WO2009113832A1

WO2009113832A1 - Ｄｅｓ-Ｒ 프로트롬빈 활성 펩티드 단편 Ｆ２의 혈청 내 농도 측정을 통한 암의 모니터링,진단 및 스크리닝 방법

Info

Publication number: WO2009113832A1
Application number: PCT/KR2009/001266
Authority: WO
Inventors: 김철우; 박필제; 신용성; 이길현; 신호상; 김병권
Original assignee: 주식회사 바이오인프라
Priority date: 2008-03-14
Filing date: 2009-03-13
Publication date: 2009-09-17
Also published as: EP2251354A1; KR20090098418A; EP2251354A4; KR100967614B1; ES2566969T3; US8435748B2; EP2251354B1; US20110086404A1

Abstract

본 발명은 des-R-프로트롬빈 활성 펩티드 단편 F2(des-R prothrombin activation peptide fragment F2; des-R F2)의 혈청 내 농도 측정을 통한 암의 진단 및 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 간암, 유방암 및 위암에 특이적으로 발현이 감소하는 단백질 마커인 des-R-프로트롬빈 활성 펩티드 단편 F2 및 상기 단백질 마커의 정량에 의한 간암, 유방암 및 위암을 진단 및 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 단백질 마커는 정상인과 간암, 유방암 및 위암 환자에서 발현량의 차이를 확인함으로써 간암, 유방암 및 위암 진단 및 스크리닝에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

Ｄｅｓ－Ｒ 프로트롬빈 활성 펩티드 단편 Ｆ２의 혈청 내 농도 측정을 통한 암의 모니터링，진단 및 스크리닝 방법

본 발명은 암 모니터링, 진단 및 스크리닝용 단백질 마커, 및 이를 이용한 암의 모니터링, 진단 및 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 간암, 유방암 및 위암에서 특이적으로 발현이 감소하는 단백질 마커인 des-R-프로트롬빈 활성 펩티드 단편 F2(des-R prothrombin activation peptide fragment F2, des-R F2), 및 상기 단백질 마커의 정량을 이용한 간암, 유방암 및 위암을 모니터링, 진단 및 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

1984년 헨리 밴스-존스(Henry Bence-Jones)가 산화된 뇨에서 침전하는 단백질을 다발성 골수종(multiple myeloma)의 진단용 바이오마커(biomarker)로 처음 사용한 이후, 수많은 종양관련 바이오마커(종양 마커, 암 마커, 종양 표지자, 암 표지자 등)가 개발 및 보고되었으며, 종양마커의 개념이 보다 넓어지고, 다양한 정의가 사용되고 있다(Diamandis, E. P., et al., AACC Press, Washington DC, pp. 3-8, 2002). 그러나 대부분의 연구자들이 암 관련 바이오마커에 대하여 갖고 있는 공통된 정의는 다음과 같다. 종양 마커란 전암성 병변(pre-cancerous condition) 또는 암성 병변에서 정량적 또는 정성적 변화를 보이는 특정 분자, 물질 또는 과정으로 정의한다(Hayes D. F. et al., J Natl Cancer Inst 88, 1456-66, 1996). 이러한 변화는 종양 자체에 의하여 초래될 수도 있으며 종양에 대한 정상조직의 반응에 의하여서도 초래될 수 있다.

국내(대한민국)의 경우 1970년도부터 암 발생률이 점차 증가하여 현재 전체 사망원인 중 1위를 암 질환이 차지하게 되었다. 2005년 국민건강보험공단 암환자 자료에 의하면 암 종류별 발생빈도 순위는 위암, 대장암, 폐암, 간암, 갑상선암 순이었으며, 남자의 경우 위암, 폐암, 간암, 대장암, 전립선암 순이고, 여자의 경우 갑상선암, 유방암, 위암, 대장암, 폐암 순이었다. 상기 보고서에 의하면 2005년 한해 암으로 인한 사망이 65,479명에 이를 정도로 암질환은 현재 국내에서 가장 높은 사망원인으로 기록되었다. 상기 암들은 전립선암 및 갑상선암을 제외하고 대부분 진행된 상태에서 발견되며, 진단 당시 50% 전후의 완치율을 보이는 것으로 알려져 있다. 2003년 국립암센터의 연구결과를 보면 암으로 인해 환자가 직접 부담하는 직접비용은 한해 2조 2천억 원, 조기사망 및 보호자 손실비용 등 생산성 손실부담을 포함하면 경제적 총부담은 한해 15조원을 넘는다. 암 환자들은 암 발생 후 56%가 직업을 상실할 정도로 건강과 보건의 측면과 더불어 개인 및 국가 경제에 막대한 손실을 주는 질환으로 평가된다. 이에 반해 조기 위암의 경우 완치율이 90%, 유방암의 경우 조기 진단시 생존율이 95%를 기록하는 등 상기 주요 암 질환의 조기 진단은 암으로 인한 개인의 완치율에 있어 획기적인 개선과 더불어 막대한 보건적 및 경제적 유효성을 가지고 있다. 따라서 여러 국가에서 막대한 예산을 투자하여 간편하고 정확한 조기진단법의 개발을 위해 노력하고 있다. 전립선암의 진단에 활용되는 전립선 특이항원(prostate specific antigen, PSA) 측정법은 혈청을 통해 손쉽게 측정할 수 있으며 전립선암으로 인한 사망률 감소에 획기적인 전기를 가져다주게 되어, 국내외 여러 연구자들이 혈청 등에서 다양한 종양관련 바이오마커를 발굴하기 위해 노력하고 있다.

종양 관련 바이오마커의 연구-바이오마커의 개발(identification)과 유효성 검증(validation)은 전통적으로 많은 시간과 노동이 요구되는 과정이었다. 이러한 전통적 연구방법에 커다란 변혁을 가져다준 것은 인간 유전체 프로젝트(인간 게놈 프로젝트)의 완성과 고집적 유전자 칩(DNA microarray) 기반 기술 및 프로테옴 기법을 활용한 고-수행(high-throughput) 연구기법의 활용을 들 수가 있다.

유전자 칩을 활용한 게놈 분석 방법이 암질환의 병태생리에 대한 이해와 진단에 유용한 바이오마커의 발굴에 중요한 역할을 하고 있음은 주지의 사실이다. 그러나 게놈분석 방법은 결정적 제한점을 가지고 있는데 이는 종양에서의 mRNA 전사 활성도가 단백 발현의 정도를 직접 반영하지 못하며 관련 단백의 기능을 직접적으로 반영할 수 없다는 것이다. 이는 유전정보(DNA)가 RNA로 전사되어 단백질 생성이 이루어진다 할지라도 RNA 수준, 단백질 발현과정(translation)과 번역 후 단백질 변형(post-translational modification) 수준에서 무수히 많은 다양화 과정을 거치기 때문이다. 따라서 유전자의 최종적 산물인 단백질에 대한 분석(프로테옴)이 되어야만 특정 유전자와 해당 단백이 종양의 발생에서 갖는 생물학적 의미를 알게 하며, 진단에 유용한 바이오마커를 발굴을 가능케 하고, 향후 약물의 치료적 표적의 개발에 중요한 단서가 제공될 수 있겠다.

이차원 전기영동(2-Dimensional Gel Electrophoresis), MALDI-TOF MS(Matrix-assisted laser desorption and ionization time-of-flight mass spectrometry) 및 SELDI-TOF MS(surface-enhanced laser desorption and ionization time-of-flight mass spectrometry) 방법은 현재 소개되고 있는 고-수행(high-throughput) 프로테옴 분석 방법으로, 상기 기술들은 매우 넓은 범위의 분자량에 걸쳐있는 모든 단백질 및 변형 단백질의 발현양상을 분석(profile)할 수 있게 한다(Richter R. et al., J Chromotogr B Biomed Sci Appl 726, 2535, 1999; Paweletz C.P. et al., Drug Dev Research 49, 3442, 2000). 이중 SELDI-TOF MS는 MALDI-TOF MS와 비슷하나, 상대적으로 높은 민감도의 정량과 우수한 재현성을 목적으로 설계되었다. 복잡한 생화학 물질들을 다룰 수 있으며, 아주 적은 양의 단백질 시료만을 가지고도 정제 없이 바로 사용될 수 있고, 이 밖에 표식자 전처리나 매트릭스 혼합 작업이 불필요한 점 등 여러 장점을 가지고 있다. 그러나 간암, 유방암 및 위암을 보다 쉽고 정확하게 진단하기 위한 새로운 마커 및 이를 이용한 방법이 필요한 상황이다.

이에, 본 발명자들은 간암, 유방암 및 위암 환자와 정상인 혈청 샘플의 단백질 양상을 SELDI-TOF MS, 단백질 서열분석 및 바이오인포매틱스 방법을 이용함으로써 간암, 유방암 및 위암을 모니터링, 진단 및 스크리닝할 수 있는 단백질 마커를 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 암 모니터링, 진단 및 스크리닝용 단백질 마커, 상기 단백질 마커를 이용하는 암 모니터링, 진단 및 스크리닝하는 방법, 및 상기 단백질 마커를 이용하는 암 모니터링, 진단 및 스크리닝용 키트를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 des-R-프로트롬빈 활성 펩티드 단편 F2(des-R prothrombin activation peptide fragment F2; des-R F2)에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 암 모니터링, 진단 및 스크리닝용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은

1) 피검체의 시료로부터 des-R-프로트롬빈 활성 펩티드 단편 F2의 발현량을 측정하는 단계; 및

2) 단계 1)의 des-R-프로트롬빈 활성 펩티드 단편 F2의 발현량을 정상 개체의 발현량과 비교하여 발현이 감소하는 개체를 선별하는 단계를 포함하는, 암 모니터링, 진단 및 스크리닝을 위한 des-R-프로트롬빈 활성 펩티드 단편 F2의 검출 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 des-R-프로트롬빈 활성 펩티드 단편 F2에 특이적으로 결합하는 생물분자들이 고형기질에 집적된 암 모니터링, 진단 및 스크리닝용 바이오칩을 제공한다.

또한, 본 발명은 des-R-프로트롬빈 활성 펩티드 단편 F2를 암 모니터링, 진단 및 스크리닝용 키트의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.

아울러, 본 발명은 des-R-프로트롬빈 활성 펩티드 단편 F2를 암 모니터링, 진단 및 스크리닝용 바이오칩의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 des-R-프로트롬빈 활성 펩티드 단편 F2(des-R prothrombin activation peptide fragment F2; des-R F2)에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 암 모니터링, 진단 및 스크리닝용 키트를 제공한다.

상기 des-R-프로트롬빈 활성 펩티드 단편 F2는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 des-R-프로트롬빈 활성 펩티드 단편 F2는 각각 N-말단(N-terminal) 부위에 서열번호 2(Ser Glu Gly Ser Ser Val Asn Leu Ser Pro Pro Leu)로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 에피토프(epitope)를 가지고, C-말단(C-terminal) 부위에 서열번호 3(Gly Leu Asp Glu Asp Ser Asp Arg Ala Ile Glu Gly)으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 에피토프(epitope)를 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 des-R-프로트롬빈 활성 펩티드 단편 F2는 정상 개체에 비해 암을 가진 개체에서 발현량이 감소하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 암은 간암, 유방암 또는 위암인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 항체는 des-R-프로트롬빈 활성 펩티드 단편 F2의 카르복시 말단 부위에 해당되는 에피토프에 특이적으로 결합하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 키트는 암을 가진 개체와 정상 개체에서 발현에 차이가 있는 단백질 마커인 des-R F2를 측정하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 키트는 개체가 암인지 아닌지를 구별하여 진료 행위자가 모니터링, 진단 및 스크리닝하는 것을 가능하게 할 뿐 아니라, 치료에 대한 개체의 반응을 모니터하여 그 결과에 따라 치료를 변경하는 것을 가능하게 한다.

본 발명의 키트에 사용될 수 있는 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 에피토프와 결합할 수 있는 단편 등을 포함한다.

다클론 항체는 단백질 마커인 des-R F2를 동물에 주사하고 해당 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 종래의 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 당업계에 알려진 어떠한 방법에 의해서든 정제될 수 있고, 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 만들어질 수 있다.

단클론 항체는 연속 세포주의 배양을 통한 항체 분자의 생성을 제공하는 어떠한 기술을 사용하여도 제조할 수 있다. 이러한 기술로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 하이브리도마 기술, 사람 B-세포 하이브리도마 기술 및 EBV-하이브리도마 기술이 포함된다(Kohler G et al., Nature 256:495-497, 1975; Kozbor D et al., J Immunol Methods 81:31-42, 1985; Cote RJ et al., Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030, 1983; 및 Cole SP et al., Mol Cell Biol 62:109-120, 1984).

또한, 상기 마커 단백질에 대한 특정 결합 부위를 함유한 항체 단편이 제조될 수 있다. 예를 들면 이들로 한정되는 것은 아니지만 F(ab')2 단편은 항체 분자를 펩신으로 분해시켜 제조할 수 있으며, Fab 단편은 F(ab')2 단편의 디설파이드 브릿지를 환원시킴으로써 제조할 수 있다. 다른 방도로서, Fab 발현 라이브러리를 제작하여 원하는 특이성을 갖는 단클론 Fab 단편을 신속하고 간편하게 동정할 수 있다(Huse WD et al., Science 254: 1275-1281, 1989).

상기 항체는 세척이나 복합체의 분리 등 그 이후의 단계를 용이하게 하기 위해 고형 기질(solid substrate)에 결합될 수 있다. 고형 기질은 예를 들어 합성수지, 니트로셀룰로오스, 유리기판, 금속기판, 유리섬유, 미세구체 및 미세비드 등이 있다. 또한, 상기 합성수지에는 폴리에스터, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, PVDF 및 나일론 등이 있다. 본 발명에 있어서, 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 고형 기질에 결합시키기 위해, 미세구체를 현탁한 후 마이크로튜브(microtube)에 옮겨 원심분리로 상층액을 제거한 후 재현탁하고, N-하이드록시-설포숙시니마이드(N-hydroxy-sulfosuccinimide) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이마이드 하이드로클로라이드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride)를 차례로 처리한 후 원심분리로 상층액을 제거한 후 세척하여 보관하였다.

또한, 환자로부터 수득된 시료를 고형 기질에 결합된 상기 단백질 마커에 특이적으로 결합할 수 있는 항체와 접촉시키는 경우, 시료는 항체와 접촉 전에 알맞은 정도로 희석될 수 있다.

본 발명의 키트는 상기 단백질 마커에 특이적으로 결합하는 검출용 항체를 포함할 수 있다. 상기 검출용 항체는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지한 접합체(conjugate)일 수 있고, 바람직하게는 상기 마커에 특이적으로 결합할 수 있는 1차 항체일 것이다. 예를 들어, 상기 발색효소는 퍼록시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase) 또는 산성 포스파타제(acid phosphatase)(예: 양고추냉이 퍼록시다제(horseradish peroxidase))일 수 있고; 형광물질인 경우, 플루오레신카복실산(FCA), 플루오레신 이소티오시아네이트(FITC), 플루오레신 티오우레아(FTH), 7-아세톡시쿠마린-3-일, 플루오레신-5-일, 플루오레신-6-일, 2',7'-디클로로플루오레신-5-일, 2',7'-디클로로플루오레신-6-일, 디하이드로테트라메틸로사민-4-일, 테트라메틸로다민-5-일, 테트라메틸로다민-6-일, 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 또는 4,4-디플루오로-5,7-디페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 등을 사용하는 것이 가능하다.

또한, 본 발명의 키트는 추가로 (1) 상기 마커에 특이적으로 결합하는 검출용 항체 및 (2) 상기 검출용 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 포함할 수 있다. 상기 리간드에는 단백질 A 또는 검출용 항체에 특이적으로 결합하는 2차 항체 등이 있다. 또한 상기 리간드는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지한 접합체(conjugate)일 수 있다. 상기 검출용 항체는 상기 리간드를 위해, 바이오틴화(biotinylation) 또는 다이곡시제닌(digoxigenin) 처리한 1차 항체를 이용하는 것이 바람직하나, 상기 검출용 항체의 처리방법은 이에 한정되지 않는다. 또한 상기 리간드로는 상기 검출용 항체에 결합하기 위해, 스트렙타비딘 또는 아비딘 등이 사용되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 구체적인 실시예에서 상기 검출체로 형광물질을 부착한 스트렙타비딘(streptavidin)을 리간드로 사용하였으며, 상기 리간드를 위해 바이오틴화(biotinylation)시킨 검출용 항체를 이용하였다.

본 발명의 키트는 상기 항체 및 마커 복합체에 검출용 항체를 처리한 후 검출용 항체의 양을 탐색함으로써 암을 모니터링, 진단 및 스크리닝할 수 있다. 또는 상기 항체 및 마커 복합체에 검출용 항체 및 리간드를 순차적으로 처리한 후, 검출용 항체의 양을 탐색함으로써 암을 진단 및 스크리닝할 수 있다. 본 발명에서, 검출용 항체를 세척된 항체-마커 복합체와 정온배치한 후 세척하여 검출용 항체를 측정함으로써 상기 마커의 양을 측정할 수 있다. 검출용 항체의 양 측정이나 존재 검출은 형광, 발광, 화학발광(chemiluminescence), 흡광도, 반사 또는 투과를 통해 이루어질 수 있다.

또한, 상기 검출용 항체 또는 리간드의 양을 탐색하는 방법으로는 초고속 스크리닝(high throughput screening, HTS) 시스템을 이용하는 것이 바람직하고, 여기에는 검출체로 형광물질이 부착되어 형광을 검출함으로써 수행되는 형광법 또는 검출체로 방사선 동위원소가 부착되어 방사선을 검출함으로써 수행되는 방사선법; 검출체의 표지 없이 표면의 플라즈몬 공명 변화를 실시간으로 측정하는 SPR(surface plasmon resonance) 방법 또는 SPR 시스템을 영상화하여 확인하는 SPRI(surface plasmon resonance imaging) 방법을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

예를 들어 상기 형광법은 형광 스캐너 프로그램을 이용하여 상기 검출용 항체를 형광물질로 라벨링한 후 스포팅하여 신호를 확인하는 방법으로, 이 방법을 적용하여 결합 정도를 확인할 수 있다. 상기 형광물질은 Cy3, Cy5, 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate, FITC), 로다민-B-이소티오시아네이트(rhodamine-B-isothiocyanate, RITC), 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 SPR 시스템은 형광법과는 달리 시료를 형광물질로 표지할 필요가 없이 항체의 결합 정도를 실시간으로 분석하는 것이 가능하나 동시다발적인 시료 분석이 불가능하다는 단점이 있다. SPRI의 경우에는 미세정렬 방법을 이용하여 동시다발적인 시료 분석이 가능하지만 탐지 강도가 낮은 단점이 있다.

본 발명의 키트는 효소와 발색 반응할 기질 및 결합되지 않은 단백질 등은 제거하고 결합된 마커만을 보유할 수 있는 세척액 또는 용리액을 추가로 포함할 수 있다. 분석을 위해 사용되는 시료는 혈청, 뇨, 눈물 타액 등 정상적인 상태와 구별될 수 있는 질환 특이적 폴리펩타이드를 확인할 수 있는 생체 시료를 포함한다. 바람직하게는 생물학적 액체 시료, 예를 들어 혈액, 혈청, 혈장, 더욱 바람직하게는 혈청으로부터 측정될 수 있다. 시료는 마커의 탐지감도를 증가시키도록 준비될 수 있는데 예를 들어 환자로부터 수득한 혈청 시료는 음이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 액체 크로마토그래피, 연속추출(sequential extraction) 또는 젤 전기영동 등의 방법을 이용하여 전처리될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명자들은 암 진단에 유용한 바이오마커를 발굴하기 위해 임상적으로 확진된 간암, 유방암, 위암 질환 개체 및 정상적인 개체의 혈청을 수득한 후 SELDI-TOF MS(surface-enhanced laser desorption and ionization time-of-flight mass spectrometry) 방법을 이용하여 단백질 분석을 수행하였다. 상기 단백질 분석은 SELDI-TOF MS(surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry), MALDI-TOF MS(Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry) 또는 ESI-Q-TOF MS(Electrospray-quadrupole-time of flight mass spectrometry)를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다(Richter R. et al., J Chromotogr B Biomed Sci Appl 726, 2535, 1999; Paweletz C.P. et al., Drug Dev Research 49, 3442, 2000). 생성된 피크(peak)들에 대한 Mann-Whitney U-test p-value, AUC(area under the receiver operator characteristic curve, ROC 곡선 하위 부위)를 정상인 그룹 및 암환자 그룹 간에 비교하였다. 그 결과, 전체 피크(peak)들 중 12.5 kDa 피크(12,451 m/z)가 공통적으로 3가지 암에서 정상인 그룹과 현저한 차이를 보였고, 정상인에 비해 정도는 다르지만 공통적으로 감소하는 경향을 나타내었다. 각 암환자 그룹의 정상인에 대한 평균값의 비율을 보면 간암, 위암, 유방암 순으로 감소하는 정도가 큰 것을 확인하였다(표 1, 도 1 내지 도 7 참조).

본 발명자들은 간암, 유방암 및 위암 환자에서 유의한 변화를 보이는 SELDI-TOF MS 피크(peak)의 단백질을 분리하기 위해 혈청으로부터 크로마토그래피와 이차원 전기영동으로 분리하였다. 상기 크로마토그래피는 이온교환 크로마토그래피(Ion-exchange chromatography) 및 소수성 크로마토그래피(Hydrophobic chromatography)를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명자들은 간암, 유방암 및 위암 환자에서 유의한 변화를 보이는 SELDI-TOF MS 피크(peak)의 단백질을 동정하기 위해 상기 크로마토그래피와 이차원 전기영동으로 분리된 단백질 분획(fraction)을 염색 및 용리한 후, ESI-Q-TOF MS/MS 및 N-말단 아미노산 서열분석(N-terminal amino acid sequencing) 방법을 이용하여 확인하였다. 그 결과, Ser-Glu-Gly-Ser-Ser-Val-Asn(서열번호: 4)의 아미노산 잔기 서열을 밝힐 수 있었다. 이 서열은 프로트롬빈 프리커서(Prothrombin precursor(P00734))의 아미노산 잔기 199-205에 해당하는 부분으로 프로트롬빈 활성 펩티드 단편 F2(Prothrombin activation peptide fragment F2)의 N-말단(N-terminal) 부분임을 알 수 있었다. ESI-Q-TOF MS/MS 분석 결과와 N-말단 아미노산 서열분석 결과를 종합해서 전체 아미노산 서열을 확인한 결과, 프로트롬빈 활성 펩티드 단편 2에서 C-말단 아르기닌(C-terminal arginine) 잔기 하나가 떨어져 나간 des-R-프로트롬빈 활성 펩티드 단편 F2(des-R F2)로 알려졌으며, 이론적으로 계산한 분자량(12,457 Da)과 SELDI-TOF MS에서 찾은 피크(peak)(12,451 m/z)가 일치하였다(도 8 내지 도 11 참조). 상기 des-R-프로트롬빈 활성 펩티드 단편 F2의 서열은 다음과 같다:

Ser Glu Gly Ser Ser Val Asn Leu Ser Pro Pro Leu Glu Gln Cys

Val Pro Asp Arg Gly Gln Gln Tyr Gln Gly Arg Leu Ala Val Thr

Thr His Gly Leu Pro Cys Leu Ala Trp Ala Ser Ala Gln Ala Lys

Ala Leu Ser Lys His Gln Asp Phe Asn Ser Ala Val Gln Leu Val

Glu Asn Phe Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Glu Glu Gly Val Trp

Cys Tyr Val Ala Gly Lys Pro Gly Asp Phe Gly Tyr Cys Asp Leu

Asn Tyr Cys Glu Glu Ala Val Glu Glu Glu Thr Gly Asp Gly Leu

Asp Glu Asp Ser Asp Arg Ala Ile Glu Gly(서열번호: 1)

또한, 본 발명은

1) 피검체의 시료로부터 des-R-프로트롬빈 활성 펩티드 단편 F2(des-R prothrombin activation peptide fragment F2; des-R F2)의 발현량을 측정하는 단계; 및

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 des-R-프로트롬빈 활성 펩티드 단편 F2는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 des-R-프로트롬빈 활성 펩티드 단편 F2는 각각 N-말단 부위에 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 에피토프(epitope)를 가지고, C-말단 부위에 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 에피토프를 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 시료는 혈액, 혈청 또는 혈장인 것이 바람직하고, 혈청인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 발현량은 이차원 전기영동(2-Dimensional Gel Electrophoresis), MALDI-TOF MS(Matrix-assisted laser desorption and ionization time-of-flight mass spectrometry) 또는 SELDI-TOF MS(surface-enhanced laser desorption and ionization time-of-flight mass spectrometry) 방법을 이용하여 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 2)의 선별은 바이오인포매틱스(bioinformatics) 방법을 도입하여, 정상 개체와 피검체 간 단백질 마커의 발현량을 비교하여, 상기 발현량의 감소를 나타내는 암을 가진 개체를 선별하는 것이 바람직하다. 상기 바이오인포매틱스를 이용한 분석방법은 대한민국 특허 제 0679173호에 기재되어 있다.

상기 방법에 있어서, 단계 2)의 암은 간암, 유방암 또는 위암인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 단백질 마커를 이용하면, 암 질환의 발병 여부를 확인하고자 하는 분석 대상 혈청 프로테옴을 입력받아 상기한 바와 같이 바이오인포매틱스 방법에 의해 분석하여 질환 특이적 마커 단백질인 des-R F2의 발현 패턴을 혈청 내 본 발명의 마커 단백질의 양과 정상 표본의 단백질 양을 수치화한 후 비교하여, 비교 결과에 따라 분석 대상 혈청 프로테옴 패턴이 정상인지 암 질환 상태인지 확인하는 모니터링, 진단 및 스크리닝이 가능하다.

상기 생물분자는 항체 또는 앱타머인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 고형기질은 플라스틱, 유리, 금속 및 실리콘으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 단백질 마커를 이용하면, 암 질환의 발병 여부를 확인하고자 하는 분석 대상 혈청 프로테옴을 입력받아 바이오인포매틱스 방법에 의해 분석하여 질환 특이적 마커 단백질인 des-R F2의 발현 패턴을 혈청 내 본 발명의 마커 단백질의 양과 정상 표본의 단백질 양을 수치화한 후 비교하여, 비교 결과에 따라 분석 대상 혈청 프로테옴 패턴이 정상인지 암 질환 상태인지 확인하는 모니터링, 진단 및 스크리닝이 가능하다.

본 발명의 des-R-프로트롬빈 활성 펩티드 단편 F2는 정상 개체에 비해 간암, 유방암 또는 위암을 가진 개체에서 특이적으로 발현량이 감소하므로, 이를 마커 단백질로 이용하여 간암, 유방암 또는 위암에 대한 모니터링, 진단 및 스크리닝을 위한 키트 또는 바이오칩을 제조할 수 있음을 알 수 있다.

본 발명의 des-R-프로트롬빈 활성 펩티드 단편 F2(des-R prothrombin activation peptide fragment F2, des-R F2)는 간암, 유방암 및 위암 환자의 체액 내에서 발현량이 감소함으로써, 상기 단백질의 발현량을 확인하는 것만으로 간편하게 간암, 유방암 및 위암의 조기 진단 및 스크리닝을 가능하게 함으로써 신속한 치료가 가능하게 하여 간암, 유방암 및 위암 환자의 생존율을 향상시키고 암 치료로 인한 국가적 손실을 줄이는데 기여할 수 있을 것이다.

도 1은 간암 환자의 혈청을 스펙트럼 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 2는 위암 환자의 혈청을 스펙트럼 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 3은 유방암 환자의 혈청을 스펙트럼 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 4는 정상인과 간암 환자의 혈청의 스펙트럼을 비교하는 그림이다.

도 5는 간암 환자의 혈청의 스펙트럼 분석 결과 정상인에 비해 12.5 kDa의 피크의 정도가 감소하였음을 나타내는 산포도이다.

도 6은 위암 환자의 혈청의 스펙트럼 분석 결과 정상인에 비해 12.5 kDa의 피크의 정도가 감소하였음을 나타내는 산포도이다.

도 7은 유방암 환자의 혈청의 스펙트럼 분석 결과 정상인에 비해 12.5 kDa의 피크의 정도가 감소하였음을 나타내는 산포도이다.

도 8은 12.5 kDa 피크의 단백질을 이차원 전기영동한 결과 및 상기 단백질을 용리한 후 SELDI-TOF MS로 분석한 결과를 나타내는 그림이다.

도 9는 12.5 kDa 피크의 단백질을 ESI-Q-TOF MS/MS로 분석한 결과를 나타내는 그림이다.

도 10은 12.5 kDa 피크의 단백질을 N-말단 서열결정을 이용한 결과인 프로트롬빈 프리커서(P00734)의 아미노산 잔기를 나타내는 그림이다.

도 11은 12.5 kDa 피크의 단백질(des-R F2)의 전체 아미노산 서열을 나타내는 그림이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 혈청 수득 및 보관

본 발명에서는 정상인 71명(여자 29명, 남자 42명)과 간암 환자 66명(여자 14명, 남자 52명)을 대상으로 한 실험, 정상인 250명(여자 119명, 남자 131명)과 위암 환자 245명(여자 84명, 남자 161명)을 대상으로 한 실험, 및 정상인 196명(여자 196명)과 유방암 환자 252명(여자 252명)을 대상으로 한 실험 등, 3가지 암에 대해 각각 실험하였다.

간암관련 실험에 포함된 정상인들의 나이는 29세 ~ 64세(mean: 46.9, median: 47)였으며 간암 환자들의 나이는 35세 ~ 75세(mean: 57.1, median: 58)였다. 또한, 위암관련 실험에 포함된 정상인들의 나이는 23세 ~ 67세(mean: 45.7, median: 45)였으며 위암 환자들의 나이는 28세 ~ 86세(mean: 59.1, median: 61)였다. 위암 환자의 병기별 분포는 1기-129명, 2기-48명, 3기-36명, 4기-32명이었다. 아울러, 유방암관련 실험의 경우 성별은 모두 여성으로 하였으며 실험에 포함된 정상인들의 나이는 23세 ~ 71세(mean: 46.5, median: 45)였으며 유방암 환자들의 나이는 21세 ~ 82세(mean : 47.5, median : 47)였다. 유방암 환자의 병기별 분포는 0기-17명, 1기-71명, 2기-104명, 3기-50명, 4기-10명이었다.

상기 정상인, 간암, 유방암 및 위암 환자로부터 Vacutainer SST II tube(Becton Dickinson)에 말초혈액 5㎖를 채취하여 상온에 한 시간 동안 방치한 후 1500g에서 10분 동안 원심분리하여 생긴 상층액을 취해 혈청을 얻었으며 사용하기 전까지 -80℃에 보관하였다.

<실시예 2> 혈청 단백질 분석

혈청은 음이온 교환 단백질 칩 어레이(Anion Exchange(Q10) ProteinChip array(Ciphergen))로 분석하였다. 우선, 혈청 10㎕를 가용성 완충용액(Solubilization buffer)(9M Urea, 2% CHAPS) 15㎕로 희석하여 상온에 30분간 방치한 후 희석된 샘플 5㎕에 Q10 결합 완충용액(Binding buffer)(0.05% Triton X-100 in 50mM HEPES, pH 7.0) 45㎕을 가하고 보르텍스(Vortex)로 잘 섞어주었다. Q10 칩을 평형화시키기(Q10 Chip Equilibration)위해 결합 완충용액 10㎕를 스팟(spot)마다 로딩(loading)하고 상온에서 5분간 두었다. 결합 완충용액을 제거한 후 다시 결합 완충용액 10㎕를 스팟(spot)에 로딩하고 5분간 상온에 두었다. 스팟(Spot)에 혈청 혼합물(Serum mixture)(혈청 샘플+가용성 완충용액+결합 완충용액)을 5㎕씩 로딩한 후, 상온의 항습 챔버(humidity chamber)에서 1시간 동안 반응시켰다. 혈청 혼합물을 제거하고, 결합 완충용액 10㎕를 로딩하고, 바로 결합 완충용액을 제거하였다(4회 더 반복). 결합 완충용액을 제거하고, HPLC용 초순수(HPLC water) 5㎕를 로딩한 후 HPLC용 초순수를 제거하였다(2회 더 반복). 칩을 상온에서 건조시킨 후 SPA 용액(50% 아세토니트릴(Acetonitrile), 0.5% 트리플루오로아세트산(Trifluoroacetic Acid)용액에 5㎎ sinapinic acid를 녹여 만듦)을 건조된 스팟(spot) 위에 1㎕ 로딩하고 SPA가 건조되면 1㎕ 더 로딩하였다. 상기 스팟(Spot)이 완전히 건조되면, 칩을 ProteinChip System Series 4000(Ciphergen Biosystems Inc., Fremont, CA, USA)으로 스펙트럼을 얻었다. 이때 조건은 Focus mass 15,000, laser energy 3000 nJ, 265 shots, 1000-200000 Da 범위였다.

<실시예 3> 스펙트럼 분석

Mass calibration은 보빈 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(bovine Superoxide dismutase), 에퀸 미오글로빈(equine Myoglobin), 보빈 베타-락토글로빈 A(bovine beta-lactoglobulin A) 및 홀스라디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase)(Ciphergen Biosystems Inc., Fremont, CA, USA)를 보정물질(calibrant)로 사용하여 외부 교정(external calibration)하였고, 총 이온 전류(total ion current)를 이용하여 표준화(normalization)하였다. Ciphergen Express Client ver. 3.0 소프트웨어를 사용하여 노이즈에 대한 시그날(signal-to-noise) 5 이상, 골 깊이(valley depth) 5 이상, 최소의 피크 역가(minimum peak threshold)는 0%, 집단 질량 창(cluster mass window) 0.3% MW 조건에서 자동으로 피크 검색(peak detection)을 수행하여 모두 203개의 피크 집단(peak cluster)이 생성되었다. 상기 피크(peak)들에 대한 Mann-Whitney U-test p-value, AUC(area under the receiver operator characteristic curve, ROC 곡선 아래 부위)를 정상인 그룹과 암환자 그룹간에 비교하였다.

그 결과, 전체 피크들 중 12.5 kDa 피크(12,451 m/z)가 3가지 암에서 공통적으로 정상인 그룹과 현저한 차이를 보였는데, 하기 표 1에 나타낸 것처럼 정상인에 비해 정도는 다르지만 공통적으로 감소하는 경향을 나타내었다. 각 암환자 그룹의 정상인에 대한 평균값의 비율을 보면 위암 0.57, 유방암 0.67, 간암 0.31로 간암, 위암, 유방암 순으로 감소하는 정도가 컸다. AUC 값은 위암 0.76, 유방암 0.73, 간암 0.97 이었다(도 1 내지 도 7).

표 1

	평균(암)	평균(정상)	평균(암)/평균(정상)	p-value
간암	간암환자n=66	정상인n=71
간암	4.14	13.21	0.31	1.56 10^-21
위암	위암환자n=245	정상인n=250
위암	11.14	19.39	0.57	1.16 10^-23
유방암	유방암환자n=252	정상인n=196
유방암	6.93	10.31	0.67	1.73 10^-17

<실시예 4> 12,451 m/z의 단백질 분리

<4-1> 내열성 혈청 샘플의 제조

0.2M Tris-HCl(pH 9.0)(7% PEG 6000(Merck) 및 20mM EDTA를 포함한다) 용액 50㎖과 Pooled Human Serum(Serologicals corporation, Norcross, GA, USA) 50㎖을 1 : 1 비율로 섞어주었다. 1ℓ 비이커에 물을 100℃로 끓이고 50㎖ 튜브(tube) 4개에 각각 25㎖의 혼합액을 넣은 후 100℃에서 10분간 끓여주었다. 이때 2분에 한 번씩 튜브(tube)를 꺼내어 보르텍스 믹스(vortex mix)해 주었다. 상온에서 10분간 방치한 후 3,000 rpm으로 15분간 원심분리하여 상층액을 분리하였다. 상층액에 부유물이 떠다닐 경우에는 여과하여 크로마토그래피를 실시하였다. 그 결과, 끓인 혈청(boiled serum)이 약 50~60㎖ 정도 수득하였다.

<4-2> 이온교환 크로마토그래피

100mM 인산 나트륨(sodium phosphate) 및 50mM 시트르산(citric acid)을4.6 : 5.4의 비율로 혼합한 완충용액(pH 4.5~6.0)을 제조하여 끓인 혈청(boiled serum)을 1 : 2의 비율로 희석하였다(끓인 혈청 50㎖ + 완충용액 100㎖ = 150㎖). 10㎖ 용량의 원심분리 컬럼(Handee^TM Centrifuge Columns(PIERCE)) 4개에 각각 Q-Sepharose Fast Flow resin(Sigma Q1126) 2㎖을 패킹(packing)하였다. 상기 패킹된 컬럼을 1,000g-포스(force)로 2분 동안 원심분리하여 보존용액을 스핀아웃(spin out)한 후 처음 제조한 완충용액 4㎖로 비드들(beads)을 전-평형화(pre-equlibration)해 주었다(2 ~ 3회). 상기 컬럼에 희석된 끓인 혈청을 각각 12.5㎖씩 20분 동안 결합시켰다. 컬럼을 1,000g-포스로 2분간 원심분리하여 결합되지 않은 단백질을 제거하였다. 상기 과정에서 사용한 컬럼에 남아있는 끓인 혈청을 각각 12.5㎖씩 20분 동안 결합시킨 후 컬럼을 1,000g로 2분간 원심분리하여 결합되지 않은 단백질을 제거하였다. 또한, 상기 과정에서 사용한 컬럼에 남아있는 끓인 혈청을 각각 12.5㎖씩 20분 동안 결합시킨 후 컬럼을 1,000g로 2분간 원심분리하여 결합되지 않은 단백질을 제거하였다. 음이온 교환수지(anion exchange resin)를 상기 처음 제조한 완충용액으로 5분씩 2번 세척하였다. 음이온 교환수지에 결합된 단백질들을 1% TFA 3㎖로 10분 동안 4회 용리(elution)하였다. 각각의 단계에서 모아진 분획(fraction)들은 Au-chip에 올려 SELDI-TOF로 확인하였다.

<4-3> 소수성 크로마토그래피

원심분리 컬럼 2개에 Octyl-Sepharose CL 4B resin(Sigma O6001) 2㎖을 각각 패킹한 후 1,000g로 2분 동안 원심분리하여 보존용액을 제거하고 1% TFA 4㎖로 소수성 수지(hydrphobic resin)를 전-평형화(pre-equilibration)하였다(2~3회). 상기 소수성 수지가 패킹된 컬럼에 1% TFA로 용리된 분획을 12㎖씩 20분 동안 결합시킨 후 1,000g-포스로 2분간 원심분리하여 결합되지 않은 단백질을 스핀아웃하였다. 상기 과정에서 사용한 동일한 컬럼에 남아있는 분획을 12㎖씩 20분 동안 결합시킨 후 1,000g-포스로 2분간 원심분리하여 결합되지 않은 단백질을 제거하였다. 소수성 수지를 0.1% TFA/10% ACN 용액으로 5분 동안 3번 세척하였다. 세척 후 각각의 소수성 수지에 결합된 단백질들을 0.1% TFA/50% ACN 3㎖로 10분 동안 4회 용리하였다. 상기 용리된 분획들은 FPLC로 분리하기 위하여 동결건조기를 이용하여 총 부피 1㎖로 농축시켰다.

<4-4> 소수성 크로마토그래피(FPLC 시스템, C8 20㎖ 컬럼)

완충용액 A(0.1% TFA)와 완충용액 B(0.1% TFA/80% ACN) 시스템으로 C8 컬럼(HiPrep 16/10 Octyl FF column(Amersham))을 이용하여 분리시켰다. 첫 단계는 0.1% TFA로 단백질들을 13분 동안 결합시켰고, 두 번째 단계는 25분 동안 0 ~ 50%까지 ACN을 구배(gradient)를 주었고, 세 번째 단계는 15분 동안 50% ACN으로 일정(isocratic)하게 흘려주었고, 마지막은 80% ACN으로 20분 동안 세척하였다. 이때 유속(flow rate)은 2㎖/분으로 조절하였다. 상기 각 단계에서 얻은 분획들은 Au-chip에 올려 SELDI-TOF로 확인하였고, m/z 12,451 피크(peak)는 50% ACN 용리 단계에서 확인할 수 있었다. 상기 확인된 분획들을 모아서 동결건조기로 건조하였다. 분획에 남아있는 TFA와 ACN을 제거하기 위하여 HPLC D.W를 이용하여 완전건조 후 다시 녹이는 과정을 10회 반복 후 pH 페이퍼(paper)로 확인하였다. 상기 건조된 샘플을 최종적으로 D.W 200㎕에 녹여 -70℃에 보관하였다.

<4-5> 이차원 전기영동

보관중인 샘플 40㎕를 10% SDS 10㎕와 혼합 후, 이 혼합물을 1.1 X 재수화 완충용액(Rehydration buffer)(8.8M Urea, 4.4% CHAPS, 0.55% IPG 완충용액, BPB) 220㎕와 혼합하여 이 중 260㎕를 pH 4-7 13 cm 스트립(strip)에 로딩(loading)하였다. 등전점전기영동(Isoelectric focusing, IEF) 조건은 하기 표 2와 같다.

표 2

	전압(V)	시간(hr)
재수화(Rehydration)	30	10
탈염화(Desalting)	500	1
탈염화(Desalting)	1000	1
단계-n-홀드(Step-n-hold)	3000	1
단계-n-홀드(Step-n-hold)	5000	2
구배(Gradient)	8000	2
단계-n-홀드(Step-n-hold)	8000	4.5

등전점전기영동 후 IPG 스트립을 평형화 용액(50mM Tris-HCl, pH 8.8 / 6M Urea / 30% 글리세롤 / 2% SDS / BPB)에 5분 담가둔 후 12.5% 폴리아크릴아마이드 겔(polyacrylamide gel)에서 전기영동을 실시하였다. 정전류(Constant current)는 1 단계 10mA, 30분, 및 2 단계 20mA, 5시간이었다. 전기영동이 끝난 후 겔은 Coomassie Blue G-250(Fluka)으로 밤새 염색하였다(도 8).

<4-6> 수동적 용리(Passive elution)

상기 실시예 <4-5>에서 염색한 겔(gel)에서 용리할 스팟(spot)을 선별한 후 일회용 파이펫맨 팁(tip)으로 도려내고 세척하여 쿠마시 블루 염료(coomassie blue dye)를 제거하였다. 상기 세척은 약 20㎕의 50% ACN / 50 mM 암모늄 비카보네이트(ammonium bicarbonate)로 5 분씩 3회 동안 하는데 염색된 정도에 따라 세척 횟수를 조절하였다. 세척된 겔(gel) 스팟(spot)을 100% ACN으로 20분 동안 재수화(dehydration) 시켰다. 재수화된 겔(gel) 스팟(spot)에 5~10㎕의 용리 용액(10% 포름산(Fluka), 30% ACN, 20% 이소프로판올(isopropanol), 40% D.W)을 가하고 2시간 동안 상온에서 강한 진탕(vigorous shaking)을 한 후 용리된 단백질 2㎕를 NP20 chip에 올려 SELDI-TOF MS로 확인하였다(도 8).

<실시예 5> 12,451 m/z의 단백질 동정

<5-1> ESI-Q-TOF MS 방법

상기 <실시예 4>에서처럼 전기영동과 수동적 용리 실험으로 확인된 12451(m/z) 단백질 스팟(spot)을((주)인투젠에 의뢰하여) ESI-Q-TOF MS/MS를 이용하여 분석하였다(도 9).

먼저 인-겔 다이제스천(in-gel digestion)을 실시하였다(Jensen, O. N., et al., Anal Chem., 69, 1706-1714, 1997). 잘라낸 겔 스팟(gel spot)을 탈색(destain) 용액(50% Methanol in 10% Acetic acid) 100㎕에 넣고 5분간 진탕한 후 용액을 제거하고 겔 스팟을 200 mM 탄화수소암모늄(Ammonium bicarbonate) 용액에 20분간 두었다. 그 다음 100㎕ 아세토니트릴(Acetonitrile)로 탈수시키고 스피드 백(speed vac)에서 건조시켰다. 마른 겔 조각을 다시 0.2 g 변형된 트립신(modified trypsin)(Promega)이 있는 50 mM 탄화수소암모늄 20㎕로 얼음 위에서 재수화(rehydration)시켰다. 남아있는 용액을 제거하고 50 mM 탄화수소암모늄 30㎕를 추가하여 37℃에서 밤새 반응시켰다. 펩타이드 용액은 질량분석기로 분석하기 전에 직접 제작한 C18 나노 컬럼(nano column)으로 탈염 및 농축시켰다. GELoader tip(Eppendorf, Hamburg, Germany)에 다공성의 역상 R2 material(20-30 um bead size, PerSeptive Biosystems) 100-300 nL를 채워 넣어 만든 컬럼을 사용하였고 용액이 컬럼을 통과하도록 10㎖ 주사기를 사용하여 부드럽게 공기압을 가하였다. 펩타이드 혼합물 30㎕와 5% 포름산(formic acid) 30㎕를 섞은 후 컬럼에 적재(loading)하였고 5% 포름산 30㎕로 씻어준 후 50% 메탄올/49% H₂O/1% 포름산으로 용리하였다.

다음엔 인-겔 다이제스천(in-gel digestion)으로 만들어진 펩타이드를 Q-TOF2 질량 분석기(mass spectrometer)(Micromass, Manchester, UK)의 nano-ESI로 MS/MS를 수행했다. 공급 온도(source temperature)는 80℃인 상태에서 안정적인 유속(10-30 nL/min)을 얻을 수 있도록 0-5 psi의 질소 압력을 유지하며 1 kV의 전위를 precoated borocilicate nanoelectrospray needle(EconoTipTM, New Objective, USA)에 걸어주었다. 분자량에 따라 상대적인 콜리전 에너지(collision energy)를 갖는 collision-induced dissociation(CID)을 이용하여 프리커서 이온(precursor ions)의 서열을 증명하기 위해 MS/MS 스펙트럼(spectrum)을 기록하였다. 콘(cone)의 전압은 40V이었다. 헥사폴 콜리전 세포(hexapole collision cell)에서의 분열(fragmentation)을 위한 프리커서 이온 선택에는 4극자(quadrupole) 분석기를 이용하였고, 6-7 x 10^-5 mbar 압력의 아르곤(argon)을 콜리전 가스(collision gas)로 사용하였으며 콜리전 에너지는 20-30V였다. 생산 이온(pruduct ions)은 반사경(reflector), 마이크로-채널 플레이트 탐지기(micro-channel plate detector) 및 TDC(time-to-digital converter)가 달려있는 직교 TOF 분석기(orthogonal TOF analyzer)로 분석하였다. 데이터는 Mass Lynx Windows NT PC system으로 처리하였다.

마지막으로 단백질 동정과 시퀀스 프로세싱(sequence processing)을 실시하였다. 모든 tryptic peptide MS/MS spectrum과 PepSeq라는 peptide de-novo sequencing 프로그램으로 추론된 아미노산 서열들을 MASCOT 검색 프로그램(www.matrixscience.com) 및 BLAST를 사용하여 NCBInr과 EST 데이타베이스(databases)의 단백질 서열에 대해 검색하였다.

<5-2> N-말단 서열결정(N-terminal Sequencing) 방법

상기 <4-5>에서 이차원 전기영동이 끝난 후 이동(transfer)시키고자 하는 겔(gel) 부위를 잘라내 PVDF 막(membrane)으로 250V에서 1시간 동안 이동시켰다(Mini Trans-Blot Cell(Bio-Rad, Hercules, CA) 이용). 상기 이동 후 막을 Coomassie G-250으로 밤새 염색을 한 후 염색된 막을 약 10분간 탈색(destaining)하여 배경(background)을 제거하였다(10% 메탄올, 7% 아세트산). 한국기초과학지원연구원에 의뢰하여 Procise 492 cLC protein sequencer(Applied Biosystems, USA)로 N-말단 서열결정(N-terminal sequencing)을 실시하였다.

그 결과, Ser-Glu-Gly-Ser-Ser-Val-Asn(서열번호: 4)의 아미노산 잔기 서열을 밝힐 수 있었다. 이 서열은 프로트롬빈 프리커서(Prothrombin precursor(P00734))의 아미노산 잔기 199-205에 해당하는 부분으로 프로트롬빈 활성 펩티드 단편 2(prothrombin activation peptide fragment 2)의 N-말단 부분이다(도 10). ESI-Q-TOF 분석 결과와 N-말단 서열결정의 결과를 종합해서 12451(m/z) 피크(peak)의 전체 아미노산 서열을 예상할 수 있었다(Ser 199 - Gly 313). 이 단편은 프로트롬빈 활성 펩티드 단편 2에서 C-말단 아르기닌(C-terminal arginine) 잔기 하나가 떨어져 나간 des-R F2로 알려져 있으며, 이론적으로 계산한 분자량(12,457 Da)이 SELDI-TOF MS에서 찾은 피크(peak)(12,451 m/z)와 일치하였다(도 11).

본 발명의 키트 및 진단 방법은 간편하게 간암, 유방암 및 위암의 진단, 스크리닝 및 진행 정도 평가를 가능하게 함으로써 신속한 치료가 가능하게 하여 암 환자의 생존율을 향상시키고 암 치료로 인한 국가적 손실을 줄이는데 기여할 수 있을 것이다.

서열번호 1은 인간 혈청으로부터 유래한 des-R-프로트롬빈 활성 펩티드 단편 F2(des-R prothrombin activation peptide fragment F2; des-R F2)의 아미노산 서열이다.

서열번호 2는 상기 des-R-프로트롬빈 활성 펩티드 단편 F2의 N-말단 부위에 위치하는 에피토프의 아미노산 서열이다.

서열번호 3은 상기 des-R-프로트롬빈 활성 펩티드 단편 F2의 C-말단 부위에 위치하는 에피토프의 아미노산 서열이다.

서열번호 4는 프로트롬빈 프리커서(Prothrombin precursor(P00734))의 아미노산 잔기 199-205에 해당하는 부분으로, des-R-프로트롬빈 활성 펩티드 단편 F2의 N-말단 부분의 아미노산 서열이다.

Claims

des-R-프로트롬빈 활성 펩티드 단편 F2(des-R prothrombin activation peptide fragment F2, des-R F2)에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 암 모니터링, 진단 및 스크리닝용 키트.
제 1항에 있어서, des-R-프로트롬빈 활성 펩티드 단편 F2는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 암 모니터링, 진단 및 스크리닝용 키트.
제 1항에 있어서, 상기 des-R-프로트롬빈 활성 펩티드 단편 F2는 정상 개체에 비해 암을 가진 개체에서 발현량이 감소하는 것을 특징으로 하는 암 모니터링, 진단 및 스크리닝용 키트.
제 1항에 있어서, 상기 des-R-프로트롬빈 활성 펩티드 단편 F2는 각각 N-말단 부위에 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 에피토프(epitope)를 가지고, C-말단 부위에 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 에피토프를 가지는 것을 특징으로 하는 암 모니터링, 진단 및 스크리닝용 키트.
제 1항에 있어서, 상기 암은 간암, 유방암 및 위암으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암 모니터링, 진단 및 스크리닝용 키트.
제 1항에 있어서, 상기 항체는 고체기질에 결합되는 것을 특징으로 하는 암 모니터링, 진단 및 스크리닝용 키트.
제 6항에 있어서, 상기 고체기질은 합성수지, 니트로셀룰로오스, 유리기판, 금속기판, 유리섬유, 미세구체 및 미세비드로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 암 모니터링, 진단 및 스크리닝용 키트.
제 1항에 있어서, 상기 des-R-프로트롬빈 활성 펩티드 단편 F2에 특이적으로 결합하는 항체는 리간드, 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 및 콜로이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 검출체가 부착된 접합체인 것을 특징으로 하는 암 모니터링, 진단 및 스크리닝용 키트.
제 8항에 있어서, 상기 리간드는 스트렙타비딘(streptavidin) 또는 아비딘(avidin)인 것을 특징으로 하는 암 모니터링, 진단 및 스크리닝용 키트.
제 8항에 있어서, 상기 항체는 바이오틴(biotin) 또는 다이곡시제닌(digoxigenin)으로 표지된 것을 특징으로 하는 암 모니터링, 진단 및 스크리닝용 키트.
제 8항에 있어서, 상기 항체는 i) SPR(surface plasmon resonance) 방법 또는 SPRI(surface plasmon resonance imaging) 방법, 또는 ii) 검출용 항체에 부착된 형광표지에 의한 형광을 검출함으로써 양이 측정되는 것을 특징으로 하는 암 모니터링, 진단 및 스크리닝용 키트.
제 8항에 있어서, 상기 항체에 특이적인 결합 단백질을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 암 모니터링, 진단 및 스크리닝용 키트.
제 12항에 있어서, 상기 항체에 특이적인 결합 단백질은 단백질 A 또는 검출용 항체에 특이적으로 결합하는 2차 항체인 것을 특징으로 하는 암 모니터링, 진단 및 스크리닝용 키트.
제 12항에 있어서, 상기 항체에 특이적인 결합 단백질은 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 및 콜로이드로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 검출체가 부착된 것을 특징으로 하는 암 모니터링, 진단 및 스크리닝용 키트.
제 12항에 있어서, 상기 항체에 특이적인 결합 단백질은 i) SPR(surface plasmon resonance) 방법 또는 SPRI(surface plasmon resonance imaging) 방법, 또는 ii) 단백질에 부착된 형광표지에 의한 형광을 검출함으로써 양이 측정되는 것을 특징으로 하는 암 모니터링, 진단 및 스크리닝용 키트.
1) 피검체의 시료로부터 des-R-프로트롬빈 활성 펩티드 단편 F2의 발현량을 측정하는 단계; 및

2) 단계 1)의 des-R-프로트롬빈 활성 펩티드 단편 F2의 발현량을 정상 개체의 발현량과 비교하여 발현이 감소하는 개체를 선별하는 단계를 포함하는, 암 모니터링, 진단 및 스크리닝을 위한 des-R-프로트롬빈 활성 펩티드 단편 F2의 검출 방법.
제 16항에 있어서, 단계 1)의 시료는 혈액, 혈청 또는 혈장으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 암 모니터링, 진단 및 스크리닝을 위한 des-R-프로트롬빈 활성 펩티드 단편 F2의 검출 방법.
제 16항에 있어서, 단계 1)의 발현량은 이차원 전기영동(2-Dimensional Gel Electrophoresis), MALDI-TOF MS(Matrix-assisted laser desorption and ionization time-of-flight mass spectrometry) 또는 SELDI-TOF MS(surface-enhanced laser desorption and ionization time-of-flight mass spectrometry) 방법을 이용하여 측정되는 것을 특징으로 하는, 암 모니터링, 진단 및 스크리닝을 위한 des-R-프로트롬빈 활성 펩티드 단편 F2의 검출 방법.
제 16항에 있어서, 단계 2)의 선별은 바이오인포매틱스에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는, 암 모니터링, 진단 및 스크리닝을 위한 des-R-프로트롬빈 활성 펩티드 단편 F2의 검출 방법.
제 16항에 있어서, 상기 암은 간암, 유방암 또는 위암인 것을 특징으로 하는, 암 모니터링, 진단 및 스크리닝을 위한 des-R-프로트롬빈 활성 펩티드 단편 F2의 검출 방법.
des-R-프로트롬빈 활성 펩티드 단편 F2에 특이적으로 결합하는 생물분자들이 고형기질에 집적된 암 모니터링, 진단 및 스크리닝용 바이오칩.
제 21항에 있어서, 상기 생물분자는 항체 또는 앱타머인 것을 특징으로 하는 암 모니터링, 진단 및 스크리닝용 바이오칩.
제 21항에 있어서, 상기 고형기질은 플라스틱, 유리, 금속 및 실리콘으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 암 모니터링, 진단 및 스크리닝용 바이오칩.
제 21항에 있어서, 상기 암은 간암, 유방암 또는 위암인 것을 특징으로 하는 암 모니터링, 진단 및 스크리닝용 바이오칩.
des-R-프로트롬빈 활성 펩티드 단편 F2를 암 모니터링, 진단 및 스크리닝용 키트의 제조에 이용하는 용도.
des-R-프로트롬빈 활성 펩티드 단편 F2를 암 모니터링, 진단 및 스크리닝용 바이오칩의 제조에 이용하는 용도.
제 25항 또는 제 26항에 있어서, 상기 암은 간암, 유방암 또는 위암인 것을 특징으로 하는 용도.