WO2009115756A2 - Procede de detection directe de l'albumine modifiee de l'ischemie par utilisation d'un partenaire de liaison a un derive aldehyde issu de la peroxydation de lipides sous forme liee - Google Patents

Procede de detection directe de l'albumine modifiee de l'ischemie par utilisation d'un partenaire de liaison a un derive aldehyde issu de la peroxydation de lipides sous forme liee Download PDF

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Christine Des Rosiers
Colette Jolivet-Reynaud
Jérôme MARTINEZ
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bioMérieux
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders
    • G01N2800/324—Coronary artery diseases, e.g. angina pectoris, myocardial infarction

Definitions

  • the present invention relates to the field of the diagnosis of ischemic states in humans, and in particular to a method for the detection of ischemia-modified albumin ("Ischemia Modified Albumin" or AMI).
  • ischemia-modified Albumin Ischemia Modified Albumin
  • Ischemia is the decrease in arterial blood supply to an organ. This decrease essentially leads to a decrease in the oxygenation of the tissues of the organ below its needs (hypoxia), and the disruption or even the cessation of its function. Ischemia may be due to a blood clot that obstructs an artery (thrombosis), to an atheromatous plaque, to a hemorrhage that prevents the tissues from being properly fed, to a compression of an artery by an external object (crush of a limb, tourniquet) or by an internal phenomenon (hematoma, tumor, effusion of a liquid). Ischemia can be reversible and cause only limited discomfort. But it can also be irreversible and lead to infarction of the organ, that is to say to the necrosis of part or all of it.
  • IMA which is serum albumin with the N-terminal portion modified, is now frequently used as a marker of ischemic heart disease.
  • IMA could also be a biomarker of acute stroke 1 .
  • Detecting the presence of AMI in the blood of patients who are suspected to be ischemic is therefore of extreme importance and emergency professionals are looking for a specific and reliable test.
  • the IMA assay is performed indirectly by a colorimetric test (ACB test) which quantifies the AMI by evaluating the decrease in the cobalt ion fixation capacity by the patient's total albumin. after modification of part of its albumin.
  • ACB test colorimetric test
  • the current marketed ACB test has the drawbacks of not directly detecting AMI, detecting false positives and it has been considered unreliable in the case where patients have an albumin level below
  • HNE 4-hydroxy-2-nonenal
  • HHE 4-hydroxy-2-hexenal
  • MDA malondialdehyde
  • HNE an aldehyde of this type, is toxic and is generated by the ⁇ cleavage of hydroperoxides of ⁇ -6 polyunsaturated fatty acids 4 .
  • HHE is also derived from the peroxidation of polyunsaturated fatty acids, specifically acides3 5 fatty acids.
  • proteins and peptides are liberated in free form in biological tissues, but diffuse easily from their original site. Because of their ability to bind to the nucleophilic sites of proteins and peptides, principally the histidine, lysine and cysteine residues, to form covalently modified biomolecules, they are thus found either in free form or in bound form. proteins and peptides.
  • proteins modified with aldehyde derivatives derived from the lipid peroxidation, and in particular with the HNE include hemoproteins, such as hemoglobin and myoglobin, lipoproteins such as LDL or apolipoprotein B-100, enzymes such as glucose-6-phosphate dehydrogenase or cathepsin B 6 , and albumin which, because of its high concentration in the serum, is a preferred target for these aldehyde derivatives.
  • ToyoKuni S. et al. 7 described the importance of HNE-modified albumin for patients with type 2 diabetes. Aldini G. et al.
  • HSA human serum albumin
  • ToyoKuni S. et al. 9 described monoclonal antibodies recognizing bovine serum albumin modified with HNE and suggested that these antibodies could be useful for the evaluation of ROS (Reactive Oxygen Species) damage, which ROS being involved in a number of biological phenomena such as ischemia-reperfusion. This document does not describe a marker of ischemia itself.
  • ROS reactive Oxygen Species
  • the modified albumin of ischemia or IMA is actually albumin covalently modified by a reactive aldehyde derivative derived from peroxidation. of lipids and that it was possible to directly detect the IMA, and thus the ischemic states using this property.
  • the present invention relates to the use of a binding partner to an aldehyde derivative derived from lipid peroxidation in protein-bound form for the detection of ischemia-modified albumin (IMA) in a biological sample.
  • IMA ischemia-modified albumin
  • IMA albumin modified with ischemia
  • the method of the invention which consists in detecting the AMI by implementing at least one binding partner with an aldehyde derivative derived from the lipid peroxidation of a protein-bound form, has the advantage that it makes it possible to detect directly the IMA, thus increasing the detection sensitivity compared to the indirect detection test of the IMA.
  • an aldehyde derivative resulting from the peroxidation of lipids there may be mentioned 4-hydroxy-2-nonenal (HNE), 4-hydroxy-2-hexenal (HHE) and malondialdehyde, which constitutes a particular embodiment of the invention.
  • the biological sample in which the method of the invention is implemented is any sample likely to contain IMA.
  • IMA any sample likely to contain IMA.
  • the aldehyde derivatives can be found in the biological sample either in free form or in bound form and it is desired to detect in said sample only said aldehyde derivatives bound to albumin form.
  • the binding partner used in the process of the invention is either specific for said derivative in albumin-bound form, or it is not specific for said aldehyde derivative in albumin bound form, but it recognizes of course, said aldehyde derivative in form bound to another protein or peptide.
  • the detection method must also implement a means for isolating albumin from the biological sample.
  • a means for isolating albumin from the biological sample mention may be made of a specific binding partner for albumin, such as an anti-human serum albumin antibody, which constitutes a mode of particular embodiment of the invention.
  • the detection method of the invention implements both a specific binding partner of an aldehyde derivative in bound form and a specific binding partner of albumin, said binding partner being able to to be specific for an aldehyde derivative in albumin bound form.
  • Non-molecule binding partners are called when their binding specificity to this molecule is low and they are then able to bind to other ligands, such as, in the case of aldehyde derivatives in bound form, an aldehyde derivative in form bound to a protein other than albumin.
  • the detection method of the IMA of the invention can be implemented by any biochemical test widely known to those skilled in the art involving molecular interactions, namely reactions between said aldehyde derivative derived from lipid peroxidation linked to albumin and one or more binding partner (s), specific or not, of the same said aldehyde derivative derived from the lipid peroxidation.
  • the method for detecting the AMI of the invention therefore comprises the following steps: a biological sample that may contain IMA is available, this biological sample is brought into contact with at least one partner of the invention. binding of the aldehyde derivative from lipid peroxidation in protein-bound form and detecting the binding of IMA / binding partner of the aldehyde derivative from lipid peroxidation in protein-bound form.
  • a biological sample that may contain IMA is available
  • binding of the aldehyde derivative from lipid peroxidation in protein-bound form and detecting the binding of IMA / binding partner of the aldehyde derivative from lipid peroxidation in protein-bound form.
  • the method of the invention uses a specific partner of the albumin to make it possible to isolate the albumin of said sample, as indicated previously, either in detection or in capture.
  • the biochemical test is an immunoassay known to those skilled in the art involving immunological reactions between the aldehyde derivative derived from the lipid peroxidation, which is the antigen, and one or more specific binding partner (s) ( s) what are the antibodies directed against this antigen.
  • immunoassay known to those skilled in the art involving immunological reactions between the aldehyde derivative derived from the lipid peroxidation, which is the antigen, and one or more specific binding partner (s) ( s) what are the antibodies directed against this antigen.
  • immunological tests as defined above, mention may be made of "sandwich” methods such as ELISA, IRMA and RIA, so-called competitive methods and direct immunodetection methods such as immunohistochemistry, immunocytochemistry , Western-blot and Dot-blot.
  • the specific or non-specific binding partners of the aldehyde derivative (s) resulting from the lipid peroxidation sought in the process of the invention, and, where appropriate, the specific binding partners of albumin, are any partner likely to bind to this protein. or these molecules.
  • the binding partner antibodies are, for example, either polyclonal antibodies or monoclonal antibodies.
  • the polyclonal antibodies can be obtained by immunization of an animal with the molecule concerned, followed by the recovery of the desired antibodies in purified form, by taking the serum of said animal, and separating said antibodies from the other constituents of the serum, in particular by chromatography. affinity on a column on which is fixed an antigen specifically recognized by the antibodies, in particular said aldehyde derivative derived from lipid peroxidation.
  • the monoclonal antibodies can be obtained by the hybridoma technique widely known to those skilled in the art.
  • the monoclonal antibodies can also be recombinant antibodies obtained by genetic engineering, by techniques well known to those skilled in the art.
  • anti-aldehyde derivative antibodies derived from lipid peroxidation in protein bound form other than albumin and anti-albumin antibodies are widely known to those skilled in the art and are sold for example by JaICA and Hytest, respectively.
  • the antibodies specifically binding to aldehyde derivatives derived from the peroxidation of lipids in albumin-bound form are new and constitute another subject of the invention.
  • Antibodies specifically binding to aldehyde derivatives derived from lipid peroxidation in albumin-bound form means any antibody capable of binding to said derivatives with a high specificity or even a specificity of 100%, and unable to bind to aldehyde derivatives derived from the peroxidation of lipids in form bound to a protein other than albumin.
  • the binding partner to said aldehyde derivative derived from the peroxidation of lipids in bound form is an antibody, preferably an anti-aldehyde derivative antibody derived from the lipid peroxidation of lipid-bound form. albumin.
  • at least one aldehyde derivative bonding partner of the bound form lipid peroxidation it is meant that the process of the invention can employ two or more such partners.
  • the method of the invention can implement a binding partner bound to the HNE, in particular linked to albumin, and a binding partner HHE bound form , in particular linked to albumin, or a binding partner bound to the HNE, in particular linked to albumin, and an MDA binding partner in bound form, in particular bound to albumin.
  • the binding partners of the aldehyde derivative derived from the lipid peroxidation in protein-bound form used in the method of the invention may be used as a capture reagent or as a detection reagent.
  • a specific binding partner of albumin it may be used as a capture reagent or as a detection reagent depending on whether the binding partner of the aldehyde derivative derived from the lipid peroxidation of a bound form of protein is used respectively as a detection reagent or as a capture reagent.
  • the visualization of immunological reactions i.e., the IMA binding / binding partner, may be performed by any means of detection, such as direct or indirect means.
  • the immunological reactions are observed for example by surface plasmon resonance or by cyclic voltammetry on an electrode bearing a conductive polymer.
  • the indirect detection is done by means of a marking, either of the binding partner called the revealing reagent, or of the IMA itself. In the latter case, we speak of a competition method.
  • labeling is meant the attachment of a marker reagent capable of directly or indirectly generating a detectable signal.
  • a nonlimiting list of these marker reagents consists of:
  • enzymes that produce a detectable signal for example by colorimetry, fluorescence, luminescence, such as horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, glucose-6-phosphate dehydrogenase,
  • chromophores such as fluorescent compounds, luminescent compounds, dyes, radioactive molecules such as 32P, 35S or 1251, and
  • fluorescent molecules such as Alexa or phycocyanines.
  • Indirect detection systems can also be used, such as, for example, ligands capable of reacting with an anti-ligand.
  • the ligand / anti-ligand pairs are well known to those skilled in the art, which is the case, for example, of the following pairs: biotin / streptavidin, hapten / antibody, antigen / antibody, peptide / antibody, sugar / lectin, polynucleotide / complementary polynucleotide. In this case, it is the ligand that carries the binding partner.
  • the anti-ligand can be detectable directly by the labeling reagents described in the preceding paragraph or be itself detectable by a ligand / antiligand.
  • the in vitro diagnostic method of ischemic states also implements the detection of a cardiac marker.
  • cardiac markers include, without limitation, commonly used cardiac markers such as troponin, such as troponin I or troponin T, and CK-MB (isoform MB of creatine kinase), troponin I being the preferred heart marker.
  • cardiac markers such as troponin, such as troponin I or troponin T, and CK-MB (isoform MB of creatine kinase), troponin I being the preferred heart marker.
  • the IMA being one of them, they can be separately demonstrated, for example by means of different biochemical tests, or else Simultaneously, in multiplex assay, according to the techniques described above.
  • the IMA was purified using its property of no longer binding the divalent ions in order to isolate it from normal HSA.
  • a pool of 10 plasmas of patients who had unstable angina (ischemia) or a healthy plasma were each deposited on a column of Nickel-Agarose resin (Pharmacia).
  • the unmodified HSA binds to the resin while the IMA is not adsorbed and passes into the filtrate.
  • the IMA contained in the filtrates was then concentrated and immunopurified using the anti-HSA 15C7 monoclonal antibody (HyTest) coupled to cyanogen bromide-activated Sepharose resin.
  • the IMA was isolated after electrophoresis SDS-PAGE on 12% acrylamide gel and transfer to a PVDF membrane. It was then sequenced by the Edman technique, in order to determine if the modification that characterizes the IMA is a cleavage amino acids component its N-terminal, as indicated in the patent application WO00 / 20840. Results: Position 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
  • HSA N-term- D A H K S E VA H R IMA: N-term- D A H K X E VA X X
  • the SELDI-TOF technique (Ciphergen) was used to identify a mass addition related to the binding of a group to the modified albumin plasma albumin relative to the albumin of healthy samples. Interaction with the anti-hydroxynonenal antibody was then characterized with these same 2 angor and healthy samples.
  • the non-adsorbed Nickel-Agarose resin fractions from a pool of 4 angina plasmas, as well as a pool of 14 healthy sera, are immunopurified on anti-HSA resin (mAb 15C7 monoclonal antibody).
  • eluates enriched in IMA, resulting from this double purification, are analyzed by SELDI-TOF on hydrophilic strips (NP20) and on epoxide grouped arrays (PS20) on which are grafted covalently, via their amine function, anti-antibodies.
  • NP20 hydrophilic strips
  • PS20 epoxide grouped arrays
  • -HNE HNEJ-2, JaICA
  • the results in the table show a significant mass shift between albumin from pooled healthy sample eluates and albumen from the pool of angina samples.
  • the albumin pool albumin has a higher albumin mass than the normal samples (healthy pool eluate and commercial HSA), which means that the modification that characterizes the MAI would be the addition of an undefined pool causing an increase massive.
  • the anti-HNE-protein monoclonal antibody HNEJ-2 (JaICA) was coupled on a PS20 surface via its epoxide groups.
  • the 2 non-adsorbed fractions adsorbed on a nickel-agarose resin column, of the same pool of 6 angor plasmas, are immunopurified with an anti-HSA affinity resin (AcM 15C7).
  • AcM 15C7 anti-HSA affinity resin
  • the 2 purified fractions (IMA and HSA) are dialysed in PBS, concentrated, quantified by spectrometry D ⁇ 27 9nm and stabilized by a reduction to NaBD 4 .
  • Anti-HNE-protein monoclonal antibody solution HNEJ-2 from JaICA
  • anti-HHE-protein JaICA HHE53
  • anti-MD A-protein Jaica 1F83
  • diluted to 10 ⁇ g / mL buffer Tris 0.2 M maleic acid 0.2 M at pH 6.2 was incubated for 2 h at 37 0 C on a black plate of 96 wells (capture antibody). After 2 hours of saturation at 37 ° C. with a solution of PBS containing 0.2% of gelatin, plasmas diluted 1/10 in PBS-Tween 0.05% were incubated overnight at 40 ° C.
  • IMA, or albumin modified by the HNE, HHE or MDA, specifically selected by the monoclonal capture antibody was detected by an antibody F (ab ') 2 anti-human serum albumin (MAb 10C3, bioMérieux, France ) coupled to biotin, diluted to 1 ⁇ g / ml in PBS containing 0.05% Tween and 0.1% gelatin and incubated for 2h at 37 ° C.
  • Streptavidin coupled to alkaline phosphatase diluted at 1 ° C. / 10000 in TBS (Saline Tris Buffer) containing 0.05% Tween and 0.1% gelatin was incubated for 1 h at 37 ° C.
  • a measurement of the fluometric signal was then carried out after the introduction of a substrate fluorogenic alkaline phosphatase.

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Abstract

La présente invention concerne l'utilisation d'au moins un partenaire de liaison à un dérivé aldéhyde issu de la peroxydation de lipides sous forme liée à une protéine, tel que par exemple au 4-hydroxy-2-nonenal, au 4-hydroxy-2-hexenal ou au malondialdehyde pour la détection de l'albumine modifiée de l'ischémie (IMA) dans un échantillon biologique.

Description

Procédé de détection directe de l'albumine modifiée de l'ischémie par utilisation d'un partenaire de liaison à un dérivé aldéhyde issu de la peroxydation de lipides sous forme liée
La présente invention concerne le domaine du diagnostic des états ischémiques chez l'homme, et en particulier un procédé de détection de l'albumine modifiée de l'ischémie (« Ischemia Modified Albumin » ou IMA).
L'ischémie est la diminution de l'apport sanguin artériel à un organe. Cette diminution entraîne essentiellement une baisse de l'oxygénation des tissus de l'organe en deçà de ses besoins (hypoxie), et la perturbation, voire l'arrêt de sa fonction. L'ischémie peut être due à un caillot de sang qui obstrue une artère (thrombose), à une plaque d'athérome, à une hémorragie qui empêche les tissus d'être correctement alimentés, à une compression d'une artère par un objet extérieur (écrasement d'un membre, garrot) ou par un phénomène interne (hématome, tumeur, épanchement d'un liquide). L'ischémie peut être réversible et n'entraîner qu'une gêne limitée. Mais elle peut aussi être irréversible et conduire à l'infarctus de l'organe, c'est-à-dire à la nécrose d'une partie ou de la totalité de celui-ci.
L'IMA, qui est de l'albumine sérique dont la partie N-terminale est modifiée, est utilisée maintenant fréquemment comme marqueur d'ischémie cardiaque. De plus, une étude récente a montré que l'IMA pouvait être aussi un biomarqueur d'accident vasculaire cérébral aigu1.
La détection de la présence d'IMA dans le sang de patients dont on suspecte qu'ils souffrent d'un état ischémique est donc d'une extrême importance et les professionnels des urgences sont demandeurs d'un test spécifique et fiable. A l'heure actuelle, le dosage de l'IMA est effectué de manière indirecte par un test colorimétrique (test ACB) qui quantifie l'IMA en évaluant la diminution de la capacité de fixation d'ions cobalt par l'albumine totale du patient après modification d'une partie de son albumine. Le test ACB actuellement commercialisé a pour inconvénients de ne pas détecter directement l'IMA , de détecter des faux positifs et il a été jugé peu fiable dans le cas où les patients ont une albuminémie inférieure à
34 g/13
II devient donc urgent de disposer d'un test palliant les inconvénients ci-dessus, notamment en dosant directement l'IMA.
Les dérivés aldéhyde issus de la peroxydation des acides gras polyinsaturés (lipides), molécules générées de façon endogène, tels que le 4-hydroxy-2-nonenal (HNE), le 4-hydroxy-2-hexenal (HHE), le 4-oxohexenal, le 4-oxononénal et le malondialdéhyde (MDA), sont des molécules largement rencontrées dans l'organisme. L'HNE, un aldéhyde de ce type, est toxique et est généré par le clivage en β d'hydroperoxides d'acides gras ω-6 poly-insaturés4. L'HHE est aussi issu de la peroxydation d'acides gras polyinsaturés, spécifiquement les acides gras de type ω35. Ces dérivés sont libérés sous forme libre dans les tissus biologiques, mais diffusent facilement de leur site d'origine. Du fait de leur capacité de se lier aux sites nucléophiles des protéines et des peptides, principalement les résidus histidine, lysine et cystéine, pour former des biomolécules modifiées de façon covalente, on les retrouve donc soit sous forme libre, soit sous forme liée à des protéines et peptides.
Des exemples de protéines modifiées par les dérivés aldéhyde issus de la peroxydation de lipides, et en particulier par le HNE, comprennent les hémoprotéines, telles que l'hémoglobine et la myoglobine, les lipoprotéines telles que les LDL ou l'apolipoprotéine B-IOO, les enzymes telles que la glucose-6-phosphate déshydrogénase ou la cathépsine B6, et l'albumine qui, du fait de sa forte concentration dans le sérum, constitue une cible privilégiée pour ces dérivés aldéhyde. ToyoKuni S. et al.7 ont décrit l'importance de l'albumine modifiée par le HNE pour les patients atteints de diabète de type 2. Aldini G. et al.8 ont caractérisé en spectrométrie de masse la modification covalente de l'albumine sérique humaine (HSA) par le HNE en modifiant in vitro de l'albumine humaine avec du HNE. Ces auteurs en ont conclu, à partir de ces expériences in vitro, que cette albumine modifiée pourrait être utile en tant que biomarqueur dans le cas de patients en stress oxydatif, comme indiqué également dans la demande de brevet WO2007/041868. Aucune mention n'a été faite sur les états ischémiques.
ToyoKuni S. et al.9 ont décrit des anticorps monoclonaux reconnaissant de l'albumine sérique bovine modifiée par du HNE et ont suggéré que ces anticorps pourraient être utiles pour l'évaluation des dommages induits par les ROS (« Reactive Oxygen Species » ou Espèces oxygénées réactives), lesquels ROS étant impliqués dans un certain nombre de phénomènes biologiques tels que l'ischémie-reperfusion. Ce document ne décrit pas de marqueur de l'ischémie proprement dit.
Les présents inventeurs ont maintenant mis en évidence contre toute attente que, dans le cadre des états ischémiques, l'albumine modifiée de l'ischémie ou IMA est en fait de l'albumine modifiée de façon covalente par un dérivé aldéhyde réactif issu de la peroxydation de lipides et qu'il était possible de détecter directement l'IMA, et donc les états ischémiques en utilisant cette propriété.
Ainsi, la présente invention a pour objet l'utilisation d'un partenaire de liaison à un dérivé aldéhyde issu de la peroxydation de lipides sous forme liée à une protéine pour la détection de l'albumine modifiée de l'ischémie (IMA) dans un échantillon biologique.
Elle a également pour objet un procédé de détection de l'albumine modifiée de l'ischémie (IMA), caractérisé en ce qu'il met en œuvre au moins un partenaire de liaison à un dérivé aldéhyde issu de la peroxydation de lipides, étant entendu que ce dérivé aldéhyde reconnu par le partenaire de liaison est sous forme liée à une protéine et, lorsque la protéine de liaison audit dérivé aldéhyde n'est pas l'albumine, en ce qu'il met également en œuvre un partenaire de liaison spécifique de l'albumine.
Elle concerne enfin un procédé de diagnostic in vitro des états ischémiques, caractérisé en ce qu'il met en œuvre le procédé de détection de l'IMA de l'invention. Le procédé de l'invention, qui consiste à détecter l'IMA en mettant en œuvre au moins un partenaire de liaison à un dérivé aldéhyde issu de la peroxydation de lipides sous forme liée à une protéine, a pour avantage qu'il permet de détecter directement l'IMA, augmentant ainsi la sensibilité de détection par rapport au test de détection indirecte de l'IMA. A titre d'exemple de dérivé aldéhyde issu de la peroxydation de lipides, on peut citer le 4-hydroxy-2-nonenal (HNE), le 4-hydroxy-2-hexenal (HHE) et le malondialdéhyde, ce qui constitue un mode de réalisation particulier de l'invention.
L'échantillon biologique dans lequel le procédé de l'invention est mis en œuvre est tout échantillon susceptible de contenir de l'IMA. A titre d'exemple d'un tel échantillon, on peut citer le sang, le plasma ou le sérum.
Pour mettre en œuvre le procédé de l'invention consistant à utiliser un partenaire de liaison au dérivé aldéhyde issu de la peroxydation de lipides, il est nécessaire que ledit partenaire soit un partenaire dudit dérivé sous forme liée à une protéine ou un peptide. En effet, comme indiqué précédemment, les dérivés aldéhyde peuvent se retrouver dans l'échantillon biologique soit sous forme libre, soit sous forme liée et on ne veut détecter dans ledit échantillon que lesdits dérivés aldéhyde sous forme liés à l'albumine. Pour ce faire, le partenaire de liaison utilisé dans le procédé de l'invention est soit spécifique dudit dérivé sous forme lié à l'albumine, soit il n'est pas spécifique dudit dérivé aldéhyde sous forme liée à l'albumine, mais il reconnaît bien entendu ledit dérivé aldéhyde sous forme liée à une autre protéine ou peptide. Dans ce dernier cas, le procédé de détection doit également mettre en œuvre un moyen permettant d'isoler l'albumine de l'échantillon biologique. A titre d'exemple de moyen permettant d'isoler l'albumine de l'échantillon biologique, on peut citer un partenaire de liaison spécifique de l'albumine, tel qu'un anticorps anti-albumine sérique humaine, ce qui constitue un mode de réalisation particulier de l'invention.
Selon un mode de réalisation particulier, le procédé de détection de l'invention met en œuvre à la fois un partenaire de liaison spécifique d'un dérivé aldéhyde sous forme liée et un partenaire de liaison spécifique de l'albumine, ledit partenaire de liaison pouvant être spécifique d'un dérivé aldéhyde sous forme liée à l'albumine.
On parle de partenaires de liaison spécifiques d'une molécule quand ils sont capables de se lier à ces molécules avec une spécificité élevée, voire une spécificité de 100%. On parle de partenaires de liaison non spécifiques à une molécule lorsque leur spécificité de liaison à cette molécule est faible et qu'ils sont alors capables de se lier à d'autres ligands, tels que, dans le cas des dérivés aldéhydes sous forme liée, un dérivé aldéhyde sous forme liée à une protéine autre que l'albumine.
Le procédé de détection de l'IMA de l'invention peut être mis en œuvre par tout test biochimique largement connu de l'homme du métier impliquant des interactions moléculaires, à savoir des réactions entre ledit dérivé aldéhyde issu de la peroxydation de lipides lié à l'albumine et un ou des partenaire(s) de liaison, spécifique(s) ou non, du même dit dérivé aldéhyde issu de la peroxydation de lipides.
Le procédé de détection de l'IMA de l'invention comprend donc les étapes suivantes : on dispose d'un échantillon biologique susceptible de contenir de l'IMA, on met en contact cet échantillon biologique avec au moins un partenaire de liaison du dérivé aldéhyde issu de la peroxydation de lipides sous forme liée à une protéine et on détecte la liaison IMA/partenaire de liaison du dérivé aldéhyde issu de la peroxydation de lipides sous forme liée à une protéine. Bien entendu, lorsque la protéine dudit partenaire de liaison du dérivé aldéhyde issu de la peroxydation de lipides n'est pas l'albumine, le procédé de l'invention met en œuvre un partenaire spécifique de l'albumine pour permettre d'isoler l'albumine dudit échantillon, comme indiqué précédemment, soit en détection, soit en capture.
De préférence, le test biochimique est un dosage immunologique connu de l'homme du métier impliquant des réactions immunologiques entre le dérivé aldéhyde issu de la peroxydation de lipides, qui est l'antigène, et un ou des partenaire(s) de liaison spécifique(s) que sont les anticorps dirigés contre cet antigène.
A titre d'exemple de tests immunologiques tels que définis ci-dessus, on peut citer les méthodes « sandwich » telles qu'ELISA, IRMA et RIA, les méthodes dites de compétition et les méthodes d'immunodétection directe comme rimmunohistochimie, l'immunocytochimie, le Western-blot et le Dot-blot.
Les partenaires de liaison spécifiques ou non du ou des dérivés aldéhyde issus de la peroxydation de lipides recherchés dans le procédé de l'invention, et le cas échéant les partenaires de liaison spécifiques de l'albumine, sont tout partenaire susceptible de se lier à ce ou ces molécules. A titre d'exemple, on peut citer les anticorps, les fractions d'anticorps, les récepteurs, les aptamères et toute autre molécule capable de se lier à ces molécules.
Les anticorps partenaires de liaison sont par exemple soit des anticorps polyclonaux, soit des anticorps monoclonaux. Les anticorps polyclonaux peuvent être obtenus par immunisation d'un animal avec la molécule concernée, suivie de la récupération des anticorps recherchés sous forme purifiée, par prélèvement du sérum dudit animal, et séparation desdits anticorps des autres constituants du sérum, notamment par chromatographie d'affinité sur une colonne sur laquelle est fixé un antigène spécifiquement reconnu par les anticorps, notamment ledit dérivé aldéhyde issu de la peroxydation de lipides.
Les anticorps monoclonaux peuvent être obtenus par la technique des hybridomes largement connu de l'homme du métier. Les anticorps monoclonaux peuvent être également des anticorps recombinants obtenus par génie génétique, par des techniques bien connues de l'homme du métier.
Les anticorps anti-dérivés aldéhyde issus de la peroxydation de lipides sous forme liée à une protéine autre que l'albumine et les anticorps anti-albumine sont largement connus de l'homme du métier et sont vendus par exemple par JaICA et Hytest, respectivement.
En revanche, les anticorps se liant spécifiquement aux dérivés aldéhyde issus de la peroxydation de lipides sous forme liée à l'albumine, que l'albumine soit entière ou sous forme de fragments, sont nouveaux et constituent un autre objet de l'invention. Par anticorps se liant spécifiquement aux dérivés aldéhyde issus de la peroxydation de lipides sous forme liée à l'albumine, on entend tout anticorps capable de se lier auxdits dérivés avec une spécificité élevée, voire une spécificité de 100%, et incapable de se lier à des dérivés aldéhyde issus de la peroxydation de lipides sous forme liée à une protéine autre que l'albumine. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le partenaire de liaison audit dérivé aldéhyde issu de la peroxydation de lipides sous forme liée est un anticorps, de préférence un anticorps anti-dérivé aldéhyde issu de la peroxydation de lipides sous forme liée à l'albumine. Par au moins un partenaire de liaison à un dérivé aldéhyde de la peroxydation de lipides sous forme liée, on entend que le procédé de l'invention peut mettre en œuvre deux ou davantage de tels partenaires. Ainsi, à titre d'exemple et pour améliorer le sensibilité, le procédé de l'invention peut mettre en œuvre un partenaire de liaison au HNE sous forme liée, notamment liée à l'albumine, et un partenaire de liaison au HHE sous forme liée, notamment liée à l'albumine, ou bien un partenaire de liaison au HNE sous forme liée, notamment liée à l'albumine, et un partenaire de liaison au MDA sous forme liée, notamment liée à l'albumine.
Les partenaires de liaison du dérivé aldéhyde issu de la peroxydation de lipides sous forme liée à une protéine mis en œuvre dans le procédé de l'invention peuvent être utilisés comme réactif de capture ou comme réactif de détection. Lorsqu'on utilise également un partenaire de liaison spécifique de l'albumine, celui-ci peut être utilisé comme réactif de capture ou comme réactif de détection selon que le partenaire de liaison du dérivé aldéhyde issu de la peroxydation de lipides sous forme liée à une protéine est utilisé respectivement comme réactif de détection ou comme réactif de capture.
La visualisation des réactions immunologiques, c'est-à-dire de la liaison IMA/partenaire de liaison, peut être effectuée par tout moyen de détection, tels que des moyens directs ou indirects.
Dans le cas de la détection directe, c'est-à-dire sans l'intermédiaire d'un marquage, on observe les réactions immunologiques par exemple par résonance plasmonique de surface ou par voltamétrie cyclique sur une électrode portant un polymère conducteur. La détection indirecte se fait par l'intermédiaire d'un marquage, soit du partenaire de liaison dit réactif de révélation, soit de l'IMA elle-même. On parle alors dans ce dernier cas de méthode de compétition.
Par marquage, on entend la fixation d'un réactif marqueur capable de générer directement ou indirectement un signal détectable. Une liste non limitative de ces réactifs marqueurs consiste en :
- les enzymes qui produisent un signal détectable par exemple par colorimétrie, fluorescence, luminescence, comme la peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la β-galactosidase, la glucose-6-phosphate déshydrogénase,
- les chromophores comme les composés fluorescents, luminescents, colorants, - les molécules radioactives comme le 32P, le 35S ou le 1251, et
- les molécules fluorescentes telles que les Alexa ou les phycocyanines.
Des systèmes indirects de détection peuvent être aussi utilisés, comme par exemple des ligands capables de réagir avec un anti-ligand. Les couples ligand/anti- ligand sont bien connus de l'homme du métier, ce qui est le cas par exemple des couples suivants : biotine/streptavidine, haptène/anticorps, antigène/anticorps, peptide/anticorps, sucre/lectine, polynucléotide/complémentaire du polynucléotide. Dans ce cas, c'est le ligand qui porte le partenaire de liaison. L' anti-ligand peut être détectable directement par les réactifs marqueurs décrits au paragraphe précédent ou être lui-même détectable par un ligand/anti-ligand. Ces systèmes indirects de détection peuvent conduire, dans certaines conditions, à une amplification du signal. Cette technique d'amplification du signal est bien connue de l'homme du métier, et l'on pourra se reporter aux demandes de brevet antérieures FR98/10084 ou WO-A-95/08000 de la Demanderesse ou à l'article de Chevalier et al10. Selon le type de marquage utilisé, l'homme du métier ajoutera des réactifs permettant la visualisation du marquage. Le procédé de l'invention permettant de détecter l'albumine modifiée de l'ischémie, il est particulièrement adapté pour le diagnostic in vitro des états ischémiques, ce qui constitue un autre objet de l'invention.
Selon un mode de réalisation particulier et pour déterminer si l'état ischémique est d'origine cardiaque ou non, le procédé de diagnostic in vitro des états ischémiques met également en œuvre la détection d'un marqueur cardiaque.
Des exemples de tels marqueurs cardiaques comprennent, sans aucune limitation, les marqueurs cardiaques classiquement utilisés tels que la troponine, telle que la troponine I ou la troponine T, et la CK-MB (isoforme MB de la créatine kinase), la troponine I étant le marqueur cardiaque préféré. Lorsque, dans le procédé de l'invention, on détecte au moins deux marqueurs, l'IMA étant l'un deux, ils peuvent être mis en évidence de façon séparée, par exemple à l'aide de tests biochimiques différents, ou bien de façon simultanée, en dosage multiplex, selon les techniques décrites précédemment.
L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples suivants donnés à titre illustratif et non limitatif.
Exemple 1 : Séquencage d'Edman
L'IMA a été purifiée en utilisant sa propriété de ne plus fixer les ions divalents afin de l'isoler de l'HSA normale. Pour cela un pool de 10 plasmas de patients ayant eu un angor instable (ischémie) ou un plasma sain ont chacun été déposés sur une colonne de sur résine Nickel-agarose(Pharmacia). Par cette technique, l'HSA non modifiée se fixe sur la résine tandis que l'IMA n'est pas adsorbée et passe dans le filtrat . L'IMA contenue dans les filtrats a été ensuite concentrée et immunopurifiée à l'aide de l'anticorps monoclonal anti-HSA 15C7 (HyTest) couplé sur une résine Sepharose activée au bromure de cyanogène. Après élution par une solution de diéthylamine à 0,1 M pH 11,5, l'IMA a été isolée après électrophorèse SDS-PAGE sur gel d'acrylamide à 12% et transfert sur une membrane de PVDF. Elle a ensuite été séquencée par la technique d'Edman, dans le but de déterminer si la modification qui caractérise l'IMA est un clivage des acides aminés composant son extrémité N-terminale, comme indiqué dans la demande de brevet WO00/20840. Résultats : Position 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
HSA : N-term- D A H K S E VA H R IMA : N-term- D A H K X E VA X X
On retrouve pour l'HSA et l'IMA les même acides aminés du côté N-terminal de la protéine; la modification n'est donc pas un clivage du coté N-terminale de la protéine.
On note cependant pour 3 acides aminés des indéterminations, ce qui laisse penser que ces acides aminés sont altérés par l'ajout d'un groupement.
Exemple 2 : Identification du groupement altérant l'albumine
La technique SELDI-TOF (Ciphergen) a été utilisée pour identifier un ajout de masse lié à la fixation d'un groupement sur l'albumine modifiée de plasmas angor par rapport à l'albumine d'échantillons sains. Linteractionn avec l'anticorps anti- hydroxynonenal a été ensuite caractérisée avec ces 2 mêmes échantillons angor et sain. Les fractions non-adsorbées sur résine Nickel-agarose d'un pool de 4 plasmas angor, ainsi qu'un pool de 14 sérums sains sont immunopurifiés sur résine anti-HSA (anticorps monoclonal AcM 15C7). Les éluats, enrichis en IMA, issus de cette double purification, sont analysés par SELDI-TOF sur barrettes hydrophiles (NP20) et sur barrettes à groupements époxydes (PS20) sur lesquelles sont greffés de façon covalente, via leur fonction aminé, des anticorps anti-HNE (HNEJ-2, JaICA). 2-1-Analyse des profils (NP20) des éluats angor et sains Les éluats obtenus après la double purification de 25 μL du pool de plasmas angor et du pool de plasmas sains, ont été dilués au 1/10 dans de l'eau et 2 μL de ces solutions ont été déposés sur une surface NP20, ainsi que les 3 contrôles suivants : - Dilution au 1/10 de l'éluat obtenu après la double purification d'un standard
HSA-HNE (1:1)
4 ng de HSA purifiée commerciale (HSA comm.) - 10 ng de standard HSA-HNE (1:6) Après séchage, les échantillons ont été analysés par spectrométrie de masse de type SELDI-TOF (Ciphergen ProteinChip System Séries 4000), avec les paramètres suivants : tirs à 150OnJ et 200OnJ, avec focus mass = 66440 Da et matrix atténuation = 10000 Da.
Les résultats sont donnés dans le Tableau 1 ci-dessous. Tableau 1
Figure imgf000011_0001
Les résultats dans le tableau mettent en évidence un décalage de masse significatif entre l'albumine issue des éluats de pool d'échantillons sains et l'albumine du pool d'échantillons angor. L'albumine du pool angor possède une masse supérieure à l'albumine des échantillons normaux (éluat pool sain et HSA commerciale), ce qui signifie que la modification qui caractérise l'IMA serait l'ajout d'un groupement non défini entraînant une augmentation de masse.
2-2-Analyse de l'interaction des éluats angor et sains avec l'anticorps anti- HNE (PS20)
L'anticorps monoclonal anti-HNE-protéine HNEJ-2 (JaICA) a été couplé sur une surface PS20 via ses groupements époxydes. Les éluats obtenus après la double purification de 25 μL du pool de plasmas angor, du pool de plasmas sains et d'un standard HSA-HNE (1:6), ont été dilués au 1/500 dans du PBS (Phosphate Buffer Saline) contenant 0,1% de Tween 20, puis 100 μL de cette solution ont été mis en contact avec la surface PS20-AcM anti-HNE-protéine. Après 3 lavages en PBS-Tween 0,1%, les protéines spécifiquement retenues ont été analysées par spectrométrie de masse SELDI-TOF (Ciphergen ProteinChip System Séries 4000) avec les paramètres suivants : tir à 200OnJ, avec focus mass = 66440 Da et matrix atténuation = 10000 Da.
Aucun signal pour l'éluat de pool sain n'est détecté, alors qu'un signal est détecté pour le pool de plasmas angor et pour le standard HSA-HNE (1:6). Il peut en être conclu que la quantité de HSA-HNE dans les échantillons sains est plus faible que la quantité de HSA-HNE dans les échantillons angor.
Exemple 3 : Analyse par Gaz Chromatograpy Mass Spectrometry
Les 2 fractions non-adsorbées et adsorbées sur une colonne de résine Nickel- agarose, d'un même pool de 6 plasmas angor, sont immunopurifiées avec une résine d'affinité anti-HSA (AcM 15C7). De cette façon, on concentre l'IMA contenue dans ce pool de plasmas angor dans la fraction non retenue par la résine au nickel.
Les 2 fractions purifiées (IMA et HSA) sont dialysées en PBS, concentrées, quantifiées par spectrométrie Dθ279nm et stabilisées par une réduction au NaBD4.
Une quantité identique de l'IMA et de la HSA de ce pool angor est analysée par GCMS, en mesurant la quantité de l'ion correspondant à une association HNE-histidine / HNE- lysine / DHN-cystéine (m/z = 256) et de l'ion correspondant à l'association HNE-cystéine (m/z = 257) suivant la méthode précédemment décrite11.
Les résultats sont donnés dans le tableau 2 suivant. Tableau 2
Figure imgf000012_0001
* Signal pour la même quantité d'albumine.
Les résultats dans le tableau 2 mettent en évidence que la fraction d'albumine non-adsorbée sur résine nickel-agarose d'un plasma angor possède une quantité plus importante de groupements HNE-histidine/HNE-lysine et DHN-cystéine que la fraction qui se lie à cette résine au nickel. La fixation de ces dérivés aldéhyde sur l'albumine entraîne donc une perte d'affinité pour les ions nickel et forme l'IMA. Exemple 4 : Dosage de l'IMA via le dosage de HSA-HNE, HSA-HHE et HSA-
MDA sur une série de plasmas « suspicion de syndrome coronarien aigu » par ELISA de type sandwich
Trois dosages de type ELISA sandwich sont mis au point dans le but doser les groupements hydroxynonenal, hydroxyhexenal et malondialdehyde liés à l'albumine dans les plasmas de patients, et de corréler ces résultats au dosage de l'IMA de ces mêmes échantillons par le test ACB.
Une solution d'anticorps monoclonal anti-HNE-protéine (HNEJ-2 de JaICA), anti-HHE-protéine (HHE53 de JaICA) ou anti-MD A-protéine (1F83 de JaICA), dilué à 10 μg/mL en tampon Tris 0,2 M acide maléique 0,2 M à pH 6,2, a été incubée 2h à 370C sur une plaque noire de 96 puits (anticorps de capture). Après 2h de saturation à 370C avec une solution de PBS contenant 0,2% de gélatine, des plasmas dilués au 1/10 dans du PBS-Tween 0,05% ont été incubés pendant une nuit à 40C. L'IMA, ou albumine modifiée par l'HNE, l'HHE ou le MDA, spécifiquement retenue par l'anticorps monoclonal de capture a été détectée par un anticorps F(ab')2 anti-albumine sérique humaine (AcM 10C3, bioMérieux, France) couplé à la biotine, dilué à 1 μg/mL dans du PBS contenant 0,05% de Tween et 0,1% de gélatine et incubé pendant 2h à 370C. De la streptavidine couplée à de la phosphatase alcaline diluée au 1/10000 en TBS (Tris Buffer Saline) contenant 0,05% de Tween et 0,1% de gélatine a été incubée pendant Ih à 370C. Une mesure du signal fluométrique a ensuite été effectuée après l'introduction d'un substrat fluorogène de la phosphatase alcaline.
Une série de 30 plasmas « suspicion de syndrome coronarien aigu (SCA)», préalablement dosée par le test commercial ACB (Inverness Médical), est utilisée dans notre test ELISA de type sandwich. La conclusion diagnostique de ces 3 tests est comparée dans le tableau 3 suivant. Tableau 3
Figure imgf000014_0001
Les résultats dans le tableau ci-dessus mettent en évidence que le procédé de l'invention permet bien d'exclure tous les patients non SCA. En revanche, il détecte moins de patients à suspicion de SCA que le test ACB. Ceci peut s'expliquer par le fait que le test ACB peut donner de faux positifs. Ne connaissant pas le diagnostic clinique final, il n'est pas sûr que tous les plasmas reconnus positifs par le test ACB soient des plasmas provenant de patients réellement atteints de SCA. Bibliographie
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Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'un partenaire de liaison à un dérivé aldéhyde issu de la peroxydation de lipides sous forme liée à une protéine pour la détection de l'albumine modifiée de l'ischémie (IMA) dans un échantillon biologique.
2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisé en ce que le dérivé aldéhyde issu de la peroxydation de lipides est le 4-hydroxy-2-nonenal, le 4-hydroxy-2-hexenal ou le malondialdéhyde.
3. Utilisation selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le au moins un partenaire de liaison est spécifique d'un dérivé aldéhyde issu de la peroxydation de lipides sous forme liée à l'albumine.
4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le au moins un partenaire de liaison à un dérivé aldéhyde issu de la peroxydation de lipides sous forme lié à une protéine est un anticorps.
5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le au moins un partenaire de liaison à un dérivé aldéhyde issu de la peroxydation de lipides sous forme lié à une protéine est un anticorps monoclonal anti-dérivé aldéhyde issu de la peroxydation de lipides sous forme liée à l'albumine.
6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il met également en œuvre un partenaire de liaison spécifique de l'albumine.
7. Procédé de détection de l'IMA dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il met en œuvre au moins un partenaire de liaison à un dérivé aldéhyde issu de la peroxydation de lipides sous forme liée à une protéine et en ce que, si la protéine de liaison audit dérivé aldéhyde n'est pas l'albumine, il met également en œuvre un partenaire de liaison spécifique de l'albumine.
8. Procédé de détection de l'IMA selon la revendication 7, caractérisé en ce que le dérivé aldéhyde issu de la peroxydation de lipides est le 4-hydroxy-2-nonenal, le A- hydroxy-2-hexenal ou le malondialdéhyde.
9. Procédé de détection de l'IMA selon l'une des revendications 7 ou 8, caractérisé en ce que le au moins un partenaire de liaison est spécifique d'un dérivé aldéhyde issu de la peroxydation de lipides sous forme liée à l'albumine.
10. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que le au moins un partenaire de liaison à un dérivé aldéhyde issu de la peroxydation de lipides sous forme lié à une protéine est un anticorps.
11. Procédé de détection de l'IMA selon la revendication 10, caractérisé en ce que le au moins un partenaire de liaison à un dérivé aldéhyde issu de la peroxydation de lipides sous forme lié à une protéine est un anticorps monoclonal anti-dérivé aldéhyde issu de la peroxydation de lipides sous forme liée à l'albumine.
12. Procédé de diagnostic in vitro des états ischémiques, caractérisé en ce qu'il met en œuvre le procédé de détection de l'IMA selon l'une quelconque des revendications 7 à 11.
13. Procédé de diagnostic in vitro des états ischémiques du myocarde selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il met en œuvre également la détection d'un marqueur cardiaque.
14. Anticorps monoclonal se liant spécifiquement à un dérivé aldéhyde issu de la peroxydation de lipides sous forme liée à l'albumine.
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