어진 핵산.
  2. a) 서열 번호: 6으로 표시된 아미노산 서열로 이루어지고, 진균성 병원균 및 세균성 병원균 중에서 선택되는 병원체의 감염을 제거하는 특성이 보존되어 있는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산.
  3. 서열 번호: 1로 표시된 핵산 서열로 이루어진 핵산 서열을 이용하여 식물을 유전적으로 형질전환시켜 서열 번호: 6로 이루어진 항-병원성 단백질의 연속 발현 및 유도 발현을 유도함으로써, 진균성 병원균 및 세균성 병원균 중에서 선택되는 병원체에 의해 발병된 식물 질환에 대한 내성을 증가시키는 방법.
  4. 서열 번호: 6 또는 서열 번호: 7로 표시된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드.
  5. 삭제
  6. DNA 재조합 방법 또는 화학적 합성에 의해 수득된 제 4 항에 따른 폴리펩티드.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 DNA 재조합 방법을 통한 발현은 Pichia pastoris의 배양 상층액에서 수행되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  8. 서열 번호:6 또는 서열 번호: 7로 표시된 폴리펩티드를 포함하는, 진균성 병원균 및 세균성 병원균 중에서 선택되는 병원체 제어용 생물 소재.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 유전적으로 변형된 숙주로부터 정제되거나, 상기 숙주의 배양 상층액에 포함된 것을 직접 사용하는 것을 특징으로 하는 진균성 병원균 및 세균성 병원균 중에서 선택되는 병원체 제어용 생물 소재.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 숙주는 P. pastoris인 것을 특징으로 하는 진균성 병원균 및 세균성 병원균 중에서 선택되는 병원체 제어용 생물 소재.
  11. 제 8 항에 있어서, 상기 병원체는 진균성 병원균인 것을 특징으로 하는 진균성 병원균 및 세균성 병원균 중에서 선택되는 병원체 제어용 생물 소재.
  12. 제 8 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 1 내지 9μg/ml의 농도 범위인 것을 특징으로 하는 진균성 병원균 및 세균성 병원균 중에서 선택되는 병원체 제어용 생물 소재.
  13. 서열 번호: 6 또는 서열 번호: 7로 표시된 폴리펩티드의 단편을 포함하는, 진균성 병원균 및 세균성 병원균 중에서 선택되는 병원체 제어용 생물 소재.
  14. 제 8 항의 생물 소재를 식물에 적용하는 것을 특징으로 하는, 진균성 병원균 및 세균성 병원균 중에서 선택되는 식물 병원체의 제어 방법.
  15. 생물 농약(biopesticide)과 혼합된 제 8 항의 생물 소재를 적용하는 것을 특징으로 하는, 진균성 병원균 및 세균성 병원균 중에서 선택되는 식물 병원체의 제어 방법.
  16. 진균성 병원균 및 세균성 병원균 중에서 선택되는 병원체에 의해 발병된 식물 질환에 대한 내성을 증가시키기 위해 서열 번호: 1로 표시된 핵산 서열에 의해 유전적으로 변형된 식물.
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