WO2009110470A1 - 角膜経上皮電気抵抗値の測定方法 - Google Patents

角膜経上皮電気抵抗値の測定方法 Download PDF

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WO2009110470A1
WO2009110470A1 PCT/JP2009/053968 JP2009053968W WO2009110470A1 WO 2009110470 A1 WO2009110470 A1 WO 2009110470A1 JP 2009053968 W JP2009053968 W JP 2009053968W WO 2009110470 A1 WO2009110470 A1 WO 2009110470A1
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corneal
electrode
cornea
insulator
ter
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PCT/JP2009/053968
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聖典 上松
隆 北岡
幸二 西田
佑治 田中
松彦 西澤
弘和 梶
宗一郎 関根
Original Assignee
国立大学法人 長崎大学
国立大学法人東北大学
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • A61B5/05—Detecting, measuring or recording for diagnosis by means of electric currents or magnetic fields; Measuring using microwaves or radio waves 
    • A61B5/053—Measuring electrical impedance or conductance of a portion of the body
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • A61B5/68—Arrangements of detecting, measuring or recording means, e.g. sensors, in relation to patient
    • A61B5/6801—Arrangements of detecting, measuring or recording means, e.g. sensors, in relation to patient specially adapted to be attached to or worn on the body surface
    • A61B5/6813—Specially adapted to be attached to a specific body part
    • A61B5/6814—Head
    • A61B5/6821—Eye
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61B2562/00—Details of sensors; Constructional details of sensor housings or probes; Accessories for sensors
    • A61B2562/02—Details of sensors specially adapted for in-vivo measurements
    • A61B2562/0209—Special features of electrodes classified in A61B5/24, A61B5/25, A61B5/283, A61B5/291, A61B5/296, A61B5/053
    • A61B2562/0215—Silver or silver chloride containing

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring a corneal transepithelial electrical resistance value that is less invasive to each tissue of the eye including the corneal epithelium.
  • the cornea is a transparent membrane having a thickness of about 0.5 mm and has a five-layer structure composed of corneal epithelial cells, Bowman's membrane, corneal stroma, Desme layer, and corneal endothelial cells in this order from the body surface side.
  • corneal epithelial cells have a high regenerative ability.
  • the epithelial cells are severely damaged, severe corneal ulcers or irreversible corneal turbidity may remain. Therefore, it is desirable to measure the degree of damage to the corneal epithelium quantitatively and to lead to early treatment.
  • TER corneal transepithelial electrical resistance
  • the present inventors initially conducted an experiment by fixing the cut cornea to a Ussing chamber in which the area (a) value was constant and the accurate TER could be obtained by the short-circuit current method. Because the state is different from that in the living body, it could not be said that the experiment reflected a true biological reaction. Therefore, the present inventors have found a method in which electrode needles are placed on the corneal epithelium of the living eye and in the anterior chamber, and an electric current is passed between them to measure the electrical resistance (see Non-Patent Document 4). In this measurement, the Ussing chamber was reproduced with a living cornea, and an accurate TER was obtained with a constant measurement area (a). However, since this method is an invasive method involving anterior chamber puncture, it cannot be applied to humans and is not suitable for clinical diagnosis and treatment of corneal disorders.
  • Non-Patent Document 5 describes a method of measuring a corneal resistance value with a living eye using a corneal contact lens (CL) provided with electrodes. Since this method does not invade each part of the eye, it has applicability to humans. However, in this method, since an appropriate insulator is not provided, the current cannot be reliably passed through the corneal epithelium due to tears on the surface of the eye, and the obtained measurement value is in the state of the corneal epithelium. It is thought that it mainly reflects the state of tears. Further, since CL is fixed to the cornea by suction, the measuring device itself may cause a corneal disorder. Furthermore, it was reported at the 2007 Japanese Ophthalmological Pharmacological Society that the presence of small corneal erosions could not be detected.
  • Patent Document 1 discloses a device for detecting corneal epithelial damage or the like, which measures a decrease in potential difference between the cornea and sclera (capsular membrane) as an index of damage.
  • Patent Document 1 roughly shows an electrophysiological phenomenon in which the electrical resistance value decreases when a corneal disorder occurs, the measurement principle and accuracy are not at all equivalent to the technique of the present application.
  • An object of the present invention is to provide a method for evaluating a corneal disorder that can measure a corneal disorder quantitatively and is applicable to a living eye. Specifically, it is to provide a method for measuring a corneal transepithelial electrical resistance value that can measure corneal TER with good sensitivity and can be applied to a living eye.
  • the technology of the present invention like the Ussing Chamber, applies a constant current (Im) from a volt-ohm meter to a predetermined area (a) of the cornea and measures the change in the corneal potential ( ⁇ Vc).
  • Im and a are surely constant, and ⁇ Vc can be measured accurately, so that corneal injury can be accurately evaluated by TER.
  • the present inventors have succeeded in producing a novel measuring apparatus suitable for carrying out the method and completed the present invention.
  • the present invention [1] A method for measuring corneal transepithelial electrical resistance, wherein electrodes are disposed on the cornea and the conjunctiva; [2] A method for measuring corneal transepithelial electrical resistance, (1) placing the first electrode on the cornea and placing the second electrode on the conjunctiva; and (2) passing an electric current between the first electrode and the second electrode, A method comprising the step of measuring; [3] The method according to [1] or [2] above, wherein the periphery of the electrode disposed on the cornea is insulated; [4] The method according to any one of [1] to [3], which is performed with a living eye; [5] A device for measuring corneal transepithelial electrical resistance of a living eye, (1) a first electrode suitable for placement on the cornea; (2) a second electrode suitable for placement on the conjunctiva; and (3) an insulator that insulates the first electrode; And a device in which the first electrode and the insulator are integrated; [6] The device according to the above
  • the method for measuring the corneal transepithelial electrical resistance value of the present invention does not require anterior chamber puncture, the electrical resistance value of human corneal epithelial cells can be measured even with a living eye.
  • the method of the present invention is a simpler method that can obtain measurement results comparable to the method using anterior chamber puncture.
  • the corneal transepithelial electrical resistance measurement method of the present invention it is possible to quantitatively detect a corneal disorder in a living eye without puncturing the anterior chamber.
  • the detection data obtained thereby can be used to diagnose corneal disorders and be used for early treatment.
  • the method for measuring the corneal transepithelial electrical resistance value of the present invention can be measured over time in a short time. Further, it is useful for studies for screening drugs (for example, preclinical studies, etc.), studies for evaluating drug efficacy, studies for evaluating corneal toxicity of drugs, and the like.
  • the method for measuring the corneal transepithelial electrical resistance value of the present invention makes it possible to measure the barrier function of a biological cornea, which has been impossible in the past. Thereby, new useful knowledge can be obtained about the corneal barrier function in various corneal diseases, which contributes to the development of ophthalmology and ophthalmology.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing an embodiment of the present invention.
  • the corneal electrode is disposed in a conductor (buffer solution) that fills the inside of the insulator.
  • the conjunctival electrode is in contact with tear fluid stored in the conjunctival sac.
  • FIG. 2 is a schematic view showing another embodiment of the present invention.
  • An applanation tonometer type cornea electrode (conductor (gel) inside the insulator) is used, and the conjunctival electrode is covered with the conductor (gel).
  • FIG. 3 is a schematic view showing still another embodiment of the present invention.
  • a contact lens type electrode including a corneal electrode, a conductor (gel), an insulator, and a conjunctival electrode is used.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing an embodiment of the present invention.
  • the corneal electrode is disposed in a conductor (buffer solution) that fills the inside of the insulator.
  • the conjunctival electrode is in contact with tear fluid
  • FIG. 4 is a graph showing measured values of TER after administration of 0.02% BAC.
  • the vertical axis represents ⁇ ⁇ cm 2
  • the horizontal axis represents seconds after administration of BAC.
  • FIG. 5 shows the same results as FIG. 4 when the TER measurement before administration is 100%.
  • the vertical axis represents%
  • the horizontal axis represents seconds after BAC administration.
  • FIG. 6 is a schematic diagram showing a particularly preferred TER measuring apparatus of the present invention.
  • the corneal contact surface of the insulator has the same curvature as the cornea, and the conjunctival electrode portion has a sheet-like shape.
  • FIG. 7 shows a corneal TER recording before and after administration of 0.02% BAC of normal cornea, measured with the measuring apparatus of FIG. The TER value became stable within 1 second after the measurement device was brought into contact with the cornea.
  • the present invention provides a method for measuring corneal transepithelial electrical resistance (referred to as the method of the present invention), characterized in that electrodes are disposed on the cornea and the conjunctiva.
  • the method of the present invention comprises: (1) disposing a first electrode (also referred to as a corneal electrode) on the cornea and disposing a second electrode (also referred to as a conjunctival electrode) on the conjunctiva; and (2) the first electrode and the second electrode. It includes a step of passing an electric current between the electrodes and measuring an electric resistance.
  • a first electrode also referred to as a corneal electrode
  • a second electrode also referred to as a conjunctival electrode
  • corneal transepithelial electrical resistance As used herein, the term “corneal transepithelial electrical resistance”, “transepithelial electrical resistance (t ransepithelial e lectric r esistance: TER) " of the “cornea” refers to.
  • TER is thought to reflect the barrier function of the epithelium. It is known that the lower the measured TER, the higher the degree of damage to epithelial cells. That is, by measuring the corneal transepithelial electrical resistance, the barrier function of the corneal epithelium can be evaluated, and the degree of injury of the corneal epithelial cells can also be evaluated.
  • Barrier function means that epithelial cells form bonds that are unique to epithelial cells such as tight junctions (tight junctions), fixed bonds (adhesive bonds, desmosomes, etc.), and various substances penetrate the epithelium. A function that controls movement into and out of the body.
  • the value of corneal transepithelial electrical resistance is about 100 to 700 ⁇ ⁇ cm 2 in the case of a rabbit, for example, when measured by a method using a conventional free cornea piece (cut cornea piece). .
  • a slightly higher TER value can be obtained because there are few corneal epithelial disorders associated with corneal segment resection.
  • the normal value of rabbit corneal transepithelial electrical resistance is about 500 to 1500 ⁇ ⁇ cm 2 .
  • corneal transepithelial electrical resistance which is an index of the degree of corneal damage, is due to an increase in the permeability of the cornea due to a corneal epithelial cell disorder (also called injury), that is, a decrease in barrier function. It is thought to be caused by
  • corneal epithelium is the outermost part of the cornea and is in contact with the outside world, so it is a part that is easily damaged.
  • corneal disorder, corneal epithelial disorder and corneal epithelial cell disorder are terms used interchangeably.
  • Corneal epithelial cell disorders refer to various disorders accompanied by damage such as tight junctions (tight junctions) and fixed bonds (adhesive bonds, desmosomes, etc.) between corneal epithelial cells.
  • corneal erosion, corneal ulcer, cornea Examples include perforation, corneal edema (epithelial edema), corneal infection (bacterial corneal ulcer, corneal mycosis, viral keratitis, etc.).
  • corneal epithelial cell disorders include trauma, inflammatory reaction, ultraviolet light, oxygen deficiency, dry eye, inappropriate contact lens wear, foreign substances such as dust, chemicals and drugs (for example, preservatives in eye drops) Etc.). Damage to the corneal epithelial cells can lead to microbial infection in the eye, ulceration, vision loss, and the like.
  • Corneal epithelial cells can regenerate, but if the damage of the corneal epithelial cells is large, the inner cell group (in the present specification, these are collectively referred to as corneal endothelial cells) is also adversely affected. Since corneal endothelial cells have a lower regenerative ability than corneal epithelial cells, it is preferable to treat corneal epithelial cell disorders early. For this purpose, it is preferable to detect corneal epithelial cell damage early. In the following examples, corneal injury was induced using benzalkonium chloride (BAC), which is commonly used as an antiseptic in eye drops and the like, but the method of the present invention was caused by any of the above causes. It is clear that it can be applied to the detection of corneal disorders.
  • BAC benzalkonium chloride
  • degree of corneal damage refers to the degree of corneal epithelial damage, and is quantitatively expressed as a percentage of the TER value after corneal damage to the normal value without corneal damage.
  • electrodes used for measurement are disposed on the cornea and the conjunctiva.
  • the conjunctiva is composed of a bulbous conjunctiva, a conical conjunctiva and a conjunctiva.
  • the “conjunctiva” in the present invention includes any film constituting the conjunctiva.
  • a space formed by these conjunctiva is referred to as a “conjunctival sac”.
  • disposing an electrode on the cornea means disposing an electrode at a position where it directly contacts the outer surface of the corneal epithelium directly or indirectly through a conductor.
  • arranging the electrodes on the conjunctiva means a position in contact with the outer surface of the bulbous conjunctiva, the conical conjunctiva or the conjunctiva, or within the conjunctival sac so as to be in contact with any one of the membranes via a conductor. It also includes disposing electrodes on the substrate.
  • the electrode disposed on the cornea and the conjunctiva is composed of at least one positive electrode and at least one negative electrode, either of which may be a positive electrode or a negative electrode.
  • the number of electrodes to be used is not particularly limited, and the number can be appropriately determined by those skilled in the art.
  • the type of electrode to be used is not particularly limited as long as the object and effects of the present invention can be achieved, and those known per se can be appropriately used as an electrode for measuring transepithelial electrical resistance.
  • examples of the electrode material include gold, platinum, silver, silver chloride, copper, stainless steel, iron, and carbon. From the viewpoint of hardly damaging the living body, electrodes of gold, platinum, silver and silver chloride are preferably used.
  • the structure of the electrode to be used is not particularly limited as long as the objective effect of the present invention can be achieved and the eye tissue is not damaged, and a known electrode used for a living body can be appropriately used.
  • electrodes having various shapes such as a rod shape, a plate shape, a disk shape, and a ring shape made of the above-described electrode material can be mentioned, but not limited thereto.
  • the electrode may be in direct contact with the cornea or conjunctiva without using the conductor, but may be used with the conductor.
  • the conductor is placed in the gap between the electrode and the cornea or conjunctiva.
  • the material is not particularly limited as long as the object effects of the present invention can be achieved and the eye is not adversely affected, and a material known per se can be appropriately used as the conductive material.
  • the conductor may be a solid, a liquid, a gel, or the like, but a liquid or a gel is preferable from the viewpoint of more closely attaching the electrode to the cornea and / or conjunctiva.
  • Examples of the conductor in this case include physiological saline, buffer solution (for example, phosphate buffer solution, Hanks' Balanced Salt Solution, etc.) and hydrogel (eg, hyaluronic acid, atelocollagen gel, etc.). It is not limited.
  • the electrical conductor may be replaced with tears collected in the conjunctival sac.
  • the contact surface with the cornea or the conjunctiva is made to conform to the shape of the outer surface of the cornea or the conjunctiva so as to be as close as possible to the cornea or the conjunctiva (for example, the cornea When used as an electrode, it is desirable that the contact surface with the cornea has the same curvature as the cornea).
  • the corneal transepithelial electrical resistance is measured by passing an electric current through the corneal epithelium, it is necessary to reliably pass the electric current through the corneal epithelium. Since tear fluid is usually present on the cornea, it is usually possible to disperse current not only in the corneal epithelium but also in the tear fluid simply by placing an electrode on the cornea, so that an accurate corneal transepithelial electrical resistance value cannot be obtained. There is sex.
  • the outer periphery of the corneal electrode (the conductor when the conductor is interposed between the electrode and the cornea) It is preferable to arrange an insulator.
  • the material of the insulator is not particularly limited as long as it can achieve the object effects of the present invention and does not adversely affect the eyes. It is possible to appropriately use a material known per se as an insulating material. Examples thereof include, but are not limited to, silicon rubber including dimethylsiloxane (PDMS). A plurality of insulators may be used in combination as necessary.
  • the insulator is provided in an integrated form with the corneal electrode.
  • integrated between the insulator and the corneal electrode means that the insulator and the corneal electrode have a configuration that does not require separate arrangement of the insulator and the corneal electrode. Examples of such a configuration include a configuration in which an insulator and a corneal electrode are in direct contact with each other and an integrated shape, and other substances such as a conductor between the insulator and the corneal electrode.
  • the present invention is not limited thereto.
  • the shape of the insulator may vary depending on the shape of the electrode or conductor used, but surrounds the outer periphery of the electrode or conductor so as to prevent a short circuit of current from the electrode or conductor to tear fluid, etc.
  • the shape is not particularly limited as long as the shape adheres closely to the cornea.
  • examples of the shape of the insulator include a ring shape and a cylindrical shape.
  • the corneal contact surface of the insulator has the same curvature as the cornea.
  • the dimensions of the ring can be selected as appropriate so long as the diameter (at least the inner diameter) does not exceed the corneal diameter.
  • the inner diameter of the ring is preferably 3 to 9 mm (for example, about 6 mm).
  • the inner diameter of the ring is 3 to 11 mm (for example, about 7 mm).
  • Insulator adhesion methods include mild compression, negative pressure adsorption, insulation gel, adhesive, eye ointment, etc., but do not damage or damage the cornea and other ocular tissues Is preferred. Specifically, for example, mild compression, insulator gel, and eye ointment are preferable, and insulator gel and eye ointment are particularly preferable.
  • the insulator gel include, but are not limited to, petrolatum.
  • the adhesive include, but are not limited to, a cyanoacrylate adhesive and an acrylic resin adhesive.
  • eye ointment include, but are not limited to, Talbid eye ointment (registered trademark), flavitan eye ointment (registered trademark), and the like.
  • the current flowing between the electrodes is not particularly limited as long as the TER value can be measured and the epithelial cells are not damaged, but is preferably 10 ⁇ A to 10 mA, more preferably 20 ⁇ A to 100 ⁇ A. .
  • the current may be direct current or alternating current.
  • measuring instruments for measuring electrical resistance include, but are not limited to, a short-circuit current device, a voltage / electrical resistance measuring instrument (for example, EVOM (registered trademark) manufactured by World Precision Instruments, Inc.), and the like.
  • the TER value is represented by ⁇ ⁇ cm 2 and is a value obtained by multiplying the obtained electrical resistance value by the area (a) through which current flows. This area (a) is the area of the cornea inside the insulator surrounding the corneal electrode. By comparing this value with a normal value or the like, the degree of injury of corneal epithelial cells can be quantitatively evaluated.
  • the method of the present invention is less invasive, it can be performed on a living eye.
  • the “living eye” refers to an eye that has not been taken out of a living animal exemplified below as an application target of the present invention.
  • a living eye is an eye that has not undergone an invasive operation such as extraction or incision.
  • Applicable objects of the method of the present invention include humans and mammals such as laboratory animals, pets, livestock (eg, rabbits, rats, mice, hamsters, cats, dogs, cows, pigs, horses, sheep, monkeys, etc.). Can be mentioned. Among these, application to experimental animals used for preclinical trials of eye drops, animals for which treatment of corneal disorders is desired, and the like can be contemplated.
  • the mammal is preferably a human.
  • the present invention also provides an apparatus for measuring corneal transepithelial electrical resistance of a living eye (referred to as the apparatus of the present invention), which is (1) a first suitable for placement on the cornea. An electrode, (2) a second electrode suitable for placement on the conjunctiva, and (3) an insulator integrated with the first electrode. Each element in this apparatus is as described above.
  • the corneal electrode described in detail in the method of the present invention is preferably used.
  • the conjunctival electrode described in detail in the method of the present invention is preferably used.
  • the insulator the insulator described in detail in the method of the present invention is preferably used.
  • the device of the present invention is characterized in that the corneal electrode and the insulator are integrated.
  • integration has the same meaning as described above.
  • the corneal electrode integrated with the insulator is hereinafter referred to as “corneal electrode portion”.
  • the cornea electrode portion may be composed only of the electrode and the insulator, or may further include a member for connecting the electrode and the cornea. Good.
  • the corneal electrode portion may further include a conductor for causing the electrode to contact the cornea indirectly. That is, in a preferred embodiment, the electrode of the corneal electrode portion is integrated with the insulator via the conductor.
  • a solid or gel-like material can be selected as the conductor in order to maintain the integrity of the corneal electrode portion.
  • a material such as hydrogel (hyaluronic acid, atelocollagen gel, etc.) is particularly preferred.
  • the shape of the corneal electrode itself is not particularly limited as long as it fits inside the insulator surrounding the corneal electrode, and an electrode known per se can be appropriately used as an electrode for measuring transepithelial electrical resistance. is there.
  • Examples of the shape include a rod shape, a plate shape, and a line shape, but are not limited thereto.
  • the shape of the corneal electrode part only needs to be a shape that can be in close contact with the cornea, and specifically includes a cylinder with a concave corneal contact surface, a prism, etc., but is not limited thereto, and as a shape of the corneal electrode part, For example, an applanation tonometer-like shape and a contact lens-like shape are also included.
  • the size of the corneal electrode portion may be any size as long as the inner diameter of the insulator does not exceed the corneal diameter.
  • the inner diameter of the insulator is preferably up to the corneal diameter (about 12 mm), preferably 1-12 mm.
  • the conjunctival electrode may be constituted singly or may be integrated with a solid or gel-like conductor (generally referred to as “conjunctival electrode portion”).
  • the size of the conjunctival electrode portion may be a size that allows the entire conjunctival electrode portion to be accommodated in the conjunctival sac, but it is sufficient that at least a part of the conjunctival electrode portion is in contact with the conjunctiva or lacrimal fluid stored in the conjunctival sac.
  • the size is preferably within the range of 1-10 mm as a whole.
  • the shape may be any shape that can contact the lacrimal fluid stored in the conjunctiva or conjunctival sac, and a shape that does not damage the eye tissue is preferable.
  • Specific examples include a flat body having a concave conjunctival contact surface, a plate shape, a linear shape, and a sheet shape, but are not limited thereto.
  • the corneal electrode portion and the conjunctival electrode portion are integrated in such a manner that no direct current flows between them.
  • FIG. 1 shows an example of a corneal electrode using a ring-shaped insulator and a buffer solution.
  • FIG. 2 shows an example of an applanation tonometer type corneal electrode, and
  • FIG. 3 shows an example of a contact lens type electrode.
  • the conjunctival electrode is attached to the edge of the contact lens.
  • the material constituting the outer portion of the insulator can be any material commonly used for contact lenses, such as plastic (eg, acrylic resin, polycarbonate, etc.), rubber, etc. However, it is not limited to these.
  • FIG. 6 is a schematic diagram showing an example of a particularly preferred embodiment of the present invention.
  • TER since the corneal electrode, the insulator, the conductor, and the conjunctival electrode are integrated, TER can be measured immediately just by touching the living eye as it is, and the labor of setting can be eliminated. It is possible to reduce the burden on the body.
  • silicon rubber, nitrile rubber, or the like can be used as the insulator.
  • silicone rubber include, but are not limited to, polydimethylsiloxane (PDMS), vinyl methyl silicone rubber, and the like. Since silicon rubber is highly biocompatible and soft, it is difficult to damage the corneal surface, so it is a highly safe material and easy to process. Therefore, it is particularly preferable to use silicon rubber. By using silicon rubber as the insulator, it is possible to prevent the cornea from being scratched by the measuring device.
  • This insulator preferably has a ring-shaped to cylindrical shape (eg, an inner diameter of 1 to 13 mm (eg, 3 to 11 mm), a thickness of 0.1 to 5 mm (eg, 1 to 3 mm), and a height of 0.1 mm to 20 mm (eg, 1 to 1 mm). 10mm)), and the contact surface with the cornea has the same curvature as the cornea.
  • “The same curvature as the cornea” is intended to include substantially the same curvature as that of the cornea as long as adhesion between the insulator and the cornea is ensured, and may not be the same curvature.
  • the contact surface may be thicker than the above thickness.
  • the curvature of the cornea can be measured by an ordinary method using an ophthalmometer, a keratometer, a photokeratoscope, or the like, and the curvature attached to the insulator can be appropriately changed according to the type of the subject.
  • the radius of curvature is 650 to 850 mm (for example, 790 mm).
  • the radius of curvature is 600 to 800 mm (for example, 750 mm).
  • the entire circumference of the insulator touches the cornea surely by light compression or the like so as not to leave a tear film between the insulator and the eye surface.
  • the insulator should have a certain thickness (preferably 1 to 3 mm), and even if the tear film remains, the current hardly flows through the tear film, that is, the electrical resistance value passing through the tear film is epithelial. It is desirable that the electrical resistance value passing through is so high that it can be ignored. As long as insulation is performed reliably, insulation may be performed by any method.
  • the conductor gel is placed inside the insulator (see, for example, FIGS. 2 and 6).
  • a synthetic polymer such as polyethylene glycol containing a buffer solution, or a gel derived from a biological polymer such as hyaluronic acid, atelocollagen, gelatin, cellulose, or agarose can be used. It is preferable to use a hyaluronic acid or atelocollagen gel that is highly biocompatible, highly safe, easy to process, and conductive. It is not limited. In order to make it adhere to a cornea, it is preferable to give the same curvature as a cornea also to the cornea contact surface of this conductor gel like an insulator.
  • the corneal electrode is preferably disposed so as to be in contact with the conductive gel or embedded in the conductive gel, and the corneal electrode and the insulator are integrated (corneal electrode portion). As a result, the corneal electrode is in indirect contact with the cornea via the conductor gel.
  • the corneal electrode used is miniaturized to fit this embodiment. The dimensions / shape / material, etc. of the corneal electrode are as described above.
  • the outer shape of the entire portion including the corneal electrode portion is not particularly limited, and may be appropriately changed according to the mode of use. For example, ease of handling, normal ophthalmic medical equipment (slit lamp or intraocular pressure measurement) It can be determined appropriately in consideration of the mounting on the apparatus), and examples shown in FIG. 6 can be given.
  • the outer shape of the entire portion including the corneal electrode portion may be a shape (for example, a pen shape) that can be operated by hand, but is not limited thereto.
  • the insulator may cover the whole as it is to form the outer shape, or the corneal electrode portion (in this case, the portion including the conductor) is integrated with other members constituting the outer shape described above. May be.
  • the conjunctival electrode part is made into a sheet-like form.
  • the sheet form means, for example, a sheet having a thickness of 0.001 cm to 0.1 cm, a length (direction b in FIG. 6) of 0.5 cm to 5 cm, and a width of 0.1 cm to 2 cm (direction a in FIG. 6).
  • An example is a sheet having a thickness of 0.01 cm, a length of 1 cm, and a width of 0.5 cm.
  • a sheet having an arbitrary shape such as a square, a circle, and an ellipse can be used, but a substantially rectangular sheet is preferably used.
  • the shape may be rounded.
  • insertion into the conjunctival sac becomes easy.
  • This sheet can be formed from materials such as PET, polyimide, silicon rubber, and acrylic, but PET and polyimide are preferred because they are strong, flexible, and easy to mold.
  • the conjunctival electrode is preferably arranged at the distal end of this sheet-like conjunctival electrode part (opposite the attachment site to the corneal electrode part), but it is in direct contact with the lacrimal fluid stored in the conjunctiva or conjunctival sac As long as indirect contact via a conductor is ensured, it may be arranged at any location, for example, at a position of 5 mm from the distal end of the conjunctival electrode portion.
  • the conjunctival electrode portion may be covered with an electric conductor, and the hydrogel described above may be used as the electric conductor, but is not limited thereto as long as it is a conductive gel.
  • the conjunctival electrode is preferably disposed on the conjunctival contact side of the sheet, but when an electric conductor is used, it may be disposed on the outer side of the sheet (opposite side of the conjunctival contact surface) or embedded in the electric conductor. .
  • the conjunctival electrode is placed on the conjunctiva, in the conjunctival sac or in the tears at the time of measurement, and the position is 0.1 to 15 mm from the corneal limbus, preferably 3 mm.
  • the conjunctival electrode portion is attached to the corneal electrode portion at an angle along the shape of the eyeball so that the device is properly placed when the device is brought into contact with the conjunctiva.
  • the corneal electrode portion and the conjunctival electrode portion can be appropriately changed according to the size of the subject's cornea and eyeball.
  • the size can be reduced in human infants, human children, mice, rats, monkeys and the like, and the size can be increased in large animals such as pigs and cows.
  • the present invention also provides a drug screening system characterized by using the above-described method of the present invention or including the apparatus of the present invention as a component.
  • a corneal disorder in a living eye.
  • a disease associated with a corneal disorder for example, , Corneal erosion, corneal ulcer, corneal perforation, corneal edema (epithelial edema), corneal infection (bacterial corneal ulcer, corneal mycosis, viral keratitis, etc.
  • biological corneal TER measurement is performed before and after administration of a test compound, and a test compound whose TER value is significantly improved by administration is selected as a candidate compound for a therapeutic agent for a disease associated with corneal disorder. Can do.
  • the present invention also provides a drug efficacy and / or toxicity evaluation system characterized by using the above-described method of the present invention or including the apparatus of the present invention as a component.
  • a corneal disorder in a living eye.
  • an experimental animal having a damaged cornea or a human suffering from a disease associated with a disorder of the cornea Subjects with corneal disorders (eg corneal erosion, corneal ulcer, corneal perforation, corneal edema (epithelial edema), corneal infection (bacterial corneal ulcer, corneal mycosis, viral keratitis, etc.), etc. ) Can be evaluated for efficacy.
  • corneal disorders eg corneal erosion, corneal ulcer, corneal perforation, corneal edema (epithelial edema), corneal infection (bacterial corneal ulcer, corneal mycosis, viral keratitis, etc.), etc.
  • corneal disorders eg corneal erosion, corneal ulcer, corneal perforation, corneal
  • the drug is used for the treatment of a disease accompanied by a disorder of the cornea. It can be determined that it is valid.
  • a test animal or human suffering from an eye disease other than a corneal disorder can be used as a subject to evaluate the corneal toxicity of a therapeutic agent for the disease. That is, in the subject, when the corneal TER measurement is performed before and after the administration of the drug to be evaluated and the TER value is significantly deteriorated by the administration of the drug, it can be determined that the drug has corneal toxicity. .
  • the present invention also provides a disease associated with a disorder of the cornea comprising a pharmaceutically acceptable substance that can be used in the method of the present invention as an electrical conductor or to attach an insulator to the cornea (for example, A diagnostic agent for corneal erosion, corneal ulcer, corneal perforation, corneal edema (epithelial edema), corneal infection (bacterial corneal ulcer, corneal mycosis, viral keratitis, etc.) is provided.
  • the pharmaceutically acceptable substance that can be used as the conductor include physiological saline, buffer solution (for example, phosphate buffer solution, Hanks' Balanced Salt Solution, etc.), hydrogel, and the like.
  • Examples of the pharmaceutically acceptable substance that can be used for closely attaching the insulator to the cornea include a method using an insulator gel, an adhesive, an eye ointment, and the like.
  • a method using an insulator gel, an adhesive, an eye ointment, and the like Specifically, as the gel of the insulator, petrolatum, etc., as the adhesive, cyanoacrylate adhesive, acrylic resin adhesive, etc., as the eye ointment, Talivid Eye Ointment (registered trademark), flavitan eye Examples include, but are not limited to, ointments (registered trademark).
  • the diagnostic agent of the present invention may further contain other pharmaceutically acceptable additives such as preservatives, isotonic agents, pH adjusters, stabilizers and the like.
  • Diagnosis of a disease associated with a corneal disorder using the diagnostic agent of the present invention is performed in a subject by performing the above-described method of the present invention using it as a means for bringing an electric conductor or insulator into close contact with the cornea. It can be carried out by performing biological corneal TER measurement and comparing the measured value with a normal value.
  • Example 1 Evaluation of corneal damage of BAC by biocorneal TER measurement (Fig. 1) that does not require anterior chamber puncture (referred to as conjunctival sac method)
  • Fig. 1 A rod-shaped silver / silver chloride electrode was placed on the cornea of the living rabbit and in the conjunctival sac, and 0.02% BAC was administered. Changes in corneal TER due to exposure to BAC were measured with a voltage / electrical resistance measuring device.
  • the periphery of the electrode on the cornea was insulated by fixing a rubber ring (inner diameter 6 mm) with a bioadhesive (Aron Alpha A, manufactured by Sankyo Co., Ltd.) so that current always passed through the corneal epithelium.
  • the TER decrease curve obtained by the conjunctival sac method was similar to the TER decrease curve obtained by the conventional anterior chamber puncture method.
  • the TER at 10 seconds after administration was 35.1 ⁇ 6.8%, and after 60 seconds, it was significantly reduced to 13.5 ⁇ 2.1% (p ⁇ 0.00). 01).
  • the TER 60 seconds after administration by the anterior chamber puncture method was 19.7 ⁇ 5.9%.
  • the value of TER after 60 seconds, a conjunctiva ⁇ a 175 ⁇ 14 ⁇ cm 2 the anterior chamber puncture method was 138 ⁇ 10 .OMEGA.cm 2.
  • Example 2 Production of biological corneal TER measurement device (Fig. 6) Corneal electrode portion A silver electrode having a diameter of 1 mm and a silver / silver chloride electrode were placed on a circular cover glass having a diameter of 12 mm. A cylindrical PDMS having a diameter of 10 mm and an inner diameter of 6 mm and having a radius of curvature of the corneal contact surface of 7.9 mm was fixed on a cover glass with an adhesive. An Eppendorf tube was attached to the rear (opposite side of the corneal contact surface (cover glass side)) for mounting on a slit lamp. The inner lumen of PDMS was filled with atelocollagen gel, and the radius of curvature was adjusted to 7.9 mm.
  • TER Measurement Using the TER measuring apparatus thus prepared, changes in corneal TER of living rabbits were measured. Japanese white rabbits were anesthetized and opened with adhesive tape. The above-mentioned device is installed at the tip of the slit lamp, and by operating the slit lamp, the corneal electrode part is adhered accurately to the central part of the cornea, and the conjunctival electrode part is adhered to the conjunctival sac and the lacrimal fluid stored therein. Let Rabbits were instilled with 0.02% BAC and compared to pre-dose TER values. The results are shown in FIGS. FIG. 7 shows that TER can be measured immediately when the TER measuring device is brought into contact with the cornea.
  • Stable TER values could be measured within 1 second after contacting the device with the cornea both before BAC administration (indicated as “normal cornea” in FIG. 7) and after administration. As shown in FIG. 8, TER decreased significantly 1 minute after BAC administration. This was a value consistent with the result shown in FIG.
  • the present invention provides a method for detecting a corneal disorder in a living eye with low invasiveness. Since the detection method according to the present invention does not require anterior chamber puncture, it can be applied to humans and can be used for diagnosis of corneal disorders and early treatment thereof. In the method of the present invention, measurement in a short time after corneal injury and measurement of corneal injury over time are possible. Research for screening drugs, research for evaluating drug efficacy, drugs for the eye This is useful for research to evaluate the effects of Moreover, new useful knowledge about the corneal barrier function in various corneal diseases can be obtained, which contributes to the development of ophthalmology and ophthalmology.

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Abstract

　角膜の障害を定量的に測定可能であって、かつ生体眼に適用可能な角膜障害の評価方法を提供すること。 　電極を、角膜上および結膜上に配置することを特徴とする、角膜経上皮電気抵抗の測定方法。（１）第一の電極を角膜上に配置し、第二の電極を結膜上に配置する工程；および（２）第一の電極と第二の電極との間に電流を流し、電気抵抗を測定する工程を含む、角膜経上皮電気抵抗を測定する方法。ならびに角膜経上皮電気抵抗を測定するための装置。

Description

角膜経上皮電気抵抗値の測定方法
　本発明は、角膜上皮を含む眼の各組織に対する侵襲が少ない、角膜経上皮電気抵抗値の測定方法に関する。
　角膜は、厚さ約０．５ｍｍの透明な膜であり、体表側から順に、角膜上皮細胞、ボーマン膜、角膜実質、デスメ層、角膜内皮細胞からなる５層構造を持つ。このうち角膜上皮細胞は再生能力が高いが、上皮細胞の障害が大きいと、重症な角膜潰瘍をきたしたり、不可逆的な角膜混濁を残してしまうことがある。よって、角膜上皮の障害度を定量的に測定し、早期の治療につなげることが望まれる。
　これまでに行われてきた角膜の障害度を測定するための方法は目視による検査法が主であったため、角膜上皮の障害の定量は困難であり、角膜の障害度を数値化して定量する方法が求められていた。
　近年、角膜のバリア機能を表す角膜経上皮電気抵抗（ｃｏｒｎｅａｌ　ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｅｌｅｃｔｒｉｃ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ（ＴＥＲ））を測定することで、角膜の障害度を定量的に測定可能であることが知られている（非特許文献１～３参照）。TERは角膜電気抵抗値（Rc）と測定する部分の面積（a）の積で表され、TER=Rc×aとなる。角膜上皮に障害が生じると角膜のバリア機能が低下し、低い角膜ＴＥＲ値となる。本発明者らは当初、面積（a）の値を一定にして短絡電流法で精確なTERを求めることのできるUssing chamberに切り取った角膜を固定して実験を行っていたが、切り取った角膜では生体内と状態が異なる為、真の生体反応を反映する実験とはいえなかった。そこで本発明者らは、電極針を生体眼の角膜上皮上と前房中とに配置し、その間に電流を流して電気抵抗を測定する方法を見出した（非特許文献４参照）。この測定はUssing chamberを生体角膜で再現したものであり、測定面積（a）の値を一定にして正確なTERを求めることができた。
　しかし、この方法は前房穿刺を伴う侵襲性の方法である為、ヒトへの適用は考えられず、臨床における角膜障害の診断・治療には適さないものであった。
　非特許文献５には、電極を備えた角膜コンタクトレンズ（ＣＬ）を用いて生体眼で角膜抵抗値を測定する方法が記載されている。この方法は眼の各部位に対して侵襲しないため、ヒトへの適用可能性を有する。
　しかしこの方法では、適切な絶縁体が設けられていないため、眼表面の涙液に起因して電流を角膜上皮に確実に通過させることができず、得られた測定値は角膜上皮の状態ではなく主に涙液の状態を反映していると考えられる。また、吸引によってＣＬを角膜に固定しているので、測定装置自体が角膜障害を起こす可能性がある。さらに、２００７年日本眼科薬理学会において、小さい角膜びらんの存在を検出できなかったことが報告されている。これは、測定する電流が角膜上皮を完全に通過しておらず、電極が角膜障害を十分検知できていないためであると考えられる。その上この方法では電流の流れる面積（a）を考慮していないため、角膜障害を正確に評価するTERを求めることができない。このように、非特許文献５の方法の検出感度には問題がある。
　また、特許文献１には角膜上皮の損傷等を検出する装置が開示されているが、これは角膜と強膜（鞏膜）との電位差の低下を損傷の指標として測定するものである。特許文献１のパラメーターである角膜電位（Vc）は角膜電気抵抗値（Rc）と角膜内皮によるイオン輸送機能（電流）（Ic）によって規定されるものであり、Vc=Rc×Icが成り立つ。さらに角膜電位（Vc）を強膜電位（Vｓ）と比較しており、Vｃ=k Vsにおけるｋが角膜障害を表す指標となる。よってｋ=Rc×Ic/Vsで角膜障害を表現している。この測定でRcをｋに反映させるためにはIcとVsの精度が高いことが求められるが、実際には角膜内皮から生じる電流Icは非常に微弱であり一定しない。強膜電位Vsも測定条件や個体によりばらつきがあるため、これと比較しても正確な角膜障害は求められない。さらに前述のように角膜障害を直接反映するTERはTER=Rc×aで表され、TERを求めるには電流の通る面積（a）が必要であるが、この測定では正確に決められていない。よってこの測定では正確な角膜障害は測定できない。
　特許文献１は角膜障害が起こると電気抵抗値が下がるという電気生理学的現象をおおまかにみているとも言えるが、その測定原理と正確性は本願の技術には全く及ばない。
実公昭４８－１０７１６ Ｒｏｊａｎａｓａｋｕｌ　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．，（６６）１３１－１４２（１９９０） Ｒｏｊａｎａｓａｋｕｌ　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．，（６３）１－１６（１９９０） Ｃｈｅｔｏｎｉ　Ｐ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌ　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ，（１７）４９７－５０４（２００３） Ｕｅｍａｔｓｕ　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３９，３０８－３１４，２００７ 福田正道ら、あたらしい眼科　２４（４）：５２１－５２５、２００７
　本発明の課題は、角膜の障害を定量的に測定可能であって、かつ生体眼に適用可能な角膜障害の評価方法を提供することである。具体的には、良好な感度で角膜ＴＥＲを測定することが可能であって、かつ生体眼に適用可能な角膜経上皮電気抵抗値の測定方法を提供することである。
　本発明者らは、一方の電極を角膜上に配置し、他方の電極を結膜上に配置することによって、前房中に片方の電極を挿入するこれまでの方法よりも眼に対する侵襲性が低く、しかもそれに匹敵する測定結果が得られることを見出した。本発明の技術はUssing Chamberと同様、角膜の決まった面積（a）に対して測定器(volt-ohm meter)から一定の電流（Im）を流し、角膜電位の変化（ΔVc）を測定し電気抵抗値Rcを求めるものであり、TER=Rｃ×a=(ΔVc/Im)×aの関係が成り立つ。ここではImとaは確実に一定であり、ΔVcは正確に測れるため、角膜障害をTERで正確に評価することができる。
　さらに、本発明者らは、当該方法の実施に適した新規測定装置を作製することに成功し、本発明を完成した。
　即ち、本発明は、
［１］電極を、角膜上および結膜上に配置することを特徴とする、角膜経上皮電気抵抗の測定方法；
［２］角膜経上皮電気抵抗を測定する方法であって、
（１）第一の電極を角膜上に配置し、第二の電極を結膜上に配置する工程、および
（２）第一の電極と第二の電極との間に電流を流し、電気抵抗を測定する工程
を含む、方法；
［３］角膜上に配置した電極の周囲が絶縁されている、上記［１］または［２］記載の方法；
［４］生体眼で実施する、上記［１］～［３］のいずれか一項に記載の方法；
［５］生体眼の角膜経上皮電気抵抗を測定するための装置であって、
（１）角膜上に配置するのに適した第一の電極、
（２）結膜上に配置するのに適した第二の電極、および
（３）第一の電極を絶縁する絶縁体、
を備え、かつ第一の電極と絶縁体とが一体化されている、装置；
［６］第一の電極と絶縁体とが、電導体を介して一体化されている、上記［５］記載の装置；
［７］さらに第二の電極が一体化されている、上記［５］または［６］に記載の装置、
［８］絶縁体がシリコンゴムで形成され、且つ絶縁体の角膜との接触面が角膜と同じ曲率を有している、上記［５］～［７］のいずれか１項記載の装置、
［９］第二の電極がシート状の形態である、上記［５］～［８］のいずれか１項記載の装置、
［１０］電導体がヒアルロン酸又はアテロコラーゲンのゲルである、上記［５］～［９］のいずれか１項記載の装置、
等を提供する。
　本発明の角膜経上皮電気抵抗値の測定方法は、前房穿刺の必要がないので、ヒト角膜上皮細胞の電気抵抗値を生体眼であっても測定することができる。また、本発明の方法は、前房穿刺を用いる方法に匹敵する測定結果を得ることができる、より簡便な方法である。
　本発明の角膜経上皮電気抵抗値の測定方法を利用することで、前房穿刺することなく、生体眼の角膜障害を定量的に検出することができる。これによって得られた検出データを用いて角膜障害の診断をし、早期治療に利用することができる。
　本発明の角膜経上皮電気抵抗値の測定方法は、短時間で経時的な測定が可能である。また、薬物をスクリーニングするための研究（例えば、前臨床研究など）、薬物の薬効を評価するための研究、薬物の角膜毒性を評価するための研究等に有益である。
　本発明の角膜経上皮電気抵抗値の測定方法は、従来不可能であった、生体角膜のバリア機能の測定を可能とする。これにより、様々な角膜疾患における角膜バリア機能について新たな有用なる知見を得ることができ、眼科学、眼科医療の発展に寄与するものである。
図１は、本発明の一実施形態を示す模式図である。角膜電極は、絶縁体の内側を満たす電導体（緩衝液）中に配置されている。結膜電極は結膜嚢に貯留した涙液に接触している。 図２は、本発明の別の実施形態を示す模式図である。圧平式眼圧測定器タイプの角膜電極（絶縁体の内側に電導体（ゲル））を用い、結膜電極を電導体（ゲル）で覆っている。 図３は、本発明のさらに別の実施形態を示す模式図である。角膜電極、電導体（ゲル）、絶縁体及び結膜電極を備えたコンタクトレンズタイプの電極を用いている。 図４は、０．０２％ＢＡＣ投与後のＴＥＲの測定値を示すグラフである。図中、縦軸はΩ・ｃｍ２を、横軸はＢＡＣ投与後の秒を示す。 図５は、投与前のＴＥＲ測定値を１００％としたときの、図４と同じ結果を示す。図中、縦軸は％を、横軸はＢＡＣ投与後の秒を示す。 図６は、本発明の特に好ましいＴＥＲ測定装置を示す模式図である。絶縁体の角膜接触面は角膜と同じ曲率を有し、結膜電極部はシート状の形状を有している。 図７は、図６の測定装置で測定した、正常角膜の0.02％BAC投与前後の角膜のTERの記録図を示す。TER値は、この測定装置を角膜に接触させて1秒以内に、安定した値となった。 図８は、図６の測定装置を用いて測定した、０．０２％ＢＡＣ投与前及び投与１分後のＴＥＲ測定値を示す（ｎ＝３）。
符号の説明
１　角膜
２　結膜
３　結膜嚢にたまった涙液
４　角膜電極
５　結膜電極
６　絶縁体
７　電導体
８　電気抵抗値測定器
９　結膜電極部
　本発明は、電極を角膜上および結膜上に配置することを特徴とする、角膜経上皮電気抵抗の測定方法（本発明の方法と呼ぶ）を提供する。
　より具体的には、本発明の方法は、
（１）第一の電極（角膜電極ともいう）を角膜上に配置し、第二の電極（結膜電極ともいう）を結膜上に配置する工程；および
（２）第一の電極と第二の電極との間に電流を流し、電気抵抗を測定する工程
を含む。
　本明細書中、「角膜経上皮電気抵抗」とは、「角膜」の「経上皮電気抵抗（ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｅｌｅｃｔｒｉｃ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：ＴＥＲ）」のことをいう。
　ＴＥＲは、上皮のバリア機能を反映していると考えられている。測定されたＴＥＲが低いほど上皮細胞の障害度が高いことが公知である。すなわち、角膜経上皮電気抵抗を測定することによって、角膜上皮のバリア機能を評価することができ、角膜上皮細胞の障害度をも評価することができる。「バリア機能」とは、上皮細胞同士が密着結合（タイトジャンクション）、固定結合（接着結合、デスモソーム等）等の上皮細胞に特有な結合を形成することで、種々の物質が上皮を透過して体の内外に移動することを制御する機能をいう。
　障害のない正常な角膜では、角膜経上皮電気抵抗の値は、従来の遊離角膜片（切り取った角膜片）を用いた方法で測定すると、例えばウサギの場合、１００～７００Ω・ｃｍ２程度である。本発明の方法を用いると、角膜片切除に伴う角膜上皮障害が少ないため、これよりやや高いＴＥＲ値が得られる。具体的には、本発明の方法で測定した場合、ウサギの角膜経上皮電気抵抗の正常値は、５００～１５００Ω・ｃｍ２程度である。
　角膜の障害度の指標である角膜経上皮電気抵抗（ｃｏｒｎｅａｌ　ＴＥＲ）値の低下は、角膜上皮細胞の障害（傷害ともいう）によって角膜の物質透過性が上昇したこと、即ちバリア機能が低下したことに起因すると考えられている。
　角膜上皮は角膜の最も外側にあり外界に接触するため、障害を受けやすい部分である。本明細書中で、角膜の障害、角膜上皮の障害および角膜上皮細胞の障害は、互換可能に使用される用語である。角膜上皮細胞の障害とは、角膜上皮細胞間の密着結合（タイトジャンクション）、固定結合（接着結合、デスモソーム等）等の損傷を伴う各種障害のことをいい、例えば、角膜びらん、角膜潰瘍、角膜穿孔、角膜浮腫（上皮浮腫）、角膜感染症（細菌性角膜潰瘍、角膜真菌症、ウイルス性の角膜炎等）などが挙げられる。これらの角膜上皮細胞の障害は、外傷、炎症反応、紫外線、酸素不足、ドライアイ、不適切なコンタクトレンズ装用、ごみなどの異物、化学物質や薬品（例えば、点眼薬に含まれる防腐剤が挙げられる）などによって引き起こされ得る。角膜上皮細胞の障害は、眼内への微生物感染、潰瘍、視力低下などを導き得る。
　角膜上皮細胞は再生が可能であるが、角膜上皮細胞の障害が大きいとその内側の細胞群（本明細書中、これらを角膜内皮細胞と総称する）にも悪影響が及ぶ。角膜内皮細胞は角膜上皮細胞に比して再生能力が低いため、角膜上皮細胞の障害は早期に治療することが好ましい。そのためには、角膜上皮細胞の障害を早期に検出することが好ましい。
　なお下記の実施例では、点眼薬等において防腐剤として一般に用いられる塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）を使用して角膜障害を誘導しているが、本発明の方法が上記原因のいずれによって引き起こされた角膜障害の検出にも適用可能であることは明らかである。
　本明細書中で使用する場合、「角膜の障害度」とは、角膜上皮の障害の程度をいい、角膜障害後のＴＥＲ値の、角膜障害なしの正常値に対する％として、定量的に表現される。
　本発明の角膜経上皮電気抵抗の測定方法において、測定に用いる電極は、角膜上および結膜上に配置する。
　結膜は、球結膜、円蓋部結膜および瞼結膜から構成される。本発明における「結膜」とは、結膜を構成するいずれの膜をも包含する。また本明細書中、これらの結膜によって形成された空間（円蓋部結膜を中心とした結膜の袋状の構造）を、「結膜嚢」と称する。
　本明細書中において、「角膜上に電極を配置する」とは、角膜上皮の外表面と直接的もしくは電導体を介して間接的に接するような位置に電極を配置することを意味する。また、「結膜上に電極を配置する」とは、球結膜、円蓋部結膜もしくは瞼結膜の外表面に接する位置か、あるいは電導体を介して前記いずれかの膜に接するように、結膜嚢内に電極を配置することをも包含する。
　角膜上および結膜上に配置される電極は、少なくとも一つの正極および少なくとも一つの負極から構成されるが、いずれが正極でも負極でもよい。使用する電極の数も特に限定されず、その数は当業者であれば適宜決定することができる。
　使用する電極の種類としては、本発明の目的効果を達成し得る限り特に限定されず、経上皮電気抵抗を測定する際の電極として自体公知のものなどを適宜使用することが可能である。
　例えば、電極の素材としては、金、白金、銀、塩化銀、銅、ステンレス、鉄、カーボンなどが挙げられる。生体に損傷を与えにくいという観点から、好ましくは金、白金、銀、塩化銀の電極が用いられる。
　使用する電極の構造としては、本発明の目的効果を達成し得、眼の組織に障害を与えない限り特に限定されず、生体に使用される自体公知の電極を適宜使用することが可能である。たとえば、上記の電極素材からなる棒状、板状、円盤状、環状などの各種形状を有する電極が挙げられるが、それらに限定されない。電極は、電導体を用いずに角膜または結膜に直接接触させてもよいが、電導体と共に用いてもよい。
　電導体は電極と角膜または結膜との間隙部分に配置される。その素材としては、本発明の目的効果を達成し得、眼に対して悪影響を与えない限り特に限定されず、電導物質として自体公知のものを適宜使用することが可能である。電導体は、固体、液体、ゲルなどであり得るが、電極をよりフレキシブルに角膜および／または結膜に密着させる観点から、液体、ゲルが好ましい。この場合の電導体としては、生理食塩水、緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、Hanks' Balanced Salt Solutionなど）やハイドロゲル（例えば、ヒアルロン酸、アテロコラーゲンのゲルなど）などが挙げられるがこれらに限定されない。結膜電極の場合、電導体は結膜嚢にたまった涙液で代用してもよい。また、電導体として固体状のものを用いる場合、角膜もしくは結膜にできるだけ密着するように、角膜もしくは結膜との接触面は、角膜もしくは結膜の外表面の形状に適合した形状とする（例えば、角膜電極で用いる場合、角膜との接触面を角膜と同じ曲率にする）ことが望ましい。
　本発明の測定方法では、角膜上皮に電流を流すことによって角膜経上皮電気抵抗を測定するので、角膜上皮に確実に電流を流す必要がある。角膜上には通常涙液が存在するため、通常、電極を角膜上に配置するだけでは角膜上皮だけでなく涙液にも電流が分散され、正確な角膜経上皮電気抵抗値が得られない可能性がある。
　従って、電極間の電流を角膜上皮に確実に通し、涙液等を介する電流の短絡を防ぐために、角膜電極（電極と角膜との間に電導体が介在する場合は該電導体）の外周に絶縁体を配置することが好ましい。絶縁体の素材としては、本発明の目的効果を達成し得、眼に悪影響を与えない限り特に限定されず、絶縁物質として自体公知のものを適宜使用することが可能であり、ニトリルゴム、ポリジメチルシロキサン（PDMS）をはじめとしたシリコンゴムなどが挙げられるが、これらに限定されない。必要に応じて複数の絶縁体を組み合わせて使用してもよい。
　好ましい一実施形態においては、絶縁体は、角膜電極と一体化された形態で提供される。絶縁体と角膜電極とが「一体化」しているとは、絶縁体と角膜電極とが、絶縁体の配置と角膜電極の配置とを別々に行なうことを要しない構成を予めとっていることをいい、そのような構成としては、例えば、絶縁体と角膜電極とが直接接触して一体化した形状を有している構成、絶縁体と角膜電極との間に電導体などの他の物質が介在して全体として一体化した形状を有している構成等をいうが、これらに限定されない。
　絶縁体の形状は、使用する電極や電導体などの形状に依存して異なり得るが、電極もしくは電導体から涙液等への電流の短絡を防ぐように電極もしくは電導体の外周を囲み、かつ角膜に密着する形状である限り特に限定されない。例えば、絶縁体の形状としては、リング状、筒状などが挙げられる。さらに、角膜に密着させるため、絶縁体の角膜接触面を角膜と同じ曲率にすることなども考えられる。
　例えば、絶縁体としてニトリルゴムのリングを使用する場合、リングの寸法は、その直径（少なくとも内径）が角膜径を超えない範囲で適宜選択することができる。例えば、ヒトの場合、リングの内径は３～９ｍｍ（例えば、６ｍｍ程度）が好ましい。ウサギの場合、例えば、リングの内径は３～１１ｍｍ（例えば、７ｍｍ程度）である。
　角膜電極を結膜電極から絶縁するため、角膜に接触させる際、絶縁体を角膜上に密着させることが望ましい。絶縁体の密着方法としては、軽度の圧迫、陰圧による吸着、絶縁体のゲル、接着剤、眼軟膏などを用いる方法が挙げられるが、角膜及び他の眼組織に損傷または障害を与えないものが好ましい。具体的には、例えば、軽度の圧迫、絶縁体のゲル、眼軟膏が好ましく、絶縁体のゲル、眼軟膏が特に好ましい。絶縁体のゲルとしては、ワセリンなどが挙げられるがこれらに限定されない。接着剤としては、シアノアクリレート系接着剤、アクリル樹脂系接着剤などが挙げられるがこれらに限定されない。眼軟膏としては、タリビッド眼軟膏（登録商標）、フラビタン眼軟膏（登録商標）などが挙げられるがこれらに限定されない。
　本発明において電極間に流す電流は、ＴＥＲ値の測定が可能であってかつ上皮細胞が損傷を受けない限りにおいて特に限定されないが、好ましくは１０μＡ～１０ｍＡであり、より好ましくは２０μＡ～１００μＡである。電流は、直流であっても交流であってもよい。
　ＴＥＲ値は、電流に対する電圧の変化を測定し、オームの法則（電圧＝電流×抵抗）により算出した抵抗値から得ることができる。電気抵抗を測定するための測定機器としては、短絡電流装置、電圧・電気抵抗値測定器（例えば、World Precision Instruments, Inc.製のＥＶＯＭ（登録商標））などが挙げられるが、これらに限定されない。
　TER値はΩ・ｃｍ２で表され、得られた電気抵抗の値に電流が流れる面積（a）を乗算して得た値である。この面積（a）は、角膜電極を囲む絶縁体の内側の角膜の面積である。この値を正常値と比較等することで、角膜上皮細胞の障害度を定量的に評価することができる。
　本発明の方法は、侵襲が少ないため、生体眼に対して実施することが可能である。本明細書において「生体眼」とは、本発明の適用対象として下記に例示した生体動物の、取り出されていない眼をいう。生体眼は、摘出、切開等の侵襲性の操作を受けていない眼である。
　本発明の方法の適用対象としては、ヒトならびに実験動物、愛玩動物、家畜などの哺乳動物（例、ウサギ、ラット、マウス、ハムスター、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、サルなど）が挙げられる。なかでも、目薬の前臨床試験等に用いられる実験動物、角膜障害の治療が望まれる動物などへの適用が意図され得る。哺乳動物は、好ましくはヒトである。
　本発明はまた、生体眼の角膜経上皮電気抵抗を測定するための装置（本発明の装置と呼ぶ）を提供し、この装置は、（１）角膜上に配置するのに適した第一の電極、（２）結膜上に配置するのに適した第二の電極、および（３）第一の電極と一体化された絶縁体を備える。この装置における各要素は上記の通りである。
　第一の電極としては、上記本発明の方法において詳述した角膜電極が好ましく用いられる。また、第二の電極としては、上記本発明の方法において詳述した結膜電極が好ましく用いられる。さらに、絶縁体としては、上記本発明の方法において詳述した絶縁体が好ましく用いられる。本発明の装置は、角膜電極と絶縁体とが一体化されていることを特徴とする。ここで「一体化」とは前記と同義である。当該絶縁体と一体化した角膜電極を、以下「角膜電極部」という。角膜電極部は、電極が角膜に直接的に接するように設計されている場合には、電極と絶縁体のみからなっていてもよいし、あるいは電極と角膜を連結するための部材をさらに含んでもよい。一方、電極が角膜に直接的に接しない場合、角膜電極部は、電極を角膜に間接的に接触させるための電導体をさらに構成として含み得る。即ち、好ましい態様において、角膜電極部は、電極が電導体を介して絶縁体と一体化されている。この場合、電導体としては、角膜電極部の一体性を保持するために、固体もしくはゲル状の素材が選択され得る。使用前の形状安定性と使用時の角膜との密着性を考慮すると、ハイドロゲル（ヒアルロン酸、アテロコラーゲンのゲルなど）などの素材が特に好ましい。
　角膜電極自体の形状は、角膜電極を囲む絶縁体の内側に収まるものであれば特に限定されず、経上皮電気抵抗を測定する際の電極として自体公知のものなどを適宜使用することが可能である。例えば、棒状、板状、線状などが挙げられるが、これらに限定されない。角膜電極部の形状は、角膜に密着できる形状であればよく、具体的には角膜接触面が凹である円柱、角柱等が挙げられるが、これらに限定されず、角膜電極部の形状として、例えば圧平式眼圧測定器様の形状やコンタクトレンズ様の形状も挙げられる。
　角膜電極部の大きさは、絶縁体の内径が角膜径を超えない大きさであればよく、ヒトの場合、好ましくは絶縁体の内径は最大で角膜径（約１２ｍｍ）までであり、好ましくは１－１２ｍｍである。
　結膜電極は単独で構成されてもよいし、固体もしくはゲル状の電導体と一体化させて用いてもよい（包括的に「結膜電極部」という）。結膜電極部の大きさは、結膜電極部全体が結膜嚢に収まる大きさであってもよいが、結膜電極部の少なくとも一部が結膜や結膜嚢に貯留した涙液に接触すれば足りる。結膜電極部の全体を結膜嚢に収まる大きさとする場合、ヒトの場合、好ましくは、全体として１－１０ｍｍの範囲に収まる大きさである。形状は結膜や結膜嚢に貯留した涙液に接することの出来る形状であればよく、眼の組織に障害を与えない形状が好ましい。具体的には結膜接触面が凹である扁平体、板状、線状、シート状などが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、好ましい一実施形態においては、角膜電極部と結膜電極部とが、その間で直接電流が流れないような形態で一体化される。
　図１～３は、本発明の可能な実施形態を例示する模式図（矢状断面）である。図示した実施形態は例に過ぎない。図１は、リング状の絶縁体と緩衝液を用いた角膜電極の例を示す。図２は圧平式眼圧測定器タイプの角膜電極の例を示し、図３はコンタクトレンズタイプの電極の例を示している。図３では、結膜電極がコンタクトレンズの縁部に取り付けられている。
　電極をコンタクトレンズの形状にする場合、絶縁体の外側の部分を構成する素材は、コンタクトレンズに一般に用いられる任意の素材であり得、例えば、プラスティック（例えば、アクリル樹脂、ポリカーボネートなど）、ゴムなどが挙げられるが、これらに限定されない。
　図６は、本発明の特に好ましい実施形態の１例を示す模式図である。この実施形態では、角膜電極、絶縁体、電導体及び結膜電極が一体化しているため、生体眼にそのまま接触させるだけで即座にTERを測定することができ、セッティングの手間を排除できるため、被験体の負担を軽減することが可能である。
　本実施形態では、絶縁体としてシリコンゴム、ニトリルゴムなどを使用することができる。シリコンゴムの例としては、ポリジメチルシロキサン（PDMS）、ビニルメチルシリコンゴムなどが挙げられるがこれらに限定されない。シリコンゴムは生体適合性が高く、柔らかいため角膜表面に傷がつきにくいので安全性が高い材料であり、また加工も容易であるため、シリコンゴムを使用することが特に好ましい。シリコンゴムを絶縁体として用いることにより、測定装置によって角膜に擦過創ができるのを防ぐことができる。
　この絶縁体は、好ましくはリング状～筒状の形状（例、内径1～13mm（例えば3～11mm）、厚さ0.1～5mm（例えば1～3mm）、高さ0.1mm～20mm（例えば1～10mm））であり、角膜との接触面には角膜と同じ曲率をつける。「角膜と同じ曲率」とは、絶縁体と角膜との密着が確保される限り、角膜とほぼ同じ曲率も含むことを意図しており、完全に同じ曲率でなくてもよい。また、接触面は上記厚さより厚くなっていてもよい。
　角膜の曲率は、オフタルモメーター、ケラトメーター、フォトケラトスコープなどを用いて通常の方法で測定でき、絶縁体に付す曲率は、被験体の種類等に応じて適宜変更できる。例えば、ヒトの場合、曲率半径は６５０～８５０ｍｍ（例えば７９０ｍｍ）である。また、ウサギの場合、曲率半径は６００～８００ｍｍ（例えば７５０ｍｍ）である。
　正確にTERを測定するには電極間の確実な絶縁が必要である。特に眼表面は涙液で覆われており、絶縁が不十分であると電流が涙液を通るため正確なTERを測定することができない。絶縁体は、絶縁体と眼表面との間に涙液層を残さないよう、軽い圧迫等により全周が確実に角膜上に触れることが好ましい。また絶縁体にはある程度（好ましくは１～３ｍｍ）の厚みを持たせ、涙液層が残存したとしても電流が涙液層をほとんど流れないこと、即ち、涙液層を通る電気抵抗値が上皮を通る電気抵抗値を無視できるほど高くなることが望ましい。絶縁が確実に行なわれる限り、絶縁はいずれの方法によってもよい。
　この絶縁体の内側に電導体ゲルを配置する（例えば、図２及び図６を参照のこと）。電導体ゲルとしては、緩衝液を含むポリエチレングリコールなどの合成高分子、ヒアルロン酸、アテロコラーゲン、ゼラチン、セルロース、アガロースなどの生物由来高分子のゲルなどが使用できる。生体適合性が高く、安全性の高い材料であり、加工が容易で、電導性の得られるヒアルロン酸又はアテロコラーゲンのゲルを使用することが好ましいが、これらの条件を充たす素材であれば上記ゲルに限定されない。角膜に密着させるため、絶縁体同様、この電導体ゲルの角膜接触面にも角膜と同じ曲率をつけることが好ましい。
　角膜電極は、好ましくはこの電導体ゲルに接触するように配置されるか或いは電導体ゲルに埋め込まれ、角膜電極と絶縁体とが一体化される（角膜電極部）。その結果、角膜電極は電導体ゲルを介して角膜と間接的に接触する。用いる角膜電極は、この実施形態に適合するよう小型化されたものである。角膜電極の寸法/形状/材質等は上述の通りである。
　角膜電極部を含む部分の全体としての外形は特に限定されず、使用の態様に応じて適宜変更してよく、例えば、取り扱いのしやすさ、通常の眼科診療機器（細隙灯や眼圧測定装置）への搭載等を考慮して適宜決定することができ、図６に示したようなものを例として挙げることができる。例えば、角膜電極部を含む部分の全体としての外形は、手で持って操作できるような形状（例えばペン型）などとすることができるが、これに限定されない。
　上記絶縁体がそのまま全体を覆って外形を構成していてもよく、あるいは角膜電極部（この場合、電導体も合わせた部分をいう）が、上述の外形を構成する他の部材と一体化していてもよい。
　また、本実施形態では、結膜電極部をシート状の形態にする。シート状とは、例えば厚さ０．００１ｃｍ～０．１ｃｍ、長さ（図６中ｂ方向）０．５ｃｍ～５ｃｍ、幅０．１ｃｍ～２ｃｍ（図６中ａ方向）のものをいい、好ましい例は、厚さ０．０１ｃｍ、長さ１ｃｍ、幅０．５ｃｍのシートである。また、方形、円形、楕円形など任意の形状のシートが使用できるが、略長方形のシートを用いることが好ましい。結膜接触時の擦傷を防ぐため、角をとった形状としてもよい。結膜電極をシート状にすることにより、結膜嚢への挿入が容易になる。
　このシートは、例えば、PET、ポリイミド、シリコンゴム、アクリルなどの材料から形成され得るが、強度があり、柔軟性が高く、成形が容易である点からPET、ポリイミドが好ましい。
　結膜電極は、このシート状結膜電極部の遠位端（角膜電極部への取り付け部位の反対側）に配置することが好ましいが、結膜や結膜嚢に貯留した涙液との直接的接触又は電導体を介した間接的接触が保証される限りいずれの場所に配置してもよく、例えば、結膜電極部の遠位端から５ｍｍまでの位置に配置することができる。結膜電極部は電導体で覆った形態としてもよく、電導体としては上述したハイドロゲルが用いられ得るが、電導性のあるゲルであればそれらに限定されない。結膜電極はシートの結膜接触側に配置することが好ましいが、電導体を用いる場合にはシートの外側（結膜接触面の反対側）に配置してもよく、電導体の内部に埋め込む事もできる。
　結膜電極は測定時には結膜上、結膜嚢内または涙液内に留置されるが、その位置は角膜輪部から０．１～１５ｍｍであり、３ｍｍが望ましい。
　結膜電極部は、本装置を結膜に接触させた際に適切に配置されるよう、眼球の形状に沿う角度をつけて、角膜電極部に取りつける。
　角膜電極部及び結膜電極部は被験体の角膜や眼球の大きさによって適宜変更することができる。例えば、ヒト乳児、ヒト小児、マウス、ラット、サルなどではサイズは小さくでき、ブタ、ウシなど大型動物ではサイズを大きくすることができる。
　本発明はまた、上記した本発明の方法を用いることを特徴とする、あるいは本発明の装置を構成として含む、薬物のスクリーニング系を提供する。本発明の方法および本発明の装置を用いれば、生体眼における角膜障害を定量的に測定することができるので、例えば、角膜障害を誘導したモデル動物を用いて、角膜の障害を伴う疾患（例えば、角膜びらん、角膜潰瘍、角膜穿孔、角膜浮腫（上皮浮腫）、角膜感染症（細菌性角膜潰瘍、角膜真菌症、ウイルス性の角膜炎等）など）の治療薬の候補化合物をスクリーニングすることができる。即ち、該モデル動物において、試験化合物投与の前後で生体角膜ＴＥＲ測定を行い、投与によりＴＥＲ値が有意に改善された試験化合物を、角膜の障害を伴う疾患の治療薬の候補化合物として選択することができる。
　本発明はまた、上記した本発明の方法を用いることを特徴とする、あるいは本発明の装置を構成として含む、薬物の薬効及び／又は毒性評価系を提供する。本発明の方法および本発明の装置を用いれば、生体眼における角膜障害を定量的に測定することができるので、例えば、角膜が障害された実験動物もしくは角膜の障害を伴う疾患に罹患したヒトを被験体として、角膜の障害を伴う疾患（例えば、角膜びらん、角膜潰瘍、角膜穿孔、角膜浮腫（上皮浮腫）、角膜感染症（細菌性角膜潰瘍、角膜真菌症、ウイルス性の角膜炎等）など）の治療薬の薬効を評価することができる。即ち、該被験体において、評価対象薬物の投与の前後で生体角膜ＴＥＲ測定を行い、該薬物の投与によりＴＥＲ値が有意に改善された場合に、該薬物は角膜の障害を伴う疾患の治療に有効であると判定することができる。一方、例えば、角膜障害以外の眼の疾患に罹患している実験動物もしくはヒトを被験体として、該疾患の治療薬の角膜毒性を評価することができる。即ち、該被験体において、評価対象薬物の投与の前後で生体角膜ＴＥＲ測定を行い、該薬物の投与によりＴＥＲ値が有意に悪化した場合に、該薬物は角膜毒性を有すると判定することができる。
　本発明はまた、本発明の方法において、電導体として、あるいは絶縁体を角膜に密着させるために使用され得る、医薬上許容される物質を含有してなる、角膜の障害を伴う疾患（例えば、角膜びらん、角膜潰瘍、角膜穿孔、角膜浮腫（上皮浮腫）、角膜感染症（細菌性角膜潰瘍、角膜真菌症、ウイルス性の角膜炎等）など）の診断剤を提供する。電導体として使用され得る、医薬上許容される物質としては、例えば、生理食塩水、緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、Hanks' Balanced Salt Solutionなど）やハイドロゲルなどが挙げられる。また、絶縁体を角膜に密着させるために使用され得る、医薬上許容される物質としては、例えば、絶縁体のゲル、接着剤、眼軟膏などを用いる方法が挙げられる。具体的には、絶縁体のゲルとしては、ワセリンなどが、接着剤としては、シアノアクリレート系接着剤、アクリル樹脂系接着剤などが、眼軟膏としては、タリビッド眼軟膏（登録商標）、フラビタン眼軟膏（登録商標）などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の診断剤は、防腐剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、安定化剤等の他の医薬上許容される添加剤をさらに含有してもよい。
　本発明の診断剤による角膜の障害を伴う疾患の診断は、それを電導体もしくは絶縁体を角膜に密着させるための手段として用いて、上記した本発明の方法を実施することにより、被験体における生体角膜ＴＥＲ測定を行い、該測定値を正常値と比較することにより実施することができる。
　以下の実施例によって本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら特定の実施例に限定されるものではない。
　（比較例１）
　前房穿刺を用いた生体角膜ＴＥＲ測定による、ＢＡＣの角膜障害の評価（前房穿刺法と呼ぶ）
　上記非特許文献４に記載された方法に従って、ウサギの角膜上および前房中に電極を配置し、０．０２％ＢＡＣを投与した後の角膜ＴＥＲを測定した。
　（実施例１）
　前房穿刺を必要としない生体角膜ＴＥＲ測定（図１）による、ＢＡＣの角膜障害の評価（結膜嚢法と呼ぶ）
　生体ウサギの角膜上と結膜嚢内に棒状の銀・塩化銀電極を配置し、０．０２％ＢＡＣを投与した。ＢＡＣへの曝露による角膜ＴＥＲの変化を、電圧・電気抵抗値測定器で測定した。角膜上の電極の周囲は、ゴムリング（内径6ｍｍ）を生体接着剤（三共社製、アロンアルファＡ）で固定することによって絶縁し、電流が必ず角膜上皮を通過するようにした。±20μＡの交流電流を流し、ＴＥＲの変化曲線、０．０２％ＢＡＣ曝露の６０秒後のＴＥＲの減少およびＴＥＲの値を従来の前房穿刺を行なう測定法（比較例１）と比較した。ＴＥＲの値は、測定値から予備実験で測定した前房－結膜嚢間の電気抵抗値を減じることで算出した。
　比較例１および実施例１で得られた結果の比較を図４および５に示す。０．０２％ＢＡＣを投与したとき、結膜嚢法で得たＴＥＲ減少曲線は、従来の前房穿刺法で得たＴＥＲ減少曲線と類似していた。ＢＡＣ投与前のＴＥＲを１００％とすると、投与１０秒後のＴＥＲは３５．１±６．８％となり、６０秒後には１３．５±２．１％と有意に減少した（ｐ＜０．０１）。前房穿刺法での投与６０秒後のＴＥＲは１９．７±５．９％であった。６０秒後のＴＥＲの値は、結膜嚢法では１７５±１４Ωｃｍ２であり、前房穿刺法では１３８±１０Ωｃｍ２であった。
　以上より、本発明の方法（結膜嚢法）により、前房穿刺法と匹敵する検出結果が得られることが明らかである。
　（実施例２）
生体角膜TER測定装置の作製（図６）
角膜電極部
　直径１２ｍｍの円形のカバーグラス上に直径１ｍｍの銀電極と銀・塩化銀電極をおいた。直径１０ｍｍ、内径６ｍｍの円柱状のPDMSで角膜接触面の曲率半径を７．９ｍｍに形成したものをカバーグラス上に接着剤で固定した。細隙灯に搭載するため、エッペンドルフチューブを後部（角膜接触面の反対側（カバーグラス側））に取り付けた。PDMSの内腔にアテロコラーゲンゲルを充満させ、その曲率半径を７．９ｍｍに整えた。
結膜電極部
　０．００５×０．５×１ｃｍのPETシート上に直径１ｍｍの銀電極と塩化銀電極をシートの遠位端から１mmの眼球側においた。コラーゲンゲルでPETシートと銀電極と塩化銀電極を薄くコーティングした。この結膜電極部を、眼球の形状に沿う角度をつけて、角膜電極部のエッペンドルフチューブに接着剤で固定した。
ＴＥＲ測定
　こうして作製したTER測定装置を用いて、生体ウサギの角膜TERの変化を測定した。日本白色ウサギに全身麻酔をかけ、接着テープで開瞼した。上述の装置を細隙灯の先端に設置し、細隙灯を操作することで正確に角膜中央部に角膜電極部を接着させるとともに、結膜電極部を結膜嚢及びそこに貯留する涙液に接着させる。
　ウサギに０．０２％　ＢＡＣを点眼し、投与前のＴＥＲ値と比較した。結果を図７及び図８に示す。図７から、TER測定装置を角膜に接触させると直ぐにTERが測定できることがわかる。BAC投与前（図７中、「正常角膜」と示す）及び投与後共に、装置を角膜に接触させてから１秒以内に、安定したTER値を測定することができた。図８が示すとおり、BAC投与の１分後にTERは有意に減少した。これは、図４に示す結果と整合性のある値であった。
　また、TER測定の前後に角膜染色試験を行なって上皮障害の有無を確認したところ、本装置を用いたTER測定では角膜障害はほとんど生じなかった（図示せず）。
　本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明であろう。本発明者は、本発明が本明細書に詳細に記載された以外の方法で実施され得ることを意図する。したがって、本発明は添付の特許請求の範囲の精神および範囲に包含されるすべての変更・修飾を含むものである。
　本発明は、侵襲性の低い生体眼の角膜障害検出方法を提供する。本発明による検出方法は前房穿刺の必要がないので、ヒトへの適用も可能であり、角膜障害の診断やその早期治療に利用することができる。また、本発明の方法では、角膜障害後短時間での測定及び角膜障害の経時的な測定が可能であり、薬物をスクリーニングするための研究、薬物の薬効を評価するための研究、眼に対する薬物の影響を評価するための研究等に有益である。また、様々な角膜疾患における角膜バリア機能について新たな有用なる知見を得ることができ、眼科学、眼科医療の発展に寄与するものである。
　本出願は、日本で出願された特願２００８－０５２５６７（出願日：平成２０年３月３日）を基礎としており、その内容は本明細書にすべて包含されるものである。

Claims (10)

  1. 　電極を、角膜上および結膜上に配置することを特徴とする、角膜経上皮電気抵抗の測定方法。
  2. 　角膜経上皮電気抵抗を測定する方法であって、
    （１）第一の電極を角膜上に配置し、第二の電極を結膜上に配置する工程；および
    （２）第一の電極と第二の電極との間に電流を流し、電気抵抗を測定する工程
    を含む、方法。
  3. 　角膜上に配置した電極の周囲が絶縁されている、請求項１または２記載の方法。
  4. 　生体眼で実施する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　生体眼の角膜経上皮電気抵抗を測定するための装置であって、
    （１）角膜上に配置するのに適した第一の電極、
    （２）結膜上に配置するのに適した第二の電極、および
    （３）第一の電極を絶縁する絶縁体、
    を備え、かつ第一の電極と絶縁体とが一体化されている、装置。
  6. 　第一の電極と絶縁体とが、電導体を介して一体化されている、請求項５記載の装置。
  7. 　さらに第二の電極が一体化されている、請求項５または６に記載の装置。
  8. 　絶縁体がシリコンゴムで形成され、且つ絶縁体の角膜との接触面が角膜と同じ曲率を有している、請求項５～７のいずれか１項記載の装置。
  9. 　第二の電極がシート状の形態である、請求項５～８のいずれか１項記載の装置。
  10. 　電導体がヒアルロン酸又はアテロコラーゲンのゲルである、請求項５～９のいずれか１項記載の装置。
     
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