CN101878038A - 用于疫苗用途的经改造的百日咳杆菌粘附素变体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医学领域，并且包括改造百日咳杆菌粘附素(Pertactin，Prn)蛋白以获得其，并将其用在菌苗中，更特别地，用在针对百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)的无细胞疫苗中。所述经改造的百日咳杆菌粘附素在其结构中包含不同菌株的多态性，并且当作为疫苗进行检验时，其诱导具有更大的保护能力和更高的调理吞噬的活性的抗体应答。本发明的经改造的百日咳杆菌粘附素变体可应用于人类医学和兽医学。

Description

用于疫苗用途的经改造的百日咳杆菌粘附素变体

技术领域

本发明涉及生物医学领域，尤其是涉及改造百日咳杆菌粘附素(Pertactin，Prn)蛋白以将其用在针对百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)的无细胞疫苗中。所述经改造的百日咳杆菌粘附素在其结构中包含不同菌株的多态性，并且当作为疫苗进行检验时，其诱导具有更大的保护能力和更高的调理吞噬的活性的抗体应答。

发明背景

百日咳是一种高度传染性的急性呼吸系统疾病，其由百日咳博德特氏菌引起，所述百日咳博德特氏菌是由Bordet和Gengou在1906年首次分离出的微生物[Bordet，J和O.Gengou.Ann Inst Pasteur(Paris)，1906.20：p.731-41]。最近，据估计，全世界的感染的年发病率为4850万。该病在小于6个月的儿童中是特别严重的，全部死亡者(300,000-400,000)中的90％与该人口亚群相关[Crowcroft，N.S.等人，Lancet Infect Dis，2003.3(7)：p.413-8]。

存在有各种类型的针对百日咳博德特氏菌的疫苗，它们被分成两个大组：细胞疫苗，和更新近的无细胞类型的疫苗。通过疫苗接种，产生了该病发生率的显著降低，并且还产生了由儿童转向青少年和成人的病例发生率的转移。许多研究表明，青少年是百日咳博德特氏菌的主要贮库，并且是向部分受保护的儿童传染的主要来源。因此，百日咳仍是未解决的问题，对于其来说需要开发新的疫苗以更好地控制疾病流行、再出现的爆发，和可能在地方流行区域根除该疾病[Cherry，J.D.Pediatrics，2005.115(5)：p.1422-7；Singh，M.和K.Lingappan，Chest，2006.130(5)：p.1547-53]。

博德特氏菌属(Bordetella)包括九个种，其中四个种与哺乳动物中的感染相关，即霍氏博德特氏菌(B.holmesii)、支气管炎博德特氏菌(B.bronchiseptica)、副百日咳博德特氏菌(B.parapertussis)和百日咳博德特氏菌(B.pertussis)，后两种是人中的感染的主要参与者(Mattoo，S.等人，Front Biosci，2001.6：p.E168-86)。大部分的毒力因子在转录水平上受到称为BvgA/S(博德特氏菌毒力基因激活物/传感物(Bordetella virulence genes Activator/Sensor))的双组分系统的调控[Stibitz，S.等人，Nature，1989.338(6212)：p.266-9]。其中，最相关的因子是百日咳毒素(PT)，气管定居因子，腺苷酸环化酶；以及丝状植物凝集素(FHA)、菌毛蛋白(Fim)和百日咳杆菌粘附素(Prn)蛋白这些粘附素，本发明集中于百日咳杆菌粘附素蛋白。

Prn是一种外膜蛋白，其属于V型自转运蛋白家族。其特点在于催化自身转运穿过外膜[Henderson，I.R.Trends Microbiol，2000.8(12)：p.534-5]。在支气管炎博德特氏菌[Henderson，I.R.Infect Immun，2001.69(3)：p.1231-43]、百日咳博德特氏菌[Charles，I.G.等人，Proc Natl Acad Sci USA，1989.86(10)：p.3554-8]和副百日咳博德特氏菌[Li，L.J.等人，Mol Microbiol，1991.5(2)：p.409-17]中，成熟的Prn分别为68kDa、69kDa和70kDa的蛋白质。其结构包括形成β螺旋和V型横断面的16条平行链[Emsley，P.等人，Nature，1996.381(6577)：p.90-2]。从该螺旋状核心抛射出许多套圈。其中之一是三联体Arg-Gly-Asp(RGD)，其是与粘附至组织相关的基元[Leininger，E.等人，Infect Immun，1992.60(6)：p.2380-5；Emsley，P.等人，Nature，1996.381(6577)：p.90-2]。

基元RGD和许多富含脯氨酸的区域的存在与在粘附过程中Prn的功能相关。通过实验已观察到，Prn能够介导与呼吸上皮细胞的粘附[Everes t，P.等人，Microbiology，1996.142(Pt11)：p.3261-8]。然而，在所研究的条件下，人血清抑制百日咳博德特氏菌粘附至A549细胞系(人肺泡上皮)的试验没有表明，在该过程中Prn是关键因素[Rodriguez，M.E.等人，FEMS Immunol Med Microbiol，2006.46(1)：p.39-47]。

Prn蛋白存在于具有三种或更多种组分的无细胞疫苗中。无细胞疫苗可以由下列构成：1)一种组分，百日咳毒素(PT)；2)两种组分：PT和丝状植物凝集素(FHA)；3)三种组分：PT、FHA和Prn；以及4)五种组分，包括前面提及的三种组分，以及菌毛蛋白2(FIM2)和菌毛蛋白3(FIM3)。在人中，抗-Prn、抗-FIM2和抗-PT抗体的水平与针对该疾病的保护水平相关[Cherry，J.D.等人，Vaccine，1998.16(20)：p.1901-6；Storsaeter，J.等人，Vaccine，2003.21(25-26)：p.3542-9]。

用百日咳博德特氏菌和支气管炎博德特氏菌的Prn进行的主动免疫接种产生针对Prn的特异性抗体应答，其在各种不同的动物模型中赋予了保护[Charles，I.G.等人，Eur J Immunol，1991.21(5)：p.1147-53；Roberts，M.等人，Vaccine，1992.10(1)：p.43-8]。类似地，被动施用抗-Prn单克隆抗体(MAbs)在呼吸系统攻击模型中保护了小鼠[King A.J.等人，Microbiology，2001.147(Pt11)：p.2885-95]。通过向包含PT和FHA的疫苗中添加Prn，提高了小鼠(呼吸系统攻击-鼻内模型)中的保护水平[Guiso，N.等人，Vaccine，1999.17(19)：p.2366-76]。最近观察到，Prn是无细胞疫苗中的产生与调理吞噬的活性相关的抗体应答水平的唯一组分[Hellwig，S.M.等人，J Infect Dis，2003.188(5)：p.738-42]。

尽管存在有有效的疫苗以及已为大家认可的疫苗接种程序，百日咳依然在美洲、欧洲和亚洲区域流行，其被认为是再出现的疾病[Raguckas，S.E.等人，Pharmacotherapy，2007.27(1)：p.41-52]。所提出的用于解释这种现象的假说之一是由于抗性菌株的出现而导致的疫苗效力的丧失[Moo i，F.R等人，Emerg Infect Dis，2001.7(3Suppl)：p.526-8]。Prn是百日咳博德特氏菌中最具多态性的蛋白质之一。它含有两个可变区，称为区域1(R1)和区域2(R2)，其中分别观察到富含脯氨酸的重复的氨基酸序列Gly-Gly-X-X-Pro(GGXXP)和Pro-Gln-Pro(PQP)。R1区域位于靠近氨基末端(N-末端)并与基序RGD邻近的突起的套圈中，而R2区域位于朝向羧基末端(C-末端)处[Hijnen，M.等人，Infect Immun，2004.72(7)：p.3716-23]。迄今，在美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的数据库中，对于百日咳博德特氏菌已鉴定出了总共12种Prn变体(Prn1、Prn2、Prn3......Prn12)。携带Prn1、Prn2和Prn3的菌株是更具世界分布的菌株。对于在美洲、欧洲、亚洲和澳洲各个地区中的分离物(追溯的和当前流行的)的众多表征研究显示出Prn2菌株逐渐代替Prn1菌株的趋势，Prn2菌株在大部分国家中占优势地位[Mooi，F.R.等人，Infect Immun，1998.66(2)：p.670-5；Cass iday，P等人，J Infect Dis，2000.182(5)：p.1402-8；Weber，C.等人，J Clin Microbiol，2001.39(12)：p.4396-403；Hallander，H.O.等人，J Clin Microbiol，2005.43(6)：p.2856-65；van Amersfoorth，S.C.等人，J Clin Microbiol，2005.43(6)p.2837-43；Byrne，S等人，BMC Infect Dis，2006.6：p.53]。

细胞疫苗(DTPc)和无细胞疫苗(DTPa)中的Prn的氨基酸序列不同于当前流行的菌林这一事实支持了关于由于新菌株的出现而造成目前疫苗的效力丧失的假说。对于在荷兰和意大利用DTPc和DTPa进行疫苗接种和未进行疫苗接种的人群的研究表明，这种类型的疫苗更好地提供针时具有类似特征的当前流行的菌株的保护[Mooi，F.R等人，Infect Immun，1998.66(2)：p.670-5；Mas trantonio，P.等人，Microbiology，1999.145(Pt8)：p.2069-75]。与这些发现相一致，小鼠模型显示，用DTPc进行的疫苗接种区别性地提供针对携带Prn1和Prn2的菌株的保护，这表明Prn的R1区域中的变异可赋予抗性程度[King A.J.等人,Microbiology，2001.147(Pt11)：p.2885-95]。然而，通过考虑来源国家、疫苗接种状况和疫苗类型(DTPc和DTPa)而进行的对百日咳博德特氏菌菌株实施分级的更大规模的研究并未揭示出，对于当前流行的菌株和疫苗接种程序来说在等位基因prn、ptxC、ptxA或tcfA2的频率方面存在显著的差异[van Amersfoorth，S.C.等人，J Clin Microbiol，2005.43(6)p.2837-43]。

虽然这些发现难以证明疫苗接种使得新变体出现，但是Prn2菌林在许多国家中的流行升高表明，某些方式有助于Prn2菌株的传播。一方面，引人注目的是，在那些研究[van Amersfoorth，S.C.等人，J Clin Microbiol，2005.43(6)p.2837-43]中，分离出的具有与所采用的疫苗的等位基因类似的等位基因的三株临床菌株只存在于未疫苗接种的儿童中。无论是否是偶然事件，这暗示Prn1菌株在没有特异性免疫力的小生境中是受优待的。另一方面，近来鉴定出了通过作为初级受体的Prn而感染博德特氏菌的噬菌体(BPP-1)，这使得人们考虑，在该蛋白质中的变异可能是由于与免疫系统的那些不同的选择压力而产生的[Liu，M.等人，Science，2002.295(5562)：p.2091-4]。并没有排除这样的可能性，即这两种现象与其他未知因素一起相互协调地导致百日咳博德特氏菌群体中的变异。

已经通过数学模型模拟了百日咳流行病学的可能的演变，所述数学模型独立地整合了该疾病的发生率和病原体的传播[Aguas，R.等人，Lancet InfectDis，2006.6(2)：p.112-7]。该模型预测，常规的加强剂量将不能去除在实际的疾病流行中所观察到的该疾病的严重度等级。很有可能的是，这是由于可用的无细胞疫苗所赋予的短的保护持续时间(4-12年)，以及所产生的免疫力的可变性和疫苗的多样性而引起的。该模型预测，最佳的情形是拥有产生优于天然免疫力的免疫力的疫苗，这是当前的细胞疫苗和无细胞疫苗所追求的典范。

本发明的主要目的在于开发更有效的针对百日咳的无细胞疫苗。在本发明之前的主要工作着眼于找到更有效的疫苗，这基于通过应用Prn(Nicole Guiso等人，WO 01/90143 A2和US 2006/0008474 A1)或Prn R1区域的合成肽(Frederik Mooi等人，WO 02/00695 A2)的混合物来获得免疫原性制剂。因此，预防百日咳的一个重要问题是开发出更有效的无细胞疫苗。

发明详述

本发明有助于解决上述问题，并且包括改造编码称为百日咳杆菌粘附素(Prn)的百日咳博德特氏菌外膜蛋白的prnA基因。本发明通过下列方式满足了现有技术中所表明的需要：使获得经改造的百日咳杆菌粘附素的各种不同变体成为可能，从而在单个分子中包含Prn R1区域的两个不同的多态性结构域。本发明的多能性还考虑改造新的Prn，其另外还包含R1区域的三个或更多个不同的多态性结构域。

本发明的目标是编码经改造的百日咳杆菌粘附素蛋白的多核苷酸序列，其中所述经改造的百日咳杆菌粘附素蛋白包含靠近给定类型的天然成熟百日咳杆菌粘附素的N-末端的直至前300个氨基酸(PrnX300)，以及合靠近给定类型的天然成熟百日咳杆菌粘附素的C-末端的直至最后620个氨基酸的氨基酸序列(PrnY620)，这导致得到经改造的百日咳杆菌粘附素PrnX300-PrnY620。

在本发明的范围内，术语“经改造的百日咳杆菌粘附素”是指通过下列方式而产生的蛋白质：将包含靠近天然成熟百日咳杆菌粘附素分子的N-末端的直至前300个氨基酸的片段与包含靠近天然成熟百日咳杆菌粘附素分子的C-末端的直至最后620个氨基酸的另一片段毗邻地或不毗邻地相连接。

经改造的新的百日咳杆菌粘附素变体通过分子诱变而获得，其中将包含靠近给定类型的天然成熟百日咳杆菌粘附素的N-末端的直至前300个氨基酸的序列与包含接近给定类型的天然成熟百日咳杆菌粘附素的C-末端的直至最后620个氨基酸的序列毗邻地相连接。经改造的新的Prn在单个分子中包含来自不同类型的Prn的序列，而不影响保护性免疫应答。

在本发明的一个优选实施方案中，获得了各种不同的经改造的Prn变体，其由标示为SEQ ID NO：1-SpQ ID NO：6的核酸序列编码。通过用所述各种不同的变体对小鼠进行免疫接种，获得了比用天然Prn(单独地或以混合物进行配制)所获得的那些显著更高的保护水平和调理吞噬的活性水平。用经改造的Prn所产生的免疫应答针对表达不同类型的Prn的菌株是同样有效的。

在本发明的一个实施方案中，包含靠近给定类型的天然成熟百日咳杆菌粘附素的N-末端的前300个氨基酸的片段(PrnX300)相应于博德特氏菌属的百日咳杆菌粘附素。在一个优选的实施方案中，该片段相应于百日咳博德特氏菌或副百日咳博德特氏菌的百日咳杆菌粘附素，优选地相应于百日咳博德特氏菌的Prn1、Prn2和Prn3变体。

在本发明的一个实施方案中，靠近给定类型的天然成熟百日咳杆菌粘附素的C-末端的最后620个氨基酸(PrnY620)相应于博德特氏菌属的百日咳杆菌粘附素。在本发明的一个特别的实施方案中，片段PrnY620相应于百日咳博德特氏菌或副百日咳博德特氏菌的百日咳杆菌粘附素，优选地相应于百日咳博德特氏菌的Prn1、Prn2和Prn3变体。

本发明的多核苷酸序列编码多肽链，所述多肽链包含以PrnX300-PrnY620形式的给定类型的百日咳杆菌粘附素的任何可能的组合。

在本发明的多核苷酸序列中，氨基酸序列PrnX300和PrnY620毗邻地或者通过使用序列IDNATWVMTDN或IDNATWVMTDNIDNATWVMTDN相连接。

在本发明中，氨基酸序列PrnX300和PrnY620可以没有重复序列，优选地没有R1和R2区域的GGXXP和PQP序列。支持这一特点的证据如下：包含重复序列GGXXP的区域1被人和兔血清很弱地识别，这表明其不是免疫显性区域[Hijnen，M.，F.R.Mooi等人，(2004).Infect Immun 72(7)：3716-23]。另一方面，近来的工作报道了Prn突变体，其中缺失了重复序列GGXXP和PQP或者包含这些序列的区域。GGXXP的缺失未影响所获得的突变体的物理化学性质，正如对于突变型Prn和时于非突变型Prn通过使用相同的条件在表达和纯化方法中所证明的[Hijnen，M.，P.G.van Gageldonk等人，(2005).Protein Expr Purif 41(1)：106-12]。类似地，GGXXP的缺失未显著影响结构性质，因为在区域1中发生突变的Prn被针对天然百日咳杆菌粘附素而产生的构象单克隆抗体(MAbs)所识别，而不被抗-GGXXP序列MAbs所识别。此外，已观察到，在区域1中的确定的突变可以增强确定的构象MAbs的结合能力。最后，有证据表明区域1(GGXXP)和区域2(PQP)形成单个表位[Hijnen，M.，R.de Voer等人，(2007).Vaccine 25(31)：5902-14]。

本发明的目标还在于编码经改造的百日咳杆菌粘附素的多核苷酸序列，其中氨基酸序列PrnX300和PrnY620包含作为辅助T表位起作用的肽，所述辅助T表任优选地为白喉、破伤风、HBV、脊髓灰质炎病毒、牛痘、HIV或流感病毒的表位。本领域技术人员知晓，插入这种类型的表位导致了通过具有所述表位的分子所产生的免疫应答的增强。

本发明的目标还在于根据权利要求1的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列在密码子使用方面进行了优化，以用于在细菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞中进行表达。用于增加通过重组而获得的分子的表达的该形式是本领域技术人员广泛知晓的。

考虑到作为本发明目标的新蛋白质是联合疫苗的多个组分之一，强调了没有任何先前的发明打算获得较少可能数目的满足本领域需要的分子实体。

最后，在现有技术中，需要拥有考虑了百日咳博德特氏菌和副百日咳博德特氏菌之间的交叉保护的疫苗制剂。考虑到博德特氏菌属的不同物种的百日咳杆菌粘附素之间的高度同源性，本发明包括产生经改造的百日咳杆菌粘附素，其在单个分子中考虑了来自博德特氏菌属的不同物种的不同的多态性区域。

出乎意料地，作为本发明目标的经改造的百日咳杆菌粘附素不仅能产生针对表达Prn1和Prn2的百日咳博德特氏菌的不同菌株的有效免疫应答，而且还诱导相对于天然百日咳杆菌粘附素蛋白而言更有效的抗体应答，正如在呼吸系统攻击模型和调理吞噬试验中所证实的。令人惊讶地，由经改造的百日咳杆菌粘附素所诱导的免疫应答也优于由Prn1和Prn2的等摩尔混合物(Prn1+Prn2)所诱导的免疫应答。

基于同一物种或不同物种的不同百日咳杆菌粘附素的混合物的疫苗组合物(尽管涵盖了多态性)导致与生产过程相关的技术困难，例如不希望的污染物浓度的增加和各批次之间的生产不一致性。这是对于开发其中牵涉具有不同特征的多个抗原的联合疫苗来说至关重要的方面，它可以累及所述制剂的系统免疫原性。另一方面，预期到，采用基于R1区域的合成肽的策略，将会获得不如现有疫苗有效的疫苗，这是因为从保护性应答中排除了在天然Prn中存在的相关的其他表位。

为了解决本技术领域中的这个问题，本发明提供了药用细合物，其包含一种或多种由根据权利要求1-13的多核苷酸序列编码的经改造的百日咳杆菌粘附素，所述经改造的百日咳杆菌粘附素的量足以通过在哺乳动物，优选人中的免疫接种程序而产生针对博德特氏菌属物种的有效的体液和细胞免疫应答。在本发明的一个实施方案中，包含一种或多种经改造的百日咳杆菌粘附素的药物组合物产生针对百日咳博德特氏菌的有效的体液和细胞免疫应答。

本发明的目标还在于包含一种或多种由根据权利要求1-13的多核苷酸序列编码的经改造的百日咳杆菌粘附素的活疫苗或减毒疫苗，其中所述经改造的百日咳杆菌粘附素优选地表达在外膜中。在所述活疫苗或减毒疫苗中，根据权利要求1-13的多核苷酸序列可以被包含在质粒载体或细菌染色体中。

在本发明的另一个实施方案中，编码经改造的百日咳杆菌粘附素的根据权利要求1-13的多核苷酸序列被包含在哺乳动物表达载体中。包含根据权利要求1-13的多核苷酸序列的所述表达载体是核酸疫苗(其也为本发明的目标)的基础。

在本发明的一个实施方案中，由根据权利要求1-13的多核苷酸序列编码的多肽序列可以在用于检测博德特氏菌感染的方法中使用。本发明的目标还在于用于检测针对博德特氏菌的抗体存在与否的诊断试剂盒，其包含由根据权利要求1-13的多核苷酸序列编码的多肽序列。

附图简述

图1.在用不同的重组且经改造的百日咳杆菌粘附素变体进行疫苗接种的Ba1b/c小鼠中的保护实验。百日咳博德特氏菌菌株Tohama I(Prn1)和临床分离株CH53(Prn2)用于攻击。柱状物代表了相对于用PBS进行免疫接种的对照组而言，在肺中的活细胞减少的对数的平均值。

图2.由用不同的重组且经改造的百日咳杆菌粘附素变体进行疫苗接种的Ba1b/c小鼠的血清介导的调理吞噬。该图显示了在两种温育条件(PE4℃-PE37℃)下，用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的细胞的以任意单位(AU)表示的荧光(藻红蛋白，PE)的差异。

图3.在用表达Prn1、Prn2、Prn2CCPrn1和Prn2CLPrn1的质粒进行免疫接种的小鼠中产生的针对Prn1和Prn2CCPrn1的体液免疫应答(IgG)。

具体实施方式的详细描述/实施例

实施例1.用于在大肠杆菌(Escherichia coli)中细胞内表达经改造的百日咳杆菌粘附素变体的载体的构建，以及其纯化

使用先前报道的寡核苷酸1和2[Hijnen，M.，P.G.van Gageldonk等人，(2005).Protein Expr Purif 41(1)：106-12]，通过聚合酶链式反应(PCR)从基因组DNA中扩增出百日咳博德特氏菌菌株Tohoma I(Prn1)和CH53(Prn2)的prnA1和prnA2基因。

使用Nde I和BamH I位点将所获得的片段克隆到载体pET-28a(Novagen)中。为了获得经改造的Prn，使用先前由Imai等人于1991年所描述的反向PCR方法[Imai，Y.等人，Nucleic Acids Res，1991.19(10)：p.2785]。在表1中显示了用于扩增不同序列的寡核苷酸。寡核苷酸对1，2用于使载体pET28aprn1和pET28aprn2线性化，它们分别相应于百日咳杆菌粘附素1和2。通过用寡核苷酸3和4进行扩增而获得DomR1片段。另外，通过使用寡核苷酸时3，5和3，6来扩增该区域，以分别添加编码短的和长的连接体的序列。表2概括了在用于本发明的各种不同片段的PCR扩增中所使用的条件。

表1.用于扩增各种不同序列的寡核苷酸

表2.用于PCR扩增在本发明中所使用的各种不同片段的条件

将通过反向PCR获得的线性载体pET28aprn1和pET28aprn2连接至各种不同片段，所述片段编码包含Prn1和Prn2的区域1的结构域。在这些载体中，经改造的新基因处于T7诱导型启动子的转录控制之下。将具有正确序列的克隆引入到大肠杆菌菌株BL21-Codonplus(DE3)-RP中，以用于将其表达为包含体[Hijnen，M.等人，Protein Expr Purif(2005).41(1)：p.106-12]。

对于所有情形，重组百日咳杆菌粘附素1和2以及各种不同变体的表达水平达到15％至20％，这是通过在用考马斯蓝染色的聚丙烯酰胺凝胶中施行光密度测定法而证实的。

为了纯化这些蛋白质，将相应于每种变体的细菌膏状物悬浮在破裂缓冲液中(以100mg/mL的细胞浓度)，并通过超声波来裂解细胞。将细胞沉淀溶解在8M尿素中，并通过在十二烷基硫酸钠存在下在聚丙烯酰胺凝胶上的电泳(SDS-PAGE)(12.5％)来进行分级分离。通过咪唑-锌反向染色对凝胶进行染色，并且在提取缓冲液存在下使相应于目的蛋白的条带通过100μm的钢网。然后，将提取出的蛋白质复性并通过超滤进行浓缩(使用Amicon浓缩室，具有50kDa的膜)，并且通过双金鸡宁酸方法来测定浓度。通过检验15μg的在用考马斯蓝染色的分析型SDS-PAGE凝胶中纯化出的蛋白质，没有检测出污染物，这证明这些制备物具有超过95％或更高的纯度。在表3中概括了各种不同的构建体和所获得的经改造的Prn的特征。

表3.各种不同的构建体和经改造的Prn的特征

CC：短的连接体；CL：长的连接体

实施例2.在小鼠模型中的主动免疫接种、抗体应答和保护作用

用在氢氧化铝中配制的0.2μg、0.02μg或无(PBS)重组蛋白Prn1、Prn2，Prn1和Prn2的等摩尔混合物(Prn1+Prn2)，以及6种经改造的Prn变体(显示在表3中)对小鼠进行免疫接种。所述剂量相应于在人中使用的剂量(8μg)的1/40和1/400。所采用的免疫接种途径为皮下，其中使用100μL的体积。通过ELISA类型的免疫酶测定法来评估经免疫接种的小鼠的血清。抗体滴度达到1.2×10³至4.6×10⁴的中值。在所有情形中，相应于较大剂量的滴度的中值显著不同于用所使用的较小剂量所达到的滴度(p＜0.05，Kruskal Wallis-Dunns)。对于用百日咳杆菌粘附素1和2以及等摩尔混合物Prn1+Prn2所产生的抗体应答，未观察到差异。类似地，在所述各种不同的经改造的变体的滴度中值之间也没有观察到差异。令人惊讶地，经改造的变体的滴度显著高于未改造的重组百日咳杆菌粘附素的滴度(p＜0.01，Kruskal Wallis-Dunns)。

为了进行鼻内攻击，使用菌株Tohama I(Prn1)和临床分离株CH53(Prn2)。在含有Bordet-Gengou Agar培养基(Sigma)(补充有1％甘油和14％去纤维蛋白的绵羊血)的平板上培养所述细菌。将平板温育24小时(于37℃)，并且将菌落以10⁸个细胞/mL的密度重悬浮在Stainer-Scholte培养基中。将该悬浮液用于鼻内攻击。在最后一次免疫接种后15天，通过滴注50μL细菌悬浮液(5×10⁶个细胞)来攻击经免疫接种的小鼠。在攻击后5天，处死小鼠并无菌地取出肺，并且进行匀浆以测量细菌负荷[Denoel，P.等人，Vaccine，2005.23(46-47)：p.5333-41]。所述各种不同的变体显示出比未经疫苗接种的对照显著更高的保护水平(p＜0.001)。出乎意料地，对于所述两种菌株，所述经改造的变体显示出相比于重组百日咳杆菌粘附素和等摩尔混合物Prn1+Prn2而言更高的保护水平(p＜0.001)。在所研究的较小剂量下，可以观察到，经改造的变体同样地提供了针对所述两种菌株的保护，而对于百日咳杆菌粘附素1和2则不是如此。这些结果证明，这些变体具有不同于且优于分开地或以等摩尔混合物形式进行检验的重组百日咳杆菌粘附素1和2蛋白的免疫学特性(图1)。

实施例3.血清的调理吞噬的活性

由抗-Prn抗体介导的调理吞噬地活性已显示为在用无细胞疫苗进行疫苗接种的人群的应答中的关键参数[Hellwig，S.M.等人，J Infect Dis，2003.188(5)：p.738-42]。在本发明中显示，各种不同的经改造的百日咳杆菌粘附素变体能够诱导具有这些特征的抗体。通过所提及的并经调整而适合于小鼠模型的方法研究了调理吞噬的活性。在Bordet-Gengou-Agar培养基中生长百日咳博德特氏菌的Tohama I和CH53菌株，并用FITC进行标记(2×10⁶菌落形成单位)。然后，于37℃在平板摇动器上用经免疫接种的小鼠的血清将经标记的细菌调理30分钟，所述小鼠是用重组蛋白Prn1、Prn2、Prn1+Prn2以及用两种经改造的Prn变体(Prn2-CC-Prn1和Prn2-CL-Prn1)进行免疫接种的。在粘附步骤中，将经调理的细菌和未调理的对照与多形核细胞(PMN)一起进行温育。将样品分开，并于4℃或37℃再温育45分钟。最后，将样品与山羊抗小鼠-PE缀合物一起于4℃再温育30分钟。通过流式细胞术(PARTEC PAS III)来分析样品。使用维持于4℃的细胞的绿色和红色的强度作为粘附对照。将在发绿色荧光的细胞中红色荧光的差异用于验证由各种不同血清介导的吞噬活性。

在图2中显示了，所检验的经改造的变体显示出调理吞噬的活性。令大惊讶地，仅在用经改造的Prn进行免疫接种的组和用PBS接种的小鼠的细之间具有显著差异(p＜0.05，Kruskal Wallis-Dunns)。用未改造的重组百日咳杆菌粘附素(单独地或以其混合物)产生的血清的调理吞噬的活性达到对照PBS的6倍的值，尽管这些差别并不显著。最后，这些结果证明了，所述经改造的变体能够诱导具有显著的调理吞噬的活性的抗体，而与细菌所携带的百日咳杆菌粘附素的类型无关。

实施例4.用于在哺乳动物中表达经改造的百日咳杆菌粘附素变体的载体的构建，以及体液应答的评估

使用先前报道的寡核苷酸1和2[Hijnen，M.，P.G.van Gageldonk等人，(2005).Protein Expr Purif 41(1)：106-12]，通过PCR从各自的表达载体(见表3)中扩增出基因prnA1、prnA2，以及基因变体Prn2CCPrn1和Prn2CLPrn1，在此在寡核苷酸1中具有修饰，其中用BamH I位点替代了寡核苷酸1的Nde I位点。使用该BamH I位点，将所获得的片段克隆到载体pAEC-SPE3中[Herrera AM，Rodriguez EG等人 ，(2000)BBRC，279，548-551]。该载体计划用于在哺乳动物细胞中进行抗原的细胞外表达。使用用于纯化质粒的商业试剂盒

来纯化所述载体。以三周的间隔，通过肌内途径，以1μg/μL的浓度(在PBS中)用100μg DNA对雌性Ba1b/c小鼠(6-7周龄)的组免疫接种三次。使用没有插入片段的质粒(pAEC-SPE3)，以相同方式免疫接种对照组。在最后一次接种后15天处死小鼠，并收集血液以用于血清的评估。使用1/1000的稀释度并用等摩尔量的Prn1(2μg/mL)和Prn2CCPrn1(2.4μg/mL)蛋白进行包被，通过ELISA技术来评估血清中存在的特异性IgG。如在图3中所观察到的，相对于用pAEC-SPE3(没有插入片段的载体)进行免疫接种的动物而言，用表达Prn1、Prn2、Prn2CCPrn1和Prn2CLPrn1的各种不同质粒进行免疫接种的动物产生了特异性的且显著更高的(p＜0.001)免疫应答(IgG)。与在用蛋白质和氢氧化铝进行免疫接种的小鼠中产生的血清(数据未显示)相类似，在所述经免疫接种的小鼠中产生的血清以比天然Prn1蛋白更高的中值识别经改造的变体Prn2CCPrn1(p＜0.05)，这可能是由于相比于Prn1而言在Prn2CCPrn1中所述共有的表位更好地暴露。

Claims (21)

1.编码经改造的百日咳杆菌粘附素蛋白的多核苷酸序列，其中所述经改造的百日咳杆菌粘附素蛋白包含靠近给定类型的天然成熟百日咳杆菌粘附素的N-末端的直至前300个氨基酸(PrnX300)，以及含靠近给定类型的天然成熟百日咳杆菌粘附素的C-末端的直至最后620个氨基酸的氨基酸序列(PrnY620)，这导致得到经改造的百日咳杆菌粘附素PrnX300-PrnY620。

2.根据权利要求1的多核苷酸序列，其中PrnX300相应于博德特氏菌属(Bordetella)的百日咳杆菌粘附素。

3.根据权利要求2的多核苷酸序列，其中PrnX300相应于百日咳博德特氏菌(B.pertussis)或副百日咳博德特氏菌(B.parapertussis)的百日咳杆菌粘附素。

4.根据权利要求3的多核苷酸序列，其中PrnX300相应于百日咳博德特氏菌的Prn1、Prn2和Prn3变体。

5.根据权利要求1的多核苷酸序列，其中PrnY620相应于博德特氏菌属的百日咳杆菌粘附素。

6.根据权利要求5的多核苷酸序列，其中PrnY620相应于百日咳博德特氏菌或副百日咳博德特氏菌的百日咳杆菌粘附素。

7.根据权利要求6的多核苷酸序列，其中PrnY620相应于百日咳博德特氏菌的Prn1、Prn2和Prn3变体。

8.根据权利要求1的多核苷酸序列，其编码多肽链，所述多肽链包含以PrnX300-PrnY620形式的给定类型的百日咳杆菌粘附素的任何可能的组合。

9.根据权利要求1的多核苷酸序列，其中氨基酸序列PrnX300和PrnY620毗邻地或者通过使用序列IDNATWVMTDN或IDNATWVMTDNIDNATWVMTDN相连接。

10.根据权利要求1-9的多核苷酸序列，其中氨基酸序列PrnX300和PrnY620没有重复序列，优选地没有R1和R2区域的GGXXP和PQP序列。

11.根据权利要求1-10的多核苷酸序列，其中氨基酸序列PrnX300和PrnY620还包含作为辅助T表位起作用的肽，所述辅助T表位优选地为白喉、破伤风、HBV、脊髓灰质炎病毒、牛痘、HIV或流感病毒的表位。

12.根据权利要求1的多核苷酸序列，其包含标示为SEQ ID NO：1至SEQ IDNO：6的核苷酸序列。

13.根据权利要求1的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列在密码子使用方面进行了优化，以用于在细菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞中进行表达。

14.药物组合物，其包含一种或多种由根据权利要求1-13的多核苷酸序列编码的经改造的百日咳杆菌粘附素，所述经改造的百日咳杆菌粘附素的量足以通过在哺乳动物，优选人中的免疫接种程序而产生针对博德特氏菌属物种的有效的体液和细胞免疫应答。

15.根据权利要求14的药物组合物，其产生针对百日咳博德特氏菌的有效的体液和细胞免疫应答。

16.包含一种或多种由根据权利要求1-13的多核苷酸序列编码的经改造的百日咳杆菌粘附素的活疫苗或减毒疫苗，其中所述经改造的百日咳杆菌粘附素优选地表达在外膜中。

17.根据权利要求16的活疫苗或减毒疫苗，其中根据权利要求1-13的多核苷酸序列被包含在质粒载体或细菌染色体中。

18.包含一种或多种根据权利要求1-13的多核苷酸序列的哺乳动物表达载体，所述多核苷酸序列编码经改造的百日咳杆菌粘附素。

19.包含根据权利要求18的表达载体的核酸疫苗。

20.用于检测博德特氏菌感染的方法，其包括使用由根据权利要求1-13的多核苷酸序列编码的多肽序列。

21.用于检测针对博德特氏菌的抗体存在与否的诊断试剂盒，其包含由根据权利要求1-13的多核苷酸序列编码的多肽序列。

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