WO2009056076A1 - Variantes ingenierizadas de pertactina para uso vacunal - Google Patents
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Definitions
- the present invention is framed in the field of biomedicine, specifically in the engineering of the pertactin protein (Pm) for use in acellular vaccines against Bordetella pertussis.
- the engineered pertactins encompass in their structure the polymorphism of different strains and when tested as vaccines they induce an antibody response of greater protective capacity and greater opsonophagocytic activity.
- Pertussis, Coqueluche or Pertussis is an acute, highly infectious respiratory disease caused by the Bordetella pertussis bacteria, a microorganism first isolated in 1906 by Bordet and Gengou [Bordet, J. and O. Gengou. Ann Inst Pasteur (Paris), 1906. 20: p. 731-41]. Recently it was estimated that the annual morbidity of infected people in the world is 48.5 million. In children under 6 months, the disease is particularly severe, with 90% of the total number of deaths associated with this population subgroup (300-400 thousand) [Crowcroft, N. S., et al. Lancet Infect Dis, 2003. 3 (7): p. 413-8]. There are several types of vaccines against B.
- pertussis comprised in two large groups: cell vaccines and the most recent, of the acellular type. Due to the effect of vaccination there has been a dramatic decrease in the incidence of disease, and there has also been a shift in the incidence of cases, moving from children to adolescents and adults. Numerous studies show that adolescents are the fundamental reservoir of B. pertussis, and that these constitute the fundamental source of contagion for partially protected children. Therefore, whooping cough is still an unsolved problem, so it is necessary to develop new vaccines for better control of the epidemic, reemerging outbreaks and possible eradication of this disease in the regions of endemism [Cherry, JD Pediatrics, 2005. 115 (5): p. 1422-7; Singh, M. and K. Lingappan, Chest, 2006. 130 (5): p. 1547-53].
- the Bordetella genus comprises nine species, of which four have been associated with infections in mammals, namely B. holmesii, B. bronchiseptica, B. parapertussis and B. pertussis, the last two being the fundamental actors of human infections [Mattoo, S., et al. Front Biosci, 2001. 6: p. E168-86]. Most virulence factors are regulated at the transcriptional level by a two-component system called BvgA / S (Bordetella virulence Activator / Sensor genes) [Stibitz, S., et al. Nature, 1989. 338 (6212): p. 266-9].
- Pm Pertussis toxins (from the English pertussis toxin, abbreviated PT), Trachea Colonization Factor, Adenylate Cyclase; and the adhesives Phytohemagglutinin filamentous (FHA), Fimbria (Fim) and pertactin (Pm), a protein on which the present invention focuses.
- Pm is an outer membrane protein, which belongs to the family of type V autotransporters. It is characterized by catalyzing its own transport through the outer membrane. [Henderson, IRTrends Microbiol, 2000. 8 (12): p. 534-5].
- Mature Pm is a 68-kDa, 69-kDa and 70-kDa protein in B.
- bronchiseptica Henderson, IR Infec ⁇ Immun, 2001. 69 (3): p. 1231-43.
- B. pertussis [Char ⁇ es, LG. , et al. Proc Nati Acad Sci USA, 1989. 86 (10): p. 3554-8.]
- B. parapertussis [Li, LJ. , et al. Mol Microbiol, 1991. 5 (2): p. 409-17], respectively.
- the structure consists of 16 parallel strands in ⁇ -helix and a V-shaped cross section [Emsley, P., et al. Nature, 1996. 381 (6577): p. 90-2.]. From this helical core numerous loops are projected.
- Acellular vaccines may consist of: 1) a component of Pertussis Toxin (PT), 2) two components: PT and Phytohemagglutinin filamentous (FHA), 3) three components: PT, FHA and Prn, and 4) five components, which includes the three previous components and Fimbria 2 (FIM2) and Fimbria 3 (FIM3).
- PT Pertussis Toxin
- FHA Phytohemagglutinin filamentous
- FHA Phytohemagglutinin filamentous
- Prn is one of the proteins with the highest polymorphism in B. pertussis.
- region 1 region 1
- region 2 region 2
- PQP Pro-GIn-Pro
- the R1 region is located in a protuberant loop near the amino terminal (N-term) end and adjacent to the RGD motif
- the R2 region is located towards the carboxyl terminal (C-term) end [Hijnen, M., et al. Infect Immun, 2004. 72 (7): p. 3716-23.].
- a total of 12 variants of Prn (Prn1, Prn2, Prn3 ... Pm12) have been identified, for B.
- the present invention has as main objective to contribute to the development of more effective acellular vaccines against pertussis.
- the main works that precede the present invention, with a view to finding more effective vaccines, are based on obtaining immunogenic preparations by applying mixtures of Pm (Nicole Guiso et al., WO 01/90143 A2 and US 2006/0008474 A1) or synthetic peptides from the R1 region of Prn (Frederik Mooi et al., WO 02/00695 A2). Therefore, an important problem of the prevention of pertussis is to achieve the development of more effective acellular vaccines.
- This invention contributes to solving the aforementioned problem, and is part of the engineering of the prnA gene, coding for the ⁇ outer membrane protein.
- pertussis called Pertactin (Pm).
- the invention covers the needs evidenced in the state of the art, making it possible to obtain different variants of engineering pertactins, so that in a single molecule two different polymorphic domains of the R1 region of Pm are understood.
- the versatility of the invention provides for the engineering of new Pm, additionally comprising three or more different polymorphic domains of the R1 region.
- the object of the present invention is a polynucleotide sequence encoding an engineered pertactin protein, comprising up to the first 300 amino acids near the N-terminal end of a given type of pertactin natura! mature (PmX300) and an amino acid sequence comprising up to the last 620 amino acids near the C-terminal end of a given type of mature natural pertactin (PmY620), which results in a PrnX300- PrnY620 engineered pertactin.
- engineing pertactin refers to a protein that results from coupling, adjacent or not, a fragment comprising up to the first 300 amino acids near the N-terminal end of a mature natural pertactin molecule to another fragment containing up to the last 620 amino acids near the C-terminal end of a mature natural pertactin molecule.
- the new variants of engineering pertactins are obtained by molecular mutagenesis, by adjacently coupling sequences comprising up to 300 amino acids near the N-terminal end of a given type of mature natural pertactin, to sequences comprising up to the last 620 amino acids near end C -terminal of a given type of mature natural pertactin.
- the new immunized Pm comprises sequences of different types of Pm in a single molecule, without affecting the protective immune response.
- different engineering variants of Pm encoded by the nucleic acid sequences identified as SEQ ID No 1- SEQ ID No 6 are obtained.
- the fragment of the first 300 amino acids near the N-terminal end of a given type of mature natural pertactin correspond to pertactins of the genus Bordetella.
- this fragment corresponds to pertactins of B. pertussis or B. parapertussis, preferably to the variants Pm1, Pm2 and Prn3 of B. pertussis.
- the last 620 amino acids near the C-terminal end of a given type of pertactin natura! mature correspond to pertactins of the genus Bordetella.
- the PmY620 fragment corresponds to pertactins of f ⁇ . pertussis and S. parapertussis, preferably to the Prn1, Pm2 and Prn3 variants of ⁇ . pertussis
- the polynucleotide sequence of the present invention encodes a polypeptide chain comprising any possible combination of given types of pertactins in the PrnX300-PrnY62Q format.
- the amino acid sequences PrnX300 and PrnY620 are coupled adjacently, or by the use of the sequences IDNATWVMTDN or IDNATWVMTDNIDNATWVMTDN.
- the PrnX300 and PmY620 amino acid sequences can be devoid of repeated sequences, preferably the GGXXP and PQP sequences of the R1 and R2 regions.
- Region 1 which comprises the repeated sequences GGXXP is weakly recognized by human and rabbit sera, indicating that it is not an immunodominant region [Hijnen, M., FR Mooi, et al. (2004). Infect Immun 72 (7): 3716-23].
- GGXXP deletions do not significantly affect the structural properties, since Prn mutated in region 1 are recognized by conformational monoclonal antibodies (AcM) generated against natural pertactins, and not by sequential anti-GGXXP mAbs. Additionally, it has been observed that certain mutations in regions 1 can increase the binding capacity of certain conformational mAbs. Finally, there is evidence indicating that region 1 (GGXXP) and region 2 (PQP) form a unique epitope [Hijnen, M., R. de Voer, et al. (2007). Vaccine 25 (31): 5902-14].
- the object of the present invention is also a polynucleotide sequence that codes for an engineered pertactin, where the amino acid sequences PmX300 and PmY620 comprise peptides that function as helper T epitopes, preferably Diphtheria, Tetanus, HBV, Poliovirus, Vaccina, HIV and Influenza epitopes. It is known by people versed in this field of The technique that the insertion of this type of epitopes leads to an increase in the immune response generated by the molecules that possess them.
- the object of the present invention are also polynucleotide sequences according to claim 1, wherein the polynucleotide sequence is optimized in its use of codons, for its expression in bacteria, yeasts, insect or mammalian cells.
- the present invention includes the generation of engineering pertactins that contemplate in a single molecule different polymorphic regions from different species of the genus Bordetella.
- the engineering pertactin object of the present invention was not only capable of generating an effective response against different strains of B. pertussis, which express Prn1 and Prn2, but also induced a more effective antibody response with respect to natural proteins, evidenced in the respiratory challenge model and in the opsonophagocytosis trial.
- the response induced by the engineering pertactin was, in addition, superior to that of an equimolar mixture composed of Pm 1 and Prn2 (Pm1 + Prn2).
- Vaccine compositions based on mixtures of different pertactins of one species or of different species, although they cover polymorphism, lead to technological difficulties associated with production processes, such as an increase in the concentration of pollutants and inconsistency in batch production. , among others. This is an aspect of vital importance for the development of combined vaccines, where multiple antigens of different characteristics are involved, which can compromise the systemic immunogenicity of the formulation.
- the present invention provides a pharmaceutical composition
- a pharmaceutical composition comprising one or more engineering pertactins, encoded by the polynucleotide sequences of claims 1 to 13, which in sufficient quantities generate a humoral immune response and Cellular effective against species of the genus Bordetella, by an immunization procedure in mammals, preferably in humans.
- the pharmaceutical composition comprises one or more engineering pertactins generates an effective humoral and cellular immune response against B. pertussis.
- the object of the present invention is also a live or attenuated vaccine comprising one or more engineering pertactins, encoded by the polynucleotide sequences of claims 1 to 13, wherein the engineering pertactin is preferably expressed in the outer membrane.
- the polynucleotide sequences of claims 1 to 13 may be comprised in a plasmid vector or in the bacterial chromosome.
- the polynucleotide sequences of claims 1 to 13, which code for degenerate pertactins are comprised in a mammalian expression vector.
- Said expression vector which contains the polynucleotide sequences of claims 1 to 13, is the basis of a nucleic acid vaccine, also object of the present invention.
- the polypeptide sequences encoded by the polynucleotide sequences of claims 1 to 13 can be used in a method for the detection of infection by Bordetella.
- the object of this invention is also a diagnostic kit for the detection of the presence or absence of antibodies against Bordetella, comprising polypeptide sequences encoded by the polynucleotide sequences of claims 1 to 13.
- FIG. 1 Protection experiment in vaccinated Balb / c mice with different variants of recombinant and engineered pertactins. Strains of B. pertussis Tohama I (Pm1) and clinical isolation CH53 (Pm2) were used for the challenge. The bars represent the average logarithm of reduction of viable cells in the lung, relative to the control group immunized with PBS.
- FIG. 1 Opsonophagocytosis mediated by sera from Balb / c mice vaccinated with the different variants of recombinant and engineered pertactins.
- the graph shows the difference in fluorescence (Phycoerythrin, from English phycoerithrin, abbreviated PE) in arbitrary units (UA) of cells marked with fluorescein isothiocyanate (from English fluorescein isothiocyanate, abbreviated FITC), of two incubation conditions (PE4 ° C - PE37 ° C).
- the prnA1 and prnA2 genes of the ⁇ strains were amplified by Polymerase Chain Reaction (PCR) from genomic DNA using oligonucleotides 1 and 2, previously reported [Hijnen, M., P. G. van Gageldonk, et al. (2005). Protein Expr Purif 41 (1): 106-12].
- the fragments obtained were cloned into the vector pET-28 a (Novagen) using the Nde I and BamH I sites.
- the reverse CPR method previously described by Imai et al. In 1991 [Imai, Y., et al. Nucleic Acids Res, 1991. 19 (10): p. 2785].
- Table 1 shows the oligonucleotides used for the amplification of the different sequences.
- the pair of oligonucleotides 1, 2 was used to linearize the vectors pET28apm1 and pET28aprn2, corresponding to pertactins 1 and 2, respectively.
- DomR1 fragments were obtained by amplifying with oligonucleotides 3 and 4.
- this region was amplified using oligonucleotide sets 3.5 and 3.6, to add sequences encoding the short and long connectors, respectively.
- Table 2 summarizes the conditions used in the PCR amplification of the different fragments used in the invention.
- the bacterial cream corresponding to each variant was resuspended in rupture buffer (at a concentration of 100 mg / ml cells) and the cells were broken by ultrasound.
- the cell precipitate was solubilized in 8M urea and fractionated by polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of sodium dodecyl sulfate (Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamid ⁇ GeI Electrophoresis, abbreviated SDS-PAGE) (12.5%).
- the gel was stained by Imidazol-Zinc reverse staining, and the band corresponding to the protein of interest was passed through a 100 ⁇ M steel membrane, in the presence of extraction buffer.
- the extracted protein was renatured and concentrated by Ultrafiltration, using an Amicon concentration cell, with a 50 kDa membrane, and the concentration was determined by the bicinconinic acid method. No contaminants were detected, by testing 15 ⁇ g of the purified proteins in analytical gels of SDS-PAGE stained with Coomassie blue, evidencing that the preparations contained a purity greater than 95% or more.
- Table 3 The characteristics of the different constructions and engineering Pm obtained are summarized in Table 3.
- DC Short Connector
- CL Connect Long
- mice were immunized with 0.2 ⁇ g, 0.02 ⁇ g, or in the absence (PBS), of the recombinant proteins Prn1, Pm2, an equimolar mixture of Prn1 and Pm2 (Prn1 + Pm2), and of the 6 variants of the engineered Pm (shown in Table 3) formulated in aluminum hydroxide.
- the doses correspond to 1/40 and 1/400 of the dose used in humans (Infanrix®, 8 ⁇ g).
- the immunization route used was subcutaneous, using a volume of 100 ⁇ l.
- Sera from immunized mice were evaluated by an ELISA immunoenzymatic assay.
- Antibody titers reached mean values between 1.2x10 3 and 4.6x10 4 .
- the means of the titers corresponding to the higher dose differed significantly from the titers achieved with the lowest dose used (p ⁇ 0.05, Kruskal Wallis-Dunns). No differences were observed for the antibody response generated with pertactins 1 and 2, and the equimolar mixture Pm1 + Prn2. Similarly, no differences were observed between the average of the titles for the different engineering variants. Surprisingly, the titles of the engineered variants were significantly higher than the non-engineered recombinant pertactins (p ⁇ 0.01, Kruskal Wallis-Dunns). For the intranasal challenge, the Tohama I strain (Pm1) and the clinical isolation CH53 (Pm2) were used.
- the bacteria were grown in Bordet-Gengou Agar (Sigma) medium plates supplemented with 1% glycerol and 14% defibrinated sheep blood. The plates were incubated for 24h (at 37 ° C) and the colonies were resuspended in Stainer-Shoulte medium at a density of 10 8 cells / ml. This suspension was used for the intranasal challenge.
- the immunized mice were challenged 15 days after the last immunization, by instilling 50 ⁇ l (5 x 10 6 cells) of the bacterial suspension. Five days after the challenge, the mice were sacrificed and the lungs removed aseptically, and homogenized to measure the bacterial load [Denoel, P., et al.
- Opsonophagocytic activity mediated by anti-Prn antibodies has been shown to be a crucial parameter in the response of vaccinated with acellular vaccines [Hellwig, SM, et al. J Infected Dis, 2003. 188 (5): p. 738-42].
- Opsonophagocytic activity was studied by means of the aforementioned procedure adapted to the mouse model.
- the Tohama I and CH53 strains of B. pertussis were grown in Bordet-Gengou-Agar medium and labeled (2 x 10 6 colony forming units) with FITC.
- the labeled bacteria were opzoned with sera from mice immunized with the recombinant proteins Prn1, Prn2, Prn1 + Pm2 and with two variants of the engineering Prn (Prn2-CC-Prn1 and Pm2-CL-Pm1, for 30 min at 37 0 C, on plate shaker
- the opsonized bacteria and the non-opsonized control were incubated with the polymorphonuclear cells (PMN)
- the samples were divided and incubated for another 45 min, at 4 0 C or 37 0 C.
- the samples were incubated another 30 min at 4 0 C. with the goat anti-mouse-PE conjugate.
- the prnA1, prnA2 and Prn2CCPrn1 and Prn2CLPrn1 gene variants were amplified by PCR from their respective expression vectors (See Table 3), and using oligonucleotides 1 and 2, previously reported [Hijnen, M., PG van Gageldonk , et al. (2005). Protein Expr Purif 41 (1): 106-12], with a modification in oligonucleotide 1, where the Nde I site of oligonucleotide 1 is replaced by the BamH I site.
- the fragments obtained were cloned into the pAEC-SPE3 vector using the BamH I site [Herrera AM, Rodr ⁇ guez EG, et al.
- This vector is designed for extracellular expression of antigens in mammalian cells.
- the vectors were purified using the commercial case (Qiagen®) for plasmid purification.
- Groups of female Balb / c mice (6-7 weeks) were immunized three times with 100 ⁇ g of DNA, intramuscularly, at a concentration of 1 ⁇ g / ⁇ L, in PBS, at three-week intervals.
- the control group was immunized in the same way, using plasmid without insert (pAEC-SPE3). Fifteen days after the last inoculation the mice were sacrificed, and the blood was collected for the evaluation of the sera.
- the specific IgG present in the sera was evaluated, by means of the ELISA technique, using a 1/1000 dilution and coating with equimolar amounts of the Pm1 (2 ⁇ g / mL) and Prn2CCPrn1 (2.4 ⁇ g / mL) proteins.
- animals immunized with the different plasmids expressing Pm1, Pm2, Pm2CCPm1 and Prn2CLPm1 generated a specific immune response (IgG), and significantly higher (p ⁇ 0.001), compared to animals immunized with pAEC-SPE3 (vector without insert).
- the sera generated in the immunized mice recognized to a greater extent (p ⁇ 0.05) the engineering variant Pm2CCPm1 than the natural protein Pm1, which could due to a better exposure of the epitopes shared in Prn2CCPm1 with respect to Pm1.
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Abstract
La presente invención se enmarca en el campo de la biomedicina, y comprende la ingenierización de la proteína pertactina (Prn) para su obtención y uso en vacunas bacterianas, más particularmente en vacunas acelulares contra Bordetella pertussis. Las pertactinas ingenierizadas abarcan en su estructura el polimorfismo de diferentes cepas, y al ensayarse como vacunas inducen una respuesta de anticuerpos de mayor capacidad protectora y de mayor actividad opsonofagocítica. Las variantes ingenierizadas de pertactina de esta invención son aplicables en la medicina humana y veterinaria.
Description
VARIANTES INGENIERIZADAS DE PERTACTINA PARA USO VACUNAL.
Campo de Ia técnica
La presente invención se enmarca en el campo de Ia biomediciπa, específicamente en Ia ingenierización de Ia proteína pertactina (Pm) para su uso en vacunas acelulares contra Bordetella pertussis. Las pertactinas ¡ngenierizadas abarcan en su estructura el polimorfismo de diferentes cepas y al ensayarse como vacunas inducen una respuesta de anticuerpos de mayor capacidad protectora y de mayor actividad opsonofagocítica.
Estado de Ia técnica anterior
La Tos Ferina, Coqueluche o Pertussis es una enfermedad respiratoria aguda, altamente infecciosa, causada por Ia bacteria Bordetella pertussis, microorganismo aislado por primera vez en 1906 por Bordet y Gengou [Bordet, J. and O. Gengou. Ann Inst Pasteur (París), 1906. 20: p. 731-41]. Recientemente se estimó que Ia morbilidad anual de infectados en el mundo es de 48.5 millones. En los niños menores de 6 meses Ia enfermedad es particularmente severa, asociándose a este subgrupo poblacional el 90% del total de fallecidos (300-400 mil) [Crowcroft, N. S., et al. Lancet Infect Dis, 2003. 3(7): p. 413-8]. Existen varios tipos de vacunas contra B. pertussis, comprendidas en dos grandes grupos: las vacunas celulares y las más recientes, de tipo acelular. Por efecto de Ia vacunación se ha producido un descenso dramático en Ia incidencia de enfermedad, y también se ha producido un desplazamiento en Ia incidencia de los casos, trasladándose de niños hacia adolescentes y adultos. Numerosos estudios demuestran que los adolescentes son el reservorio fundamental de B. pertussis, y que estos constituyen Ia fuente fundamental de contagio para los niños parcialmente protegidos. Por tanto, Ia Tos Ferina es aún un problema no resuelto, por Io que es necesario el desarrollo de nuevas vacunas para un mejor control de Ia epidemia, los brotes reemergentes y Ia posible erradicación de esta enfermedad en las regiones de endemismo [Cherry, J. D. Pediatrics, 2005. 115(5): p. 1422-7; Singh, M. and K. Lingappan, Chest, 2006. 130(5): p. 1547-53].
El género Bordetella comprende nueve especies, de las cuales cuatro se han asociado a infecciones en mamíferos, a saber B. holmesii, B. bronchiseptica, B. parapertussis y B. pertussis, las dos últimas constituyen los actores fundamentales
de las infecciones en humanos [Mattoo, S., et al. Front Biosci, 2001. 6: p. E168-86]. La mayor parte de los factores de virulencia están regulados a nivel transcripcional por un sistema de dos componentes denominado BvgA/S (Bordetella virulence genes Activator/Sensor) [Stibitz, S., et al. Nature, 1989. 338(6212): p. 266-9]. Dentro de los principales se encuentran las toxinas de Pertussis (del inglés pertussis toxin, abreviado PT), Factor de Colonización de Ia Traquea, Adenilato Ciclasa; y las adhesinas Fitohemaglutinina filamentosa (FHA), Fimbria (Fim) y Ia pertactina (Pm), proteína en Ia cual se centra Ia presente invención. La Pm es una proteína de membrana externa, que pertenece a Ia familia de autotransportadores tipo V. Se caracteriza por catalizar su propio transporte a través de Ia membrana externa. [Henderson, I.R.Trends Microbiol, 2000. 8(12): p. 534-5]. La Pm madura es una proteína de 68-kDa, 69-kDa y 70-kDa en B. bronchiseptica [Henderson, I. R. Infecí Immun, 2001. 69(3): p. 1231-43.], B. pertussis[Char\es, LG. , et al. Proc Nati Acad Sci U S A, 1989. 86(10): p. 3554-8.], y B. parapertussis [Li, LJ. , et al. Mol Microbiol, 1991. 5(2): p. 409-17], respectivamente. La estructura consiste en 16 hebras paralelas en hélice β y una sección transversal en forma de V [Emsley, P., et al. Nature, 1996. 381(6577): p. 90-2.]. A partir de este núcleo helicoidal se proyectan numerosos lazos. Uno de estos presenta el tri píete Arg-Gly-Asp (RGD), motivo asociado con Ia adherencia a tejidos [Leininger, E., et al. Infecí Immun, 1992. 60(6): p. 2380-5; Emsley, P., et al. Nature, 1996. 381(6577): p. 90-2.]
La presencia del motivo RGD y numerosas regiones ricas en prolina se relaciona a su función en Ia adhesión. Experimentalmente se ha observado que es capaz de mediar Ia adhesión a células del epitelio respiratorio [Everest, P., et al. Microbiology, 1996. 142 ( Pt 11): p. 3261-8]. No obstante, ensayos de inhibición de Ia adhesión de B. pertussis a Ia línea celular A549 (epitelio alveolar humano) por sueros humanos no evidencian, bajo las condiciones estudiadas, que sea un elemento crucial en Ia misma [Rodríguez, M. E., et al. FEMS Immunol Med Microbiol, 2006. 46(1 ): p. 39- 47.]. La proíeína Pm esíá presente en las vacunas acelulares de tres o más componentes. Las vacunas acelulares pueden estar compuestas por: 1 ) un componente de Toxina de Pertussis (PT), 2) dos componentes: PT y Fitohemaglutinina filamentosa (FHA), 3) tres componentes: PT, FHA y Prn, y 4) cinco componentes, que incluye los tres componentes anteriores y Fimbria 2 (FIM2) y Fimbria 3 (FIM3). En humanos, los niveles de anticuerpos anti-Pm, anti-FIM2 y
anti-PT correlacionan con niveles de protección contra Ia enfermedad [Cherry, J. D., et al. Vaccine, 1998. 16(20): p. 1901-6; Storsaeter, J., et al.Vaccine, 2003. 21(25- 26): p. 3542-9.
La inmunización activa con Pm de S. pertussis y B. bronchisepetica genera una respuesta de anticuerpos específicos contra Prn que confiere protección en diferentes modelos animales [ Charles, I. G., et al.Eur J Immunol, 1991. 21(5): p. 1147-53; Roberts, M., et al. Vaccine, 1992. 10(1 ): p. 43-8.]. De igual forma, Ia administración pasiva de anticuerpos monoclonales (AcMs) anti-Prn protege a ratones en el modelo de reto respiratorio [ King, AJ., et al. Microbiology, 2001. 147(Pt 11 ): p. 2885-95.]. La adición de Pm a vacunas conteniendo PT y FHA incrementa los niveles de protección en ratones (modelo intranasal-reto respiratorio) [Guiso, N., et al. Vaccine, 1999. 17(19): p. 2366-76]. Recientemente se observó que Pm es el único componente de las vacunas acelulares que genera un nivel de respuesta de anticuerpos que correlaciona con Ia actividad opsonofagocítica [Hellwig, S. M., et al. J Infect Dis, 2003. 188(5): p. 738-42].
A pesar de Ia existencia de vacunas eficaces, así como de programas de vacunación bien establecidos, Ia Tos Ferina permanece endémica en regiones de América, Europa y Asia, siendo considerada como una enfermedad re-emergente [Raguckas, S. E., et al. Pharmacotherapy, 2007. 27(1 ): p. 41-52]. Una de las hipótesis planteadas, para explicar este fenómeno, es Ia pérdida de eficacia de las vacunas por Ia aparición de cepas resistentes [Mooi, F.R et al. Emerg Infect Dis, 2001. 7(3 Suppl): p. 526-8]. La Prn es una de las proteínas de mayor polimorfismo en B. pertussis. Cuenta con dos regiones variables designadas como región 1 (R1 ) y región 2 (R2), donde se observan secuencias repetidas de aminoácidos ricas en prolina Gly-Gly-X-X-Pro (GGXXP) y Pro-GIn-Pro (PQP), respectivamente. La región R1 se localiza en un lazo protuberante próximo al extremo amino terminal (N-term) y adyacente al motivo RGD, Ia región R2 se ubica hacia el extremo carboxilo terminal (C-term) [Hijnen, M., et al. Infect Immun, 2004. 72(7): p. 3716-23.]. Un total de 12 variantes de Prn (Prn1 , Prn2, Prn3...Pm12) se han identificado, para B. pertussis, hasta la fecha en Ia Base de datos del Nacional Center for Biotechnoloy Information. Las cepas que portan Pm 1 , Prn2 y Prn3 son las de mayor circulación mundial. Numerosos estudios de caracterización de aislamientos, tanto retrospectivos como circulantes, en diversas regiones de América, Europa, Asia y Australia, muestran una tendencia a un desplazamiento gradual de las cepas Pm1 por Prn2,
predominando en Ia mayoría de los países las cepas Pm2 [Mooi, F. R., et al. Infect Immun, 1998. 66(2): p. 670-5; Cassiday, P et al. J Infect Dis, 2000. 182(5): p. 1402- 8; Weber, C. et al. J Clin Microbiol, 2001. 39(12): p. 4396-403; Hallander, H. O., et al. J Clin Microbiol, 2005. 43(6): p. 2856-65; van Amersfoorth, S.C., et al. J Clin Microbiol, 2005. 43(6): p. 2837-43; Byrne, S, et al. BMC Infect Dis, 2006. 6: p. 53]. La hipótesis sobre Ia pérdida de Ia eficacia de las vacunas actuales, por Ia aparición de nuevas cepas, tiene a su favor que las secuencias aminoacídicas de Pm en las vacunas celulares (DTPc) y acelulares (DTPa) difieren de las de las cepas circulantes. Estudios de vacunados y no vacunados con DTPc y DTPa, realizados en Holanda e Italia, indican que este tipo de vacuna protege mejor contra cepas circulantes de iguales características [Mooi, F. R., et al. Infect Immun, 1998. 66(2): p. 670-5; Mastrantonio, P., et al. Microbiology, 1999. 145 ( Pt 8): p. 2069-75]. En línea con estos hallazgos, el modelo de ratón muestra que Ia vacunación con DTPc protege diferencialmente a cepas que portan Prn1 y Prn2, indicando que las variaciones en Ia región R1 de Pm pueden conferir grados de resistencia [King, AJ., et al. Microbiology, 2001. 147(Pt 11 ): p. 2885-95]. Sin embargo, estudios de mayor envergadura al estratificar las cepas de B. pertussis atendiendo a: país de origen, estatus de vacunación y tipo de vacuna (DTPc y DTPa), no revelan diferencias significativas en las frecuencias del alelo prn, ptxC, ptxA, tcfA2 para las cepas circulantes y los programas de inmunización [van Amersfoorth, S. C, et al. J Clin Microbiol, 2005. 43(6): p. 2837-43].
Si bien estos hallazgos difícilmente justifican que sea Ia vacunación quien haya originado las nuevas variantes, Ia elevada prevalencia de cepas Prn2 en muchos países es indicativa de que Ia transmisión de las cepas Prn2 está siendo favorecida de algún modo. Por una parte, es llamativo el hecho de que en ese estudio [van Amersfoorth, S. C, et al. J Clin Microbiol, 2005. 43(6): p. 2837-43] las tres cepas clínicas aisladas con alelos similares a los de las vacunas empleadas solo se encontraron en niños no vacunados. De no ser un evento casual, sugiere que las cepas Prn1 son favorecidas en nichos sin inmunidad específica. Por otra parte, Ia identificación reciente de un fago que infecta Bordetella (BPP-1 ), a través de Prn como receptor primario, hace pensar que las variaciones en esta proteína se generan por presiones selectivas diferentes a las del sistema inmune [Liu, M., et al. Science, 2002. 295(5562): p. 2091-4]. No se excluye Ia posibilidad de que ambos
fenómenos, junto a otros desconocidos, se armonicen para guiar las variaciones en las poblaciones de B. períussis.
La posible evolución de Ia epidemiología de Pertussis se ha simulado mediante un modelo matemático que integra de manera independiente Ia incidencia de Ia enfermedad y Ia transmisión del patógeno [Aguas, R., et al. Lancet Infect Dis, 2006. 6(2): p. 112-7]. Este modelo predice que dosis regulares de refuerzo no serán capaces de eliminar los grados de severidad de Ia enfermedad observados en Ia epidemia actual. Es muy probable que esto se deba a Ia corta duración de Ia protección conferida (4-12 años) por las vacunas acelulares disponibles, así como a Ia variabilidad de Ia inmunidad generada y Ia diversidad de las vacunas. El modelo prevé que el escenario más optimista sería contar con vacunas que generen una inmunidad superior a Ia natural, paradigma que emplaza las vacunas celulares y acelulares actuales. La presente invención tiene como objetivo principal contribuir al desarrollo de vacunas acelulares más eficaces contra Ia Tos Ferina. Los trabajos principales que preceden Ia presente invención, con vistas a encontrar vacunas más efectivas, se basan en Ia obtención de preparaciones inmunogénicas aplicando mezclas de Pm (Nicole Guiso et al., WO 01/90143 A2 y US 2006/0008474 A1 ) o de péptidos sintéticos de Ia región R1 de Prn (Frederik Mooi et al., WO 02/00695 A2). Por Io tanto, un importante problema de Ia prevención de Ia Tos Ferina es lograr el desarrollo de vacunas acelulares más eficaces.
Explicación de Ia invención
Esta invención contribuye a resolver el problema antes mencionado, y se enmarca en Ia ingenierización del gen prnA, codificante para Ia proteína de membrana externa de β. pertussis denominada Pertactina (Pm). La invención cubre las necesidades evidenciadas en el estado del arte, posibilitando Ia obtención de diferentes variantes de pertactinas ingenierizadas, de modo tal que en una única molécula se comprendan dos dominios polimórficos diferentes de Ia región R1 de Pm. La versatilidad de Ia invención prevé Ia ingenierización de nuevas Pm, comprendiendo adicionalmente tres o más dominios polimórficos diferentes de Ia región R1.
Es objeto dθ Ia presente invención una secuencia polinucleotídica que codifica para una proteína pertactina ingenierizada, que comprende hasta los primeros 300
aminoácidos próximos ai extremo N-terminal de un tipo dado de pertactina natura! madura (PmX300) y una secuencia aminoacídica que comprende hasta los últimos 620 aminoácidos próximos ai extremo C-terminal de un tipo dado de pertactina natural madura (PmY620), Io que resulta en una pertactina ingenierizada PrnX300- PrnY620.
En el contexto de Ia presente invención, el término "pertactina ingenierizada" se refiere a una proteína que resulta de acoplar, adyacentemente o no, un fragmento comprendiendo hasta los primeros 300 aminoácidos próximos al extremo N-terminal de una molécula de pertactina natural madura a otro fragmento conteniendo hasta los últimos 620 aminoácidos próximos al extremo C- Terminal de una molécula de pertactina natural madura.
Las nuevas variantes de pertactinas ingenierizadas se obtienen mediante mutagénesis molecular, al acoplar adyacentemente secuencias que comprenden hasta los 300 aminoácidos próximos al extremo N-terminal de un tipo dado de pertactina natural madura, a secuencias que comprenden hasta los últimos 620 aminoácidos cercanos al extremo C-terminal de un tipo dado de pertactina natural madura. La nueva Pm ¡ngenierizada comprende secuencias de diferentes tipos de Pm en una única molécula, sin afectarse Ia respuesta inmune protectora. En una realización preferida de Ia presente invención se obtienen diferentes variantes de Pm ingenierizadas codificadas por las secuencias de ácidos nucleicos identificadas como SEQ ID No 1- SEQ ID No 6. Al inmunizarse ratones con las diferentes variantes se alcanzan niveles de protección y de actividad opsonofagocitica significativamente superiores a los que se alcanzan con Pm naturales, formuladas independientes o en mezclas. La respuesta inmune generada con las Pm ingenierizadas fue igualmente efectiva contra cepas que expresan diferentes tipos de Pm.
En una realización de Ia invención, el fragmento de los primeros 300 aminoácidos próximos al extremo N-terminal de un tipo dado de pertactina natural madura (PrnX300) corresponden a pertactinas del género Bordetella. En una realización preferida, este fragmento corresponde a pertactinas de B. pertussis o B. parapertussis, preferentemente a las variantes Pm1 , Pm2 y Prn3 de B. pertussis. En una realización de Ia invención, los últimos 620 aminoácidos próximos al extremo C-terminal de un tipo dado de pertactina natura! madura (PmY620) corresponden a pertactinas del género Bordetella. En una realización particular de Ia invención, el
fragmento PmY620 corresponde a pertactinas de fí. pertussis y S. parapertussis, preferentemente a las variantes Prn1 , Pm2 y Prn3 de β. pertussis. La secuencia polinucleotídica de Ia presente invención, codifica para una cadena polipeptídica que comprende cualquier combinación posible de tipos dados de pertactinas en el formato PrnX300-PrnY62Q.
En Ia secuencia polinucleotídica de Ia presente invención las secuencias aminoacídicas PrnX300 y PrnY620 se acoplan adyacentemente, o mediante el uso de las secuencias IDNATWVMTDN o IDNATWVMTDNIDNATWVMTDN. En Ia presente invención, las secuencias aminoacídicas PrnX300 y PmY620 pueden estar desprovistas de secuencias repetidas, preferiblemente las secuencias GGXXP y PQP de las regiones R1 y R2. Las evidencias que soportan este rasgo son las siguientes: La región 1 , que comprende las secuencias repetida GGXXP es débilmente reconocida por sueros humanos y de conejos, indicando que no es una región inmunodominante [Hijnen, M., F. R. Mooi, et al. (2004). Infect Immun 72(7): 3716-23]. Por otro lado, trabajos recientes refieren mutantes de Prn donde las secuencias repetidas GGXXP y PQP o regiones comprendiendo estas secuencias aparecen delecionadas. Las deleciones GGXXP no afectan las propiedades fisicoquímicas de los mutantes obtenidos, evidenciándose en Ia utilización de condiciones idénticas en los métodos de expresión y purificación para las Pm mutantes y para las Pm no mutadas [Hijnen, M., P. G. van Gageldonk, et al. (2005). Protein Expr Purif 41(1 ): 106-12]. De igual forma, las deleciones GGXXP no afectan significativamente las propiedades estructurales, ya que Prn mutadas en Ia región 1 son reconocidas por anticuerpos monoclonales (AcM) conformacionales generados contra pertactinas naturales, y no por los AcM secuenciales anti-GGXXP. Adicionalmente, se ha observado que determinadas mutaciones en las región 1 pueden aumentar Ia capacidad de unión de determinados AcM conformacionales. Finalmente existen evidencias que indican que Ia región 1 (GGXXP) y Ia región 2 (PQP) forman un epitopo único [Hijnen, M., R. de Voer, et al. (2007). Vaccine 25(31 ): 5902-14]. Es también objeto de Ia presente invención una secuencia polinucleotídica que codifique para una pertactina ingenierizada, donde las secuencias aminoacídicas PmX300 y PmY620 comprendan péptidos que funcionan como epitopos T cooperadores, preferiblemente epitopos de Difteria, Tétano, HBV, Poliovirus, Vaccina, HIV e Influenza. Es conocido por las personas versadas en este campo de
Ia técnica que Ia inserción de este tipo de epitopos conduce a un aumento de Ia respuesta inmune generada por las moléculas que los poseen. Son objeto de Ia presente invención, además, secuencias polinucleotídicas de acuerdo a las reivindicación 1 , donde Ia secuencia polinucleotídica se optimice en su uso de codones, para su expresión en bacterias, levaduras, células de insecto o de mamíferos. Esta forma de aumentar Ia expresión de las moléculas que se obtienen por vía recombinante es ampliamente conocida por aquella personas que se desarrollan en este campo de Ia técnica. Atendiendo a que Ia nueva proteína, objeto de Ia presente invención, será uno de los múltiples componentes de una vacuna combinada, se enfatiza que ninguna de las invenciones precedentes contempla Ia obtención del menor número posible de entidades moleculares que satisfagan las necesidades en este campo de Ia técnica. Finalmente, en el estado del arte hay necesidad de contar con preparaciones vacunales que contemplen protección cruzada entre B. pertussis y B. parapertussis. Atendiendo a Ia alta homología entre las pertactinas de las diferentes especies de Bordetella, Ia presente invención incluye Ia generación de pertactinas ingenierizadas que contemplen en una única molécula diferentes regiones polimórficas provenientes de especies diferentes del género Bordetella. Inesperadamente, Ia pertactina ingenierizada objeto de Ia presente invención, no solo fue capaz de generar una respuesta efectiva contra diferentes cepas de B. pertussis, que expresan Prn1 y Prn2, sino que indujo una respuesta de anticuerpos de mayor efectividad respecto a las proteínas naturales, evidenciado en el modelo de reto respiratorio y en el ensayo de opsonofagocitosis. Sorprendentemente, Ia respuesta inducida por Ia pertactina ingenierizada fue, además, superior a Ia de una mezcla equimolar compuesta por Pm 1 y Prn2 (Pm1 +Prn2).
Las composiciones vacunales a base de mezclas de diferentes pertactinas de una especie o de diferentes especies, aunque cubren el polimorfismo, acarrean dificultades tecnológicas asociadas a los procesos productivos, como el incremento ¡ndeseado en Ia concentración de contaminantes e inconsistencia en Ia producción de los lotes, entre otros. Este es un aspecto de vital importancia para el desarrollo de vacunas combinadas, donde intervienen múltiples antígenos de diferentes características, que puede comprometer Ia inmunogenicidad sistémica de Ia formulación. Por otro lado, es de esperar que con las estrategias basadas en péptidos sintéticos de Ia región R1 se obtengan vacunas menos efectivas que las
actuales, al excluirse de Ia respuesta protectora otros epitopos de relevancia presentes en Ia Pm natural.
Para solucionar ese problema de este campo de Ia técnica, Ia presente invención provee de una composición farmacéutica que comprende una o más pertactinas ingenierizadas, codificadas por las secuencias polinucleotídicas de las reivindicaciones 1 a Ia 13, que en cantidades suficientes generan una respuesta inmune humoral y celular efectiva contra especies del género Bordetella, mediante un procedimiento de inmunización en mamíferos, preferiblemente en humanos. En una realización de Ia invención, Ia composición farmacéutica comprende una o más pertactinas ingenierizadas genera una respuesta inmune humoral y celular efectiva contra B. pertussis.
Es también objeto de Ia presente invención una vacuna viva o atenuada que comprende una o más pertactinas ingenierizadas, codificadas por las secuencias polinucleotídicas de las reivindicaciones 1 a Ia 13, donde Ia pertactina ingenierizada se exprese preferiblemente en Ia membrana extema. En dicha vacuna viva o atenuada las secuencias polinucleotídicas de las reivindicaciones 1 a Ia 13 pueden estar comprendidas en un vector plasmídico o en el cromosoma bacteriano. En otra realización de Ia invención, las secuencias polinucleotídicas de las reivindicaciones 1 a Ia 13, que codifican para pertactinas ¡ngenierizadas, están comprendidas en un vector de expresión en mamíferos. Dicho vector de expresión, que contiene las secuencias polinucleotídicas de las reivindicaciones 1 a Ia 13, es Ia base de una vacuna de ácidos nucleicos, también objeto de Ia presente invención. En una materialización de Ia invención, las secuencias polipeptídicas codificadas por las secuencias polinucleotídicas de las reivindicaciones 1 a Ia 13, pueden ser empleadas en un procedimiento para Ia detección de infección por Bordetella. Es también objeto de esta invención un estuche diagnóstico para Ia detección de presencia o ausencia de anticuerpos contra Bordetella, que comprenda secuencias polipeptídicas codificadas por las secuencias polinucleotídicas de las reivindicaciones 1 a Ia 13.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Experimento de protección en ratones Balb/c vacunados con diferentes variantes de pertactinas recombinantes e ingenierizadas. Las cepas de B. pertussis Tohama I (Pm1 ) y el aislamiento clínico CH53 (Pm2) se usaron para el reto. Las
barras representan el promedio del logaritmo de reducción de células viables en el pulmón, respecto al grupo control inmunizado con PBS.
Figura 2. Opsonofagocitosis mediada por sueros de ratones Balb/c vacunados con las diferentes variantes de pertactinas recombinantes e ingenierizadas. El gráfico muestra Ia diferencia de fluorescencia (Ficoeritrina, del inglés phycoerithrin, abreviado PE) en unidades arbitrarias (UA) de las células marcadas con isotiocianato de fluoresceína (del inglés fluorescein isothiocyanate, abreviado FITC), de dos condiciones de incubación (PE4°C - PE37°C).
Figura 3. Respuesta inmune humoral (IgG) contra Prn1 y Pm2CCPrn1 generada en ratones inmunizados con plasmidios que expresan Prn1 , Pm2, Pm2CCPm1 y
Pm2CLPrn1.
Exposición detallada de modos de realización / Ejemplos de realización Ejemplo 1. Construcción de vectores para Ia expresión intracelular en Escheríchia cotí de las variantes de pertactinas ingenierizadas. Purificación.
Los genes prnA1 y prnA2 de las cepas de β. pertussis Tohoma I (Pm1 ) y CH53 (Pm2) se amplificaron mediante Reacción en Cadena de Ia Polimerasa (RCP) a partir de ADN genómico utilizando los oligonucleótidos 1 y 2, previamente reportados [Hijnen, M., P. G. van Gageldonk, et al. (2005). Protein Expr Purif 41 (1 ): 106-12].
Los fragmentos obtenidos, se clonaron en el vector pET-28a (Novagen) usando los sitios Nde I y BamH I. Para Ia obtención de Pm ingenierizadas se utilizó el método de RCP inversa, descrito previamente por Imai y colaboradores en 1991 [Imai, Y., et al. Nucleic Acids Res, 1991. 19(10): p. 2785]. En Ia Tabla 1 se muestran los oligonucleótidos utilizados para Ia amplificación de las diferentes secuencias. El par de oligonucleótidos 1 , 2 se utilizó para linearizar los vectores pET28apm1 y pET28aprn2, correspondiente a las pertactinas 1 y 2, respectivamente. Los fragmentos DomR1 se obtuvieron al amplificar con los oligonucleótidos 3 y 4. Adicionalmente, esta región se amplificó usando los juegos de oligonucleótidos 3,5 y 3,6, para añadir secuencias que codifican para los conectores corto y largo, respectivamente. La Tabla 2 resume las condiciones usadas en Ia amplificación por RCP de los diferentes fragmentos usados en Ia invención.
Tabla 1. Oligonucleótidos utilizados para Ia amplificación de las diferentes secuencias.
Tabla 2. Condiciones para Ia amplificación por RCP de los diferentes fragmentos usados en la invención.
Los vectores pET28aprn1 y pET28apm2 lineales, obtenidos por RCP inversa, se ligaron a los diferentes fragmentos codificantes para los dominios que contienen Ia región 1 de las Pm 1 y Prn 2. En estos vectores los nuevos genes ¡ngenieπ'zados quedan bajo el control transcripcional del protomor inducible T7. Los clones con Ia secuencia correcta se introdujeron en Ia cepa BL21-Codonplus(DE3)-RP de E. coli, para su expresión como cuerpos de inclusión [Hijnen, M., et al. Protein Expr Purif, 2005. 41(1): p. 106-12].
Los niveles de expresión de las pertactinas recombinantes 1 y 2, así como de las diferentes variantes se obtuvieron entre 15-20% para todos los casos, evidenciado por densitometría en geles de poliacrilamida teñidos con azul de Comassie.
Para Ia purificación de las proteínas, Ia crema bacteriana correspondiente a cada variante se resuspendió en tampón de ruptura (a una concentración de células de 100 mg/ml) y las células se rompieron por ultrasonido. El precipitado celular se solubilízó en urea 8M y se fraccionó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecilo sulfato de sodio (del inglés Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamidθ GeI Electrophoresis, abreviado SDS-PAGE) (12.5 %). El gel se tiñó mediante tinción inversa Imidazol-Zinc, y Ia banda correspondiente a Ia proteína de interés se pasó a través de una membrana de acero de 100μM, en presencia de tampón de extracción. Posteriormente, Ia proteína extraída se renaturalizó y se concentró por Ultrafiltración, usando una celda de concentración Amicon, con membrana de 50 kDa, y Ia concentración se determinó por el método del Acido bicinconinico. No se detectaron contaminantes, al ensayar 15 μg de las proteínas purificadas en geles analíticos de SDS-PAGE teñidos con azul de Coomassie, evidenciando que las preparaciones contenían una pureza superior al 95% o más. Las características de las diferentes construcciones y Pm ingenierizadas obtenidas se resumen en Ia Tabla 3.
Tabla 3. Características de las diferentes construcciones y Pm ingenierizadas.
Los ratones se inmunizaron con 0.2 μg, 0.02 μg, o en ausencia (PBS), de las proteínas recombinantes Prn1 , Pm2, una mezcla equimolar de Prn1 y Pm2 (Prn1 +Pm2), y de las 6 variantes de las Pm ingenierizadas (mostradas en Ia Tabla 3) formuladas en hidróxido de aluminio. Las dosis se corresponden a 1/40 y 1/400 de Ia dosis empleada en humanos (Infanrix®, 8 μg). La ruta de inmunización empleada fue Ia subcutánea, empleando un volumen de 100 μl. Los sueros de los ratones inmunizados se evaluaron mediante un ensayo inmunoenzimático tipo ELISA. Los títulos de anticuerpos alcanzaron valores medios entre 1.2x103 y 4.6x104. En todos los casos las medias de los títulos correspondientes a Ia dosis mayor difirieron significativamente de los títulos alcanzados con Ia menor dosis usada (p<0.05, Kruskal Wallis-Dunns). No se observaron diferencias para Ia respuesta de anticuerpos generada con las pertactinas 1 y 2, y Ia mezcla equimolar Pm1+Prn2. De igual forma, no se observaron diferencias entre Ia media de los títulos para las distintas variantes ingenierizadas. Sorprendentemente, los títulos de las variantes ingenierizadas fueron significativamente superiores respecto a las pertactinas recombinantes no ingenierizada (p<0.01 , Kruskal Wallis-Dunns). Para el reto intranasal se utilizaron Ia cepa Tohama I (Pm1 ) y el aislamiento clínico CH53 (Pm2). Las bacterias se cultivaron en placas de medio Bordet-Gengou Agar (Sigma) suplementadas con 1 % de glicerol y 14% de sangre de carnero desfibrinada. Las placas se incubaron por 24h (a 37°C) y las colonias se resuspendieron en medio Stainer-Shoulte a una densidad de 108 células/ml. Esta suspensión se utilizó para el reto intranasal. Los ratones inmunizados se retaron 15 días después de Ia última inmunización, mediante Ia instilación de 50 μl (5 x 106 células) de Ia suspensión bacteriana. Cinco días después del reto, los ratones se sacrificaron y los pulmones se extrajeron asépticamente, y se homogenizaron para medir Ia carga bacteriana [Denoel, P., et al. Vaccine, 2005. 23(46-47): p. 5333-41]. Las diferentes variantes mostraron niveles de protección significativamente superiores a los controles no vacunados (p<0.001 ). Inesperadamente, las variantes ingenierizadas mostraron niveles de protección superiores respecto a las pertactinas recombinantes y a Ia mezcla equimolar Prn1 +Prn2 para ambas cepas (pθ.001 ). En Ia menor dosis estudiada pudo observarse que las variantes ingenierizadas
protegieron igualmente contra ambas cepas, no así para las pertactinas 1 y 2. Los resultados evidencian que estas variantes poseen propiedades inmunológicas diferentes, y superiores, a las pertactinas recombinante 1 y 2 ensayadas por separado o en forma de mezclas equimolares (Figura 1 ). Ejemplo 3. Actividad opsonofagocítica de los sueros.
La actividad opsonofagocítica mediada por anticuerpos anti-Prn ha mostrado ser un parámetro crucial en Ia respuesta de vacunados con vacunas acelulares [Hellwig, S. M., et al. J Infecí Dis, 2003. 188(5): p. 738-42]. En Ia presente invención se muestra como diferentes variantes de pertactina ingenierizadas fueron capaces de inducir anticuerpos con estas características. La actividad opsonofagocítica se estudió mediante el referido procedimiento adaptado al modelo de ratón. Las cepas Tohama I y CH53 de B. pertussis se crecieron en medio Bordet-Gengou-Agar y se marcaron (2 x 106 unidades formadoras de colonias) con FITC. Posteriormente, las bacterias marcadas se opzonizaron con sueros de ratones inmunizados con las proteínas recombinantes Prn1 , Prn2, Prn1 +Pm2 y con dos variantes de las Prn ingenierizadas (Prn2-CC-Prn1 y Pm2-CL-Pm1 , durante 30 min a 37 0C, en agitador de placas. En el paso de adhesión, las bacterias opsonizadas y el control no opsonizado se incubaron con las células polimorfonucleares (PMN). Las muestras se dividieron y se incubaron por otros 45 min, a 4 0C o 37 0C. Finalmente, las muestras se incubaron otros 30 min a 4 0C con el conjugado de cabra anti-ratón-PE. Las muestras se analizaron por citometría de flujo (PARTEC PAS III). La intensidad de verde y rojo de las células mantenidas a 4 0C se utilizó como control de Adhesión. La diferencia de fluorescencia roja en las células fluorescentes verdes se utilizó para evidenciar Ia actividad fagocítica mediada por los diferentes sueros. En Ia Figura 2 se muestra como las variantes ingenierizadas ensayadas mostraron actividad opsonofagocitica. Sorprendentemente, solo hubo diferencias significativas entre los grupos inmunizados con las Prn ingenierizadas y el grupo de ratones inoculados con PBS (p<0.05, Kruskal Wallis-Dunns). La actividad opsonofagocitica de los sueros generados con las pertactinas recombinantes por separado, y sus mezclas, alcanzaron valores 6 veces mayores que el control PBS, aunque estas diferencias no fueron significativas. Finalmente, los resultados evidencian que las variantes ingenierizadas son capaces de inducir anticuerpos con actividad opsonofagocitica significativa, independientemente del tipo de pertactina que porte Ia bacteria.
Ejemplo 4. Construcción de vectores para Ia expresión en mamíferos de variantes de pertactinas ingenierizadas y evaluación de Ia respuesta humoral.
Los genes prnA1, prnA2 y las variantes de genes Prn2CCPrn1 y Prn2CLPrn1 se amplificaron mediante RCP a partir de sus respectivos vectores de expresión (Ver Tabla 3), y usando los oligonucleótidos 1 y 2, previamente reportados [Hijnen, M., P. G. van Gageldonk, et al. (2005). Protein Expr Purif 41 (1 ): 106-12], con una modificación en el oligonucleótido 1 , donde se sustituye el sitio Nde I del oligonucleótido 1 por el sitio BamH I. Los fragmentos obtenidos se clonaron en el vector pAEC-SPE3 usando el sitio BamH I [Herrera AM, Rodríguez EG, et al. (2000) BBRC, 279, 548-551]. Este vector está diseñado para Ia expresión extracelular de antígenos en células de mamíferos. Los vectores fueron purificados usando el estuche comercial (Qiagen®) de purificación de plasmidios. Los grupos de ratones Balb/c hembras (6-7 semanas) se inmunizaron tres veces con 100 μg de ADN, vía intramuscular, a una concentración de 1 μg/μL, en PBS, a intervalos de tres semanas. El grupo control se inmunizó de igual forma, usando el plasmidio sin inserto (pAEC-SPE3). Quince días posteriores a Ia última inoculación los ratones se sacrificaron, y Ia sangre fue colectada para Ia evaluación de los sueros. La IgG específica presente en los sueros se evaluó, mediante Ia técnica de ELISA, usando una dilución 1/1000 y recubriendo con cantidades equimolares de las proteínas Pm1 (2 μg/mL) y Prn2CCPrn1 (2.4 μg/mL). Como se observa en Ia Figura 3, los animales inmunizados con los diferentes plasmidios expresando Pm1 , Pm2, Pm2CCPm1 y Prn2CLPm1 generaron una respuesta inmune específica (IgG), y significativamente superior (p<0.001 ), respecto a los animales inmunizados con pAEC-SPE3 (vector sin inserto). Al igual que los sueros generados en ratones inmunizados con proteína e hidróxido de aluminio (datos no mostrados), los sueros generados en los ratones inmunizados reconocieron en mayor medida (p<0.05) Ia variante ingenierizada Pm2CCPm1 que Ia proteína natural Pm1 , Io cual pudiera deberse a una mejor exposición de los epitopos compartidos en Prn2CCPm1 respecto Pm1.
Claims
1. Secuencia polinucleotídica que codifica para una proteína pertactina ingenierizada que comprende hasta los primeros 300 aminoácidos próximos al extremo N-terminal de un tipo dado de pertactina natural madura (PmX300) y una secuencia aminoacídica que comprende hasta los últimos 620 aminoácidos próximos al extremo C-terminal de un tipo dado de pertactina natural madura (PmY620), Io que resulta en una pertactina
¡ngenierizada PrnX300-PmY620.
2. Secuencia polinucleotídica de acuerdo a Ia reivindicación 1 , en Ia cual PrnX300 corresponde a pertactinas del género Bordetella.
3. Secuencia polinucleotídica de acuerdo a Ia reivindicación 2, en Ia cual PmX3Q0 corresponde a pertactinas de β. pertussis o B. parapertussis.
4. Secuencia polinucleotídica de acuerdo a Ia reivindicación 3, en Ia cual PmX300 corresponde a las variantes Pm 1 , Pm2 y Prn3 de B. pertussis.
5. Secuencia polinucleotídica de acuerdo a Ia reivindicación 1 , en Ia cual PmY620 corresponde a pertactinas del género Bordetella.
6. Secuencia polinucleotídica de acuerdo a Ia reivindicación 5, en Ia cual
PmY620 corresponde a pertactinas de B. pertussis y B. parapertussis.
7. Secuencia polinucleotídica de acuerdo a Ia reivindicación 6, en Ia cual PrnY620 corresponde a las variantes Prn1 , Prn2 y Pm3 de β. pertussis.
8. Secuencia polinucleotídica de acuerdo a Ia reivindicación 1 , que codifica para una cadena polipeptídica que comprende cualquier combinación posible de tipos dados de pertactinas en el formato PmX300-PrnY620.
9. Secuencia polinucleotídica de acuerdo a Ia reivindicación 1 , donde las secuencias aminoacídicas PrnX300 y PrnY620 se acoplan adyacentemente, o mediante el uso de Ia secuencia IDNATWVMTDN o I DNATWVMTDN I DNATWVMTDN.
10. Secuencia polinucleotídica de acuerdo a las reivindicaciones 1-9, donde las secuencias aminoacídicas PrnX300 y PrnY620 están desprovistas de secuencias repetidas, preferiblemente las secuencias GGXXP y PQP de las regiones R1 y R2.
11. Secuencia polinucleotídica de acuerdo a las reivindicaciones 1-10, donde las secuencias aminoacídicas PrnX300 y PmY620 comprenden además péptidos que funcionan como epitopos T cooperadores, preferiblemente epitopos de Difteria, Tétano, HBV, Poliovirus, Vaccinia, VIH o Virus Influenza.
12. Secuencia polinucleotídica de acuerdo a las reivindicación 1 , que comprende las secuencias nucleotídicas identificadas como SEQ ID No. 1- SEQ ID No. 6.
13. Secuencia polinucleotídica de acuerdo a las reivindicación 1 , donde Ia secuencia polinucleotídica se optimiza en su uso de codones para su expresión en bacteria, levadura, células de insecto o de mamíferos.
14. Una composición farmacéutica que comprende una o más pertactinas ingenierizadas, codificadas por las secuencias polinucleotídicas de las reivindicaciones 1 a Ia 13, que en cantidades suficientes generan una respuesta inmune humoral y celular efectiva contra especies del género Bordetella, mediante un procedimiento de inmunización en mamíferos, preferiblemente en humanos.
15. Una composición farmacéutica de acuerdo a las reivindicación 14, que genera una respuesta inmune humoral y celular efectiva contra B. pertussis.
16. Una vacuna viva o atenuada que comprende una o más pertactinas ingenierizadas, codificadas por las secuencias polinucleotídicas de las reivindicaciones 1 a Ia 13, donde Ia pertactina ingenierizada se exprese preferiblemente en Ia membrana externa.
17. Una vacuna viva o atenuada de acuerdo a Ia reivindicación 16 donde las secuencias polinucleotídicas de las reivindicaciones 1 a Ia 13 estén comprendidas en un vector plasmídico o en el cromosoma bacteriano.
18. Un vector de expresión en mamíferos que comprende una o más secuencias polinucleotídicas de las reivindicaciones 1 a Ia 13, que codifican para pertactinas ingenierizadas.
19. Una vacuna de ácidos nucleicos que comprenda un vector de expresión como el de Ia reivindicación 18.
20. Un método para Ia detección de infección por Bordetella, que comprende el uso de secuencias polipeptídicas codificadas por las secuencias polinucleotídicas de las reivindicaciones 1 a Ia 13.
21. Un estuche diagnóstico para Ia detección de presencia o ausencia de anticuerpos contra Bordetella que comprenda secuencias polipeptídicas codificadas por las secuencias polinucleotídicas de las reivindicaciones 1 a Ia 13.
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